JPH01199161A - 白血球を定量且つ識別する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、白血球を未溶解の全血中にむいて、赤色蛍光
染料とフロー細胞定量法（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅ−ｔ
ｒｙ）技術を用いることによって赤血球及び血小板から
識別する方法に関する。

臨床環境を自動装置化する必要性から、いろいろな種類
の血球を数えうる多種類の装置の開発が余儀なくされて
きた。赤血球、血小板及び白血球の自動化計数は種々の
技術によって達成できる。

血球を数える際に用いるための装置の１つの種類は、フ
ロー細胞定員法技術に基づくものを含む。

７０−細胞定量法は個々の細胞の迅速な分析及び分類に
対する１つの高精度技術での顕微鏡及び生化学的分析の
利点の多くを兼ね備えている。この技術によって測定し
うる細胞は迅速に移動する流体流の中心に導入され、単
一ファイル（ｆ　ｉ　ｌｅ）を小さい直径のオリフィス
から均一な速度で流出させられる。粒子は層流（ｓｈｅ
ａｔｈ　ｆｌｕｉｄ）の囲りの層によって水圧的に流れ
の中心に向う。流れの中の細胞は光源の照射されている
測定位置を通過し、２．５ｘｌＯ”〜１０’細胞／分の
速度で測定される。細胞の測定にはレーザー光源を用い
る。

使用される典型的なレーザー光源は、アルゴンイオンレ
ーザ−（Ｕ　Ｖ、青色及び緑色光）、クリプトンレーザ
ー（黄色及び赤色光）、ヘリウム−カドミウムレーザー
（ＵＶ及び青色光）、及びヘリウム−ネオンレーザ−（
赤色光）を含む。

流動流中の細胞が光線の中を通過するとき、照射光は細
胞によって散乱し、異なる角度での散乱の強度は細胞の
大きさ及び表面の形態に関する情報を与える。光はすべ
ての方向に散乱するけれど、照射レーザー光線の軸に沿
う前方向において低角度で散乱する光［前角度（ｆｏｒ
ｗａｒｄ　ａｎｇｌｅ）光散乱：ＦＡＬＳ］の強度は細
胞の大きさと関係する。

例えばリンパ球は殆んどＦＡＬＳを示さず、大きいＦＡ
ＬＳを示すより大きい顆粒球から典型的に区別すること
ができ、一方単球は顆粒球と凡そ同一のＦＡＬＳ値を示
す。

細胞によって散乱され且つレーザー光線に対して直角に
集められる光（９０６又は直角或いは広角度光散乱）は
多くの場合細胞の内部又は表面構造から反射された光を
表わし、細胞の顆粒状態の指数として解釈される。ＦＡ
ＬＳと直角散乱パラメーターを組合せて用いれば人間の
血球の異なった種類を識別することにおいていずれのパ
ラメーターの場合よりも信頼性が増す。これらの２つの
パラメーターの他に、蛍光色素も問題の細胞を標識する
ために使用できる。照射レーザー光線によって励起した
場合に細胞によって発せられる蛍光は細胞の細区分を識
別するための細胞に関する更なる情報を与える。

米国特許第３．８８３．２４７号［アダムス（Ａｄａｍ
ｓ）　］は白血球を６つの範ちゅうに、即ちリンパ球、
単Ｌニュートロフィル、ニオシッフイル、パンフィル及
び未成熟顆粒球に識別分析するための組成物及び方法を
記述してい名。これでは、異染性の蛍光色素染料アクリ
ジンオレンジでの染色中に、非生理的媒体即ち低張水性
塩溶液によって細胞に「ショック」を与える条件下に細
胞を処理する。この方法は新しい血液試料を低張の水性
アクリジンオレンジ溶液中にある期間懸濁させ、次いで
この懸濁液を青色レーザーからの照射に供することを含
む。次いで青色レーザー照射からの励起に呼応して個々
の細胞から出る赤色及び緑色蛍光の大きさにおける差に
基づいて細胞を識別的に分類する。

アダムスの教示する方法の問題点は、それがアクリジン
オレンジ蛍光体を励起するために青色スペクトルに波長
をもつ照射を与えるアルゴンイオンレーザ−の使用を必
要とすることである。アルゴンイオンレーザ−は高価な
光源であり、赤色スペクトルに照射を与える光源、例え
ばヘリウム−ネオンレーザ−を用いることは更に望まし
いであろう。アダムスの方法の更なる問題は、それが白
血球を識別するために蛍光のパラメーターだけを用いる
ということである。それではフロー細胞定員法技術で使
用されるＦＡＬＳパラメーターのような細胞の大きさに
基づいて細胞を識別する手段が存在しない。斯くしてア
ダムスの方法はすべて１回の操作で赤血球、血小板及び
白血球の細区分を定量化し且つ識別するのに適当でない
。

アダムスの教示す６方法には更なる問題が存在する。低
張希釈剤の使用は赤血球の大きさを変化させてしまう。

これは細胞の正確な定量のために細胞の大きさの正確な
測定が必要な場合に欠点である。また赤血球はアクリジ
ンオレンジを吸収し、試料中の染料の有効濃度を変化さ
せる。この結果白血球を染色するために存在する染料が
少くなる。

この問題はアクリジンオレンジの有効範囲が狭いため解
決するのが困難である。染料をあまり高濃度で用いれば
すべての細胞が最大量の染料を吸収し、結果として細胞
の識別が妨害される。染料濃度が低すぎれば、全熱染色
が起こらない。

本発明の目的は、白血球を赤血球及び血小板から識別し
、更に赤血球、血小板及び白血球を定量化する方法を提
供することである。フロー細胞定量技術を用いる１回の
操作で少くとも４つの部分の異なる白血球が得られる。

本発明の更なる目的は、ヘリウム−ネオンレーザ−のよ
うな高価でない光源によって励起しうる広い有効濃度範
囲を有する赤色蛍光染料、例えばオキサジン染料を用い
ることによって白血球の識別を達成することである。

