JP4324552B2 - 白血球の分類計数方法 - Google Patents
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Description
本発明は白血球の分類計数方法に関する。より詳細には、フローサイトメータを利用した血液学的試料の白血球、ことにＤＮＡ量異常白血球の分類計数方法に関する。
臨床検査の分野において、ＤＮＡ量異常白血球や幼若白血球の分類計数を行うことにより、疾患の診断を行う上で極めて有用な情報を得ることができる。例えば、通常、正常な末梢血中の白血球には、リンパ球、単球、好塩基球、好酸球、好中球の５つが存在し、そのＤＮＡ量は一定である。しかし、例えば、ウィルス疾患やリンパ系白血病などの血液疾患ではＤＮＡ量異常白血球が出現し、骨髄系白血病などの血液疾患では幼若白血球が出現する。
従来、ＤＮＡ量異常白血球を測定するには、比重遠心分離により白血球から分離した単核球（リンパ球および単球）または末梢血などと核酸染色色素と溶血剤とを混合して染色した後に、測定する必要があった。比重遠心分離による単核球分離は、操作が煩雑であるため、分離が完了するまでに１時間以上要する。さらに単核球または末梢血を核酸染色色素および溶血剤と混合し染色するのに３０分以上要する。
また幼若白血球を分類計数するには、血液の塗沫標本を作製し、適当な染色を施した後に顕微鏡で観察しながら、分類計数するのが一般的であった。一方、近年、フローサイトメータの原理を応用した種々の全自動血球分類計数装置が提供されている。しかしながら、これらの装置は、正常な白血球を高精度に分類計数することができるが、血小板凝集や同時通過細胞などの影響を大きく受け、幼若白血球を確実に検出し、分類することはできなかった。
一方、幼若白血球を生きた状態に保持し、その他の白血球に損傷を与える溶血剤で処理した後に、損傷を受けた細胞を染色できる蛍光色素で染色し、得られた血球の散乱光と蛍光を測定することにより、幼若白血球と正常白血球を同時に、分類計数できることが報告されている（特開平１０−２０６４２３号）。しかしこの方法では、ＤＮＡ量異常白血球と血小板凝集および同時通過細胞を分別することができず、ＤＮＡ量異常白血球を正確に分類計数することができなかった。
したがって、ＤＮＡ量異常白血球、さらに同時に幼若白血球を測定するための迅速、簡便かつ高精度に測定可能な方法が望まれている。
従来、ＤＮＡ量異常白血球を測定するには、比重遠心分離により白血球から分離した単核球（リンパ球および単球）または末梢血などと核酸染色色素と溶血剤とを混合して染色した後に、測定する必要があった。比重遠心分離による単核球分離は、操作が煩雑であるため、分離が完了するまでに１時間以上要する。さらに単核球または末梢血を核酸染色色素および溶血剤と混合し染色するのに３０分以上要する。
また幼若白血球を分類計数するには、血液の塗沫標本を作製し、適当な染色を施した後に顕微鏡で観察しながら、分類計数するのが一般的であった。一方、近年、フローサイトメータの原理を応用した種々の全自動血球分類計数装置が提供されている。しかしながら、これらの装置は、正常な白血球を高精度に分類計数することができるが、血小板凝集や同時通過細胞などの影響を大きく受け、幼若白血球を確実に検出し、分類することはできなかった。
一方、幼若白血球を生きた状態に保持し、その他の白血球に損傷を与える溶血剤で処理した後に、損傷を受けた細胞を染色できる蛍光色素で染色し、得られた血球の散乱光と蛍光を測定することにより、幼若白血球と正常白血球を同時に、分類計数できることが報告されている（特開平１０−２０６４２３号）。しかしこの方法では、ＤＮＡ量異常白血球と血小板凝集および同時通過細胞を分別することができず、ＤＮＡ量異常白血球を正確に分類計数することができなかった。
したがって、ＤＮＡ量異常白血球、さらに同時に幼若白血球を測定するための迅速、簡便かつ高精度に測定可能な方法が望まれている。
本発明によれば、幼若白血球を生きた状態に保持し、その他の白血球に損傷を与える溶血剤で処理した後に、損傷を受けた細胞を染色できる蛍光色素で染色し、得られた血球の散乱光と蛍光を測定し、散乱光ピークの強度差と散乱光幅の差を用いることにより、ＤＮＡ量異常白血球、さらに同時に幼若白血球および成熟白血球を分類計数することが可能な方法を提供する。
従って、本発明によれば、
（１）血液学的試料を溶血剤で処理して得られた試料中の細胞を、少なくとも成熟白血球、ＤＮＡ量異常白血球および幼若白血球との間に蛍光強度の差異を生じうる蛍光色素で染色する工程、
（２）染色された細胞を含む試料をフローサイトメータに導入して、各細胞について、散乱光と、蛍光とを測定する工程、
（３）散乱光ピークの強度差と散乱光幅の差を利用して、同時通過細胞および血小板凝集と、白血球とを分類する工程、
（４）工程（３）で分類された白血球について散乱光の強度差と蛍光の強度差を利用して、成熟白血球、ＤＮＡ量異常白血球および幼若白血球を分類計数する工程
からなる白血球の分類計数方法が提供される。
本発明でいう血液学的試料は、末梢血液、骨髄穿刺液、尿等で採取した試料など、白血球を含む体液試料をいう。
本発明でいう成熟白血球とは、成熟したリンパ球、単球、顆粒球のことをいう。
ＤＮＡ量異常白血球とは、通常のＤＮＡ量より多い、または少ないＤＮＡ量をもった白血球のことをいう。ただし、本発明においては、ＤＮＡ量異常白血球とは、通常のＤＮＡ量より多いＤＮＡ量をもった白血球のことを指す。
本発明でいう幼若白血球とは、通常骨髄に存在し、末梢血に出現しない未成熟な白血球をいう。例えば、骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球などをいう。前骨髄球、骨髄球、後骨髄球については、まとめて顆粒球系幼若球とすることもある。さらには、芽球以前の分化段階の細胞である、骨髄系幹細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＮ）、好中球・マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、好酸球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＥＯＳ）等の白血球系の造血前駆細胞も本発明の幼若白血球の範囲に含む。
本発明でいう血小板凝集とは、血小板が２個以上凝集したものをいう。
本発明でいう同時通過細胞とは、２個以上の細胞がほぼ同時にフローセルの検出域を通過し、１つの細胞として計数される状態をいう。
本発明でいう散乱光ピークとは、散乱光から得られる信号波形のピークであり、散乱光幅とは、散乱光から得られる信号波形の幅をいう。
本発明では、血液学的試料を溶血剤で処理し、赤血球を溶解させる。一方、この処理により、幼若球白血球は溶解も損傷もせず、成熟白血球及びＤＮＡ量異常白血球は損傷される。特定の組成の溶血剤を細胞に作用させた場合、作用機序は明確ではないが、特定の細胞の細胞膜脂質構成成分の一部を抽出（引き抜く）することにより、細胞膜に特定の物質が通過できるだけの細孔をあける。これを損傷と呼ぶ。この結果、特定の細胞内に色素分子が入り込み染色することができる。従って、損傷を与えられた成熟白血球およびＤＮＡ量異常白血球は、染色に好適な状態である。一方、損傷をうけない幼若白血球は、色素の透過を可能とするだけの細孔があけられないために、色素で染色されない。さらに成熟白血球及びＤＮＡ量異常白血球は、細胞に含まれるＤＮＡ量によって色素の結合量が異なっている。従って、そのような細胞を色素で染色すると、ＤＮＡ量に応じて染色される色素の量が異なり、染色された細胞の蛍光強度が異なる。例えば、ＤＮＡ量が成熟白血球の２倍量のＤＮＡ量異常白血球の場合、結合する色素の量は正常な成熟白血球の２倍となり、この細胞は成熟白血球より強い蛍光を発する。この結果、成熟白血球、ＤＮＡ量異常白血球および幼若白血球との間に蛍光強度の差異が生じうる。
