JP2565844B2 - 細胞溶解処理条件下で異種細胞集団を正確に計数し，感受性に関する格付けを行う方法 - Google Patents

細胞溶解処理条件下で異種細胞集団を正確に計数し，感受性に関する格付けを行う方法

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、一般的には、細胞学、および細胞懸濁物に
存在する特定の細胞の型の正確な分類および計数を可能
とする自動装置の使用に関する。また、本発明は、細胞
懸濁物に存在する細胞の型の厳密な機能上の同定および
特徴付けを可能とする。特に、本発明は、他の意味では
望ましいサンプル処理条件下である跳躍的な方法で不安
定と考えられる、細胞集団の正確な分類、特徴付け、同
定および計数を可能とする方法に関する。そのような細
胞集団としては、異常な細胞条件の結果、または強力な
細胞溶解処理剤および条件の使用の結果（またはそのよ
うな因子の相互作用により）、突然大きな変化を受け
る、壊れやすくて溶解感受性を有する血液細胞が挙げら
れる。
発明の背景 混合細胞懸濁物の細胞集団の有無およびそのサンプル
に存在する細胞の特定の型の数に関する定量的情報が分
析可能であることは、先の研究者らにより認められてい
る。この情報は、病気の診断および特定の病状の治療の
有効性をモニターするのに有用である。先の研究者らは
さらに、混合細胞懸濁物に課した条件に対する細胞集団
反応における検出可能な差異を利用すると、特定の細胞
集団の有無を有利に示すことができることを認めてい
る。また、これらの検出可能な示差反応を使用すると、
単一の細胞集団に特有の信号を発生させることができ、
その細胞集団を計数することが可能である。示差反応技
術が研究されている混合細胞系としては、血液、血漿、
骨髄、精液および臓器の細胞懸濁物などの生理的流体な
らびに植物細胞懸濁物などの細胞培地が挙げられる。そ
のような反応技術は、添加色素の存在下での細胞の分染
法から、極端な温度、pH、毒性または化学的ミクロ環境
に短時間または長時間さらすなどのストレスを課して１
個以上の細胞集団の生存を停止させるものまでに及ぶ。
混合細胞懸濁物から示差反応を発生させるために課す
る条件の選択は、典型的には、歩み寄った中間的なもの
である。細胞懸濁物に存在する細胞集団同士の固有の類
似性により、標的としない細胞集団からもいくつかの部
分的な反応が起こることが避けられず、これが、そのよ
うな全ての種類の示差反応技術で得られる情報の質に悪
影響を及ぼしている。
哺乳類の血液は、より完全に研究された混合細胞懸濁
物の一つであり、示差的細胞集団生存反応などの種々の
示差反応技術を利用して分析される。全血に存在する細
胞集団は、哺乳類での濃度が数百万個／μ１である赤血
球（Ｅ）；哺乳類での濃度が一般に数万〜数十万個／μ
１である核のない血小板（Ｔ）；および哺乳類での濃度
が一般に数百〜数万個／μ１であり、それを超える場合
もある（白血球のサブ集団の場合）核のある白血球であ
る。正常な哺乳類の末梢血の白血球はさらに、５種類の
主要な型、すなわち小さいリンパ球（Ｌ）、大きい好中
球（Ne）、好酸球（Eo）、好塩基球（Ba）および単球
（Mo）のサブ集団に分類される。
これらの血球集団を図１に示すが、好中球、好酸球お
よび好塩基球はまとめて顆粒球（Ｇ）として示す。白血
球の主要な５種類全部のサブ集団は図６に示す。
赤血球と白血球との主要な差異の一つは、健康な場
合、赤血球を選択的に破壊（または溶解）し、一方、典
型的な白血球は実質的にそのままにしておく溶血剤の選
定が比較的簡単であることである。この異なる生存反応
は、細胞質構造が大きく相違することにより説明され
る。白血球集団の溶液を、全血サンプル中の全赤血球が
この臨界溶血閾値を超える物理化学的条件で存在させる
と、全血サンプル中のこれらの赤血球は、主に浸透現
象、腫張現象および表面膜現象の相互作用である急速な
細胞溶解性崩壊プロセスにより溶解されてしまう。そし
て、一般的には、白血球の全サブ集団も、それ自身の溶
解性崩壊プロセスを開始すると予想される。しかし、成
