JP4433611B2 - 有核の赤血球の識別方法 - Google Patents
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Description
関連する出願についての参照
本出願は、1997年11月21日に出願された、継続中の特許出願番号08/975,846号の部分継続出願である。
発明の属する分野
本発明は有核の(nucleated)赤血球の識別のための方法に関する。さらに、この方法は適切な電気的測定及び光学的測定による血液細胞標本中の白血球の同時識別方法を提供する。
【0002】
発明の背景
正常な末梢血液は核及び細網のない成熟赤血球を含有する。有核の赤血球(NRBC)または赤芽球は、未成熟赤血球である。それらは、通常、骨髄に生じるが末梢血液には生じない。しかしながら、特定の病気、たとえば、貧血及び白血病においては、NRBCは末梢血にも生じる。したがって、NRBCを測定することは臨床的に重要である。伝統的にNRBCの識別及び数え上げは手動で行なわれている。その工程は、血液標本の顕微鏡のスライド上への塗り付け及びスライドの染色に続いて、個々のスライドの手動の目視による分析を包含する。NRBCの濃度は100個の白血球当りのNRBCの数として報告される。通常、200個の白血球と同じ領域の血液塗抹に存在するNRBCの数を数え、その数を2で割って、100個の白血球当りのNRBCの数としてNRBC濃度を表わす。このアプローチは、非常に時間がかかると同時に個々のスライドの分析の解釈に依存する。
【0003】
最近、NRBCの識別のために、いくつかの蛍光フローサイトメトリー法が開発されてきた。これらの方法は、電気的または光学的性質に基づいてNRBCを識別することが容易でないという理由で、他の細胞集団からNRBCを区別するために特異的核染色技術を利用する。
米国特許第5,298,426号(Inami他に対する)は、NRBCを識別するための蛍光方法を開示している。この方法は、酸性の低血圧の蛍光染料溶液である第1流体及び第1流体のオスモル濃度及びpHを変える第2流体を用いる2工程染色を用いる。イナミ(Inami)他は、第1流体が、有核の赤血球中に拡散して、その核を特異的に染色する赤芽球染色染料を含有し、次いで、2次元プロットでNRBCの群を他の細胞群から分離して、それによりNRBC識別の結果をコンピュータ化することを教示している。同時に白血球の亜集団を識別するために、第1流体は、2つの追加の蛍光染料、すなわち、好酸球/好塩基球染色染料及び白血球染色染料もこれらの細胞型の特異的染色のために含有する。
【0004】
米国特許第5,559,037号(Kim他に対する)は、NRBC及び白血球のフローサイトメトリー分析方法を開示する。この方法は、全血標本から赤血球及びNRBC細胞質を溶解して、NRBCの核を生体核染色剤にさらすこと及び白血球への生体核染色剤の浸透を最小限にすること並びに蛍光及び2つの角度の光散乱を測定することによる標本の分析を含む。この方法は、デブリ(蛍光性及び非蛍光性の)からのシグナルを阻止し、ALLトリガーの下であるが、NRBCとして蛍光トリガー(FL3)の上に落ちるシグナルを同定する三重トリガー方法を特色とする。ALLは光の光軸損失または入射光から0°で検出された光散乱シグナルである。したがって、1次元より大きい予備ゲーティングシグナルがNRBC集団の同定のためのこの方法に必要となる。白血球も有核の細胞であるから、蛍光測定への干渉を回避するために、これらの細胞の染色を防止することが必要である。白血球膜の維持及び核染色剤の白血球への浸透を最小限にすることは、赤血球の溶解の間に脂肪族アルデヒドで白血球を同時に固定することにより達成される。アルデヒド同定剤は危険な化学薬品として知られている。さらに、この方法はNRBCと白血球の識別を得るために試薬を42℃まで加熱する必要がある。
【0005】
