BR112013008965B1 - Método para determinação de um grau de infecção - Google Patents

Abstract

método para determinação de um grau de infecção. trata-se de um método para determinar um grau de infecção que compreende as etapas de i) preparar uma amostra não isolada adicionando-se um marcador de diferenciação, adequadamente, uma mancha metacromática tal como, por exemplo, laranja de acridina a leite de mamífero em uma quantidade suficiente para fornecer uma diferenciação entre tipos de células; ii) medir uma contagem de células somáticas diferencial na amostra por meio de um citômetro que tem um sistema de detecção sensível a diferenças no marcador de diferenciação resultantes do fato de o marcador se tornar diferentemente associado aos diferentes tipos de células na amostra; e iii) determinar uma indicação de um grau de infecção dependente da contagem de células diferencial medida.

Description

A presente invenção refere-se a um método para determinar um grau de infecção de uma contagem de células somáticas diferencial em leite de mamífero, particularmente, a tal método para determinar a presença e/ou grau de mastite e, mais particularmente, mastite bovina.

Mastite é a inflamação da glândula mamária tipicamente causada por infecção bacteriana que, dependendo do seu grau, pode causar perda severa no rendimento do leite bem como mudanças indesejáveis na qualidade do leite. Estimou-se que a perda econômica anual para os fazendeiros somente nos Estados Unidos devido à mastite bovina é superior a US$ 2 bilhões. Estima-se que uma porção substancial desse valor seja devido à mastite subclínica.

A mastite clínica é tipicamente tratada com um curso de antibióticos relativamente caro. A mastite subclínica não é necessariamente tratada com antibióticos durante a lactação. Frequentemente, as infeções subclínicas são eliminadas pelo sistema imunológico, mas a mastite subclínica pode ocasionalmente levar à mastite clínica ou permanecer como uma inflamação subclínica (mastite crônica).

A identificação de mastite, particularmente mastite bovina, é tipicamente baseada no número total de células somáticas em um volume predeterminado de leite, tipicamente usando citometria de fluxo ou imageamento para realizar a contagem de células somáticas. Quando se faz essa contagem de células somática, as células de leucócitos (glóbulos brancos) e epiteliais (pele) são tipicamente contadas sem que qualquer discriminação seja feita, particularmente entre os diferentes tipos de leucócitos presentes no leite.

A seguir, os tipos de linfócito, monócito e macrófagos de leucócitos serão chamados de leucócitos de 'Grupo A' e tipos de leucócitos polimorfonuclear ou PMN (neutrófilos, eosinófilos e basófilos) serão chamados de leucócitos de 'Grupo B'.

Em geral, entende-se que os membros do Grupo A representam cerca de 85% do número total de células somáticas 5 sob as condições normais, enquanto que os membros do Grupo B representam aproximadamente 10% das células somáticas sob as condições normais e aumentam para entre 30% e 90% da contagem de células somáticas total, dependendo do grau de mastite.

Há certo tempo se propõe que uma contagem de 10 células somáticas diferencial, que é uma medida das proporções relativas de leucócitos de Grupo A e Grupo B e mesmo a proporção de tipos de leucócitos dentro de um ou desses dois grupos, deve ser empregada como uma indicação de um ou mais dentre a presença ou grau de e/ou susceptibilidade 15 a mastite.

A contagem de células diferencial é tipicamente atingida por meio de um marcador de diferenciação, tal como uma mancha metacromática ou microesferas fluorescentes ou radioativas, que tem uma ou mais características mensuráveis 20 que variam dependendo do tipo de célula ao qual a mesma se torna associada. Um citômetro é, então, empregado para contar eventos (células) usando um sistema de detecção sensível às diferenças nessas características, tais como mudanças nas propriedades fluorescentes, para diferenciar entre os tipos 25 de células de uma maneira conhecida.

