NO20130484A1 - Fremgangsmate for bestemmelse av graden av infeksjon - Google Patents

Abstract

Det er beskrevet en fremgangsmåte for å bestemme en grad av infeksjon, innbefattende trinnene med å i) fremstille en ikke-isolert prøve ved tilsetting av en differensierende markør, passende en metakromatisk farge så som for eksempel acridin orange til pattedyrsmelk i en tilstrekkelig mengde til å erholde en differensiering mellom celletyper; ii) måle et differensialt somatisk celletall i prøven ved hjelp av et cytometer med et deteksjonssystem som er sensitivt for forskjellig i den differensierende markøren som er resultatet av at markøren blir forskjellig forbundet med ulike celletyper i prøven; og iii) bestemme en indikasjon for en grad av infeksjon avhengig av det målte differensielle celletallet.

Description

FREMGANGSMÅTE FOR BESTEMMELSE AV GRADEN AV INFEKSJON.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å bestemme graden av infeksjon fra et differensielt somatisk celletall i melk fra pattedyr, spesielt en fremgangsmåte for å bestemme nærvær og/eller graden av mastitt om mest spesielt bovin mastitt.

Mastitt er betennelse i brystkjertelen til et pattedyr som typisk er forårsaket av bakterieinfeksjon som, avhengig av graden, kan medføre betydelig tap av melkeproduksjon så vel som uønskede endringer av melkens kvalitet. Det har blitt anslått at de årlige økonomiske tapet for bønder i USA alene på grunn av bovin mastitt overstiger $ 2 milliarder. En betydelig andel av dette er anslått å skyldes subklinisk mastitt.

Klinisk mastitt blir typisk behandlet med en relativt kostbar antibiotikabehandling. Subklinisk mastitt blir ikke nødvendigvis behandlet med antibiotika under melkeproduksjonen. Subkliniske infeksjoner blir fjernet av immunsystemet, men subklinisk mastitt kan ofte lede til klinisk mastitt eller bli igjen som en subklinisk infeksjon (kronisk mastitt).

Identifikasjon av mastitt, spesielt bovin mastitt, er typisk basert på det totale antallet somatiske celler i et forutbestemt volum med melk, typisk ved bruk av enten billedanalyse eller strømningscytometri for å få frem det somatiske celletallet. Ved utførelse av denne somatiske celletellingen blir det typisk talt leukocytter (hvite blodceller) og epitelial (hud) celler blir typisk talt uten det gjøres noen diskriminering spesielt mellom de forskjellige typene av leukocytter som er tilstede i melke.

I det følgende vil lymfocytten, monocytten og makrofagtyper av leukocytt bli betegnet som "Gruppe A" leukocytter og polymorfonukleære eller PMN (neutrofiler, eosinofiler og basofiler) typer av leukocytt bli betegnet som "Gruppe B" leukocytter.

Det er generelt forstått at Gruppe A medlemmer står for ca. 85 % av det totale antallet somatiske celler under normale betingelser, mens Gruppe B medlemmer står for tilnærmet 10 % av de somatiske cellene under normale betingelser og øker til mellom 30 % og 90 % av det totale antallet somatiske celler, avhengig av graden av mastitt.

Det har lenge vært foreslått at et differensielt somatisk celletall, som er et mål for de relative andelene av Gruppe A og Gruppe B leukocytter og til og med andelene av typene av leukocytter innen den ene eller begge disse gruppene, kunne anvendes som en indikasjon på en eller flere av nærværet eller graden av og/eller mottakeligheten for mastitt.

Differensiell celletelling blir typisk erholdt ved hjelp av en differensierende markør, så som en metakromatisk farging eller fluorescent eller radioaktive mikrokuler, som har en eller flere målbare karakteristika som varierer avhengig av typen celler de blir forbundet med. Det blir så benyttet et cytometer for å telle hendelser (celler) ved bruk av et deteksjonssystem som er sensitivt overfor forskjellene i disse karakteristikaene, så som endringer av fluorescerende egenskaper, for å differensiere mellom celletypene på en kjent måte.