熟赤血球と違って、白血球（血小板を含む）は、容易に
補充可能な余分の内在化細胞膜を多く有している。適切
な条件下では、この膜物質が外在化し、その結果、白血
球はふくらんでいく石鹸の泡と特徴を多く共有する。さ
らにふくらむことができるそれらの石鹸の泡は、容易に
補充可能な予備（非表面）の石鹸分子をまだ残してい
る。網赤血球以上に成熟した赤血球は、もはや余分の表
面物質をもっていない。その結果、白血球集団がその臨
界溶血閾値に達する速度は赤血球と比較して一般に遅
く、従って、制限時間内の分析条件下では、多くは白血
球集団を実質上溶解耐性を有するものとみなすことがで
きる。
一世紀以上にわたって、この相異なる細胞生存反応
は、全血サンプルに存在する白血球の分類および計数を
行うために無神経に利用されてきた。もし、赤血球が簡
単に溶解され、白血球および血小板が保存されるなら
ば、数の少ない白血球サブ集団の各構成要素ごとに１万
個以上もの赤血球を処理する必要がないことは、図１か
ら明らかである。この処理負担の軽減により、全血サン
プルの分析時間（およびコスト）がかなり短縮される。
しかし、この相異なる細胞生存反応を１世紀前の方法の
溶解剤に適用すると、非常に現実的な制限を受ける。完
全な溶血を行う溶血性の強い条件の使用（いくつかの白
血球が犠牲にされる）と白血球に影響を及ぼさないため
のあまり溶血性の強くない条件の使用（妨げとなる未溶
解の赤血球の存在のために白血球の計数が損なわれる）
との間で妥協案を打ち出さなければならない。ここ150
年以上、健康なヒトと病気のヒトの両方でこれらの相反
する反応を同時に処理する最適な妥協条件は見出されて
いない。
その結果、ヒトおよび獣医の臨床用途における自動化
に有益な、費用効果を有する迅速な溶血方法も、本質的
には白血球溶解性（白血球・血小板溶解性）である。従
って、白血球サブ集団の正確な分類および計数は妥協さ
れることになる。溶血に伴う白血球溶解活性は、計数の
正確度を大幅に低下させ、白血球サブ集団の臨床上の分
類および計数の質を下げる。従って、本発明の目的は、
通常使用される溶血剤および溶血条件に固有な白血球溶
解活性について説明がつく（そして、計数の補正がなさ
れる）白血球サブ集団の分類・計数法を提供することで
ある。
壊れやすいリンパ球 白血球サブ集団の分類・計数法の臨床上の価値は、健
康な体および病気の体の血液中を循環する赤血球および
白血球に存在する異常を同定し、格付けする際の有用性
に直接関係する。例えば、ごくまれな、しかし非常に重
要な臨床上の疾患では、循環している特定の白血球サブ
集団が極めて溶解感受性の高い要素を含んでいる可能性
がある。この状況の例としては、特定のケースの慢性リ
ンパ性白血病および感染性単核球症におけるような「壊
れやすいリンパ球」がある。そのような臨床状態におい
て、前世紀の形態学者たちは、血液膜の顕微鏡分析で
「グンプレヒト影」を認めた。H.Begemann,J.Rastette
r,Atlas of Clinical Hematology,第４版 1989,p.227 （Springer−Verlag）参照。今日の化学技術者は、よご
れ細胞「smear cells」（J.CrossEngland,C.A.Strange,
“Erroneous Ortho ELT 800/WS WBC in chronic lympha
tic leukaemia",Clin.Lab.Hematol.1987,9,371−375）
または「smudge celss」（National Committee for Cli
nical Laboratory Standard.Reference Leukocyte Diff
erential Count（Proportional）and Evaluation of In
strumental Method.Approved Standard,NCCLS Document
H20−A 1992（Villanova,Pa.）を認めている。影響を
受けた白血球細胞集団は、非常に壊れやすいため、膜形
