KR101331332B1

KR101331332B1 - 유약 백혈구 분석용 시약 및 분석용 시약 키트

Info

Publication number: KR101331332B1
Application number: KR1020097025267A
Authority: KR
Inventors: 유키코 가타오카; 도모히로 츠지; 신이치로 오구니; 아유무 요시다; 마사키 아베
Original assignee: 시스멕스 가부시키가이샤
Priority date: 2007-06-25
Filing date: 2008-06-25
Publication date: 2013-11-20
Also published as: RU2010102038A; EP2166353A1; EP2166353B1; BRPI0811799B1; ES2684695T3; JP4981907B2; RU2435164C2; WO2009001868A1; CN101680879A; BRPI0811799A2; MX2009012997A; US8455209B2; JPWO2009001868A1; BRPI0811799C1; HUE040270T2; CN101680879B; BRPI0811799B8; PL2166353T3; KR20100032853A; EP2166353A4

Abstract

본 발명은 적혈구 및 성숙 백혈구의 세포막에 손상을 주는 계면활성제와 손상된 혈구를 수축시키는 가용화제와 핵산 염색 색소를 포함하고, 침투압이 1O mOsm/kg 이상 15O mOsm/kg 미만인 유약 백혈구의 분석용 시약을 제공한다.

Description

유약 백혈구 분석용 시약 및 분석용 시약 키트{REAGENT AND REAGENT KIT FOR ANALYSIS OF IMMATURE LEUKOCYTE}

본 발명은 생체로부터 채취된 시료 중의 백혈구를 분류하여, 계수하기 위한 시약 및 시약 키트에 관한 것이다.

혈구 세포는 골수에서 생산되어, 미숙한 세포로부터 분화하고 성숙하여 말초혈로 이행한다. 건강한 정상인의 경우, 유약한 백혈구(유약 백혈구)가 말초혈에 출현하는 일은 없다. 한편, 백혈병, 암의 골수 전이, 다발성 골수종, 중증 감염증 등의 환자의 말초혈에는 유약 백혈구가 출현하는 일이 있다. 이 때문에 생체 시료 중의 성숙 백혈구나 유약 백혈구를 분류하여 측정하는 것은 이러한 질환을 진단하는데 있어서 매우 중요하다.

유약 백혈구를 측정하기 위한 시약으로서 일본 특개 평10-206423호(특허 문헌 1)에 개시된 시약이 알려져 있다. 이 시약과 생체 시료를 혼합한 측정 시료를 플로우 사이토미터에 도입하고, 특정 파장의 빛을 조사하여 얻어지는 광학적 정보에 기초하여 검체 중의 성숙 백혈구와 유약 백혈구를 분류하여 각각을 계수할 수 있다. 또, 유약 백혈구를 골수아구, 유약 과립구 등으로 세분류하여 각각 계수하는 것도 가능하다.

특허 문헌 1: 일본 특개 평10-206423호 공보

발명이 해결하려고 하는 과제

종래의 시약을 이용하는 혈구 분석에서는 예를 들어, 플로우 사이토미터를 이용하여 혈구를 측정했을 경우, 용혈한 적혈구의 파편(적혈구 고스트)의 시그널 영역과 골수아구의 시그널 영역이 일부 중복되는 일이 있었다. 그러한 시약을 이용하면 골수아구가 포함되지 않는 혈액 시료를 분석했을 경우에서도, 적혈구 파편의 시그널이 골수아구의 시그널로서 잘못 인식되어, 정확한 혈구 분석 결과를 얻을 수 없었다. 예를 들면 다발성 골수종, 담관암, 복막염, 당뇨병, 사구체 신염, 흉막염 등의 특정 질환에 이환(罹患)한 환자의 말초혈에는 골수아구가 포함되지 않는다. 그러나 상기 종래의 시약을 이용하여 이러한 환자로부터 채취한 말초혈의 혈구 분류를 실시하면 스캐터그램에서의 골수아구의 시그널 검출 영역에 시그널이 검출되어 버리는 경우가 있었다. 이것은 이와 같은 특정 환자로부터의 시료에 포함되는 적혈구가 건강한 정상인이나 이러한 질환 이외의 질환의 환자 시료 중의 적혈구와는 달리, 잘 용혈되지 않는 것이 원인이 아닐까하고 생각된다. 말초혈 중에 실제보다 많은 양의 골수아구가 검출되면 올바른 진단 및 치료가 이루어지지 않을 우려가 있다. 또한, 본 명세서에 있어서 「적혈구 고스트」란 혈액 시료와 혈액 분석용 시약의 반응 결과, 헤모글로빈을 상실했지만 충분히 수축하지 않았던 적혈구를 의미한다.

따라서, 이와 같은 특정 질환 환자로부터의 혈액 시료에서도, 보다 정확한 유약 백혈구의 분류 및 계수를 실시할 수 있는 시약을 제공하는 것을 본 발명의 과제로 한다.

과제를 해결하기 위한 수단

이와 같은 문제를 해결하기 위해서 연구를 거듭한 결과, 본 발명자들은 유약 백혈구 분석용 시약의 침투압을 종래 생각되고 있었던 것보다도 낮게 함으로써 상기 과제를 해결할 수 있는 것을 알아냈다.

종래의 유약 백혈구 분석용 시약은 유약 백혈구 및 성숙 백혈구가 측정시에 용해하는 것을 방지하기 위해서, 이들 혈구 세포와 동일한 정도의 침투압을 갖는 것을 이용하는 것이 적합하다고 생각되고 있었다.

그렇지만, 이번 다발성 골수종, 담관암, 복막염, 당뇨병, 사구체 신염, 흉막염 등의 특정 질환에 이환한 환자로부터의 생체 시료를 분석하는 경우, 종래의 기술 상식으로는 생각할 수 없었던 저침투압 분석용 시약을 이용하면 이와 같은 특정 환자로부터의 생체 시료의 분석의 정밀도가 보다 향상하는 것을 알아냈다. 예를 들어, 저침투압 분석용 시약을 이용함으로써 골수아구와 용혈한 적혈구를 보다 명확하게 변별할 수 있었다. 또 놀랍게도, 상기 특정 질환 이외의 질환을 이환하고 있는 환자로부터의 생체 시료에서도, 본 발명의 분석용 시약을 이용하면 침투압이 높은 종래의 시약과 같이 유약 백혈구와 성숙 백혈구를 명확하게 구별할 수 있는 것을 알 수 있었다. 예를 들어, 본 발명의 분석용 시약을 이용함으로써 적혈구 고스트의 출현을 막을 수 있는 것을 알 수 있었다.

