JP3467310B2 - 白血球分析用試薬及び白血球の分類方法 - Google Patents

白血球分析用試薬及び白血球の分類方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、白血球分析用試薬及び
白血球の分類方法に関し、より詳細には、臨床検査分野
における、白血球分類計数用試薬及び白血球を分類計数
する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】臨床検査分野において、患者の全血を用
いて白血球を分類計数することは、各種の疾患を診断す
る上で重要である。白血球のうち好塩基球は、正常検体
では、白血球全体の０．５〜２．０％程度の比率を占め
るだけである。そのため、白血球を分類計数する場合に
は、好塩基球以外の白血球を溶解あるいは裸核化し、好
塩基球のみを特異的に残し、細胞の電気インピーダンス
信号及び散乱光信号を測定し、その信号強度の差を求め
ることによって、好塩基球と他の白血球とを弁別する。
【０００３】これらの方法としては、特開平３−２０６
６７号、特開平４−２３０８５４号、特開昭６１−８８
８９６号が知られている。特開平３−２０６６７号は、
ポリオキシエチレンの付加重合モル数が１２〜３０のノ
ニオン性界面活性剤とカチオン性界面活性剤からなるｐ
Ｈ３．０〜４．０の水溶液を用い、細胞の電気インピー
ダンス信号を測定する（ＤＣ法）ものである。
【０００４】また、特開平４−２３０８５４号は、ポリ
オキシエチレン系ノニオン界面活性剤、ＳＤＳ，フタル
酸−塩酸、抗酸化剤を含むｐＨ２．５〜３．２の水溶液
を用い、細胞の電気インピーダンス信号を測定するもの
である。さらに、特開昭６１−８８８９６号は、希薄酸
と水溶性界面活性剤からなるｐＨ１．８〜２．３の水溶
液を用い、細胞の低角散乱光と広角散乱光を測定するこ
とにより、好塩基球を計数するものである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】特開平３−２０６６７
号では、好塩基球と幼若顆粒球以外の白血球を裸核化す
ることにより、好塩基球を分類計数することができ、さ
らに幼若顆粒球の出現をＤＣ法によって検知することが
できる。しかしながら、幼若顆粒球と、好塩基球とがオ
ーバーラップし、各々を個別に分類計数することはでき
ず、その他の白血球を細分類することもできない。ま
た、この試薬をフローサイトメータに適用し、細胞の低
角散乱光と広角散乱光とを測定しても同様であり、図１
２及び図１３に示したように、幼若顆粒球、好塩基球の
各々を分類計数することはできない。
【０００６】また、特開平４−２３０８５４号では、好
塩基球のみの分類計数ができることを開示しているのみ
であり、他の白血球の計数、あるいは、骨髄芽球、幼若
顆粒球の分類計数については、何ら示唆していない。さ
らに、特開昭６１−８８８９６号では、好塩基球以外の
白血球を裸核化することにより、好塩基球、単核球（リ
ンパ球、単球）、ＰＭＮ（好中球及び好酸球）を分類計
数することに加え、核の形態的情報（広角散乱光強度）
とペルオキシダーゼチャネルのデータとを比較検討する
ことにより、芽球、幼若顆粒球、レフトシフトの出現を
検知することができる。しかし、この方法では、幼若顆
粒球は単核球の分画に含まれるため、幼若顆粒球の検出
は、ペルオキシダーゼチャネルの単核細胞数との差によ
って行っており、単独のチャネルで幼若顆粒球を検出す
ることができない。
【０００７】本発明は、単独のチャネルで、好塩基球の
分類計数を行うと同時に、幼若顆粒球、単核球（リンパ
球、単球）、好塩基球以外の顆粒球（好中球及び好酸
球）を分類計数することができる試薬及び方法を提供す
ることを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明によれば、（１）