成プロセスのストレスを細胞に課する前に血液の小滴に
高濃度のコロイド（アルブミンなど）を添加しなけれ
ば、血液膜中に保持することすらできない細胞を含んで
いる可能性がある。NCCLS Document H20−A;Densmore,
C.M.“Eliminating disintegrated cells on hematolog
ic films"Lab.Med.12:640−41,1981。これらの細胞の余
分の内膜物質は全て高度に分散した状態にあるため、極
めて大きいコロイド活性（oncotic actibity）を有し、
浸透圧の低いストレス条件下では容易に回復できない。
これらの細胞は、（後述する）図２の溶解前の球状体に
類似する。希釈物中のコロイドのコロイド浸透圧が高い
と、これらの溶解前のリンパ球の球面指数が減少する。
このため、血液膜傷害過程（blood filmsmearing proce
ss）の剪断圧縮下であっても、それらの細胞はもはや破
裂することはない。
また、そのような非常に壊れやすい白血球細胞は、血
液をかなり希釈して、いわゆる流動細胞計測の自動血液
細胞カウンター中で激しく処理する場合、細胞維持が困
難である。このことは、希釈物が、妨害する多くの赤血
球を溶解するよりも維持することを目的とする、明らか
に平衡化された（蛋白質を含まない）生理食塩水溶液で
ある場合ですら当てはまる。従って、これらの壊れやす
い白血球がサンプル中に存在すると、循環している白血
球の濃度（または白血球の全数）および白血球サブ集団
の計数値を正しく知ることが本質的に不可能である場合
がある。J.Cross,C.A.Strange,“Erroneous Ortho ELT
800/WS WBC in chronic lymphatic leukaemia",Clin.La
b.Hematol.1987,9,371−76;J.B.Dixonら，“Electronic
Counting of Dog Leukocytes Discrepancies Arising
From Calibration With Coulter Standard 4C and With
the Hemocytometer",Res.Vet.Sci.31（２）,1981,249
−252;J.M.Englandら，“An assessment of the Ortho
ELT−8",Clin.Lab.Hematol.,1982,4,187−99。
本発明は、そのような壊れやすい細胞の存在を確認
し、循環総数を恐らく過少評価してしまうような他の計
数法により白血球を計数している実験室に警告を与える
ような方法を提供する。また、白血球サブ集団の正確な
分類および計数を行い、それにより全白血球の計数を行
う方法も提供する。これらの目的は、分析のデータ収集
中の意図しない白血球溶解により生じる白血球の計数誤
差を、十分厳密に補正することにより果たすことができ
る。本発明は、細胞の型を定性的に識別または分類する
定量的データを使用することを可能にする。
溶解耐性赤血球 本発明方法によってうまく処理することができた別の
重要な臨床上のジレンマは、いわゆる溶解耐性赤血球を
含む全血サンプルに関する。溶解により耐える赤血球を
生じる周知の条件の一群には、赤血球自体が、通常のヒ
トサンプルに適用可能な方法では溶解困難と思われる、
例えば鎌状赤血球症、胎児および新生児の血球、ならび
に他の非定型で異常生理学的な哺乳類の赤血球集団があ
る。他の条件または障害では、溶解を妨げる妨害物質の
存在により、通常のヒトサンプルに有効な溶血条件下で
の赤血球の溶解が困難になる。例えば、異常に高濃度の
血液蛋白は、溶血剤の一部を中和し、溶血剤の物理的接
近の一部をコロラド的に妨害する傾向にある。A.Bremme
lgaard,J.Nygard,“Interference by Cryoglobulins wi
th White Blood Cell Measurements on Coulter Counte
r",Scand.J.Clin.Lab.Invest.51 5,1991,489−492。非
