JP2002540426A

JP2002540426A - 単チャンネル単希釈検出法

Info

Publication number: JP2002540426A
Application number: JP2000608174A
Authority: JP
Inventors: ズェルマノヴィク，デイヴィド; ジョウンズ，ヴァレンタイン
Original assignee: バイヤー、コーパレイシャン
Priority date: 1999-03-31
Filing date: 2000-03-31
Publication date: 2002-11-26
Also published as: AU4053100A; WO2000058727A1; CA2367780A1; IL145669A0; BR0009420A; US6524858B1; EP1166110A1; AU775260B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、フローサイトメトリー、および各細胞により散乱して吸収される光の検出を利用する血液自動分析器の単チャンネルを使用して、全血の細胞成分を同定、分析および定量する単希釈法およびシステムを提供する。当該方法では、網状血小板を含めて網状赤血球の核酸を染色するための試薬溶液中の有機色素と試料中の白血球とを使用する。単チャンネル法は、人間および人間以外の哺乳動物からの血液試料について、白血球数を測定し、全血試料のパラメータを評価するのに特に有用である。当該方法を実施するための装置は、哺乳動物の全血試料に対する完全な血球分析を行う経済的で、簡素化され、省スペースのアナライザを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、一般には、ヒトおよびヒト以外の全血球試料を含めた哺乳動物の血
液試料における血小板を含むさまざまな血球種を検出、同定、および定量する経
済的な単チャンネル法およびシステムに関する。本発明の方法およびシステムに
よって、ヘモグロビン分析も実施される。本発明の方法およびシステムは、フロ
ーサイトメトリシステムを利用する自動血液分析に対して特に経済的かつ有用で
ある。

【０００２】（発明の背景）全血試料における細胞状血液成分および粒状血液成分の検出、同定および定量
はフローサイトメトリを含む、血液分析器を使用する血液試料分析の必要で、一
般的なパラメータである。いくつかの半自動および自動の血液分析器によって、
血液試料の分析を実施することが可能である。しかしながら、血液試料の分析に
さらなる精度、経済性および正確さを付与する血液自動分析器およびシステムの
技術が進歩することにより、さまざまな血球種を区別し、全血試料に対して必要
な血液成分の分析を行う能力が向上、改善される。

【０００３】成熟赤血球（ＲＢＣ）および網状赤血球を含む赤血球、ならびに好中球、リン
パ球、単球、好酸球および好塩基球を含む白血球（ＷＢＣ）、血小板ならびにヘ
モグロビンを区別し、定量するのに適した血液自動分析器の例としては、本発明
の譲受人が開発、販売するバイエル（旧テクニコン）血液分析器Ｈ＊（商標）シ
ステムシリーズ（Ｈ＊３（商標）およびＨ＊Ｎｅｘｔ（商標）システムを含む）
、ならびにＡＤＶＩＡ（登録商標）１２０ヘマトロジシステムが挙げられるが、
それらに限定されるものではない。バイエルＡＤＶＩＡ（登録商標）１２０シス
テムは、臨床試験室における体外診断用途に向けた赤血球および血小板分析、な
らびに白血球および網状赤血球分析を行う定量的な多チャンネル多希釈血液自動
分析器である。

【０００４】本発明がなされる前は、上述のアナライザのような血液分析器を使用するには
、血液試料における成熟赤血球、網状赤血球、血小板、ならびに好中球、リンパ
球、好塩基球、単球および好酸球を含む白血球を測定し、検出し、区別するため
の個別のチャンネル、試薬およびチャンネル検出光学部品が必要であった。例え
ば、従来の方法およびシステムでは、血液分析器の１つのチャンネルは赤血球お
よび血小板の分析に充てられ、第２のチャンネルは網状赤血球の分析に充てられ
、第３のチャンネルは白血球の分析に充てられ、第４のチャンネルは好塩基球分
析に充てられ、第５のチャンネルはヘモグロビン分析に充てられる。アナライザ
にいくつかの異なるチャンネルを使用することに関連し、いくつかの血液のアリ
コートを希釈して様々な細胞種を互いに明確に区別するためのいくつかの異なる
試薬、例えば約５から８種類程度の試薬が使用される。

【０００５】従来の方法とは対照的に、本発明は、例えば血液自動分析器の網状赤血球チャ
ンネルに匹敵し、哺乳動物の全血試料における赤血球および白血球群ならびに血
小板の中の様々な種類の細胞を区別しそのパラメータを測定するとともに、同一
の試料におけるヘモグロビンに関する情報を提供するのに２種類の試薬、すなわ
ち水性有機色素含有試薬、好ましくはカチオン色素、およびシース／リンス試薬
のみを必要とする単希釈単測定チャンネル法を提供する。より具体的には、本発
明の方法は、いわゆる網状血小板の数および比率を含む、単測定チャンネルにお
けるＣＢＣ／Ｄｉｆｆ／Ｒｅｔｉｃ定量を与える。ＣＢＣ／Ｄｉｆｆ／Ｒｅｔｉ
ｃ定量における「ＣＢＣ」という言葉は、全血球計算と定義づけられ、以下の定
量、すなわちＷＢＣ（白血球数；１０^３／μｌ）、ＲＢＣ（赤血球数；１０^６／
μｌ）、ＰＬＴ（血小板数；１０^３／μｌ）、ＨＧＢ（ヘモグロビン濃度；ｇ／
ｄｌ）、ＨＣＴ（ヘマトクリット；％）、ＭＣＶ（平均細胞容積；ｆｌ）、ＭＣ
Ｈ（平均赤血球ヘモグロビン量；ｐｇ）、ＭＣＨＣ（平均赤血球ヘモグロビン濃
度；ｇ／ｄｌ）、ＲＤＷ（赤血球容積分布幅；％）、ＨＤＷ（試料内での赤血球
ヘモグロビン濃度の変動性の尺度となる赤血球ヘモグロビン濃度分布幅；ｇ／ｄ
ｌ）、ＣＨＤＷ（ＭＣＨに関連する分布幅、（Ｖ×ヘモグロビン濃度＝赤血球ヘ
モグロビン質量）、ＭＰＶ（平均血小板容積）、ＭＰＣ（平均血小板成分濃度；
ｇ／ｄｌ）、ＭＰＭ（平均血小板乾燥質量）、好中球比率（％）、［リンパ球比
率（％）＋好塩基球比率（％）］、単球比率（％）、好酸球比率（％）、絶対網
状赤血球数（１０^９／ｌ）、網状赤血球比率（％）、網状赤血球ＭＣＶ、網状赤
血球ＭＣＨおよび網状赤血球ＭＣＨＣ、ならびに網状血小板の絶対数および比率
を含む。

【０００６】ＣＢＣ／Ｄｉｆｆ／Ｒｅｔｉｃ定量における「Ｄｉｆｆ」という言葉は、好中
球比率（％）、［リンパ球比率（％）＋好塩基球比率（％）］、単球比率（％）
および好酸球比率（％）、ならびにＭＮＶ（平均好中球容積）、ＭＮＣ（平均好
中球成分濃度、ｇ／ｄｌ）、ＭＮＭ（平均好中球乾燥質量）、ＭＬＶ（平均リン
パ球＋好塩基球容積）、ＭＬＣ（平均リンパ球＋好塩基球成分濃度、ｇ／ｄｌ）
、ＭＬＭ（平均リンパ球＋好塩基球乾燥質量ＭＭＶ（平均単球容積）、ＭＭＣ（
平均単球成分濃度、ｇ／ｄｌ）、ＭＭＭ（平均単球乾燥質量）、ＭＥＶ（平均好
酸球容積）、ＭＥＣ（平均好酸球成分濃度、ｇ／ｄｌ）、およびＭＥＭ（平均好
酸球乾燥質量）の定量を含む白血球差分と定義づけられる。

【０００７】ＣＢＣ／Ｄｉｆｆ／Ｒｅｔｉｃ定量における「Ｒｅｔｉｃ」という言葉は網状
赤血球と定義づけられ、網状赤血球比率（％）、網状赤血球ＭＣＶ、網状赤血球
ＭＣＨおよび網状赤血球ＭＣＨＣを含む絶対網状赤血球数を含む。また、網状血
小板、ならびに絶対網状血小板数および網状血小板比率（％）をも含む。

【０００８】（発明の概要）本発明の目的は、全血試料における血小板を含めた様々な種類の赤血球および
白血球を検出および測定するための単チャンネルを含む方法およびシステムを提
供することである。本発明により、人間および人間以外の哺乳動物の血液試料の
分析が可能である。

【０００９】本発明の方法によれば、少なくとも３つの信号を収集および使用して、血液自
動分析器のフローセル検出器を通過する各細胞、実質的に一度に１つの細胞に関
する情報を特定する。該信号は２つの散乱信号、および１つの吸収信号（すなわ
ち散乱／散乱／吸収）、または１つの蛍光信号（すなわち散乱／散乱／蛍光）を
含む。その最も単純な態様では、この信号チャンネルには３つの信号のみが必要
とされ、散乱／散乱／吸収または散乱／散乱／蛍光パターンに基づいて、全血試
料を含めた人間または人間以外の哺乳動物の血液試料における血小板、赤血球種
および白血球種のすべてを計数し、互いに区別する単希釈法である。ここに提示
する新しい単チャンネル測定法によれば、同じ機能を発揮する従来のアナライザ
と比較し、血液自動分析器を空間および容積の点で物理的に簡素化して、赤血球
、白血球および血小板の分析を行うことができるように、血液自動分析器を設計
するまたは適合させることができる。

【００１０】本発明の他の目的は、この単測定チャンネル法を実施することによって、全血
液算定の以下のパラメータおよび定量、すなわちＣＢＣ／Ｄｉｆｆ／Ｒｅｔｉｃ
（ただし、ＣＢＣはＷＢＣ（白血球数；１０^３／μｌ）、ＲＢＣ（赤血球数；１
０^６／μｌ）、ＰＬＴ（血小板数；１０^３／μｌ）、ＨＧＢ（ヘモグロビン濃度
；ｄ／ｄｌ）、ＨＣＴ（ヘマトクリット；％）、ＭＣＶ（平均細胞容積；ｆｌ）
、ＭＣＨ（平均赤血球ヘモグロビン量；ｐｇ）、ＭＣＨＣ（平均赤血球ヘモグロ
ビン濃度；ｇ／ｄｌ）、ＲＤＷ（赤血球細胞体咳分布幅；％）、ＨＤＷ（赤血球
ヘモグロビン濃度分布幅；ｇ／ｄｌ）、ＣＨＤＷ（ＭＣＨに関連する分布幅、（
Ｖ×ヘモグロビン濃度＝赤血球ヘモグロビン質量）、ＭＰＶ（平均血小板容積）
、ＭＰＣ（平均血小板成分濃度；ｇ／ｄｌ）、ＭＰＭ（平均血小板乾燥質量）を
含み、ＤＩＦＦは好中球比率（％）、［リンパ球比率（％）＋好塩基球比率（％
）］、単球比率（％）、好酸球比率（％）、ＭＮＶ、ＭＬＶ、ＭＭＶ、ＭＥＶ、
ＭＮＣ、ＭＬＣ、ＭＭＣ、ＭＥＣ、ＭＮＭ、ＭＬＭ、ＭＭＭ、ＭＥＭを含み、Ｒ
ｅｔｉｃは絶対網状赤血球数（１０^９／ｌ）、網状赤血球比率（％）、網状赤血
球ＭＣＶ、網状赤血球ＭＣＨおよび網状赤血球ＭＣＨＣ、ならびに絶対網状血小
板数および網状血小板比率（％）を含む）を提供することである。ＨＧＢはＲＢ
Ｃ×ＭＣＶ×ＭＣＨＣ／１０００として計算する。

【００１１】本発明の他の目的は、該方法の実施には、上述の全血液分析パラメータおよび
分析値を提供するのに分析器の単反応槽および単希釈ステップのみが必要である
との理由から、試料中の様々な種類の赤血球および白血球を区別するためのより
単純かつ便利な方法およびシステムを提供することである。加えて、該方法は、
ＣＢＣ／Ｄｉｆｆ／Ｒｅｔｉｃ血液分析パラメータを確保する試薬として単に２
種類の試薬、すなわち、１）試料分析用として、有機色素化合物、好ましくは有
機カチオン色素化合物を含む血液希釈配合物、好ましくは「オートレティック」
または「レティック」試薬（例えば、バイエルＡＤＶＩＡ（登録商標）オートレ
ティキュロサイトリゲンド）と、２）本発明により与えられる検出および定量結
果を実行および達成するためのシース／リンス試薬（例えば、その含有量が参照
により本明細書に盛り込まれている、米国特許第５，８８８，７４２号（Ｍ．Ｍ
ａｌｉｎ他）に記載されているバイエルＡＤＶＩＡ（登録商標）ユニバーサルリ
ンスレゲンド）を包括するにすぎない。ここで用いられる「オートレティック」
または「レティック」試薬という言葉は、血液試料中の赤血球数および網状赤血
球数のみを同定し、区別し、測定する血液自動分析器の網状赤血球チャンネルに
おいてのみあらかじめ使用される試薬を指す略称である。本発明のこの単チャン
ネル法の大きな利点は、単チャンネルサイクルと希釈剤による血液試料の単希釈
とを併用することである。血液試料アリコートと混ぜ合わせた単血液希釈試薬の
みを使用して、試料を分析し、全ＣＢＣ、ＤＩＦＦおよび網状赤血球分析を達成
することが可能である。

【００１２】本発明の他の目的は、３種類の光学信号を収集および処理して白血球を他のす
べての血球と区別し、網状血小板分析、および他の種に対する白血球指標を含む
ＣＢＣ／ＤＩＦＦ／Ｒｅｔｉｃ分析を実施する単チャンネル単希釈法およびシス
テムを使用して他の種の血球を区別および分析できるような多種分析法およびシ
ステムを提供することである。

【００１３】本発明により達成されるさらなる目的および効果は、以下の詳細な説明を読む
ことによって明らかになるであろう。

【００１４】（図面の説明）図の添付図面は、本発明をさらに説明し、また種々の態様を明らかにして理解
の手助けとするために示している。

【００１５】図１Ａ〜図１Ｃは、バイエル社の自家レティック試薬で６２５倍に希釈され、
ＡＤＶＩＡ（登録商標）１２０血液システム（バイエル社、ニューヨーク州テリ
ータウン）で分析された正常ヒト全血球１０回吸引の総計を示し、実施例１に記
載するように、それに関して約５００，０００個の全血球を分析した。図１Ａ〜
図１Ｃには、サイトグラム上の別個の細胞領域を示す対照として提供された関連
するペルオキシダーゼチャンネルのサイトグラム（図１Ａ）；非ゲート制御網状
赤血球チャンネル散乱／吸収サイトグラム（図１Ｂ）；非ゲート制御網状赤血球
チャンネル散乱／散乱サイトグラム（図１Ｃ）；および報告された白血球（ＷＢ
Ｃ）パラメータまたはＷＢＣ百分率（すなわち、ＷＢＣ数；好中球（Ｎｅｕｔ．
）％；リンパ球（Ｌｙｍｐｈ）％）；単球（Ｍｏｎｏ）％；好酸球（Ｅｏｓ．）
％；好塩基球（Ｂａｓｏ）％；非染色大リンパ球（ＬＵＣ）；小葉指標（ＬＩ）
；および１０回吸引で平均化された平均ペルオキシダーゼ活性指数（ＭＰＸＩ）
が含まれる。細胞の種類は、網状赤血球サイトグラム上に標識され、「ＰＬＴ」
は血小板を言い；「Ｍｏｎｏ」は単球を言い；「Ｌｙｍｐｈ」はリンパ球を言い
；「ＷＢＣ」は白血球を言い（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓと呼ぶ）；「Ｒｅｔｉｃ」
は網状赤血球を言い；「ＲＢＣ」は赤血球を言う。

【００１６】図２Ａ〜図２Ｃは、バイエル社の自家レティック試薬で６２５倍に希釈され、
ＡＤＶＩＡ（登録商標）１２０血液システム（バイエル社、ニューヨーク州テリ
ータウン）で分析された正常ヒト全血球１０回吸引の総計を示す。図２Ａ〜図２
Ｃは、図１Ａ〜図１Ｃに記載されたものと同一の網状赤血球サイトグラムを含む
が、図２Ａ〜図２Ｃの結果はゲート制御され、細胞の吸収値が０から９９の範囲
にある散乱／吸収サイトグラムの吸収軸（「ｘ軸」）上の吸収チャンネル８０を
超える吸収値をもつ細胞のみを含んでいる。ゲート制御網状赤血球の散乱サイト
グラムの図２Ｃにおいて、好中球（Ｎｅｕｔ）、単球および好酸球（ＥＯＳ）が
血液試料分析に入らない領域を観察することができる。図２Ａ〜図２Ｃに係るＷ
ＢＣ百分率は図１Ａ〜図１Ｃに示されたものである。

【００１７】図３Ａ〜図３Ｃは、血小板に富む血漿（ＰＲＰ）の１０回吸引の総計に関する
サイトグラムを示す。図３Ａ〜図３Ｃのサイトグラムは、同所共存のない状態で
の散乱／散乱サイトグラム上に種々のＷＢＣタイプの予想位置を例示するもので
ある。これらは単チャンネル法により生じたサイトグラム上（または網状赤血球
チャンネルサイトグラム上）のものと同一のＷＢＣタイプにより占められた位置
であることが判る。一般に、同所共存信号は、同一時間に光学検出槽に２個以上
の細胞（正常な哺乳動物の血液試料中全血球の約９５％を含んで成る典型的な赤
血球）が存在することによる。同所共存信号は、個々の細胞による信号よりも大
きく、それらはＰＭＮ白血球と同一の散乱／散乱空間を占めている。しかし、好
中球および好酸球は、赤血球（および、それらの同時共存）、血小板および網状
赤血球よりも有意に光を吸収する。これに基づき、白血球は他の細胞種から「ゲ
ート制御した」（すなわち、サイトグラム上に視覚化されるように２次元または
３次元空間に細胞を単離する技術手段）することができ、引き続き散乱／散乱空
間で分析される。この目的は、散乱／散乱空間の好中球、好酸球および好塩基球
の位置に基づきのそれらを区別することである。