ポリオキシエチレンの付加重合モル数が３〜９の少なく
とも１種のノニオン性界面活性剤と、（２）少なくとも
１種のカチオン性界面活性剤と、（３）ｐＨを２．５〜
４．０にするための緩衝剤とからなる白血球分析用試薬
が提供される。
【０００９】また、本発明の白血球分析用試薬を、血液
試料と混合することにより、赤血球は後の測定の障害と
ならない程度に溶血され、一方、白血球は、好塩基球以
外の顆粒球が裸核化される。次いで、細胞の大きさ情報
と形態学的情報（核の形態、顆粒等の細胞内物質の状態
に関する情報）を測定することにより、白血球を、好塩
基球、幼若顆粒球、単核球（リンパ球、単球）、好塩基
球以外の顆粒球（好中球及び好酸球）に分類計数するこ
とができる。
【００１０】本発明においては、ポリオキシエチレンの
付加重合モル数が３〜１０の少なくとも１種のノニオン
性界面活性剤を含有する。本発明で使用できるノニオン
性界面活性剤としては、以下の構造式で表されるものを
用いることができる。 Ｒ1 −Ｒ2 −（ＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ）n −Ｈ [式中、Ｒ1 は炭素数８〜１８のアルキル基又はアルケ
ニル基、Ｒ2 は−Ｏ−又は−（Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｏ−、ｎは
ポリオキシエチレンの平均付加重合モル数で３〜１０の
実数] 。
【００１１】上記式において、炭素数８〜１８のアルキ
ル基又はアルケニル基としては、例えば、オクチル、ノ
ニル、デシル、ウンデシル、ラウリル（ドデシル）、ト
リデシル、ミリスチル（テトラデシル）、ペンタデシ
ル、セチル（ヘキサデシル）、ヘプタデシル、ステアリ
ル（オクタデシル）等を挙げることができる。中でも、
ドデシルが好ましい。
【００１２】ノニオン性界面活性剤の具体的な例として
は、ポリオキシエチレン（４．２）ドデシルエーテル
（ＢＬ４．２、日光ケミカルズ（株））、ポリオキシエ
チレン（９）ドデシルエーテル（ＢＬ９、日光ケミカル
ズ（株））、ポリオキシエチレン（５）ドデシルエーテ
ル（日光ケミカルズ（株））、ポリオキシエチレン
（５．５）セチルエーテル（日光ケミカルズ（株））、
ポリオキシエチレン（７）セチルエーテル（日光ケミカ
ルズ（株））、ポリオキシエチレン（７）オレイルエー
テル（日光ケミカルズ（株））等を挙げることができ
る。
【００１３】ノニオン性界面活性剤は、３００〜２００
００ｍｇ／ｌの濃度で使用でき、より好ましくは５００
〜１００００ｍｇ／ｌである。具体的には、ポリオキシ
エチレン（３〜１０）ドデシルエーテルを５００〜８０
００ｍｇ／ｌで使用することが好ましい。濃度が低すぎ
る場合、好塩基球以外の顆粒球を完全に裸核化できず、
濃度が高すぎる場合は、カチオン性界面活性剤による好
塩基球以外の顆粒球の裸核化を阻害する。上記以外のノ
ニオン性界面活性剤では、例えば、ポリオキシエチレン
の付加重合モル数が大きすぎる場合、図１３に示すよう
に、好塩基球以外の顆粒球を完全に裸核化できない。ま
た、ポリオキシエチレンの付加重合モル数が小さすぎる
場合、水に溶解しにくくなり使用が困難になる。
【００１４】本発明の白血球分析用試薬におけるカチオ
ン性界面活性剤としては、以下の構造を有する四級アン
モニウム塩とピリジニウム塩型界面活性剤とからなる群
から選ばれるカチオン性界面活性剤の少なくとも１種を
含有する。
【００１５】
【化２】
【００１６】[式中Ｒ1 は炭素数１０〜１８のアルキル
基又はアルケニル基、Ｒ2 、Ｒ3 又はＲ4 は炭素数１〜
３のアルキル基又はアルケニル基、Ｘはハロゲン] 又は Ｒ1 −Ｎ+ Ｃ5 Ｈ5 Ｘ- [式中Ｒ1 、Ｘは上記と同意味] 上記式において、炭素数１０〜１８のアルキル基又はア