経口輸液、ある種の血液脂質障害および治療薬も、単独
または他の物質と併用して、または異常赤血球とともに
赤血球保護条件を作り出すように作用する可能性があ
る。
溶解耐性赤血球問題の結果、溶血しなかったり、溶血
が部分的であったりすると、その影響を受けたサンプル
については白血球の計数処理全体が無効になる可能性が
ある。溶解せず残存する赤血球は白血球の視覚化を妨げ
る。ヒトの血液１μ１に対して500万個存在する赤血球
の１％が溶血しないと、５万個の非溶解赤血球が残存
し、１μ１のヒト血液に５千個の有核白血球をおおい隠
すことになる。残留する赤血球が0.1％と少ないサンプ
ルでさえ、それらを正常な血液サンプルと区別する識別
信号を出す装置があり、これらのサンプル中の白血球の
計数には他の方法を使用しなければならない。場合によ
っては計数を手動で行わなければならないが、所要時
間、装置、研究室の空間、直接の作業、そして何より
も、研究室の専門的技術およびこれら問題サンプルの処
理のために開発・維持・品質管理しなければならない複
雑な手順のため、常に高コストで計数が行われる。ジレ
ンマは、溶血性の大きい物質または条件を使用して溶血
を完全に行い、溶解耐性赤血球の数を減少させると、白
血球溶解が非常に増加するということである。従って、
現在は危険な妥協が存在するが、これでは、単一の費用
効果のある血液分析器で、日常的に信頼性のある溶血と
白血球保護を両立させ得ない。
例えば、完全自動CELL−DYN 1600血液分析器は、有
核白血球を簡単な「弱溶解（soft lyse）」により大雑
把にリンパ球、単球および好中球に分類し、少量の好酸
球および好塩基球は溶解変性したこれらの主要な白血球
サブ集団の間に分散させるものである。CELL−DYN 160
0は一次元のインピーダンス変換器を使用しており、そ
の白血球測定は、溶解耐性赤血球が非常に多いと無効と
なる。これらの問題サンプルの場合は、「弱溶解」条件
下では、目的とする有核白血球の粗サブ分類も、また全
有核白血球の計数すらも得られない。その結果、先天的
に溶解耐性赤血球を含む多くの新生児血液のサンプルを
処理しなければならない研究室では、新生児の全赤血球
を効果的に破壊するために「強溶解（hard lyse）」を
利用する第二の自動血液分析器を購入しなければならな
いことが多い。必然的に、「強溶解」は、有核白血球の
細胞質も全て破壊し、実質的に均質の白血球の核のみが
図１のＥピークと非常に類似した、しかし66f1（LEEV）
の周りに位置する単一のピークとして残る。これらの核
の分析により全有核白血球の正しい計数値を得ることが
できるが、これらの細胞型のサブ分類を行って、溶解変
性しているが全く有用な、図１に示すようないわゆる示
差的な白血球のプロフィールを得ることはもはやできな
い。
この「強溶解」分析器が、典型的なヒト血液サンプル
に適する「弱溶解」用に設計されたCELL−DYN 1600と
同じであれば、その装置の品質保証アルゴリズム次第
で、標準化した弱溶解による示差的白血球プロフィール
に強い歪みがあると警告が鳴らされる。GLP（グッド・
ラボラトリー・プラクティス）およびCLIA（臨床実験室
改善法）の指針によれば、アラームが鳴れば、個々の装
置について調査および注意が必要である。このジレンマ
に答えて、CELL−DYN社は、わずかに改良した血液分析
器、CELL−DYN 1300を市販した。これは「強溶解」に
対して効果的に作動することができる。このわずかに安
価な装置は、溶解しにくい赤血球に関連する全白血球の
計数問題−WBC−のみを解決するものである。しかし、
これは、顧客にとっては高価な解決法である。というの
は、溶血に耐える、細胞質を含まない白血球の核の総数
を除く全ての白血球に関する情報をたとえ犠牲にして
も、追加の装置がスペースを占有し、それが完全な保守
を必要とするからである。血液膜調製物で利用できる形
態学上の白血球情報と比較しても、サブ集団について得
られる単一ピークの白血球ヒストグラムに関しては、利
用できる示差的または形態学的な情報はない。