【００１８】上記の図１Ａ〜図１Ｃのように、図３Ａは対照のペルオキダーゼチャンネル分
析を示し；図３Ｂは網状赤血球チャンネル散乱／吸収サイトグラムを示すが、一
方、図３Ｃは網状赤血球チャンネル散乱／散乱サイトグラムを示す。また、上記
に定義されたように、報告されたＷＢＣ百分率のパラメータを示す。

【００１９】図４Ａ〜図４Ｃから図９Ａ〜図９Ｃまでは、ネコの全血試料の３つの個別分析
結果を示す。３つの個別実験結果を図４Ａ〜図４Ｃから図９Ａ〜図９Ｃに示す。
これらの図は、参照ペルオキシダーゼチャンネルのサイトグラム（図４Ａ、図５
Ａ、図６Ａ、図７Ａ、図８Ａおよび図９Ａ）と同じく非ゲート制御散乱／吸収サ
イトグラム（図４Ｂ、図５Ｂおよび図６Ｂ）および非ゲート制御散乱／散乱サイ
トグラム（図４Ｃ、図５Ｃおよび図６Ｃ）およびゲート制御対応物（それぞれ図
７Ｂ、図８Ｂおよび図９Ｂ；図７Ｃ、図８Ｃおよび図９Ｃ）を含む。ヒトの血液
試料のペルオキシダーゼサイトグラム（例えば、図１Ａおよび図２Ａ）と対照的
に、ネコのペルオキシダーゼサイトグラムは好酸球クラスタ類を別個に示してい
ないことに注意されたい。これはネコの好酸球ペルオキシダーゼ陰性のためであ
る。しかし、ゲート制御散乱／散乱サイトグラムは、表された３つの試料におい
て２％から１６％の好酸球パーセンテージでの別個の好酸球クラスタを示す。

【００２０】図４Ａ〜図４Ｃ、図５Ａ〜図５Ｃおよび図６Ａ〜図６Ｃは、異なるネコの全血
試料を分析する３つの実験からの非ゲート制御結果を示すサイトグラムを描写す
る。図７Ａ〜図７Ｃ、図８Ａ〜図８Ｃおよび図９Ａ〜図９Ｃは、それぞれ図４Ａ
〜図４Ｃ、図５Ａ〜図５Ｃおよび図６Ａ〜図６Ｃに示される非ゲート制御サイト
グラムの結果に対応するゲート制御結果を示すサイトグラムを描写する。非ゲー
ト制御散乱／散乱サイトグラム（図４Ｃ、図５Ｃおよび図６Ｃ）には、赤血球（
同所共存を含む）、血小板、リンパ球（および単球）、および幾つかの多核白血
球に関する別個のクラスタを含む。非ゲート制御散乱／吸収サイトグラム（図４
Ｂ、図５Ｂおよび図６Ｂ）には、血小板、赤血球／網状赤血球／赤血球同所共存
および白血球に関する別個のクラスタがある。網状赤血球は、赤血球／網状赤血
球吸収チャンネルのヒストグラムの統計解析により成熟赤血球細胞と区別される
。

【００２１】ゲート制御散乱／散乱サイトグラム（図７Ａ〜図７Ｃ、図８Ａ〜図８Ｃおよび
図９Ａ〜図９Ｃ）には、吸収信号が飽和吸収チャンネル（吸収軸がチャンネル０
から９９の範囲にある散乱／吸収サイトグラムの吸収軸のチャンネル９９）に出
現する細胞を含む。ゲート制御散乱／散乱サイトグラム（図７Ｃ、図８Ｃおよび
図９Ｃ）において、好酸球クラスタは好中球クラスタと区別される。

【００２２】図４Ａ〜図４Ｃ（非ゲート制御）および図７Ａ〜図７Ｃ（ゲート制御）；図５
Ａ〜図５Ｃ（非ゲート制御）および図８Ａ〜図８Ｃ（ゲート制御）；および図６
Ａ〜図６Ｃ（非ゲート制御）および図９Ａ〜図９Ｃ（ゲート制御）に関するＷＢ
Ｃ百分率データは同一である。非ゲート制御サイトグラムに関してはＷＢＣ百分
率データのみを示す。これらの群化された図は、３種の異なるネコの血液試料か
らの非ゲート制御およびゲート制御結果を表す。

【００２３】図１０は、本発明の単チャンネル法に関連する光学デザインの図式描写を示す
。

【００２４】図１１Ａ〜図１１Ｅは、網状血小板の分析から生じた散乱／吸収サイトグラム
を示す。網状血小板は、末梢血における約２４時間齢未満の血小板である。それ
らは成熟血小板よりも高濃度の核酸を含有し、成熟血小板を区別できる。それら
のパーセンテージまたは絶対数における有意な変化は、血小板新生活性における
変化を意味する。図１１Ａは網状血小板の高角度散乱／吸収サイトグラムを示し
、図１１ＢはＲＢＣ／ＰＬＴ網状赤血球の低角度散乱／高角度散乱サイトグラム
を示し、図１１Ｃは血小板高増幅、低角度散乱／高増幅、高角度散乱サイトグラ
ムを示す。また、網状血小板（ＲｅｔｉｃＰＬＴ）のパラメータ表（図１１Ｄ
）および血小板（ＰＬＴ）パラメータ表（図１１Ｅ）を示す。

【００２５】（発明の詳細な説明）本発明は、血液自動分析器の使用に関する方法とシステムを提供し、そこでの
単チャンネルは全血試料中の血小板を含む各種血球および血球成分を識別し、同
定し、定量するために使用される。ヒトおよび非ヒトの哺乳動物血液試料の双方
が本発明を用いて分析できる。

【００２６】血液試料のフローサイトメトリー分析を装備するバイエル（旧称テクニコン）
Ｈ＊（商標）３血液自動分析器およびＡＤＶＩＡ（登録商標）１２０血液自動分
析器（バイエル社、ニューヨーク州テリータウン）など一般に知られて、血液自
動分析器の網状赤血球分析チャンネルとしてのみ使用されている単チャンネルは
、ヒトおよび非ヒト血液試料などの血液試料中の全ての赤血球、白血球および血
小板を区別するのに使用できることが新たに発見された。

【００２７】本発明の方法を実行する中で使用でき、または使用のために適用でき、散乱／
散乱および散乱／吸収システム操作の使用に好適であり、現在、上記のバイエル
Ｈ＊３血液自動分析器およびＡＤＶＩＡ（登録商標）血液自動分析器により例証
されて汎用されている自動分析器およびフローサイトメトリー分析器システムは
、Ｄ．Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ他の米国特許第５，８１７，５１９号、Ｇ．Ｃｏｌ
ｅｌｌａ他の米国特許第５，４３８，００３号および米国特許第５，３５０，６
９５号、およびＴｙｃｋｏの米国特許第４，７３５，５０４号に記載されており
、全てそれらの内容は引用文献としてここに組込まれている。好適なハードウェ
アおよびシステム要素を有する他の血液自動分析装置は、本発明に従って使用ま
たは使用のために採用できることが理解されよう。

【００２８】本発明の方法の実施には、水性試薬組成物または血液希釈剤試薬組成物（例え
ば、バイエル社により販売されているＡＤＶＩＡ（登録商標）１２０のオートレ
ティック試薬などのオートレティック試薬組成物またはレティック試薬組成物）
の使用を含み、この組成物は網状赤血球のＲＮＡおよび核酸、すなわち全血試料
アリコート中の白血球のＤＮＡおよびＲＮＡを染色するための有機色素化合物を
含んで成り、またこの有機色素は希釈試薬および緩衝剤または緩衝剤混合物によ
る血液試料のアリコートを混合することにより形成された反応混合物からは沈殿
しない。緩衝剤または緩衝剤混合物は、細胞が界面活性剤により実質的に等容性
の球形になることを保証できるように、試薬組成物および反応混合物（すなわち
、約６から約９のｐＨ、好ましくは約７から約８、さらに好ましくは約７．２か
ら約７．８、および最も好ましくは約７．３から約７．５）の中性またはほぼ中
性のｐＨを維持し、また等張性であることが好ましい。血液希釈剤試薬組成物は
、水性試薬混合物または本法において分析できる溶液試薬を形成するために、好
ましくは抗凝固処理した哺乳動物全血試料のアリコートにより混合する。最適の
血小板決定のために、全血試料は、好ましくはＫ_３ＥＤＴＡ中で抗凝固処理され
る。

【００２９】本法の使用に好適である他の血液希釈試薬組成物の例としては、Ｓ．Ｆａｎ他
の米国特許第５，４１１，８９１号、およびＧ．Ｃｏｌｅｌｌａ他の米国特許第
５，４３８，００３号および米国特許出願番号第０８／８３３，０３３号に記載
され、それらの内容は、完全に引用文献としてここに組み入れている。

【００３０】核酸（ＲＮＡおよびＤＮＡ）は、実際に任意の有機カチオン色素で染色できる
ポリアニオン類である。しかしながら、網状赤血球のＲＮＡおよび白血球のＲＮ
ＡおよびＤＮＡ（核酸）は、カチオン色素、例えばブリリアントクレシルブルー
（ＢＣＧ）、ニューメチレンブルー（ＮＭＢ）、オーラミンＯ（ＡｕＯ）、アク
リジンオレンジ（ＡＯ）、チアゾールオレンジ（ＴＯ）、オキサジン７５０およ
びピロニンＹ（ＰＹ）などで効果的に染色できる。これらの色素の中で、サブセ
ットのみが細胞および核を迅速に浸透する（したがって、染色する）ことができ
る。網状赤血球の染色速度と程度は、色素の細胞外濃度、細胞膜を通過する色素
の浸透速度、および色素と細胞のＲＮＡおよび／またはＤＮＡとの間の一定の特
異的結合強度に依存する。後者の２つの性質は異なり、各色素に関して容易に予
測できないので、その結果、慣例的な試行錯誤により有用な核酸染色を見出す必
要があると思われる。

【００３１】限定しないが、本発明の試薬組成物の使用に好ましいカチオン色素は、青色吸
収色素のオキサジン７５０（オハイオ州デイトン、エクサイトン社）；または青
色吸収色素のニューメチレンブルーが挙げられる。

【００３２】血液希釈試薬はさらに、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムが約２５０ミリオ
スモル（ｍＯｓｍ）から約３３０ミリオスモルに調整された最終浸透圧の特記さ
れた濃度における以下の１つまたは複数の成分：約５〜５０ｍＭの濃度でのＫ／
ＮａＨＣＯ_３；約０〜８８ｍＭの濃度でのＭｇＣｌ_２；約４〜１０４ｍＭの濃度
でのＫＣｌ；約０〜１．５ｍＭの濃度でのＮａ_３ＰＯ_４；および約０〜０．６ｍ
Ｍの濃度でのＣａＣｌ_２を含んでよい。好ましくは、緩衝液は、約７から約８の
間、最も好ましくは約７．４でオートレティック試薬組成物のｐＨを維持するた
めに製剤化され、したがって、約２８０ミリオスモル（ｍＯｓｍ）から約３００
ミリオスモルの最終浸透圧で与えられた濃度範囲における以下の１つまたは複数
の成分：約０〜１５０ｍＭの濃度でのＴｒｉｓ／ＴＥＡ；約０〜１２１ｍＭの濃
度でのＫ_２Ｏｘ／ＥＤＴＡ；および約０〜１５５ｍＭの濃度でのＫＣｌ／ＮａＣ
ｌを含んでよい。

【００３３】試薬組成物はまた、細胞膜を通しての色素の浸透を促進するために、ある一定
のアニオン類およびカチオン類（例えば、アルキル金属塩化物）を含んでよい。
アニオン類の非限定例としては、重炭酸塩、塩化ホウ酸塩、バルビタール、蓚酸
塩（Ｏｘ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられる。必ずしも
全てのアニオン類が、細胞膜を通しての色素の浸透を促進するのに効果的ではな
かったことを特記する。例えば、１つまたは複数の以下のアニオン類：リンゴ酸
塩、酒石酸塩またはリン酸塩が唯一の主アニオン類として試薬組成物に含まれた
場合、網状赤血球と赤血球の間で特性差を成しえたのはあったとしてもごく僅か
であった。好適なカチオンの非限定例としては、ナトリウム（例えばＮａＣｌ）
、カリウム（例えばＫＣｌ）、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ
）、塩酸トリス［ヒドロキシメチル］アミノメタン（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）または
トリエタノールアミン（ＴＥＡ）が挙げられる。

【００３４】抗菌化合物もまた、微生物増殖を阻止するために試薬組成物に含むことができ
る。好適な抗菌剤の非限定例としては、プロクリン１５０（２−メチル−４−イ
ソチアゾリン−３−オン）およびプロクリン３００（５−クロロ−２−メチル−
４−イソチアゾリン−３−オン）（ローム＆ハース社）；ゲルモール１１５（Ｎ
，Ｎ’−メチレンビス［Ｎ’−（１−（ヒドロキシメチル）−２，５−ジオキソ
−４−イミダゾリジニル］尿素）（サットンラボラトリー社）；ダウアシル２０
０（１−（３−クロロアリル）−３，５，７−トリアザ−１−アゾニアアダマン
タンクロリド）（ダウケミカル社）；およびブロノポール２−ブロモ−２−ニト
ロプロパン−１，３−ジオール（Ｃ_３Ｈ_６ＢｒＮＯ_４）（アンガスケミカル社）
が挙げられる。プロクリン３００は、本発明に使用される試薬組成物に使用する
ための好ましい抗菌剤である。

【００３５】上記緩衝系の存在下、試薬組成物中のオキサジン７５０色素の濃度は、約２μ
ｇ／ｍｌから約１５μｇ／ｍｌの範囲内にある。試薬組成物中のニューメチレン
ブルー色素の濃度は約１０μｇ／ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの範囲内にある。
これらの濃度は、網状赤血球のＲＮＡ染色に適切であることが判った。

【００３６】本法に使用される血液希釈剤試薬組成物（例えば、オートレティック試薬）は
また、非イオン界面活性剤または両性イオン界面活性剤の形体で、試料中の赤血
球、網状赤血球、白血球および血小板を実質的に効果的に球状化する球状化剤を
含有してもよい。両性イオン界面活性剤が好ましい。また、採取した血液試料の
血小板は、採取した試料中に存在するＥＤＴＡの効力により効果的に球状化され
ることを特記する。球状化剤としての界面活性剤は、本発明による単チャンネル
、単希釈法における分析を受ける血液試料中の赤血球（または他の血球種）を実
質的に溶血しないものである。すなわち、本発明の方法、およびここで用いられ
る試薬組成物は、血液試料中の赤血球および他の血球に対して実質的に非溶血性
である。

【００３７】限定しないが、好適な非イオン界面活性剤の例としては、ドデシルマルトシド
、さらに特に、例えばｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−テトラドデシル
−β−Ｄ−マルトシドおよびｎ−テトラドデシル−β−Ｄ−グルコシドなどのア
ルキルグリコシド類が挙げられる。

【００３８】両性イオン界面活性剤が使用される場合、ラウルアミドプロピルベタイン（Ｌ
ＡＢ）、ココアミドプロピルベタイン（ＣＡＰＢ）、またはココアミドスルホベ
タイン（ＣＡＳＢ）などのアルキルアミドベタインまたはアルキルベタインが好
ましい。他の好ましい球状化剤は、Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−
アンモニオ−１−プロパンスルホネート（ＴＤＡＰＳ）およびＮ−ドデシル−Ｎ
，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート（ＤＤＡＰＳ）で
ある。ＴＤＡＰＳおよびＤＤＡＰＳの両者は、最も安定な試料製剤を提供する。

【００３９】血液試料中の赤血球、網状赤血球および白血球の効果的な等容性球状化に関し
て、試薬組成物中の球状化剤の濃度は、一般に約３．９μｇ／ｍｌから約１４８
μｇ／ｍｌである。ＬＡＢの場合、球状化剤は約１２μｇ／ｍｌから約８７．５
μｇ／ｍｌの量で試薬組成物中に存在するのが好ましく；球状化剤としてのＴＤ
ＡＰＳに関して、ＴＤＡＰＳは約３．９μｇ／ｍｌから約１１．８μｇ／ｍｌの
量で試薬組成物中に存在するのが好ましく；球状化剤としてのＤＤＡＰＳに関し
て、ＤＤＡＰＳは約４９．３μｇ／ｍｌから約１４８μｇ／ｍｌの量で試薬組成
物中に存在するのが好ましく；球状化剤としてのＣＡＰＢに関して、ＣＡＰＢは
約８．８μｇ／ｍｌから約１７．５μｇ／ｍｌの量で試薬組成物中に存在するの
が好ましく；および球状化剤としてのＣＡＳＢに関して、ＣＡＳＢは約１２．５
μｇ／ｍｌから約１５μｇ／ｍｌの量で試薬組成物中に存在するのが好ましい。

