FI68262C - Foerfarande foer konstatering av juverinflammation - Google Patents

Description

68262

MENETELMÄ UTARETULEHDUKSEN TOTEAMISEKSI

Tämä keksintö koskee menetelmää utaretulehduksen kvantitatiiviseksi määrittämiseksi siten, että mitataan maidon 5 trypsiiniä inaktivoiva vaikutus, mikä on lisääntynyt utaretulehduksen yhteydessä. Lisääntymisen syy on lähinnä se, että maidon ^-antitrypsiini valuu verestä maitotilaan utaretulehduksessa .

Tärkeimmät nykyisin käytössä olevat utaretulehduksen 10 määritys- ja toteamismenetelmät perustuvat bakterologiaan sekä solujen lukumäärän määrittämiseen maitonäytteestä.

Näillä menetelmillä on mm. seuraavia haittapuolia: - laitteistot solujen määrittämiseen ja laskemiseen ovat kalliita, työläitä käyttää sekä vaativat runsasta 15 huoltoa. Näin ollen nykyisiä laitteita on olemassa ainoastaan kaikkein suurimmissa maitotalouden tutkimuslaboratorioissa sa (esim. Valio, Helsinki) - maitonäytteiden säilytys ja varastointi solujen laskemiseksi ja määrittämiseksi on teknisesti hankalaa ja vaa- 20 tii erityistoimenpiteitä - johtuen näytteenottoajankohdasta ja tavasta maito-näytteestä mitattavaan solujen lukumäärään vaikuttavat muutkin tekijät kuin utaretulehdus.

Mm. yllä mainituista syistä johtuen ei tähän mennessä 25 ole luotettavasti kyetty suorittamaan vedinkohtaista selvitystä utaretulehduksen esiintymisestä. Piilevän utaretulehduksen toteaminen on ollut erittäin epävarmaa. Eri yhteyksissä on arvioitu, että esim. Suomessa koko lehmäkarjasta jopa 40 % sairastaa akuuttista tai piilevää utaretu-30 lehdusta.Tämä puolestaan johtaa huomattaviin taloudellisiin menetyksiin.

Tämän keksinnön mukaisella menetelmällä trypsiini-inhibiittoripitoisuuden määrittäminen suoritetaan siten että maitonäyte kirkastetaan ja siihen lisätään tietty 35 määrä trypsiiniä sekä jotain trypsiinin määrityksessä tavanomaista substraattia, josta trypsiini vapauttaa väril- 2 68262 listä yhdistettä, jonka jälkeen mitataan optisen tiheyden mittauslaitteella ylimääräisen trypsiinin substraatista vapauttaman värillisen yhdisteen määrä.

Substraattina, josta trypsiini vapauttaa värillistä yh-5 distettä, tulee ennen kaikkea kysymykseen N-bentsoyyliargi-niini-p-nitroanilidi.

Keksinnön mukainen menetelmä utaretulehduksen mittaamiseksi on aikaisempiin menetelmiin verrattuna yksinkertainen, helppokäyttöinen ja hinnaltaan edullinen. Lisäksi menetelmal-lä on suuri kapasiteetti, jolloin lehmien systemaattinen ja yksilö- ja vedinkohtainen tutkiminen ja taudin seuranta on mahdollista. Keksinnön mukaisessa menetelmässä myös näytteiden uusi esikäsittelytapa on huomattavasti yksinkertaisempaa aikaisempaan verrattuna.

15 Menetelmä perustuu seuraavaan perushavaintoon: Kun leh mä sairastuu utaretulehdukseen, muuttuu tulehduskohdan hiussuonten seinämäsolujen läpäisevyys eli permeabiliteetti.

Tämän seurauksena utaretulehduksen yhteydessä valuu veren valkuaisaineita (ennen kaikkea pienimolekyylisiä) maitoon. Onkin 2° havaittu, että utaretulehduksen yhteydessä maidossa löytyy mm. veren albumiinia ja -^-antitrypsiiniä, jotka kuuluvat veren pienimolekyylisten valkuaisaineiden ryhmään. Antitrypsiinin esiintyminen maidossa utaretulehduksen yhteydessä on kuvattu mm. seuraavissa kirjallisuusviitteissä.