저침투압 분석용 시약을 이용했을 경우에도 검체에 따라서는 골수아구의 시그널과 호염기구의 시그널이 겹쳐 검출되는 경우가 있다. 그 때문에 건강한 정상인의 말초혈 중에 골수아구가 출현하고 있지 않아도, 골수아구가 출현하고 있다고 여겨져 올바른 검사가 이루어지지 않을 우려가 있었다. 골수아구의 시그널과 호염기구의 시그널이 중복된다고 하는 추가적인 문제에 대해서는 유약 백혈구 분석용 시약의 계면활성제, 가용화제 농도를 종래 생각되고 있었던 것보다도 낮게 함으로써 해결할 수 있었다. 즉, 호염기구를 많이 포함하는 혈액 시료에서도 본 발명의 시약을 이용함으로써 호염기구와 골수아구를 보다 명확하게 구별할 수 있었다. 또한, 계면활성제, 가용화제 농도를 낮게 함으로써 저침투압하에 있어서도 성숙 백혈구를 적어도 3 분류할 수 있었다.

본 발명의 한 측면은 적혈구 및 성숙 백혈구의 세포막에 손상을 주는 계면활성제와,

손상된 혈구를 수축시키는 가용화제와,

핵산 염색 색소를 포함하고,

침투압이 10 mOsm/kg 이상 150 mOsm/kg 미만인 유약 백혈구 분석용 시약이다.

또, 본 발명의 한 측면은 적혈구 및 성숙 백혈구의 세포막에 손상을 주는 계면활성제와 손상된 혈구를 수축시키는 가용화제를 포함하고, 침투압이 10 mOsm/kg 이상 150 mOsm/kg 미만인 제1 시약, 및

핵산 염색 색소를 포함하는 제2 시약을 포함하는 유약 백혈구 분석용 시약 키트이다.

본 발명의 또다른 한 측면은 적혈구 및 성숙 백혈구의 세포막에 손상을 주는 계면활성제와 손상된 혈구를 수축시키는 가용화제와 핵산 염색 색소를 포함하고, 침투압이 10 mOsm/kg 이상 150 mOsm/kg 미만인 유약 백혈구 분석용 시약과, 유약 백혈구를 포함할 수 있는 생체 시료를 혼합하여 성숙 백혈구의 핵산을 염색하는 공정, 및

상기 공정에서 처리한 유약 백혈구 중 적어도 1개의 산란광과 적어도 1개의 형광을 측정하여 그 강도 차이에 의해서 유약 백혈구를 분류하는 방법이다.

발명의 효과

본 발명의 유약 백혈구 분석용 시약 및 시약 키트를 이용함으로써, 다발성 골수종, 담관암, 복막염, 당뇨병, 사구체 신염, 흉막염 등의 특정 질환에 이환한 환자의 생체 시료에서도, 종래의 시약에 비해 보다 정확한 유약 백혈구 및 성숙 백혈구의 분류 및 계수를 실시할 수 있다.

발명을 실시하기 위한 바람직한 형태

본 실시 형태의 유약 백혈구 분석용 시약(이하, 「시약」이라고도 한다)을 이용하면 생체 시료에 포함되는 백혈구를 성숙 백혈구와 유약 백혈구로 분류하여 각각을 계수할 수 있다. 또, 성숙 백혈구를 임파구, 단구, 과립구, 호염기구 등 중 적어도 3종 이상으로 분류하여 각각을 계수할 수 있다. 또한, 이 시약을 이용하면 유약 백혈구를 유약 과립구와 골수아구로 세분류하여 각각을 정밀하게 계수할 수도 있다.

본 명세서에 있어서, 「유약 백혈구」란 건강한 정상인에 있어서 말초혈에는 존재하지 않고 골수에 존재하는 미성숙한 백혈구를 가리킨다. 유약 백혈구로는 예를 들면 골수아구, 전 골수구, 골수구, 후 골수구 등을 들 수 있다. 전 골수구, 골수구 및 후 골수구를 합하여 「유약 과립구」라고 칭하기도 한다. 골수아구는 골수계 간세포(CFU-GEMN), 호중구ㆍ마이크로 파지 콜로니 형성 세포(CFU-GM), 호산구 콜로니 형성 세포(CFU-EOS) 등 백혈구계 조혈 전구 세포를 포함한다.

본 실시 형태의 시약을 이용하여 분석하는 생체 시료로는 백혈구를 포함하는 시료이면 특별히 한정되지 않고, 혈액, 뇨, 골수 천자액(骨髓穿刺液), 아페레시스(apheresis)에서 채취한 시료 등을 예시할 수 있다.

본 실시 형태의 시약은 적혈구 및 성숙 백혈구의 세포막에 손상을 주는 계면활성제와 손상된 혈구를 수축시키는 가용화제와 핵산 염색 색소를 포함하고, 침투압이 10 mOsm/kg 이상 150 mOsm/kg 미만이다.

생체 시료와 시약을 혼합하면 계면활성제와 가용화제의 작용에 의해 시료에 포함된 혈구의 세포막이 손상을 받는다. 계면활성제는 적혈구나 성숙 백혈구의 세포막에 손상을 주기 쉽고, 유약 백혈구의 세포막은 손상시키기 어렵다. 적혈구나 성숙 백혈구 등의 손상된 혈구는 가용화제의 작용에 의해 수축한다. 한편, 유약 백혈구의 세포막은 거의 손상되지 않기 때문에 적혈구나 성숙 백혈구보다 가용화제에 의한 세포의 수축이 일어나기 어렵다.

손상을 받은 혈구 가운데, 백혈구의 핵은 핵산 염색 색소의 작용에 의해 강하게 염색되기 쉽다. 그러나 손상을 받지 않은 유약 백혈구는 염색되기 어렵다. 또, 적혈구는 핵을 갖지 않기 때문에 상기 핵산 염색 색소에 의해서는 염색되기 어렵다. 따라서, 유약 백혈구, 성숙 백혈구, 적혈구를 각각 변별할 수 있다.

본 실시 형태의 시약의 침투압은 10 mOsm/kg 이상 150 mOsm/kg 미만이고, 바람직하게는 10~l00 mOsm/kg, 보다 바람직하게는 10~60 mOsm/kg이다. 이 침투압은 이하에 기재하는 성분을 이하에 기재하는 양으로 혼합하는 것에 의하던지 또는 완충제의 농도를 적절히 조절함으로써 얻을 수 있지만, 원하는 바에 따라 당류, 아미노산, 염화 나트륨 등을 더함으로써 조정해도 된다.