【００４０】本発明の単チャンネル法に特に有用な好ましい希釈試薬組成物（例えば、オー
トレティック試薬組成物）には、カチオン色素濃度を増加して上記のようなカチ
オン色素、上記のような球状化剤、および例えば１９９７年４月３日に出願され
た米国特許出願番号第０８／８３３，０３３号に記載されているようになｐＨ降
下剤を含んでいる。この試薬はまた、アジド類（Ｎ_３ ⁻）、例えばアジドナトリ
ウム；またはシアン酸塩（ＯＣＮ⁻）イオン、例えばシアン酸ナトリウムなどの
１つまたは複数の求核剤を含有してもよい。好ましいオートレティック試薬組成
物のｐＨは、約７．２から７．８、好ましくは７．３から７．５、さらに好まし
くは７．４である。試薬組成物の浸透圧は、約２５０ｍＯｓｍから約３２０ｍＯ
ｓｍ、好ましくは約２８７ｍＯｓｍから約２９７ｍＯｓｍ、さらに好ましくは約
２９２＋／−５ｍＯｓｍである。この好ましいオートレティック試薬溶液におい
て、カチオン色素、例えばオキサジン７５０の濃度は、約６μｇ／ｍｌから約２
０μｇ／ｍｌ、好ましくは約６．５μｇ／ｍｌから約１９．５μｇ／ｍｌ、およ
びさらに好ましくは約９μｇ／ｍｌから約１０．５μｇ／ｍｌである。一般に、血液試料で混合後の血液希釈試薬中のカチオン色素は、網状赤血球の
ＲＮＡ、および白血球を含む試料中の有核細胞の核内ＤＮＡおよびＲＮＡを染色
する。この染色は、網状赤血球チャンネルにおいて他の血球種からこれらの血球
種を同定することを可能にするが、これは本発明までは、分析器の幾つかの追加
および別個のチャンネル、例えば好塩基球（Ｂａｓｏ）チャンネルおよびペルオ
キシダーゼ（Ｐｅｒｏｘ．）チャンネルを用いることにより同定し識別化する必
要があった。さらに、血液希釈試薬は、本法における分析を受ける赤血球および
血小板などの如何なる血球種をも実質的に溶血しない。したがって、本法の各測
定サイクルには、赤血球、網状赤血球、血小板、網状血小板および白血球の相対
数を含んでいる。

【００４１】上記のオートレティック試薬組成物は、単チャンネル法において他の細胞と識
別するために網状赤血球のＲＮＡを着色するのみならず、白血球のＤＮＡおよび
ＲＮＡを着色するという発見は、他のＷＢＣ百分率法以上に本法の重要な利点を
提供する。例えば、ＷＢＣ評価の標準法とは異なり、ＷＢＣ数または判別精度に
対して不利な影響を有すると思われるＲＢＣ溶血結果として、選択されたＷＢＣ
種に対する損傷という可能性がない。他の重要な利点は、血液試料中の相対的血
球数は全て単一の希釈段階から得られ、これにより較正が単純化され、精度が維
持されることである。また分析器の単チャンネルに使用する必要のあるものがた
だ１種の血液希釈試薬だけでよいということは他の利点であり、複数の異なる試
薬および／または分析器の個別のチャンネル類に個別の溶液を用いる必要性が省
かれる。この点におけるさらなる利点は、剪断バルブを経るなど機械的または他
の手段により血液アリコートに小分けする必要がないので、装置の設計をさらに
単純化できることである。

【００４２】本発明の単チャンネル法の実施により得られた報告パラメータには、以下のも
のが含まれる：ＷＢＣ（白血球数；１０^３／μｌ）、ＲＢＣ（赤血球数；１０^６／μｌ）、ＰＬＴ（血小板数；１０^３／μｌ）、ＨＧＢ（ヘモグロビン濃度；ｇ
／ｄｌ）、ＨＣＴ（ヘマトクリット；％）、ＭＣＶ（平均細胞容積；ｆｌ）、Ｍ
ＣＨ（平均赤血球ヘモグロビン量；ｐｇ）、ＭＣＨＣ（平均赤血球ヘモグロビン
濃度；ｇ／ｄｌ）、ＲＤＷ（赤血球容積分布幅；％）、ＨＤＷ（赤血球ヘモグロ
ビン濃度分布幅；ｇ／ｄｌ）、ＭＰＶ（平均血小板容積）、ＭＰＣ（平均血小板
成分濃度；ｇ／ｄｌ）、ＭＰＭ（平均血小板乾燥質量）、好中球％、［リンパ球
％＋好塩基球％］、単球％、好酸球％、絶対網状赤血球数（１０^９／ｄｌ）、網
状赤血球％、網状赤血球ＭＣＶ、網状赤血球ＭＣＨおよび網状赤血球ＭＣＨＣ。
ＨＧＢは、ＲＢＣ×ＭＣＶ×ＭＣＨＣ／１０００として計算する。また、網状血
小板の絶対数および比率と同じく白血球種の平均細胞容積、平均成分濃度（また
は細胞密度）および平均乾燥質量を含む。

【００４３】ここに記載される単チャンネル法により提供される上記の情報およびパラメー
タ値は以下のように帰属される：ＲＢＣ数（１０^６／μＬ）は、高ゲインの高角度散乱検出器により細胞として同
定された信号数に基づく。検出された細胞数は、さらにここの説明と実施例で記
載されるように、引き続き低ゲイン散乱／散乱空間におけるこれらの細胞により
占められる領域に従ってＲＢＣｓおよび非ＲＢＣｓに区画される。ＰＬＴ数（１０^３／μＬ）は、上記のＲＢＣ数のように細胞として同定された信
号数に基づくが、但し、さらにここの説明と実施例で記載されるように、細胞が
低ゲイン散乱／散乱空間よりもむしろ、高ゲイン散乱／散乱空間に占める領域に
従ってＰＬＴｓと非ＰＬＴｓに区画されることを除く。ＭＣＶ（ｆＬ）は、ＲＢＣとして同定された各細胞に関する１対の低ゲイン散乱
強度値を、ミー散乱理論計算から得られた変換表を引用して対応する対の細胞容
積およびヘモグロビン濃度値に変換することにより決定される。細胞容積値の総
計を分析された細胞の総計で割ってＭＣＶを得る。ＭＣＨＣ（ｇ／ｄＬ）は、上記のミー散乱変換表に基づいて各細胞に関連する赤
血球ヘモグロビン濃度値を総計し、次いでこの総計を分析された細胞の総計で割
ることにより決定される。ＭＣＨ（ｐｇ）＝ＭＣＶ×ＭＣＨＣ／１００ＨＧＢ（ｇ／ｄＬ）＝ＲＢＣ×ＭＣＶ×ＭＣＨＣ／１０００ＨＣＴ（％）＝ＲＢＣ×ＭＣＶ／１０ＲＤＷ（％）＝赤血球容積値の標準偏差／ＭＣＶＨＤＷ（ｇ／ｄＬ）＝赤血球ヘモグロビン濃度値の標準偏差ＣＨＤＷ（ｐｇ）＝赤血球ヘモグロビン含量値の標準偏差（これはＭＣＨが得ら
れる）ＭＰＶ（ｆＬ）は、ＰＬＴとして同定された各細胞に関する対の高ゲイン散乱強
度値を、ミー散乱理論計算から得られた変換表を引用して対応する対の細胞容積
および血小板成分濃度値に変換することにより決定される。細胞容積値の総計を
分析された細胞の総計で割ってＭＰＶを得る。ＭＰＣ（ｇ／ｄＬ）は、上記の変換表に基づいて各細胞に関連する血小板成分濃
度値を総計し、次いでこの総計を分析された細胞の総計で割ることにより決定さ
れる。ＭＰＭ（ｐｇ）＝ＭＰＶ×ＭＰＣ／１００絶対好中球数（１０^３／μＬ）は、さらにここに説明と実施例で記載されるよう
に、散乱／散乱／吸収空間または散乱／散乱／蛍光空間においてそれらの座標に
より好中球として同定された細胞数により決定される。絶対リンパ球数＋好塩基球数（１０^３／μＬ）は、さらにここに説明と実施例で
記載されるように、散乱／散乱／吸収空間または散乱／散乱／蛍光空間において
それらの座標によりリンパ球＋好塩基球として同定された細胞数により決定され
る。絶対単球数（１０^３／μＬ）は、さらにここに説明と実施例で記載されるように
、散乱／散乱／吸収空間または散乱／散乱／蛍光空間においてそれらの座標によ
り単球として同定された細胞数により決定される。絶対好酸球数（１０^３／μＬ）は、さらにここに説明と実施例で記載されるよう
に、散乱／散乱／吸収空間または散乱／散乱／蛍光空間においてそれらの座標に
より好酸球として同定された細胞数により決定される。ＷＢＣ数（１０^３／μＬ）＝絶対好中球数＋絶対［リンパ球＋好塩基球］数＋絶
対単球数＋絶対好酸球数絶対網状赤血球数（１０^９／μＬ）は、低ゲイン散乱／散乱サイトグラムのＲＢ
Ｃｓとして最初に同定される細胞数により決定され、次いでさらにここに説明と
実施例で記載されるように、散乱／吸収または散乱／蛍光空間においてそれらの
座標に基づく成熟ＲＢＣｓと識別する。％網状赤血球（％）＝絶対網状赤血球数／ＲＢＣ網状赤血球ＭＣＶ（ｆＬ）は、上記で決定されたように、絶対網状赤血球数に従
って網状赤血球として指定されたこれらの細胞の平均細胞容積である。網状赤血球ＭＣＨＣ（ｇ／ｄＬ）は、上記で決定されたように、網状赤血球と呼
ばれるこれらの細胞の平均赤血球ヘモグロビン濃度である。網状赤血球ＭＣＨ（ｐｇ）は、上記で決定されたように、網状赤血球と呼ばれる
これらの細胞の平均赤血球ヘモグロビンである。絶対網状血小板数（１０^３／μＬ）は、上記のように血小板として同定された粒
子数を数えることにより決定され、次いで散乱／吸収または蛍光空間においてそ
れらの座標に基づいて成熟血小板と網状血小板とを識別する。平均好中球容積（ｆＬ）は、好中球として同定された各粒子に関する対の散乱強
度値を、ミー散乱理論変換表を引用して対応する対の細胞容積および屈折率値に
変換することにより決定される。この容積値の総計を分析された細胞の総計で割
って平均好中球容積を得る。平均リンパ球＋好塩基球容積（ｆＬ）は、リンパ球または好塩基球として同定さ
れた各粒子に関する対の散乱強度値を、ミー散乱理論変換表を引用して対応する
対の細胞容積および屈折率値に変換することにより決定される。この容積値の総
計を分析された細胞の総計で割り平均リンパ球＋好塩基球容積を得る。平均単球容積（ｆＬ）は、単球として同定された各粒子に関する対の散乱強度値
を、ミー散乱理論変換表を引用して対応する対の細胞容積および屈折率値に変換
することにより決定される。この容積値の総計を分析された細胞の総計で割り平
均単球容積を得る。平均好酸球容積（ｆＬ）は、好酸球として同定された各粒子に関する対の散乱強
度値を、ミー散乱理論変換表を引用して対応する対の細胞容積および屈折率値に
変換することにより決定される。この容積値の総計を分析された細胞の総計で割
り平均好酸球容積を得る。平均好中球成分濃度（ｇ／ｄＬ）は、上記のミー散乱理論変換表に基づく各細胞
に関連する好中球成分濃度値を総計し、次いでこの総計を分析された細胞の総計
で割ることにより決定される。平均リンパ球＋好塩基球成分濃度（ｇ／ｄＬ）は、上記の変換表に基づく各細胞
に関連する好塩基球成分濃度値を総計し、次いでこの総計を分析された細胞の総
計で割ることにより決定される。平均単球成分濃度（ｇ／ｄＬ）は、上記の変換表に基づく各細胞に関連する単球
成分濃度値を総計することにより決定され、次いでこの総計を分析された細胞の
総計で割る。平均好酸球成分濃度（ｇ／ｄＬ）は、上記の変換表に基づく各細胞に関連する好
酸球成分濃度値を総計し、次いでこの総計を分析された細胞の総計で割ることに
より決定される。平均好中球乾燥質量（ｐｇ）＝平均好中球容積×平均好中球成分濃度平均リンパ球＋好塩基球乾燥質量（ｐｇ）＝平均リンパ球＋好塩基球容積×平均
リンパ球＋好塩基球成分濃度平均単球乾燥質量（ｐｇ）＝平均単球容積×平均単球成分濃度平均好酸球乾燥質量（ｐｇ）＝平均好酸球容積×平均好酸球成分濃度

【００４４】第２の試薬が、本発明の単測定チャンネル法に好ましくは使用されることが好
ましい。Ｍ．Ｍａｌｉｎ他の米国特許第５，８８８，７５２号に記載され、その
内容がここに引用文献として組入れられているように、これはシーツ剤またはリ
ンス剤組成物（すなわち、シース／リンス剤）である。他の類似の試薬は、Ｄ．
Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ他の米国特許第５，８１７，５１９号に記載されているＲ
ＢＣ／シーツ剤のように、血液試料分析中および／または分析後のシステム成分
およびハードウェアを洗浄するために使用できる。シース／リンス剤を使用する
場合、それは光学フロー細胞測定のためのシース形成剤と同様に、分析器の構成
要素、液圧利用のラインおよびチューブのためのリンス剤または洗浄剤として働
き、それはまた、各種試料吸引物間で使用できる。上記のシース／リンス剤など
のシーツ剤は、直接血球と相互作用しない受動型試薬であるが、血液試料分析に
影響を与えることなく、フローセル中の流れを包囲し、中央に置くことができ、
または血液自動分析器システムのフローセルおよび種々の構成要素をすすぐこと
ができる。

【００４５】本発明は、低角度散乱強度、高角度散乱強度および光吸収または蛍光強度の何
れかから成る３次元測定空間の粒子（すなわち、細胞）の位置に基づき全血試料
中の種々の血球種間を識別する。表１から表３は、各信号の動的範囲における各
粒子種より各３次元内に占めるチャンネル範囲を表している。表に示された値は
、０から９９の全範囲によるチャンネル数である。表１から表３は、ヒト血液試
料について測定された結果に基づいたものであり、光吸収は３次元測定として用
いられる。表１血小板（ＰＬＴ）の動的範囲パラメータ

【表１】表２赤血球（ＲＢＣ）の動的範囲パラメータ

【表２】表３白血球（ＷＢＣ）の動的範囲パラメータ

【表３】

【００４６】表１に示されるように、各粒子種はこの３次元信号空間にユニークな領域を占
める。各種動的範囲は、一方では、小さな信号血小板および網状血小板の十分な
信号分解能を提供し、一方では、視覚範囲に戻る飽和レベルの散乱信号を有する
好中球および好酸球をもたらすために必要となる。各動的範囲は、特異的な増幅
因子を対の散乱信号に適用することにより確立される。表に示された結果につい
ては、単吸収チャンネル増幅因子が使用された。しかしながら、この必要性だけ
でなく、所望ならば、吸収／蛍光信号増幅因子を調整してもよいことを理解する
必要がある。十分に高分解能のアナログ／デジタル（Ａ／Ｄ）信号変換、例えば
１４−ビットが十分に大きなメモリ（ＲＡＭ）、すなわち１０メガバイトに加え
て使用される場合、個別の増幅器を必要としない。

【００４７】１群として最も小さな信号を生じることから、最も高い増幅を必要とする血小
板に好適な増幅因子で始まって、表１は、他の全ての細胞が、血小板にとり可能
である最大信号よりも大きな信号を有していることから、血小板および網状血小
板が他の全ての血球種と識別されることを示す。網状血小板は色素を取り込むた
め、それらの光（または蛍光）吸収に基づいて血小板と識別される。

【００４８】次のより低い増幅プラトーにおいて、赤血球／網状赤血球は、散乱強度の増加
のために血小板／網状血小板と識別される。赤血球／網状赤血球は、散乱／散乱
／吸収または蛍光空間における白血球のユニークな位置のために白血球と識別さ
れる。リンパ球／好塩基球は、それらが散乱／散乱空間においてユニークな位置
を占め、また、より高い吸収（または蛍光）信号を有していることから、他の細
胞種と識別される。単球は、同所共存信号により散乱／散乱空間において部分的
に不明瞭であるが、それらのより大きな信号による吸収（または蛍光）範囲で分
解される。好中球および好酸球は、同所共存信号により完全に不明瞭であるが、
それらはまた、大きな吸収（または蛍光）信号により分解される。網状赤血球は
色素を取り込むため、それらの光（または蛍光）吸収に基づいて赤血球と識別さ
れる。

【００４９】最も低い増幅レベルにおいて、白血球は、上記のように赤血球／網状赤血球お
よび血小板／網状血小板と識別される。この低い増幅は、好中球、好酸球、およ
び飽和から幾つかの単球の散乱／散乱信号を除くのに必要であり、その結果、全
ての白血球種は、散乱／散乱／吸収（または蛍光）空間におけるユニークな位置
に基づき相互に識別できる。

【００５０】種々の粒子種が、散乱理論を参照することなくこの３つの信号空間において独
自に決定できることは上記から理解できる。しかし、粒子種のクラスタ類へのミ
ー散乱理論の適用は、これらの粒子について重要な追加情報を提供する。各カテ
ゴリーの粒子、すなわち血小板、赤血球および白血球に関して、この理論は、対
の散乱信号または３組の散乱／散乱／吸収または蛍光信号を、それぞれのクラス
タ内の各粒子に関する容積と屈折率値に変換するのに適用できる。この情報は、
容積、細胞成分濃度（または密度）および乾燥質量にかんする平均値を算出する
のに用いることができる。