Sabe-se, por exemplo, a-- partir do documento US 2009/0233329, que para realizar uma contagem de células somáticas diferencial com o uso de "teste de esfregaço" que emprega uma câmara microfluídica em formato de cunha 30 inovadora em que é colocada uma mistura de amostra de leite e uma mancha metacromática. Aqui, 80 μl de leite são diluídos com 20 μl de uma mancha metacromática e uma pequena gota da mistura é aplicada à câmera. A identificação das células diferentes de acordo com sua coloração ou morfologia é feita tanto manual quanto automaticamente com o uso de análise de imagem. Um problema com isso é que uma nova câmara microfluídica precisa ser usada com cada teste. Além disso, a 5 altura da câmara de imagem pode causar uma indefinição da imagem que pode levar a complicações na identificação das células.

A citometria de fluxo é uma alternativa bastante conhecida para o ensaio do tipo de teste de esfregaço acima 10 descrito. Em um artigo de M. Hageltorn e M. Alaa Saad publicado em Am. J. Vet. Res., páginas 2012 a 2016, Vol. 47, n2 9, setembro de 1986, é revelado que a citometria de fluxo pode ser usada para distinguir diferentes populações de leucócitos. Aqui, uma amostra de leite fresco (com não mais 15 que 6 horas) foi diluída em um razão de 1:200 com uma solução salina hipotônica que contém 0,0004% de mancha metacromática de laranja de acridina e o ensaio é realizado com o uso de citometria de fluxo fluorescente padrão. Essa etapa de diluição é realizada para eliminar de modo eficaz a 20 possibilidade de uma coincidência das células a serem medidas e partículas de interferência (tais como partículas de gordura) no ponto de medição, mas adiciona complexidade à técnica de ensaio. Ademais, a alta diluição requer que um volume muito maior de líquido seja ensaiado antes que uma 25 contagem de células estatisticamente significante seja atingida. Isso, por sua vez, aumenta significantemente o tempo para o ensaio.

O desempenho da contagem de células somáticas diferencial com o uso de uma técnica de ensaio de citometria 30 de fluxo padrão é também descrita, por exemplo, no documento U.S. 6.979.550. Aqui, é revelado que com a finalidade de realizar a contagem de células diferencial, as células somáticas precisam ser primeiramente isoladas das partículas de interferência na amostra de leite. Isso é feito aqui através de centrifugação da amostra de leite com a finalidade de remover partículas de interferência, tais como partículas de gordura e concentrar as partículas de interesse. Uma 5 mancha fluorescente é adicionada para discriminar todas as células das partículas de interferência. A contagem de partícula é então realizada é um citômetro de fluxo padrão com o uso de um sistema de detecção de evento compatível com a mancha fluorescente empregada. A centrifugação aumenta a 10 complexidade do ensaio e em alguns casos pode até modificar a amostra de modo que a mesma não seja mais representativa do conjunto.

É um objetivo da presente invenção resolver pelo menos um dos problemas associados às técnicas de ensaio de 15 citometria conhecidas para contagem de células somáticas diferencial.

Consequentemente, a presente invenção fornece um método para determinar um grau de infecção que compreende as etapas de i) preparar uma amostra não isolada adicionando-se 20 um reagente que contém um marcador de diferenciação, tal como mancha metacromática, microesferas fluorescentes ouradioativas, em uma quantidade suficiente para fornecer uma diferenciação entre os tipos de células para leite de mamífero para diluir a mesma em uma faixa menor que 1:200, 25 preferencialmente menor que 1:50 e com a máxima preferência menor que 1:5; ii) medir uma contagem de células somáticas diferencial na amostra por meio de um citômetro de fluxo que tem um sistema de detecção sensível às diferenças no marcador de diferenciação resultante do marcador que se torna 30 diferentemente associado aos diferentes tipos de células na amostra; e iii) determinar uma indicação de um grau de infecção dependente da contagem de células diferencial medida.

Assim, descobriu-se de forma surpreendente que a escolha judiciosa da quantidade de marcador de diferenciação adicionado a uma amostra, um ensaio de citômetro tem a capacidade de ser realizado em uma amostra não isolada, 5 essencialmente não diluída, com a finalidade de fazer uma medição de contagem de células somáticas diferencial através de monitoramento da(s) característica(s) de diferenciação do próprio marcador, cujos resultados podem ser usados para determinar uma indicação do grau de infecção de mastite. O 10 desvio dessa (s) característica(s) de diferenciação de uma norma e/ou a extensão de desvio pode ser usado para identificar a existência de, estágio de e/ou probabilidade de contrair mastite.