特に言及しておきたいことは、利用価値のある「中位
の溶解条件」−溶血強度がCELL−DYN 1600の「弱溶
解」とCELL−DYN 1300の「強溶解」との中間である−
をまだ誰も見出すことができないことである。そのよう
な溶解条件の選択を試みる場合、完全にむきだしになっ
た核の領域に、部分的に溶解した好中球が代わりに移動
する。これは、弱溶解条件下では、溶血した小リンパ球
の領域である。このため、雑ではあるが有用な有核白血
球の区別−主として細胞質が取り除かれたリンパ球（図
１の66f1（LEEV）の周り）、わずかに溶解して損傷を受
けた好中級（多かれ少なかれ図１の顆粒球Ｇの部分）、
ならびにＬおよびＮ細胞残余の間にあって、同一である
ことが証明され、目に見えるように好塩基球残余および
好酸球残余によって包囲された（これらの細胞は、血液
中のかなりの濃度がここに存在する）、中位に損傷を受
けたた単球への区別−があやふやなものになる。
現在は、２世代のCELL−DYN 3000装置が存在する。
第一世代のCELL−DYN 3000.1は、容易に第二世代のCEL
L−DYN 3000.2に変換することができる。この第二世代
のCELL−DYN 3000.2は本発明を利用している。本発明
は、第一世代装置の白血球に関する４次元の光学的情報
の他に時間の次元を加えている。溶解しにくい赤血球の
問題（CELL−DYN 3000で白血球の計数を不正確にし、
従って許容できないものにしていた）を克服するため
に、第一世代のCELL−DYN 3000.1は、強溶解を利用す
るCELL−DYN 1300もしくは1400またはCELL−DYN 1600
とセットで販売されていた。本発明を利用する第二世代
のCELL−DYN 3000.2は、等級の低い随伴装置はもはや
必要としない。実際、CELL−DYN 3000.1とCELL−DYN
3000.2との相違を表す本発明では、その最も簡単な構成
にもかかわらず、遥かに複雑なCELL−DYN 3000Aシステ
ムを無用のものとした。そのCELL−DYN 3000Aシステム
は、CELL−DYN 3000.1より大きくなることなく単一装
置内でCELL−DYN 3000.1とCELL−DYN 1300と組み合わ
せたものとして開発された。CELL−DYN 3000.2で表さ
れる装置の成功は、費用効果がはるかに大きい。
本発明は、溶血性の強い物質および条件の使用に伴う
白血球溶解を相殺するための白血球数の厳密な補正に対
し対策を講じているため、溶血性の強い物質および条件
の使用を可能とし、もって完全な溶血を保証するもので
ある。本発明方法は、白血球集団が、適切に選択した溶
血性の強い物質または条件の存在下では、比較的安定で
ゆっくりした、計算可能な崩壊速度で溶解するという実
験的に得られた知見を十分利用している。それらの白血
球崩壊パターンは、白血球の計数期に包含される比較的
短時間のうちに記録することができ、得られる崩壊速度
を使用すると、白血球サンプル処理サイクルの開始時に
白血球溶解プロセスが始まる前のサンプル溶液に最初に
存在した白血球集団の濃度を正確に推定することができ
る。
細胞の計数速度をモニターすることはよく知られてい
るものの、この目的のために使用されたことはない。そ
れは、細胞計数器の検出ゾーンの完全性または計数プロ
セス中に変換器を通過する細胞含有サンプル溶液の流量
の安定性を評価するために使用することが多い。また、
分析中の細胞が検出ゾーンを通過するとき、それらが互
いに付着しないことを保証する手段としても知られてい
る。計数速度のモニタリングは、1960年代以来、核物理
学分野に対して製造されたほとんどのマルチチャンネル
分析器にMCS（マルチカウントスケーリング）機能が存
在したので、血球計数器の初期の開発段階では上記の目
的のために使用された。これらの装置を初期の血球計数
器と結合した場合、細胞計数サイクル中の計数速度のモ
ニタリングは単純な自動操作であった（von Behrens,W.
E.and Lander,Proc.Australian Soc.Med.Research,Vol.