米国特許第5,631,165号(Chupp 他に対する) は、溶解した血液標本中の有核赤血球または網状赤血球及び細胞表面抗原を数え及び識別するための自動化方法を開示する。この方法は、フローセル中の溶解した血液標本から多角度光散乱及び蛍光シグナルを検出する。米国特許第5,559,037号(Kim 他に対する) と同様に、この方法は、蛍光染料を用いる核染色により生産された有核赤血球または網状赤血球からの蛍光シグナルの検出を必要とする。
【0006】
上記方法は蛍光フローサイトメトリーによりNRBCと白血球を識別及び数え上げることができる。しかしながら、蛍光測定は複雑で高価な検出方法である。 最近の自動血液分析機、たとえば、Abbott Cell−Dyn(登録商標)3500、COULTER(登録商標)STKS(登録商標)、Technicon H* 1(登録商標)及びTOA Sysmex(商標)NE−8000は、機器がヒストグラムの赤血球デブリ領域の近くに増加量のシグナルを感じた時、分析血液標本中における、NRBCの存在の可能性についてのNRBCのフラッグ付け(flagging)のみを提供できる。しかしながら、このような技術は、多くの他の血液の異常性が同じ領域に、増大したシグナル、たとえば血小板のかたまり及び鎌状赤血球並びに不十分な溶解化血液標本からの赤血球デブリを引き起こすから、しばしば、誤った陽性のフラッグ付けを生じさせる。これらの方法ではNRBCは同定されない。代りに、ヒストグラムまたは点プロットにおける、単なる共通のNRBC標本分布パターンが、上記他の原因により生じた同様のパターンと容易に混同し得る機器により認識される。誤った陽性のフラッグを包含する、フラッグを付された標本について、手動方法による標本の再検査が臨床試験所で必要になる。標本を含有するNRBCについての他の問題は、血液分析機により報告された白血球の総数(WBC)は、NRBCは白血球と誤同定されることによりWBCを上昇させることがあるだろうから、これらの標本について正確でないことである。他方、全血標本からの白血球集団の分析は、病理学の多様性に関する診断手順の必須の部分である。自動化方法で白血球の主要な亜集団を分析する能力は、単一血液標本の急速診断及び多くの標本の同時の急速処理のために必須である。
米国特許第5,155,044号(Ledis他に対する)は全血標本からの白血球の単離及び分析方法を開示し、それは、自動血液分析機で一工程測定において白血球を5つの亜集団に識別することを可能にする。この検出技術は、同時光散乱測定と、DC(直流)及びRF(高周波)の両方におけるインピーダンス測定を含む。この方法は単純で速いが、NRBCの識別を提供できない。
【0007】
米国特許第5,384,549号(Hamaguchi他に対する)は、複雑な手順により白血球を5つの亜集団に識別する溶解剤系及び方法を記載している。この方法は3つの溶解試薬、3つの分離標本調製物並びに、リンパ球集団及び単球集団に加えて、好酸球集団、好中球集団、好塩基球集団の同一性のための測定を必要とする。ハマグチ他は、溶解試薬系及びDC対RF検出方法を用いる、単に異常な白血球集団と有核赤血球の観察を記載している。しかしながら、この方法はいくつかの異常な細胞型の存在を観察するだけで、NRBCを識別または数え上げることができない。
【0008】
米国特許第5,686,308号(Li他に対する)は、自動化血液分析機で一工程で白血球を5つの亜集団に識別するための溶解化試薬系及び方法を記載している。溶解試薬系は、エトキシル化長鎖アミン化合物を含む溶解試薬及び溶解試薬のpHを2.0〜3.6の範囲内に調整するための酸並びに高張アルカリ性安定化剤を含む。この特許は白血球亜集団の識別のための試薬及び方法を教示するが、有核赤血球の識別を教示しない。
先の記載に基づいて、NRBCを識別及び数え上げるための簡単で費用の少ない方法についての必要性がある。
【0009】
発明の概要
本発明の一つの目的は、蛍光または核染色剤を用いずに自動化血液分析機で有核赤血球の識別を可能とする方法を提供することである。この方法は分析のための血液標本を供給し、前記血液標本から成熟赤血球を溶解し、2つの角度の光散乱測定により前記血液標本を分析して、有核赤血球を識別し、そこで、第2光散乱シグナルは中角度の光散乱シグナルまたは直角の光散乱シグナルであり、そして、血液細胞標本中の有核赤血球を報告することを含む。