【００５１】赤血球の場合、これは、ＭＣＶ（平均赤血球容積）を提供するために本発明の
方法を可能にする（例えば、Ｔｙｃｋｏの米国特許第４，７３５，５０４号を参
照）。ヘモグロビン濃度は、細胞密度と直線関係があり、次いで屈折率と直線関
係にあることから、ＭＣＨＣ（平均赤血球ヘモグロビン濃度）をまた得ることが
できる。さらに、本発明の方法はまた、ＲＢＣ数を提供することから、ＲＢＣ、
ＭＣＶおよびＭＣＨＣの積は、血液中のヘモグロビンの全濃度（ｇ／ｄＬ）であ
るＨＧＢ値を提供するために用いることができる。また、ＭＣＶおよびＭＣＨＣ
の積はＭＣＨ（平均赤血球ヘモグロビン、ｐｇ）を提供する。同じ情報を網状赤
血球に関しても得ることができる。

【００５２】血小板の場合、ＭＰＶ（平均血小板容積）とＭＰＣ（平均血小板成分濃度）は
、ＭＣＶおよびＭＣＨＣと類似して得ることができる。ＭＰＶとＭＰＣの積は、
ＭＰＭ（平均血小板乾燥質量、ｐｇ）を提供する。再度、同一情報が網状血小板
に関して得ることができる。白血球に関して、平均細胞容積、成分濃度および平
均乾燥質量値は、本発明で新たに提供されたとおり、各細胞クラスタに関して得
ることができる。

【００５３】また特殊な非限定例として、網状赤血球チャンネル散乱／散乱サイトグラム、
散乱／吸収サイトグラムおよびゲート制御散乱／散乱サイトグラムは、上記方法
により分析されたネコの全血試料に関して示される。粒子種は、３次元空間で識
別されるが、この試料は、視覚容易な２次元空間上に投影されて示される（実施
例３および図４Ａ〜図４Ｃから図９Ａ〜図９Ｃを参照）。ゲート制御散乱／散乱
サイトグラムは、散乱／吸収サイトグラムの吸収軸上で決定されるように、吸収
信号が飽和吸収チャンネル（チャンネル９９）に出現する細胞を含む。非ゲート
制御散乱／散乱サイトグラムには、赤血球（同所共存を含む）、血小板、リンパ
球＋好塩基球および単球、および幾つかの多核白血球に関する別個のクラスタを
含む。非ゲート制御散乱／吸収サイトグラムは、血小板、赤血球／網状赤血球／
赤血球同所共存および白血球に関する別個の領域を含む。網状赤血球は、赤血球
／網状赤血球吸収チャンネルのヒストグラムの統計解析により成熟赤血球と識別
される。ゲート制御散乱／散乱サイトグラムにおいて、好酸球クラスタは好中球
クラスタと識別される。

【００５４】一般に、本発明の単チャンネル法は、提供された分析血液像情報に到達するた
めに血液試料中の多数の血球分析を伴う。正常ヒト血液試料に関して、赤血球（
ＲＢＣｓ）の白血球（ＷＢＣｓ）に対する比率は、約５００：１から１０００：
１である。したがって、例えば、十分なＷＢＣ数およびＷＢＣ百分率の精度を提
供する約１，０００個のＷＢＣｓをカウントするために、一般に約５００，００
０〜１，０００，０００個のＲＢＣｓをカウントする必要がある。しかし、これ
は自動システムにおける本発明に限定されていない。というのは、５００，００
０個の分析は、短時間すなわち約４５秒のオーダーで、また確かに約２分未満で
実施することができる。さらに、十分なＷＢＣ数およびＷＢＣ百分率の精度は、
オートレティック試薬中に懸濁した全血の１マイクロリットル（μｌ）の少なさ
で含有するアリコートから反復サンプリングにより簡便に達成される。正常ヒト
全血の１マイクロリットルには、約４，０００，０００〜５，０００，０００個
のＲＢＣｓ、１５０，０００〜４００，０００個のＰＬＴｓおよび５，０００〜
１０，０００個のＷＢＣｓを含有する。前記のように、反応時間とカウントを含
む全分析時間は約２分未満である。

【００５５】さらに、単チャンネル法において約５００，０００〜１，０００，０００個の
ＲＢＣｓのカウントは、異常血液試料の分析、例えば約２０，０００／μｌ未満
をカウントする血小板減少性または高血小板減少性の血液試料において特に有利
である。このような試料において、一般に１回の吸引は約５０，０００個のＲＢ
Ｃｓおよび約２００以下のＰＬＴｓをカウントするが、一方、本法によれば、２
，０００〜４，０００個のＰＬＴｓのカウントと共に約５００，０００個または
１，０００，０００個のＲＢＣｓがカウントされ、ＰＬＴカウント精度を改良し
た。したがって、本法およびシステムは、血液試料分析の効率と精度を維持し、
所与の血液試料を分析するのに必要な時間を有意に増加しない。

【００５６】本発明の他の利点は、分析器の所与のチャンネルにおいて決定される細胞種に
依存する多数の試薬の必要性を除外することである。血液試料アリコートにより
反応混合物または反応溶液を形成するために、１種の細胞希釈剤組成物が本単チ
ャンネルである単希釈法に用いられるが、血液自動分析器の各種チャンネルを使
用する場合、以前は少なくとも９種の試薬が種々の血球種分析のために必要であ
った。また、記載したように、本発明は、正常血液試料、および血小板減少症お
よび溶血性貧血などの血球障害から生じる異常血液試料の分析に直接適用できる
。

【００５７】現在普及の自動分析器は、赤血球種、血小板種および白血球種をカウントする
のに複数のチャンネルを必要とする１つの理由は、これらの分析器における赤血
球の相対数およびカウント頻度に関連する。多くの場合、赤血球は血液試料中全
血液粒子の９０％超を構成している。実際、短時間で十分な赤血球数をカウント
する必要性の結果、カウント頻度は、フローセル内の著しく多くの同所共存事象
を生じる。同所共存は、任意の所与の時間でフローセル中１個を超える粒子の検
出に相当する。信号空間においてこれらの事象数および分布は、一般にある一定
の白血球種からの信号を不明瞭にする（実施例１を参照）。

【００５８】さらに、５０，０００個の赤血球（例えば、典型的な数）が１分析サイクルで
カウントされても、白血球数は一般に１００未満となる。これは、正確かつ再現
性よく白血球数または自動分析器上の分析血液像を提供するには小さすぎる数で
ある。この結果、赤血球と血小板は、１測定サイクルにおいて数えあげられ（お
よび白血球もまた数えあげられる）、一般に十分な白血球数である５，０００〜
１０，０００を得るために、白血球は、赤血球の溶血を含み、赤血球／血小板分
析よりも非常に低い希釈因子を必要とする少なくとも他の１サイクルにおいて数
えあげられる。本発明は、白血球を同所共存と識別するのに寄与する第３の測定
範囲（光吸収または蛍光）を加えることにより、赤血球の同所共存信号による白
血球の不明瞭さに関連する困難を克服する。同所共存に関連する困難を克服して
、本発明は、より高いカウント頻度、すなわち典型的な速度の４倍高い利点を与
える。延長されたカウント回数と連結したこの高い速度は、正確なカウントおよ
び分析血液像を提供する好適な白血球数、すなわち５００〜１，０００以上のオ
ーダーでこの分析を可能にする。

【００５９】本発明の単チャンネル、単希釈法の一般的な説明は次のとおりである。試薬組
成物を全血試料のアリコートと混合する。例えば、全血試料の２−マイクロリッ
トルのアリコートを吸引し、次いで１．２５ミリリットルのオートレティック試
薬（例えば、ＡＤＶＩＡ（登録商標）１２０オートレティック試薬）に懸濁する
。この混合物を約１０〜１５（好ましくは約１３）秒間室温で反応させ、その時
間網状赤血球を含む赤血球は球状化し、網状血小板を含む網状赤血球および白血
球を染色する。次いで、混合物は、血液自動分析器単チャンネルの光学フローセ
ルの１セルを本質的に１度に通る。本発明の実施に関連する血液自動分析器シス
テム、例えばバイエルＨ＊（商標）システムおよびＡＤＶＩＡ（登録商標）シス
テム分析器の操作原理は、Ｄ．Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ他の米国特許第５，８１７
，５１９号およびＤ．Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ他の米国特許出願番号第０８／８３
３，０３３号に記載され、それらの内容はここに引用文献として組入れている。
このような分析システムの一般的な特徴は以下に説明する。

【００６０】本自動化単チャンネル法において、血球は、分析器の単光学測定チャンネルに
おいて共に分析され、それにはレーザー光源、フローセル、２台の光学散乱検出
器および１台の吸収または蛍光検出器を含んでいる。流体力学的焦点合わせによ
って、１つの細胞が、好適な照度波長を有する焦点合わせの光源により照らされ
るフローサイトメータの感知帯を通過する。少なくとも１つ、好ましくは２つの
散乱光信号および少なくとも１つの吸収信号、または１つの蛍光信号の何れかは
、散乱光および吸収または蛍光の何れかを測定する検出システムにより細胞毎の
原理において細胞に関して測定される。これらの測定および関連するサイグラム
分析から、散乱／散乱および散乱／散乱／吸収または散乱／散乱／蛍光フローサ
イトメトリーの技術を用いて、試料中の血球が同定され、区別され、種々のパラ
メータが決定された。

【００６１】本発明の単チャンネル法を用いて血液試料分析を実施するための完全自動機器
は、一般に各反応成分の適切な容積および成分を一緒に十分に混合する手段を提
供する血液並びに試薬計量装置、反応槽、および混合物を測定装置に移動する手
段を含んで成る。この測定装置は、細胞をカウントし、数え上げるためのフロー
セルを通る細胞含有反応混合物の計量されたフローを提供する手段を含んで成る
。一般にヘリウム‐ネオンレーザーまたはレーザーダイオードからの光をフロ−
セルに起こり易くし、この光はフローセルを介する血球の通過により断続される
。血球は、光をさえぎって散乱し、網状赤血球および白血球の染色核酸の場合、
光を良く吸収する。

【００６２】細胞がフローセルを通過して細胞から誘導される光学的および吸収または蛍光
信号を取扱うフローセル検出器を含んで成る単反応槽および単光学チャンネルま
たは測定チャンネルのみを含むだけであることから、本発明の単チャンネル法お
よびシステムに従う装置または機器はコンパクトなサイズとなるであろう。この
ような装置または機器は、ここに記載されるような血液試料分析を実施し、遂行
するために必要な全てのハードウェアおよびソフトウェアの構成要素、例えば試
料送達ポンプ、シーツ剤送達ポンプ、吸引機構または血液希釈試薬で混合した血
液試料の取り込み用および自動化システムへの送達用のアスピレータ、リンス機
構および関連構成要素、結果の保存構成要素、例えば結果を保存するためのコン
ピュータまたはコンピュータ装置、および、例えばサイトグラムを視覚化するた
めのプリント構成要素および／またはディスプレイ成分を含むことが解される。

【００６３】さらに具体的に、だが本発明に限定することを意図するものではないが、単チ
ャンネル法を実施するのに用いられる測定装置は３台の光学検出器を含む。２台
の検出器は、入射軸からそれぞれ約１°〜５°および４°〜２５°、好ましくは
それぞれ約２°〜３°および５°〜１５℃に散乱された光を検出する。第３の検
出器は、吸収された光のフラクションまたは蛍光強度の何れかを決定する。３台
の検出器からの信号は、信号を細胞容積、成分濃度およびフローセルを通過する
各細胞に関する質量含量データに変換するためにミー散乱理論誘導表を使用する
コンピュータにより分析される。このコンピュータはまた、細胞懸濁に関する種
々の散乱プロット対散乱プロット、散乱プロット対吸収プロットまたは散乱プロ
ット対蛍光プロットのサイトグラムを表示し、また赤血球信号、網状赤血球信号
、白血球信号、血小板信号、網状血小板信号および同所共存信号を識別し、区別
するために数理アルゴリズムを使用する。

【００６４】本発明の単チャンネル法に使用される光学検出システムの図式描写を図１０に
示す。この図式において、低散乱信号および高散乱信号は、それぞれＳ_Ｌおよび
Ｓ_Ｈとして示される。Ｓ_Ｌに関して、描写された第１段階信号増幅は、低角度、
低ゲインのものである。Ｓ_Ｈに関して、描写された第１段階信号増幅は、高角度
、低ゲインのものである。Ｓ_Ｌに関して、描写された第２段階信号増幅は、低角
度、高ゲインのものであるが、Ｓ_Ｈに関して、描写された第２段階信号増幅は、
高角度、高ゲインのものである。吸収信号はまた、（Ａｂｓ）で示される。蛍光
が本発明の態様に従って描写される場合、吸収信号（Ａｂｓ）は、蛍光信号（Ｆ
Ｌ）と交換できる。

【００６５】本発明の単チャンネル、単希釈法の実施の詳細な説明は以下のとおりである：
Ｋ_３ＥＤＴＡで抗凝固処理された全血の１から２マイクロリットルを吸引し、次
いで血液を、血球試料と試薬組成物を含んで成る反応混合物を形成するために、
血液１容量に対して試薬６２５容量の比率でオートレティック試薬で混合する反
応槽に引き入れる。試薬組成物は、効果的かつ等容的に赤血球および白血球を球
状化する。血小板は、Ｋ_３ＥＤＴＡの抗凝固化試薬により効果的に球状化される
。

【００６６】この混合物を約１３秒間反応させて、この混合物の全量約１２５マイクロリッ
トルを５個連続した２５マイクロリットルアリコートまたは他のマイクロリット
ルの組合せにて光学フローセルを通してポンプで注入させて、全血の全部で０．
２マイクリットルを分析する。正常な哺乳動物の血液試料に関して、この容量に
は、約８００，０００個以上の赤血球、約２０，０００以上の血小板および約１
，０００以上の白血球を含有する。

【００６７】反応槽から各２５マイクロリットルのアリコートを引き入れ、光学フローセル
を通してポンプで注入する工程には約１５秒以下かかる。したがって、全サイク
ル時間は、約８８秒以下である。混合物はフローセルを通してポンプで注入され
るので、それはシース／リンス剤によりシースされる。シースは、混合物の流れ
を狭めて、血球は、光学検出器による認識と同時にコンピュータソフトウェアに
よる分析を可能にする時間と速度で本質的に一度にフローセルを通過する。

【００６８】各細胞はフローセルを通過するので、焦点が合わされた光ビームを断続し、入
射ビームの散乱および部分吸収または蛍光となる。入射放射の与えられた波長に
関して、球状細胞による散乱は細胞サイズと屈折率の関数である。２台の検出器
は、低角度範囲に関して、ほぼ１〜１０度、好ましくはほぼ１〜７度、さらに好
ましくはほぼ２〜５度、最も好ましくはほぼ２〜３度；および高角度範囲に関し
ては、ほぼ４〜３０度、好ましくはほぼ５〜２５度、およびさらに好ましくはほ
ぼ５〜１５度からの低角度および高角度の範囲内で散乱された光を捕集する位置
にある。このように、フローセル内で分析された各細胞に関して、高散乱（Ｓ_Ｈ）および低散乱（Ｓ_Ｌ）信号が検出される。検出器はまた、各細胞により吸収さ
れた光フラクションを決定する、または代わりに蛍光強度を決定する位置にある
。

【００６９】各々の散乱信号は、１段階または２段階の何れかの信号増幅を受ける。このよ
うな信号増幅は、Ｄ．Ｚｅｌｍａｎｏｖｉｃ他の米国特許第５，８１７，５１９
号に記載されている。血小板に関して簡単に記載されているように、光学信号が
ほぼ２〜３度の散乱から生じる場合、血小板は、対応する赤血球信号の約２０倍
から３５倍、好ましくは約３０倍増幅される。光学信号が、５°〜１５°の散乱
または８．５°〜２５°の散乱から生じる場合、光学信号は、約８倍から１５倍
、好ましくは約１２倍増幅される。

【００７０】赤血球または白血球に関して特別に適用されたように、第１段階増幅、すなわ
ち低ゲイン信号増幅は、第１信号を赤血球（網状赤血球を含む）および白血球の
詳細な分析に適するものにする。すなわち、第１段階増幅信号分析は、他の血球
種と赤血球との識別と同時に、他の血球種と好中球、リンパ球＋個塩基球、単球
および好酸球との識別を含む。これは、非ゲート制御低ゲイン散乱／散乱サイト
グラムで視覚化される（例えば、図１Ｃ参照）。

【００７１】分析に関して、各種細胞は、表２および表３に示されるパラメータ値の範囲を
参照して相互に識別できる。表中の値の各種組合せは、散乱／散乱／吸収空間ま
たは蛍光空間において分析された血液試料中における各細胞種の独自の位置を与
える。

【００７２】高ゲイン増幅信号を伴う第２段階増幅は、表４に示されるように他の細胞種と
の識別を含む血小板の定性的パラメータを計量し決定するための情報を提供する
ことにより、血小板信号を詳細な分析に適するものとし、細胞容積および屈折率
値を決定する。第２段階信号増幅からの血小板信号の視覚化は、高ゲイン散乱／
散乱サイトグラムを経て生じる。血小板に関して、赤血球および白血球と同様に
、この屈折率情報は血小板成分濃度（ＭＰＣ）の直線関係のパラメータに換算し
て表される。

