KR19980042627A

KR19980042627A - 유약백혈구의 분류계수법

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Publication number: KR19980042627A
Application number: KR1019970061432A
Authority: KR
Inventors: 다카시사카타; 도시히로미즈카미; 가요하타나카
Original assignee: 이에츠구히사시; 도아이요우덴시가부시키가이샤
Priority date: 1997-11-20
Filing date: 1997-11-20
Publication date: 1998-08-17

Abstract

높은 정밀도로 유약백혈구를 측정함과 동시에, 정상백혈구의 분류 및 백혈구계수를 할 수 있는 방법을 제공한다.

다음의 공정으로부터 유약백혈구의 분류계수법;

(1) 유약백혈구를 살아있는 상태로 보존하고, 그 외의 백혈구에 손상을 주는 용혈제로 혈액학적 시료처리를 한다;

(2) 손상을 준 상기의 백혈구를, 손상된 세포를 염색할 수 있는 형광색소로 염색한다; 그리고,

(3) 상기의 공정으로 처리한 혈구에 1종류 이상의 산란광과, 1종류 이상의 형광으로 측정하여, 이 강도 차이에 의하여 백혈구를 분류계수한다.

Description

유약백혈구의 분류계수법

본 발명은, 플로우시토측정법(flowcytometry)에 의한 백혈구의 분류계수법에 관한 것이다.

임상조사의 분야에 있어서, 백혈구의 분류계수를 하는 것은, 질환의 진단을 실시함에 매우 유용한 정보를 얻을 수 있다. 통상, 정상인 말초혈액중의 백혈구에는, 임파구, 단구(單球), 호산구(好酸球), 호염기구(好鹽基球), 호중구(好中球)의 5가지가 존재하는 것으로 확인된다. 그러나, 예를 들면, 여러 가지의 혈액질환에서는, 골수구, 골수아구(骨髓芽球) 등의 유약백혈구가 나타나고 있다. 이들의 유약백혈구의 출현을 검출하는 것은, 질환의 진단상 매우 중요하다.

종래, 이 목적은, 혈액의 도말표본(smear)을 제작하여 적당한 염색을 실시한 후에 현미경으로 관찰하여 이루어진 것으로부터 분류계수하는 것이 일반적이었다. 한편, 최근에, 플로우시토계기(flowcytometer)의 원리를 응용한 여러 가지의 전자동 백혈구 분류계수장치가 제공되어있다. 그러나, 이들의 장치는 정상인 백혈구는 높은 정밀도로 분류계수할 수 있으나, 상기의 유약백혈구를 확실히 검출하는 것은 할 수 없었다.

최근에, RF/DC측정원리를 사용하여 유약백혈구의 출현을 높은 정밀도로 검출하는 시약 및 방법이 제공되어있다(특개평 6-273413호).

상기 공보의 방법은, 특정의 조건하에서는, 정상백혈구보다도 유약백혈구의 방(方)이 파괴되기 어렵다고 하는 성질을 이용하여 전기적(電氣的)으로 측정한 것이다. 또, 산란광 정보에 의해 측정할 수 있는 것도 시사되어 있다. 그러나, 이 방법은, 유약백혈구의 검출만을 목적으로 하고, 유약백혈구의 검출에 있어서 우수한 성능을 갖으나, 유약백혈구의 측정과 동시에 정상인 백혈구를 분류계수할 수 없다. 정상 백혈구의 분류계수는, 별도의 다른 방법으로 해야한다.

특개평 6-20792호에는, 백혈구에 표식물질이 통과하는 것만으로 손상을 주어서 혈액을 분석하는 방법이 개시되어 있으나, 이 방법은 정상백혈구에도 유약백혈구에도 동시에 손상을 입혀서 분석하는 방법으로서, 유약백혈구와 정상백혈구의 분리가 반드시 좋다고는 할 수 없다. 또, 이 방법으로 처리된 유약백혈구는, 표식물질로서 사용되는 색소에 대하여 투과성이 있고, 유약백혈구에 손상을 주지 않는 방법은 개시되어 있지 않다.