당류로는 특별히 한정되지 않지만, 단당류(예를 들면 글루코스, 프룩토스 등), 다당류(예를 들면 아라비노스 등), 당 알코올(예를 들면 자일리톨, 소르비톨, 만니톨, 리비톨 등) 등을 들 수 있다.

예를 들면 자일리톨을 이용하는 경우, 시약 중에 0~10 g/L, 보다 바람직하게는 4~8 g/L 이용해도 된다.

상기 아미노산으로는 발린, 프롤린, 글리신, 알라닌 등을 들 수 있다. 글리신 및 알라닌 중 어느 하나 또는 양쪽 모두를 이용하는 것이 바람직하다.

예를 들면 글리신을 이용하는 경우, 시약 중에 0~10 g/L, 보다 바람직하게는 2~6 g/L 이용해도 된다.

적혈구 및 성숙 백혈구의 세포막에 손상을 주는 계면활성제는 비이온 계면활성제가 바람직하고, 보다 바람직하게는 폴리옥시 에틸렌계 비이온 계면활성제이다. 이 폴리옥시 에틸렌계 비이온 계면활성제는 이하의 식 (I):

(식 중, R¹은 탄소수 9~25인 알킬기, 알케닐기 또는 알키닐기이고, R²는 -O-, -COO- 또는

이고, n은 10~40의 정수이다)로 표시하는 것이 보다 바람직하다.

상기 식 (I)로 나타내는 계면활성제로는 폴리옥시 에틸렌(15) 올레일 에테르, 폴리옥시 에틸렌(20) 올레일 에테르, 폴리옥시 에틸렌(20) 스테아릴 에테르, 폴리옥시 에틸렌(15) 세틸 에테르, 폴리옥시 에틸렌(20) 세틸 에테르 등을 들 수 있고, 1종 또는 복수종을 이용할 수 있다.

시약 중의 계면활성제의 농도는 계면활성제의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있다. 계면활성제가 폴리옥시 에틸렌 올레일 에테르인 경우, 계면활성제의 시약 중의 농도는 500~15000ppm이 바람직하고, 보다 바람직하게는 750~10000ppm, 더욱 바람직하게는 1000~2500ppm이다.

본 발명의 보다 바람직한 실시 형태에 있어서, 계면활성제의 농도를 예를 들면 1000~10000ppm와 같이 비교적 낮게 설정한다. 그러한 농도 범위에 있어서는 성숙 백혈구의 1종인 호염기구의 세포막 손상이 계면활성제의 농도가 비교적 높은 경우보다 약해져서, 호염기구가 손상되어 세포내 성분이 세포외로 유출하는 것을 막을 수 있다. 이것에 의해, 호염기구는 다른 성숙 백혈구와 같이 핵산 염색 색소의 작용에 의해 염색되기 쉬워진다. 한편, 유약 백혈구의 1종인 골수아구의 세포막은 상기와 같이 손상을 받지 않기 때문에 염색되기 어렵다. 이와 같이 하여 호염기구와 골수아구를 보다 양호하게 변별할 수 있다.

복수종의 계면활성제를 이용하는 경우, 이들 계면활성제의 혼합비는 계면활성제의 수산기가에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들면 수산기가 64.8인 폴리옥시 에틸렌(15) 올레일 에테르와 수산기가 52.4인 폴리옥시 에틸렌(20) 올레일 에테르를 이용하는 경우, 혼합비는 1:9가 바람직하다.

상기 가용화제로는 예를 들면 사르코신 유도체, 콜산 유도체, 메틸 글루칸 아미드 등을 들 수 있다. 이들로부터 선택되는 1종 또는 복수종을 이용할 수 있다.

사르코신 유도체로는 이하의 구조식으로 나타낸 사르코신 유도체 및 그 염을 포함한다. 구체적으로는 N-라우로일사르코신산 나트륨, 라우로일메틸 β-알라닌 나트륨, 라우로일사르코신 등을 들 수 있다. 콜산 유도체로는 이하의 구조식으로 나타낸 콜산 및 그 염을 포함한다. 구체적으로는 CHAPS(3-[(3-콜아미드프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트), CHAPSO([(3-콜아미드프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시-1-프로판술포네이트) 등을 들 수 있다. 메틸 글루칸 아미드로는 MEGA8(옥타노일-N-메틸 글루카미드), MEGA9(노나노일-N-메틸 글루카미드), MEGA10(데카노일-N-메틸 글루카미드) 등을 들 수 있다.

사르코신 유도체는 다음의 구조식을 갖는다.

(식 중, R₁은 C_10-22의 알킬기이고, n은 1~5이다.)

콜산 유도체는 다음의 구조식을 갖는다.

(식 중, R₁은 수소 원자 또는 수산기이다.)

메틸 글루칸 아미드는 다음의 구조식을 갖는다.

(식 중, n은 5~7이다.)

가용화제의 시약 중의 농도는 이용하는 가용화제의 종류에 따라 적절히 선택할 수 있다.

가용화제로서 사르코신 유도체를 이용하는 경우, 시약 중의 가용화제의 농도는 50~3000ppm이 바람직하고, 보다 바람직하게는 100~400ppm이다. 콜산 유도체를 이용하는 경우, 50~10000ppm이 바람직하고, 보다 바람직하게는 50~1300ppm이다. 메틸 글루칸 아미드를 이용하는 경우, 500~8000ppm이 바람직하고, 보다 바람직하게는 500~1100ppm이다.

또, 가용화제로는 n-옥틸 β-글루코시드, 슈크로스 모노카프레이트, N-포르밀메틸로이실알라닌 등을 이용할 수도 있다. 이들을 이용하는 경우, 시약 중의 농도는 5~50000ppm이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5~6600ppm이다. 가용화제는 단독으로 이용해도 되고, 2 종류 이상의 가용화제를 병용해도 된다.

본 발명의 보다 바람직한 실시 형태에 있어서, 가용화제의 농도를 비교적 낮게 함으로써 성숙 백혈구의 1종인 호염기구의 세포막 손상이 가용화제의 농도가 비교적 높은 경우보다 약해져서, 호염기구가 손상되어 세포내 성분이 세포외로 유출하는 것을 막을 수 있다. 이것에 의해, 호염기구는 다른 성숙 백혈구와 같이 핵산 염색 색소의 작용에 의해 염색되기 쉬워진다. 한편, 유약 백혈구의 1종인 골수아구의 세포막은 상기와 같이 손상을 받지 않기 때문에 염색되기 어렵다. 이와 같이 하여 호염기구와 골수아구를 보다 양호하게 변별할 수 있다.