De modo útil, a indicação do grau de infecção pode 15 incluir a identificação de um ou mais dentre a presença, probabilidade ou nível de mastite. Tal identificação pode ser empregada em várias decisões de gerenciamento de gado tais como a ordem de ordenha de acordo com o status de mastite, melhor lavagem da garra de ordenha após ordenhar uma vaca 20 infectada ou com o uso de uma garra de ordenha separada para vacas infectadas, com a finalidade de diminuir o risco de infecção vaca para vaca; agrupamento de vacas com mastite subclínica, com a finalidade de diminuir o risco de infecção de vaca para vaca; prever se uma infecção de mastite 25 subclínica evoluirá para um caso clínico e consequentemente identificar aquelas vacas.suscetíveis a se beneficiar com o tratamento antibiótico; e seleções de abate e alimentação.

A presente invenção será agora ilustrada a título de exemplos não limitadores e com referência aos desenhos das 3 0 Figuras anexas em que:

A Figura 1 mostra uma plotagem de pontos de intensidade de dispersão lateral versus fluorescência verde através de citometria de fluxo em uma amostra de leite em que as células são marcadas de acordo com a presente invenção;

A Figura 2 mostra uma plotagem de pontos de fluorescência vermelha versus verde da região em mosaico ilustrada na Figura 1;A Figura 3 mostra uma plotagem de pontos defluorescência vermelha versus verde da região em mosaico ilustrada na Figura 2 em que as populações de célula diferentes são identificadas;

A Figura 4 mostra um gráfico de % de PMN medida noDia 0 (leite fresco) versus % de PMN medida nos dias subsequentes com o uso de um método de acordo com a presente invenção;

A Figura 5 mostra uma típica plotagem de ponto não controlado de fluorescência vermelha versus verde através de 15 citometria de fluxo em uma amostra de leite preparada de acordo com os valores da Tabela 2;

A Figura 6 mostra uma plotagem de pontos de fluorescência vermelha versus verde proveniente de uma amostra de leite manchada com uma concentração relativamente 20 baixa de laranja de acridina;

A Figura 7 mostra uma plotagem de pontos de fluorescência vermelha versus verde que ilustra o efeito da adição de EDTA a uma amostra manchada com uma concentração conforme empregada na Figura 5;

A Figura 8 mostra uma plotagem de pontos devermelho versus verde antes da adição de. PBS.;.._.eA Figura 9 mostra os efeitos da adição de PBS. EXEMPLO 1

Uma quantidade de 50 μl de leite frio e preservado3 0 (com abas de BSM II) proveniente de uma vaca individual étransferida em um tubo de Eppendorf. 5 0 μl de laranja de acridina em PBS (1 mg/ml) e 10 μl de Na2H2EDTA (0,1 g/ml, pH=7) são adicionados a um reagente de cada vez e misturadas.

Adicionalmente, 100 μl de PBS são então adicionados à mistura acima mencionada e misturados. Após reagir por 1 a 2 minutos em temperatura ambiente, a mistura foi medida em um citômetro de fluxo padrão. Nesse citômetro de fluxo, e somente a título 5 de exemplo, a amostra flui além da região de detecção com uma velocidade de 14 μl/min. Visto gue o marcador de diferenciação é uma mancha metacromática, tipos de células podem ser diferenciados com o uso de fluorescência de célula. A mancha empregada no presente exemplo é laranja de acridina 10 e, assim, a fluorescência é, no presente exemplo, excitada por um laser azul (488 nm) com as intensidades de verde (aqui designadas FL1 -H) e vermelho (aqui designadas FL2-H) que são monitorados. Um valor de FL1-H de 400.000 é usado como sinal de disparo. Na presente disposição, sinais de dispersão de 15 luz são também adquiridos e a intensidade da luz de dispersão lateral (aqui designada SSC-H) é, de modo vantajoso, empregada para reduzir ruído (isto é, sinais não relacionados às células a serem contadas) do sinal adquirido.