ルケニル基としては、例えば、デシル、ウンデシル、ラ
ウリル（ドデシル）、トリデシル、ミリスチル（テトラ
デシル）、ペンタデシル、セチル（ヘキサデシル）、ヘ
プタデシル、ステアリル（オクタデシル）等を挙げるこ
とができる。中でも、デシル、ラウリル、ミリスチル、
セチル又はステアリル等が好ましい。
【００１７】また、炭素数１〜３のアルキル基又はアル
ケニル基としては、メチル、エチル、プロピル、エチニ
ル、プロピニル等が挙げられる。カチオンの具体例とし
ては、デシルトリメチルアンモニウム、ラウリルトリメ
チルアンモニウム、ミリスチルトリメチルアンモニウ
ム、セチルトリメチルアンモニウム、セチルジメチルエ
チルアンモニウム、ラウリルジメチルエチルアンモニウ
ム、ミリスチルジメチルエチルアンモニウム、ラウリル
ピリジニウム、セチルピリジニウム等が挙げられる。
【００１８】さらに、ハロゲンとしては、フッ素、塩
素、臭素、ヨウ素等が挙げられる。上記のカチオン性界
面活性剤は、赤血球、血小板をほぼ完全に溶解し、少な
くとも好塩基球以外の顆粒球をほぼ裸核化させるのに充
分な濃度で使用される。この濃度は、例えば、通常の光
学顕微鏡で裸核化の状態を観察することによって、好適
な濃度が簡単に決定される。具体的には、約１００ｍｇ
／ｌ〜１００００ｍｇ／ｌ、より好ましくは３００ｍｇ
／ｌ〜５０００ｍｇ／ｌの濃度であるが、カチオン性界
面活性剤の種類により、適宜調製することができる。少
なすぎると、赤血球、血小板を完全に溶解できず、ま
た、過剰量のカチオン性界面活性剤の存在は、単核球の
裸核化をも促進するため好ましくない。
【００１９】各カチオン性界面活性剤種類及びその好適
な量を表１に示す。なお、これらの界面活性剤は１種又
はそれ以上を組み合わせて使用することもできる。
【００２０】
【表１】
【００２１】カチオン性界面活性剤の種類は特に限定さ
れるものではないが、前述の構造式で示されるカチオン
性界面活性剤が好適である。カチオン性界面活性剤の溶
血力は、その主鎖の長さに依存している。主鎖の長いも
のは、溶血力が強く、従って少量で効果が得られる。本
発明の白血球分析用試薬のpHは、緩衝剤によって２．５
〜４．０、好ましくは３．０〜４．０の範囲に保たれ
る。pHが2.5 未満の場合、幼若顆粒球、単核球が裸核化
しやすくなり、各白血球を弁別することが困難になる。
pHが4.0 を越える場合は、白血球を収縮、裸核化させる
ことが困難になり、かつ、赤血球、血小板の収縮、溶解
が困難になる。
【００２２】本試薬で用いられる緩衝剤は特に限定され
ず、pKa が２．０〜５．０の範囲にある緩衝剤が好適に
使用できる。例えば、クエン酸、リンゴ酸、ジグリコー
ル酸、コハク酸、ギ酸、酒石酸などが好適に使用でき
る。緩衝剤の濃度は特に限定されず、pHを所定のpH範囲
に調整できる濃度が使用できる。通常５〜５０ｍＭが好
適に使用される。
【００２３】本発明の試薬においては、上記に示したノ
ニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤及び緩衝剤
を適宜選択し、所望の割合で混合することにより調製す
ることができる。中でも、DTAB，ＢＬ４．２及びクエン
酸を組み合わせた試薬、LTAC，ＢＬ４．２及びクエン酸
を組み合わせた試薬、MTAB，ＢＬ４．２及びクエン酸を
組み合わせた試薬、CTAC，ＢＬ４．２及びクエン酸を組
み合わせた試薬、STAC，ＢＬ４．２及びクエン酸を組み
合わせた試薬、CDMEB,ＢＬ４．２及びクエン酸を組み合
わせた試薬、CPyC，ＢＬ４．２及びクエン酸を組み合わ
せた試薬、DTAB，ＢＬ９及びクエン酸を組み合わせた試
薬、LTAC，ＢＬ９及びクエン酸を組み合わせた試薬、MT
AB，ＢＬ９及びクエン酸を組み合わせた試薬、CTAC，Ｂ