상기 핵산 염색 색소는 핵산을 염색할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 형광 색소인 것이 바람직하다. 이와 같은 색소를 이용함으로써 핵산을 갖지 않는 적혈구는 거의 염색되지 않고, 핵산을 갖는 백혈구는 강하게 염색된다. 이 염색 강도의 차이에 기초하여 적혈구와 백혈구를 변별할 수 있다. 또, 색소를 투과할 수 있을 정도의 손상을 받은 세포막을 갖는 성숙 백혈구는 이 색소에 의해 강하게 염색되지만, 손상을 거의 받지 않은 유약 백혈구는 거의 염색되지 않는다. 이 염색 강도의 차이에 기초하여 백혈구 중 성숙 백혈구와 유약 백혈구를 변별할 수 있다.

핵산 염색 색소는 분석에 이용하는 조사하는 빛에 의해서 적절히 선택된다. 예를 들면 이하와 같은 구조식을 갖는 색소를 이용하는 것이 바람직하다.

(1) 이하의 식 (II)을 갖는 색소

(식 중, R₁ 및 R₂는 저급 알킬기이고; n은 1 또는 2이고; X^-는 음이온이며; Z는 황 원자, 산소 원자 또는 저급 알킬기로 치환된 탄소 원자이다).

상기 식 (II) 중, R₁ 및 R₂에서의 저급 알킬기는 탄소수 1~6인 직쇄 또는 분지의 알킬기를 말한다. 저급 알킬기로는 예를 들면 메틸기, 에틸기, 프로필기, 부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기, 펜틸기, 헥실기 등을 들 수 있고 이들 중 에틸기가 바람직하다.

Z에서의 저급 알킬기는 상기대로이다. Z로는 황 원자가 바람직하다.

X^-에서의 음이온은 할로겐 이온(불소, 염소, 브롬 또는 요오드 이온), 할로겐화 붕소 이온(BF₄ ^-, BCl₄ ^-, BBr₄ ^- 등), 인 화합물 이온, 할로겐 산소산 이온, 플루오로 황산 이온, 메틸 황산 이온, 방향환 할로겐 혹은 할로겐을 갖는 알킬기를 치환기로서 갖는 테트라 페닐 붕소 화합물 이온 등을 들 수 있다. 이들 중 요오드 이온이 바람직하다.

상기 식 (II)의 핵산 염색 색소로는 이하와 같은 색소가 적합하다.

색소 A

(2) 이하의 식 (III)을 갖는 색소

(식 중, R₁ 및 R₂는 저급 알킬기이고; n은 1 또는 2이며; X^-는 음이온이다).

상기 식 (III)에서의 R₁ 및 R₂의 저급 알킬기 및 X^-의 음이온에 대해서는 상기 식 (II)에서 기술한 것과 같다.

상기 식 (III)의 핵산 염색 색소로는 이하와 같은 색소가 적합하다.

색소 B

(3) 이하의 식 (IV)을 갖는 색소

(식 중, R₁은 수소 원자 또는 저급 알킬기이고; R₂ 및 R₃는 수소 원자, 저급 알킬기 또는 저급 알콕시기이고; R₄는 수소 원자, 아실기 또는 저급 알킬기이며; R₅는 수소 원자 또는 치환되어 있어도 되는 저급 알킬기이고; Z는 황 원자, 산소 원자 또는 저급 알킬기로 치환된 탄소 원자이고; n은 1 또는 2이며; X^-는 음이온이다).

상기 식 (IV)에서의 R₁의 저급 알킬기에 대해서는 상기 식 (II)에서 기술한 것과 같다.

R₂ 및 R₃에서의 저급 알킬기는 상기와 같다. 저급 알콕시기는 탄소수 1~6인 알콕시를 의미하여, 예를 들면 메톡시, 에톡시, 프로폭시 등을 들 수 있고 그 중에서도 메톡시기, 에톡시기가 바람직하다. 또한, R₂ 및 R₃는 수소 원자인 것이 바람직하다.

상기 식 (IV)에 있어서, R₄에서의 아실기란 지방족 카르복시산으로부터 유도된 아실기가 바람직하고, 예를 들면 아세틸, 프로피오닐 등을 들 수 있고 그 중에서도 아세틸기가 바람직하다. 또, 저급 알킬기는 상기와 같다.

R₅에서의 저급 알킬기란 상기와 같고, 치환되어 있어도 되는 저급 알킬기란 1~3개의 수산기, 할로겐 원자(불소, 염소, 브롬 또는 요오드) 등으로 치환되어 있어도 되는 저급 알킬기를 의미하여, 그 중에서도 1개의 수산기로 치환된 메틸기, 에틸기가 바람직하다.

Z에서의 저급 알킬기는 상기와 같고, Z로는 황 원자인 것이 바람직하다.

X^-에서의 음이온으로는 브롬 이온 또는 BF₄ ^-가 바람직하다.

상기 식 (IV)의 핵산 염색 색소로는 이하와 같은 색소가 적합하다.

색소 C

(4) 이하의 식 (V)을 갖는 색소.

(식 중, X₁ 및 X₂는 독립적으로 Cl 또는 I이다)

(5) 이하의 식 (VI)을 갖는 색소(NK-3975).

(6) 이하의 식 (VII)을 갖는 색소(NK-1570).

(7) 이하의 식 (VIII)을 갖는 색소(NK-1049).

(8) 이하의 식 (IX)을 갖는 색소(NK-98).

(9) 이하의 식 (X)을 갖는 색소(NK-141).

(10) 프로피듐아이오다이드 또는 에티듐브로마이드.

(11) 에티듐-아크리딘헤테로다이머, 에티듐디아지드, 에티듐호모다이머-1, 에티듐호모다이머-2, 에티듐모노아지드, 트리메틸렌비스[[3-[[4-[[(3-메틸벤조티아졸-3-이움)-2-일]메틸렌]-1,4-디히드로퀴놀린]-1-일]프로필]디메틸아미늄]ㆍ테트라요디드(TOTO-1), 4-[(3-메틸벤조티아졸-2(3H)-이리덴)메틸]-1-[3-(트리메틸아미니오)프로필]퀴놀리늄ㆍ디요디드(TO-PRO-1), N,N,N',N'-테트라메틸-N,N'-비스[3-[4-[3-[(3-메틸벤조티아졸-3-이움)-2-일]-2-프로페닐리덴]-1,4-디히드로퀴놀린-1-일]프로필]-1,3-프로판디아미늄ㆍ테트라요디드(TOTO-3) 또는 2-[3-[[1-[3-(트리메틸아미니오)프로필]-1,4-디히드로퀴놀린]-4-이리덴]-1-프로페닐]-3-메틸벤조티아졸-3-이움ㆍ디요디드(TO-PRO-3).

