KR20140020835A - 감염도 결정 방법 - Google Patents

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Abstract

i) 감별 표지, 적절하게는 예를 들어 아크리딘 오렌지와 같은 변색성 염료를 세포 타입 간 감별을 제공하기에 충분한 양으로 포유류 우유에 첨가하는 것에 의해 미분리된 샘플을 제조하는 단계; ii) 샘플에서 다른 세포 타입과 다르게 연관되는 표지로부터 야기되는 감별 표지의 차이를 감지하는 검출 시스템을 갖는 세포분석기에 의해 샘플에서 감별 체세포 수를 측정하는 단계; 및 iii) 측정된 감별 세포 수에 따라 감염도의 지표를 결정하는 단계를 포함하는 감염도 결정 방법.

Description

감염도 결정 방법{METHOD FOR DETERMINING A DEGREE OF INFECTION}
본 발명은 포유류 우유에서의 감별 체세포 계수로부터 감염도를 결정하는 방법에 관한 것으로, 특히 유선염 및 가장 특별하게는 소 유선염의 정도 및/또는 존재를 결정하는 방법에 관한 것이다.
유선염은 정도에 따라 우유 품질의 원치 않는 변화뿐 아니라 우유 수율의 심각한 손실을 야기할 수 있는, 전형적으로 세균 감염에 의해 야기되는 포유류의 유선의 염증이다. 소의 유선염에 기인하는 미국에서만의 연간 농부들의 경제적 손실은 20억불이 넘는 것으로 추정된다. 이 중 상당한 비율은 무증상 유선염에 기인하는 것으로 추정된다.
임상적 유선염은 통상적으로 비교적 값비싼 항생제 치료로 처치된다. 무증상 유선염은 수유 중에는 반드시 항생제 치료가 필요한 것은 아니다. 종종 무증상 감염은 면역 시스템에 의해 제거되지만, 무증상 유선염은 때때로 임상적 유선염으로 유도되거나 무증상 감염(만성 유선염)으로 남을 수 있다.
유선염, 특히 소의 유선염의 확인은 통상적으로 체세포 계수를 위한 유동세포분석법 또는 화상 처리(imaging)를 사용한, 미리 결정된 용량의 우유에서의 총 체세포의 수에 기초한다. 이러한 체세포 계수시, 백혈구(white blood cells)와 표피(피부) 세포는 일반적으로, 특히 우유에 존재하는 다른 타입의 백혈구 간의 어떠한 구별도 없이 계수된다.
이하에서, 림프구, 단핵구 및 대식세포 타입의 백혈구는 ‘그룹 A’ 백혈구로 지칭되고, 다형핵 또는 PMN(호중구, 호산구 및 호염기구) 타입의 백혈구는 ‘그룹 B’ 백혈구로 지칭될 것이다.
그룹 A 구성원들은 정상적인 조건 하에서 전체 체세포 수의 약 85%를 차지하는 반면, 그룹 B 구성원들은 정상적인 조건 하에서 체세포의 약 10%를 차지하고 유선염 정도에 따라 전체 체세포 계수의 30% 내지 90%까지 증가하는 것으로 보통 이해되고 있다.
감별 체세포 계수는, 그룹 A 및 그룹 B 백혈구의 상대적 비율의 정도, 심지어 이들 그룹 중 하나 또는 양쪽에서 백혈구 타입의 비율에 대한 척도로, 유선염에 대한 감수성 및/또는 유선염의 정도 또는 존재 중 하나 이상에 대한 지표로서 이용되어야 한다는 것이 오랫동안 제안되어 왔다.
감별 세포 계수는 통상적으로 관련되는 세포의 타입에 따라 변화하는 하나 이상의 측정 가능한 특성을 갖는 변색성 염료(meta-chromatic stain) 또는 형광 또는 방사성 마이크로비드와 같은 감별 표지에 의해 달성된다. 공지의 방식으로 세포 타입 사이를 감별하도록 형광 특성의 변화와 같은 이들 특성에서의 차이를 감지하는 검출 시스템을 사용하여 이벤트(세포)를 계수하기 위해 세포계산기가 이용된다.