本譲受人は現在赤血球、白血球及び血小板を数えうるＥ
ＬＴ装置シリーズを商業的に提供している。更にこれは
次の５つの伝統的なパラメーターも測定できる：ＨＧＢ
（ヘモグロビン）、ＨＣＴ（ヘマトクリット）　、ＭＣ
Ｖ　（平均細胞容量）、ＭＣＨ（平均細胞ヘモグロビン
）及びＭＣＨＣ（平均細胞ヘモグロビン濃度）。ＥＬＴ
系は３つの部分の異なる白血球、即ちリンパ球、顆粒球
及び半球を計数する。しかし顆粒球をニューロフィル、
バッフイル及びニオシッフイルに更に区別することによ
って白血球を４つ又は５つの部分に識別しうる装置が必
要とされている。

白血球を３つの部分に識別する従来法は、赤血球を溶解
するという患者の血液試料の２段階希釈を必要とした。

この溶解は、従来法が白血球を赤血球から区別できなか
ったから必要であった。赤血球を試料から除去し、その
白血球分析への干渉を防止するために赤血球を溶解した
。溶解法の主な欠点はいくつかの赤血球が耐溶解性であ
ることである。更に溶解剤は白血球も溶解するか或いは
白血球の分布特性に致命的に影響する。そのような結果
は細胞数の精度に不利に影響する。

米国特許第４．２８４，４１２号［ハンセン（Ｈａｎｓ
ｅｎ）ら】は、血液試料中の血球の亜種を数えるための
自動化法を記述している。この方法は分析すべき試料中
の赤血球の溶解及び続く白血球亜種、即ちリンパ球、単
球及び顆粒球の計数を含む。直角散乱、前角度散乱及び
緑色蛍光値を測定するために７０−細胞定量法を使用す
る。緑色蛍光値を生じさせるためにＦＩＴＣ標識及びア
ルゴンイオンレーザ−が使用される。

米国特許第３．９１６．２０６号及び第４．　１４６．
６０４号Ｅ両方ともフライネルマン（Ｋ　ｌｅｉ−ｎａ
ｒｍａｎ）］は、白血球、赤血球、網赤血球を数えるた
めの方法及び組成物、そして白血球の識別的計数及び分
類を記述している。リンパ球、半球、ニュートロフィル
及びエオシノフイルヲ（Ｋ　ＩＩＩ　ｔ　６ために、３
つの異なる種類の染料（エチジウムブロマイド１、ブリ
リアント・スルファフラビン及びスチルベンジスルホン
酸誘導体）が記述されている。この方法はスライドガラ
ス板上に塗り、アルコールで固定した血液試料を調製す
ることを含む。

そして細胞の識別的染色を検出するために、この血液塗
布物を３種の異なる光源（ＵＶ、紫色及び緑色）で照射
する。

シャピロ（Ｓ　ｈａｐｉｒｏ）らは、白血球の５つの部
分、即チリンハ球、半球、ニュートロフィル、ニオシッ
フイル及びバッフイルを得るためにフライネルマンの開
発した同一の染料組成物を７０−細胞定量法に使用した
［シャピロ、Ｈ，Ｍ、ら、ジェイ・ヒスト・アンド・シ
ト（Ｊ、　Ｈｉｓｔ、　ａｎｄ　Ｃｙｔ、　）、（１９
７６）、２４＝３９６〜４１１．シャピロ、Ｈ，Ｍ、ら
、ジェイ・ヒスト・アンド・シト、（１９７７）１．λ
ｊ１．９７６〜９８９］。記述されている方法は最初に
染料の捕捉を高めるために、血液試料を等張溶液中にお
いて細胞の溶解を回避しつつグルタルアルデヒドで固定
することを含む。

細胞を固定した後に染料組成物を添加し、次いで更に希
釈して細胞フォトメーターで最適な細胞の採取割合が得
られるようにする。蛍光の前角度散乱、直角散乱及び３
つの異なる蛍光値のパラメーターを測定する。３つの異
なるレーザーを用いて試料を照射する。

米国特許第４．３７６．８２０号［ギアンニニ（Ｇ　１
ａｎｎｉｎ　ｉ　）ら］は、血液試料中の白血球の全数
及び顆粒球、半球及びリンパ球の数の定量的評価法を記
述している。この方法は等張水溶液中での白血球、オキ
サジン染料及びクエンチャ−分子の付加物の生成を含む
。得られる付加物を、第１のパルス光線及び第２の単色
光線による照射に供する。後者の光線の出口の光学的強
度を時間の関数として解析する。細胞の旭理前に、血液
試料を白血球と赤血球に分離し、或いは白血球を最初に
濃縮する。

米国特許第４，４００．３７０号［カス（Ｋａｓｓ）］
は、白血球を５つの部分に分けて分析するための手動法
を記述している。この方法は白血球の試料を染料塩基性
オレンジ２１号と接触させてリンパ球、ニュートロフィ
ル、ニオシッフイル、バッフイル及び半球を区別するこ
とを含む。この特許は１つの独特な染料、即ち塩基性オ
レンジ２１号の使用を記述し、他の染料を例示していな
い。特許は、用いる染料が細胞の識別を達成するために
メタクロマジーでなければならないということを記述し
ている。オキサジン種は記述されている方法で取り扱い
うるいくつかの種類を有することが提案されている。記
述されている方法は細胞の形態の自動顕微鏡的分析を必
要とし、従ってフロー細胞定量法では使用できない。

米国特許第４．４６３．０９９号［バロンセリ（Ｂ　ａ
ｒｏｎｃｅｌｌｉ）ら］は免疫蛍光試薬としてオキサジ
ンを用いることを記述している。記述されている免疫蛍
光試薬は標識すべき蛋白質、架橋剤及びオキサジン染料
を反応させることによって製造される。

本発明は未溶解の全血において、白血球を赤血球及び血
小板から区別する方法を提供する。この方法は検討すべ
き血液から試料の一部を準備し、次いでこの試料の一部
を一段階で、赤色光を吸収する蛍光染料を含む等張溶液
で希釈することを含んでなる。この染料は長波長の照射
、即ち赤色スペクトルで励起され、赤色スペクトルの照
射を発する。血球の溶解は本方法において必要ない。血
球は適当な時間染料と接触せしめられ、細胞を識別的に
染色する。希釈された試料の一部の少くとも一部分、実
質的には一度に一細胞は赤色の光学的蛍光刺激域中を通
過する。この領域は細胞の予想される寸法よりもいくら
かだけ大きい断面寸法を有していてよい。細胞がこの領
域を通過するにつれて、刺激された細胞からの前角度光
散乱、直角光散乱及び赤色蛍光を検知し、測定する。次
いで白血球が赤血球及び血小板と異なる前角度散乱、直
角散乱及び赤色蛍光染色性を有するということに基づい
て赤血球及び血小板から識別される。

