JPS6261600A - プロテア−ゼ阻害剤の測定法 - Google Patents

プロテア−ゼ阻害剤の測定法

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JPS6261600A
JPS6261600A JP61208109A JP20810986A JPS6261600A JP S6261600 A JPS6261600 A JP S6261600A JP 61208109 A JP61208109 A JP 61208109A JP 20810986 A JP20810986 A JP 20810986A JP S6261600 A JPS6261600 A JP S6261600A
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inhibitor
concentration
mol
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JP61208109A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 テアーゼのための基質を用いることによるプロテアーゼ
阻害剤の測定法に関する。
プロテアーゼ阻害剤はプロテアーゼと反応しそしてそれ
らの活性を調節する血漿の蛋白質である。血液中におけ
る最も重要なプロテアーゼ阻害剤はα２−マクログロプ
リン、Ｃ１−アンチトリプシン、アンチトロンビンＩＩ
Ｉ（以下ＡＴｌｆｉと略記する）、Ｃ２−アンチプラス
ミンおよびＣ１−エステラーゼ阻害剤である。プロテア
ーゼと同様に阻害剤もまた多かれ少なかれ高い特異性な
有する。プロテアーゼ阻害剤の活性低下は患者に生命を
脅やかず状況をもたらしうる。
かかる患者においては、治療処置を適時に執りうるよう
にこれら阻害剤の測定が指示される。
さらに、特定の治療形態期間中および一般に手術前の患
者の「予検」にとって、プロテアーゼ阻害剤の測定は高
い情報価値を有する一般的に実施される診断上の措置で
ある。
プロテアーゼ阻害剤の濃度を測定するには放射免疫拡散
法、酵素免疫検定法、放射線免疫検定法および類似の方
法を用いる比濁法または混濁測定を用いる免疫学的方法
が用いられる。しかしながら原則的゛にはすべてのこれ
まで知られた免疫学的方法においてはプロテアーゼ阻害
剤の不活性な分子および不活性な酵素阻害剤複合物も捕
捉される。しかしながらプロテアーゼ阻害剤が正常な濃
度で存在はするが、活性低下まタハ活性欠落を示す多く
の場合が知られテイル。
それゆえこれら蛋白質は次第にそれらの酵素を阻害する
能力を利用する機能的方法を用いて測定されてきている
。通常の方法では、測定すべき阻害剤により阻害されう
る酵素を過剰に加え、そしてプロテアーゼと試料中の阻
害剤との反応終了後酵素の残存する反応性を、例えば色
原体基質を用いて測定する（アンチトロンビンｍの測定
：　ｒＴｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、Ｊ　５．６２１〜６３
２（１９７４））。
種々のプロテアーゼ阻害剤は比較的簡単にかかる方法で
測定されうる。特に合成基質例えばペプチドｐ−ニトロ
アニリドまたは、測光的にまたは螢光測定により測定さ
れうる類似化合物を用いることにより、これら測定の感
度、精度および正確さが相当に改良された。それＫより
かかる蛋白質がルーチン法により力学的にまたは終末点
法により測定できた。
しかし現代の技術水準による代表的な阻害剤測定の操作
経過ではこれら試験の実施を困難にする短所をなお有す
る。特に、過剰に存在する酵素を最大に阻害するＫは数
分のインキュベーション時間が必要でありうる。このイ
ンキュベ・−ジョン時間はかなり正確に保持されねばな
らない、何故ならあまりにインキュベーション時間が短
いと最大阻害が達成されず、一方インキエペーション時
間があまり長いと非特異的なプロテアーゼ阻害剤による
付加的な阻害がありうるからである。その他ある場合に
は試料の予備希釈が必要である。さらに、残りの酵素活