예를 들어 US 2009/0233329로부터, 우유 샘플과 변색성 염료의 혼합물이 놓인 신규의 쐐기 형태의 미세유체 쳄버를 이용하는 ‘도말 시험(smear test)’을 사용하여 감별 체세포 계수를 수행하는 것이 알려져 있다. 여기에서는 80 ㎕의 우유가 20 ㎕의 변색성 염료로 희석되고 혼합물의 작은 방울이 쳄버로 도입된다. 이들의 변색과 형태에 따른 다른 세포의 확인은 화상 분석을 사용하여 자동 또는 수동으로 이루어진다. 이의 문제점은 매 시험마다 새로운 미세 유체 쳄버가 사용되어야 한다는 것이다. 또한, 화상 분석 쳄버의 높이가 세포의 확인을 어렵게 만들 수 있는 화상의 흐려짐을 야기할 수 있다.
유동 세포분석법은 위에 기술된 도말 시험 타입 분석의 대안으로서 잘 알려져 있다. Am. J. Vet. Res., pp 2012-2016, Vol. 47, No. 9, September 1986에 공표된 M. Hageltorn 및 M. Alaa Saad의 논문에서는, 다른 백혈구 집단을 구분하기 위해 유동 세포분석법이 사용될 수 있는 것으로 개시되어 있다. 여기에서는 신선한 우유 샘플(6 시간 보다 오래 되지 않은)이 0.0004% 아크리딘 오렌지 변색성 염료를 포함하는 저장성 염 용액으로 1:200의 비율로 희석되고 표준 형광 유동 세포분석법을 사용하여 분석을 실시한다. 이러한 희석 단계는 측정 시점에서 측정되는 세포와 방해 입자(예컨대 지방 입자)의 일치 가능성을 효과적으로 배제시키기 위해 수행되지만 분석 기술에 복잡성을 부가한다. 더욱이, 고도 희석은 통계적으로 유의성 있는 세포 계수가 달성될 수 있기 전에 매우 많은 용량의 액체가 분석될 것을 요구한다. 이는 결과적으로 분석 시간을 상당히 증가시킨다.
표준 유동 세포분석법 분석 기술을 사용한 감별 체세포 계수의 수행은 또한, 예를 들어 US 6,979,550에도 개시되어 있다. 여기에서는 감별 세포 계수를 수행하기 위해 체세포가 먼저 우유 샘플 중에서 방해 입자로부터 분리되어야 한다고 개시되어 있다. 이것은 여기에서 지방 입자와 같은 방해 입자를 제거하기 위해 우유 샘플을 원심분리하고 분석할 입자를 농축하는 것에 의해 실시된다. 방해 입자로부터 모든 세포를 구별하기 위해 형광 염료가 첨가된다. 다음에 입자 계수는 이용된 형광 염료에 적합한 이벤트 검출 시스템을 사용하여 표준 유동 세포분석기에서 수행된다. 원심분리는 분석의 복잡성을 증가시키고, 어떤 경우에는 더 이상 전체를 대표할 수 없도록 샘플을 변형시킬 수도 있다.
본 발명의 목적은 감별 체세포 계수를 위한 공지의 세포분석 기술과 관련된 문제 중 적어도 하나를 다루고자 하는 것이다.
따라서, 본 발명은
i) 세포 타입 간 감별을 제공하는 데 충분한 양의 변색성 염료, 형광 또는 방사성 미소구와 같은 감별 표지를 포함하는 시약을 포유류 우유에 가하여 1:200 미만, 바람직하게는 1:50 미만 및 가장 바람직하게는 1:5 미만의 범위로 희석시킨 미-분리된 샘플을 제조하는 단계; ii) 샘플에서의 다른 세포 타입과 다르게 연관되는 표지로부터 야기되는 감별 표지에서의 차이를 감지하는 검출 시스템을 갖는 유동 세포분석기에 의해 샘플에서 감별 체세포 수를 측정하는 단계; 및 iii) 측정된 감별 세포 수에 따른 감염도의 지표를 결정하는 단계를 포함하는 감염도 결정 방법을 제공한다.
이에 따라, 본 발명자는 놀랍게도 샘플에 첨가되는 감별 표지의 양의 적절한 선택에 의해, 표지 자체의 감별 특성(들)을 모니터링하는 것에 의해 감별 체세포 수를 측정하도록 미-분리되고 본질적으로 희석되지 않은 샘플에서 세포계측 분석이 수행될 수 있고, 그 결과가 유선염 감염의 정도의 지표를 결정하는 데 이용될 수 있다는 것을 발견하였다. 이러한 감별 특성(들)의 표준으로부터의 편차 및/또는 편차의 크기는 수축성 유선염의 존재, 단계 및/또는 가능성을 확인하는 데 사용될 수 있다.