本発明の方法は白血球を少くとも４つの細区分、即ちリ
ンパ球、単球、ニュートロフィル及びニオシッフイルに
識別する。・更に第５の細区分、バッフイルも識別しう
る。

本発明は白血球の定量化及び白血球の、フロー細胞定量
法を用いる蛍光により少くとも４つの細区分への識別に
対する染料組成物も提供する。本組成物は白血球の細区
分を識別的に染色でき、但し血球を溶解しない赤色光を
吸収する蛍光染料を含む等張溶液を含んでなる。好適な
具体例において、染料はオキサジン染料である。好適な
オキサジン染料はオキサジン１７０である。

臨床的血液学で用いるために現存する細胞計数器は、多
くの赤血球中の比較的少ない白血球を検出するためにい
くつかの種類の赤血球の溶解を用いる。このための理由
は、赤血球を最初に除去しないならば、従来法が白血球
を試料中の赤血球から十分に識別できないということで
ある。この溶解法の主たる欠点は、これが耐溶解性の赤
血球に敏感なことである。本発明は血球を溶解しない赤
色光を吸収する蛍光染料組成物を用いることによってこ
の欠点を克服する方法を提供する。

本発明の染料は等張溶液に溶解し、−段階の希釈で全血
希釈剤として使用される。血球種間の構造的相違のため
に、白血球は本組成物と混合した時、赤血球又は血小板
よりも実質的に大きい蛍光を発現する。適当な蛍光の励
起及び検知系を用いることにより、白血球は未溶解の全
血中において赤血球及び血小板から識別される。赤血球
及び血小板は、適当な赤色蛍光しきい値（ｔｈｒｅｓｈ
ｏｌｄ）により白血球から容易に分離されるような低い
蛍光を示す。すべての細胞種がこの方法では完全でいる
（溶解がない）から、白血球、赤血球及び血小板の計数
は１回の希釈で行なうことができる。

赤色光を吸収する蛍光染料を用いることの利点は、それ
が励起源として赤色レーザー、例えばヘリウム−ネオン
レーザ−の使用を可能にしたことである。ヘリウム−ネ
オンレーザ−は他のレーザー例えばアルゴンイオンレー
ザ−よりも安価であり、その使用はレーザーを用いる血
液学装置の価格を低下させる。更に長波長で励起され且
つ長波長に光を発する蛍光物質の使用は、その波長が他
の生体分子からの自然の蛍光を排除して容易に検出しう
るから望ましい。そのような自然の蛍光は、さもなけれ
ばバックグランド信号となり、しばしば蛍光標識からの
望ましい信号を覆いかくシ、従って感度を低下させる。

本発明の方法の更なる利点は、それが白血球の区分の識
別を可能にするということである。細胞膜の性質、大き
さ及び内部構造の相違は、白血球の細区分の識別的蛍光
染色性を与える。斯くしていくつかの血球球種は他のも
のよりも大程度に染色され、この結果これらの細胞によ
り高量の蛍光を付与する。前角度光散乱性及び直角光散
乱性と関連して、この蛍光現象はリンパ球、単球、ニュ
トロフィル、ニオシッフイル及びバッフイルを数えるこ
とを可能にする。

第１Ａ図は赤色蛍光（縦軸）の、直角散乱（横軸）に対
する白血球細胞図を示す。細胞図における各「点」は分
析される試料中の１つ又はそれ以上の白血球から得られ
る値を表わす。これらの細胞は電子的に設定されたしき
い値を起える赤色蛍光値を示す。このしきい値以下、即
ち細胞図で示されない場合には、赤血球及び血小板から
得られる値である。領域Ｉは正常なリンパ球に対する値
が見出される領域を定義する。単球に対する値は領域２
にある。またニュートロフィルに対しては領域３及びニ
オシッフイルに対しては領域４に見出される。

第１Ｂは赤色蛍光の、前角度散乱に対する白血球細胞図
を示す。この細胞図は、直角散乱の代りに前角度光散乱
を示す以外実施例ＩＡと同一の試料を表わす。この表示
において、ビオフィルは領域５に入る細胞を数えること
によって計数しうる。

本発明は、患者から得た未溶解の全血試料において白血
球を赤血球から識別する方法を提供する。

本方法は赤色レーザー例えばヘリウム−ネオンレーザ−
によって簡便に刺激しうる赤色光を吸収する蛍光染料を
利用する。この方法は白血球の少くとも４つの明白な細
区分の識別を可能にする。この細区分はリンパ球、単球
、ニュートロフィル及びニオシッフイルを含んでなる。

これらの細区分は細胞図において赤色蛍光値を直角散乱
値に対してプロットすることによって識別し且つ計数す
ることができる。更に白血球の第５の細区分も識別しう
る。この第５の細区分、パンフィルは別の細胞図におい
て赤色蛍光値を前角度散乱値に対してプロットすること
によって識別できる。

本発明の赤色光を吸収する蛍光染料は、白血球の適当な
計数と識別を可能にするいずれかの赤色光を吸収する染
料であってよい。この染料はすべての血球、即ち白血球
、赤血球及び血小板中に浸透しうるが、血球種間の自然
の相違（即ち内部細胞構造における相異）のために、実
質的により大きい蛍光が白血球中に発現する。ある正に
荷電した有機染料は、血球を細胞化学的に染色するのに
特に良好に働く。斯くして適当な染料は、血球膜を横切
ることができ且つ細胞化学的に血球を染色する、即ち細
胞顆粒を染色し又は細胞質成分に結合しうる正に荷電し
た有機染料という特性を有する。

すべての意図及び目的に対し、赤血球は他の細胞より少
ない染料を捕捉し且つ適当な蛍光しきい値によって白血
球から分離されると考えられるから非蛍光体として見な
すことができる。更に膜の性質、核の構造、大きさ及び
内部細胞の顆粒性に関して、白血球の再区分間の相違は
異なる直角光散乱及び蛍光染色性を与える。これらの性
質の相違は白血球の計数及び比較的未変性の全血環境に
おける白血球亜種間の識別を可能にする。