本発明の他の目的は有核赤血球と白血球の同時識別を可能とする方法を提供することである。この方法は、分析のための血液標本を供給し、前記血液標本から成熟赤血球を溶解し、DC測定及び光散乱測定により前記血液標本を分析して、有核赤血球及び白血球亜集団を識別し、そこで、有核赤血球を識別するための前記光散乱測定が2つの角度の光散乱シグナルを用いて行なわれ、有核赤血球を識別するための第2光散乱シグナルが中角度光散乱シグナルまたは直角の光散乱シグナルであり、そして、血液細胞標本中の有核赤血球及び白血球亜集団を報告することを含む。
後の発明の好ましい態様の詳細な説明からよりよく分かるように、本発明は、核染色及び複雑な蛍光検出方法を用いることなく、光散乱を用いて有核赤血球の識別を与える点で従来の技術に比較して特に有益である。本発明の追加の特徴は、標本調製物の加熱を必要とせず、室温で最適に働くことである。本発明は後の好ましい態様の記載からよりよく理解されるだろう。
【0010】
好ましい態様の詳細な説明
本発明はNRBCの識別のための方法に関する。さらに、本方法は血液細胞標本中の白血球の同時識別を提供する。
第1の態様では、本発明の方法は、血液細胞標本を成熟赤血球を溶解する試薬系にさらし、続いて、光散乱測定を用いて流動セル中で前記標本混合物を分析して、NRBCを識別し、前記血液細胞標本中のNRBCを報告することを含む。
本発明のために適当な1つの試薬系は、一般式:
【0011】
【化1】
(式中、Rは12〜22の炭素原子を有するアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり、m及びnは各々1以上であり、m+nは20〜40の間である)で表わされるエトキシル化長鎖アミン化合物を含む溶解試薬及び溶解試薬のpHを2.0〜3.6の範囲内に調整するための酸並びに高張アルカリ性安定化試薬を含む。
【0012】
任意に、赤血球デブリを減らすのに有効な量で1以上の溶解化剤を溶解試薬に包含させることができる。典型的には溶解化剤はポリオキシエチレン及びポリオキシプロピレンコポリマー並びに16以上のHLBを有するエトキシル化アルコールである。適当なコポリマーはPluronicコポリマー(BASFコーポレイション、ニュージャージー州、パーシッパニー)、たとえばPluronic F38及びPluronic 25R8を含むが、これらに限定されない。適当なエトキシル化アルコールはPlurafac A38(BASF)及びHetoxol STA30(Heterene, Inc. ニュージャージー州、パタソン)を含むが、これらに限定されない。
【0013】
さらなる任意の添加剤を、溶解試薬中に、それらの存在が溶解試薬組成物中の主要機能性成分と相溶性である濃度で含ませることもできる。これらの添加剤の中では、組成物の棚寿命を増加するための、酸化防止性を有する保存剤、及び抗微生物性を有する保存剤である。抗酸化性を有する保存剤はEDTA及びブチルメチルフェノールを含むが、これらに限定されない。抗微生物活性を有する保存剤は、ジメチロールジメチルヒダントイン、ヨードプロピニルブチルカーバメート及びイソチオゾロン誘導体を含むが、これらに限定されない。
【0014】
本発明の方法に用いることができる他の試薬系は米国特許第5,155,044号に開示されている。この試薬系は、赤血球を選択的に溶解するために低張酸溶解を利用し、続いて、溶解化活性を遅延し、識別分析のために白血球を保護するために、急冷(quenching)溶液を加える。
NRBCの識別分析は光散乱測定を用いて外筒流体を用いる流動セル中で実施する。粒子、たとえば血液細胞が流動セルの開口を通過する時、レーザービームからの入射光を全方向に散乱させる。光散乱シグナルは0〜180°の間の入射光に呼応する種々の角度で光検出器により検出できる。各細胞集団は大きいか小さいかのいずれかで異なった光散乱特性を有し、異なった細胞集団の識別のために利用し得ることが分かった。入射光から10°未満で検出される光散乱シグナルは一般に低角度光散乱と呼ばれる。入射光から約10°〜約70°で検出される光散乱シグナルは中角度光散乱と呼ばれ、入射光の約90°で検出される光散乱シグナルは直角の光散乱と呼ばれる。光散乱シグナルの特徴は細胞のサイズ、細胞の量及び細胞の表面特性により影響を受ける。