유용하게도, 감염도의 지표는 유선염의 존재, 가능성 또는 수준 중 하나 이상의 확인을 포함할 수 있다. 이러한 확인은, 젖소-대-젖소 감염 위험을 낮추기 위해 유선염 상태에 따른 착유 명령, 감염된 젖소 착유 후 착유 클로(milking claw)의 더 나은 세척 또는 감염된 젖소에 대하여 분리된 착유 클로의 사용; 젖소-대-젖소 감염 위험을 낮추기 위해 무증상 유선염 젖소의 그룹화; 무증상 유선염 감염이 임상 케이스로 진전할 것인지를 예상하여 결과적으로 이들 젖소를 항생제 치료를 받도록 확인; 그리고 도태 및 사육 선택과 같은 수많은 가축군 관리 결정에 이용될 수 있다.
본 발명은 이하에서 비-제한적인 예로서 첨부되는 도면을 참고로 예시될 것이다.
도 1은 본 발명에 따라 세포가 표지된 우유 샘플에서 유동 세포분석법에 의한 측면 산란 강도 대 녹색 형광의 도트 플롯을 보여준다;
도 2는 도 1에 나타낸 게이트 영역의 적색 대 녹색 형광의 도트 플롯을 보여준다;
도 3은 다른 세포 집단이 확인된 도 2에 나타낸 게이트 영역의 적색 대 녹색 형광의 도트 플롯을 보여준다;
도 4는 본 발명에 따른 방법을 사용하여 0일에 측정된(신선한 우유) %PMN 대 다음 날에 측정된 %PMN의 그래프를 보여준다;
도 5는 표 2의 값에 따라 제조된 우유 샘플에서 유동 세포분석법에 의한 적색 대 녹색 형광의 전형적인 언게이트 도트 플롯을 보여준다;
도 6은 비교적 저농도의 아크리딘 오렌지로 염색된 우유 샘플로부터의 적색 대 녹색 형광의 도트 플롯을 보여준다;
도 7은 도 5에 이용된 농도로 염색된 샘플에 EDTA를 첨가한 효과를 나타내는 적색 대 녹색 형광의 도트 플롯을 보여준다;
도 8은 PBS 첨가 전 적색 대 녹색의 도트 플롯을 보여준다; 그리고
도 9는 PBS 첨가의 효과를 보여준다.
실시예 1
각각의 젖소로부터의 50 ㎕ 양의 냉장 및 보존된(BSM II 탭으로) 우유를 에펜도르프 튜브로 옮긴다. 50 ㎕의 PBS 중 아크리딘 오렌지(1 ㎎/㎖) 및 10 ㎕ Na2H2EDTA(0.1 g/㎖, pH=7)를 한번에 한 시약씩 첨가하여 혼합한다. 다음에, 100 ㎕ PBS를 위에 언급한 혼합물에 첨가하고 혼합한다. 실온에서 1~2 분간 반응시킨 후, 혼합물을 표준 유동 세포분석기에서 측정하였다. 이 유동 세포분석기에서, 그리고 단지 하나의 예로서, 샘플을 14 ㎕/분의 속도로 검출 영역을 지나 유동시킨다. 감별 표지가 변색성 염료이므로 세포 타입이 세포 형광을 사용하여 감별될 수 있다. 본 실시예에 이용된 염료는 아크리딘 오렌지이고 따라서 형광은 본 실시예에서 청색 레이저(488 ㎚)에 의해 여기되어 녹색(여기에 FL1-H로 나타냄) 및 적색(여기에 FL2-H로 나타냄) 강도로 모니터링된다. 400,000의 FL1-H 값이 트리거 신호로서 사용된다. 본 방식에서 광 산란 신호가 또한 얻어지고, 얻어진 신호로부터 노이즈(즉, 계측되는 세포와 무관한 신호)를 감소시키기 위해 측면 산란 광(여기에서 SSC-H로 나타냄)의 강도가 유리하게 이용된다.