赤色光を吸収する蛍光染料の特別な種類はオキサジン種
である。使用されるオキサジン染料は、正に荷電し、血
球膜を横切ることができ、顆粒を染色し又は細胞質成分
に結合する。

適当なオキサジン染料の例は、構造式！又は■Ｉ　　　
　　　　　　　　Ｉｆ ［式中、Ｒ１及びＲ２は同一でも異なってもよく且つ構
造式の中央の環における環窒素と共鳴構造を形成しうる
第一、第二又は第三アミンである］ を有するものである。第二及び第三アミンはアルキル、
アリール、アリールアルキル又はアルキルアリール基で
置換されていてもよいＯＲ”、Ｒ’％Ｒ７及びＲｍはＨ
またはＣ，−Ｃ，アルキルであってよい。Ｒ４及びＲ１
はそれぞれ独立にＨ又はＣ８〜Ｃ４アルキルであってよ
く或いはそれらが結合する２つの炭素原子と一緒になっ
てベンゼン環を形成し、即ちナフタレン環構造を形成し
てもよい。

Ｒ１及びＲ１に対する適当なアルキル及び芳香族置換基
は次の通りである： ＮＨ，、ＮＨ（メチル）、Ｎ（メチル）３、ＮＨ（エチ
ル）、Ｎ（エチル）３、ＮＨ（ｎ−プロピル）、Ｎ（ｎ
−プロピル）８、ＮＨ（ｎ−ブチル）、Ｎ（ｎ−ブチル
）！、ＮＨＣＨ，ＣＨ，ＮＨ−Ｃ−（フェニル）、Ｎ　
ＨＣＨｚＣＯＯＨ，Ｎ　Ｈ（ＣＩ（＊）ｔＮ　Ｈｚ又は
カチオン性オキサジン染料は適当なアニオン例え１ｆｃ
ｌ″″、Ｃ１０ａ−、Ｎ　Ｏｘ−又はＣＩ（、ＣＯ，−
の塩として製造しうる。好ましくは、アニオンはより安
定な染料組成物を形成することの示されたＣＩ″″であ
る。

オキサジン染料の好適な群は、構造式■を有する、但し Ｒ１はＮ（エチル）２、ＮＨ（４チル）、Ｎ（ｎ−ブチ
ル）、又は、 Ｒ１はＮＨ（ベンジル）、ＮＨＣＨ，ＣＨ，ＮＨＣ思 Ｈ，Ｃ０ＯＨ，ＮＨＣ）Ｉ、ＣＨ，Ｎ１（−Ｃ−（フェ
ニル）又はＮ　Ｈ（Ｃ！　Ｈｓ　）であり：そしてＲ３
はＨまたはメチルである、 ものである。

好適なオキサジンはオキサジン１７０で、構造式 白血球の良好な識別を提供する他のオキサジンは次の構
造式を有する： 本発明のオキサジン染料は１．約６１０〜約６６Ｑ　ｎ
ｍ、更に特に６１０へ６３５ｎｍのスペクトル範囲に最
大吸収波長を有する。この染料に対する最大発光波長範
囲は約６２０〜約７１０ｎｍ及び更に最適には６４０〜
６９０ｎｍの範囲である。６１０〜６６０ｎｍの範囲の
励起波長を付与しうるいずれの光源も、オキサジン染料
に対する赤色の光学的刺激源として使用しうる。ヘリウ
ム−ネオンレーザ−は約６３２．８％ｍの発光波長を有
するそのような光源である。

オキサジン１７０（文献にはオキサジン７２０としても
言及されている）はレーザーポンプ性（ｐｕｍｐａｂ　
ｌｅ）の効果的なレーザー染料であり、約６２３ｎｍの
最大吸収波長を有する。この分子はそのままでヘリウム
−ネオンレーザ−によって効果的に励起される。好適な
具体例において、オキサジン１７０のクロライド塩が本
発明において使用される。このクロライドアニオンは溶
液中において染料カチオンから解離し、最適な蛍光効率
とする。

本発明の染料の発色団は環窒素原子及びＲ１及びＲ１の
アミノ基の窒素原子からなる。分子上の正の荷電はＲ１
及びＲ２間で前後に共鳴しうる。この時正の荷電を有す
る窒素は炭素−窒素二重結合も有する。同業者には公知
の共鳴構造を安定化させる他の官能基がＲ１及びＲ２に
おけるアミノ基に代替していてもよい。１つのそのよう
な官能基はフェノール性水酸基である。

本発明の方法において、赤色光を吸収する蛍光染料は生
理学的媒体例えば凡そ中性のｐＨを有する等張溶液中に
含有される。この等張溶液は食塩水溶液である。溶液の
緊張性（ｔｏｎｉｃｉｔｙ）の、アニオンとカチオンの
適当なバランスによる維持は適当な染色反応を達成する
のに重要である。この等張溶液は一段階希釈における血
液試料の一部の希釈剤として使用される。染料濃度の最
適化、イオンバランス及び細胞を染料試剤にさらす時間
の長さは白血球のリンパ球、半球、二ニートロフィル、
ニオシッフイル及びバッフイルへの識別を可能にする。

本組成物中の染料の濃度は、・適当には約０．００１〜
約３．０ｍＭ及び好ましくは０．Ｏ１〜０．０３ｍＭの
範囲内である。好適な染料濃度は０．０２ｍＭである。

染料と接触させ且つ混合すべき血球に対する適当な時間
は約５〜約９０秒である。　本発明の染料組成物は好ま
しくはｐＨ範囲７．１〜７．９に緩衝されている。この
緩衝はホスフェート緩衝剤系で達成しうるが、適当なｐ
Ｈを維持しうる他の緩衝剤も全く適当である。他の適当
な緩衝剤はＨＥＰＥＳ及びＤＩＰＳＯ［［グツド（Ｇｏ
ｏｄ）　Ｊ系の有機含窒素緩衝剤］である。