【００７３】本発明の他の実施形態において、ＷＢＣは、屈折率（ｒ．ｉ．）に基づきＲＢ
Ｃと識別でき、その屈折率は入射光の波長比、すなわち吸光度（ｒ．ｉ．（また
は密度）に対するＡｂｓ、ナノメートル（ｎｍ））、例えば細胞のＡｂｓ／ｒ．
ｉ．値を決定することにより細胞密度に対して直線関係にある。吸収が生じる入
射光の波長は、６２５ｎｍから６９０ｎｍの間、好ましくは６３０ｎｍから６７
５ｎｍの間、さらに好ましくは６３３ｎｍから６７０ｎｍの間の狭いバンドであ
る。一般に、ＷＢＣは核酸成分の影響として低いｒ．ｉ．値および高い吸光度値
を有する。このように、Ａｂｓ／ｒ．ｉ．比の決定は、ＷＢＣとＲＢＣとの分離
を可能にする。

【００７４】本発明の散乱／散乱／蛍光の態様に関して、吸収検出器は、フォトダイオード
または光電子増倍管であってもよい蛍光検出器で置き換えられる。散乱信号の１
つの部分を、フローセルから散乱検出器の１つ、例えば５〜１５度の散乱検出器
の経路において、二色鏡などの光学ビームスプリッタを設置することにより蛍光
検出器の方向に転換できる。入射ビームよりも長波長の光のみを効果的に通過す
る波長フィルタは、非蛍光成分をろ過するためにビームスプリッタと蛍光検出器
との間に挿入される。

【００７５】ここで以前に記載したように、幾つかの利点が、本法および本システムの実施
により提供される。１つは、以前の方法と比較して、すなわち５種から９種の試
薬を用いるような各々異なる試薬を必要とする複数または多数の個別のチャンネ
ルと比較すると、分析器の１つのチャンネルを使用することにより（ここでは二
種の試薬が用いられる）血液試料の分析を完了し、種々の血球種を同定し、識別
するために、試薬の数が有意に少なくてすむことである。

【００７６】本発明の単チャンネル法に用いられる２種の主要な試薬はまた、全血試料の赤
血球および白血球成分分析用のより緩和な試薬である。本法の白血球分析によれ
ば、例えば、赤血球を除くために過酷な界面活性剤および／または他の成分を含
有する試薬組成物を必要としない。試料中の他の血球種に与えなく、赤血球を溶
血する試薬をデザインするために当業者の努力にもかかわらず、時には白血球の
溶血および他の望ましくない作用が依然として生じ、それにより分析される白血
球のカウントが下回ることとなる。

【００７７】本法および本システムのさらなる利点は、１つの反応槽および測定チャンネル
のみが、結果を得るために必要であることであり、すなわち、全血試料１または
２マイクロリットルのみが結果を得るのに必要であり、および全血試料の１つの
アリコートのみが必要であり、それにより、複数の分析チャンネルを有するシス
テムに必要な複雑で高価な血液アリコート配分ハードウェアを除外する。

【００７８】本発明の他の実施形態には、非ヒト哺乳動物種からの血液試料分析、すなわち
、例えばネコ属（例えば、ネコ）の血液分析に有用な多種分析法を含む。バイエ
ルＡＤＶＩＡ（登録商標）１２０分析器などの血液自動分析器のペルオキシダー
ゼチャンネルは、ネコの血液試料を分析する場合、好酸球と好中球とを分離する
のに好適ではないことが新たに定められた。これは、好酸球のペルオキシダーゼ
染色の欠如および僅かにまたは淡く染色された好酸球と好中球とを識別できない
ためである。しかし、本発明による単チャンネル法において、散乱／散乱および
吸収または蛍光信号は、ネコの血液試料中の白血球、特に好酸球と他の全ての細
胞とを識別するのに使用される。この方法により、好酸球は、他の白血球種から
のゲート制御散乱／散乱サイトグラムプロットにおいてユニークな領域を占め（
実施例３を参照）、その結果、同定および定量化データの双方を得ることができ
る。

【００７９】要するに、本発明は、散乱および吸収または蛍光信号、信号増幅およびサイト
グラムの描写に続いてミー散乱理論を含むフローサイトメトリー分析を使用する
ことにより、哺乳動物血液試料中の網状赤血球を含む赤血球、白血球、血小板お
よび網状血小板の識別、同定および測定、および血液試料成分の定性および定量
パラメータを決定するための単チャンネル法を提供する。本発明はまた、記載さ
れた単チャンネル法を実施するためのより簡便でコンパクトな省空間の自動血液
分析装置を含む。上記のように、例えばこの機器は、この方法により得られるＣ
ＢＣ／Ｄｉｆｆ／Ｒｅｔｉｃ結果を得るために１つの反応槽および１つの測定チ
ャンネルのみが必要になると思われる。

【００８０】広い態様において、本発明の方法は、反応混合物を形成するために血液試料の
アリコートを水性試薬組成物と混合することを含んで成り、その中で試薬組成物
には、有機色素化合物、好ましくは網状赤血球のＲＮＡおよび白血球の核酸を染
色するのに効果的な量でのカチオン色素化合物、実質的に等容性の球状赤血球、
網状赤血球および白血球に効果的な量での球状化剤としての界面活性剤、および
試薬組成物の中性または中性付近のｐＨを維持する緩衝剤または緩衝液または緩
衝剤混合物を含んで成る。最適には、色素化合物は、血液試料のアリコートと試
薬組成物との間で形成される反応混合物からは沈殿しない。

【００８１】血球および試薬組成物を含有する反応混合物は、フローセルを通って一度に実
質的に１セルを通過する。フローセル内の各細胞は、光が散乱され、吸収される
（または蛍光発色される）焦点合わせの光源を分断する。２つの散乱強度測定値
、すなわち高散乱および低散乱を生成する２台の光学検出器により散乱信号を増
幅するために、散乱光は、ほぼ１度から１０度の低角度間隔、好ましくはほぼ１
度から７度の低角度間隔、さらに好ましくはほぼ２度から５度の低角度間隔、最
も好ましくはほぼ２度から３度の低角度間隔；およびほぼ４度から３０度の高角
度間隔、好ましくはほぼ５度から２５度の高角度間隔、さらに好ましくはほぼ５
度から１５度の高角度間隔を有する特に対の角度間隔で検出される。

【００８２】各散乱信号は、赤血球、網状赤血球および白血球の信号の分析のために好適に
する第１段階セット、および血小板信号の分析のために好適にする第２段階セッ
トによる２セットの増幅段階を受ける。検出器はまた、色素化合物を網状赤血球
および白血球の核酸またはその成分に結合することから生じる吸収または入射放
射の蛍光の何れかを検出する位置にある。この方法は、システムの光学検出器に
より検出される散乱および吸収または蛍光信号を用いて、散乱／散乱／吸収また
は蛍光空間パラメータを決定することにより試料の各種血球成分と血小板成分と
の間の識別および測定を可能にする。

【００８３】（実施例）ここに示される実施例は発明を実施する種々の態様を例証することを目的とし
、本発明を限定することを意図するものではない。

【００８４】実施例１実施例１において、正常なヒト全血試料の分析における上記の単チャンネル法
の有用性および成果を説明する。Ｋ_３ＥＤＴＡ抗凝固処理されたヒト全血球を、
オートレティック試薬およびシース／リンス試薬組成物を用い、図２Ａ〜図２Ｃ
に示されたサイトグラムのディスプレイ結果の提示にゲートする吸収を含む本発
明の方法に従って分析した。

【００８５】血球およびオートレティック試薬の反応混合物は１０回吸引され、各回約５０
，０００個の細胞がカウントされた。具体的には、抗凝固処理されたヒト全血試
料１から２マイクロリットルを吸引し、次いで反応槽に注入された。反応槽にお
いて、血液アリコートは、血液１容に対して試薬６２５容の比率でＡＤＶＩＡ（
登録商標）１２０オートレティック試薬と混合し、反応混合物を形成した。ＡＤ
ＶＩＡ（登録商標）１２０シース／リンス剤もまた使用した。

【００８６】この血液／試薬混合物を約１３秒間反応させ、次いで５連続の７マイクロリッ
トルのアリコートで光学フローセルを通して、全部で７マイクロリットルをポン
プにより注入した。

【００８７】本実験結果を図１Ａ〜図１Ｃおよび図２Ａ〜図２Ｃに示す。図１Ａ〜図１Ｃに
、対照ペルオキシダーゼチャンネルサイトグラム（図１Ａ）と同じく散乱／吸収
サイトグラムの非ゲート制御版（図１Ｂ）および散乱／散乱サイトグラム（図１
Ｃ）を示す。図２Ａ〜図２Ｃに、対照ペルオキシダーゼチャンネルサイトグラム
（図２Ａ）と同じく散乱／吸収サイトグラムのゲート制御版（図２Ｂ）および散
乱／散乱サイトグラム（図２Ｃ）を示す。非ゲート制御およびゲート制御散乱／
散乱サイトグラムの比較は、好中球および好酸球は、散乱／散乱空間において赤
血球の同所共存から分離できないが、散乱／散乱／吸収空間では明瞭であること
を示す。非ゲート制御（図１Ｃ）およびゲート制御（図２Ｃ）散乱／散乱サイト
グラムにおける白血球の相対数とペルオキシダーゼチャンネルサイトグラムのも
のとの比較は定性的な一致を示す。

【００８８】本実施例に引き続き、散乱検出器は２°〜３°および５°〜１５°からの散乱
光を集めた。吸収検出器は前進方向への透過光を集めた。

【００８９】ＷＢＣ百分率は図１Ａ〜図１Ｃおよび図２Ａ〜図２Ｃに示し、以下の図におい
て、ＷＢＣ（白血球数）、Ｎｅｕｔ（好中球）、Ｌｙｍｐｈ（リンパ球）、Ｍｏ
ｎｏ（単球）、Ｅｏｓ（好酸球）、Ｂａｓｏ（好塩基球）、ＬＵＣ（未染色大リ
ンパ球）、ＬＩ（小葉指標）、およびＭＰＸＩ（好中球の位置と角度に関連する
平均ペルオキシダーゼ活性指標）に関する低（Ｌ）および／または高（Ｈ）ゲイ
ンにおける数値データをふくむ。

【００９０】実施例２実施例に示された実験は、同所共存がない状態で白血球の識別を明示するため
に実施された。本実施例において、血小板に富む血漿（ＰＲＰ）は、オートレテ
ィック試薬（ＡＤＶＩＡ（登録商標）１２０オートレティック試薬およびＡＤＶ
ＩＡ（登録商標）１２０シース／リンス剤）を用いて本発明に従って分析した。
Ｋ_３ＥＤＴＡ抗凝固処理されたヒト全血球を遠心分離して、血漿懸濁液中の実質
全ての赤血球、残存血小板、白血球および少量の赤血球を除去した。同所共存吸
収信号がなかったことから、吸収ゲート制御は対応するサイトグラムディスプレ
イにとって必要ではなかった。この試料を１０回吸引し、上記実施例１のように
試料分析法が行われた。

【００９１】本実験結果を図３Ａ〜図３Ｃに示す。参照対照としてペルオキシダーゼチャン
ネルサイトグラム（図３Ａ）と同じく、各々約５，８００個の細胞（血小板と白
血球に富む）の１０回吸引の総計に関する網状赤血球チャンネルの散乱／吸収サ
イトグラム（図３Ｂ）および散乱／散乱サイトグラム（図３Ｃ）を示した。ＷＢ
Ｃ百分率の数値結果もまた示す。

【００９２】実施例２に提示した実験は、好中球と好酸球を不明瞭にする赤血球の同所共存
の欠如下、散乱／散乱サイトグラム（非ゲート制御低ゲインサイトグラム）上に
種々の白血球種に関して予想位置を証明するために実施した。散乱／散乱サイト
グラムに出現する白血球種の相対数は、定性的に参照のペルオキシダーゼチャン
ネルサイトグラムにおける相対数に一致する。本発明の方法により計算されたリ
ンパ球は、ペルオキシダーゼチャンネルにより計算されるリンパ球およびＬＵＣ
（未染色細胞）の両者を含むことが解される。

【００９３】実施例３本実施例において、単チャンネル法の多種の態様は、ヒト全血球以外の哺乳動
物全血球の分析において証明された。したがって、４種のネコの全血球を、ヒト
血液試料に係る実施例１に記載される方法を使用して本発明の単チャンネル法に
より分析した。４種のネコ血液試料のうち３種の分析結果を図４Ａ〜図４Ｃから
図９Ａ〜図９Ｃに提示する。

【００９４】各試料を１回吸引し、約１５０，０００個のネコ細胞が各回にカウントされた
。３つの個別の実験結果を図４Ａ〜図４Ｃから図９Ａ〜図９Ｃに提示する。全て
の図には、非ゲート制御散乱／吸収サイトグラムおよび散乱／散乱サイトグラム
およびゲート制御対応のものと同様に参照のペルオキシダーゼチャンネルサイト
グラムを含む。ヒト血液試料のペルオキシダーゼサイトグラムと対照的に（例え
ば、図１Ａおよび図２Ａ）、ネコのペルオキシダーゼサイトグラム（図４Ａおよ
び図７Ａ；図５Ａおよび図８Ａ；図６Ａおよび図９Ａ）は、明確な好酸球クラス
タを示さないことを特記するものである。これは、ネコの好酸球のペルオキシダ
ーゼ陰性によるものである。しかし、ゲート制御散乱／散乱サイトグラムは、表
された３つの試料において２％から１６％の好酸球パーセンテージに関して明確
な好酸球クラスタを示す。

【００９５】特に、図４Ａ〜図４Ｃ、図５Ａ〜図５Ｃおよび図６Ａ〜図６Ｃは、ネコの全血
球を分析する３つの実験から非ゲート制御結果を示すサイトグラムを描写する。
図７Ａ〜図７Ｃ、図８Ａ〜図８Ｃおよび図９Ａ〜図９Ｃは、それぞれ図４Ａ〜図
４Ｃ、図５Ａ〜図５Ｃおよび図６Ａ〜図６Ｃに示される非ゲート制御サイトグラ
ム結果に対応するゲート制御結果を示すサイトグラムを描写する。非ゲート制御
散乱／散乱サイトグラム（図４Ｃ、図５Ｃおよび図６Ｃ）は、赤血球（同所共存
を含む）、血小板、リンパ球（および単球）および幾つかの多核白血球に関する
明確なクラスタを含む。非ゲート制御散乱／吸収サイトグラム（図４Ｂ、図５Ｂ
および図６Ｂ）は、血小板、赤血球／網状赤血球／赤血球同所共存および白血球
に関する明確なクラスタを有する。網状赤血球は、赤血球／網状赤血球の吸収チ
ャンネルヒストグラムの統計解析により成熟赤血球と識別された。

【００９６】ゲート制御散乱／散乱サイトグラム（図７Ａ〜図７Ｃ、図８Ａ〜図８Ｃおよび
図９Ａ〜図９Ｃ）は、吸収信号が飽和吸収チャンネルに現れる細胞を含む（吸収
軸がチャンネル０からチャンネル９９の範囲にある散乱／吸収サイトグラムの吸
収軸のチャンネル９９）。

【００９７】上記のように、ゲート制御散乱／散乱サイトグラム（図７Ｃ、図８Ｃおよび図
９Ｃ）において、好酸球クラスタは、好中球クラスタと識別される。本法は、ネ
コの試料分析において好酸球と好中球との識別を可能にするが、ペルオキシダー
ゼチャンネルを伴う方法は識別されないことが、本発明の方法と試薬に関する他
の利点である。

【００９８】本発明の単チャンネル法およびシステムのさらなる利点は、ここに提出された
実施例および図において、参照のペルオキシダーゼサイトグラムおよび非ゲート
制御およびゲート制御散乱／散乱サイトグラムの比較から明らかである。全ての
ペルオキシダーゼサイトグラムには、血小板およびある赤血球間質を構成するリ
ンパ球領域のまじかに「ノイズ」領域を有する。アルゴリズムは、非リンパ球ノ
イズとリンパ球とを識別するのに必要である。時々、これらの領域が混同される
可能性があり、総白血球数と同じくリンパ球数におけるエラーの可能性の原因と
なる。対照的に本発明の実施において、このようなノイズ領域はリンパ球に近接
しては現れず、それによりリンパ球数におけるエラーの潜在的原因を排除する。

【００９９】実施例４本実施例において、網状血小板を本発明により分析した。全血試料を、バイエ
ルのオートレティック試薬で６２５倍希釈し、ここに記載しているように、約５
０，０００個の細胞を、単チャンネル、単希釈法を用いて血液自動分析器で分析
した。網状血小板は、核酸特異的色素の取り込みのため光のより大きな吸収によ
り成熟血小板と識別された。この結果を図１１Ａ〜図１１Ｅに提示する。

【０１００】ここに引用される特許出願、特許公報、公表論文および引用文献、および教科
書の内容は、本発明が関係する技術の状態をさらに完全に説明するためにそっく
りそのまま引用文献としてここに組入れている。

【０１０１】上記組成物および方法において、本発明の範囲および趣旨から逸脱することな
く種々変化させることができるので、上記に含まれ、添付図で示され、添付され
た特許請求の範囲で定義された内容は、例証であって限定することを意図するも
のではないと解釈すべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】実施例１の実験結果を示すサイトグラムである。

【図２】実施例１の実験結果を示すサイトグラムである。

【図３】実施例２の実験結果を示すサイトグラムである。

【図４】実施例３の実験結果を示すサイトグラムである。

【図５】実施例３の実験結果を示すサイトグラムである。

【図６】実施例３の実験結果を示すサイトグラムである。

【図７】実施例３の実験結果を示すサイトグラムである。

【図８】実施例３の実験結果を示すサイトグラムである。

【図９】実施例３の実験結果を示すサイトグラムである。

【図１０】本発明方法の光学デザインを説明する線図的説明図である。

【図１１】実施例４の実験結果を示すサイトグラムである。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年３月１９日（２００１．３．１９）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項１８３】ゲート制御低ゲイン、散乱−散乱サイトグラム上で好中
球および好酸球が占める領域に基づいて、好中球と好酸球とをさらに区別する、
請求項１８２に記載の装置。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年１０月１２日（２００１．１０．１２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】全図