Para análise de dados, a dispersão lateral versus 20 fluorescência verde é plotada e é mostrada na Figura 1. Nessa plotagem, um mosaico é desenhado para definir onde na plotagem os eventos de interesse, nesse exemplo, as células estão localizadas. As partículas que mostram sinais de dispersão lateral significante (SSC-H), mas sinais de 25 fluorescência verde relativamente baixos (FL1 -H) , podem ser prontamente identificadas como nãointeressantes e eliminadas a partir de análise adicional. Os parâmetros exatos para o mosaico podem ser prontamente determinados pelo indivíduo versado com o uso de técnicas padrão conhecidas na técnica de 30 citometria de fluxo.

Assim, partículas de ruído são eliminadas ou pelo menos reduzidas significantemente. Essa região em mosaico é identificada como P4 e, no presente exemplo, representa 52,6% do número total de eventos contados.

Os eventos em mosaico P4 são então plotados em uma plotagem de fluorescência vermelha (FL2-H) versus verde (FL1 -H) conforme ilustrado na Figura 2. De modo útil, mas não 5 essencial, nessa plotagem, um segundo mosaico é desenhado para definir onde na plotagem, os eventos de interesse (células) estão localizados e assim as partículas de ruído adicionais são eliminadas. Essa região em mosaico é identificada como Pll e, no presente exemplo, representa 10 96,4% do número total de eventos contados na região emmosaico P4 e corresponde a uma contagem de células somáticas total de 450.000 células por mililitro (células /ml). Essa plotagem pode ser empregada na determinação da porcentagem de células pertencentes aos Grupos A e B, no entanto o mosaico 15 que preferencialmente define todas as células n região Pll da Figura 2 é então subdividido em regiões que definem diferentes populações de célula com base nas razões relativas de fluorescência detectada nos comprimentos de onda característicos da mancha metacromática empregada, aqui 20 laranja de acridina com intensidades fluorescência vermelha/verde associada (FL2-H/FL1-H). A região Pll da Figura 2 está na presente Figura 3 identificada como P2. As regiões de diferentes tipos de células são ilustradas como P5, P6, P7 e P8 na Figura 3 e, a partir da observação visual, 25 consideraram-se mais prováveis de ser compostas de monócitos (Grupo A) ; PMN (Grupo B) ; linfócitos (Grupo A) e macrófagos (Grupo A) respectivamente. Uma vez que essas correlações visuais foram feitas, as razões de fluorescênciacaracterística associadas a essas regiões podem ser30 empregadas em análise futura sem depender da etapa de identificação visual.

O número de eventos na região P6 que define a assim chamada região celular do Grupo B (ou PMN) na Figura3 é dividido pelo número total de células e multiplicado por 100 para obter a % do Grupo B (PMN) que, no presente exemplo, é 78,2%.

Com a finalidade de estabelecer uma indicação do5 grau de infecção a partir desse resultado, uma comparação pode ser feita com valores de referência estabelecidos com o uso de leite proveniente de vacas com um grau de infecção conhecido. Essa comparação pode ser feita matematicamente com o uso de técnicas . de regressão ou quimiométricas10 convencionais aplicadas aos valores de referência com a finalidade de estabelecer uma relação matemática entre a contagem de células e o grau de infecção. O resultado de uma amostra desconhecida pode então ser processado em um processador de dados com o uso da relação matemática15 previamente estabelecida com a finalidade de chegar a uma indicação do grau de infecção da vaca desconhecida. Alternativamente, as faixas de contagens celulares podem ser indexadas contra o diagnóstico de mastite e as contagens celulares medidas são então comparadas às faixas a fim de20 fornecer uma indicação de um grau de infecção. Isso é ilustrado somente a título de exemplo na Tabela 1 abaixo e pode ser realizado tanto manual como automaticamente por meio de um processador de dados.