본 발명은, 높은 정밀도로 유약백혈구를 측정함과 동시에, 정상백혈구의 분류 및 백혈구계수를 할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 본 발명의 방법에 사용할 수 있는 플로우시토계기의 개략도를

나타낸다.

도 2는 본 발명의 방법을 사용하여 측정한 결과를 나타낸다. A는 정상인

혈구의 측정혈구, B는 유약과립구가 나타나있는 혈구, C는

유약과립구, 아구가 나타나있는 검체의 측정결과이다.

도 3은 본 발명의 측정법에 의한 측정결과와 종래법에 의한 측정결과를

비교하여 상관 분석결과를 나타낸다

도 4는 G-CSF투여 후, 조혈전구세포가 나타난 검체를 본 발명의 방법을

사용하여 측정한 결과를 나타낸다.

도 5는 CD34양성의 조혈전구세포를 분리한 후, 본 발명의 방법을 사용하여

측정한 결과를 나타낸다.

본 발명은, 다음의 공정;

(1) 유약백혈구를 살아있는 상태로 보존하고, 그 외의 백혈구에 손상을 주어서 용혈제로 혈액학적 시료 처리를 한다;

(2) 손상을 준 상기 백혈구를, 손상된 세포를 염색할 수 있는 형광색소로 염색한다; 그리고,

(3) 상기의 공정에서 처리한 혈구의 1종류 이상을 산란광과, 1종류 이상의 형광으로 측정하여, 이 강도 차이에 의하여 백혈구를 분류계수한다.

로부터 이루어진 유약백혈구의 분류계수법을 제공한다.

본 발명에서 말하는 백혈구의 손상은, 통상, 살아있는 백혈구의 세포막을 통과하지 못하는 색소를 세포막투과가 가능하게 하는 조작이다. 본 발명에서는, 정상백혈구를 손상시켜서, 색소의 투과를 가능하게 하는 한편, 유약백혈구는 손상되지 않고, 다시 말하면 색소투과성이 없는 상태이다.

통상의 백혈구세포는, 세포 내에 불필요한 물질(예를 들면, 색소)을 배제하는 물질배제기능을 갖고 있다.

한편, 특정 조성의 용혈제를 세포에 작용시킨 경우, 작용순서는 명확하지 않으나, 특정 세포(예를 들면, 정상백혈구)의 세포막지질 구성성분의 일부를 추출(인발)하여, 세포막에 특정의 물질만 통과할 수 있는 세공을 만든다. 그 결과, 특정 세포 내에 색소분자가 들어가서 염색할 수 있다. 한편, 유약백혈구는, 색소의 투과를 가능하게만 하는 세공을 뚫을 수 없기 때문에(이 상태를 본 발명 중에서는 살아있는 상태라고 함), 색소로 염색되지 않는다. 또, 본 발명에서 말하는 유약백혈구는, 통상 골수에 존재하며, 말초혈액에 존재하지 않는 미성숙된 세포를 가리킨다. 예를 들면, 아구, 전골수구, 골수구, 후골수구를 가리킨다. 전골수구, 골수구, 후골수구에 대해서는, 종합하여 유약과립구라고 하는 것이다. 또는, 아구이전의 분화단계의 세포인, 골수계간세포(CFU-GEMN), 호중구·마크로파아지콜로니(macrophage colony)형성세포(CFU-GM), 호산구콜로니형성세포(CFU-EOS) 등의 백혈구계의 조혈전구세포도 본 발명의 유약백혈구의 범위에 포함한다. 유약백혈구가 염색되지 않고, 이외의 다른 백혈구가 염색되도록 하는 것은 다음의 용혈제와 혈액학적시료를 혼합하여 얻어진다. 본 발명에서 말하는 혈액학적시료는, 주로 말초혈액을 가리키나, 이외에도, 골수액, 아페레시스(apheresis) 등에 의하여 회수된 혈액성분을 함유한 시료 또는 복강액, 요(尿)시료 등의 백혈구 성분을 함유한 생체시료도 바람직한 시료이다.