상기 색소의 시약 중의 농도는 0.01~500ppm이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.1~200ppm이다. 상기 색소는 단독으로 이용해도 되고, 2 종류 이상의 색소를 병용해도 된다.

본 실시 형태의 시약의 pH는 5.0~9.0이 바람직하고, 보다 바람직하게는 6.5~7.5, 더욱 바람직하게는 6.8~7.3이다. 시약의 pH는 완충제를 첨가하여 조정할 수 있다. 완충제로는 예를 들면 HEPES, MOPS(3-morpholinopropanesulfonic acid), MOPSO(2-Hydroxy-3-morpholinopropanesulfonic acid) 또는 BES(2-[bis(2-hydroxyethyl)amino]ethanesulfonic acid) 등의 굿 완충제(Good's buffer), 인산 완충제 등을 이용할 수 있다. 또, 수산화 나트륨 등의 pH 조정제를 이용할 수 있다.

본 실시 형태의 시약은 상기 계면활성제, 가용화제 및 핵산 염색 색소와 원하는 바에 따라 임의의 성분을 상기 농도가 되도록 적절한 용매에 용해함으로써 얻을 수 있다. 상기 적절한 용매로는 상기 성분을 용해할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 물, 알코올, 에틸렌 글리콜, 디메틸술폭시드(DMSO), 이들의 혼액 등을 들 수 있다.

상기 계면활성제, 가용화제 및 핵산 염색 색소는 상기와 같이 단독의 시약으로서 생체 시료와 혼합하여 유약 백혈구의 분석을 실시할 수 있다. 혹은 계면활성제와 가용화제를 포함하는 제1 시약 및 핵산 염색 색소를 포함하는 제2 시약을 포함하는 시약 키트로서 이용하여, 유약 백혈구의 분석에 이용할 수도 있다.

따라서, 본 발명은 적혈구 및 성숙 백혈구의 세포막에 손상을 주는 계면활성제와 손상된 혈구를 수축시키는 가용화제를 포함하고, 침투압이 10 mOsm/kg 이상 150 mOsm/kg 미만인 제1 시약 및 핵산 염색 색소를 포함하는 제2 시약을 포함하는 유약 백혈구 분석용 시약 키트도 제공한다.

상기 제1 시약 중의 계면활성제 및 가용화제의 농도는 제2 시약과 혼합했을 때에, 상기 유약 백혈구 분석용 시약에 대하여 기술한 농도가 되는 것이면 된다. 또, 상기 제1 시약의 침투압은 계면활성제 및 가용화제를 상기와 같이 적절한 용매에 용해하여, 원하는 바에 따라 상기 완충제의 양을 적절히 조절함으로써 원하는 범위로 조정할 수 있다. 또, 상기 당, 아미노산 등을 이용하여 조정해도 된다.

상기 제2 시약 중 핵산 염색 색소의 농도는 제1 시약과 혼합했을 때에, 상기 유약 백혈구 분석용 시약에 대해 기술한 농도가 되는 것이면 된다. 제2 시약은 색소의 보존 안정성을 향상시킬 수 있으므로, 핵산 염색 색소를 에틸렌 글리콜 등의 유기용매에 용해한 것이 바람직하다.

상기 시약 및 시약 키트는 생체 시료와 혼합하여 측정용 시료를 조제하여 플로우 사이토미터에 제공함으로써 유약 백혈구 분석을 실시할 수 있다. 생체 시료와 이 시약 또는 시약 키트의 제1 시약 및 제2 시약의 합계의 혼합비(용량비)는 1:10~1:1000이 바람직하다.

또, 시약 키트에 있어서, 제1 시약과 제2 시약의 혼합비(용량비)는 1000:1~10:1 정도가 바람직하다.

상기 시약 키트를 이용하는 경우, 시약 키트의 각 시약과 생체 시료를 혼합하는 순서로는 특별히 한정되지 않지만, 제1 시약 및 제2 시약을 혼합하고, 그 다음에 생체 시료를 혼합하는 것이 바람직하다.

상기 시약 또는 시약 키트와 생체 시료의 혼합은 시약에 따라 적절히 설정할 수 있다. 예를 들면 20~40℃의 온도 및 3~30초간의 반응시간으로부터 선택할 수 있다. 반응 온도가 높을 때는 반응 시간을 짧게 하고, 반응 온도가 낮을 때는 반응 시간을 길게 할 수 있다.

상기 분석에 플로우 사이토미터를 이용하는 경우, 플로우 셀 안을 흐르는 측정 시료 중의 혈구에 빛을 조사하고 산란광이나 형광 등의 광학적 정보를 취득하여, 이에 기초하여 혈구의 종류 및 수를 측정할 수 있다.

구체적으로는 상기 분석은 도 1에 나타내는 플로우 사이토미터를 이용하여 실시할 수 있다. 이하, 도 1에 기초하여 본 실시 형태의 일례로서 골수아구의 측정에 대하여 상술한다.

노즐 (6)로부터 토출된 측정용 시료는 플로우 셀 (23)의 오리피스부를 흐른다. 이때, 시료 중의 혈구는 일렬이 되어 오리피스부를 통과한다. 광원 (21)으로부터 사출한 빛은 콜메이트 렌즈 (22)를 통해 플로우 셀 (23)을 흐르는 혈구에 조사된다. 혈구에 빛을 조사함으로써 측방 산란광, 측방 형광 및 전방 산란광이 생긴다. 측방 산란광은 집광렌즈 (27)와 다이크로익 미러 (28)를 통해 측방 산란광 검출기(포트멀티플라이어 튜브) (29)에 입사한다. 측방 형광은 집광렌즈 (27)와 다이크로익 미러 (28)와 필터 (28')와 핀홀판 (30)을 통해 측방 형광 검출기(포트멀티플라이어 튜브) (31)에 입사한다. 전방 산란광은 집광렌즈 (24)와 핀홀판 (25)을 통해 전방 산란광 검출기(포토 다이오드) (26)에 입사한다.

전방 산란광 검출기 (26)로부터 출력되는 전방 산란광 신호와 측방 산란광 검출기 (29)로부터 출력되는 측방 산란광 신호와 측방 형광 검출기 (31)로부터 출력되는 측방 형광 신호는 각각 앰프 (32), 앰프 (33) 및 앰프 (34)에 의해 증폭되어 해석부 (35)에 입력된다.