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図１】

【図２】

【図３】

【図４】

【図５】

【図６】

【図７】

【図８】

【図９】

【図１０】

【図１１】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/49 Ｇ０１Ｎ 33/49 ＢＫＳ 33/72 33/72 ＡＦターム(参考） 2G043 AA03 AA04 BA16 DA01 DA02 DA05 EA01 EA13 EA14 HA09 JA02 2G045 AA02 AA06 BB24 BB42 FA11 GA01 GA02 GA03 GA04 GA05 GA06 GA07 GA08 GA09 GC07 GC11 2G057 AA04 AB01 AC01 BA05

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】正常または異常な哺乳動物の血液試料における赤血球、白血
球および血小板成分を同定および測定するとともに、前記血液試料成分の定性お
よび定量パラメータを決定する単チャンネル単希釈法であって、（ａ）単希釈で血液試料のアリコートと水性試薬組成物とを混合して反応混合
物を形成し、前記試薬組成物は、試料中の血球を球状化するのに有効な量の球状
化剤としての表面活性剤と、網状赤血球ＲＮＡおよび白血球核酸を染色するのに
有効な量の色素化合物と、緩衝剤または緩衝液とを含み、赤血球は実質的に前記
反応混合物中で溶解されていないこと、（ｂ）（ａ）の反応混合物を単チャンネル内のフローセルに、実質的に一細胞
ずつ通過させ、各細胞により光が散乱して吸収され、前記散乱光を低角度間隔で
光学的に検出して低光散乱強度測定値を生成し、高角度間隔で光学的に検出して
高光散乱強度測定値を生成すること、（ｃ）単チャンネルにおいて、色素化合物の網状赤血球および白血球核酸、ま
たはその成分への結合によって生じる入射放射線によって生成する吸収信号を検
出すること、および（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の散乱および吸収信号を用いて、散乱−散
乱光学信号、散乱−吸収光学信号、または散乱−散乱−吸収光学信号を検出する
ことによって、試料の異なる血球および血小板成分を区別および測定することを
含む方法。
【請求項２】（ｂ）において、前記低および高散乱強度測定は第１および
第２の増幅を受け、前記第１の増幅は、網状赤血球を含む赤血球、および白血球
の信号を分析に適するものとし、前記第２の増幅は、血小板および網状血小板の
信号を分析に適するものとする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】ステップ（ａ）の低角度間隔は約１度から１０度で、高角度
間隔は約４から３０度である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】ステップ（ａ）の低角度間隔は約１度から７度で、高角度間
隔は約５から２５度である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】ステップ（ａ）の低角度間隔は約１度から５度で、高角度間
隔は約５から１５度である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】ステップ（ａ）の低角度間隔は約２度から３度で、高角度間
隔は約５から１５度である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】前記区別するステップ（ｄ）において、（ｉ）散乱−散乱パ
ラメータに基づいて、血小板および網状血小板を他の血球から分離させ、（ｉｉ
）散乱−散乱パラメータに基づいて、赤血球を血小板から分離させ、（ｉｉｉ）
散乱−吸収パラメータに基づいて、赤血球を網状赤血球から分離させ、（ｉｖ）
散乱−散乱パラメータに基づいて、赤血球をリンパ球、好塩基球および単球から
分離させ、（ｖ）散乱−散乱−吸収パラメータに基づいて、赤血球を好中球およ
び好酸球から分離させ、（ｖｉ）散乱−散乱−吸収パラメータに基づいて、リン
パ球および好塩基球を単球から分離させ、（ｖｉｉ）散乱−散乱パラメータに基
づいて好中球を好酸球から分離させるとともに、吸収パラメータに基づいて赤血
球および網状赤血球信号をゲート制御する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】ステップ（ａ）の緩衝剤または緩衝液混合物は試薬組成物の
ｐＨを約６に維持する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】ステップ（ａ）の緩衝剤または緩衝液混合物は試薬組成物の
ｐＨを約７．２から約７．５に維持する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】ステップ（ａ）の緩衝剤または緩衝液混合物は試薬組成物
のｐＨを約７．４に維持する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】前記緩衝剤または緩衝システムが等張性であることにより
、血球に対して実質的に等容性球状化を施す、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】（ａ）の血液試料のアリコートは約１から２マイクロリッ
トルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】ステップ（ａ）の試薬組成物における色素化合物はカチオ
ン色素化合物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】カチオン色素化合物はオキサジン７５０である、請求項１
に記載の方法。
【請求項１５】オキサジン７５０は、試薬組成物中に約２μｇ／ｍｌから
約１５μｇ／ｍｌの量で存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】オキサジン７５０は、試薬組成物中に約６μｇ／ｍｌから
約２０μｇ／ｍｌの量で存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】オキサジン７５０は、試薬組成物中に約９μｇ／ｍｌから
約１０．５μｇ／ｍｌの量で存在する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】ステップ（ａ）の試薬組成物におけるカチオン色素はニュ
ーメチレンブルーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】ニューメチレンブルーは、試薬組成物中に約１０μｇ／ｍ
ｌから約１００μｇ／ｍｌの量で存在する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】（ａ）の試薬組成物における表面活性剤は非イオン表面活
性剤および両性表面活性剤より成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】前記表面活性剤は非イオン表面活性剤である、請求項２０
に記載の方法。
【請求項２２】前記非イオン表面活性剤はアルキルグリコシドである、請
求項２１に記載の方法。
【請求項２３】前記非イオン表面活性剤は、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マル
トシド、ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトシドおよびｎ−テトラデシル−β−
Ｄ−グルコシドより成る群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】（ａ）の試薬組成物における表面活性剤は両性表面活性剤
である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】ステップ（ａ）の試薬組成物における両性表面活性剤はア
ルキルアミドベタインまたはアルキルベタインである、請求項２４に記載の方法
。
【請求項２６】前記両性表面活性剤は、ラウルアミドプロピルベタイン（
ＬＡＢ）、ココアミドプロピルベタイン（ＣＡＰＢ）およびココアミドスルホベ
タイン（ＣＡＳＢ）より成る群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】ラウルアミドプロピルベタイン（ＬＡＢ）は、前記試薬組
成物中に約１２μｇ／ｍｌから約８７．５μｇ／ｍｌの量で存在し、ココアミド
プロピルベタイン（ＣＡＰＢ）は、前記試薬組成物中に約８．８μｇ／ｍｌから
約１７．５μｇ／ｍｌの量で存在し、ココアミドスルホベタイン（ＣＡＳＢ）は
、前記試薬組成物中に約１２．５μｇ／ｍｌから約１５μｇ／ｍｌの量で存在す
る、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】ステップ（ａ）の試薬組成物における表面活性剤は、Ｎ−
テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート
（ＴＤＡＰＳ）またはＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−
プロパンスルホナート（ＤＤＡＰＳ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−
１−プロパンスルホナート（ＴＤＡＰＳ）は、前記試薬組成物中に約３．９μｇ
／ｍｌから約１１．８μｇ／ｍｌの量で存在し、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート（ＤＤＡＰＳ）は、前記試薬組
成物中に約４９．３μｇ／ｍｌから約１４８μｇ／ｍｌの量で存在する、請求項
２８に記載の方法。
【請求項３０】ステップ（ａ）の試薬組成物はアルカリ金属塩をさらに含
む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】ステップ（ａ）の試薬組成物における前記アルカリ金属塩
は、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】ステップ（ａ）の試薬組成物は抗菌化合物をさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項３３】ステップ（ａ）の試薬組成物における抗菌化合物は、１つ
または複数の２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メ
チル−４−イソチアゾリン−３−オン、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス［Ｎ’−（１−
（ヒドロキシメチル）−２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル）］尿素、（
１−（３−クロロアリル）−３，５，７−トリアザ−１−アゾニアアダマンタン
クロリド）、およびブロノポル２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオ
ール（Ｃ_３Ｈ_６ＢｒＮＯ_４）より成る群から選択される、請求項３２に記載の方
法。
【請求項３４】ステップ（ｃ）の前記吸収された入射放射線はスペクトル
の赤色領域に励起波長を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】ステップ（ａ）の前記試薬組成物は少なくとも１つの救核
試薬をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】前記救核試薬はアジ化物イオン（Ｎ_３ ⁻）またはシアン化
物イオン（ＯＣＮ⁻）である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】前記救核試薬は、前記試薬組成物中に約２０ｍＭの濃度で
存在する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】ステップ（ａ）の試薬組成物の浸透圧は約２５０から３０
０ミリオスモルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】ステップ（ａ）の試薬組成物の浸透圧は約２８７から２９
７ミリオスモルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】前記分析される血液試料は、正常または異常な哺乳動物の
血液試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】前記定性および定量パラメータは、赤血球数、白血球数、
血小板数、ヘモグロビン濃度、ヘマトクリット、平均細胞容積、平均赤血球ヘモ
グロビン量、平均赤血球ヘモグロビン濃度、赤血球容積分布幅、赤血球ヘモグロ
ビン濃度分布幅、平均血小板容積、平均血小板成分濃度、平均血小板乾燥質量、
好中球の比率および絶対数、リンパ球プラス好塩基球の比率および絶対数、単球
の比率および絶対数、好酸球の比率および絶対数、網状赤血球の比率および絶対
数、網状赤血球平均赤血球容積、網状赤血球平均赤血球ヘモグロビン量、網状赤
血球平均赤血球ヘモグロビン濃度、網状血小板の比率および絶対数、平均好中球
容積、平均好中球成分濃度、平均好中球乾燥質量、平均リンパ球＋好塩基球容積
、平均リンパ球＋好塩基球成分濃度、平均リンパ球＋好塩基球乾燥質量、平均単
球容積、平均単球成分濃度、平均単球乾燥質量、平均好酸球容積、平均好酸球成
分濃度および平均好酸球乾燥質量より成る群から選択される、請求項１に記載の
方法。
【請求項４２】単チャンネルを洗浄して残留細胞および反応混合物の蓄積
物を除去することにより、試薬の蓄積を防ぐステップをさらに含む、請求項１に
記載の方法。
【請求項４３】血液試料を抗凝固処理する、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】血液試料をＫ_３ＥＤＴＡで抗凝固処理する、請求項４３に
記載の方法。
【請求項４５】該方法において互いに区別された血球および血小板が占め
る領域をサイトグラムが表示する、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】（ｉ）サイトグラム上の低ゲイン、散乱−散乱空間におい
て赤血球が占める領域に基づいて、赤血球と試料中の他の血球とを区別し、（ｉ
ｉ）サイトグラム上の低ゲイン、散乱−散乱空間においてリンパ球プラス好塩基
球および単球が占める領域に基づいて、リンパ球プラス好塩基球および単球と試
料中の他の血球とを区別し、（ｉｉｉ）高ゲイン、散乱−散乱サイトグラムにお
いて血小板が占める領域に基づいて、血小板および網状血小板と試料中の他の血
球とを区別し、（ｉｖ）低ゲイン高角度吸収空間において成熟赤血球および網状
赤血球が占める位置から導かれる吸収周波数ヒストグラムの統計解析に基づいて
、網状赤血球と試料中の他の血球とを区別し、（ｖ）散乱−散乱吸収空間内で好
中球および好酸球が占める領域に基づいて、好中球および好酸球と試料中の他の
血球とを区別する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】ゲート制御低ゲイン、散乱−散乱サイトグラム上で好中球
および好酸球が占める領域に基づいて好中球と好酸球とをさらに区別する、請求
項４６に記載の方法。
【請求項４８】ステップ（ｄ）において、入射光の波長と血球の屈折率値
の比率に基づいて白血球と赤血球とを分離する、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】吸収が生じる入射光の波長は６２５ナノメータから６９０
ナノメータまでの狭帯域幅を有する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】哺乳動物の血液試料における血球および血小板を区別およ
び計数する単チャンネル単希釈法であって、（ａ）単希釈ステップにおいて、血液試料のアリコートと水性試薬組成物と血
液分析器の単反応槽内で混合して反応混合物を形成し、前記試薬組成物は、網状
赤血球ＲＮＡおよび白血球核酸を染色するのに有効な量のカチオン色素化合物と
、試料中の血球を球状化するのに有効な量の表面活性剤と、緩衝剤または緩衝液
とを含み、赤血球は実質的に前記反応混合物で溶解されていないこと、（ｂ）ステップ（ａ）の反応混合物を、単一の光学チャンネルを含む単槽内の
フローセルに実質的に一細胞ずつ通過させ、各細胞により光が散乱して吸収され
、前記散乱光を約１度から１０度の低角度間隔、および約４度から３０度の高角
度間隔で光学的に検出して低および高散乱強度測定値を生成し、前記低および高
散乱強度測定値に第１および第２の増幅を施し、前記第１の増幅は、網状赤血球
を含む赤血球、および白血球の信号を分析に適するものとし、前記第２の増幅は
、血小板の信号を分析に適するものとする（ｃ）色素化合物の網状赤血球および白血球核酸、またはその成分への結合に
よって生じる入射放射線によって生成する吸収信号を検出すること、および（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の前記散乱および吸収信号を用いて、散乱
−散乱空間パラメータ、散乱−吸収空間パラメータ、または散乱−散乱−吸収空
間パラメータを決定することによって、血液試料の異なる血球および血小板成分
を区別および測定することを含む方法。
【請求項５１】ステップ（ａ）の低角度間隔は約１度から７度で、高角度
間隔は約５度から２５度である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】前記区別するステップ（ｄ）において、（ｉ）散乱−散乱
パラメータに基づいて、血小板および網状血小板を他の血球から分離させ、（ｉ
ｉ）散乱−散乱パラメータに基づいて、赤血球を血小板から分離させ、（ｉｉｉ
）散乱−吸収パラメータに基づいて、赤血球を網状赤血球から分離させ、（ｉｖ
）散乱−散乱パラメータに基づいて、赤血球をリンパ球、好塩基球および単球か
ら分離させ、（ｖ）散乱−散乱−吸収パラメータに基づいて、赤血球を好中球お
よび好酸球から分離させ、（ｖｉ）散乱−散乱パラメータに基づいて、リンパ球
および好塩基球を単球から分離させ、（ｖｉｉ）散乱−散乱パラメータに基づい
て好中球を好酸球から分離させるとともに、吸収パラメータに基づいて赤血球お
よび網状赤血球信号をゲート制御する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】（ａ）の緩衝剤または緩衝液混合物は試薬組成物のｐＨを
約６から約９に維持する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】ステップ（ａ）の緩衝剤または緩衝液混合物は試薬組成物
のｐＨを約７．２から約７．５に維持する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】前記緩衝剤または緩衝システムが等張性であることにより
、血球に対して実質的に等容性球状化を施す、請求項５０に記載の方法。
【請求項５６】ステップ（ａ）の試薬組成物におけるカチオン色素化合物
はオキサジン７５０である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】オキサジン７５０は、試薬組成物中に約２μｇ／ｍｌから
約１５μｇ／ｍｌの量で存在する、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】ステップ（ａ）の試薬組成物におけるカチオン色素化合物
はニューメチレンブルーである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５９】ニューメチレンブルーは、試薬組成物中に約１０μｇ／ｍ
ｌから約１００μｇ／ｍｌの量で存在する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】（ａ）の試薬組成物における表面活性剤は非イオン表面活