25 T. Honkanen-Buzalski, T. Katila and M. Sandholm: Milk antitrypsin, activity during clinical and experimental bovine mastitis. Acta Vet. scand. 1981 22. 300-368; T. Honkanen-Buzalski and M. Sandholm: Trypsin inhibitors in mastic milk and colostrumjcorrelation between trypsin 50 inhibitor capacity, bovine serum albumin and somatic cell contents, J. Dairy Res. 1981 48, 213-223-

Siis sekä veren albumiinin että (X^-antitrypsiinin esiintyminen maidossa ilmaisee periaatteessa utaretulehduksen ja pitoisuus on korrelaatiossa tulehduksen vakavuuteen.

55 Käytännössä veren albumiinin määrittäminen maidosta on työlästä ja vaatii mm. immunokemiallisia menetelmiä, mutta ^-antitrypsiinin määrittäminen on erittäin helppoa, koska 5 68262 se voidaan suorittaa entsymaattisesti mittaamalla maidon proteaasi-inhibiittori kapasiteettia.

Tästä syystä on kehitetty jäljempänä kuvattu utaretulehduksen määritysmenetelmä perustuen antitrypsiinin määrit-5 tämiseen maitonäytteistä juuri mainitun proteaasi-inhibiittori kapasiteetin perusteella.

Menetelmää kehitettäessä on erityisesti pidetty mielessä, että sen on sovelluttava suurten näytemäärien käsittelemiseen. Yksinkertaisimmin proteaasi-inhibiittorin aktii-10 visuus voidaan mitata sekoittamalla trypsiiniä näytteeseen ja mittaamalla ylimäärätrypsiinin proteolyyttinen aktiivisuus. Proteolyyttinen aktiivisuus voidaan mitata helposti käyttäen pienimolekyylisiä orgaanisia substraatteja, kuten N-bentsoyyliarginiini-p-nitroanilidia (BPNA).

15 Keksintöä selostetaan lähemmin seuraavassa viitaten oheisiin erään keksinnön sovellutusesimerkin mukaisiin piirustuksiin, joissa kuvio 1 esittää päältä nähtynä keksinnön mukaisessa menetelmässä käytettävää nk. mikrotiitteri-levyä ja kuvio 2 esittää graafisesti mittaustuloksia, jotka 20 on saatu keksinnön mukaisella menetelmällä.

Keksintöä voidaan soveltaa esimerkiksi seuraavalla tavalla : Näytteiden esikäsittely: 1 ml:n maitonäytteet kirkastetaan renniinillä, 0,1 ml, joka on ennalta laimennettu 25 1/50000 käyttäen 0,1 M asetaattipuskuria, pH 5,0. Kirkas taminen tapahtuu inkuboimalla maito-renniiniseosta 30 min 37 °C:ssa ja linkoamalla tai suodattamalla näytteet.

Trypsiini-inhibiittoripitoisuuden mittaamista varten kirkastetuista maitonäytteistä käytetään 0,1 ml. Kirkastetun 50 maitonäytteet annostellaan mikrotiitterilevyn kuoppiin.

Tämän jälkeen kuoppiin lisätään 0,3. ml vakioista trypsiini-liuosta (2,5 /ig/ml, liuotettuna 1 mH HCl:iin) ja 0,1 ml substraattiliuosta, joka sisältää 1 mg N-bentsoylarginiini- p-nitroanilidia (ΒΑΡΝΑ) l mgrssa tislattua vettä.

35 .....