流動セルを通過する粒子または細胞からの光散乱シグナルを本発明の目的のために用いる。好ましくは、2つの角度の光散乱シグナルをNRBCの識別に用いる。より好ましくは、光散乱の角度の一方は10°未満である低角度光散乱シグナルである。低角度光散乱シグナルの好ましい範囲は約0°〜約4°である。第2の光散乱角度は低、中または直角光散乱シグナルである。
図1〜4は、例Iに記載された手順に従って処理し、分析された11NRBC/100WBCを含有する、臨床的全血標本の一連の散布図を示す。これらの散布図、図1におけるLS1(約1°〜約3°)対LS2(約4°〜約6°)、図2におけるLS1対LS4(約6°〜約8°)、図3におけるLS1対LS5(約9°〜約11°)及び図4におけるLS1対LS3(約24°〜約35°)においては、NRBCは、NRBCの下に記される赤血球デブリから明確に識別され、かつ白血球(この散布図の範囲の外にある)から明確に識別されるクラスターを形成する。DCのスケールでは、図1〜4に記載されたNRBC集団は、通常は図5で示されるようなデブリ領域と考えられる領域中でリンパ球の下にある。NRBCを識別するための最良のモードは、血液標本中に高い網状赤血球が存在する時に、第2光散乱シグナルのために低角度光散乱シグナルを用いることである。光散乱測定によるNRBCの識別は単純で、簡単である。それは、NRBCを他の細胞型から識別するために、定例の二次元点プロットまたは散布図を用いる。LS1におけるNRBCのクラスター上の細胞集団は総白血球(WBC)として数えられる。さらに他の方法は総白血球(WBC)を決定するのに用いられる。DC検出装置も用いられるなら、リンパ球の最小DC体積より上の細胞集団は総白血球として数えることができる。これらの方法の両方で得られたWBCはNRBCの干渉がなく、補正されたWBCと等しく、それは、NRBCの寄与を含有する総白血球数からNRBC総数を引き去ることにより生じる。
【0015】
分析した標本のNRBC濃度は、同定されたNRBCクラスター(図1〜4)中に数えた細胞の数を数えた総白血球(WBC)により割り、そして、その商に100を掛けることにより計算できる。NRBC濃度はNRBC/100WBCの数として報告することができ、それは、手動の報告単位と同じであるか、または1μlの全血に対する絶対NRBCとして報告することができる。
【0016】
本発明の第2の態様では、白血球の識別分析はNRBCの識別といっしょに実施できる。識別分析は同じ試薬系及び1つの標本調製物を用いて、電気的及び光学的分析を用いて1工程で実施できる。電気的及び光学的分析は光散乱測定及びインピーダンス測定を含む。自動血液分析機による白血球分析に用いられるDCインピーダンス測定装置は当業者に知られており、一般にRodriguez 他に対する米国特許第5,125,737号に記載されており、その全体を参照により本明細書に組み入れる。NRBC及び白血球の識別分析のために、流動セルを通過する粒子または細胞からの多角度光散乱シグナルを検出可能な光散乱検出器が用いられる。
【0017】
図1〜4においては、白血球は表示された散布図の範囲外にあり、これらの図には示されていない。しかしながら、白血球の識別及びNRBCの識別のための標本分析を一工程測定で実施できる。両方の識別のためのデータ分析は、一工程の測定から得られた異なったパラメータを用いて同時に実施できる。
図5は、例II(例Iで用いられたのと同じ試薬及び手順)にしたがって処理された新鮮な正常全血標本から得られたDC対LS3(中角度散乱、約24°〜約35°)散布図である。図5は白血球亜集団である、リンパ球、単球、好中球及び好酸球の4つの別個のクラスターを示す。標本を一つの標本調製物において処理し、NRBCの識別と同時に分析した。DC対LS3散布図においては、リンパ球集団の最小DC体積より上のすべての細胞集団を総白血球(WBC)として数え、それは、LS1対LS2散布図におけるNRBCクラスターより上の集団に等しい。