본 발명에서 사용할 수 있는 용혈제는, 계면활성제를 함유한 용액이 사용되고, 또는 다음의 구조식을 갖는 폴리옥시에틸렌계 비이온(nonionic)계면활성제를 함유한 것도 적당히 사용된다. 특개평 6-273413호에 기재된 용혈제가 바람직하다. 상기 공보에 기재된 용혈제는, (1) 유약백혈구의 세포질 및 세포막을 고정화하기 위한 폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면활성제; (2) 혈구의 세포막에 손상을 최소화하기 위한 가용화제; (3) 유약백혈구의 세포질 및 세포막을 고정하기 위한 아미노산; 및 (4) 액체의 pH를 5.0∼9.0, 침투압을 150∼600 mOsm/㎏으로 하는 완충액, 전기전도도를 6.0∼9.0mS/㎝로 하는 완충액을 함유한다. 본 발명에서는 광학적으로 측정을 하기 때문에, 전기전도도의 영향은 거의 없고, 따라서 전기전도도는 상기의 범위로 한정되지 않는다.

상기 폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면활성제는, 다음의 구조식을 갖는 것을 사용할 수 있다.

R₁― R₂― (CH₂CH₂O)_n― H

(식 중, R₁은 탄소수 10∼25의 알킬기, 알케닐기 또는 알키닐기; R₂는 - O -,또는 - COO -; n은 10∼40이다.)

특히, 폴리옥시에틸렌(20)라우릴에테르, 폴리옥시에틸렌(15)오레일에테르(oreylether), 폴리옥시에틸렌(16)오레일에테르가 바람직하다.

폴리옥시에틸렌계 비이온성계면활성제의 농도는, 사용하는 것에 따라 다르지만, 상술의 폴리옥시에틸렌(20)라우릴에테르는, 0.1∼2.0 g/ℓ(바람직하게는 0.5∼1.5g/ℓ), 폴리옥시에틸렌(15)오레일에테르는 1∼9g/ℓ(바람직하게는 3∼7g/ℓ), 폴리옥시에틸렌(16)오레일에테르는 5∼50g/ℓ(바람직하게는 15∼35g/ℓ)의 범위에서 사용할 수 있다. 폴리옥시에틸렌계 비이온성 계면활성제는, 소수성기의 탄소수가 같으면, n의 수가 적어질수록 세포를 손상시키는 힘이 강하고, n이 클수록 약해진다. 또, n의 수가 같으면, 소수성기의 탄소수가 적어짐에 따라 세포를 손상하는 힘이 강하게 된다. 이 점을 고려하여, 상기의 값을 기준으로 하여, 필요한 계면활성제 농도는 실험에 의해 간단히 구할 수 있다.

또, 상기의 가용화제는 다음의 것으로부터 선택할 수 있다.

(1) 다음의 식의 사르코신(sarcosine)유도체 또는 그의 염:

(식 중에서, R₃는 탄소수 10∼22의 알킬기; m은 1∼5이다.)

(2) 다음의 식의 코올산(cholic acid)유도체:

(식 중에서, R은 수소원자 또는 수산기이다.)

(3) 다음의 식의 메틸글루칸아마이드(methylglucan amide):

(식 중에서, y는 5∼7이다.)

가용화제의 바람직한 농도는, 사르코신산유도체 또는 그의 염은 0.2∼2.0g/ℓ, 코올산유도체는, 0.1∼0.5g/ℓ, 메틸글루칸아마이드에서는, 1.0∼8.0g/ℓ이다. 구체적으로는, N-라우로일사르코신산나트륨, 라우로일메틸-β-알라닌나트륨, 라우로일사르코신, 3-[(3-코올아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설폰네이트(CHAPS), 3-[(3-코올아미도프로필)디메틸암모니오]-2-하이드록시-1-프로판설폰네이트(CHAPSO), 옥타노일-N-메틸글루카마이드(MEGA8), 노난노일-N-메틸글루카마이드(MEGA9), 데카노일-N-메틸글루카마이드(MEGA10) 등을 적당하게 사용할 수 있다. 이외에, n-옥틸-β-글루코사이드, 수크로우즈모노카프레이트(sucrosemonocaprate)나 N-포밀메틸루이실알라닌 등을 사용할 수 있고, 이들의 바람직한 농도는, 0.01∼50.0g/ℓ이다.