Fra US 2009/0233329 er det for eksempel kjent å utføre en differensiell somatisk celletelling ved bruk av en "smøre test" som anvender et nytt, kileformet mikrofluid kammer i hvilket det anbringes en blanding av en melkeprøve og en metakromatisk farge. Her blir 80 ul melk fortynnet med 20 ul av en metakromatisk farge og en liten dråpe av blandingen blir tilført til kammeret. Identifikasjon av de forskjellige cellene i henhold til deres farging eller morfologi blir gjort enten manuelt eller automatisk ved bruk av billedanalyse. Et problem med dette er at et nytt mikrofluid kammer må brukes for hver test. Videre kan høyden til billedkammeret medføre en uskarphet i bildet som kan føre til komplikasjoner ved identifisering av cellene.

Strømningscytometri er et velkjent alternativ til den ovenfor beskrevne smøretest typen analyser. I en artikkel av M. Hageltorn og M. Alaa Saad publisert i Am. J. Vet. Res., s. 2012-2016, Vol. 47, No. 9, september 1986 er det beskrevet at strømningscytometri kan brukes for å skjelne mellom ulike leukocytt populasjoner. Her ble en fersk melkeprøve (ikke mer enn 6 timer gammel) fortynnet i et forhold på 1:200 med en hypoton saltvannsløsning inneholdende 0,0004 % acridin orange metakromatisk farge og analysen ble utført ved bruk av standard fluorescent strømningscytometri. Dette fortynningstrinnet ble utført for effektivt å eliminere muligheten for et sammentreff av cellene som skulle måles og påvirkende partikler (så som fettpartikler) ved målepunktet, men gjør analyseprosessen mer kompleks. Videre krever den høye fortynningsgraden at det analyseres et mye større væskevolum før det kan erholdes et statistisk signifikant celletall. Dette vil i sin tur øke analysetiden i betydelig grad.

Ytelsen til differensiell somatisk celletelling som anvender en standard strømningscytometri analyseteknikk er også beskrevet for eksempel i US 6,979,550. Her er det beskrevet at for å kunne utføre den differensielle celletellingen må de somatiske cellene første isoleres fra påvirkende partikler i melkeprøven. Dette gjøres her ved å sentrifugere melkeprøven for å fjerne påvirkende partikler så som fettpartikler og konsentrere partiklene av interesse. En fluorescerende farga blir tilsatt for å diskriminere alle celler fra påvirkende partikler. Partikkeltellingen blir deretter utført i et standard strømningscytometer ved bruk av et deteksjonssystem som er kompatibelt med den fluorescerende fargen som benyttes. Sentrifugeringen øker kompleksiteten til analysen og kan i visse tilfeller til og med modifisere prøven slik at den ikke lenger er representativ som et hele.

Et mål med foreliggende oppfinnelse er å ta opp minst et av problemene forbundet med kjente cytometriske analyseteknikker

For differensiell somatisk celletelling.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer derfor en fremgangsmåte for bestemmelse av en grad av infeksjon innbefattende trinnene med å i) preparere en ikke-isolert prøve ved tilsetning av en reagens inneholdende en differensierende markør, så som metakromatisk farge, fluorescerende eller radioaktive mikrokuler, i en tilstrekkelig mengde til å erholde en differensiering mellom celletyper av pattedyrsmelk ved å fortynne den i et område mindre enn 1:200, fortrinnsvis mindre enn 1:50 og mest foretrukket mindre enn 1:5, ii) måle et differensielt somatisk celletall i prøven ved hjelp av et strømningscytometer med et deteksjonssystem som er sensitivt for differanser i den differensierende markøren som er resultatet av at markøren blir forbundet forskjellig med forskjellige celletyper i prøven; og iii) bestemme en indikasjon av en grad av infeksjon avhengig av det målte differensielle celletallet.

Oppfinnerne har derfor overraskende funnet at ved et skjønnsomt valg av mengden differensierende markør tilsatt til en prøve, kan det utføres en cytomet4ri analyse på en ikke-isolert, i det vesentligste ikke-fortynnet, prøve for å utføre en differensiell somatisk celletallsmåling ved måling av de differensierende karakteristika til selve markøren, hvor resultatet av dette kan brukes til å bestemme en indikasjon for en grad av mastittinfeksjon. Avviket til disse differensierende karakteristika fra en norm og/eller graden av avvik kan brukes til å uidentifisere nærværet av, graden av og/eller sannsynligheten for å få mastitt.