Ｌ９及びクエン酸を組み合わせた試薬、STAC，ＢＬ９及
びクエン酸を組み合わせた試薬、CDMEB,ＢＬ９及びクエ
ン酸を組み合わせた試薬、CPyC，ＢＬ９及びクエン酸を
組み合わせた試薬、DTAB，ＢＬ４．２及びコハク酸を組
み合わせた試薬、LTAC，ＢＬ４．２及びコハク酸を組み
合わせた試薬、MTAB，ＢＬ４．２及びコハク酸を組み合
わせた試薬、CTAC，ＢＬ４．２及びコハク酸を組み合わ
せた試薬、STAC，ＢＬ４．２及びコハク酸を組み合わせ
た試薬、CDMEB,ＢＬ４．２及びコハク酸を組み合わせた
試薬、CPyC，ＢＬ４．２及びコハク酸を組み合わせた試
薬、DTAB，ＢＬ９及びコハク酸を組み合わせた試薬、LT
AC，ＢＬ９及びコハク酸を組み合わせた試薬、MTAB，Ｂ
Ｌ９及びコハク酸を組み合わせた試薬、CTAC，ＢＬ９及
びコハク酸を組み合わせた試薬、STAC，ＢＬ９及びコハ
ク酸を組み合わせた試薬、CDMEB,ＢＬ９及びコハク酸を
組み合わせた試薬、CPyC，ＢＬ９及びコハク酸を組み合
わせた試薬等が好ましい。
【００２４】本発明の試薬においては、さらに金属塩を
加えてもよい。通常、金属塩は必要ないが、電気インピ
ーダンス信号を検出することによって測定を行う装置を
用い、試料の電気伝導度が低い場合に測定を行うために
好適な値に調整するために必要となるからである。使用
することができる金属塩としては、特に限定されるもの
ではなく、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩
化リチウムなどのアルカリ金属塩が好適である。この際
の使用量は、溶液の電気伝導度が３〜２０ｍＳ／ｃｍの
範囲にする量が好ましい。
【００２５】また、本発明の試薬を用いて白血球を分類
するには、本発明の試薬と血液試料とを混合するだけの
簡単な操作で測定試料を調製することができる。試薬と
血液試料との混合は、試薬を構成する成分と血液試料と
がほぼ同時に接触することが好ましいが、試薬の構成成
分の種類又は濃度等により、順次血液試料と混合しても
よい。血液試料と本発明の試薬との混合比は特に限定さ
れないが、１：２〜１：１００程度の比率で混合するこ
とが好適である。
【００２６】反応はほぼ瞬時に進行し、混合後約１０秒
から少なくとも１２０秒程度まで安定して測定すること
ができる。反応温度は、１０〜４０℃程度までは特に問
題なく測定することができる。反応温度が高い場合は、
幾分短い時間で、低い場合は、幾分長い時間で反応を行
うことが必要である。本発明の白血球分類計数方法で
は、大きさ情報（細胞の体積）を測定するために電気イ
ンピーダンス信号あるいは前方低角散乱光信号のうち、
少なくとも１つを測定し、形態学的情報（細胞内物質の
情報）を測定するために前方広角散乱光信号あるいは側
方散乱光信号のうち、少なくとも１つを測定する。
【００２７】例えば、図１４に示すような構造を持つフ
ローサイトメータで前方低角散乱光信号と前方広角散乱
光信号とを測定する組合せが最も安価に測定装置を提供
できる。図１４の装置は、簡単な２角度前方散乱光検出
部を備えている。フローセルＣＥＬＬの前方に、コンデ
ンサレンズＬ２及びコリメータレンズＬ１を介して、半
導体レーザＬＤが配設されている。また、フローセルＣ
ＥＬＬの後方にはビームストッパＢＳが併設されたコレ
クタレンズＬ３を介してフォトダイオードＰＤが配設さ
れている。フォトダイオードＰＤのセンサー部の中心部
には、前方低角散乱光検出センサーＬＦが、その上部に
は、前方広角散乱光検出センサーＨＦがある。このよう
な装置により、散乱する前方方向の散乱光のうち、低角
度（１〜５°）と広角度（６〜２０°）の二つの散乱光
強度を測定し、散乱光強度の差を求めることによって、
白血球を分類計数することができる。
【００２８】本発明で使用する装置は、この装置に限ら