Assim, no presente exemplo, um valor de PMN de 78%,juntamente com a contagem de células somáticas total de 450.000 indica mastite subclínica. Será verificado por aqueles versados na técnica que a indicação do grau de 5 infecção pode ser então apresentada a um usuário de vários modos diferentes sem se afastar da invenção conforme reivindicada, tal como SIM/NÃO para a presença de um ou ambas mastite e mastite subclínica ou conforme um nível de infecção ou conforme previsão de contrair mastite.10 EXEMPLO 2

O leite proveniente de uma vaca individual é preservado (com abas de BSM II) e aquecido a 40°C antes da análise. Um volume de 50 μl de leite é transferido em um tubo de Eppendorf. 16 0 μl de um reagente de laranja de acridina 15 (0,3 mg/ml de laranja de acridina e 0,03 mg/ml de Na2H2EDTAem PBS) são adicionados e misturados. Após reagir por um minuto em temperatura ambiente, a mistura foi medida no citômetro de fluxo padrão usado no Exemplo 1. No citômetro de fluxo, a amostra é medida com uma velocidade de 100 μl/min e 20 é novamente excitada por um laser azul (488 nm) . Um valor de FL1-H de 200.000 é usado como sinal de disparo. Os sinais fluorescentes (FL1-H, FL2-H) e sinais de dispersão de luz (dispersão lateral, SSC-H) são novamente adquiridos.

A análise de dados é similar à usada no Exemplo 1, 25 os resultados são os mesmos, indicando um nível de PMN de cerca de 78,2%. Isso ilustra que o método de acordo com a presente invenção é bastante adequado à aplicação industrial (em oposição à pesquisa) uma vez que as velocidades de fluxo podem ser realizadas relativamente altas e os aditivos podem 30 ser pré-misturados e adicionados como um único reagente sem perda significante na precisão da previsão. Com o uso dos mesmos parâmetros experimentais, asmedições foram feitas em nove amostras adicionais e asmedições repetidas após um dia (Dia 1 na Figura 4) enovamente após três dias (Dia 3 na Figura 4) . Os resultados5 são ilustrados na Figura 4 e mostram que os resultados da medição do Dia 1 são comparáveis aos resultados obtidos quando a amostra estava fresca (Dia 0 na Figura 4) e que, após três dias, os valores medidos são somente ligeiramente menores que os do Dia 1 (e fresca)., Isso indica que o método 10 de acordo com a presente invenção pode ser utilizável para determinar uma indicação de um grau de infecção mesmo em amostras preservadas por até três dias. Isso é uma vantagem quando se usa o método para medir amostras de leite recebidas em um laboratório central provenientes de produtores de leite 15 distantes. Nesse caso, as amostras recebidas são amostras tipicamente preservadas de um ou dois dias. Ademais, isso indica que o método também pode ser utilizável para distinguir células viáveis, uma vez que a mortalidade aumenta com a idade.20 É um recurso essencial da presente invenção que umaquantidade apropriada de marcador de diferenciação, por exemplo, mancha metacromática de laranja de acridina, seja adicionada a uma amostra que é suficiente para permitir a diferenciação de célula somática com o uso de citometria de 25 fluxo, mas que não dilui de modo adverso a amostra fornecendo-se um efeito de separação conforme discutido acima. Um nível apropriado pode ser determinado empiricamente com o uso de julgamento razoável e erro, através de inspeção visual das plotagens de ponto apropriadas conforme será 30 descrito abaixo somente a título de exemplo:

Os seguintes reagentes foram preparados: 1 mg/ml de laranja de acridina em PBS, 0,1 g/ml de Na2H2EDTA (pH=7) e PBS de força normal. Uma amostra de leite com diferentes tipos de células é usada e misturada com os reagentes com o uso das seguintes combinações:

Após reagir por 1 a 2 minutos à temperatura5 ambiente, cada combinação é medida no citômetro de fluxo padrão usado nos Exemplos 1 e 2 essencialmente da maneira descrita nos Exemplos 1 e 2 acima. No citômetro de fluxo, a amostra é medida com uma velocidade de 14 μl/min e é excitada por um laser azul (488 nm) . Um valor de FL1-H de 400.000 é 10 usado como sinal de disparo. Os sinais fluorescentes (FL1-H, FL2-), e sinais de dispersão de luz (dispersão lateral, SSC- H) são usados.

Para a análise de dados, a fluorescência vermelha versus verde (FL2-H versus FL1-H) é plotada e os resultados 15 são ilustrados na Figura 5. Quando se usa 2 μl ou 10 μl de laranja de acridina, somente uma população de célula é vista nas plotagens (Figura 6), isto é, baixas concentrações de laranja de acridina não fornecem diferenciação suficiente. Em contraste, no presente as diversas populações são vistas na plotagem quando se usa 50 μl de laranja de acridina (consulte 5 Figura 5.).