本発明の工程（１）で用いる溶血剤は、界面活性剤、可溶化剤、アミノ酸および緩衝液とからなるのが好ましい。
界面活性剤としては種々のものを使用できるが、ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤が好ましい。具体的には、以下の式（ＩＩ）：
（式中、Ｒ１ＩＩはＣ９−２５のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基；Ｒ２ＩＩは、−Ｏ−、
または−ＣＯＯ−；ｎＩＩは１０〜４０である。）を有するものを用いることができる。
Ｃ９−２５のアルキル基としては、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル等が挙げられる。Ｃ９−２５のアルケニル基としては、ドデセニル、テトラデセニル等が挙げられる。Ｃ９−２５のアルキニル基としては、ドデシニル、ウンデシニル、ドデシニル等が挙げられる。
さらに具体的には、ポリオキシエチレン（２０）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテルが好適である。
界面活性剤は水溶液の形態で用いることができる。例えばポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤の水中濃度については、使用する界面活性剤の種類によって異なるが、前述のポリオキシエチレン（２０）ラウリルエーテルでは、０．１〜２．０ｇ／ｌ（好ましくは０．５〜１．５ｇ／ｌ）、ポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテルでは、１〜９ｇ／ｌ（好ましくは３〜７ｇ／ｌ）、ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテルでは、５〜５０ｇ／ｌ（好ましくは１５〜３５ｇ／ｌ）の範囲で使用できる。ポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤は、疎水性基の炭素数が同じであれば、ｎＩＩの数が小さくなるほど細胞を損傷する力が強く、ｎＩＩが大きくなるほど弱くなる。また、ｎＩＩの数が同じであれば、疎水性基の炭素数が小さくなるにつれて細胞を損傷する力が強くなる。その点を考慮し、上記の値を目安にして、必要な界面活性剤濃度は実験により簡単に求めることができる。
可溶化剤は、血球の細胞膜に損傷を与え、縮小化するために用いる。具体的には、以下：
式（ＩＩＩ）：
（式中、Ｒ１ＩＩＩはＣ１０−２２のアルキル基；ｎＩＩＩは１〜５である。）
のサルコシン誘導体あるいはその塩、
式（ＩＶ）：
（式中、Ｒ１ＩＶは水素原子または水酸基。）
のコール酸誘導体、および
式（Ｖ）：
（式中、ｎＶは５〜７である。）
メチルグルカンアミドから選択される１またはそれ以上を用いることができる。
Ｃ１０−２２のアルキル基としては、デシル、ドデシル、テトラデシル、オレイル等が挙げられる。
具体的には、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、ラウロイルメチルβ−アラニンナトリウム、ラウロイルサルコシン、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、ＣＨＡＰＳＯ（［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）、ＭＥＧＡ８（オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド）、ＭＥＧＡ９（ノナイノイル−Ｎ−メチルグルカミド）、ＭＥＧＡ１０（デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド）等が好適に使用できる。
可溶化剤の濃度は、サルコシン酸誘導体あるいはその塩では、０．２〜２．０ｇ／Ｌ、コール酸誘導体では、０．１〜０．５ｇ／Ｌ、メチルグルカンアミドでは、１．０〜８．０ｇ／Ｌが好ましい。
その他に、可溶化剤としては、ｎ−オクチルβ−グルコシド、シュークロースモノカプレートやＮ−ホルミルメチルロイシルアラニン等が使用でき、０．０１〜５０．０ｇ／Ｌの濃度で用いるのが好ましい。
また、アミノ酸は、幼若白血球の細胞質および細胞膜を固定化するために用いる。例えば、タンパク質を構成するアミノ酸を使用でき、グルタミン酸、バリンや、特にメチオニン、シスチン及びシステイン等のような含硫アミノ酸が好適であり、メチオニンが最も好適である。アミノ酸は、１〜５０ｇ／ｌの範囲で使用でき、グルタミン酸の場合は８〜１２ｇ／ｌが好適であり、メチオニンの場合には、１６〜２４ｇ／ｌが好適である。
緩衝液は、ＨＥＰＥＳ等のＧｏｏｄ緩衝液やリン酸緩衝液等に水酸化ナトリウム等のようなｐＨ調整剤を加え、必要があれば、塩化ナトリウムのような浸透圧調整剤をさらに加え、ｐＨを５．０〜９．０、浸透圧を１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇとするのが好ましい。
本発明の溶血剤としては、（１）ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤；（２）血球の細胞膜に損傷を与え縮小化するための可溶化剤；（３）アミノ酸；および（４）液のｐＨを５．０〜９．０、浸透圧を１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇにする緩衝液、電気伝導度を６．０〜９．０ｍＳ／ｃｍにするための緩衝液からなる、特開平６−２７３４１３号に記載の溶血剤が好ましい。
本発明の成熟白血球、ＤＮＡ量異常白血球および幼若白血球との間に蛍光強度の差異を生じうる蛍光色素は、損傷を与えた細胞または幼若白血球のうちいずれか一方を染色できるものであればよい。損傷を与えた細胞を染色する色素が好ましい。このような蛍光色素は、試料中の血球を含む細胞すべてを染色することができる。
損傷を与えた細胞を染色する色素とは、細胞核、特にＤＮＡに対して特異性を有する色素あるいはＲＮＡに特異性を有する色素が挙げられる。この目的には、いくつかのカチオン性色素が好適である。
一般的にカチオン性色素は、生きた細胞の細胞膜を通過し、細胞内構成成分を染色する。しかしながら、特定のカチオン性色素（例えば、エチジウムブロマイド、プロピジウムアイオダイド等）は、生細胞を通過せず、損傷細胞のみを染色することがよく知られている。
蛍光色素は、具体的には、前述のエチジウムブロマイド、プロピジウムアイオダイド、さらにモレキュラープローブ社より販売されているエチジウム−アクリジンヘテロダイマー、エチジウムアジド、エチジウムホモダイマー−１、エチジウムホモダイマー−２、エチジウムモノアジド、ＴＯＴＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯＴＯ−３、
ＴＯ−ＰＲＯ−３等が挙げられる。さらに光源としてＨｅ−Ｎｅ、赤色半導体レーザを使用する場合に好適な色素として、式（Ｉ）：
（式中、Ｒ１Ｉ水素原子または低級アルキル基；Ｒ２Ｉ及びＲ３Ｉは水素原子、低級アルキル基または低級アルコキシ基；Ｒ４Ｉは水素原子、アシル基または低級アルキル基；Ｒ５Ｉは水素原子または置換されても低級アルキル基；Ｚは硫黄原子、酸素原子または低級アルキル基で置換された炭素原子；ｎＩは１または２；ＸＩ−はアニオンである。）で示される色素が使用できる。
上記構造式のＲ１Ｉおける低級アルキル基は、Ｃ１−６の直鎖または分岐のアルキル基を意味し、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル基が挙げられ、中でもメチル基、エチル基が好ましい。