性を測定するには、少くとも３分間にわたる直線状の動
力学を得るために比較的大量の高価な色原体基質が必要
である。ｒＴｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、　Ｊ　２５．２４
５〜２５３（１９８２）にはヘパリンの存在下における
合成基質およびトロンビンおよびその阻害剤とＡＴＩと
の相互作用がいかにして測定されうるか記載されている
。一定量の精製ＡＴ　ＩＩＩ　Ｋ種々の量の基質および
ヘパリンを加えそして非直線状の基質加水分解プロット
からヘパリンの作用を示す動力学的データを測定する。
類似のヘパリン測定法はｒｃｌｉｎ、　Ｃｈｅｍ、Ｊ　
２８．１５２１〜１５２４（１９８２）に記載されてい
る。しかしながらこの場合分析時間がまさしく長い。
今、篤くべきことに、試料中においてフィブリン形成に
よるかまたは変化するフイブリノゲン濃度（これはトロ
ンビンと反応する）による障害を顧慮することなく、基
質濃度およびプロテアーゼ濃度そしてＡＴＩＩＩの場合
はヘパリン濃度を一定に保つ場合は血漿中のプロテアー
ゼ阻害剤の活性を測定しうろことが見出された。
それゆえ本発明はプロテアーゼ阻害剤により阻害されう
るプロテアーゼ、およびこのプロテアーゼのための基質
を用いて該阻害剤を測定するにあたり、詳細にはこのプ
ロテアーゼ阻害剤および基質を混合する前にはプロテア
ーゼを添加しない様式でプロテアーゼ阻害剤を含有する
液体、基質およびプロテアーゼを混合し、そして基質の
加水分解速度を測定することからなる方法に関する。
プロテアーゼ阻害剤のこの測定法により前記した他の測
定法の多数の欠点が回避てれる。本発明による方法は予
備インキュベーションがなくてすみそして多数の酵素／
阻害剤系に適用されうる。
この方法を用いて、阻害剤の活性についての情報を測光
的に得るために一方では色原体基質に対するそしてもう
一方では血漿試料または血清試料中の分析すべきプロテ
アーゼ阻害剤に対する酵素の競合反応が用いられうる。
この力学的方法においては予備インキュベーションおよ
び予備希釈が何ら必要々いので、従来法による確立され
た終末点法に比較して単位時間当りかなりより高い試料
処理が達成されうる。さらに、大抵の場合より少量に基
質を使用することが可能である。
基質としては特に式！ Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−ＲＩ （式中Ａは遊離のまたは保護された形態のアミノ酸の残
基であるか、はプチド化学に慣用のＮ−末端保護基であ
るかまたは水素原子でありそしてＢ、ＣおよびＤはそれ
ぞれ遊離のまたは保ごｊされたアミノ酸の残基でありそ
してＲは測光的にか、螢光測定によるかまたはルミネセ
ンス測定により測定されうる色原性のまたは発螢光性の
または発ルミネセンス性の残基であるか、または色素を
生成する反応によりＤ−Ｒ結合が加水分解されたのちに
測光的に測定されうるメルカプタンの残基である）を有
するトリまたはテトラペプチドが使用されうる。
この方法の態様の一つくおいては、阻害剤がアンチトロ
ンビンＩＩＩでありそしてプロテアーゼが［ＬＯ５〜１
好ましくは［Ｌ３〜Ｑ、５Ｕ／ｍｌの濃度のトロンビン
であり、そして基質が合成はプチド基質でありそしてヘ
パリンを含有する緩衝液が使用されるものであり、その
場合検定混合物中のヘパリン濃度はα０２〜１０単位／
ｍｌ１好ましくは２単位／ｌ１ｍ／である。
一つの態様においては基質がＨ−Ｄ−Ｐｈｅ　−Ｐｒｏ
　−Ａｒ　ｇ　−ＡＮＢＡのインプロピルアミド（ＡＮ
ＢＡ＝５−アミノ−２−ニトロ安息香酸）でありそして
０．１〜１ミリモル／Ｌ好ましくは０．１５〜０．２５
ミリモル／ｌの濃度で用いられる。しかしまた他の基質
、例えばＴｏｓ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇのｐ−ニトロ
アニリドも使用されうる。
もう一つの態様においてはプロテアーゼが０．０２〜ｔ
　ＯＵ　／ｄ、好ましくはＱ、０８〜ｌ１１１２Ｕ／＋
ｄの濃度のＸａ因子でありそして基質が０．１〜１ミリ