해석부 (35)는 수신한 전방 산란광 신호, 측방 산란광 신호 및 측방 형광 신호로부터 전방 산란광 강도, 측방 산란광 강도 및 형광 강도를 산출한다. 해석부 (35)는 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 제1 이차원 분포도를 작성하고, 이 이차원 분포도상에서 시료 중의 전(全)백혈구가 출현하는 영역(전백혈구 영역)을 특정한다. 또한, 전백혈구 영역에 출현하는 세포에 대하여 측방 산란광 강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 제2 이차원 분포를 작성한다. 이 이차원 분포도상에서 성숙 백혈구가 출현하는 영역(성숙 백혈구 영역), 임파구가 출현하는 영역(임파구 영역), 단구가 출현하는 영역(단구 영역), 과립구가 출현하는 영역(과립구 영역)을 설정한다. 또한, 골수아구가 출현하는 영역(골수아구 영역 1) 및 유약 과립구가 출현하는 영역(유약 과립구 영역)을 특정한다.

다음에, 측방 산란광 강도 및 전방 산란광 강도를 2축으로 하는 제３ 이차원 분포를 작성하고, 이 이차원 분포상에서 골수아구가 출현하는 영역(골수아구 영역 2)을 특정한다. 골수아구 영역 1 및 골수아구 영역 2에 출현하는 세포수를 시료에 포함되는 골수아구 수로서 계수하고, 유약 과립구 영역에 출현하는 세포수를 시료에 포함되는 유약 과립구 수로서 계수한다. 또한, 골수아구는 세포 사이즈가 크고, 단핵이기 때문에 전방 산란광 강도가 강하고, 측방 산란광 강도가 약하다. 또, 상술한 것처럼 거의 염색되지 않기 때문에 형광 강도가 약하다. 유약 과립구는 세포 사이즈가 크고, 핵이 분엽(分葉)하고 있으므로, 전방 산란광 강도 및 측방 산란광 강도가 강하다. 또, 상술한 것처럼 거의 염색되지 않기 때문에 형광 강도가 약하다.

본 발명은 상기 분석용 시약 또는 분석용 시약 키트를 생체 시료와 혼합하는 것을 포함하는 유약 백혈구의 분석 방법도 제공한다.

본 발명의 방법의 바람직한 실시 형태에 있어서, 상기 분석용 시약 중 또는 분석용 시약 키트의 제1 시약과 제2 시약을 혼합한 시약 중의 계면활성제의 농도는 500~15000ppm, 보다 바람직하게는 750~10000ppm, 더욱 바람직하게는 1000~2500ppm이다.

또, 본 발명의 방법의 다른 바람직한 실시 형태에 있어서, 가용화제로서 사르코신산 유도체 또는 그 염을 이용하는 경우, 상기 분석용 시약 중 또는 분석용 시약 키트의 제1 시약과 제2 시약을 혼합한 시약 중의 가용화제의 농도는 100~400ppm이고, 콜산 유도체를 이용하는 경우에는 50~1300ppm이고, 메틸 글루칸 아미드를 이용하는 경우에는 500~1100ppm이다.

이러한 바람직한 실시 형태에 의하여, 생체 시료 중의 호염기구와 골수아구의 변별을 보다 명확하게 실시할 수 있다.

도 1은 본 발명의 시약 또는 시약 키트를 이용하여 유약 백혈구의 분석을 실시할 때에 이용할 수 있는 플로우 사이토미터의 일례를 나타내는 모식도이다.

도 2는 실시예 1에서 얻어진 스캐터그램을 나타낸다.

도 3은 실시예 2에서 얻어진 스캐터그램을 나타낸다.

도 4는 실시예 3에서 얻어진 스캐터그램을 나타낸다.

도 5는 실시예 4에서 얻어진 스캐터그램을 나타낸다.

도 6은 실시예 5에서 얻어진 스캐터그램을 나타낸다.

도 7은 실시예 6에서 얻어진 스캐터그램을 나타낸다.

도 8은 실시예 7에서 얻어진 스캐터그램을 나타낸다.

도 9는 실시예 8에서 얻어진 스캐터그램을 나타낸다.

도 10은 실시예 9에서 얻어진 스캐터그램을 나타낸다.

도 11은 실시예 10에서 얻어진 스캐터그램을 나타낸다.

부호의 설명

6 노즐

21 광원

22 콜 메이트 렌즈

23 플로우 셀

24 집광렌즈

25 핀홀판

26 전방 산란광 검출기

27 집광렌즈

28 다이크로익 미러(dichroic mirror)

28' 필터

29 측방 산란광 검출기

30 핀홀판

31 측방 형광 검출기

32, 33, 34 앰프

35 해석부

이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

(실시예 1)

이하의 조성의 제1 시약 및 제2 시약을 조제했다.

<제1 시약>

폴리옥시 에틸렌(20) 올레일 에테르(닛코 케미컬즈) 2000ppm

N-라우로일사르코신산 나트륨(시판품) 125ppm

MOPSO(시판품) 10mM

정제수 1L

상기 각 성분을 혼합하고 추가로 NaOH를 첨가하여 pH를 7.0으로 조정했다.

제1 시약의 침투압은 20 mOsm/kg, 전기 전도도는 0.78 mS/cm였다.

<제2 시약>

핵산 염색 색소 50ppm

에틸렌 글리콜 1L

색소를 에틸렌 글리콜에 용해하여 제2 시약을 조제했다. 또한, 핵산 염색 색소는 상기 색소 C를 이용했다.

제1 시약 980㎕, 제2 시약 20㎕ 및 건강한 정상인으로부터 채취한 혈액 시료(호염기구 비율 2.1%, 골수아구는 포함하지 않음) 20㎕를 혼합하고, 35℃에서 19초간 반응시켜 측정용 시료를 얻었다. 얻어진 측정용 시료를 이용하여 도 1에 나타내는 플로우 사이토미터로 측방 산란광 강도, 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 측정했다. 또한, 광원은 적색 반도체 레이저를 이용했다.

얻어진 전방 산란광 강도 및 형광 강도에 기초하여 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 제1 이차원 분포도(스캐터그램)를 작성했다. 이 제1 이차원 분포도에 기초하여 전백혈구 영역을 특정했다. 특정한 전백혈구 영역에 출현하는 세포수를 시료에 포함되는 전백혈구 수로서 계수했다. 얻어진 스캐터그램을 도 2(1)에 나타낸다. 특정한 전백혈구 영역에 출현한 세포를 대상으로 하여, 측방 산란광 강도 및 형광 강도를 2축으로 하는 제2 이차원 분포도(스캐터그램)와 측방 산란광 강도 및 전방 산란광 강도를 2축으로 하는 제３ 이차원 분포도(스캐터그램)를 작성했다. 제2 이차원 분포도상에서 골수아구 영역 1을 설정하고, 제３ 이차원 분포도상에서 골수아구 영역 2를 설정했다. 얻어진 스캐터그램을 도 2(2) 및 도 2(3)에 나타낸다. 그리고 설정한 골수아구 영역 1 및 골수아구 영역 2에 출현하는 세포수를 시료에 포함되는 골수아구 수로서 계수했다. 얻어진 스캐터그램을 도 2(4)에 나타낸다.