Ｒ２Ｉ及びＲ３Ｉにおける低級アルキル基は上記と同様であり、低級アルコキシ基としては、Ｃ１−６のアルコキシ基を意味し、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ等が挙げられ、中でもメトキシ基、エトキシ基が好ましい。
Ｒ４Ｉにおけるアシル基は、脂肪族カルボン酸から誘導されたアシル基が好ましく、例えば、アセチル、プロピオニル等が挙げられ、中でもアセチル基が好ましい。また、低級アルキル基は上記と同様である。
Ｒ５Ｉにおける低級アルキル基は上記と同様であり、置換されてもよい低級アルキル基とは、１〜３個の水酸基、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素またはヨウ素）等で置換されてもよい低級アルキル基を意味し、中でも１個の水酸基で置換されたメチル基、エチル基が好ましい。
Ｚにおける低級アルキル基とは上記と同様であり、Ｚとしては硫黄原子が好ましい。
ＸＩ−におけるアニオンは、ハロゲンイオン（フッ素、塩素、臭素またはヨウ素イオン）、ハロゲン化ホウ素イオン（ＢＦ４ −、ＢＣｌ４ −、ＢＢｒ４ −等）、リン化合物イオン、ハロゲン酸素酸イオン、フルオロ硫酸イオン、メチル硫酸イオン、芳香環にハロゲンあるいはハロゲンをもつアルキル基を置換基として有するテトラフェニルホウ素化合物イオン等が挙げられる。中でも臭素イオンまたはＢＦ４ −が好ましい。
上記色素としては単独または２以上を組み合わせて用いることができる。上記色素の具体的な例としては、好ましくは以下のような色素が挙げられるが、これにより本発明が制限されるものではない。
工程（Ｉ）の好ましい態様は、溶血剤と蛍光色素を含む溶液と血液学的試料を混合するものである。あるいは、蛍光色素をエチレングリコール等の水溶性有機溶媒に溶解しておき、使用時に溶血剤と混合してもよい。この場合、色素の保存安定性を高めることができるので好ましい。色素濃度は、使用する色素に応じて適宜決定できる。例えば、エチジウムブロマイドの場合、０．０１〜１００ｍｇ／ｌ、好ましくは、０．１〜３０ｍｇ／ｌが使用できる。
血液学的試料と蛍光色素を含む溶血剤の混合は、血液学的試料と、蛍光色素を含む溶血剤の比が１：１０〜１：１０００、反応温度が２０〜４０℃、反応時間が５秒〜５分間で好適に実施できる。反応温度が高いときは反応時間を短くすることが好ましい。本発明において、幼若白血球を含む試料のＤＮＡ量を測定するには、幼若白血球を染色するために反応時間を長くすることにより可能となる。その場合の反応時間は、例えば１０秒〜５分間程度の反応時間を用いるのが好ましい。
工程（２）において、このようにして調製した測定用試料をフローサイトメータに導入し、試料中の染色された細胞のそれぞれについて、散乱光と蛍光を測定する。
図１８は、本発明に使用できるフローサイトメータの光学系を示す斜視図である。同図においてレーザ２１から出射されたビームはコリメートレンズ２２を介してシースフローセル２３のオリフィス部を照射する。オリフィス部を通過する血球から発せられる前方散乱光は集光レンズ２４とピンホール板２５を介してフォトダイオード２６に入射する。
一方、オリフィス部を通過する血球から発せられる側方散乱光と側方蛍光については、側方散乱光は集光レンズ２７とダイクロイックミラー２８とを介してフォトマルチブライアチューブ（以下、フォトマルという）２９に入射し、側方蛍光は集光レンズ２７とダイクロイックミラー２８とフィルター２９とピンホール板３０を介してフォトマル３１に入射する。
フォトダイオード２６から出力される前方散乱光信号と、フォトマル２９から出力される側方散乱光信号と、フォトマル３１から出力される側方蛍光信号とは、それぞれアンプ３２、３３、３４により増幅され、解析部３５に入力される。
本発明でいう散乱光は、一般に市販されるフローサイトメータで測定できる散乱光を指し、前方低角散乱光（受光角度の例として、０〜５度未満）、前方高角散乱光（受光角度の例として、５〜２０度付近）、側方散乱光等をいい、好ましくは前方低角散乱光およびさらなる散乱光には側方散乱光が選ばれる。側方散乱光は細胞の核形態などのような内部情報を反映する。
蛍光とは、使用する色素によって好適な受光波長が選択される。蛍光信号は、細胞化学的特性を反映するものである。
フローサイトメータの光源は、特に限定されず、色素の励起に好適な波長の光源が選ばれる。例えば、アルゴンレーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザ、赤色半導体レーザ、青色半導体レーザなどが使用される。特に半導体レーザは気体レーザに比べて非常に安価であり、装置コストを大幅に下げることができる。
工程（３）において、散乱光ピークの強度差と散乱光幅の差を用いて、血小板凝集および同時通過細胞と、白血球とを分類する。具体的には、例えば、Ｘ軸に前方散乱光幅、Ｙ軸に前方散乱光ピークをとってスキャッタグラムを作成する。スキャッタグラム中、例えば図１に示すように、血小板凝集および同時通過細胞、ならびに白血球およびゴーストが集団を形成して分布する。このスキャッタグラムのすべての細胞から血小板凝集および同時通過細胞を除いて、血小板凝集および同時通過細胞と、白血球およびゴーストとを分類する。この操作により、血小板凝集および同時通過細胞がＤＮＡ量異常白血球の領域に出現することが防止され、ＤＮＡ量異常白血球を正確に分類計数することが可能になる。
次に、工程（４）において、工程（３）で分類された成分の散乱光の強度差と蛍光の強度差を用いて、成熟白血球、ＤＮＡ量異常白血球および幼若白血球に分類計数する。具体的には、例えば、Ｘ軸に蛍光強度、Ｙ軸に前方散乱光強度をとって、上述の血小板凝集および同時通過細胞を除いた血球成分の集団のみでスキャッタグラムを作成する。スキャッタグラム中、例えば、図２に示すように、成熟白血球、ＤＮＡ量異常細胞および幼若白血球の各集団と赤血球ゴーストが集団を形成して分布する。そして適当な解析ソフトを用いて各集団の領域を設定し、その領域内に含まれる細胞を分類計数する。このようにして、成熟白血球数、幼若白血球数およびＤＮＡ量異常白血球数を得ることができる。
さらに、工程（５）において、ＤＮＡ量異常白血球数と成熟白血球数または幼若白血球数とから、ＤＮＡ量異常白血球に対する成熟白血球または幼若白血球の割合を算出する。
さらに、工程（６）において、成熟白血球数と幼若白血球数とから、成熟白血球に対する幼若白血球の割合を算出する。
さらに、工程（７）において、工程（２）で異なる種類の散乱光をさらに測定し、工程（４）で得られた成熟白血球についての該散乱光と蛍光の強度差を用いてスキャッタグラムを作成する。例えば、Ｘ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に側方散乱光強度をとって、図３に示すようなスキャッタグラムを作成する。スキャッタグラム中、少なくとも３つ、例えばリンパ球、単球および顆粒球が集団を形成して分布する。そして適当な解析ソフトを用いて各集団の領域を設定し、その領域内に含まれる細胞を分類計数する。その結果、リンパ球、単球および顆粒球に分類計数することができる。
さらに、工程（８）において、工程（２）で異なる種類の散乱光をさらに測定し、工程（４）で得られた幼若白血球についての該散乱光と蛍光の強度差を用いてスキャッタグラムを作成する。例えば、Ｘ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に側方散乱光強度をとって、図３に示すようなスキャッタグラムを作成する。スキャッタグラム中、少なくとも２つ、例えば骨髄系芽球および顆粒球系幼若球が集団を形成して分布する。そして適当な解析ソフトを用いて各集団の領域を設定し、その領域内に含まれる細胞を分類計数する。その結果、骨髄系芽球および顆粒球系幼若球に分類計数することができる。