モル／ｌ好ましくはα１８〜Ｑ、２５ミリモル／Ｌの濃
度で用いられる。
瓶因子を用いる実施形態では、基質はＺ−Ｄ−Ｌｅｕ−
Ｇｌｙ−Ａｒｇの２−メトキシ−４−ニトロアニリドま
たはベンゾイル−１１ｅ−Ｇｌｕ　（δ−ピペリジル）
　−Ｇｌｙ−Ａｒｇの４−ニトロアニリドである。
もう一つの好ましい態様においてはプロテアーゼＣ１−
エステラーゼ（この場合阻害剤はＣＩ−不活剤である）
、プロテアーゼエラスターゼ（この場合阻害剤はα１−
アンチトリプシンである）、プロテアーゼキモトリプシ
ン（この場合阻害剤はα１−アンチキモトリプシンであ
る）、そしてプロテアーゼカリクレイン（この場合阻害
剤は血漿カリクレイン阻害剤である）が測定でき、その
場合それぞれのプロテアーゼにとって適する基質が用い
られる。
緩衝物質例えばトリス、ＨＥＰＥＳ　ｔたはＥＰＰＳが
０〜０．５モル／ｌ好ましくは０．０３〜０．１モル／
ｌの濃度で−７〜９好ましくは１８〜８．２で添加され
そして中性塩好ましくは塩化す）Ｊｌｌラム０〜０．５
モル／ｌ好ましくは１０８〜［１１５モル／ｌの濃度で
添加されうる。
基質分解速度は酸素添加の０〜２０好ましくは１２〜１
８秒後に第１回、そして３０〜３００好ましくは８０〜
１２゛０秒後に第２回目が行われる２つの時点で分解量
を測定することにより実施されるのが可能であり好都合
である。
実施例　１ トロンビン用の色原体基質を用いるアンチトロンビン逗
の測定 ａ）ベーリングベルケ（Ｂｅｈｒｉｎｇｖｅｒｋｅ）の
試験キットからのトロンビン試薬（ベーリクロム（Ｂｅ
ｈｒ　ｉ　ｃｈｒｏｍ■）、ＡＴＩ）が用いられた。こ
の試薬は声８．２のトリス緩衝液中のヒトα−トロンビ
ン（α３ＩＵ／ｓ□、およびヘパリン（２，５Ｕｓｐ／
ｗｔ）からなろ。基質としてはＨ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ
−Ａｒｇ−５−アミ、’　−２−二トロ安息香酸のイノ
プロピルアミドが用いられた。
混合物； 血　漿　　５０　ｓｔ（未希釈） 基　質　１００μＬ（濃度４ミリモル／Ａ）トロンビン
試薬　　１０００μｔ トロンビンを添加したのち４０５ｎｍでの吸光度を記録
器に記録する。種々の血漿濃度および血漿の代りに塩化
ナトリウムを用いた酵素ブランク値の吸光度／時間ダイ
ヤグラムを第１図に示す。
この図から、血漿が増量することにより曲線が強く折れ
てゆくことが見られうる。これに対しこの基質濃度では
ブランク値ははじめ完全に直線状であり、次に基質が不
足してくることにより反応速度が減少する。
血漿中のＡＴＩＩｇ菫についての定量的情報がこの曲線
から導かれつる。最も簡単なそして多くの装置に用いら
れうる方法は吸光度を２つの異なる時点、例えば１５お
よび９０秒後に測定することにある。第２図は前記した
反応混合物から得られた１５および９０秒後の吸光度の
差についての検量プロットを示す。
ｂ）　　ＡＴＩ測定に及ぼす墓ｆＮ濃度の影響第３図は
種々の基質濃度において得られる検量プロットを示す。
このものから、基質濃度が少ない場合に最高の感度が得
られることが引き出される。
Ｃ）方法の比較 病的面１２０ａＫついて簡略化された形態でのアンチト
ロンビン■測定値を従来法により測定法と比較した。第
４図はこの２つの方法が非常によく一致することを示し
ている。
実施例　２ Ｘａ因子を介するアンチトロンビンｍの測定アンチトロ
ンビンｍの測定は烏因子を介しても可能である。新規方
法がこの酵素にも適するか否か検査するために下記混合
物が選択された。
基質（Ｓ−２２２２、Ｋａｂｉ、３　ｍＭ　）　　５０
　ｐＬ血漿　５０μｔ Ｘａ因子試験　（Ｘａ因子０．ＩＵ／ｍ／）１０００μ
ｔ（ｐＨ８．０のトリス５０　ｍＭ、　Ｎａ（４１００
ｍＭ、アルブミン０．２％、ポリエチレングリコール６
ｏ０００．２％、ヘパリン１単位／ｍｌ１中） 実施例１および第１図に示されると同様にして、吸光度
／時間ダイヤグラムが得られ、このものから１５および
１０５秒後の吸光度測定により第５図に示される標準曲
線が作成されうる。
実施例　３ Ｃ１−不活化剤の測定 本新規方法を用いるＣ１−不活化剤の０１−二ステラー