性剤および両性表面活性剤より成る群から選択される、請求項５０に記載の方法
。
【請求項６１】前記表面活性剤は、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、
ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトシドおよびｎ−テトラデシル−β−Ｄ−グル
コシドより成る群から選択されるアルキルグリコシド非イオン表面活性剤である
、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】（ａ）の試薬組成物における表面活性剤は両性表面活性剤
である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】ステップ（ａ）の試薬組成物における両性表面活性剤はア
ルキルアミドベタインまたはアルキルベタインである、請求項６２に記載の方法
。
【請求項６４】前記両性表面活性剤は、ラウルアミドプロピルベタイン（
ＬＡＢ）、ココアミドプロピルベタイン（ＣＡＰＢ）およびココアミドスルホベ
タイン（ＣＡＳＢ）より成る群から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】ラウルアミドプロピルベタイン（ＬＡＢ）は、前記試薬組
成物中に約１２μｇ／ｍｌから約８７．５μｇ／ｍｌの量で存在し、ココアミド
プロピルベタイン（ＣＡＰＢ）は、前記試薬組成物中に約８．８μｇ／ｍｌから
約１７．５μｇ／ｍｌの量で存在し、ココアミドスルホベタイン（ＣＡＳＢ）は
、前記試薬組成物中に約１２．５μｇ／ｍｌから約１５μｇ／ｍｌの量で存在す
る、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】ステップ（ａ）の試薬組成物における表面活性剤は、Ｎ−
テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート
（ＴＤＡＰＳ）またはＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−
プロパンスルホナート（ＤＤＡＰＳ）である、請求項５０に記載の方法。
【請求項６７】Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−
１−プロパンスルホナート（ＴＤＡＰＳ）は、前記試薬組成物中に約３．９μｇ
／ｍｌから約１１．８μｇ／ｍｌの量で存在し、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート（ＤＤＡＰＳ）は、前記試薬組
成物中に約４９．３μｇ／ｍｌから約１４８μｇ／ｍｌの量で存在する、請求項
６６に記載の方法。
【請求項６８】ステップ（ａ）の試薬組成物はアルカリ金属塩をさらに含
む、請求項５０に記載の方法。
【請求項６９】ステップ（ａ）の試薬組成物における前記アルカリ金属塩
は、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】ステップ（ａ）の試薬組成物は、１つまたは複数の２−メ
チル−４−イソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチア
ゾリン−３−オン、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス［Ｎ’−（１−（ヒドロキシメチル
）−２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル）］尿素、（１−（３−クロロア
リル）−３，５，７−トリアザ−１−アゾニアアダマンタンクロリド）、および
ブロノポル２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール（Ｃ_３Ｈ_６Ｂｒ
ＮＯ_４）より成る群から選択される抗菌化合物をさらに含む、請求項５０に記載
の方法。
【請求項７１】ステップ（ｃ）の前記吸収された入射放射線はスペクトル
の赤色領域に励起波長を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項７２】ステップ（ａ）の前記試薬組成物は少なくとも１つの救核
試薬をさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項７３】前記球核試薬はアジ化物イオン（Ｎ_３ ⁻）またはシアン化
物イオン（ＯＣＮ⁻）である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】ステップ（ａ）の試薬組成物の浸透圧は約２５０から３０
０ミリオスモルである、請求項５０に記載の方法。
【請求項７５】ステップ（ａ）の試薬組成物の浸透圧は約２８７から２９
７ミリオスモルである、請求項５０に記載の方法。
【請求項７６】前記分析される血液試料は、正常または異常な哺乳動物の
血液試料である、請求項５０に記載の方法。
【請求項７７】前記定性および定量パラメータは、赤血球数、白血球数、
血小板数、ヘモグロビン濃度、ヘマトクリット、平均細胞容積、平均赤血球ヘモ
グロビン量、平均赤血球ヘモグロビン濃度、赤血球容積分布幅、赤血球ヘモグロ
ビン濃度分布幅、平均血小板容積、平均血小板成分濃度、平均血小板乾燥質量、
好中球の比率および絶対数、リンパ球プラス好塩基球の比率および絶対数、単球
の比率および絶対数、好酸球の比率および絶対数、網状赤血球の比率および絶対
数、網状赤血球平均赤血球容積、網状赤血球平均赤血球ヘモグロビン量、網状赤
血球平均赤血球ヘモグロビン濃度、網状血小板の比率および絶対数、平均好中球
容積、平均好中球成分濃度、平均好中球乾燥質量、平均リンパ球＋好塩基球容積
、平均リンパ球＋好塩基球成分濃度、平均リンパ球＋好塩基球乾燥質量、平均単
球容積、平均単球成分濃度、平均単球乾燥質量、平均好酸球容積、平均好酸球成
分濃度および平均好酸球乾燥質量より成る群から選択される、請求項５０に記載
の方法。
【請求項７８】単チャンネルを洗浄して残留細胞および反応混合物の蓄積
物を除去することにより、試薬の蓄積を防ぐステップをさらに含む、請求項５０
に記載の方法。
【請求項７９】血液試料を抗凝固処理する、請求項５０に記載の方法。
【請求項８０】血液試料をＫ_３ＥＤＴＡで抗凝固処理する、請求項７９に
記載の方法。
【請求項８１】該方法において互いに区別された血球、血小板および網状
血小板が占める領域をサイトグラムが表示する、請求項５０に記載の方法。
【請求項８２】（ｉ）サイトグラム上の低ゲイン、散乱−散乱空間におい
て赤血球が占める領域に基づいて、赤血球と試料中の他の血球とを区別し、（ｉ
ｉ）サイトグラム上の低ゲイン、散乱−散乱空間においてリンパ球プラス好塩基
球および単球が占める領域に基づいて、リンパ球プラス好塩基球および単球と試
料中の他の血球とを区別し、（ｉｉｉ）高ゲイン、散乱−散乱サイトグラムにお
いて血小板が占める領域に基づいて、血小板および網状血小板と試料中の他の血
球とを区別し、（ｉｖ）低ゲイン高角度吸収空間において成熟赤血球および網状
赤血球が占める位置から導かれる吸収周波数ヒストグラムの統計解析に基づいて
、網状赤血球と試料中の他の血球とを区別し、（ｖ）散乱−散乱吸収空間内で好
中球および好酸球が占める領域に基づいて、好中球および好酸球と試料中の他の
血球とを区別する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】散乱−散乱吸収空間内の好酸球が占める領域を決定するこ
とによって、好酸球と試料の他の血球および血小板とを区別する、請求項８２に
記載の方法。
【請求項８４】吸収ゲート制御低ゲイン、散乱−散乱サイトグラム上で好
中球および好酸球が占める領域に基づいて、好中球と好酸球とをさらに区別する
、請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】前記好酸球は人間以外の哺乳動物の血液試料中に存在する
、請求項８２から８４のいずれかに記載の方法。
【請求項８６】前記血液試料はネコの血液試料である、請求項８５に記載
の方法。
【請求項８７】ステップ（ｄ）において、入射光の波長と血球の屈折率値
の比率に基づいて白血球と赤血球とを分離する、請求項５０に記載の方法。
【請求項８８】吸収が生じる入射光の波長は６２５ナノメータから６９０
ナノメータまでの狭帯域幅を有する、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】正常または異常な哺乳動物の血液試料における赤血球、網
状赤血球、白血球および血小板を同定および測定するとともに、前記血液試料成
分の定性および定量パラメータを決定する単チャンネル単希釈法を実施する装置
であって、（ａ）血液のアリコートを提供するためのアスピレータ機構と、（ｂ）（ｉ）単希釈ステップで血液試料のアリコートと水性試薬組成物とを混
合して反応混合物を形成し、前記試薬組成物は、網状赤血球ＲＮＡおよび白血球
核酸を染色するのに有効な量の色素化合物と、試料中の血球および網状赤血球を
球状化するのに有効な量の球状化剤としての表面活性剤と、緩衝剤または緩衝液
とを含み、赤血球は実質的に前記反応混合物中に溶解されておらず、（ｉｉ）適
切なポンプを用いて、また当該ポンプが提供する適切なシーシング内で、前記血
球を含む（ｉ）の反応混合物を単光学チャンネル内のフローセルに実質的に一細
胞ずつ通過させ、各細胞により光が散乱して吸収され、前記散乱光を低角度間隔
で検出して低光散乱強度測定値を生成し、高角度間隔で検出して高光散乱強度測
定値を生成する反応槽と、（ｃ）単チャンネルにおいて、色素化合物の網状赤血球および白血球核酸、ま
たはその成分への結合によって生じる入射放射線によって生成する吸収信号を検
出するための光学検出器と、（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の散乱および吸収信号を使用し、計算し、
表示することにより、散乱−散乱空間パラメータ、散乱−吸収空間パラメータ、
または散乱−散乱−吸収空間パラメータを決定することによって、試料の異なる
血球および血小板成分を区別および測定するためのコンピュータとを含む装置。
【請求項９０】（ｂ）（ｉｉ）において、前記低および高散乱強度測定は
第１および第２の増幅を受け、前記第１の増幅は、網状赤血球を含む赤血球、お
よび白血球の信号を分析に適するものとし、前記第２の増幅は、血小板および網
状血小板の信号を分析に適するものとする、請求項８９に記載の装置。
【請求項９１】（ｂ）の低角度間隔は約１度から１０度で、高角度間隔は
約４度から３０度である、請求項８９に記載の装置。
【請求項９２】（ｂ）の低角度間隔は約１度から７度で、高角度間隔は約
５度から２５度である、請求項８９に記載の装置。
【請求項９３】（ｄ）（ｉ）において、（ｉ）散乱−散乱パラメータに基
づいて、血小板および網状血小板を他の血球から分離させ、（ｉｉ）散乱−散乱
パラメータに基づいて、赤血球を血小板から分離させ、（ｉｉｉ）散乱−吸収パ
ラメータに基づいて、赤血球を網状赤血球から分離させ、（ｉｖ）散乱−散乱パ
ラメータに基づいて、赤血球をリンパ球、好塩基球および単球から分離させ、（
ｖ）散乱−散乱−吸収パラメータに基づいて、赤血球を好中球および好酸球から
分離させ、（ｖｉ）散乱−散乱パラメータに基づいて、リンパ球および好塩基球
を単球から分離させ、（ｖｉｉ）散乱−散乱パラメータに基づいて好中球を好酸
球から分離させるとともに、吸収パラメータに基づいて赤血球および網状赤血球
信号をゲート制御する、請求項８９に記載の装置。
【請求項９４】（ｂ）の緩衝剤または緩衝液混合物は試薬組成物のｐＨを
約６から約９に維持する、請求項８９に記載の装置。
【請求項９５】（ｂ）の緩衝剤または緩衝液混合物は試薬組成物のｐＨを
約７．２から約７．５に維持する、請求項８９に記載の装置。
【請求項９６】（ｂ）の試薬組成物における色素化合物はカチオン色素化
合物である、請求項８９に記載の装置。
【請求項９７】カチオン色素化合物はオキサジン７５０である、請求項９
６に記載の装置。
【請求項９８】オキサジン７５０は、試薬組成物中に約２μｇ／ｍｌから
約１５μｇ／ｍｌの量で存在する、請求項９７に記載の装置。
【請求項９９】（ｂ）の試薬組成物におけるカチオン色素はニューメチレ
ンブルーである、請求項８９に記載の装置。
【請求項１００】ニューメチレンブルーは、試薬組成物中に約１０μｇ／
ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの量で存在する、請求項９９に記載の装置。
【請求項１０１】（ｂ）の試薬組成物における表面活性剤は非イオン表面
活性剤および両性表面活性剤より成る群から選択される、請求項８９に記載の装
置。
【請求項１０２】前記表面活性剤はアルキルグリコシド非イオン表面活性
剤である、請求項１０１に記載の装置。
【請求項１０３】前記アルキルグリコシド非イオン表面活性剤は、ｎ−ド
デシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトシドおよびｎ
−テトラデシル−β−Ｄ−グルコシドより成る群から選択される、請求項１０２
に記載の装置。
【請求項１０４】（ｂ）の試薬組成物における表面活性剤は両性表面活性
剤である、請求項１０１に記載の装置。
【請求項１０５】（ｂ）の試薬組成物における両性表面活性剤はアルキル
アミドベタインまたはアルキルベタインである、請求項１０４に記載の装置。
【請求項１０６】前記両性表面活性剤は、ラウルアミドプロピルベタイン
（ＬＡＢ）、ココアミドプロピルベタイン（ＣＡＰＢ）およびココアミドスルホ
ベタイン（ＣＡＳＢ）より成る群から選択される、請求項１０５に記載の装置。
【請求項１０７】ラウルアミドプロピルベタイン（ＬＡＢ）は、前記試薬
組成物中に約１２μｇ／ｍｌから約８７．５μｇ／ｍｌの量で存在し、ココアミ
ドプロピルベタイン（ＣＡＰＢ）は、前記試薬組成物中に約８．８μｇ／ｍｌか
ら約１７．５μｇ／ｍｌの量で存在し、ココアミドスルホベタイン（ＣＡＳＢ）
は、前記試薬組成物中に約１２．５μｇ／ｍｌから約１５μｇ／ｍｌの量で存在
する、請求項１０６に記載の装置。
【請求項１０８】（ａ）の試薬組成物における表面活性剤は、Ｎ−テトラ
デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート（ＴＤ
ＡＰＳ）またはＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパ
ンスルホナート（ＤＤＡＰＳ）である、請求項８９に記載の装置。
【請求項１０９】Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ
−１−プロパンスルホナート（ＴＤＡＰＳ）は、前記試薬組成物中に約３．９μ
ｇ／ｍｌから約１１．８μｇ／ｍｌの量で存在し、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメ
チル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート（ＤＤＡＰＳ）は、前記試薬
組成物中に約４９．３μｇ／ｍｌから約１４８μｇ／ｍｌの量で存在する、請求
項１０８に記載の装置。
【請求項１１０】（ｂ）の試薬組成物はアルカリ金属塩をさらに含む、請
求項８９に記載の装置。
【請求項１１１】（ｂ）の試薬組成物における前記アルカリ金属塩は、塩
化ナトリウムまたは塩化カリウムである、請求項１１０に記載の装置。
【請求項１１２】（ｂ）の試薬組成物は、１つまたは複数の２−メチル−
４−イソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン
−３−オン、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス［Ｎ’−（１−（ヒドロキシメチル）−２
，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル）］尿素、（１−（３−クロロアリル）
−３，５，７−トリアザ−１−アゾニアアダマンタンクロリド）、およびブロノ
ポル２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール（Ｃ_３Ｈ_６ＢｒＮＯ_４）より成る群から選択される抗菌化合物をさらに含む、請求項８９に記載の装置
。
【請求項１１３】（ｂ）の前記試薬組成物は少なくとも１つの救核試薬を
さらに含む、請求項８９に記載の装置。
【請求項１１４】前記球核試薬はアジ化物イオン（Ｎ_３ ⁻）またはシアン
化物イオン（ＯＣＮ⁻）である、請求項１１３に記載の装置。
【請求項１１５】（ｂ）の試薬組成物の浸透圧は約２５０から３００ミリ
オスモルである、請求項８９に記載の装置。
【請求項１１６】前記分析される血液試料は、正常または異常な哺乳動物
の血液試料である、請求項８９に記載の装置。
【請求項１１７】決定された前記定性および定量パラメータは、赤血球数
、白血球数、血小板数、ヘモグロビン濃度、ヘマトクリット、平均細胞容積、平
均赤血球ヘモグロビン量、平均赤血球ヘモグロビン濃度、赤血球容積分布幅、赤
血球ヘモグロビン濃度分布幅、平均血小板容積、平均血小板成分濃度、平均血小
板乾燥質量、好中球の比率および絶対数、リンパ球プラス好塩基球の比率および
絶対数、単球の比率および絶対数、好酸球の比率および絶対数、網状赤血球の比
率および絶対数、網状赤血球平均赤血球容積、網状赤血球平均赤血球ヘモグロビ
ン量、網状赤血球平均赤血球ヘモグロビン濃度、網状血小板の比率および絶対数
、平均好中球容積、平均好中球成分濃度、平均好中球乾燥質量、平均リンパ球＋
好塩基球容積、平均リンパ球＋好塩基球成分濃度、平均リンパ球＋好塩基球乾燥
質量、平均単球容積、平均単球成分濃度、平均単球乾燥質量、平均好酸球容積、
平均好酸球成分濃度および平均好酸球乾燥質量より成る群から選択される、請求
項８９に記載の装置。
【請求項１１８】（ｂ）の血液試料は抗凝固処理される、請求項８９に記
載の装置。
【請求項１１９】（ｂ）の血液試料はＫ_３ＥＤＴＡで抗凝固処理される、
請求項１１８に記載の装置。
【請求項１２０】前記コンピュータは、互いに区別された血球および血小
板が占める領域を表示するサイトグラムを提供する、請求項８９に記載の装置。
【請求項１２１】（ｉ）サイトグラム上の低ゲイン、散乱−散乱空間にお
いて赤血球が占める領域に基づいて、赤血球と試料中の他の血球とを区別し、（
ｉｉ）サイトグラム上の低ゲイン、散乱−散乱空間においてリンパ球プラス好塩
基球および単球が占める領域に基づいて、リンパ球プラス好塩基球および単球と
試料中の他の血球とを区別し、（ｉｉｉ）高ゲイン、散乱−散乱サイトグラムに
おいて血小板が占める領域に基づいて、血小板および網状血小板と試料中の他の
血球とを区別し、（ｉｖ）低ゲイン、高角度吸収空間において成熟赤血球および
網状赤血球が占める位置から導かれる吸収周波数ヒストグラムの統計解析に基づ
いて、網状赤血球と試料中の他の血球とを区別し、（ｖ）散乱−散乱−吸収空間
内で好中球および好酸球が占める領域に基づいて、好中球および好酸球と試料中
の他の血球とを区別する、請求項１２０に記載の装置。
【請求項１２２】ゲート制御低ゲイン、散乱−散乱サイトグラム上で好中
球および好酸球が占める領域に基づいて、好中球と好酸球とをさらに区別する、
請求項１２１に記載の装置。
【請求項１２３】正常または異常な哺乳動物の血液試料における赤血球、
白血球および血小板を同定および測定するとともに、前記血液試料成分の定性お
よび定量パラメータを決定する単チャンネル単希釈法であって、（ａ）単希釈ステップにおいて血液試料のアリコートと水性試薬組成物とを混
合して反応混合物を形成し、前記試薬組成物は、試料中の血球を球状化するのに
有効な量の球状化剤としての表面活性剤と、網状赤血球ＲＮＡおよび白血球核酸
を染色するのに有効な量の色素化合物と、緩衝剤または緩衝液とを含み、赤血球
は実質的に前記反応混合物に不溶であること、（ｂ）ステップ（ａ）の反応混合物を単チャンネル内のフローセルに、実質的
に一細胞ずつ通過させ、各細胞により光が散乱して蛍光化し、前記散乱光を低角