데이터 분석을 위해, 측면 산란 대 녹색 형광을 플롯팅하고 도 1에 나타낸다. 이 플롯에서 게이트는 플롯에서 관심 이벤트, 이 실시예에서는 세포가 위치하는 곳을 정의하도록 도시된다. 유의성 있는 측면 산란(SSC-H) 신호이지만 비교적 낮은 녹색 형광(FL1-H) 신호를 보여주는 입자는 쉽게 비관심으로 확인될 수 있고 다음 분석에서 제거된다. 게이트의 정확한 변수는 유동 세포분석법 분야에서 알려진 표준 기술을 사용하여 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
이와 같이 노이즈 입자는 제거되거나 적어도 유의성 있게 감소된다. 이 게이트 영역은 P4로 확인되고 본 실시예에서는 계수된 이벤트의 총 수의 52.6%를 나타낸다.
게이트 이벤트 P4는 다음에 도 2에 나타낸 것과 같이 적색(FL2-H) 대 녹색(FL1-H) 형광 플롯으로 플롯팅된다. 필수적이지는 않지만 유용하게, 이 플롯에서 제2 게이트는 플롯에서 관심 있는 이벤트(세포)가 위치하고 따라서 추가의 노이즈 입자가 제거되는 위치를 정의하도록 도시된다. 이 게이트 영역은 P11로 확인되고 본 실시예에서는 P4 게이트 영역에서 계수된 이벤트의 총 수의 96.4%를 나타내고 밀리리터 당 450,000 세포(세포/㎖)의 총 체세포 수에 상응한다. 이 플롯은 그룹 A 및 B에 속하는 세포의 백분율의 결정에 이용될 수 있으나, 바람직하게는 다음에 도 2의 P11 영역에서 모든 세포를 정의하는 게이트가, 이용된 변색성 염료, 여기에서는 관련된 적색/녹색(FL2-H/FL1-H) 형광 강도를 갖는 아크리딘 오렌지의 특징적인 파장에서 검출되는 형광의 상대적 비율에 근거하여, 상이한 세포 집단들을 정의하는 영역으로 세분된다. 도 2로부터 P11 영역은 도 3에 P2로 확인되어 있다. 상이한 세포 타입의 영역들은 도 3에 P5, P6, P7 및 P8로 나타나 있고 가시적인 관찰로부터 가장 가능성 있게는 각각 단핵구(그룹 A); PMN(그룹 B); 임파구(그룹 A) 및 대식세포(그룹 A)로 구성되는 것으로 여겨진다. 일단 이들 가시적 상관관계가 만들어지면, 이들 영역과 관련된 특징적인 형광의 비율이 가시적 확인 단계에 의존하지 않고 이후의 분석에 이용될 수 있다.
도 3에서 소위 말하는 그룹 B(또는 PMN) 세포 영역을 정의하는 영역 P6에서의 이벤트의 수를 세포의 총 수로 나누고 100을 곱하여 %그룹 B(PMN)를 얻고, 이는 본 실시예에서 78.2%이다.
이 결과로부터 감염도의 지표를 설정하기 위해, 알려진 감염도를 갖는 젖소로부터의 우유를 사용하여 설정된 참고값과 비교할 수 있다. 이 비교는 세포 수와 감염도 사이의 수학적 관계를 설정하기 위해 참고값에 적용되는 통상적인 회귀 또는 화학계량학적 기술을 사용하여 수학적으로 수행될 수 있다. 다음에 미지의 샘플로부터의 결과는 미지의 젖소의 감염도의 지표에 도달하도록 미리 수학적으로 설정된 관계를 사용하여 데이터 처리기로 처리될 수 있다. 대안으로서, 세포 수의 범위를 유선염 진단에 대하여 색인화할 수 있고, 다음에 측정된 세포 수는 감염도의 지표를 제공하기 위해 범위와 비교된다. 이것은 아래 표 1에 한 예로서만 나타내고, 데이터 처리기에 의해 수동적 또는 자동적으로 수행될 수 있다.
Figure pct00001
따라서, 본 실시예에서 총 체세포수 450,000과 함께 PMN 값 78%는 무증상 유선염을 표시한다. 청구된 본 발명으로부터 벗어나지 않고, 감염도의 지표가 다음에 많은 다른 방식으로, 예를 들어 유선염과 무증상 유선염의 하나 또는 양쪽의 존재에 대한 YES/NO 또는 감염의 정도로서 또는 수축성 유선염의 예측으로서, 사용자에게 제시될 수 있음은 본 분야의 당업자에게 이해될 것이다.