【0018】
本発明の方法は、初めて、核染色及び蛍光を用いずに有核赤血球の識別及び数え上げを報告する。核染色の除去は、染料汚染のための、器械及び流体系維持の減少、試薬持ち越しに対する系の感度の減少及び高価な蛍光染料による試薬のコストの減少における利点を提供する。本発明の方法は、速く、確かで自動化血液分析に適当である。さらに、この検出技術は蛍光方法に比較して複雑でなく、高価でない。
【0019】
本発明の方法は完全に室温、すなわち、18〜28℃で操作するという利点をも提供する。従来技術の方法は白血球亜集団またはNRBCの識別のために上昇した温度で操作する。この上昇温度の必要性は、反応を自動温度調節しなければならないから、著るしくより複雑で、コストのかかる分析機械を必要とする。それは、分析下の生物学的細胞のためによりストレスの多い状態を生じる。
【0020】
本発明の他の有利な特徴は、他の流体標本、たとえば、骨髄及び非ヒト種の血液標本の識別分析のためのその利用性である。
本発明の方法は、さらに次の例を参照することにより理解できる。しかしながら、本発明が記載された例に限定されないことが分かるだろう。
【0021】
例I
28μlのEDTA−抗凝固化臨床全血標本に対して、0.18%のギ酸、2%の式:
【0022】
【化2】
(式中、Rはステアリルで、m+nは27に等しい)で表わされるエトキシル化長鎖アミン、溶解化剤としての1.4%のPlurafac A38及び保存剤を含む、417μlの溶解試薬を加え、血液分析機の混合室で約4秒間混合した。次いで、1.4%のNaCl、3.2%のNa2 SO4 及び0.66%のNa2 CO3 を含み、pH11.0である、180μlの安定化試薬を加えて、混合し、溶解反応を遅延させた。
【0023】
安定化試薬の添加10秒後、標本混合物を、DC及び光散乱検出器を装備した実験用血液分析機の、外筒流体であるISOTON(登録商標)III 希釈剤(フロリダ州、マイアミのCoulter Corporation の製品) を有する流動セルに、NRBC及び白血球の識別分析のために供給した。光散乱検出器は、いくつかの範囲の角度、すなわち、約1°〜約3°(LS1)、約4°〜約6°(LS2)、約6°〜約8°(LS4)、約9°〜約11°(LS5)、約24°〜約35°(LS3)及びさらに高い角度で、流動セルを通過する細胞からの光散乱シグナルを検出する。
【0024】
得られる散布図を図1〜4に示す。これらの図は、LS1対LS2、LS1対LS4、LS1対LS5及びLS1対LS3散布図において、赤血球デブリ(下)及び白血球(上、しかし、散布図の範囲の外)から識別されたNRBCのクラスターを示す。
分析された標本のNRBC濃度は、同定されたNRBCクラスターにおいて数えた細胞の数(図1〜4)を数えた総白血球(WBC)で割り、その商に100を掛けることにより計算する。NRBC濃度はNRBC/100WBCの数として報告され、それは手動の報告単位と同じである。この標本について、手動の参考方法は11NRBC/100WBCを報告し、上記方法は12NRBC/100WBCを報告した。
【0025】
例II
新鮮な正常な全血標本を例Iの記載と同じ試薬及び手順を用いて分析した。標本混合物を、白血球の識別及びNRBCの識別のための例Iで用いたのと同じ血液分析機の流動セルで同時に分析した。図5は得られたDC対LS3散布図であり、それは白血球亜集団、すなわち、リンパ球、単球、好中球及び好酸球の4つの別個のクラスターを示す。
【0026】
例III
28μlのEDTA−抗凝固化臨床全血試料に対して、0.12%のギ酸及び0.07%のサポニンからなる449μlの溶解試薬を加え、血液分析機の混合室中で約5秒間混合した。次いで177μlの例Iに記載されたのと同じ安定化試薬を加えて、混合し、溶解反応を阻止した。
【0027】
安定化剤の添加の約8秒後、標本混合物を例Iに記載したのと同じ血液分析機の、外筒流体であるISOTON(登録商標)III 希釈剤を有する流動セルに、NRBC及び白血球識別分析のために供給した。図6は得られたLS1対LS2散布図(図1と同じスケールの)で、それはNRBCクラスターが他の細胞型から分離されていることを示す。