Kussakin mikrotiitterilevyn kuopassa käsitellään yksi maitonäyte. Tämän lisäksi mikrotiitterilevyllä on tausta- 11 68262 arvojen mittaamiseksi tyhjä rivi eli ns. "blank-row" sekö vakiolaimennossarja (1, 1/2, 1/4 ... 1/64) meijereiden sekoittamasta mai dostaj joka edustaa maidon keskimääräistä laatua, ja tämän lisäksi 100 % trypsiinikontrolli.

5 Trypsiini-inhibiittorin määrän maidossa on havaittu olevan suoraan verrannollinen utaretulehduksen asteeseen, eli määrä ilmaisee tulehduksen asteen.

Näin ollen ajatuksena meijereiden sekoittaman maidon käytössä (joka edustaa lehmien keskimääräistä terveysastet-10 ta) vakiolaimennossarjana on se, että tulokset kunkin yksilön kohdalla voidaan ilmoittaa myös vertaamalla vakiolaj-mennossarjaan eli ilmoittamalla, onko ko. yksilö terveempi vai sairaampi verrattuna keskiarvoon. Tämä helpottaa huomattavasti menetelmän standardisointia.

15 Reagenssien lisäyksen jälkeen mikrotiitterilevyä in- kuboidaan 3*5 t, jonka jälkeen kuopissa muodostuvan keltaisen värin määrä mitataan nk. pystymittausperiaatteella toimivalla "Titertek Multiskanilla" (Eflab Oy, Helsinki), jonka toimintaperiaate on kuvattu esim. patenttijulkaisussa 20 GB 2030 696. Pystymittausperiaatetta on kuvattu esim. seu-raavissa julkaisuissa: Suovaniemi, O., "Performance and properties of the Finnpipette Analyzer System", Proceedings of the Second National Meeting on Biophysics and Biotechnology in Finland, Kairento, A.L., Riihimäki, E. and Tarkka, P., Eds., 25 pp. 183-187 (1976); Suovaniemi, 0., "Method for Improving the Rate and Measurement Accuracy of Chemical Analysis"; Suovaniemi, O., Järnefelt, J., "Discrete Multichannel Analysis Systems", International Laboratory, April 1982 ja American Laboratory, June 1982; sekä patenttijulkaisut FI 55093 ja 30 FI 57665.

Kuviossa 1 on esitetty näytteiden järjestäminen mikro-tiitterilevyyn. Viitenumerolla 1 on merkitty näytteitä, jotka on numeroitu 1-80. Vakiolaimennossarjaa (1/1, 1/2, 1/4 ... 1/64) on merkitty numerolla 2. Numero 3 esittää 35 100 % trypsiinikontrollia (ei maitonäytettä) ja numero 4 tyhjää riviä. Trypsiini-inhibiittorin määrittäminen maito- 5 68262 näytteestä perustuu seuraavaan biokemialliseen reaktioon: antitrypsiini /

Trypsiini +__O^N - \ O ) -NHp 5 ΒΑΡΝΑ p-nitroaniliini (värillinen yhdiste, adsorptio h05 nmrssa)

Ts. mikrotiitterilevyn kuoppaan lisätty trypsiini ba- 10 joittaa BAPNArn (substraatti) värilliseksi yhdisteeksi. Maidosta peräisin oleva antitrypsiini estää tämän reaktion inaktivoimalla trypsiinin.

Mitä enemmän maitonäytteessä on trypsiini-inhibiittoria, sitä tehokkaammin se estää trypsiinin toiminnan ja näin ollen i 5 ... , .

värin syntymisen.

Trypsiini-inhibiittorin esiintyminen maitonäytteessä on siis käntäen verrannollinen mitattavan värin voimakkuuteen.

Koska aikaisemmin on havaittu, että trypsiini-inhibiit-20 ...

torin pitoisuus maidossa on suoraan verrannollinen utaretulehduksen asteeseen, voidaan sanoa yllä kuvattuun koejärjestelyyn perustuen, ettämitä tehokkaammin maitonäyte estää värinmuodostuksen mikrotiitterilevyllä, sitä vakavammasta utaretulehduksesta on kyse.