Indikasjonen på infeksjonsgard kan passende også innbefatte identifikasjon ev en eller flere av nærværet, sannsynligheten eller nivået av mastitt. En slik indikasjon kan anvendes for et mangfold flokkhåndteringsbeslutninger så som melkerekkefølgen i henhold til mastitt-status, bedre spyling av melkeutstyret detter melking av en infisert ku eller bruk av separat melkeutstyr for infiserte kuer, for å redusere faren for spredning av infeksjon fra ku til ku; gruppere kuer med subklinisk mastitt for å redusere infeksjonsfaren mellom kuene; forutsi om en subklinisk mastittinfeksjon vil kunne utvikle seg til et klinisk tilfelle og derved identifisere de kuene som vil kunne nyte godt av antibiotikabehandling; og utvelgelses- og oppdrettsvalg.

Foreliggende oppfinnelse vil bli mer detaljert forklart ved hjelp av ikke-begrensende eksempler og med henvisning til de medfølgende tegninger hvor:

Fig. 1 viser et punktplott av sidespredningsintensitet som funksjon av grønn fluorescens ved strømningscytometri av en melkeprøve hvor cellene er markert i henhold til foreliggende oppfinnelse; Fig. 2 viser et punkplott av rød vs. grønn fluorescens av det utvalgte (gated) området i fig. 1; Fig. 3 viser et punktplott av rød vs. grønn fluorescens av det utvalgte området i fig. 2 hvor forskjellige cellepopulasjoner er identifisert; Fig. 4 viser en kurve av & PMN målt på Dag 0 (fersk melk) vs. % PMN målt på etterfølgende dager ved bruk av fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse; Fig. 5 viser et typisk ikke-utvalgt (ungated) punktplott av rød vs. grønn fluorescens ved strømningscytometri i en melkeprøve preparert i henhold til verdiene i tabell 2; Fig. 6 viser et punktplott av rød vs, grønn fluorescens fra en melkeprøve farget med en relativt lav konsentrasjon av acridin orange; Fig. 7 viser et punktplott av rød vs. grønn fluorescens som viser effekten av tilsetning av EDTA til en prøve farget med en konsentrasjon som anvendt i fig. 5;

Fig. 8 viser et punktplott av rød vs. grønn før PBS blir tilsatt; og

Fig. 9 viser effektene av tilsetning av PBS.

EKSEMPEL 1

En mengde på 50 ul kald og konservert (med BSM II tabs) melk fra en individuell ku blir overført til et Eppendorf rør. 50 ul acridin orange i PBS (1 mg/ml) og 10 ul Na2H2EDTA (0,1 g/ml, pH = 7) blir tilsatt en reagens av gangen og blandet. Videre blir det deretter tilsatt 100 ul PBS til blandingen over og blandet. Etter reaksjon i 1-2 minutter ved romtemperatur, ble blandingen målt på et standard cytometer, og som et eksempel, strømmer prøven forbi deteksjonsområdet med en hastighet på 14 ul/min. Siden den differensierende markøren er en metakromatisk farge kan celletypene differensieres ved bruk av cellefluorescens. Fargen som ble benyttet i foreliggende eksempel er acridin orange og fluorescensen blir i foreliggende eksempel eksitert av en blå laser (488 nm) hvor intensitetene til grønt (her angitt FL 1-H) og rød (her angitt FL2-H) ble målt. En FL1 -H verdi på 400,000 ble brukt som et triggersignal. I det foreliggende arrangementet blir det også innsamlet lysspredningssignaler og intensiteten til sidespredningslys (her betegnet SSC-H) blir fordelaktig anvendt til å redusere støy (det vil si signaler som ikke er relatert til cellene som skal telles) fra de innhentede signalene. For dataanalyse blir sidespredning vs. grønn fluorescens plottet og er vist i fig. 1. I dette plottet er det avmerket et område for å definere hvor i plottet hendelsene av interesse, i dette eksempelet celler, er plassert. Partikler som viser signifikant sidespredning (SSC-H) signaler men relativt lav grønn fluorescens (FL1 -H) signaler kan lett identifiseres som uinteressante og fjernes fra analysen. De nøyaktige parameterne for avgrensningen (gate) kan lett bestemmes av fagmannen ved å bruke standard teknikker som er kjent innen området med strømningscytometri.