【0028】
例IV
4μlのアリゲーターの血液と4.15mlの例Iの溶解試薬とを試験管中で手動で約4秒間混合した。1.8mlの例Iの安定化試薬を加え、標本混合物を手動で混合し、例Iに記載した血液分析機に導入した。図7は、得られたLS1対LS5散布図である。明らかなようにNRBCははっきりとしたクラスターを形成した。
本発明を特に好ましい態様に関連して記載してきた。しかしながら、種々の変更を本発明の精神を離れることなくなすことができ、そのような変更は添付の請求の範囲内に入ることを意図することは明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【図1】 例Iに記載した本発明のプラクティスにしたがって得られた散布図である。
【図2】 例Iに記載した本発明のプラクティスにしたがって得られた散布図である。
【図3】 例Iに記載した本発明のプラクティスにしたがって得られた散布図である。
【図4】 例Iに記載した本発明のプラクティスにしたがって得られた散布図である。
【図5】 例IIに記載した本発明のプラクティスにしたがって得られた散布図である。
【図6】 例III に記載した本発明のプラクティスにしたがって得られた散布図である。
【図7】 例IVに記載した本発明のプラクティスにしたがって得られた散布図である。
Claims (16)
- 蛍光を用いることなく有核の赤血球を識別する方法であって
(a)分析のための血液細胞標本を供給し、
(b)前記血液細胞標本から成熟赤血球を溶解し、
(c)2つの角度の光散乱測定により前記血液細胞標本を分析して有核の赤血球を識別し、そこで、第2の光散乱シグナルは、中角度の光散乱または直角の光散乱シグナルであり、そして、
(d)前記血液細胞標本中の有核の赤血球を報告すること
を含む前記方法。 - 第1の光散乱シグナルが低角度光散乱シグナルである請求項1の方法。
- 第2の光散乱シグナルが中角度光散乱シグナルである請求項1の方法。
- 第2の光散乱シグナルが直角の光散乱シグナルである請求項1の方法。
- 第1の光散乱シグナルの範囲が0℃〜4℃である請求項2の方法。
- 前記有核の赤血球の報告が、100個の白血球当りの有核の赤血球の数であるかまたは、単位体積の血液細胞標本当りの有核の赤血球の絶対数である請求項1の方法。
- 前記血液細胞標本が、ヒトの末梢血液、非ヒトの末梢血液、ヒトの骨髄、非ヒトの骨髄から選択される請求項1の方法。
- 蛍光を用いることなく有核の赤血球及び白血球を識別する方法であって、
(a)分析のための血液細胞標本を供給し、
(b)前記血液細胞標本から成熟赤血球を溶解し、
(c)前記血液細胞標本をDC及び光散乱測定により分析して、有核の赤血球及び白血球亜集団を識別し、そこで、有核の赤血球を識別するための前記光散乱測定が2つの角度の光散乱シグナルを用いて行なわれ、有核の赤血球を識別するための第2の光散乱シグナルが中角度光散乱シグナルまたは直角の光散乱シグナルであり、そして、
(d)前記血液細胞標本中の有核の赤血球及び白血球亜集団を報告すること
を含む前記方法。 - 第1の光散乱シグナルが低角度光散乱シグナルである請求項8に記載の方法。
- 第2の光散乱シグナルが中角度光散乱シグナルである請求項8に記載の方法。
- 第2の光散乱シグナルの直角の光散乱シグナルである請求項8に記載の方法。
- 第1の光散乱シグナルの範囲が0°〜4°である請求項9の方法。
- 前記白血球亜集団が、リンパ球、単球、好中球及び好酸球から選択される請求項8に記載の方法。
- 前記白血球亜集団の報告が、前記血液標本の単位体積当りの絶対数または前記血液標本中の総白血球のパーセントである請求項8の方法。
- 前記有核の赤血球の報告が100個の白血球当りの有核の赤血球の数または血液細胞標本の単位体積当りの有核の赤血球の絶対数である請求項8の方法。
- 前記血液細胞標本がヒトの末梢血、非ヒトの末梢血、ヒトの骨髄、非ヒトの骨髄から選択される請求項8の方法。
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