れるわけではなく、大きさ情報、つまり体積を測定する
ために電気インピーダンス信号を検出してもよく、形態
学的情報を測定するために側方散乱光を測定してもよ
い。
【００２９】
【作用】本発明の白血球分析用試薬によれば、白血球
が、好塩基球、幼若顆粒球、単核球（リンパ球、単
球）、好塩基球以外の顆粒球（好中球及び好酸球）に分
類計数される。つまり、本発明の試薬を血液試料と混合
することにより、赤血球、血小板はほとんど瞬時に溶解
される。一方、白血球のうち好塩基球以外の顆粒球は、
裸核化され、好塩基球はほとんど変化せずに残る。単核
球（リンパ球、単球）は幾分収縮する。幼若顆粒球はほ
とんど収縮、裸核化せずに残る。この結果、細胞の大き
さは、幼若顆粒球＞好塩基球＞単核球＞好塩基球以外の
顆粒球の順に小さくなる。また、形態学的には、単核球
は丸い核と細胞膜とがあるのみで、最も複雑さが少な
く、好塩基球以外の顆粒球は核が分節又は棒状で、好塩
基球はさらに好塩基性顆粒を有し、幼若顆粒球は幼若顆
粒を有するために複雑な形態を有する。従って、本発明
の試薬で処理された白血球は、上記した大きさの情報と
形態学的情報とを測定することにより好塩基球、幼若顆
粒球、単核球（リンパ球、単球）、好塩基球以外の顆粒
球（好中球及び好酸球）に分類計数されることとなる。
【００３０】また、本発明の白血球の分類方法によれ
ば、白血球分析用試薬と血液試料とを混合した後、フロ
ーサイトメータを用いて上記の細胞の大きさ情報と形態
学的情報との少なくとも２つの情報を測定することによ
り、好適に白血球が分類計数される。本発明の試薬のよ
うに、カチオン性界面活性剤とノニオン性界面活性剤と
を組み合わせて使用し、緩衝剤を用いてｐＨを２．５〜
４．０の範囲に設定することにより、好塩基球以外の顆
粒球のみが選択的に裸核化される。
【００３１】また、本発明の試薬のように、カチオン性
界面活性剤を好適な濃度で使用した場合には、細胞溶解
作用の他に、カチオン性界面活性剤の陽荷電が白血球細
胞のアニオン性物質（例えば、RNA 、好塩基性顆粒等）
の荷電を中和することにより、アニオン性物質を不溶化
する。この結果、比較的RNA を多く含むリンパ球及び単
球、多量のRNA と好塩基性の顆粒とを含む幼若顆粒球、
及び好塩基性の顆粒を含む好塩基球が収縮しにくくな
り、細胞の大きさに差異を与える。
【００３２】界面活性剤には、従来よりよく知られてい
るように、赤血球、血小板を溶解させ、白血球を裸核化
させる作用があるが、カチオン性界面活性剤又はノニオ
ン性界面活性剤を単独で白血球に作用させた場合には、
図５及び図８に示すように、選択的な裸核化を行うこと
はできない。例えば、カチオン性界面活性剤を単独で使
用した場合、表１に示す好適な濃度では、リンパ球、単
球は収縮しにくくなる。幼若顆粒球は、単核球（リンパ
球、単球）よりもさらに収縮しにくい。しかし、好塩基
球以外の顆粒球は、細胞質の一部が残存し完全に裸核化
せず、図８に示すように、単核球と好塩基球以外の顆粒
球を分画することはできない。
【００３３】ポリオキシエチレンを親水基に持つノニオ
ン性界面活性剤は、一般に、付加重合モル数が小さくな
ると細胞溶解作用が強くなることが知られている。本発
明の試薬において、ノニオン性界面活性剤の作用機序は
明確ではないが、カチオン性界面活性剤と同時に使用す
ることにより、カチオン性界面活性剤で除去しきれなか
った好塩基球以外の顆粒球の細胞質を完全に溶解、裸核
化し、さらに収縮させる作用と、RNA を多く含む細胞の
収縮を抑制する作用との相反する２つの作用によって、
好適な細胞の大きさ情報と形態的情報とを与える。
【００３４】
【実施例】本発明の白血球分析用試薬の好適な組成を以