Støypartiklene blir derved eliminert eller i hvertfall betydelig redusert. Dette avgrensede området er identifisert som P4 og representerer i foreliggende eksempel 52,6 % av det totale antallet talte hendelser.

3De avgrensede hendelsene P4 blir deretter plottett i et rødt (FL2-H) vs. grønt (FL1-H) fluorescens plot som vist i fig. 2. Anvendelig, men ikke essensielt, blir det i dette plottet trukket en andre avgrensning for å definere hvor i plottett hendelsene av interesse (celler) er beliggende og ytterligere støypartikler blir derved eliminert. Dette avgrensede området er definert som P11 og i foreliggende eksempel representerer dette 96,4 % av det totale antallet opptalte hendelser i det P4 avgrensede området og korresponderer med et totalt somatisk celletall på 450,000 celler per milliliter (celler(ml). Dette plottet kan anvendes ved bestemmelsen av prosentandelen celler som tilhører Gruppe A og B. fortrinnsvis blir imidlertid avgrensningen som definerer alle cellene i P11 området i fig. 2 deretter nok en gang oppdelt i områder som definerer

forskjellige cellepopulasjoner basert på de relative forholdene av fluorescens detektert ved bølgelengder karateristiske for den metakromatiske fargen som brukes, her acridin orange med tilhørende rød/grønn (FL2-H/FL1-H) fluorescensintensiteter. P11 området fra fig. 2 er i foreliggende fig. 3 definert som P2. Områdene med forskjellige celletyper er illustrert so P5, P6, P7 og P8 i fig. 3 og er utfra visuelle observasjoner ansett å sannsynligvis bestå henholdsvis av monocytter (Gruppe A); PMN (Gruppe B); lymfocytter (Gruppe A) og makrofager (Gruppe A). Med en gang disse visuelle korrelasjonene har blitt gjort, kan forholdene mellom karakteristisk fluorescens forbundet med disse områdene anvendes ved fremtidige analyser uten å måtte være avhengig av trinnet med visuell identifikasjon.

Antallet hendelser i området P6 som definerer det såkalte Gruppe B (eller PMN) celleområdet i fig. 3 blir oppdelt med totalt antall celler og multiplisert med 100 for "å erholde prosentandelen Gruppe B (PMN) som i foreliggende eksempel er 78,2 %.

For å erholde en indikasjon på graden av infeksjon fra dette resultatet, kan det gjøres en sammenligning med referanseverdier erholdt ved bruk av melk fra kuer med en kjent infeksjonsgrad. Denne sammenligningen kan deretter gjøres matematisk ved bruk av konvensjonell regresjon eller kjemometriske teknikker som anvendes på referanseverdiene for å etablere et matematisk forhold mellom celletall og infeksjonsgrad. Resultatet fra en ukjent prøve kan deretter behandles i en datamaskin ved bruk av tidligere etablerte matematiske forhold for å kunne komme frem til en indikasjon på graden av infeksjon hos den ukjente kuen. Alternativt kan områder for celletall indekseres mot mastittdiagnose og det målte celletallene kan deretter sammenlignes med områdene for å gi en indikasjon på infeksjonsgraden. Dette er vist som et eksempel i tabell 1 under og kan gjøres enten manuelt eller automatisk ved hjelp av en datamaskin.

I foreliggende eksempel indikerer derved en PMN verdi på 78 %, sammen med det totale somati8ske celletallet på 450,000 subklinisk mastitt. En fagmann vil kunne innse at indikasjonen av graden av infeksjon deretter kan presenteres for en bruker på mange forskjellige måter uten å avvike fra oppfinnelsen slik den er angitt i kravene, så som JA/NEM til nærvær av en eller begge av mastitt og subklinisk mastitt eller som et nivå for infeksjon eller som et anslag for å få mastitt.

