JP3833642B2 - アンチトロンビン測定における特異性の改善 - Google Patents

Description

本発明は、アンチトロンビンIII(ＡＴ)結合パートナーを試料に添加し、遊離のＡＴ結合パートナーを測定することにより、体液中のＡＴを測定する方法に関する。また、本発明は前記方法に適した試薬に関する。

ＡＴは、制御的役割を担う血液凝固系の因子である。血液凝固は種々のプロテアーゼのカスケード的相互作用によって開始される。連続的活性化工程の最後は、血栓形成に関わるフィブリンモノマーを生成するトロンビンの放出である。最も重要な制御因子は、トロンビン、また血液凝固に関わる他のプロテアーゼと複合体を形成でき、活性中心をブロックするＡＴである。健常人の血液中のＡＴ量は比較的狭い範囲にある。ＡＴ量の減少は消耗性凝固障害（consumptive coagulopathy）や重症肝障害が原因であることもあれば、遺伝的であることもある。今日、ＡＴ量の減少は一般に血栓症のリスクになると考えられている。そんなわけで急性血栓症ではＡＴ量が減少している場合もある。したがって、ＡＴ量は臨床診断における重要なパラメーターである。

ＡＴ結合パートナーと試料中に存在するＡＴとの相互作用が可能な条件下で、ＡＴ結合パートナーを添加し、次いで遊離のＡＴ結合パートナーの量を測定する、種々のＡＴ検出方法が既に公知である。そのような検出は例えば免疫学的方法又は発色性基質に基づいている。後者の場合、トロンビン又は活性化されたＸ因子は、例えば試料に添加され、当該試料中に存在するＡＴと相互作用する。次いで、過剰のトロンビンは、トロンビンの作用によって着色物質を形成する発色性基質とのインキュベーション、及びＡＴ量が着色物質形成と間接的に比例した発色を評価することにより測定される。

ＡＴを測定する方法は、例えば、Bergmeyer, Methods of Enzymatic Analysis, 3rd edition, "Verlag Chemie", vol. 5, p. 441 - 448; I. Witt, ed., "Neue Methoden der Gerinnungsanalyse mit chromogenen Substraten", Stormorken, "Neue Methoden der Gerinnungsanalyse", page 119 - 121; Odegard et al., Haemostasis 7: 202-209 (1978); Fareed et al., Chromogenic Peptide Substrates (eds. M.F. Scully and V.V. Kakkar) Churchill Livingstone (1979) 183-191 and Abildgaard et al., Thromb. Res. 11, 549-553 (1977)中に記載されている。

トロンビンを添加してＡＴを測定する公知の方法の欠点は、阻害因子（例えばそれ自身がトロンビンと相互作用しうるヒルビンのような医薬品）が存在すると、誤って高いＡＴ値が得られることである。

この欠点はトロンビンの代りに活性化されたＸａ因子を用いることにより防止することができる。しかしながら、いくつかのＸａ因子阻害剤が現在治療用剤として開発中である (Ostrem et al., Biochemistry 37 (1998), 1053-1059; US Patent 5,783,421; US Patent 5,721,214; WO 96/40679; US Patent 5,693,641; WO 97/46523; JP-96-191434 etc.)。これらの製剤が市場に出るとき、トロンビンに基づく試験のように、Ｘａ因子に基づく検出方法に伴って、同様の問題が生じるだろう。

それゆえ、本発明の目的は公知の検出方法を改良し、たとえ試験される試料中に阻害因子が存在していたとしても、信頼性のある測定結果に結びつく方法を提供する。

この目的は、以下の工程を含む、阻害因子を含む可能性がある試料中のアンチトロンビンIII(ＡＴ)を検出する方法によって達成される：
(a) 試料をＡＴ結合パートナーを含む第１の試薬Ｒ１とＡＴ結合パートナーが本質的にＡＴとは相互作用しないが、阻害因子とは相互作用をする条件下で、接触させる
(b) ＡＴ結合パートナーの遊離のフラクションの１回目の測定のための第２の試薬Ｒ２を添加する
(c) ＡＴ結合パートナーがＡＴと相互作用する条件を変化させる第３の試薬Ｒ３を添加し、ＡＴ結合パートナーの遊離のフラクションの２回目の測定を実施する、そして
(d) ＡＴ結合パートナーの遊離のフラクションの１回目と２回目の測定の相違から、試料中のＡＴ量を決定する。

本発明の方法は、ＡＴ結合パートナーと試料中に存在するＡＴとの相互作用の測定に基づく、試料中（特に血液又は血漿のような体液中）のＡＴを検出であって、ＡＴ結合パートナーの１回目の測定はＡＴ相互作用なしに実施され、それに続く２回目の測定はＡＴ相互作用のもとで実施され、試料中のＡＴ量が１回目と２回目の測定の相違から決定される前記検出に関する。