なお、工程（７）と工程（８）は、別々の工程として行っても、同時に行ってもよい。同時に行う際には、工程（４）において、ゴーストを除去した成分の該散乱光の強度差と蛍光の強度差を用いてスキャッタグラムを作成すると、図３に示すようなスキャッタグラムが得られ、一度に、成熟白血球および幼若白血球をさらに複数個の集団に分類計数することができるので、好ましい。
従って、本発明によれば、
（１）血液学的試料を溶血剤で処理して得られた試料中の細胞を、少なくとも成熟白血球、ＤＮＡ量異常白血球および幼若白血球との間に蛍光強度の差異を生じうる蛍光色素で染色する工程、
（２）染色された細胞を含む試料をフローサイトメータに導入して、各細胞について、散乱光と、蛍光とを測定する工程、
（３）散乱光ピークの強度差と散乱光幅の差を利用して、同時通過細胞および血小板凝集と、白血球とを分類する工程、
（４）工程（３）で分類された白血球について散乱光の強度差と蛍光の強度差を利用して、成熟白血球、ＤＮＡ量異常白血球および幼若白血球を分類計数する工程
からなる白血球の分類計数方法が提供される。
本発明でいう血液学的試料は、末梢血液、骨髄穿刺液、尿等で採取した試料など、白血球を含む体液試料をいう。
本発明でいう成熟白血球とは、成熟したリンパ球、単球、顆粒球のことをいう。
ＤＮＡ量異常白血球とは、通常のＤＮＡ量より多い、または少ないＤＮＡ量をもった白血球のことをいう。ただし、本発明においては、ＤＮＡ量異常白血球とは、通常のＤＮＡ量より多いＤＮＡ量をもった白血球のことを指す。
本発明でいう幼若白血球とは、通常骨髄に存在し、末梢血に出現しない未成熟な白血球をいう。例えば、骨髄芽球、前骨髄球、骨髄球、後骨髄球などをいう。前骨髄球、骨髄球、後骨髄球については、まとめて顆粒球系幼若球とすることもある。さらには、芽球以前の分化段階の細胞である、骨髄系幹細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＮ）、好中球・マクロファージコロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）、好酸球コロニー形成細胞（ＣＦＵ−ＥＯＳ）等の白血球系の造血前駆細胞も本発明の幼若白血球の範囲に含む。
本発明でいう血小板凝集とは、血小板が２個以上凝集したものをいう。
本発明でいう同時通過細胞とは、２個以上の細胞がほぼ同時にフローセルの検出域を通過し、１つの細胞として計数される状態をいう。
本発明でいう散乱光ピークとは、散乱光から得られる信号波形のピークであり、散乱光幅とは、散乱光から得られる信号波形の幅をいう。
本発明では、血液学的試料を溶血剤で処理し、赤血球を溶解させる。一方、この処理により、幼若球白血球は溶解も損傷もせず、成熟白血球及びＤＮＡ量異常白血球は損傷される。特定の組成の溶血剤を細胞に作用させた場合、作用機序は明確ではないが、特定の細胞の細胞膜脂質構成成分の一部を抽出（引き抜く）することにより、細胞膜に特定の物質が通過できるだけの細孔をあける。これを損傷と呼ぶ。この結果、特定の細胞内に色素分子が入り込み染色することができる。従って、損傷を与えられた成熟白血球およびＤＮＡ量異常白血球は、染色に好適な状態である。一方、損傷をうけない幼若白血球は、色素の透過を可能とするだけの細孔があけられないために、色素で染色されない。さらに成熟白血球及びＤＮＡ量異常白血球は、細胞に含まれるＤＮＡ量によって色素の結合量が異なっている。従って、そのような細胞を色素で染色すると、ＤＮＡ量に応じて染色される色素の量が異なり、染色された細胞の蛍光強度が異なる。例えば、ＤＮＡ量が成熟白血球の２倍量のＤＮＡ量異常白血球の場合、結合する色素の量は正常な成熟白血球の２倍となり、この細胞は成熟白血球より強い蛍光を発する。この結果、成熟白血球、ＤＮＡ量異常白血球および幼若白血球との間に蛍光強度の差異が生じうる。
本発明の工程（１）で用いる溶血剤は、界面活性剤、可溶化剤、アミノ酸および緩衝液とからなるのが好ましい。
界面活性剤としては種々のものを使用できるが、ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤が好ましい。具体的には、以下の式（ＩＩ）：
Ｃ９−２５のアルキル基としては、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル等が挙げられる。Ｃ９−２５のアルケニル基としては、ドデセニル、テトラデセニル等が挙げられる。Ｃ９−２５のアルキニル基としては、ドデシニル、ウンデシニル、ドデシニル等が挙げられる。
さらに具体的には、ポリオキシエチレン（２０）ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテル、ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテルが好適である。
界面活性剤は水溶液の形態で用いることができる。例えばポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤の水中濃度については、使用する界面活性剤の種類によって異なるが、前述のポリオキシエチレン（２０）ラウリルエーテルでは、０．１〜２．０ｇ／ｌ（好ましくは０．５〜１．５ｇ／ｌ）、ポリオキシエチレン（１５）オレイルエーテルでは、１〜９ｇ／ｌ（好ましくは３〜７ｇ／ｌ）、ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテルでは、５〜５０ｇ／ｌ（好ましくは１５〜３５ｇ／ｌ）の範囲で使用できる。ポリオキシエチレン系ノニオン性界面活性剤は、疎水性基の炭素数が同じであれば、ｎＩＩの数が小さくなるほど細胞を損傷する力が強く、ｎＩＩが大きくなるほど弱くなる。また、ｎＩＩの数が同じであれば、疎水性基の炭素数が小さくなるにつれて細胞を損傷する力が強くなる。その点を考慮し、上記の値を目安にして、必要な界面活性剤濃度は実験により簡単に求めることができる。
可溶化剤は、血球の細胞膜に損傷を与え、縮小化するために用いる。具体的には、以下：
式（ＩＩＩ）：
のサルコシン誘導体あるいはその塩、
式（ＩＶ）：
のコール酸誘導体、および
式（Ｖ）：
メチルグルカンアミドから選択される１またはそれ以上を用いることができる。
Ｃ１０−２２のアルキル基としては、デシル、ドデシル、テトラデシル、オレイル等が挙げられる。
具体的には、Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム、ラウロイルメチルβ−アラニンナトリウム、ラウロイルサルコシン、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、ＣＨＡＰＳＯ（［（３−コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート）、ＭＥＧＡ８（オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド）、ＭＥＧＡ９（ノナイノイル−Ｎ−メチルグルカミド）、ＭＥＧＡ１０（デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド）等が好適に使用できる。
可溶化剤の濃度は、サルコシン酸誘導体あるいはその塩では、０．２〜２．０ｇ／Ｌ、コール酸誘導体では、０．１〜０．５ｇ／Ｌ、メチルグルカンアミドでは、１．０〜８．０ｇ／Ｌが好ましい。
その他に、可溶化剤としては、ｎ−オクチルβ−グルコシド、シュークロースモノカプレートやＮ−ホルミルメチルロイシルアラニン等が使用でき、０．０１〜５０．０ｇ／Ｌの濃度で用いるのが好ましい。