EKSEMPEL 2

Melk fra en individuell ku blir konservert (med BSM II tabs) og oppvarmet til 40 °C før analyse. Et volum på 50 ul melk blir overført til et Eppendorf rør. 160 ul an en acridin orange reagens (0,3 mg/ml acridin orange og 0.03 mg/ml Na2H2EDTA i PBS) ble tilsatt og blandet. Etter reaksjon i et minutt ved romtemperatur ble blandingen målt på det standard strømningscytometeret som ble brukt i eksempel 1. I strømningscytometeret blir prøven målt med en hastighet på 100 ul/min og blir igjen eksitert av en blå laser (488 nm). En FL1-H verdi på 200,000 blir brukt som triggersignal. Fluorescens signaler (FL1-H, FL2-H og lysspredningssignaler (sidespredning, SSC-H) blir igjen innhentet.

Dataanalysen er lik den som ble brukt i eksempel 1 og resultatene er de samme, hvilket indikerer et PMN nivå rundt 78,2 %. Dette illustrerer at fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse er vel egnet for industriell (i motsetning til forskning) applikasjoner siden strømningshastighetene kan være relativt høye og additivene kan være forblandet og tilsatt som et enkelt reagens uten signifikant tap av fortsigbar nøyaktighet.

Ved å bruke samme eksperimentelle parametre ble det utført målinger på ytterligere ni prøver og målingene ble gjentatt etter en dag (Dag 1 i fig. 4) og igjen etter tre dager (Dag 3 i fig. 4). Resultatene er vist i fig. 4 og viser at Dag 1 måleresultatene er sammenlignbare med de resultatene som ble erholdt når prøven var fersk (Dag 0 i fig. 4) og at etter tre dager var de målte verdiene kun litt lavere enn de på Dag 1 (og fersk). Dette indikerer at fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er anvendelig for å bestemme en indikasjon av en infeksjonsgrad selv på prøver som var lagret i opp til tre dager. Dette er en fordel ved bruk av fremgangsmåten for å måle melkeprøver som er mottatt av en sentralt laboratorium fra melkefarmere i en viss avstand fra. I dette tilfellet er det mottatte prøvene typisk en eller to dager gamle konserverte prøver. Videre indikerer dette at fremgangsmåten også kan være anvendelige for å skille levedyktige celler siden mortaliteten øker med alderen.

Et viktig trekk ved foreliggende oppfinnelse er at en passende mengde differensierende markør, foreksempel acridin orange metakromatisk farge, blir tilsatt til prøven, hvilket er tilstrekkelig å oppnå somatisk celledifferensiering ved bruk av strømningscytometri, men som ikke fortynnet prøven på en negativ måte ved å tilveiebringe en separasjonseffekt som diskutert over. Et passende nivå kan bestemmes empirisk ved bruk av rimelig prøving og feiling, ved visuell inspeksjon av de tilhørende punktplottene, hvilket vil bli diskutert under som et eksempel:

Følgende reagenser bli fremstilt: 1 mg/ml acridin orange i PBS, 0,1 g/ml Na2H2EDTA (pH = 7) og normal styrke PBS. En melkeprøve med forskjellige typer celler blir brukt og blandet med reagensene ved bruk av følgende kombinasjoner:

Etter å ha reagert i 1-2 minutter ved romtemperatur ble hver kombinasjon målt på det standard strømningscytometeret som ble brukt i eksemplene 1 og 2 i det vesentligste som beskrevet i eksemplene 1 og 2 over. I strømningscytometeret ble prøven målt ved en hastighet på 14 ul/min og ble eksitert med en blå laser (488 nm). En FI1-H verdi på 400,000 ble brukt som triggersignal-Fluorescenssignaler (FL1H, FL2-), og lysspredningssignaler (sidespredning, SSC-H) ble brukt.

For dataanalyse ble rød vs grønn 8FL2-H vs FL1-H) fluorescens plottet og resultatene er vist i fig. 5. Ved bruk av 2 ul eller 10 ul acridin orange kan kun en cellepopulasjon sees i plottene (fig. 6), det vil si at lave konsentrasjoner av acridin orange ikke gir tilstrekkelig differensiering. I kontrast til dette kan det sees flere populasjoner i plottet ved bruk av 50 ul acridin orange (se fig. 5).

Når den høye konsentrasjonen av acridin orange blir kombinert med EDTA beveges den meget tette populasjonen til høyre, det vil si de grønne fluorescensintensitetene til disse cellene øker (fig. 7) sammenlignet med det som er vist i fig. 5.