本発明の方法は、異なった条件下における、試料中のＡＴ結合パートナーの遊離のフラクションの測定に基づく。ＡＴ結合パートナーの１回目の測定はＡＴとの相互作用なしに実施される。つまり、存在するＡＴは本質的にＡＴ結合パートナーと反応しない、すなわち全く相互作用しないか、例えばＡＴが活性型で存在しないため実質的に測定を妨害しない程度までしか相互作用しない。次いで、試料中に存在するＡＴがＡＴ結合パートナーと相互作用しうるように、例えばＡＴとＡＴ結合パートナー間の複合体形成のような総合作用が促進されるような条件を設定する適当な試薬を添加することによって、条件を変化させる。これに続く２回目の残った遊離（及び活性）のＡＴの測定は、試料中のＡＴ量の推定を可能にする。

遊離のＡＴ結合パートナーは基本的に任意の方法で測定される。活性の発色測定としては、例えばトロンビン又はＸａ因子のようなＡＴ結合パートナーのタンパク分解活性を測定するか、あるいは、例えば、（ＡＴと）複合体化していないＡＴ結合パートナーに対して特異的に誘導され、かつ後のＡＴとＡＴ結合パートナーとの複合体形成を阻害しない抗体を用いた免疫学的測定を実施することによって測定することが好ましい。

特に好ましい本発明の方法の実施形態は、ＡＴ結合パートナーのタンパク分解活性の測定を含む。本方法では、阻害因子との反応後に残っているＡＴ結合パートナーのタンパク分解活性を、試料中に存在するＡＴが反応できないか、あるいはＡＴ結合パートナーとほんのわずかに反応できるような条件下で測定する。次いで、例えばＡＴを活性化することにより、ＡＴとＡＴ結合パートナー間の複合体形成を促進させる。複合体は本工程において活性化ＡＴと結合パートナーから形成される。そのような複合体化した結合パートナーは本質的にもはやタンパク分解活性をもたない。次に、結合パートナー活性を再度測定する。１回目と２回目の活性の相違は試料中のＡＴ量に関連する。

ＡＴ結合パートナーは検出可能な物質であり、好ましくは、その阻害にＡＴと複合体を形成しうるタンパク分解酵素活性をもった物質である。好適なＡＴ結合パートナーの例は、トロンビン及びＸａ因子である。トロンビンは特に好ましく用いられる。

ＡＴ結合パートナーは、ＡＴ結合パートナーの作用により着色物質を形成する発色性基質と結果的な発色の測定によって、好適に検出される。好ましい基質の例はペプチド性基質、例えば、トロンビンをTos-Gly-Pro-Arg-OH 及びp-ニトロアニリンによって置換したトロンビン基質Tos-Gly-Pro-Arg-p-ニトロアニリン (Chromozym（登録商標）TH) である。しかしながら、対応するＡＴ結合パートナーによって許容される他の基質も、もちろん好適である。

先行技術の方法とは対照的に、本発明の方法において、ＡＴ結合パートナーの活性の１回目の測定は、試料中に存在するＡＴが結合パートナーと複合体を形成できないか、あるいはほんのわずかな程度だけ複合体を形成し、その活性を阻害できない条件下で行われる。すなわち、１回目の測定はＡＴとＡＴ結合パートナー間の複合体形成を促進させるヘパリンのような物質の存在しない状態で実施されることが適切である。ヘパリンアンタゴニストのような促進剤のアンタゴニスト、例えばポリブレンなどを、必要であれば添加することができる。ヘパリンアンタゴニストの添加は、患者が以前にヘパリン治療を受け、試料中に存在する（低い）ヘパリン濃度により、ＡＴとＡＴ結合パートナー間の複合体形成の望ましくない促進が生じた場合に、特に好適である。

遊離のＡＴ結合パートナーの１回目の測定後、別な試薬を好ましくはヘパリンのような複合体形成促進剤を含む反応混合物に添加する。次いで、試料中に存在するＡＴがＡＴ結合パートナーと複合体形成をしうる条件下で、２回目の活性を測定する。試料中のＡＴ量は１回目と２回目の測定の相違から決定しうる。測定されたシグナルは試料中のＡＴ濃度に反比例する。もし必要であれば、第３の試薬は追加のＡＴ結合パートナーを含んでいてもよい。もしあまりに多くの基質が最初の測定ですでに消費されてしまった場合は、さらに追加の基質を別な工程でピペットで加えてもよい。

ＡＴ結合パートナーは、例えばRoche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany製のアンチトロンビンIII試験など、基本的に公知の方法によって測定される。

本発明はまた、以下を含む、試料中のＡＴの定量的検出用試薬キットに関する：
(a) ＡＴ結合パートナーを含む第１の試薬Ｒ１
(b) 遊離のＡＴ結合パートナーを測定するための第２の試薬Ｒ２、及び
(c) ＡＴとＡＴ結合パートナー間の相互作用促進剤を含む第３の試薬Ｒ３であって、該第３の試薬Ｒ３が第１の試薬Ｒ１と隔離されている、前記第３の試薬Ｒ３。