또, 아미노산, 단백질을 구성하는 아미노산을 사용할 수 있고, 글루타민산, 발린이나, 특히, 메치오닌, 시스틴 및 시스테인 등과 같은 황 함유 아미노산이 바람직하고, 메티오닌이 가장 바람직하다. 사용량은 1∼50g/ℓ의 범위로 사용할 수 있고, 글루타민산은 8∼12g/ℓ가 바람직하고, 메티오닌은 16∼24g/ℓ가 바람직하다.

완충액은, HEPES 등의 Good완충액이나 인산완충액 등에 수산화나트륨 등의 pH조정제를 가하여, 필요하면, 염화나트륨과 같은 침투압조정제를 새로이 첨가하여, pH를 5.0∼9.0, 침투압을 150∼600mOsm/㎏으로 하는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 색소는, 손상된 세포 또는 유약백혈구중 어느 한 쪽을 염색할 수 있으면 좋으나, 손상된 세포를 염색할 수 있는 색소가 바람직하다. 손상된 세포를 염색하기 위한 색소로는, 살아있는 세포에 대한 투과성이 낮은 색소이다, 일반적으로 살아있는 세포는 세포막에 의해 세포외부와 구별되어 있고, 세포막은 세포가 필요로 하지 않는 물질을 투과시키지 않도록 하는, 물질선택성이 있다. 예를 들면, 세포막 투과성이 낮은 색소의 예로서는, 트립판 블루(Trypan Blue) 등이 있다. 이들 색소는 일반적으로 산성관능기, 예를 들면, 카르복시기, 황산기 등을 갖는 산성색소이다. 이들의 색소는 살아있는 세포를 염색시키지 않고, 세포막에 손상을 받은 세포를 염색할 수 있다. 그러나, 산성색소는 혈소판 등의 백혈구이외의 성분을 염색하는 경향이 있기 때문에 본 발명에 사용하는데는 바람직하지 않다. 본 발명의 목적을 달성하려면, 백혈구에 특이하게 존재하는 성분을 염색하는 방법이 바람직하다. 이 염색대상은, 세포핵, 특히, DNA에 대하여 특이성을 갖는 색소 또는 RNA에 특이성을 갖는 색소가 특히 바람직하다. 이 목적에는, 몇 가지의 양이온성 색소가 바람직하다.

일반적으로 양이온성색소는, 살아있는 세포의 세포막을 통과하여, 세포내부의 구성성분을 염색한다. 그러나, 특정의 양이온성색소(예를 들면, 에티듐브로마이드(ethidium bromide), 프로피듐요오드(propidium iodode) 등)은, 살아있는 세포를 투과하지 못하고, 손상된 세포만을 염색하는 것이 알려져있다. 본 발명의 목적에 사용할 수 있는 색소는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 구체적으로는, 앞의 에티듐브로마아드, 프로피듐요오드, 또 몰레큘라프로브사에 의해 판매되고 있는 에티듐 아크리딘헤테로다이머, 에티듐디아자이드, 에티듐호모다이머--1, 에티듐다이머--2, 에티듐모노마이드, TOTO-1, TO-PRO-1, TOTO-3, TO-PRO-3(Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 5th Edition 1992∼1994;MOLECULAR PROCESS, INC. 1992에 기재) 등에 더하여, 또 광원으로서, He-Ne, 적색반도체레이져를 사용하는 경우에 적당한 색소로서, 다음의 구조식(I)로 표시되는 색소가 사용될 수 있는 것을 발견하였다.

(식 중에서, R₁은 수소원자 또는 저급알킬기; R₂및 R₃는 수소원자, 저급알킬기 또는 저급알콕시기; R₄는 수소원자, 아실기 또는 저급알킬기; R₅는 수소원자, 치환되어 있거나 또는 없는 저급알킬기; Z는 유황원자, 산소원자 또는 저급알킬기로 치환된 탄소원자; n은 1 또는 2; X^-는 음이온이다.)