Tilsetning av PBS til prøvene reduserer støynivået, det vil si som vist i fig. 8 og fig. 8 er det enklere å separere cellene fra støy. Støyen er den kileformede populasjonen i den venstre delen av plottene. I plottet i fig. 8 (prøven uten PBS) overlapper støypopulasjonen en av cellepopulasjonene.

Fra dette kan det konkluderes med at konsentrasjonene av acridin orange større en rundt 0,2 mg/ml gir passende differensiering. Mengden av reagens (enten som en enkelt reagens eller individuelle reagenser tilsatt separat) som kan tilsettes prøven uten å medføre uønskede fortynningseffekter, kan bestemmes ved å betrakte et optimalt gjennomløp for et system som anvender foreliggende fremgangsmåte ved rutineanalyse. Denne mengden må gi en fortynning mindre en 1:200, fortrinnsvis mindre enn 1:50 og mest foretrukket mindre enn 1:5.

Selv om denne eksperimentelle bestemmelsen er vist med henvisning til acridin orange, bør det legges merke til at etter en serie med målinger kan fagmannen forventes å bestemme et passende område med differensierende markører som kan anvendes ved fremgangsmåten i henhold til foreliggende oppfinnelse. Det bør videre legges merke til at selv om fremgangsmåten har blitt beskrevet med hensyn til strømningscytometrimålinger av relative fluorescensintensiteter som differensierende målinger for celler, kan det anvendes andre differensierende målinger avhengig av naturen til den differensierende markøren som anvendes.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for å bestemme graden av infeksjon, innbefattende følgende trinn: i) fremstille en ikke-isolert prøve ved tilsetting av en reagens bestående av en differensierende markør i en tilstrekkelig mengde til å tilveiebringe en differensiering mellom celletyper i melk fra pattedyr i et fortynningsforhold på mindre enn 1:200, fortrinnsvis mindre enn 1:50 og mest foretrukket mindre enn 1:5; ii) måle et celletall for hver av en eller flere leukocyttyper av somatiske celler valgt fra gruppen lymfocytter, monocytter, makrofager og polymorfnukleære typer av leukocytter differensiert av markøren på prøven ved hjelp av et strømningscytometer med et deteksjonssystem som er sensitivt til forskjelliger i den differensierende markøren som er resultatet av at markøren blir forskjellig forbundet med de forskjellige celletypene i prøven; og iii) bestemme en indikasjon av en grad av infeksjon avhengig av det målte celletallet ved å anvende en sammenligning av det målte celletallet med en eller flere referanseverdier som hver er forutbestemt til å forbindes med en eller flere grader av infeksjon.

2. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert vedat det er et ytterligere trinn med å måle et totalt somatisk celletall og at det i trinnet med å bestemme en indikasjon videre innbefatter sammenligning av det målte totale celletallet med en eller flere referanseverdier som hver er forutbestemt til å være forbundet med en eller flere grader av infeksjon.

3. Fremgangsmåte i henhold til hvilke som helst av de foregående krav,karakterisert vedat pattedyrsmelken er bovin melk og at bestemmelsen av en indikasjon på en grad av infeksjon innbefatter bestemmelse av en indikasjon av en eller begge av nærværet og graden av mastitt.

4. Fremgangsmåte i henhold til krav 3, karakterisert vedat indikasjonen på mastitt innbefatter en indikasjon på subklinisk mastitt.

5. Fremgangsmåte i henhold til krav 3 eller 4, karakterisert vedat det bestemmes en grad av infeksjon som er indikativ på en sannsynlighet for å utvikle klinisk mastitt.

6. Fremgangsmåte i henhold til krav 3, karakterisert vedat det anvendes en metakromatisk farge som differensieringsmarkøren.

7. Fremgangsmåte i henhold til krav 6, karakterisert vedat den metakromatiske fargen er acridin orange i en konsentrasjon på mer enn 0,2 mg/ml.

8. Fremgangsmåte i henhold til krav 3, karakterisert vedat den ene eller flere referanseverdien inkluderer en referanseverdi som indikerer det målte celletallets grad av avvik fra en norm.