실시예 2
각각의 젖소로부터의 우유를 보존하고(BSM II 탭으로) 분석 전에 40℃로 가열한다. 50 ㎕ 용량의 우유를 에펜도르프 튜브로 옮긴다. 160 ㎕의 아크리딘 오렌지 시약(PBS 중 0.3 ㎎/㎖ 아크리딘 오렌지 및 0.03 ㎎/㎖ Na2H2EDTA)을 가하고 혼합한다. 실온에서 1 분간 반응시킨 후, 혼합물을 실시예 1에서 사용한 표준 유동 세포분석기에서 측정하였다. 유동 세포분석기에서, 샘플을 100 ㎕/분의 속도로 측정하고 다시 청색 레이저(488 ㎚)로 여기시킨다. 200,000의 FL1-H 값이 트리거 신호로서 사용된다. 형광 신호(FL1-H, FL2-H 및 광 산란 신호(측면 산란, SSC-H)가 다시 얻어진다.
데이터 분석은 실시예 1에서 사용된 것과 유사하고 결과는 동일하여, 약 78.2%의 PMN 수준을 표시한다. 유동 속도는 비교적 높게 만들 수 있고 첨가제는 예측 정확도의 유의성 있는 손실 없이 사전-혼합하여 단일 시약으로서 첨가될 수 있기 때문에, 이것은 본 발명에 따른 방법이 산업적(연구에서와 반대로) 응용에 잘 맞는 것을 나타낸다.
동일한 실험적 변수를 사용하여 추가로 9개의 샘플에 대하여 측정하고 1 일 후(도 4에서 Day 1) 및 3 일 후(도 4에서 Day 3) 다시 측정을 반복하였다. 결과는 도 4에 나타내는데, Day 1 측정 결과가 샘플이 신선할 때(도 4에서 Day 0) 얻어진 결과와 비슷한 것과, 3 일 후 측정된 값은 Day 1(및 신선한) 값 보다 약간 낮은 것을 보여준다. 이것은 본 발명에 따른 방법이 3 일까지 보존된 샘플에서도 감염도의 지표를 결정하는 데 유용할 수 있음을 나타낸다. 이것은 어느 정도 거리가 있는 낙농가로부터 중앙 실험실에서 접수한 우유 샘플을 이 방법을 사용하여 측정할 때의 장점이다. 이 경우 접수된 샘플은 통상적으로 1일 또는 2일 경과된 보존된 샘플이다. 더욱이, 이것은 본 방법이 생균을 구분하는 데 사용될 수 있음을 의미하는데, 사망률은 시간에 따라 증가하기 때문이다.
유동 세포분석법을 사용하여 체세포 감별을 허용하기에 충분하지만 위에 논의된 바와 같이 분리 효과를 제공하는 것에 의해 샘플을 불리하게 희석하지 않는 적절한 양의 감별 표지, 예를 들어 아크리딘 오렌지 변색성 염료를 샘플에 첨가하는 것이 본 발명의 필수적인 특징이다. 적절한 농도는 한 예로서만 아래에 기술될 적절한 도트 플롯의 가시적 검사에 의해 합리적인 시행착오를 거쳐 실험적으로 결정될 수 있다.
다음 시약을 제조하였다: 1 ㎎/㎖의 PBS 중 아크리딘 오렌지, 0.1 g/㎖ Na2H2EDTA(pH=7) 및 정상 강도의 PBS. 다른 타입의 세포를 갖는 우유 샘플을 사용하고 다음 조합을 사용하여 시약과 혼합한다.
Figure pct00002
실온에서 1~2분간 반응시킨 후, 각각의 조합을 본질적으로 위의 실시예 1 및 2에서 기술된 방법으로 실시예 1 및 2에서 사용한 표준 유동 세포분석기에서 측정한다. 유동 세포분석기에서 샘플을 14 ㎕/분의 속도로 측정하고 청색 레이저(488 ㎚)로 여기시킨다. 400,000의 FL1-H 값이 트리거 신호로서 사용된다. 형광 신호(FL1-H, FL2-H) 및 광 산란 신호(측면 산란, SSC-H)가 사용된다.
데이터 분석을 위해, 적색 대 녹색(FL2-H 대 FL1-H) 형광을 플롯팅하고 결과를 도 5에 나타낸다. 2 ㎕ 또는 10 ㎕ 아크리딘 오렌지를 사용할 때 단 하나의 세포 집단이 플롯에 보여지는데(도 6), 즉 저농도의 아크리딘 오렌지는 충분한 감별을 제공하지 못한다. 대조적으로, 50 ㎕ 아크리딘 오렌지를 사용할 때에는 몇 개의 집단이 플롯에 보여진다(도 5 참조).