식(I)의 R₁에서의 저급알킬기로는, 탄소수 1∼6의 곧은 사슬 또는 분지의 알킬기를 의미하며, 예를 들면, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, t-부틸, 펜틸, 헵틸기를 들 수 있다. 이중에서도, 메틸기, 에틸기가 바람직하다.

R₂및 R₃에서의 저급알킬기는 상기와 동일하며, 저급알콕시기로서는, 탄소수 1∼6의 알콕시기를 의미하여, 예를 들면, 메톡시, 에톡시, 프로폭시 등을 들 수 있고, 그 중에서도 메톡시기, 에톡시기가 바람직하다. 또 R₂및 R₃는 수소원자가 보다 바람직하다.

R₄에서의 아실기로는, 지방족카르복시산으로부터 유도된 아실기가 바람직하고, 예를 들면, 아세틸, 프로피오닐 등을 들 수 있고, 그 중에서도 아세틸기가 바람직하다. 또 저급알킬기는 상기와 동일하다.

R₅에서의 저급알킬리는 상기와 동일하며, 치환되어 있거나 또는 없는 저급알킬기로는, 1∼3개의 수산기, 할로겐원자(불소, 염소, 브롬 또는 요오드) 등으로 치환되어있거나 또는 없는 저급알킬기를 의미하며, 그 중에서도 1개의 수산기로 치환된 메틸기, 에틸기가 바람직하다.

Z에서의 저급알킬기로는 상기와 동일하며, Z으로서는 유황원자인 것이 바람직하다.

X^-에서의 음이온은, 할로겐이온(불소, 염소, 브롬 또는 요오드), 할로겐화붕소이온(BF₄ ^-, BCl₄ ^-, BBr₄ ^-등), 인화물이온, 할로겐산소산이온, 플루오로황산이온, 메틸황산이온, 방향고리에 할로겐 또는 할로겐을 갖는 알킬기를 치환기로서 갖는 테트라페닐붕소화합물이온 등을 들 수 있다. 그 중에서도 브롬이온 또는 BF₄ ^-가 바람직하다.

상기식(I)의 색소의 구체적인 예로서는, 다음의 색소 A, 색소 B 및 색소C가 바람직하다. 이것들의 색소A, 색소B, 색소C에 대해서는 특개평 9-104683호에 상세한 합성방법이 기재되어있다.

합성방법의 일예를 들면, 식(I)에 있어서 n=1의 화합물은 예를 들면, 식(II)

로 표시되는 화합물과, N,N-디치환포름아미딘을 반응시켜, 이 생성물에 식(III)

로 표시되는 퀴놀린유도체를 반응시키고, 이어서, 붕소화나트륨으로 처리하여 얻을 수 있다.

또, 식(I)의 화합물중, n=2의 화합물은, 상기반응에서, N,N-디치환포름디아미딘을 사용하는 대신에, 예를 들면, 말론알데히드 비스(페닐이민)(malonaldehyde bis(phenylimine))염을 반응시켜서 얻을 수 있다.

또, 상기의 몰레큘러프로브사의 핸드북에도 몇 가지의 색소가 기재되어 있다. 상기의 색소는 예시되어 있고, 이들에 의하여 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

측정용시약의 제작에는, 상기의 용혈제와 색소를 합한 용액과 혈액시료만을 혼합하면 된다. 혹은, 색소를 에틸렌글리콜 등의 수용성 유기용매에 용해하여 두었다가, 사용할 때에 용혈제와 혼합하여도 된다. 이와 같이하여 색소의 보존안정성을 높일 수 있다. 색소농도는, 사용하는 색소에 대하여 적절히 결정하여 당업자가 용이하게 실험적으로 구할 수 있다. 예를 들면, 에티듐브로마이드의 경우, 0.01∼100ppm, 바람직하게는 0.1∼30ppm으로 사용할 수 있다.