本染料組成物は細菌学的保存剤例えば１．３−ジメチロ
ール−５，５−ジメチルヒダントインも含有しうる。こ
の成分はバクテリヤ静止性又は殺バクテリヤ性を有する
多くの他の化合物の１つで代替されてもよい。ジアゾリ
ジニル尿素又はクロルアセトアミドは２つの可能性を表
わす。保存剤の適当な量は水性染料組成物の約０．０５
〜０．４％（ｖ／ｖ）の範囲内である。更なる試剤の安
定化に対して、少量のＥＤＴＡを添加してよい。ＥＤＴ
Ａは試剤の性能に対して決定的でなく、悪影響なしに省
略することができる。

染料組成物は測定する細胞の合体性及び形態を保存する
ために滲透圧バランス化合物又は緊張性剤も含有しうる
。塩化ナトリウムは血清の重要な構成分であり、その使
用は適当な滲透圧バランス（例えば正常な全血中に存在
するそれ）を維持する問題に対する簡便な解答となる。

他の滲透圧バランス剤例工ばマンニトール又はソルビト
ールは理にかなった代替物である。組成物中の緊張性剤
の量は、滲透圧を約２５０〜約３３０　ｍｏｓｍの範囲
内に維持するのに十分であるべきである（等張性は約２
８０〜２９５ｍｏｓｍである）。

機械系における試剤の流動性を改善するために、表面活
性剤を染料組成物に添加してもよい。トリトン（Ｔｒｉ
ｔｏｎ）　Ｘ　−７０５は適当な表面活性剤である。細
胞にとって有害でない他の表面活性剤９１Ｌばプルロニ
クス（Ｐ　１ｕｒｏｎｉｃｓ）はその代替物である。表
面活性剤の適当な量は約０．０４〜約０．０６％（ｖ／
ｖ）の範囲内である。

本発明は、赤色光源と赤色蛍光、前角度光散乱及び直角
散乱に対する適当な検出器からなる測定系を利用する。

血球がフロー細胞定量系内の光学的刺激域中を通過する
につれて、装置内の光センサーは各細胞の光特性、即ち
前角度散乱、直角散乱及び赤色蛍光を測定する。光セン
サーは電気信号を発生し、これを続く解析のために増巾
する。

装置によって集められたデーターの出力は、細胞図にお
いて発生した信号の増巾のプロットであってよい。好ま
しくはこのデーターをプロットし且つ解析するためにコ
ンピューターのプログラムを利用する。２つの有用な細
胞図は赤色蛍光値の直角散乱値に対するプロット及び赤
色蛍光値の前角度散乱値に対するプロットである。

本明細書で使用される如き「細胞図（ｃｙｆｏｇｒａｍ
）Ｊとは、点のプツトとしての細胞データーの表示を表
わす。この時細胞図上の各点は多くの細胞を表わす。各
点を表示するために１６レベルの灰色スケールを用いる
。カソード光電管（ＣＲＴ）上に示される点の輝き又は
寸法は存在する細胞数を示す。点の位置は各細胞種に独
特な選択されたパラメーターに比例する座標で与えられ
る。細胞図上の魚群又は点集合は同様な種の細胞群を表
わす。

コンピュータープログラムは、細胞図形（２元ヒストグ
ラムとしても公知）において細胞データを自動的に得る
ように書かれていてよい。これは問題の２つのパラメー
ターを表わす点の２次元的配列である。この配列を作る
パラメーターの解像度は、種々の群を適当に表わし且つ
識別するのに十分でなければならない。白血球の３つの
部分の識別的魚群を数える方法は米国特許第４．５９６
゜０３５号［ガーシュマン（Ｑ　ｅｒｓｈｍａｎ）ら］
に記述されている。

群の数、形態又は位置が予じめ設定した限界を越える場
合或いは２つの群が「重なり」によって互いに相互作用
して不正確な群の数を与える可能性がある場合、異常試
料の合図がある。測定者は結果のフォーマット（即ちＣ
ＲＴスクリーン、）１−ドコピー）上の音による信号又
は指示のいずれかによってそのような合図に気付く。

前角度散乱値に関して、血球の種類間に次の関係が存在
する： 血小板く赤血球≦リンパ球≦バッフイル≦単球くニュー
トロフィル及びニオシッフイル顆粒球群内において、パ
ンフィルは最も低い値ヲ有スる。ニュートロフィル及び
ニオシッフイルは互いに凡そ同一の値を有し、そしてそ
れはバッフイルよりも高い値である。

直角散乱値に関して、白血球細区分に対して一般に次の
関係があるが、群にはいくらかの重なりが存在しうる。

リンパ球＜単球及びバッフイルくニュートロフィル及ヒ
エオシノフィル ニュートロフィル及びニオシッフイルは互いに凡そ同一
の値を有する。バッフイルは半球と凡そ同一の値を示す
。

種々の細胞種に対する赤色蛍光値は、どの位の染料が各
細胞に捕捉されたかに依存する。赤血球は他の細胞より
染料を捕捉しないと考えられ、従ってそれは無蛍光であ
ると考えてよい。血小板は顆粒球と凡そ同程度に染料に
よって染色される。

しかしながら個々の血小板は顆粒球により非常に小さい
から、細胞当り、顆粒球はど多くの染料分子を捕捉せず
、従って細胞当りの蛍光が小さい。

また血小板は顆粒球よりも非常に低い前角度散乱値を有
し、従って大きさによって区別することができる。

白血球の細区分は赤色蛍光値に対して次の関係を有する
： リンパ球及びニオシッフイルく単球、二二一トロフィル
及びパンフィル リンパ球は単球、ニュートロフィル及びパンフィルより
も低い赤色蛍光値を有する。リンパ球はニオシッフイル
と凡そ同一の赤色蛍光値をもつ。

半球、ニュートロフィル及びパンフィルは凡そ同じ値を
示し、ニオシッフイルはその各よりも低い値を有する。

バッフイルは他の顆粒球よりも低い前角度散乱値を有す
るから、それらは区別することができる。単球は直角散
乱値に基づいて顆粒球から区別しうる。斯くして直角散
乱値及び赤色蛍光値は単球及び顆粒球をリンパ球から区
別し、またニオシッフイルを他の顆粒球から区別するの
に使用することができる。