도 2(1), (2), (3), (4)로부터 분명한 바와 같이, 건강한 정상인으로부터의 혈액 시료에는 골수아구는 포함되지 않기 때문에 스캐터그램의 골수아구가 출현할 가능성이 있는 영역에는 시그널이 존재하지 않고, 또 용혈한 적혈구에 의한 시그널도 출현하지 않는다. 또한 호염기구도 다른 성숙 백혈구와 마찬가지로 염색되므로, 골수아구 영역에는 출현하지 않는다.

전백혈구수에 대한 골수아구의 비율(골수아구 비율=골수아구/전백혈구수×100)을 산출했는데, 0%였다. 또한, 육안으로 확인한 골수아구 비율도 0%였다.

(실시예 2)

이하의 조성의 제1 시약을 조제했다.

<제1 시약>

폴리옥시 에틸렌(20) 올레일 에테르(닛코 케미칼즈) 1500ppm

N-라우로일사르코신산 나트륨(시판품) 225ppm

MOPS(시판품) 10mM

정제수 1L

상기 각 성분을 혼합하고, 또한 NaOH를 첨가하여 pH를 7.25로 조정했다. 제1 시약의 침투압은 20 mOsm/kg, 전기 전도도는 0.78 mS/cm였다.

실시예 1에서 이용한 제1 시약에 대신하여 상기 제1 시약을 이용한 것 이외 에는 실시예 1과 마찬가지로 하고, 건강한 정상인으로부터의 혈액 시료에 대해 분석을 실시하였다.

얻어진 스캐터그램을 도 3(1), (2), (3), (4)에 나타낸다.

도 3(1), (2), (3), (4)로부터 분명한 바와 같이, 건강한 정상인으로부터의 혈액 시료에는 골수아구는 포함되지 않기 때문에 스캐터그램의 골수아구가 출현할 가능성이 있는 영역에는 시그널이 존재하지 않고, 또 용혈한 적혈구에 의한 시그널도 출현하지 않는다. 또한 호염기구도 다른 성숙 백혈구와 마찬가지로 염색되기 때문에 골수아구 영역에는 출현하지 않는다.

전백혈구수에 대한 골수아구의 비율(골수아구 비율=골수아구/전백혈구수×100)은 0%였다. 또한, 육안으로 확인한 골수아구 비율도 0%였다.

(실시예 3)

건강한 정상인으로부터 채취한 혈액 시료 대신에, 급성 골수성 백혈병의 환자로부터 채취한 골수아구를 포함하는 혈액 시료를 이용한 것 이외에는 실시예 1과 같이 하고 분석을 실시하여, 측방 산란광 강도, 전방 산란광 강도 및 형광 강도를 측정했다.

얻어진 스캐터그램을 도 4(1), (2), (3), (4)에 나타낸다.

도 4(1), (2), (3), (4)의 스캐터그램에 기초하여 전백혈구수에 대한 골수아구의 비율을 구했는데 1.2%였다. 또한, 같은 혈액 시료의 골수아구 비율을 육안으로 계수했는데 4.0%였다.

(실시예 4~9)

이하의 조성의 제1 시약 및 제2 시약을 조제했다.

[표 1]

제1 시약 980㎕, 제2 시약 20㎕ 및 이하의 어느 한 혈액 시료 20㎕를 혼합하고, 35℃에서 13초간(실시예 4 및 11은 17.5초간) 반응시켜 측정용 시료를 얻고, 실시예 1~3과 마찬가지로 하여 스캐터그램을 제작하였다.

혈액 시료로는 골수아구를 포함하는 백혈병 환자의 혈액(이하, 「골수아구 샘플」이라고도 한다) 또는 골수아구를 포함하지 않는 다발성 골수종 환자의 혈액(적혈구가 용혈 불량을 일으키고 있다)(이하, 「용혈 불량 샘플」이라고도 한다)을 이용했다.

얻어진 스캐터그램을 도 5~11에 나타낸다. 도 5~11의 각 도에 있어서, (A)는 골수아구 샘플을 혈액 시료로서 이용했을 경우의 스캐터그램을 나타내고, (B)는 용혈 불량 샘플을 혈액 시료로서 이용했을 경우의 스캐터그램을 나타낸다. 통상, 골수아구는 스캐터그램의 「BL」영역에서 검출된다.

도 5~11의 스캐터그램의 횡축은 측방 산란광 강도, 세로축은 형광 강도를 나타낸다. 또, 「Ly」는 임파구가 출현하는 구획을, 「Mo」는 단구가 출현하는 구획을, 「Gran」은 과립구가 출현하는 구획을 「IG」는 유약 과립구가 출현하는 구획을 표시한다.

이러한 스캐터그램에 기초하여 전백혈구수에 대한 골수아구의 비율을 산출하여, 「BL 영역」으로서 도 6~11 중에 나타낸다.

도 5~11의 결과로부터, 본 발명의 분석용 시약을 이용하여 측정을 실시하면 골수아구 샘플에서 골수아구가 검출되고, 용혈 불량 샘플에서는 골수아구 비율이 매우 낮은 값인 것을 알 수 있다. 또, 용혈 불량 샘플의 측정에 있어서, 종래의 시약을 이용했을 경우에 검출되는 적혈구 고스트가 거의 검출되지 않았다. 따라서, 본 발명의 시약을 이용하면 용혈 불량 샘플의 경우에도 골수아구가 잘못 검출되는 일이 없기 때문에 정확한 측정 결과를 얻을 수 있다. 또, 적혈구 고스트가 검출되었을 경우에서도 골수아구 영역과 적혈구 고스트 영역이 스캐터그램 상에서 중복되지 않았다(도시하지 않음). 즉, 본 발명의 분석용 시약을 이용하면 다발성 골수종과 같은 질환의 환자로부터의 혈액에서도 스캐터그램상에서 적혈구 고스트가 골수아구의 영역에 출현하지 않기 때문에 골수아구를 적혈구 고스트로부터 명확하게 구별하여 유약 백혈구를 정확하게 측정할 수 있는 것을 알 수 있다.