ゼを介する測定は以下のようにして実施された。
血漿　１００μｔ ＩＩｔ体基質（Ｎ−α−メチルオキシ−カルボニル−榔
−カルボベンゾキシーＬ−リジルーグリシル−アルギニ
ル−ｐ−ニトロアニリド、濃度３ミリモル／ｌ）　　　
５０μｔ Ｃ１−エステラーゼ（ｐＨ７，５０の１００ｍＭ燐酸ナ
トリウム緩衝液中　２ＡＴｌｉＥ／ｄ　）　　１００μ
を種々の血漿濃度についての第１図と同様の曲線群から
得られた標準曲線を第６図に示す。
実施例　４ Ｃ１−アンチトリプシンの測定 Ｃ１−アンチトリプシンは例えば顆粒球から放出されう
るエラスターゼに対する血漿の最も重要な阻害剤である
。Ｃ１−アンチトリプシンは過剰に存在するエラスター
ゼの阻害により測定されうる。
混合物： 血漿　５０　ｓｔ 基質　（ＭｅＯ−８ｕｃ−（Ａｌａ）ｘ−ｐ−ＮＡ　２
ミリモ”／１）１００ａｔエステラーゼ（Ｓｉｇｍａ社
製品、９５Ｕ／ｓｄ）　　　５０　ｐｌ緩衝液（ｐＨ８
，２のトリス緩衝液１００ｍＭ、　ＮａＣ１１５０ｍＭ
　）　　　　　　　　　　　　　　１０００　ａｔ第７
図は実施例１と同様圧して曲線群を評価することにより
得られる一連の血漿希釈系列物についての標準曲線を示
す。
実施例　５ Ｃ１−アンチキモトリプシンの測定 α１−アンチキモ）Ｊｌプシンは細胞性プロテアーセ阻
害の原因である血漿阻害剤である。これはキモトリプシ
ンの阻沓により測定されうる。
混合物： 血漿　１０μを 基質　（Ｓ−２５８６、Ｋａｂｉ、２ｍＭ）　　５００
　ｔｓＬキモトリプシン（ｍ８．２の１００ｍＭ）リス
緩衝液および１５０　ｍＭ　ＮａＣ２中α００１Ｕ／ｄ
）　　５００　ａｔ第８図は血漿連続希釈物から得られ
る標準曲線を示す。実施例１におけると同様にして評価
される。
これら実施例により本発明による方法の利点が示される
。ＡＴＩＩ［の測定に必要な時間を比較すると、例えば
合計時間約２分間である新規方法は、分析の実施だけで
大抵約７分そして試料の予備希釈にさらに時間を必要と
する大部分の従来法に比較して相当により速やかである
ことが証明される。＃Ｘ／阻薔剤反厄の短縮は、大量の
酵素を用いることにより従来法に従って行いうるが、し
かしかかる場合非常に大量の合成基質を必要としそして
あまり良く測定できないほど反応速度が非常に高くなる
。しかしながら試料届釈の欠点は少くともＡＴＩの場合
に残存し、従って付加的な希釈工程が必要でない他の方
法に比較して測定の変動係数がより劣る。
【図面の簡単な説明】
弔１図はアンチトロンビン瓜を測定するに当り種々の血
漿濃度および血漿の代りに塩化ナトリクムを用いた酵素
ブランク値の吸光度／時間ダイヤグラムを示す。 第２図は−Ａ１図における１５および９０秒後の吸光度
の差についての検量プロットを示す。 第３図はＡＴＩを測定するに当り、種々の基質濃度にお
いて得られる検量プロットを示す。 第４図は病的血漿２０個について簡略化された形態での
アンチトロンビン■測定値を従来法による測定法と比較
した。第４図はこの２つの方法が非常によく一致するこ
とを示している。 第５図は怠因子を介してアンチトロンビンｍを測定する
に当り、第１図と同様の吸光度／時間ダイヤグラムから
１５および１０５秒後の吸光度測定により作成された標
準曲線を示す。 第６図はＣ１エステラーゼを介してＣ１−不活化剤を測
定するに当り、種々の血漿濃度についての第１図と同様
の曲線から得られた標準曲線を示す。 第７図はＣ１−アンチトリプシンを測定するに当り第１
図と同様の曲線から得られる一連の血漿希釈系列物につ
いての標準曲線を示す。 第８図はα１−アンチキモトリプシンを６１１　定−す
るに当り、血漿連続希釈物から得られる標準曲線を示す
。 特許出願人　　ベーリングヴエルケ・アクチェンゲゼル
シャフト 外２名 ＦＩＧ、１ 獣炭ＡＥ ｒｇｉＸｓＬＡＥ ↑

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １）プロテアーゼ阻害剤により阻害されうるプロテアー
    ゼ、およびこのプロテアーゼのための基質を用いて該阻
    害剤を測定するにあたり、はじめにこのプロテアーゼ阻