度間隔で光学的に検出して低光散乱強度測定値を生成し、高角度間隔で光学的に
検出して高光散乱強度測定値を生成すること、（ｃ）単チャンネルにおいて、色素化合物の網状赤血球および白血球核酸、ま
たはその成分への結合によって生じる入射放射線によって生成する蛍光信号を検
出すること、および（ｄ）（ｂ）および（ｃ）の散乱および蛍光信号を用いて、散乱−散乱光学信
号、散乱−蛍光光学信号、または散乱−散乱−蛍光光学信号を検出することによ
って、試料の異なる血球および血小板成分を区別および測定することを含む方法
。
【請求項１２４】（ｂ）において、前記低および高散乱強度測定は第１お
よび第２の増幅を受け、前記第１の増幅は、網状赤血球を含む赤血球、および白
血球の信号を分析に適するものとし、前記第２の増幅は、血小板および網状血小
板の信号を分析に適するものとする、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】（ａ）の低角度間隔は約１度から１０度で、高角度間隔
は約４度から３０度である、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２６】（ａ）の低角度間隔は約１から７度で、高角度間隔は約
５から２５度である、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２７】前記区別するステップ（ｄ）において、（ｉ）散乱−散
乱パラメータに基づいて、血小板および網状血小板を他の血球から分離させ、（
ｉｉ）散乱−散乱パラメータに基づいて、赤血球を血小板から分離させ、（ｉｉ
ｉ）散乱−蛍光パラメータに基づいて、赤血球を網状赤血球から分離させ、（ｉ
ｖ）散乱−散乱パラメータに基づいて、赤血球をリンパ球、好塩基球および単球
から分離させ、（ｖ）散乱−散乱−蛍光パラメータに基づいて、赤血球を好中球
および好酸球から分離させ、（ｖｉ）散乱−散乱−パラメータに基づいて、リン
パ球および好塩基球を単球から分離させ、（ｖｉｉ）散乱−散乱パラメータに基
づいて好中球を好酸球から分離させるとともに、蛍光パラメータに基づいて赤血
球および網状赤血球信号をゲート制御する、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２８】ステップ（ａ）の緩衝剤または緩衝液混合物は試薬組成
物のｐＨを約６から約９に維持する、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２９】ステップ（ａ）の緩衝剤または緩衝液混合物は試薬組成
物のｐＨを約７．２から約７．５に維持する、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３０】前記緩衝剤または緩衝システムが等張性であることによ
り、血球に対して実質的に等容性球状化を施す、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３１】ステップ（ａ）の試薬組成物における色素化合物はカチ
オン色素化合物である、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３２】カチオン色素化合物はオキサジン７５０である、請求項
１２３に記載の方法。
【請求項１３３】オキサジン７５０は、試薬組成物中に約２μｇ／ｍｌか
ら約１５μｇ／ｍｌの量で存在する、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】ステップ（ａ）の試薬組成物におけるカチオン色素化合
物はニューメチレンブルーである、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１３５】ニューメチレンブルーは、試薬組成物中に約１０μｇ／
ｍｌから約１００μｇ／ｍｌの量で存在する、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】（ａ）の試薬組成物における表面活性剤は非イオン表面
活性剤および両性表面活性剤より成る群から選択される、請求項１２３に記載の
方法。
【請求項１３７】前記表面活性剤はアルキルグリコシド非イオン表面活性
剤である、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】前記非イオン表面活性剤は、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マ
ルトシド、ｎ−テトラデシル−β−Ｄ−マルトシドおよびｎ−テトラデシル−β
−Ｄ−グルコシドより成る群から選択される、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】（ａ）の試薬組成物における表面活性剤は両性表面活性
剤である、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１４０】ステップ（ａ）の試薬組成物における両性表面活性剤は
アルキルアミドベタインまたはアルキルベタインである、請求項１３９に記載の
方法。
【請求項１４１】前記両性表面活性剤は、ラウルアミドプロピルベタイン
（ＬＡＢ）、ココアミドプロピルベタイン（ＣＡＰＢ）およびココアミドスルホ
ベタイン（ＣＡＳＢ）より成る群から選択される、請求項１４０に記載の方法。
【請求項１４２】ラウルアミドプロピルベタイン（ＬＡＢ）は、前記試薬
組成物中に約１２μｇ／ｍｌから約８７．５μｇ／ｍｌの量で存在し、ココアミ
ドプロピルベタイン（ＣＡＰＢ）は、前記試薬組成物中に約８．８μｇ／ｍｌか
ら約１７．５μｇ／ｍｌの量で存在し、ココアミドスルホベタイン（ＣＡＳＢ）
は、前記試薬組成物中に約１２．５μｇ／ｍｌから約１５μｇ／ｍｌの量で存在
する、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】（ａ）の試薬組成物における表面活性剤は、Ｎ−テトラ
デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート（ＴＤ
ＡＰＳ）またはＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパ
ンスルホナート（ＤＤＡＰＳ）である、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１４４】Ｎ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ
−１−プロパンスルホナート（ＴＤＡＰＳ）は、前記試薬組成物中に約３．９μ
ｇ／ｍｌから約１１．８μｇ／ｍｌの量で存在し、Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメ
チル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート（ＤＤＡＰＳ）は、前記試薬
組成物中に約４９．３μｇ／ｍｌから約１４８μｇ／ｍｌの量で存在する、請求
項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】ステップ（ａ）の試薬組成物はアルカリ金属塩をさらに
含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１４６】ステップ（ａ）の試薬組成物は抗菌化合物をさらに含む
、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１４７】ステップ（ａ）の前記試薬組成物は少なくとも１つの救
核試薬をさらに含む、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１４８】前記救核試薬はアジ化物イオン（Ｎ_３ ⁻）またはシアン
化物イオン（ＯＣＮ⁻）であり、前記試薬組成物中に２０ｍＭの濃度で存在する
、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】（ａ）の試薬組成物の浸透圧は約２５０から３００ミリ
オスモルである、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１５０】ステップ（ａ）の試薬組成物の浸透圧は約２８７から２
９７ミリオスモルである、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１５１】前記分析される血液試料は、正常または異常な哺乳動物
の血液試料である、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１５２】前記定性および定量パラメータは、赤血球数、白血球数
、血小板数、ヘモグロビン濃度、ヘマトクリット、平均細胞容積、平均赤血球ヘ
モグロビン量、平均赤血球ヘモグロビン濃度、赤血球容積分布幅、赤血球ヘモグ
ロビン濃度分布幅、平均血小板容積、平均血小板成分濃度、平均血小板乾燥質量
、好中球の比率および絶対数、リンパ球プラス好塩基球の比率および絶対数、単
球の比率および絶対数、好酸球の比率および絶対数、網状赤血球の比率および絶
対数、網状赤血球平均赤血球容積、網状赤血球平均赤血球ヘモグロビン量、網状
赤血球平均赤血球ヘモグロビン濃度、網状血小板の比率および絶対数、平均好中
球容積、平均好中球成分濃度、平均好中球乾燥質量、平均リンパ球＋好塩基球容
積、平均リンパ球＋好塩基球成分濃度、平均リンパ球＋好塩基球乾燥質量、平均
単球容積、平均単球成分濃度、平均単球乾燥質量、平均好酸球容積、平均好酸球
成分濃度および平均好酸球乾燥質量より成る群から選択される、請求項１２３に
記載の方法。
【請求項１５３】単チャンネルを洗浄して残留細胞および反応混合物の蓄
積物を除去することにより、試薬の蓄積を防ぐステップをさらに含む、請求項１
２３に記載の方法。
【請求項１５４】血液試料を抗凝固処理する、請求項１２３に記載の方法
。
【請求項１５５】該方法において互いに区別された血球および血小板が占
める領域をサイトグラムが表示する、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１５６】（ｉ）サイトグラム上の低ゲイン、散乱−散乱空間にお
いて赤血球が占める領域に基づいて、赤血球と試料中の他の血球とを区別し、（
ｉｉ）サイトグラム上の低ゲイン、散乱−散乱空間においてリンパ球＋好塩基球
および単球が占める領域に基づいて、リンパ球＋好塩基球および単球と試料中の
他の血球とを区別し、（ｉｉｉ）高ゲイン、散乱−散乱サイトグラムにおいて血
小板が占める領域に基づいて、血小板および網状血小板と試料中の他の血球とを
区別し、（ｉｖ）低ゲイン、高角度蛍光空間において成熟赤血球および網状赤血
球が占める位置から導かれる蛍光周波数ヒストグラムの統計解析に基づいて、網
状赤血球と試料中の他の血球とを区別し、（ｖ）散乱−散乱−蛍光空間内で好中
球および好酸球が占める領域に基づいて、好中球および好酸球と試料中の他の血
球とを区別する、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】ゲート制御低ゲイン、散乱−散乱サイトグラム上で好中
球および好酸球が占める領域に基づいて好中球と好酸球とをさらに区別する、請
求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】ステップ（ｄ）において、入射光の波長と血球の屈折率
値の比率に基づいて白血球と赤血球とを分離する、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１５９】吸収が生じる入射光の波長は６２５ナノメータから６９
０ナノメータまでの狭帯域幅を有する、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】正常または異常な哺乳動物の血液試料における赤血球、
網状赤血球、白血球および血小板を同定および測定するとともに、前記血液試料
成分の定性および定量パラメータを決定する単チャンネル単希釈法を実施する装
置であって、（ａ）血液のアリコートを提供するためのアスピレータ機構と、（ｂ）（ｉ）単希釈ステップで血液試料のアリコートと水性試薬組成物とを混
合して反応混合物を形成し、前記試薬組成物は、網状赤血球ＲＮＡおよび白血球
核酸を染色するのに有効な量の色素化合物と、試料中の血球および網状赤血球を
球状化するのに有効な量の球状化剤としての表面活性剤と、緩衝剤または緩衝液
とを含み、赤血球は実質的に前記反応混合物に不溶であり、（ｉｉ）適切なポン
プを用いて、また当該ポンプが提供する適切なシーシング内で、前記血球を含む
（ｉ）の反応混合物を単光学チャンネル内のフローセルに実質的に一細胞ずつ通
過させ、各細胞により光が散乱して蛍光化し、前記散乱光を低角度間隔で検出し
て低光散乱強度測定値を生成し、高角度間隔で検出して高光散乱強度測定値を生
成する反応槽と、（ｃ）単チャンネルにおいて、色素化合物の網状赤血球および白血球核酸、ま
たはその成分への結合によって生じる入射放射線によって生成する蛍光信号を検
出するための光学検出器と、（ｄ）ステップ（ｂ）および（ｃ）の散乱および蛍光信号を使用し、計算し、
表示することにより、散乱−散乱空間パラメータ、散乱−蛍光空間パラメータ、
または散乱−散乱−蛍光空間パラメータを決定することによって、試料の異なる
血球および血小板成分を区別および測定するためのコンピュータとを含む装置。
【請求項１６１】（ｂ）（ｉｉ）において、前記低および高散乱強度測定
は第１および第２の増幅を受け、前記第１の増幅は、網状赤血球を含む赤血球、
および白血球の信号を分析に適するものとし、前記第２の増幅は、血小板および
網状血小板の信号を分析に適するものとする、請求項１６０に記載の装置。
【請求項１６２】（ｂ）の低角度間隔は約１度から１０度で、高角度間隔
は約４度から３０度である、請求項１６０に記載の装置。
【請求項１６３】（ｂ）の低角度間隔は約１から７度で、高角度間隔は約
５から２５度である、請求項１６０に記載の装置。
【請求項１６４】（ｄ）（ｉ）において、（ｉ）散乱−散乱パラメータに
基づいて、血小板および網状血小板を他の血球から分離させ、（ｉｉ）散乱−散
乱パラメータに基づいて、赤血球を血小板から分離させ、（ｉｉｉ）散乱−蛍光
パラメータに基づいて、赤血球を網状赤血球から分離させ、（ｉｖ）散乱−散乱
パラメータに基づいて、赤血球をリンパ球、好塩基球および単球から分離させ、
（ｖ）散乱−散乱−蛍光パラメータに基づいて、赤血球を好中球および好酸球か
ら分離させ、（ｖｉ）散乱−散乱パラメータに基づいて、リンパ球および好塩基
球を単球から分離させ、（ｖｉｉ）散乱−散乱パラメータに基づいて好中球を好
酸球から分離させるとともに、蛍光パラメータに基づいて赤血球および網状赤血
球信号をゲート制御する、請求項１６０に記載の装置。
【請求項１６５】（ｂ）の緩衝剤または緩衝液混合物は試薬組成物のｐＨ
を約６から約９に維持する、請求項１６０に記載の装置。
【請求項１６６】（ｂ）の緩衝剤または緩衝液混合物は試薬組成物のｐＨ
を約７．２から約７．５に維持する、請求項１６０に記載の装置。
【請求項１６７】前記緩衝剤または緩衝システムが等張性であることによ
り、血球に対して実質的に等容性球状化を施す、請求項８９または１６０に記載
の装置。
【請求項１６８】（ｂ）の試薬組成物における色素化合物はカチオン色素
化合物である、請求項１６０に記載の装置。
【請求項１６９】前記色素化合物はオキサジン７５０またはニューメチレ
ンブルーである、請求項１６８に記載の装置。
【請求項１７０】（ｂ）の試薬組成物における表面活性剤は非イオン表面
活性剤および両性表面活性剤より成る群から選択される、請求項１６０に記載の
装置。
【請求項１７１】前記非イオン表面活性剤はアルキルグリコシドである、
請求項１７０に記載の装置。
【請求項１７２】（ｂ）の試薬組成物における両性表面活性剤はアルキル
アミドベタインまたはアルキルベタインである、請求項１７０に記載の装置。
【請求項１７３】前記両性表面活性剤は、ラウルアミドプロピルベタイン
（ＬＡＢ）、ココアミドプロピルベタイン（ＣＡＰＢ）およびココアミドスルホ
ベタイン（ＣＡＳＢ）より成る群から選択される、請求項１７２に記載の装置。
【請求項１７４】（ａ）の試薬組成物における表面活性剤は、Ｎ−テトラ
デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート（ＴＤ
ＡＰＳ）またはＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパ
ンスルホナート（ＤＤＡＰＳ）である、請求１６０に記載の装置。
【請求項１７５】（ｂ）の試薬組成物は、塩化ナトリウムおよび塩化カリ
ウムより成る群から選択されるアルカリ金属塩をさらに含む、請求項１６０に記
載の装置。
【請求項１７６】（ｂ）の試薬組成物は、１つまたは複数の２−メチル−
４−イソチアゾリン−３−オン、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン
−３−オン、Ｎ，Ｎ’−メチレンビス［Ｎ’−（１−（ヒドロキシメチル）−２
，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニル）］尿素、（１−（３−クロロアリル）
−３，５，７−トリアザ−１−アゾニアアダマンタンクロリド）、およびブロノ
ポル２−ブロモ−２−ニトロプロパン−１，３−ジオール（Ｃ_３Ｈ_６ＢｒＮＯ_４）より成る群から選択される抗菌化合物をさらに含む、請求項１６０に記載の装
置。
【請求項１７７】（ｂ）の前記試薬組成物は少なくとも１つの救核試薬を
さらに含む、請求項１６０に記載の装置。
【請求項１７８】（ｂ）の試薬組成物の浸透圧は約２５０から３００ミリ
オスモルである、請求項１６０に記載の装置。
【請求項１７９】前記分析される血液試料は、正常または異常な哺乳動物
の血液試料である、請求項１６０に記載の装置。
【請求項１８０】決定された前記定性および定量パラメータは、赤血球数
、白血球数、血小板数、ヘモグロビン濃度、ヘマトクリット、平均細胞容積、平
均赤血球ヘモグロビン量、平均赤血球ヘモグロビン濃度、赤血球容積分布幅、赤
血球ヘモグロビン濃度分布幅、平均血小板容積、平均血小板成分濃度、平均血小
板乾燥質量、好中球の比率および絶対数、リンパ球プラス好塩基球の比率および
絶対数、単球の比率および絶対数、好酸球の比率および絶対数、網状赤血球の比
率および絶対数、網状赤血球平均赤血球容積、網状赤血球平均赤血球ヘモグロビ
ン量、網状赤血球平均赤血球ヘモグロビン濃度、網状血小板の比率および絶対数
、平均好中球容積、平均好中球成分濃度、平均好中球乾燥質量、平均リンパ球＋
好塩基球容積、平均リンパ球＋好塩基球成分濃度、平均リンパ球＋好塩基球乾燥
質量、平均単球容積、平均単球成分濃度、平均単球乾燥質量、平均好酸球容積、
平均好酸球成分濃度および平均好酸球乾燥質量より成る群から選択される、請求
項１６０に記載の装置。
【請求項１８１】前記コンピュータは、互いに区別された血球および血小
板が占める領域を表示するサイトグラムを提供する、請求項１６０に記載の装置
。
【請求項１８２】（ｉ）サイトグラム上の低ゲイン、散乱−散乱空間にお
いて赤血球が占める領域に基づいて、赤血球と試料中の他の血球とを区別し、（
ｉｉ）サイトグラム上の低ゲイン、散乱−散乱空間においてリンパ球プラス好塩
基球および単球が占める領域に基づいて、リンパ球プラス好塩基球および単球と
試料中の他の血球とを区別し、（ｉｉｉ）高ゲイン、散乱−散乱サイトグラムに
おいて血小板が占める領域に基づいて、血小板および網状血小板と試料中の他の
血球とを区別し、（ｉｖ）低ゲイン、高角度蛍光空間において成熟赤血球および
網状赤血球が占める位置から導かれる蛍光周波数ヒストグラムの統計解析に基づ
いて、網状赤血球と試料中の他の血球とを区別し、（ｖ）散乱−散乱−蛍光空間
内で好中球および好酸球が占める領域に基づいて、好中球および好酸球と他の血
球とを区別する、請求項１８１に記載の装置。
【請求項１８３】ゲート制御低ゲイン、散乱−散乱サイトグラム上で好中
球および好酸球が占める領域に基づいて、好中球と好酸球とをさらに区別する、
請求項１８２に記載の装置。