또, 혈액시료와, 색소를 혼합한 용혈용액과의 혼합비는, 1:10∼1:1000, 반응온도는 20∼40℃, 반응시간 5초∼5분간으로 실험할 수 있다. 반응온도가 높아질 수록 반응시간을 짧게 하는 것이 바람직하다.

제조된 시약을 측정할 때는, 예를 들면, 도 1에 나타난 것과 같은 구조의 플로우시토계기를 사용할 수 있다. 시판의 플로우시토계기(예를 들면, FACScan, 벡톤 딕킨슨사)를 사용할 수 있고, 특별한 개량은 필요 없다. 광원은, 사용하는 형광색소의 여기(勵起)파장에 합하여 적당히 선택할 수 있다.

산란광의 검출은, 전방산란광(저각 또는 고각)에도 측방산란과도 관계없다.

본 발명을 다음의 실시예에 의하여 설명하지만, 본 발명의 범위에 이것을 한정되지 않는다.

(실시예)

실시예 1

측정용시약:

폴리옥시에틸렌(16)오레일에테르 24.0g/ℓ

N-라우릴사코신산 나트륨 1.5g/ℓ

DL-메티오닌 20.0g/ℓ

HEPES 12.0g/ℓ

1N-NaOH 0.3g/ℓ

NaCl 4.0g/ℓ

색소 A 3.0mg/ℓ

상기의 시약 1㎖와 혈액 33㎕을 혼합하여, 10초 후에 플로우시토계기로 측방산란광, 적색형광을 측정했다(광원; 적색반도체레이져, 파장:633㎚).

얻어진 결과를 도 2(A∼C)에 나타낸다. A는 정상 혈액의 측정결과, B는 유약과립구가 나타나 있는 혈구, C는 유약과립구, 아구가 나타나 있는 검체의 측정결과를 나타낸다.

도 2의 A에서는, 백혈구가 임파구, 단구, 과립구의 3분면으로 되어 있다. B에서는, 정상의 3분면에 더하여, 유약과립구가 분면된다. C에서는 정상의 3분면에 더하여, 유약과립구와 아구가 분면된다.

이어서, 본 발명의 측정법에 의한 측정결과와 종래법에 의한 측정결과를 비교하여 상관분석을 구하였다. 종래법은 다항목자동혈구분석장치(SE-9000. 동아의용전자(주))에서 측정하였다.

얻어진 결과를 도 3(A∼D)에 나타낸다. 임파구(A), 단구(B) 및 과립구(C)의 비율, 더불어 백혈구의 총수(WBC:도 3에서는 D로 나타낸다)의 어느 것에 있어서도 종래법과 본 발명의 방법이 결과에 양호한 상관관계가 얻어졌다. 또, SE-9000의 과립구는, 호중구(NEUT)+호산구(EO)+호염기구(BA)로 구하였다.

실시예 2

실시예 1과 동일한 시약을 사용하여, G-CSF투여 후, 조혈전구세포가 나타난 검체를 플로우시토계기로 측방산란광과 적색형광을 측정하였다. 결과를 도 4에 나타낸다. 유약백혈구의 영역인 형광강도의 낮은 영역에 세포집단이 인지되었다.

또, 조혈전구세포가 CD34양성인 성질을 이용하여, 조혈전구세포를 분리하여 측정하였다. 우선, 혈액성분 분석장치에 의하여 단핵구에 많은 시료를 조제하여, 이어서, 항CD34모노클론알(monoclonal) 항체(Becton Dickinson Immunocytometry System Co., Ltd,(주)제)를 결합시킨 자기(磁氣)비드(Dynabeads^TM; DYNAL로서 시판되고 있다.)와 반응시키고, 이어서, 자기세포분리기(Isolex^TM;Baxter Co., Ltd.)를 사용하여 CD34양성의 조혈전구세포를 분리하였다. 이어서, 산소(키모파파인(chymopapin))처리를 하여 CD34양성세포를 자기비드로부터 분리하였다.