本発明の方法の利点は、それがパンフィルの、他の白血
球の細区分からの識別を可能にしたことである。人間の
バッフイルは循環する白血球の最も少ないものである。

典型的にはパンフィルは普通の健康な成人の場合すべて
の循環する白血球の約０．６％を構成する。健康な成人
の９５％において、パンフィルは決して白血球数の１．
８％を越えない。パンフィルをスクリーニングするため
の迅速で信頼しうる方法の存在は、手動によるパンフィ
ルの計数が遅く、正確でないから、臨床医に恩恵を与え
るであろう。

循環するパンフィルの低数が、パンフィルが人間の病気
に果す役割についての生医学的研究の障害であったけれ
ど、パンフィルは病気の過程に関与している。例えば気
管支喘息のようなアレルギー反応において、ＣＭＬ　（
慢性の骨髄性白血病）のような骨髄増殖型の白血病にお
いて、及び腫瘍性大腸炎においてバッフイルの増加が報
告されている。従って白血球中のバッフイルを知ること
によって、臨床医はこれらの及び多分他の病気の進行を
検知し或いは監視することが可能になろう。

次の実施例は本発明を更に明らかにしよう。実施例は本
発明の適用に関する純粋な例示である。

実施例　１ 本方法を、「インサイド（Ｉ　ｎＣｙｔｏ）　Ｊ血液分
析機［オルト・ダイアグノスチック・システムズ社（Ｏ
ｒｔｈｏ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　
Ｉｎｃ、）　］を用いて行なった。この装置は白血球を
赤血球及び血小板から識別するために赤色蛍光の検知を
使用する。更に染料の濃度、その希釈成分及び染色時間
を調節することにより、また更に光散乱の測定を行なう
ことにより、この装置は白血球の亜種を識別することが
できる。

用いる染料組成物を、次の成分を蒸留水ｌＱ中で混合す
ることによって調製した： 使用可能 １．３−ジメチロール−５，５− ジメチルヒダントイン　　　　１．８２ｍｆｆ　　　　
Ｏ，９１ｍｆｆ　−３，６４ｍＭ燐酸カリウム（二塩基
性）　　　　　２．１２ｇ２９−２．４ｇトリトンＸ　
−７０５０，５ｍｆｆ　　　　０．４ｍＱ　−，６ｍＱ
ＤＴＡ にナトリウム、二水和物）　　　０．２ｇ０９−０．４
９蒸　留　水　　　　　　　　　　ｌＱにするのに十分
な量ｐ’Ｈ及び滲透性（ｏｓｍｏ　ｆａｒ　ｉ　ｔｙ）
の範囲は上記組成で考えられるものよりもいくらか広く
てよい。

実際には、組成物はｐＨ７，１〜７．９及び滲透圧２５
０〜３３０　ｍｏｓｍで適当に機能しよう。「インサイ
ド」装置はこの試薬中の赤血球を測定する。

それ故に、これは赤血球の容積変化を防ぐために試薬が
等張付近であることに限定される。

染料成分は明らかに活性成分であるけれど、他の成分も
、白血球の合体性を維持し且ついくつかの場合には細胞
による染料の捕捉に影響することによって血球の染色の
進行に重要な役割を演する。

上述の染料組成物を、「インサイド」において全血を希
釈し且つその中の血球を染色するために使用した。全血
を装置に吸い取り、約４０μａを上述の染料組成物的１
６００μＱで希釈した（希釈比１：４０）。この溶液を
チャンバー（ｃｈａｍｂｅｒ）に誘導し、約８秒間混合
した。次いで染料／混合物を７０−セル中ヘポンプで送
りこみ、そこで血球を赤色レーザー光線（ヘリウム−ネ
オン）中を一列で通過させた。この方法において、光散
乱及び蛍光の測定を各細胞について行なった。記述する
条件及び組成物に対して最大の蛍光が発現するタイム・
ウィンドウ（ｔｉｍｅ　ｗｉｎｄｏｗ）巾測定を行なっ
Ｉ；（例えば２３〜４０秒）。これは白血球の赤血球及
び血小板からの容易な識別を可能にする。

赤血球と血小板を前角度光散乱で数えた。次に多数の細
胞がレーザー光線中を同時に通過するように試料流を増
加した。この期間中、はっきりした蛍光の白血球をにぶ
い蛍光の赤血球（このいくつかはレーザー光線中を通る
時各白血球と共に存在した）から識別するために赤色蛍
光を用いた。

白血球亜種は異なる膜及び内部構造性を有するから、細
胞の染料捕捉及び固有の光散乱特性は、第１Ａ及び１８
図に示すように、５つの分類を識別するに十分変化する
。リンパ球及びニオシッフイルは半球及びニュートロフ
ィルよりも蛍光が弱く、それ故にそれぞれ第１Ａ図の領
域ｌ及び４で表わされる。二ニートロフィル及びニオシ
ッフイルはリンパ球及び単球より大きい直角散乱を示し
、それ故にそれぞれ第１Ａ図の領域３及び４で表わされ
る。これらの２つのパラメーターを互いに対してプロッ
トすると、これらの細胞種を表わす群は四分円に入り、
数えることができる。レーザー光線中に各白血球と共に
存在した白血球は非常に小さい直角散乱を有し、そして
群のわずかなよごれ（水平方向における）だけに関わっ
た。第５の亜種、バッフイルを表わす群（領域５で表示
）は、前角度散乱を赤色蛍光に対してプーットした時明
白になる。この場合、バッフイルは低前角度散乱と高赤
色蛍光を示し、一方他の亜種は低前角度散乱、低赤色蛍
光、又は高前角度散乱、高赤色蛍光のいずれかを示した
。赤血球は結果を電子的に越える赤色蛍光を用いること
によって殆んど考慮する必要がなかった。

白血球の５つの亜種は本発明の方法によって容易に同定
されることは明らかである。これらの５つの亜種は正常
な血液試料中に予期できるものを表わす。他の細胞種を
含む異常な血液試料では、前述した位置以外に更なる群
の現われることがあり、或いはその群が亜種の正確な識
別を許さない程度まで存在する群に重なることがある。

これらの状態では「合図」があり、この結果その試料は
異常な細胞種を含むものとして同定される。

赤色蛍光を直角散乱に対してプロットした正常な血液の
結果を第１Ａ図に示す。同一試料に対する赤色蛍光の前
角度散乱に対するプロットを第１Ｂ図に示す。

本発明の他の具体例は本明細書に開示する本発明の詳細
又は実施例を考慮すれば同業者にとって明らかになるで
あろう。この詳細又は実施例は単なる例示と見なされる
ことが意図され、本発明の真の範囲及び精神は特許請求
の範囲に示される。