下に示す。 実施例１〜４ カチオン性界面活性剤 １０００〜２０００ｍｇ／ｌ ＢＬ９（ノニオン性界面活性剤 ポリオキシエチレン(9)ドデシルエーテル、 日光ケミカルズ（株） ) ４０００ｍｇ／ｌ クエン酸 ２．１ｇ／ｌ ＮａＯＨ ｐＨ３．３になる量 カチオン性界面活性剤として、種々の界面活性剤を種々
の濃度で用いた場合の上記組成の試薬１ｍｌと健常人血
液３０μｌとを混合し、１０秒後にフローサイトメータ
で前方低角散乱光強度と前方広角散乱光強度とを測定す
る。図１〜図４にカチオン性界面活性剤として、LTAC 2
000mg/l （実施例１）、MTAB 2000mg/l（実施例２）、C
TAC 1000mg/l(実施例３）、CDMEB 1000mg/l（実施例
４）を使用した場合のスキャッタグラムを示す。いずれ
の場合でも、白血球を単核球、好塩基球以外の顆粒球、
好塩基球に分類計数できる。 比較例１ 比較例として、カチオン性界面活性剤を添加しない以外
は上記実施例と同様の試薬を用いた場合のスキャッタグ
ラムを図５に示す。この場合、好塩基球以外の顆粒球が
収縮しないために分画できない。 実施例５，６ ＣＴＡＣ １０００ｍｇ／ｌ ノニオン性界面活性剤 ４０００ｍｇ／ｌ クエン酸 ２．１ｇ／ｌ ＮａＯＨ ｐＨ３．３になる量 ノニオン性界面活性剤として、種々の界面活性剤を種々
の濃度で用いた場合の上記組成の試薬１ｍｌと健常人血
液３０μｌとを混合し、１０秒後にフローサイトメータ
で前方低角散乱光強度と前方広角散乱光強度とを測定す
る。図６及び図７にノニオン性界面活性剤として、BL4.
2(ポリオキシエチレン(4.2)ドデシルエーテル) （実施
例５）、BL9(ポリオキシエチレン(9)ドデシルエーテル)
（実施例６）を使用した場合のスキャッタグラムを示
す。いずれの場合でも、白血球を単核球、好塩基球以外
の顆粒球、好塩基球に分類計数できる。 比較例２ 比較例として、ノニオン性界面活性剤を添加しない以外
は上記実施例と同様の試薬を用いた場合のスキャッタグ
ラムを図８に示す。この場合、好塩基球以外の顆粒球
は、細胞質の一部が残存し完全に裸核化せず、単核球と
好塩基球以外の顆粒球を分画することはできない。 実施例７〜９ ＭＴＡＢ １０００ｍｇ／ｌ ＢＬ９ ４０００ｍｇ／ｌ クエン酸 ２．１ｇ／ｌ ＮａＯＨ ｐＨ３．３になる量 上記組成の試薬１ｍｌと健常人血（実施例７）、幼若顆
粒球の出現した患者血液（実施例８）、骨髄芽球及び幼
若顆粒球の出現した検体（実施例９）３０μｌとをそれ
ぞれ混合し、１０秒後にフローサイトメータで前方低角
散乱光強度と前方広角散乱光強度とを測定する。測定結
果を図９〜図１１に示す。
【００３５】幼若顆粒球は、ＩＧエリアに、芽球はＢｌ
ａｓｔエリアに出現し、分類計数することができる。 比較例３ 従来技術例（特開平３−２０６６７号）として以下に示
す組成の試薬を調製した。
【００３６】 ＣＤＭＥＢ ６００ｍｇ／ｌ ＢＯ−２０（ポリオキシエチレン(20) オレイルエーテル， 日光ケミカルズ （株）) ２５．０ｇ／ｌ 蟻酸ナトリウム １．６ｇ／ｌ 塩酸 １．８ｇ／ｌ 塩化ナトリウム ０．４ｇ／ｌ 上記組成の試薬１ｍｌと幼若顆粒球の出現した検体３０
μｌとをそれぞれ混合し、１０秒後にフローサイトメー
タで前方低角散乱光強度と前方広角散乱光強度とを測定
する。測定結果を図１３に示す。図１３に示したよう
に、幼若顆粒球、好塩基球を各々分類計数できない。
【００３７】一方、同じ検体を本願の実施例７〜９の試
薬を用いて測定した結果を図１２に示す。図１２に示し
たように、幼若顆粒球、好塩基球の各々が分類できる。
【００３８】
【効果】本発明の白血球分析用試薬及び方法によれば、
本質的に１つの水溶液からなる試薬と血液試料とを混合
するだけの簡単な操作で、測定用試料を調製することが
でき、２つの散乱光信号あるいは散乱光信号とＤＣ法に
よる体積を測定するだけで、白血球を分類計数すること
ができる。特に、従来単独のチャンネルで分類計数ので