25 . . .

Tilanne on esitetty graafisesti kuviossa 2. Siinä käyrä 5 esittää tuloksia ’'terveestä" maidosta, käyrä 6 meijerissä sekoitetusta maidosta, käyrä 7 tuloksia 1/^0 laimennetusta seerumista ja käyrä 8 "utaretulehdusmaidosta".

Menetelmää kehitettäessä on olosuhteet järjestetty sel-30 ...

laisiksi, että yksittäisistä maitonäytteistä riittää, kun suoritetaan ainoastaan yksi laimennos alueella 1/1) - 1/20 ja saatua tulosta verrataan meijerissä sekoitetulla maidolla saatuun standardikäyrään (vrt. graafinen esitys).

Valituissa koeolosuhteissa juuri tällä 2aimennoksella 35 . ...

saadaan parhaiten erot näkyviin sairaiden ja terveiden leh- 6 68262 mien välillä.

On huomattava, että meijereiden sekoittama maito (tässä tapauksessa n. 5000 lehmästä) mittaustulosten perusteella (vrt. graafinen esitys) sisältää enemmän antitrypsiiniä 5 kuin terveestä lehmästä saatu maito. Tämä onkin ymmärrettävää tällä hetkellä kun muistetaan, että n. 40 % lehmistä sairastaa utaretulehdusta, joista osa piilevänä, ja että tällä hetkellä ei ole olemassa mitään keinoa lehmien vedin- ja yksilökohtaiseen systemaattiseen seurantaan.

10 Valituissa olosuhteissa yhdellä mikrotiitterilevyllä voidaan siis käsitellä kahdeksankymmentä maitonäytettä. Yhden työpäivän aikana kyseisellä menetelmällä voi yksi henkilö käsitellä ja tulostaa n. 1000 maitonäytettä.

Tulosten käsittelyä helpottaa erityisesti se, että lo-15 vynlukija on yhdistetty tietojenkäsittelylaitteeseen, joka on ennalta ohjelmoitu käsittelemään ja tulostamaan mitattavat maitonäytteet.

Ensimmäinen laajahko tutkimus kuvattua menetelmää käyttäen tehtiin suorittamalla mittaukset 1029 lehmän maitonäyt-20 teistä.

Kuvatuilla menetelmillä mittatarkkuuden ja toistettavuuden havaittiin olevan r\. 6 % keskiarvosta. Tämä luku sisältää myös erot, jotka johtuvat mikrotiitterilevyjen välisistä eroista sekä päivästä toiseen johtuvista muutoksista. 25 Tulokset, jotka kokeissa saatiin, korreloituivat hyvin kahden muun utaretulehduksen mittaustavan kanssa (albumiinin mittaus maidossa sekä solujen laskenta).

Kun antitrypsiinin mittaukseen perustuvaa menetelmää verrataan muihin käytössä oleviin menetelmiin (esim. albu-30 miinin mittaus tai solujen laskenta), saavutetaan antitrypsiinin mittauksella eräs erittäin merkittävä lisäetu: näytteiden esikäsittely on helppoa, koska ne voidaan säilöä ja varastoida joko lisäämällä näytteisiin natriummatsidia (bak-teereiden kasvua estävä yhdiste) tai pakastamalla näytteet.

35 Kyseiset toimenpiteet eivät antitrypsiinin kohdalla (toisin kuin muiden menetelmien ollessa kyseessä) häiritse mit- 68262 7 tausta.

Helpottunut esikäsittely on oleellisen tärkeää, jotta suuria näytemääriä voidaan käsitellä. Tämä mahdollistaa myös eläin- ja vedinkohtaisen seurannan.

Edellä kuvatun mikrotiittorilevyllä tapahtuvan mittauksen sijasta voidaan käyttää myös muita fotometrijärjestelmiä, joista erityisesti mainittakoon niinikään pystymittausperiaat-teella toimiva "ff-9" -analysaattori (Labsystems Oy, Helsinki).

\