2,p.380,1970）。さらに、出力は容易にプロッターに結
合することができた。集団の定量的挙動を得るために経
時的な速度情報を使用することはなかった。
マルチチャンネル装置 全血サンプルに存在する細胞を同定・分類・計数する
別の従来技術は、別々の多数のサンプル容器（volume）
を有し、その各々で細胞アリコートを異なる高度に特異
的な溶解条件に付す別々のマルチチャンネル分析を利用
するものである。この技術を利用する自動計測では、全
血サンプルが複数のアリコートに分けられる。次いで、
これらのアリコートは別々に、そのアリコート内の問題
の１種の細胞集団を除く全細胞成分が溶解するように選
択された異なる溶解条件にかけられる。これらの個々の
サンプルは次いで、各々のチャンネルで、各々の変換器
を使用して平行して処理され、生存する非溶解細胞集団
に対する計数情報が得られる。この方法は、その装置で
マルチ技法を行う必要があり、ハードウェアおよび試薬
が複雑になるという欠点を有する。製造・維持・品質管
理費の上昇は一般に、計測および試薬系の複雑さと関連
する。さらに、生存する細胞集団の純度は決して保証さ
れない。
このマルチチャンネル法を行う装置の一つはToaのE80
00 分析器である。この装置は細胞分析用に４個のチャ
ンネルを使用する。血小板、好酸球および好塩基球は、
別々のチャンネルで計数される。リンパ球、好中球およ
び単球は（分散した血小板、好酸球および好塩基球と共
に）、直流および交流電気インピーダンスによる視覚化
原理を利用する第四チャンネルで大雑把に分類し、計測
される。赤血球は、示差的溶解せず血小板とともに血小
板チャンネルで処理される。ヘモグロビンは、最大限の
全溶血後に別のチャンネルで処理される。
TechniconのH1血液分析器は、種々に調製した血液サ
ンプルを処理するためにたった２個の細胞変換器および
ヘモグロビン計を使用するものであるが、細胞アリコー
トはこれらの変換器で連続的に処理され、また10種以上
の異なる試薬を使用しなければならないため、少なくと
もToa/Sysmex E8000 と同じくらいに複雑である。
CELL−DYN 3000.1Aもまた、そのような複雑な装置で
あるが、その改良型であるCELL−DYN 3000.2では、重
要な新しい細胞分類情報を得ることができる。
本発明は、従来のマルチチャンネル型の分類・計数法
よりもかなり有益である。本発明は、より単純な装置の
使用が可能であり、全ての有核白血球サブ集団の有効な
多次元分類および計数に、たった１個のチャンネルとた
った１種の溶血試薬およびプロセスしか要しない。下記
に述べるCELL−DYN 3000.2は、全部でたった２個の変
換器およびたった３種の簡単な試薬を使用して血小板、
赤血球、ヘモグロビンおよび全白血球サブ集団の処理を
行う。
発明の要約 本発明方法は、その完全性を失っている不安定な希釈
細胞集団の存在を、日常的に形式的に認識することがで
きる。また、本発明は、分類とともに、これらの細胞集
団の実際の計数およびより厳密な特徴付けが可能であ
る。本発明方法によれば、細胞懸濁物の条件の調整後
に、特定の細胞集団生存速度の信号が送られ、モニター
される。懸濁した全細胞集団は、短い時間（サンプル分
析サイクルの細胞計数期）に検査または追跡され、その
間に細胞計数パルスが得られる。細胞は、それらが実質
的に無傷（場合によっては生存を意味する）のときに占
める領域または、ゴースト、むき出しの核もしくは死細
胞として分解された状態のいずれかで検査される。任意
の所与の単一細胞のこれらの状態間の変移は突然であ
り、飛躍的である。なぜならば、２個の状態間の細胞の
変移を感知する条件を整えることは極めて困難であるか
らである。また、細胞は、両方の状態において独立し
て、しかし同時にモニターすることができる。モニター
されるいずれか、または全ての細胞集団の変移速度（無
傷の状態から分解した状態への変移速度）により、有用
な信号を出すことが可能であり、感度のよい同定および
特徴付け情報が提供され、正確な計数データが与えられ
る。
本発明方法の好ましい実施態様では、信号が送られ、
モニターされる細胞集団の反応は、無傷の細胞集団の崩
壊速度または分解した、もしくはゴーストになった細胞