また、アミノ酸は、幼若白血球の細胞質および細胞膜を固定化するために用いる。例えば、タンパク質を構成するアミノ酸を使用でき、グルタミン酸、バリンや、特にメチオニン、シスチン及びシステイン等のような含硫アミノ酸が好適であり、メチオニンが最も好適である。アミノ酸は、１〜５０ｇ／ｌの範囲で使用でき、グルタミン酸の場合は８〜１２ｇ／ｌが好適であり、メチオニンの場合には、１６〜２４ｇ／ｌが好適である。
緩衝液は、ＨＥＰＥＳ等のＧｏｏｄ緩衝液やリン酸緩衝液等に水酸化ナトリウム等のようなｐＨ調整剤を加え、必要があれば、塩化ナトリウムのような浸透圧調整剤をさらに加え、ｐＨを５．０〜９．０、浸透圧を１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇとするのが好ましい。
本発明の溶血剤としては、（１）ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤；（２）血球の細胞膜に損傷を与え縮小化するための可溶化剤；（３）アミノ酸；および（４）液のｐＨを５．０〜９．０、浸透圧を１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇにする緩衝液、電気伝導度を６．０〜９．０ｍＳ／ｃｍにするための緩衝液からなる、特開平６−２７３４１３号に記載の溶血剤が好ましい。
本発明の成熟白血球、ＤＮＡ量異常白血球および幼若白血球との間に蛍光強度の差異を生じうる蛍光色素は、損傷を与えた細胞または幼若白血球のうちいずれか一方を染色できるものであればよい。損傷を与えた細胞を染色する色素が好ましい。このような蛍光色素は、試料中の血球を含む細胞すべてを染色することができる。
損傷を与えた細胞を染色する色素とは、細胞核、特にＤＮＡに対して特異性を有する色素あるいはＲＮＡに特異性を有する色素が挙げられる。この目的には、いくつかのカチオン性色素が好適である。
一般的にカチオン性色素は、生きた細胞の細胞膜を通過し、細胞内構成成分を染色する。しかしながら、特定のカチオン性色素（例えば、エチジウムブロマイド、プロピジウムアイオダイド等）は、生細胞を通過せず、損傷細胞のみを染色することがよく知られている。
蛍光色素は、具体的には、前述のエチジウムブロマイド、プロピジウムアイオダイド、さらにモレキュラープローブ社より販売されているエチジウム−アクリジンヘテロダイマー、エチジウムアジド、エチジウムホモダイマー−１、エチジウムホモダイマー−２、エチジウムモノアジド、ＴＯＴＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯＴＯ−３、
ＴＯ−ＰＲＯ−３等が挙げられる。さらに光源としてＨｅ−Ｎｅ、赤色半導体レーザを使用する場合に好適な色素として、式（Ｉ）：
上記構造式のＲ１Ｉおける低級アルキル基は、Ｃ１−６の直鎖または分岐のアルキル基を意味し、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル基が挙げられ、中でもメチル基、エチル基が好ましい。
Ｒ２Ｉ及びＲ３Ｉにおける低級アルキル基は上記と同様であり、低級アルコキシ基としては、Ｃ１−６のアルコキシ基を意味し、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ等が挙げられ、中でもメトキシ基、エトキシ基が好ましい。
Ｒ４Ｉにおけるアシル基は、脂肪族カルボン酸から誘導されたアシル基が好ましく、例えば、アセチル、プロピオニル等が挙げられ、中でもアセチル基が好ましい。また、低級アルキル基は上記と同様である。
Ｒ５Ｉにおける低級アルキル基は上記と同様であり、置換されてもよい低級アルキル基とは、１〜３個の水酸基、ハロゲン原子（フッ素、塩素、臭素またはヨウ素）等で置換されてもよい低級アルキル基を意味し、中でも１個の水酸基で置換されたメチル基、エチル基が好ましい。
Ｚにおける低級アルキル基とは上記と同様であり、Ｚとしては硫黄原子が好ましい。
ＸＩ−におけるアニオンは、ハロゲンイオン（フッ素、塩素、臭素またはヨウ素イオン）、ハロゲン化ホウ素イオン（ＢＦ４ −、ＢＣｌ４ −、ＢＢｒ４ −等）、リン化合物イオン、ハロゲン酸素酸イオン、フルオロ硫酸イオン、メチル硫酸イオン、芳香環にハロゲンあるいはハロゲンをもつアルキル基を置換基として有するテトラフェニルホウ素化合物イオン等が挙げられる。中でも臭素イオンまたはＢＦ４ −が好ましい。
上記色素としては単独または２以上を組み合わせて用いることができる。上記色素の具体的な例としては、好ましくは以下のような色素が挙げられるが、これにより本発明が制限されるものではない。
血液学的試料と蛍光色素を含む溶血剤の混合は、血液学的試料と、蛍光色素を含む溶血剤の比が１：１０〜１：１０００、反応温度が２０〜４０℃、反応時間が５秒〜５分間で好適に実施できる。反応温度が高いときは反応時間を短くすることが好ましい。本発明において、幼若白血球を含む試料のＤＮＡ量を測定するには、幼若白血球を染色するために反応時間を長くすることにより可能となる。その場合の反応時間は、例えば１０秒〜５分間程度の反応時間を用いるのが好ましい。
工程（２）において、このようにして調製した測定用試料をフローサイトメータに導入し、試料中の染色された細胞のそれぞれについて、散乱光と蛍光を測定する。
図１８は、本発明に使用できるフローサイトメータの光学系を示す斜視図である。同図においてレーザ２１から出射されたビームはコリメートレンズ２２を介してシースフローセル２３のオリフィス部を照射する。オリフィス部を通過する血球から発せられる前方散乱光は集光レンズ２４とピンホール板２５を介してフォトダイオード２６に入射する。
一方、オリフィス部を通過する血球から発せられる側方散乱光と側方蛍光については、側方散乱光は集光レンズ２７とダイクロイックミラー２８とを介してフォトマルチブライアチューブ（以下、フォトマルという）２９に入射し、側方蛍光は集光レンズ２７とダイクロイックミラー２８とフィルター２９とピンホール板３０を介してフォトマル３１に入射する。
フォトダイオード２６から出力される前方散乱光信号と、フォトマル２９から出力される側方散乱光信号と、フォトマル３１から出力される側方蛍光信号とは、それぞれアンプ３２、３３、３４により増幅され、解析部３５に入力される。
本発明でいう散乱光は、一般に市販されるフローサイトメータで測定できる散乱光を指し、前方低角散乱光（受光角度の例として、０〜５度未満）、前方高角散乱光（受光角度の例として、５〜２０度付近）、側方散乱光等をいい、好ましくは前方低角散乱光およびさらなる散乱光には側方散乱光が選ばれる。側方散乱光は細胞の核形態などのような内部情報を反映する。
蛍光とは、使用する色素によって好適な受光波長が選択される。蛍光信号は、細胞化学的特性を反映するものである。
フローサイトメータの光源は、特に限定されず、色素の励起に好適な波長の光源が選ばれる。例えば、アルゴンレーザ、Ｈｅ−Ｎｅレーザ、赤色半導体レーザ、青色半導体レーザなどが使用される。特に半導体レーザは気体レーザに比べて非常に安価であり、装置コストを大幅に下げることができる。
工程（３）において、散乱光ピークの強度差と散乱光幅の差を用いて、血小板凝集および同時通過細胞と、白血球とを分類する。具体的には、例えば、Ｘ軸に前方散乱光幅、Ｙ軸に前方散乱光ピークをとってスキャッタグラムを作成する。スキャッタグラム中、例えば図１に示すように、血小板凝集および同時通過細胞、ならびに白血球およびゴーストが集団を形成して分布する。このスキャッタグラムのすべての細胞から血小板凝集および同時通過細胞を除いて、血小板凝集および同時通過細胞と、白血球およびゴーストとを分類する。この操作により、血小板凝集および同時通過細胞がＤＮＡ量異常白血球の領域に出現することが防止され、ＤＮＡ量異常白血球を正確に分類計数することが可能になる。