    害剤を含有する液体および基質を混合し、そして次にプ
    ロテアーゼを添加することにより反応を開始させそして
    基質の加水分解速度を測定することからなる方法。 ２）基質が式 I Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ−Ｒ　 I （式中Ａは遊離のまたは保護された形態のアミノ酸の残
    基であるか、ペプチド化学に慣用のＮ−末端保護基であ
    るかまたは水素原子でありそしてＢ、ＣおよびＤはそれ
    ぞれ遊離のまたは保護された、アミノ酸の残基でありそ
    してＲは測光的にか、螢光測定によるかまたはルミネセ
    ンス測定により測定されうる色原性のまたは発螢光性の
    または発ルミネセンス性の残基であるか、または色素を
    生成する反応によりＤ−Ｒ結合が加水分解されたのちに
    測光的に測定されうるメルカプタンの残基である）を有
    するトリまたはテトラペプチドである前記特許請求の範
    囲第１項記載の方法。 ３）阻害剤がアンチトロンビンIIIでありそしてプロテ
    アーゼが０．０５〜１好ましくは０．１５〜０．５Ｕ／
    ｍｌの濃度のトロンビンであり、そして基質が合成ペプ
    チド基質でありそしてヘパリンを含有する緩衝液が使用
    される前記特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４）緩衝物質例えばトリス、ＨＥＰＥＳまたはＥＰＰＳ
    が０〜０．５モル／ｌ好ましくは０．０３〜０．１モル
    ／ｌの濃度でｐＨ７〜９好ましくは７．８〜８．２で添
    加されそして中性塩好ましくは塩化ナトリウムが０〜０
    ．５モル／ｌ好ましくは０．０８〜０．１５モル／ｌの
    濃度で添加される前記特許請求の範囲第１項記載の方法
    。 ５）ヘパリンが０．０２〜１０単位／ｍｌ好ましくは２
    単位／ｍｌの濃度で添加される前記特許請求の範囲第１
    項記載の方法。 ６）基質がＨ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ＡＮＢＡ
    のイソプロピルアミドでありそして０．１〜１ミリモル
    ／ｌ好ましくは０．１５〜０．２５ミリモル／ｌの濃度
    で用いられる前記特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７）プロテアーゼが０．０２〜１．０Ｕ／ｍｌ、好まし
    くは０．０８〜０．１２Ｕ／ｍｌの濃度のＸａ因子であ
    りそして基質が０．１〜１ミリモル／ｌ好ましくは０．
    １８〜０．２５ミリモル／ｌの濃度で用いられる前記特
    許請求の範囲第１項記載の方法。 ８）基質がＺ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇの２−メト
    キシ−４−ニトロアニリドである前記特許請求の範囲第
    ７項記載の方法。 ９）プロテアーゼがＣ１−エステラーゼでありそして阻
    害剤がＣ１−不活剤である前記特許請求の範囲第１項記
    載の方法。 １０）阻害剤がα＿１−アンチトリプシンでありそして
    プロテアーゼがエラスターゼである前記特許請求の範囲
    第１項記載の方法。 １１）阻害剤がα＿１−アンチキモトリプシンでありそ
    してプロテアーゼがキモトリプシンである前記特許請求
    の範囲第１項記載の方法。 １２）阻害剤が血漿カリクレイン阻害剤でありそしてプ
    ロテアーゼがカリクレインである前記特許請求の範囲第
    １項記載の方法。 １３）酵素添加の０〜２０好ましくは１２〜１８秒後に
    第１回、そして３０〜３００好ましくは８０〜１２０秒
    後に第２回目が行われる２つの時点で分解量を測定する
    ことにより基質分解速度が測定される前記特許請求の範
    囲第１項記載の方法。
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