第１の試薬Ｒ１は相互作用（例えばＡＴとＡＴ結合パートナー間の複合体形成）の促進剤を含まない。第１の試薬は必要であればまたそのような促進剤としてアンタゴニストを含んでいてもよい。ＡＴ結合パートナーを測定するための第２の試薬Ｒ２は、例えばＡＴ結合パートナーの基質を含む、発色測定に適した試薬であってもよい。さらに、第２の試薬はまた免疫学的測定に適したものであってもよく、例えば遊離の未結合型ＡＴ結合パートナーに対する抗体や、必要に応じて、例えばラテックス試験などの免疫学的試験を実施するための他の試薬を含んでいてもよい。第３の試薬Ｒ３は第１の試薬Ｒ１とは隔離されており、ＡＴとＡＴ結合パートナーの間の複合体形成のような相互作用の促進剤であり、好ましくはヘパリンである。

測定は、日立製（例えば、Hitachi model 911）やインテグラ製の従来の自動分析機で実施されうる。

本発明の方法をさらに以下の実施例によって説明する：
Lepirudinの存在下におけるアンチトロンビンIIIの測定
１. 反応スキーム
3 μlの試料溶液を測定キュベット内にピペッティングした。175 μlの試薬Ｒ１をピペットで加えた。試薬Ｒ１は100 mM Tris-HCl, 270 mM NaCl, 12mM EDTA, 10 g/l ポリエチレングリコール6000、1g/l ウシ血清アルブミン、0.5 NIH/ml ウシトロンビンからなり、適当量のフィブリン重合阻害剤、例えば、GPAP, pH 8.10を含む。次に、５分間インキュベートし、75 μlの試薬Ｒ２(Chromozym TH 1.9 mM)を加えた。次に、415 及び 700 nm (一次及び二次波長) における連続二色測定（continuous bichromatic measurement）による速度論的試験で１回目のトロンビン活性を測定した。

最終的に175 μlの試薬Ｒ３ (100 mM Tris-HCl, pH 8.1; ヘパリン 2 USP-U/ml; ウシトロンビン(3.5 NIH/ml; 140 mM NaCl))を添加し、連続測定による速度論的試験で２回目のトロンビン活性を測定した。ＡＴ量は、Roche Diagnostics GmbH, MannheimのアンチトロンビンIIIキットの指示書にしたがい、２回目と１回目のトロンビン活性の相違から決定した。

この測定は異なる量(0, 1, 2, 4 and 8 μg/ml)のヒルビン(Lepirudin（登録商標）, Behringwerke)中で実施した。結果を下表に示す。

表はLepirudin（登録商標）阻害は4 μg/ml濃度までは完全に除かれていることを示している。Lepirudin（登録商標）を投与するときの治療的濃度は通常この範囲内で実施され、したがって本発明の方法は潜在的阻害能を有する薬剤の存在下でもＡＴ量を信頼性高く測定する。

Claims (3)

1. 以下の工程を含む、阻害因子を含む可能性がある試料中のアンチトロンビンIII（ＡＴ）を検出する方法：
   (a) 試料をＡＴ結合パートナーを含む第１の試薬Ｒ１とＡＴ結合パートナーが本質的にＡＴとは相互作用しないが、阻害因子とは相互作用をする条件下で、接触させる
   (b) ＡＴ結合パートナーの遊離のフラクションの１回目の測定のための第２の試薬Ｒ２を添加する
   (c) ＡＴ結合パートナーがＡＴと相互作用する条件を変化させる第３の試薬Ｒ３を添加し、ＡＴ結合パートナーの遊離のフラクションの２回目の測定を実施する、そして
   (d) ＡＴ結合パートナーの遊離のフラクションの１回目と２回目の測定の相違から、試料中のＡＴ量を決定する。
2. アンチトロンビンIII（ＡＴ）結合パートナーとＡＴ間の相互作用の測定に基づいて試料中のＡＴを検出する方法であって、ＡＴ結合パートナーの１回目の測定がＡＴ相互作用なしに実施され、それに続く２回目の測定がＡＴ相互作用のもとで実施され、試料中のＡＴ量が１回目と２回目の測定の相違から決定されることを特徴とする、前記方法。
3. 以下を含む、請求項１又は２記載の方法の使用による試料中のアンチトロンビンIII（ＡＴ）の定量的検出用試薬キット：
   (a) ＡＴ結合パートナーを含む第１の試薬Ｒ１
   (b) 遊離のＡＴ結合パートナーを測定するための第２の試薬Ｒ２、及び
   (c) ＡＴとＡＴ結合パートナー間の相互作用促進剤を含む第３の試薬Ｒ３であって、該第３の試薬Ｒ３が第１の試薬Ｒ１と隔離されている、前記第３の試薬Ｒ３：であって、
   試薬Ｒ１が、試料と、ＡＴ結合パートナーが本質的にＡＴとは相互作用しないが、阻害因子とは相互作用をする条件下で、接触せしめられ、
   試薬Ｒ２が、ＡＴ結合パートナーの遊離のフラクションの１回目の測定のために添加され、かつ、
   試薬Ｒ３が、ＡＴ結合パートナーの遊離のフラクションの２回目の測定を実施する前に、添加されることを特徴とする、前記キット。