次に、工程（４）において、工程（３）で分類された成分の散乱光の強度差と蛍光の強度差を用いて、成熟白血球、ＤＮＡ量異常白血球および幼若白血球に分類計数する。具体的には、例えば、Ｘ軸に蛍光強度、Ｙ軸に前方散乱光強度をとって、上述の血小板凝集および同時通過細胞を除いた血球成分の集団のみでスキャッタグラムを作成する。スキャッタグラム中、例えば、図２に示すように、成熟白血球、ＤＮＡ量異常細胞および幼若白血球の各集団と赤血球ゴーストが集団を形成して分布する。そして適当な解析ソフトを用いて各集団の領域を設定し、その領域内に含まれる細胞を分類計数する。このようにして、成熟白血球数、幼若白血球数およびＤＮＡ量異常白血球数を得ることができる。
さらに、工程（５）において、ＤＮＡ量異常白血球数と成熟白血球数または幼若白血球数とから、ＤＮＡ量異常白血球に対する成熟白血球または幼若白血球の割合を算出する。
さらに、工程（６）において、成熟白血球数と幼若白血球数とから、成熟白血球に対する幼若白血球の割合を算出する。
さらに、工程（７）において、工程（２）で異なる種類の散乱光をさらに測定し、工程（４）で得られた成熟白血球についての該散乱光と蛍光の強度差を用いてスキャッタグラムを作成する。例えば、Ｘ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に側方散乱光強度をとって、図３に示すようなスキャッタグラムを作成する。スキャッタグラム中、少なくとも３つ、例えばリンパ球、単球および顆粒球が集団を形成して分布する。そして適当な解析ソフトを用いて各集団の領域を設定し、その領域内に含まれる細胞を分類計数する。その結果、リンパ球、単球および顆粒球に分類計数することができる。
さらに、工程（８）において、工程（２）で異なる種類の散乱光をさらに測定し、工程（４）で得られた幼若白血球についての該散乱光と蛍光の強度差を用いてスキャッタグラムを作成する。例えば、Ｘ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に側方散乱光強度をとって、図３に示すようなスキャッタグラムを作成する。スキャッタグラム中、少なくとも２つ、例えば骨髄系芽球および顆粒球系幼若球が集団を形成して分布する。そして適当な解析ソフトを用いて各集団の領域を設定し、その領域内に含まれる細胞を分類計数する。その結果、骨髄系芽球および顆粒球系幼若球に分類計数することができる。
なお、工程（７）と工程（８）は、別々の工程として行っても、同時に行ってもよい。同時に行う際には、工程（４）において、ゴーストを除去した成分の該散乱光の強度差と蛍光の強度差を用いてスキャッタグラムを作成すると、図３に示すようなスキャッタグラムが得られ、一度に、成熟白血球および幼若白血球をさらに複数個の集団に分類計数することができるので、好ましい。
図１は、本発明の方法によって分類計数される各細胞の出現位置を示す概念図である。
図２は、本発明の方法によって分類計数される各細胞の出現位置を示す概念図である。
図３は、本発明の方法によって分類計数される各細胞の出現位置を示す概念図である。
図４は、Ｘ軸に前方低角散乱光幅、Ｙ軸に前方低角散乱光ピークをとった実施例１のスキャッタグラムである。
図５は、Ｘ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角散乱光強度をとった実施例１のスキャッタグラムである。
図６は、Ｘ軸に側方散乱光強度、Ｙ軸に赤蛍光強度をとった実施例１のスキャッタグラムである。
図７は、本法とＤＮＡ量標準測定法の結果を示す。
図８は、Ｘ軸に前方低角散乱光幅、Ｙ軸に前方低角散乱光ピークをとった実施例２のスキャッタグラムである。
図９は、Ｘ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角散乱光強度をとった実施例２のスキャッタグラムである。
図１０は、Ｘ軸に側方散乱光強度、Ｙ軸に赤蛍光強度をとった実施例２のスキャッタグラムである。
図１１は、Ｘ軸に前方低角散乱光幅、Ｙ軸に前方低角散乱光ピークをとった実施例３の反応時間７秒の場合のスキャッタグラムである。
図１２は、Ｘ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角散乱光強度をとった実施例３の反応時間７秒の場合のスキャッタグラムである。
図１３は、Ｘ軸に側方散乱光強度、Ｙ軸に赤蛍光強度をとった実施例３の反応時間７秒の場合のスキャッタグラムである。
図１４は、Ｘ軸に前方低角散乱光幅、Ｙ軸に前方低角散乱光ピークをとった実施例３の反応時間１３秒の場合のスキャッタグラムである。
図１５は、Ｘ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角散乱光強度をとった実施例３の反応時間１３秒の場合のスキャッタグラムである。
図１６は、Ｘ軸に側方散乱光強度、Ｙ軸に赤蛍光強度をとった実施例３の反応時間１３秒の場合のスキャッタグラムである。
図１７は、反応時間１３秒の本発明の方法とＤＮＡ量標準測定法の結果を示す図である。
図１８は、本発明で使用できるフローサイトメータの光学系を示す斜視図である。
図２は、本発明の方法によって分類計数される各細胞の出現位置を示す概念図である。
図３は、本発明の方法によって分類計数される各細胞の出現位置を示す概念図である。
図４は、Ｘ軸に前方低角散乱光幅、Ｙ軸に前方低角散乱光ピークをとった実施例１のスキャッタグラムである。
図５は、Ｘ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角散乱光強度をとった実施例１のスキャッタグラムである。
図６は、Ｘ軸に側方散乱光強度、Ｙ軸に赤蛍光強度をとった実施例１のスキャッタグラムである。
図７は、本法とＤＮＡ量標準測定法の結果を示す。
図８は、Ｘ軸に前方低角散乱光幅、Ｙ軸に前方低角散乱光ピークをとった実施例２のスキャッタグラムである。
図９は、Ｘ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角散乱光強度をとった実施例２のスキャッタグラムである。
図１０は、Ｘ軸に側方散乱光強度、Ｙ軸に赤蛍光強度をとった実施例２のスキャッタグラムである。
図１１は、Ｘ軸に前方低角散乱光幅、Ｙ軸に前方低角散乱光ピークをとった実施例３の反応時間７秒の場合のスキャッタグラムである。
図１２は、Ｘ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角散乱光強度をとった実施例３の反応時間７秒の場合のスキャッタグラムである。
図１３は、Ｘ軸に側方散乱光強度、Ｙ軸に赤蛍光強度をとった実施例３の反応時間７秒の場合のスキャッタグラムである。
図１４は、Ｘ軸に前方低角散乱光幅、Ｙ軸に前方低角散乱光ピークをとった実施例３の反応時間１３秒の場合のスキャッタグラムである。
図１５は、Ｘ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角散乱光強度をとった実施例３の反応時間１３秒の場合のスキャッタグラムである。
図１６は、Ｘ軸に側方散乱光強度、Ｙ軸に赤蛍光強度をとった実施例３の反応時間１３秒の場合のスキャッタグラムである。
図１７は、反応時間１３秒の本発明の方法とＤＮＡ量標準測定法の結果を示す図である。
図１８は、本発明で使用できるフローサイトメータの光学系を示す斜視図である。
本発明を以下の実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明には種々の変更、修飾が可能であり、従って、本発明の範囲は以下の実施例によって限定されるものではない。
以下の組成の水溶液からなる試薬を調製した。
（本法）
ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテル ２４．０ｇ
Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム １．５ｇ
ＤＬ−メチオニン ２０．０ｇ
１Ｎ−ＮａＯＨ ０．３ｇ
ＮａＣｌ ４．０ｇ
式（ＶＩ）の色素 ３．０ｍｇ
ＨＥＰＥＳ １２．０ｇ
精製水 １０００ｍｌ
上述の試薬１ｍｌとリンパ球性白血病患者の血液３３μｌを混合し、１０秒後にフローサイトメータで前方低角散乱光、側方散乱光、赤蛍光を測定した（光源：赤色半導体レーザー、波長：６３３ｎｍ）。
（ＤＮＡ量標準測定法）
クエン酸３Ｎａ １００ｍｇ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（和光純薬工業株式会社） ０．２ｇ
プロピジウムアイオダイド（シグマ） ０．２ｇ
ＲＯ水 １００ｍｌ
上述の試薬１ｍｌと上述の患者の血液１００μｌを混合し、３０分後にフローサイトメータで赤蛍光を測定した（光源：アルゴンイオンレーザー、波長：４８８ｎｍ）。得られた結果を、Ｘ軸に前方低角散乱光幅、Ｙ軸に前方低角散乱光ピークをとったスキャッタグラム（図４）、Ｘ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角散乱光強度をとったスキャッタグラム（図５）およびＸ軸に側方散乱光強度、Ｙ軸に赤蛍光強度をとったスキャッタグラム（図６）に示す。
上記の血液にメイグリュンワルド染色を施した後、顕微鏡により目視を行った。白血球をリンパ球、単球、顆粒球に分類した。また、上記の血液を用いて、フローサイトメーターによるＤＮＡ量標準測定法にて、白血球のＤＮＡ量を測定した。得られた結果を、表１および図７に示す。
上記の結果、本発明の方法が、ＤＮＡ量異常白血球と幼若白血球を同時にかつ迅速、簡便に目視と同程度の高精度で測定することが可能であることが示された。
（本法）
ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテル ２４．０ｇ
Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム １．５ｇ
ＤＬ−メチオニン ２０．０ｇ
１Ｎ−ＮａＯＨ ０．３ｇ
ＮａＣｌ ４．０ｇ
式（ＶＩ）の色素 ３．０ｍｇ
ＨＥＰＥＳ １２．０ｇ
精製水 １０００ｍｌ
上述の試薬１ｍｌとリンパ球性白血病患者の血液３３μｌを混合し、１０秒後にフローサイトメータで前方低角散乱光、側方散乱光、赤蛍光を測定した（光源：赤色半導体レーザー、波長：６３３ｎｍ）。
（ＤＮＡ量標準測定法）
クエン酸３Ｎａ １００ｍｇ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（和光純薬工業株式会社） ０．２ｇ
プロピジウムアイオダイド（シグマ） ０．２ｇ
ＲＯ水 １００ｍｌ
上述の試薬１ｍｌと上述の患者の血液１００μｌを混合し、３０分後にフローサイトメータで赤蛍光を測定した（光源：アルゴンイオンレーザー、波長：４８８ｎｍ）。得られた結果を、Ｘ軸に前方低角散乱光幅、Ｙ軸に前方低角散乱光ピークをとったスキャッタグラム（図４）、Ｘ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角散乱光強度をとったスキャッタグラム（図５）およびＸ軸に側方散乱光強度、Ｙ軸に赤蛍光強度をとったスキャッタグラム（図６）に示す。
上記の血液にメイグリュンワルド染色を施した後、顕微鏡により目視を行った。白血球をリンパ球、単球、顆粒球に分類した。また、上記の血液を用いて、フローサイトメーターによるＤＮＡ量標準測定法にて、白血球のＤＮＡ量を測定した。得られた結果を、表１および図７に示す。
以下の組成の水溶液からなる試薬を調製した。
（本法）
ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテル ２４．０ｇ
Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム １．５ｇ
ＤＬ−メチオニン ２０．０ｇ１Ｎ−ＮａＯＨ ０．３ｇＮａＣｌ ４．０ｇ式（ＶＩＩ）の色素 ３．０ｍｇＨＥＰＥＳ １２．０ｇ精製水 １０００ｍｌ 上述の試薬１ｍｌと急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の血液３３μｌを混合し、１０秒後にフローサイトメータで前方低角散乱光、側方散乱光、赤蛍光を測定した（光源：赤色半導体レーザー、波長：６３３ｎｍ）
（ＤＮＡ量標準測定法）
クエン酸３Ｎａ １００ｍｇ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（和光純薬工業株式会社） ０．２ｇ
プロピジウムアイオダイド（シグマ） ０．２ｇ
ＲＯ水 １００ｍｌ
上述の試薬１ｍｌと上述の患者の血液１００μｌを混合し、３０分後にフローサイトメータで赤蛍光を測定した（光源：アルゴンイオンレーザー、波長：４８８ｎｍ）。得られた結果を、Ｘ軸に前方低角散乱光幅、Ｙ軸に前方低角散乱光ピークをとったスキャッタグラム（図８）、Ｘ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角散乱光強度をとったスキャッタグラム（図９）およびＸ軸に側方散乱光強度、Ｙ軸に赤蛍光強度をとったスキャッタグラム（図１０）に示した。
上記の血液にメイグリュンワルド染色を施した後、顕微鏡により目視を行った。白血球をリンパ球、単球、顆粒球に分類した。その結果を表２に示す。
上記の結果、本発明の方法が、ＤＮＡ量異常白血球と幼若白血球を同時にかつ迅速、簡便、高精度に測定することが可能であることが示された。
（本法）
ポリオキシエチレン（１６）オレイルエーテル ２４．０ｇ
Ｎ−ラウロイルサルコシン酸ナトリウム １．５ｇ
ＤＬ−メチオニン ２０．０ｇ１Ｎ−ＮａＯＨ ０．３ｇＮａＣｌ ４．０ｇ式（ＶＩＩ）の色素 ３．０ｍｇＨＥＰＥＳ １２．０ｇ精製水 １０００ｍｌ 上述の試薬１ｍｌと急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の血液３３μｌを混合し、１０秒後にフローサイトメータで前方低角散乱光、側方散乱光、赤蛍光を測定した（光源：赤色半導体レーザー、波長：６３３ｎｍ）
（ＤＮＡ量標準測定法）
クエン酸３Ｎａ １００ｍｇ
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（和光純薬工業株式会社） ０．２ｇ
プロピジウムアイオダイド（シグマ） ０．２ｇ
ＲＯ水 １００ｍｌ
上述の試薬１ｍｌと上述の患者の血液１００μｌを混合し、３０分後にフローサイトメータで赤蛍光を測定した（光源：アルゴンイオンレーザー、波長：４８８ｎｍ）。得られた結果を、Ｘ軸に前方低角散乱光幅、Ｙ軸に前方低角散乱光ピークをとったスキャッタグラム（図８）、Ｘ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角散乱光強度をとったスキャッタグラム（図９）およびＸ軸に側方散乱光強度、Ｙ軸に赤蛍光強度をとったスキャッタグラム（図１０）に示した。
上記の血液にメイグリュンワルド染色を施した後、顕微鏡により目視を行った。白血球をリンパ球、単球、顆粒球に分類した。その結果を表２に示す。
実施例１と同様の組成の試薬を用いた。本法試薬１ｍｌと骨髄異形性症候群患者の骨髄液３３μｌを混合し、７秒後と１３秒後にフローサイトメータで前方低角散乱光、側方散乱光、赤蛍光を測定した（光源：赤色半導体レーザー、波長：６３３ｎｍ）。
（ＤＮＡ量標準測定法）