なお本発明の主な特徴及び態様は以下の通りである。

１、ａ、検討すべき血液から試料の一部をとり；ｂ、こ
の試料の一部を一工程において、赤色光を吸収する蛍光
染料を含有する等張溶液で希釈し、この結果血球細胞は
適当な期間染料と接触させて細胞を識別的に染色し： ｃ、この希釈した試料の一部の少くとも一部分、実質的
には一度に一細胞を、赤色蛍光の光学的刺激域を通過さ
せ； ｄ、該域で刺激された細胞からの前角度光散乱、直角光
散乱及び赤色蛍光を検出し且つ測定し；そして ｅ、白血球が赤血球及び血小板と異なる前角度散乱、直
角散乱及び赤色蛍光染色性を有するということに基づい
て白血球を赤血球及び血小板から識別する、 ことを含んでなる未溶解の全血中の白血球を赤血球及び
血小板から識別する方法。

２、染料が血球細胞膜を横切りそして血球を細胞化学的
に染色しうる正に荷電した有機染料である上記ｌに記載
の方法。

３、染料が白血球を他の血球よりも大きい程度に蛍光を
発しせしめる上記２に記載の方法。

４、染料がオキサジン染料である上記ｌに記載の方法。

５、オキサジン染料が構造式Ｉ又は■ Ｉ　　　　　　　　　　　ＩＩ ［式中　Ｒ１及びＲ２は同一でも異なってもよい第一、
第二又は第三アミンであり、そしてＲ１の窒素と共に正
に荷電した二重結合が形成され、Ｒ３、Ｒ６、Ｒ１及び
ＲａはＨ又はＣ８〜Ｃ，アルキルであり；そしてＲ４及
びＲ６は独立にＨ又はＣ３〜Ｃ４アルキルであり或いは
それらが結合する２つの炭素原子と一緒になってベンゼ
ン環を形成する］ を有する上記４に記載の方法。

６、Ｒ１及びＲ１がＮＨ，、ＮＨ（メチル）、Ｎ（メチ
ル）２、ＮＨ（エチル）、・Ｎ（エチル）２、ＮＨ（ｎ
−プロピル）、Ｎ（ｎ−プロピル）！、ＮＨ（ｎ−ブチ
ル）、 層 ＮＨＣＨＩＣＨ！ＮＨ−Ｃ−（フェニル）、ＮＨＣＨ，
ＣｏｏＨ，ＮＨ（ＣＨり！ＮＨ！又はの方法。

７、染料がＩの構造式を有し、そして Ｒ１がＮ（エチル）！、ＮＨ（エチル）、Ｎ（ｎ−襲 Ｈｚ　ＣＯＯＨ１Ｎ　ＨＣＨ＊　ＣＨ！　Ｎ　ＨＣ（７
ｘ　ニル）又はＮＨ（エチル）であり； Ｒ３がＨ又はメチルであり；そしてＲ′及びＲ５がそれ
らと結合する炭素原子と一緒になってベンゼン環を形成
する、 上記６に記載の方法。

８、染料がアニオンの塩である上記６に記載の方法。

９、アニオンがＣｌ−１ＣＩＯ４−５ＮＯ，−１又はＣ
Ｈ，ＣＯ，−である上記８に記載の方法。

１０、染料がオキサジン１７０である上記２に記載の方
法。

１１、染料が血球を溶解しない上記ｌに記載の方法。

１２、赤色蛍光の光学的刺激をヘリウム−ネオンレーザ
−により行う上記ｌに記載の方法。

１３、白血球を少くとも４つの細区分に区別する上記ｌ
に記載の方法。

１４、細区分がリンパ球、単球、ニュートロフィル（ｎ
ｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）及びニオシッフイル（ｅｏｓ　１
ｎｏｐｈ　ｉ　ｌ　）を含んでなる上記１３に記載の方
法。

１５、細区分を、赤色蛍光値を直角散乱値に対してプロ
ットすることによって識別する上記１４に記載の方法。

１６、細区分が更にパンフィル（ｂａｓｏｐｈ　ｉ　ｌ
　）を含んでなる上記１４に記載の方法。

１７、パンフィルを、赤色蛍光値を前角度散乱値に対し
てプロットすることによって他の血球から識別する上記
１６に記載の方法。

１８、等張溶液が約７．１〜７．９の範囲内のｐＨを有
する上記ｌに記載の方法。

１９、等張溶液が更にバクテリヤの生長を防止するため
の保存剤を含有する上記ｌに記載の方法。

２０、保存剤が１．３−ジメチロール−５，５−ジメチ
ルヒダントインである上記１９に記載の方法。

２１、工程（ｂ）における安定化期間が約５〜約９０秒
である上記１に記載の方法。

２２、ａ、検討すべき血液から試料の一部をとり；ｂ、
この試料の一部を一工程において、赤色光を吸収する蛍
光染料を含有する等張溶液で希釈し、この結果血球細胞
を適当な期間染料と接触させて細胞を識別的に染色し； ｃ、この希釈した試料の一部の少くとも一部分、実質的
には一度に一細胞を、赤色蛍光の光学的刺激域を通過さ
せ； ｄ、核酸で刺激された細胞からの前角度光散乱、直角光
散乱及び赤・色覚光を検出し且つ測定し：そして ｅ、赤色蛍光値を直角散乱値に対してプロットすること
によって白血球の細区分を識別する、未溶解の白血球試
料中の白血球を血球の少くとも４つの細区分に識別する
方法。

２３、細区分がリンパ球、単球、ニュートロフィル及び
ニオシッフイルを含んでなる上記２２に記載の方法。

２４、細区分が更にパンフィルを含んでなり、そしてバ
ッフイルが赤色蛍光値を前角度散乱値に対してプロット
することによって他の白血球から識別される上記２３に
記載の方法。

２５、白血球の細区分を識別的に染色でき、但し血球を
溶解しない赤色光を吸収する蛍光染料を含有する等張液
を含んでなる、白血球を定量化し且つ白血球を少くとも
４種の細区分に識別するための染料組成物。