きなかった幼若顆粒球をはじめ、好塩基球、単核球、好
塩基球以外の顆粒球も同時に分類計数することができ
る。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係る白血球分析用試薬において、カチ
オン性界面活性剤としてラウリルトリメチルアンモニウ
ムクロライドを用いた場合の前方低角散乱光強度と前方
広角散乱光強度とを示すスキャッタグラムである。
【図２】本発明に係る白血球分析用試薬において、カチ
オン性界面活性剤としてミリスチルトリメチルアンモニ
ウムブロマイドを用いた場合の前方低角散乱光強度と前
方広角散乱光強度とを示すスキャッタグラムである。
【図３】本発明に係る白血球分析用試薬において、カチ
オン性界面活性剤としてセチルトリメチルアンモニウム
クロライドを用いた場合の前方低角散乱光強度と前方広
角散乱光強度とを示すスキャッタグラムである。
【図４】本発明に係る白血球分析用試薬において、カチ
オン性界面活性剤としてセチルジメチルエチルアンモニ
ウムブロマイドを用いた場合の前方低角散乱光強度と前
方広角散乱光強度とを示すスキャッタグラムである。
【図５】本発明に係る白血球分析用試薬において、ノニ
オン性界面活性剤だけを用いた場合の前方低角散乱光強
度と前方広角散乱光強度とを示すスキャッタグラムであ
る。
【図６】本発明に係る白血球分析用試薬において、ノニ
オン性界面活性剤としてＢＬ４．２を用いた場合の前方
低角散乱光強度と前方広角散乱光強度とを示すスキャッ
タグラムである。
【図７】本発明に係る白血球分析用試薬において、ノニ
オン性界面活性剤としてＢＬ９を用いた場合の前方低角
散乱光強度と前方広角散乱光強度とを示すスキャッタグ
ラムである。
【図８】本発明に係る白血球分析用試薬において、カチ
オン性界面活性剤だけを用いた場合の前方低角散乱光強
度と前方広角散乱光強度とを示すスキャッタグラムであ
る。
【図９】本発明に係る白血球分析用試薬において、健常
人の検体を測定した場合の前方低角散乱光強度と前方広
角散乱光強度とを示すスキャッタグラムである。
【図１０】本発明に係る白血球分析用試薬において、幼
若顆粒球が出現した検体を測定した場合の前方低角散乱
光強度と前方広角散乱光強度とを示すスキャッタグラム
である。
【図１１】本発明に係る白血球分析用試薬において、幼
若顆粒球と骨髄芽球が出現した検体を測定した場合の前
方低角散乱光強度と前方広角散乱光強度とを示すスキャ
ッタグラムである。
【図１２】幼若顆粒球が出現した検体を、本発明に係る
白血球分析用試薬を用いて測定した場合の前方低角散乱
光強度と前方広角散乱光強度とを示すスキャッタグラム
である。
【図１３】幼若顆粒球が出現した検体を、従来例として
特開平３−２０６６７号の試薬を用いて測定した場合の
前方低角散乱光強度と前方広角散乱光強度とを示すスキ
ャッタグラムである。
【図１４】本発明に係る白血球分析用試薬で処理した試
料を測定するための装置の概略図である。
【符号の説明】
ＬＭ 単核球 ＧＲＡ 好塩基球以外の顆粒球 Ｂａｓｏ 好塩基球 ＩＧ 幼若顆粒球 ｏｔｈｅｒ 好塩基球以外の白血球 ｂｌａｓｔ 骨髄芽球 ＣＥＬＬ フローセル Ｌ１ コリメータレンズ Ｌ２ コンデンサレンズ Ｌ３ コレクタレンズ ＢＳ ビームストッパ ＰＤ フォトダイオード ＬＤ 半導体レーザ ＬＦ 前方低角散乱光検出センサー ＨＦ 前方広角散乱光検出センサー
フロントページの続き (72)発明者 甲月 千尋 神戸市中央区港島中町７丁目２番１号 東亜医用電子株式会社内 (72)発明者 兵佐 義浩 神戸市中央区港島中町７丁目２番１号 東亜医用電子株式会社内 (56)参考文献 特開 平３−137566（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−88896（ＪＰ，Ａ) 特表 平５−501613（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/48 G01N 33/49