ＤＮＡ量標準測定法試薬１ｍｌと上述の患者の骨髄液１００μｌを混合し、３０分後にフローサイトメータで赤蛍光を測定した（光源：アルゴンイオンレーザー、波長：４８８ｎｍ）。得られた結果を、Ｘ軸に前方低角散乱光幅、Ｙ軸に前方低角散乱光ピークをとった反応時間７秒の場合のスキャッタグラム（図１１）、Ｘ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角散乱光強度をとった反応時間７秒の場合のスキャッタグラム（図１２）、Ｘ軸に側方散乱光強度、Ｙ軸に赤蛍光強度をとった反応時間７秒の場合のスキャッタグラム（図１３）、Ｘ軸に前方低角散乱光幅、Ｙ軸に前方低角散乱光ピークをとった反応時間１３秒の場合のスキャッタグラム（図１４）、Ｘ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角散乱光強度をとった反応時間１３秒の場合のスキャッタグラム（図１５）、Ｘ軸に側方散乱光強度、Ｙ軸に赤蛍光強度をとった反応時間１３秒の場合のスキャッタグラム（図１６）に示す。
上記の骨髄液にメイグリュンワルド染色を施した後、顕微鏡により目視を行った。白血球をリンパ球、単球、顆粒球に分類した。また、上記の血液を用いて、フローサイトメータによるＤＮＡ量標準測定法にて、白血球のＤＮＡ量を測定した。その結果を表３に示す。表４と図１７に反応時間１３秒の本発明の方法とＤＮＡ量標準測定法の結果を示す。
以上より反応時間７秒のときは成熟白血球、幼若白血球を正確に測定することができ、反応時間１３秒にすることにより、さらに幼若白血球に含まれるＤＮＡ量異常白血球を検出することができる。
上記に示したように、本発明により、ＤＮＡ量異常白血球を迅速かつ簡便に測定することが可能となった。
（ＤＮＡ量標準測定法）
ＤＮＡ量標準測定法試薬１ｍｌと上述の患者の骨髄液１００μｌを混合し、３０分後にフローサイトメータで赤蛍光を測定した（光源：アルゴンイオンレーザー、波長：４８８ｎｍ）。得られた結果を、Ｘ軸に前方低角散乱光幅、Ｙ軸に前方低角散乱光ピークをとった反応時間７秒の場合のスキャッタグラム（図１１）、Ｘ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角散乱光強度をとった反応時間７秒の場合のスキャッタグラム（図１２）、Ｘ軸に側方散乱光強度、Ｙ軸に赤蛍光強度をとった反応時間７秒の場合のスキャッタグラム（図１３）、Ｘ軸に前方低角散乱光幅、Ｙ軸に前方低角散乱光ピークをとった反応時間１３秒の場合のスキャッタグラム（図１４）、Ｘ軸に赤蛍光強度、Ｙ軸に前方低角散乱光強度をとった反応時間１３秒の場合のスキャッタグラム（図１５）、Ｘ軸に側方散乱光強度、Ｙ軸に赤蛍光強度をとった反応時間１３秒の場合のスキャッタグラム（図１６）に示す。
上記の骨髄液にメイグリュンワルド染色を施した後、顕微鏡により目視を行った。白血球をリンパ球、単球、顆粒球に分類した。また、上記の血液を用いて、フローサイトメータによるＤＮＡ量標準測定法にて、白血球のＤＮＡ量を測定した。その結果を表３に示す。表４と図１７に反応時間１３秒の本発明の方法とＤＮＡ量標準測定法の結果を示す。
上記に示したように、本発明により、ＤＮＡ量異常白血球を迅速かつ簡便に測定することが可能となった。
Claims (11)
- （１）血液学的試料を溶血剤で処理して得られた試料中の細胞を、少なくとも成熟白血球、ＤＮＡ量異常白血球および幼若白血球との間に蛍光強度の差異を生じうる蛍光色素で染色する工程、
（２）染色された細胞を含む試料をフローサイトメータに導入して、各細胞について、散乱光と蛍光とを測定する工程、
（３）散乱光ピークの強度差と散乱光幅の差を利用して、同時通過細胞および血小板凝集と、白血球とを分類する工程、
（４）工程（３）で分類された白血球について散乱光の強度差と蛍光の強度差とを利用して、成熟白血球、ＤＮＡ量異常白血球および幼若白血球を分類計数する工程
からなる白血球の分類計数方法。 - さらに、ＤＮＡ量異常白血球数と成熟白血球数または幼若白血球数とから、ＤＮＡ量異常白血球に対する成熟白血球または幼若白血球の割合を算出する工程からなる請求項１に記載の方法。
- さらに、成熟白血球数と幼若白血球数とから、成熟白血球に対する幼若白血球の割合を算出する工程からなる請求項１または２に記載の方法。
- 工程（２）で異なる種類の散乱光をさらに測定し、さらに、工程（４）で得られた成熟白血球についての該散乱光の強度差と蛍光の強度差を用いて、成熟白血球を少なくとも３つに分類計数する工程からなる請求項１〜３のいずれか１つに記載の方法。
- 工程（２）で異なる種類の散乱光をさらに測定し、さらに、工程（４）で得られた幼若白血球についての該散乱光の強度差と蛍光の強度差を用いて、幼若白血球を少なくとも２つに分類計数する工程からなる請求項１〜４のいずれか１つに記載の方法。
- 蛍光色素が、式（Ｉ）：
（式中、Ｒ１Ｉは水素原子または低級アルキル基；Ｒ２Ｉ及びＲ３Ｉは水素原子、低級アルキル基または低級アルコキシ基；Ｒ４Ｉは水素原子、アシル基または低級アルキル基；Ｒ５Ｉは水素原子または置換されてもよい低級アルキル基；Ｚは硫黄原子、酸素原子、または低級アルキル基で置換された炭素原子；ｎＩは１または２；ＸＩ−はアニオンである。）で表される化合物ならびにエチジウムブロマイド、プロピジウムアイオダイド、エチジウム−アクリジンヘテロダイマー、エチジウムジアジド、エチジウムホモダイマー−１、エチジウムホモダイマー−２、エチジウムモノアジド、ＴＯＴＯ−１、ＴＯ−ＰＲＯ−１、ＴＯＴＯ−３および
ＴＯ−ＰＲＯ−３からなる群から選択される請求項１〜５のいずれか１つに記載の方法。 - 溶血剤が以下の成分：
（１）ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤
（２）血球の細胞膜に損傷を与え縮小化するための可溶化剤
（３）アミノ酸および
（４）液のｐＨを５．０〜９．０、浸透圧を１５０〜６００ｍＯｓｍ／ｋｇにする緩衝液からなる請求項１〜６のいずれか１つに記載の方法。 - ポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤が、以下の式（ＩＩ）：
（式中、Ｒ１ＩＩはＣ９−２５のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基；Ｒ２ＩＩは、−Ｏ−、
または−ＣＯＯ−；ｎＩＩは１０〜４０である。）で表される化合物からなる請求項１〜７のいずれか１つに記載の方法。 - 可溶化剤が、以下：
式（ＩＩＩ）：
（式中、Ｒ１ＩＩＩはＣ１０−２２のアルキル基；ｎＩＩＩは１〜５である。）
のサルコシン誘導体あるいはその塩、
式（ＩＶ）：
（式中、Ｒ１ＩＶは水素原子または水酸基。）
のコール酸誘導体、および
式（Ｖ）：
（式中、ｎＶは５〜７である。）
メチルグルカンアミドからなる群から選択される１つ以上の化合物である請求項１〜８のいずれか１つに記載の方法。 - 測定する散乱光が、前方低角散乱光、前方高角散乱光および側方散乱光から選ばれる少なくとも２つである請求項１〜９のいずれか１つに記載の方法。
- 血液学的試料を溶血剤と混合する工程および得られた混合物中の細胞を少なくとも成熟白血球、ＤＮＡ異常白血球および幼若白血球との間に蛍光強度の差異を生じうる蛍光色素で染色する工程によって調製された測定試料を通過させるオリフィス部と、オリフィス部に光を照射する光源と、オリフィス部から発せられた散乱光を受光する第１受光部と、オリフィス部から発せられた蛍光を受光する第２受光部とを備えたフローサイトメータと、
散乱光ピークの強度差と散乱光幅の差を利用して、同時通過細胞および血小板凝集と、白血球とを分類する工程および分類された細胞の強度差と蛍光の強度差とを利用して、成熟白血球、ＤＮＡ量異常白血球および幼若白血球を分類計数する工程により測定試料を解析する解析部を備えた白血球の分類計測装置。
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