２６、染料がオキサジン染料である上記２５に記載の組
成物。

２７、染料がオキサジン１７０である上記２６に記載の
組成物。

２８、細区分がリンパ球、単球、ニュートロフィル及び
ニオシッフイルを含んでなる上記２５に記載の組成物。

２９、細区分が更にバッフイルを含んでなる上記２８に
記載の組成物。

３０．７．１〜７．９のｐＨ範囲を維持する緩衝剤系を
更に含有する上記２５に記載の組成仰。

３１、バクテリヤ静止保存剤を更に含んでなる上記２５
に記載の組成物。

３２、滲透圧バランス化合物を更に含んでなる上記２５
に記載の組成物。

３３、表面活性剤を更に含んでなる上記２５に記載の組
成物。

【図面の簡単な説明】

第１Ａ図赤色蛍光（縦軸）の、直角散乱（横軸）に対す
る白血球細胞図を示し、そして 第１Ｂ図は赤色蛍光の、前角度散乱に対する白血球細胞
図を示す。 図面の浄：！２（内容に変更なし） 館（へル責欠舌り 手続補正書 昭和６３年６月９日 特許庁長官　　小　川　邦　夫　　殿 １、事件の表示 昭和６３年特許願第８８３２６号 事件との関係　　　　特許出願人 名称　オーツ・ファーマシューチカル・コーポレーショ
ン ４、代理人　〒１０７ ５、補正命令の日付　　　（自発） ６、補正の対象 明細書の「特許請求の範囲」の欄 ７、補正の内容 明細書の特許請求の範囲を別紙のとおり訂正する。 ［特許請求の範囲１ １．ａ、検討すべき血液から試料の一部をとり；ｂ、こ
の試料の一部を一工程において、赤色光を吸収する蛍光
染料を含有する等張溶液で希釈し、ここで血球細胞は適
当な期間染料と接触せしめられ、それによって細胞を識
別的に染色し；ｃ、この希釈した試料の一部の少くとも
一部分、実質的には一度に一細胞を、赤色蛍光の光学的
刺激域を通過させ； ｄ、核酸で刺激された細胞からの前角度光散乱、直角光
散乱及び赤色蛍光を検出し且つ測定し；そして ｅ、白血球が赤血球及び血小板と異なる前角度散乱、直
角散乱及び赤色蛍光染色性を有するということに基づい
て白血球を赤血球及び血小板から識別する、 ことを含んでなる未溶解の全血中の白血球を赤血球及び
血小板から識別する方法。 ？、染料がオキサジン染料である請求３Ｊｊ第１項に記
載の方法。 コ、オキサジン染料が構造式！又は■ ６、細区分を、赤色蛍光値を直角散乱値に対してプロッ
トすることによって識別する請求項第５項９、ａ、検討
すべき血液から試料の一部をとり：ｂ、この試料の一部
を一工程において、赤色光を吸収する蛍光染料を含有す
る等張溶液で希釈し、ここで血球細胞は適当な期間染料
と接触せしめられ、それによって細胞を識別的に染色し
；Ｃ９この希釈した試料の一部の少くとも一部分、実質
的には一度に一細胞を、赤色蛍光の光学的刺激域を通過
させ； ｄ、核酸で刺激された細胞からの前角度光散乱、直角光
散乱及び赤色蛍光を検出し且つ測定し；そして ｅ、赤色蛍光値を直角散乱値に対してプロットすること
によって白血球の細区分を識別する、未溶解の白血球試
料中の白血球を血球の少くとも４つの細区分に識別する
方法。 功、白血球の細区分を識別的に染色でき、但し血球を溶
解しない赤色光を吸収する蛍光染料を含有する等張液を
含んでなることを特徴とする白血球を定量化し且つ白血
球を少くとも４種の細区分に識別するための染料組成物
。 第１Ｏ項に記載の組成物。 手続補正書（ハ） 特許庁長官　　吉　１）文　毅　殿 １、事件の表示 昭和６３年特許願第８８３２６号 ２、発明の名称 白血球を定量且つ識別する方法 ３、補正をする者 事件との関係　　　特許出願人 名称　　　オーツ・ファーマシューチカル・コーポレー
ション４、代理人　〒１０７ 電話　　　　５８５−２２５６ ５、補正命令の日付　　６３年６月２８日　（発送臼）
６、補正の対象

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ａ、検討すべき血液から試料の一部をとり；ｂ、こ
   の試料の一部を一工程において、赤色光を吸収する蛍光
   染料を含有する等張溶液で希釈し、ここで血球細胞は適
   当な期間染料と接触せしめられ、それによって細胞を識
   別的に染色し； ｃ、この希釈した試料の一部の少くとも一部分、実質的
   には一度に一細胞を、赤色蛍光の光学的刺激域を通過さ
   せ； ｄ、該域で刺激された細胞からの前角度光散乱、直角光
   散乱及び赤色蛍光を検出し且つ測定し；そして ｅ、白血球が赤血球及び血小板と異なる前角度散乱、直
   角散乱及び赤色蛍光染色性を有するということに基づい
   て白血球を赤血球及び血小板から識別する、 ことを含んでなる未溶解の全血中の白血球を赤血球及び
   血小板から識別する方法。 ２、ａ、検討すべき血液から試料の一部をとり；ｂ、こ
   の試料の一部を一工程において、赤色光を吸収する蛍光
   染料を含有する等張溶液で希釈し、ここで血球細胞は適
   当な期間染料と接触せしめられ、それによって細胞を識
   別的に染色し； ｃ、この希釈した試料の一部の少くとも一部分、実質的
   には一度に一細胞を、赤色蛍光の光学的刺激域を通過さ
   せ； ｄ、該域で刺激された細胞からの前角度光散乱、直角光
   散乱及び赤色蛍光を検出し且つ測定し；そして ｅ、赤色蛍光値を直角散乱値に対してプロットすること
   によって白血球の細区分を識別する、未溶解の白血球試
   料中の白血球を血球の少くとも４つの細区分に識別する
   方法。 ３、白血球の細区分を識別的に染色でき、但し血球を溶
   解しない赤色光を吸収する蛍光染料を含有する等張液を
   含んでなることを特徴とする白血球を定量化し且つ白血
   球を少くとも４種の細区分に識別するための染料組成物
   。