본 출원은 2007년 6월 25일에 출원된 일본 특허 출원 특원 2007-166609호 및 2008년 3월 27일에 출원된 일본 특허 출원 특원 2008-84137호와 관련하여, 이들의 특허 청구의 범위, 명세서, 도면 및 요약서 모두는 본 명세서 중에 참조로서 도입 된다.

Claims

적혈구 및 성숙 백혈구의 세포막에 손상을 주는 계면활성제와,

손상된 혈구를 수축시키는 가용화제와,

핵산 염색 색소를 포함하고,

침투압이 20 mOsm/kg 이상 100 mOsm/kg 이하인 유약 백혈구 분석용 시약.
청구항 1에 있어서,

상기 계면활성제의 분석용 시약 중의 농도가 500~15000ppm인 분석용 시약.
청구항 1에 있어서,

상기 계면활성제가 폴리옥시 에틸렌계 비이온 계면활성제인 분석용 시약.
청구항 3에 있어서,

상기 폴리옥시 에틸렌계 비이온 계면활성제가 이하의 식 (I):

(식 중, R¹은 탄소수 9~25인 알킬기, 알케닐기 또는 알키닐기이고, R²는 -O-, -COO- 또는

이고, n은 10~40의 정수이다)로 나타내는 폴리옥시 에틸렌계 비이온 계면활성제인 분석용 시약.
청구항 3에 있어서,

상기 폴리옥시 에틸렌계 비이온 계면활성제가 폴리옥시 에틸렌 올레일 에테르인 분석용 시약.
청구항 5에 있어서,

상기 폴리옥시 에틸렌 올레일 에테르가, n이 15~20인 식 (I)을 갖는 폴리옥시 에틸렌 올레일 에테르인 분석용 시약.
청구항 1에 있어서,

상기 가용화제가 사르코신 유도체, 콜산 유도체 및 메틸 글루칸 아미드로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 분석용 시약.
청구항 1에 있어서,

상기 가용화제의 분석용 시약 중의 농도가 가용화제가 사르코신 유도체인 경 우에 100~400ppm이고, 콜산 유도체인 경우에 50~1300ppm이고, 메틸 글루칸 아미드인 경우에 500~1100ppm인 분석용 시약.
청구항 1에 있어서,

상기 핵산 염색 색소가

(1) 이하의 식 (II):

(식 중, R₁ 및 R₂는 탄소수 1~6인 직쇄 또는 분지의 알킬기이고; n은 1 또는 2이고; X^-는 음이온이며; Z는 황 원자, 산소 원자 또는 탄소수 1~6인 직쇄 또는 분지의 알킬기로 치환된 탄소 원자이다)로 나타내는 색소;

(2) 이하의 식 (III)

(식 중, R₁ 및 R₂는 탄소수 1~6인 직쇄 또는 분지의 알킬기이고; n은 1 또는 2이며; X^-는 음이온이다)로 나타내는 색소;

(3) 이하의 식 (IV)

(식 중, R₁은 수소 원자 또는 탄소수 1~6인 직쇄 또는 분지의 알킬기이고; R₂ 및 R₃는 수소 원자, 탄소수 1~6인 직쇄 또는 분지의 알킬기 또는 탄소수 1~6인 알콕시기이고; R₄는 수소 원자, 아실기 또는 탄소수 1~6인 직쇄 또는 분지의 알킬기이며; R₅는 수소 원자 또는 치환되어 있어도 되는 탄소수 1~6인 직쇄 또는 분지의 알킬기이고; Z는 황 원자, 산소 원자 또는 탄소수 1~6인 직쇄 또는 분지의 알킬기로 치환된 탄소 원자이고; n은 1 또는 2이며; X^-는 음이온이다)로 나타내는 색소;

(4) 이하의 식 (V)

(식 중, X₁ 및 X₂는 독립적으로 Cl 또는 I이다)로 나타내는 색소;

(5) 이하의 식 (VI)

로 나타내는 색소;

(6) 이하의 식 (VII)

로 나타내는 색소;

(7) 이하의 식 (VIII)

로 나타내는 색소;

(8) 이하의 식 (IX)

로 나타내는 색소;

(9) 이하의 식 (X)

로 나타내는 색소;

(10) 프로피듐아이오다이드 또는 에티듐브로마이드;

(11) 에티듐-아크리딘헤테로다이머, 에티듐디아지드, 에티듐호모다이머-1, 에티듐호모다이머-2, 에티듐모노아지드, 트리메틸렌비스[[3-[[4-[[(3-메틸벤조티아졸-3-이움)-2-일]메틸렌]-1,4-디히드로퀴놀린]-1-일]프로필]디메틸아미늄]ㆍ테트라요디드(TOTO-1), 4-[(3-메틸벤조티아졸-2(3H)-이리덴)메틸]-1-[3-(트리메틸아미니오)프로필]퀴놀리늄ㆍ디요디드(TO-PRO-1), N,N,N',N'-테트라메틸-N,N'-비스[3-[4-[3-[(3-메틸벤조티아졸-3-이움)-2-일]-2-프로페닐리덴]-1,4-디히드로퀴놀린-1-일]프로필]-1,3-프로판디아미늄ㆍ테트라요디드(TOTO-3) 또는 2-[3-[[1-[3-(트리메틸아미니오)프로필]-1,4-디히드로퀴놀린]-4-이리덴]-1-프로페닐]-3-메틸벤조티아졸-3-이움ㆍ디요디드(TO-PRO-3)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 분석용 시약.
청구항 1에 있어서,

pH가 5.0~9.0인 분석용 시약.
적혈구 및 성숙 백혈구의 세포막에 손상을 주는 계면활성제와 손상된 혈구를 수축시키는 가용화제를 포함하고, 침투압이 20 mOsm/kg 이상 100 mOsm/kg 이하인 제1 시약, 및

핵산 염색 색소를 포함하는 제2 시약을 포함하는 유약 백혈구 분석용 시약 키트.
청구항 11에 있어서,

상기 계면활성제가 폴리옥시 에틸렌계 비이온 계면활성제인 분석용 시약 키트.
적혈구 및 성숙 백혈구의 세포막에 손상을 주는 계면활성제와 손상된 혈구를 수축시키는 가용화제와 핵산 염색 색소를 포함하고, 침투압이 20 mOsm/kg 이상 100 mOsm/kg 이하인 유약 백혈구 분석용 시약과, 유약 백혈구를 포함할 수 있는 생체 시료를 혼합하여 성숙 백혈구의 핵산을 염색하는 공정, 및

상기 공정에서 처리한 유약 백혈구 중 적어도 1개의 산란광과 적어도 1개의 형광을 측정하여 그 강도 차이에 의해서 유약 백혈구를 분류하는 방법.