Quando alta concentração de laranja de acridina é combinada com EDTA, a população muito densa move-se para a - direita, isto é, as intensidades da fluorescência verdedessas células aumentam (Figura 7) quando comparada àquelas 10 que são ilustrada na Figura 5.

Adicionar PBS à amostra diminui o nível de ruído, isto é, conforme mostrado na Figura 8 e na Figura 9, é mais fácil separar células de ruído. O ruído é a população em formato de cunha na parte esquerda das plotagens. Na plotagem 15 da Figura 8 (a amostra sem PBS) , a população de ruído sobrepõe uma das populações de célula. Na plotagem da Figura 9 (a amostra com PBS), a população de ruído é melhor separada de uma das populações de célula.

Pode-se concluir a partir disso que as20 concentrações de laranja de acridina maiores que cerca de 0,2 mg/ml proporciona diferenciação adequada. A quantidade de reagente (tanto como um reagente único ou reagentes individuais adicionados separadamente) que pode ser adicionada à amostra sem causar efeitos de diluição não . 25 desejados pode ser determinada através da consideração de umganho ótimo para um sistema que emprega ó presente método na análise de rotina. Essa quantidade precisa fornecer uma diluição menor que 1:200, preferencialmente, menor que 1:50 e, com a máxima preferência, menor que 1:5.

Apesar de essa determinação experimental serilustrada com referência a laranja de acridina, será verificado que seguindo uma série de medições, razoavelmente espera-se que o indivíduo versado possa determinar uma faixa adequada de marcador de diferenciação para empregar no método de acordo com a presente invenção. Será adicionalmente verificado que embora o método tenha sido descrito em relação às medições de citometria de fluxo de intensidades 5 fluorescentes relativas como uma medição de diferenciação para células, outras medições de diferenciação podem ser empregadas dependendo da natureza do marcador de diferenciação empregado.

Claims (6)

1. MÉTODO PARA DETERMINAR UM GRAU DE INFECÇÃO POR MASTITE, caracterizado por compreender as etapas de:(i) preparar uma amostra não isolada de leite de mamífero no qual células somáticas são não isoladas de partículas de interferência adicionando-se um reagente que compreende um marcador de diferenciação de mancha metacromática em uma quantidade suficiente para fornecer uma diferenciação entre tipos de células somáticas em leite de mamífero em uma razão de diluição menor que 1:200;(ii) medir uma contagem de células para cada um dentre um ou mais tipos de leucócitos de célula somática selecionado do grupo de linfócito, monócito, macrófago e tipos polimorfonucleares de leucócitos diferenciados pelo marcador por meio de um citômetro de fluxo que tem um sistema de detecção sensível às diferenças no marcador de diferenciação resultante do marcador se tornar diferentemente associado a diferentes tipos de células na amostra; e(iii) determinar uma indicação de um grau de infecção por mastite dependente da porcentagem de tipos de tipos polimorfonucleares de leucócitos no número total de células medidas como uma contagem de células medidas através da comparação da contagem de células medidas com um ou mais valores de referência, sendo que cada um é predeterminado para ser associado a um ou mais graus de infecção por mastite.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender uma etapa adicional de medição de uma contagem total de células somáticas e em que a etapa de determinação de uma indicação compreende adicionalmente comparar a contagem total de células somáticas medidas com um ou mais valores de referência, sendo que cada um é predeterminado para ser associado a um ou mais graus de infecção por mastite.

3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo leite de mamífero ser leite bovino e em que a determinação de uma indicação de um grau de infecção por mastite compreende determinar uma indicação de um ou ambos a presença e grau de mastite.

4. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela indicação de um grau de mastite compreender determinar uma indicação de um ou ambas a presença e grau de mastite subclínica.

5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 ou 4, caracterizado por um grau de infecção indicativo de uma probabilidade de desenvolver mastite clínica ser determinado.

6. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela mancha metacromática ser laranja de acridina em uma concentração maior que 0,2 mg/ml.

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