고농도의 아크리딘 오렌지를 EDTA와 조합할 때 매우 밀집된 집단이 우측으로 이동하여, 즉 도 5에 나타낸 것과 비교하여 이들 세포의 녹색 형광 강도가 증가한다(도 7).
샘플에 PBS 첨가는 도 8 및 도 9에서 보듯이 노이즈 수준을 감소시켜, 즉 노이즈로부터 세포를 분리하는 것이 보다 용이하다. 노이즈는 플롯의 좌측 부분의 쐐기형 집단이다. 도 8의 플롯에서(PBS가 없는 샘플) 노이즈 집단은 세포 집단의 하나와 겹친다. 도 9의 플롯에서(PBS가 있는 샘플) 노이즈 집단은 세포 집단의 하나로부터 보다 양호하게 분리된다.
이로부터 약 0.2 ㎎/㎖ 보다 큰 아크리딘 오렌지 농도가 적절한 감별을 부여한다는 결론을 얻을 수 있다. 원치 않는 희석 효과를 야기하지 않고 샘플에 첨가될 수 있는 시약의 양(단일 시약 또는 분리 첨가된 각각의 시약으로서)은 일상적인 분석에서 본 방법을 이용하는 시스템을 위한 최적 처리효율을 고려하여 결정될 수 있다. 이 양은 1:200 미만, 바람직하게는 1:50 미만, 가장 바람직하게는 1:5 미만의 희석을 제공해야 한다.
비록 이러한 실험적 측정이 아크리딘 오렌지에 관하여 예시되지만, 일련의 측정을 거쳐 당업자라면 본 발명에 따른 방법에 이용하기 위한 적절한 범위의 감별 표지를 결정하는 것이 합리적으로 예측될 수 있다는 것을 예상할 것이다. 또한 본 방법이 세포의 감별 측정으로서 상대적 형광 강도의 유동 세포분석법 측정에 관하여 기술된 반면, 이용되는 감별 표지의 성질에 따라 다른 감별 측정도 이용될 수 있다는 것도 예상될 것이다.

Claims (11)

  1. i) 세포 타입 간 감별을 제공하기에 충분한 양의 감별 표지를 포함하는 시약을 1:200 미만, 바람직하게는 1:50 미만, 그리고 가장 바람직하게는 1:5 미만의 희석율로 포유류 우유에 첨가하는 것에 의해 미분리된 샘플을 제조하는 단계;
    ii) 샘플에서 다른 세포 타입과 다르게 연관되는 표지로부터 야기되는 감별 표지에서의 차이를 감지하는 검출 시스템을 갖는 유동 세포분석기에 의해 샘플에서 표지에 의해 감별되는 하나 이상의 타입의 체세포 각각에 대하여 세포 수를 측정하는 단계; 및
    iii) 측정된 세포 수에 따라 감염도의 지표를 결정하는 단계를 포함하는 감염도 결정 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    지표를 결정하는 단계는, 측정된 세포 수를 각각 다수의 감염도와 연관되도록 사전 결정된 하나 이상의 참고값과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    총 체세포 수를 측정하는 단계를 더 포함하며,
    지표를 결정하는 단계는, 측정된 체세포 수를 각각 하나 이상의 감염도와 연관되도록 사전 결정된 하나 이상의 참고값과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포 수를 측정하는 단계는 다수의 다형핵 타입의 백혈구를 확인하고 계수하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    백혈구의 수를 계수하는 것은 임파구, 단핵구 및 대식세포 타입의 백혈구 중 하나 이상을 확인하고 계수하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    백혈구의 수를 계수하는 것은 임파구의 수를 확인하고 계수하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유류 우유는 소의 우유이고, 감염도의 지표를 결정하는 단계는, 유선염의 존재 및 정도 중 하나 또는 둘 다의 지표를 결정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    유선염의 지표는 무증상 유선염의 지표를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    임상적 유선염의 전개 가능성의 지표인 감염도를 결정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    변색성 염료가 감별 표지로서 이용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    변색성 염료가 0.2 ㎎/㎖ 보다 큰 농도의 아크리딘 오렌지인 것을 특징으로 하는 방법.
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