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （１）ポリオキシエチレンの付加重合モ
    ル数が３〜９の少なくとも１つのノニオン性界面活性
    剤、 （２）少なくとも１つのカチオン性界面活性剤、 （３）ｐＨを２．５〜４．０にするための緩衝剤からな
    ることを特徴とする白血球分析用試薬。
  2. 【請求項２】 さらに、アルカリ金属塩を含有する請求
    項１記載の白血球分析用試薬。
  3. 【請求項３】 ノニオン性界面活性剤が、以下の式 Ｒ1 −Ｒ2 −（ＣＨ2 ＣＨ2 Ｏ）n −Ｈ [式中、Ｒ1 は炭素数８〜１８のアルキル基又はアルケ
    ニル基、Ｒ2 は−Ｏ−又は−（Ｃ6 Ｈ4 ）−Ｏ−、ｎは
    ３〜９の実数]で表される少なくとも1 つである請求項
    １又は２記載の白血球分析用試薬。
  4. 【請求項４】 ノニオン性界面活性剤が、ポリオキシエ
    チレン（４．２）ドデシルエーテル、ポリオキシエチレ
    ン（９）ドデシルエーテル、ポリオキシエチレン（５）
    ドデシルエーテル、ポリオキシエチレン（５．５）セチ
    ルエーテル、ポリオキシエチレン（７）セチルエーテ
    ル、ポリオキシエチレン（７）オレイルエーテルのいず
    れかである請求項３に記載の白血球分析用試薬。
  5. 【請求項５】 カチオン性界面活性剤が、以下の式 【化１】 [式中Ｒ1 は炭素数１０〜１８のアルキル基又はアルケ
    ニル基、Ｒ2 、Ｒ3 又はＲ4 は炭素数１〜３のアルキル
    基又はアルケニル基、Ｘはハロゲン] 又は Ｒ1 −Ｎ+ Ｃ5 Ｈ5 Ｘ- [式中、Ｒ1 及びＸは上記と同意味]で表される少なくと
    も１つである請求項１〜３のいずれか１つに記載の白血
    球分析用試薬。
  6. 【請求項６】 カチオン性界面活性剤が、デシルトリメ
    チルアンモニウムブロマイド、ラウリルトリメチルアン
    モニウムブロマイド、ミリスチルトリメチルアンモニウ
    ムブロマイド、セチルトリメチルアンモニウムブロマイ
    ド、ステアリルトリメチルアンモニウムブロマイド、セ
    チルジメチルエチルアンモニウムブロマイド、セチルピ
    リジニウムクロライドのいずれかである請求項５に記載
    の白血球分析用試薬。
  7. 【請求項７】 ノニオン性界面活性剤が３００〜２００
    ００ｍｇ／ｌ、カチオン性界面活性剤が１００〜１００
    ００ｍｇ／ｌの濃度で使用される請求項１〜６のいずれ
    か１つに記載の白血球分析用試薬。
  8. 【請求項８】 (i) 請求項１〜７のいずれか１つに記載
    の試薬と血液試料とを混合し、 (ii)前記血液試料中の細胞の大きさ情報と形態的情報と
    のうちの少なくとも２つの情報を測定して白血球を分類
    計数することからなる白血球の分類方法。
  9. 【請求項９】 大きさ情報の測定が、フローサイトメー
    タで、前方低角散乱光を測定する工程か又は電気インピ
    ーダンス信号を検出することにより細胞体積を測定する
    工程かの少なくとも一方である請求項８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 形態的情報の測定が、フローサイトメ
    ータで、細胞の側方散乱光を測定する工程か又は細胞の
    前方広角散乱光を測定する工程の少なくとも一方である
    請求項８に記載の方法。
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