이와 같이하여 조제한 시료를 동일 시약을 사용하여, 플로우시토계기로 측방산란광과 적색형광을 측정하였다. 결과를 도 5에 나타낸다. 같은 방법으로 유약백혈구의 영역인 형광강도의 낮은 영역에 세포집단이 인지되었다.

본 발명에 의하면, 용혈제에 의한 처리에 가하여, 더구나 부상세포를 염색할 수 있는 색소로 염색하여, 산란광과 형광을 조합시켜 측정하는 것에 의하여, 종래법에서는 불가능한 정상백혈구의 분류계수와 유약백혈구의 분류계수가 동시에 가능하게 되고, 더불어 백혈구계수가 한번의 계(系)로 가능하게 되었다.

Claims

다음의 공정으로 이루어진 유약백혈구의 분류계수법;

(1) 유약백혈구를 살아있는 상태로 보존하고, 그 외의 백혈구에 손상을 주는 용혈제로 혈액학적 시료처리를 한다;

(2) 손상을 준 상기의 백혈구를, 손상된 세포를 염색할 수 있는 형광색소로 염색한다; 그리고,

(3) 상기의 공정으로 처리한 혈구에 1종류 이상의 산란광과, 1종류 이상의 형광으로 측정하여, 이 강도 차이에 의하여 백혈구를 분류계수한다.
제 1항에 있어서,

유약백혈구의 분류계수와 동시에, 정상백혈구도 검출하여, 전체백혈구수를 계수하는 유약백혈구의 분류계수법.
제 2항에 있어서,

정상백혈구를 3종류 이상 분류계수하는 유약백혈구의 분류계수법.
제 1항 내지 제 3항의 어느한 항에 있어서,

용혈제가 다음의 성분;

(1)유약백혈구의 세포질 및 세포막을 고정화하기 위한 폴리옥시에틸렌계 음이온계면활성제;

(2) 혈구의 세포막에 손상을 최소화하기 위한 가용화제;

(3) 유약백혈구의 세포질 및 세포막을 고정하기 위한 아미노산; 및

(4) 액체의 pH를 5.0∼9.0, 침투압을 150∼600mOsm/㎏으로 하는 완충액을 함유하는 유약백혈구의 분류계수법.
제 1항 내지 제 3항의 어느한 항에 있어서,

형광색소가 다음의 군에서 선택된 유약백혈구의 분류계수법

(1) 일반식(I)의 화합물;

(식 중에서, R₁은 수소원자 또는 알킬기; R₂및 R₃은 수소원자, 저급알킬기 또는 저급알콕시기; R₄는 수소원자, 아실기 또는 저급알킬기; R₅는 수소원자, 치환되어있거나 또는 없는 저급알킬기; Z는 유황원자, 산소원자 또는 저급알킬기로 치환된 탄소원자; n은 1 또는 2; X^-는 음이온이다.);

(2) 에티듐브로마이드, 프로피듐아이오다이드;

(3) 에티듐-아크리딘헤테로다이머, 에티듐다이아자이드, 에티듐호모다이머--1, 에티듐호모다이머--2, 에키듐모노아자이드, TOTO-1, TO-PRO-1, TOTO-3, TO-PRO-3.
제 4항에 있어서,

형광색소가 다음의 군에서 선택된 유약백혈구의 분류계수법

(1) 일반식(I)의 화합물;

(식 중에서, R₁은 수소원자 또는 알킬기; R₂및 R₃은 수소원자, 저급알킬기 또는 저급알콕시기; R₄는 수소원자, 아실기 또는 저급알킬기; R₅는 수소원자, 치환되어 있거나 또는 없는 저급알킬기; Z는 유황원자, 산소원자 또는 저급알킬기로 치환된 탄소원자; n은 1 또는 2; X^-는 음이온이다.);

(2) 에티듐브로마이드, 프로피듐아이오다이드;

(3) 에티듐-아크리딘헤테로다이머, 에티듐다이아자이드, 에티듐호모다이머--1, 에티듐호모다이머--2, 에키듐모노아자이드, TOTO-1, TO-PRO-1, TOTO-3, TO-PRO-3.