残余の発生速度のいずれかである。この反応情報を使用
すると、細胞集団の主要な細胞質破壊溶解がいつ生じた
か、もしくは生じたかどうか、またはまだ生じているか
どうかを実証することができる。ついで、この情報を使
用すると、ある異常な細胞集団を同定し、分類し、特徴
付けを行うことができる。確認される細胞集団変移速度
も、細胞懸濁物の処理・測定中に生じる細胞集団分解の
程度を正確に調べることにより、特定の細胞集団を正確
に計数するのに役立つ。この分解は、細胞集団の実際の
計数前に装置内で始まる連続的な溶解プロセスにより生
じる。
本発明の特に好ましい実施態様は、全血サンプルおよ
び白血球の計数に適用される。費用効果的な、溶血性の
強い条件を使用して完全な溶血を保証し、それによって
白血球の計数に対して妨害となる赤血球の悪影響を排除
する。この強い溶血条件から生じる白血球溶解は、溶解
に耐える細胞の数を経時的に調べてモニターすることに
より、同定・特徴付け・定量がなされる。白血球溶解と
いう事実を単に使用することにより、溶解感受性白血球
の存在を見知することができ、それによると、白血球計
数の他の方法のほとんどでは、白血球の全体および一部
の正確な数を過少評価する傾向にある。白血球溶解の速
度を使用すると、意図しない白血球溶解により生じる分
解した白血球の数が調整される。
特に好ましい方法は、２個の前進方向および２個の直
交する光散乱次元を利用して有核白血球を検出・分類・
計数することにより、有核白血球の５種類のサブ集団を
区別することができる流動血球測定装置において有利に
行われる。効率的に全溶血を行い、時間の次元を新しく
使用すると、この同じ分析通路により、溶解により生き
残る哺乳類の核のない血小板を評価することもできる。
図面の簡単な説明 図１は、等張的に希釈した全血に対して、流体力学に
焦点を置いた研究用血球分析器により1973年に得られた
一次元のインピーダンスデータのlog−logプロットであ
る。Ｔ＝血小板、Ｅ＝赤血球、Ｌ＝リンパ球または小単
核細胞、Ｇ＝顆粒球または多形核細胞、およびＭ＝単球
または大単核球細胞。
図２は、図４の２個の別々に記録した細胞集団図に含
まれる同じ情報の積分log−log図である。
図３は、図５にも示すように溶解前および溶解後の赤
血球の混合集団を生じさせるために低張的に希釈した全
血に対して1976年に得られた一次元のインピーダンスデ
ータのlog−logプロットである。
図４は、CELL−DYN 3000、CELL−DYN 1600およびCE
LL−DYN 1300で使用されるvon Behrensプレートインピ
ーダンス変換器により、希釈した全血に対して同時に得
た血小板および赤血球集団のデータの２個の一次元（ヒ
ストグラム）図を示す。この変換器は、前方焦点ではな
く、受動後方焦点のみを使用しているので、フィールド
誤差によりゆがめられた赤血球（EF）が生じる。これら
の血小板および赤血球は分析前には溶解されない。
図５は、図４で使用したインピーダンス変換器で同時
に得られた遷移的な溶解後および溶解前の赤血球集団デ
ータの２個の一次元図である。図5Aは、溶解後の赤血球
ゴーストおよび本質的に影響を受けていない血小板を示
す。図5Bは、溶解前の球状赤血球を示す。これらのパタ
ーンは、全血を低張性食塩水中で希釈することにより到
達した温和な溶血条件下で血液を分析して得たものであ
る。
図6Aおよび6Bは、正常なヒトの全血サンプルの有核白
血球に対する一組の四次元CELL−DYN 3000.2データを
表す同じ対の２次元投影図を示す。図6Bは、これらの２
次元投影図上に、有核白血球の無傷の５個のサブ集団が
五次元で追跡される四次元領域を示そうと試みた図であ
る。Ｌ＝リンパ球、Ｍ＝単球、Ne＝好中球、Eo＝好酸
球、Ba＝好塩基球、Ｒ＝残余、およびＴ＝大きい血小板
凝集体および、全白血球数またはWBCの「閾値外」であ
るchybomicraなどの構造からの人口パルス。
図７は、CELL−DYN 3000装置の光学変換器の感知ゾ
ーンおよびフローセル領域を図式的に示す断面図であ
る。
図８は、CELL−DYN 3000装置系の光学ベンチを図式
的に示したものである。
図９は、溶解耐性赤血球および溶解感受性白血球を含
まない患者から採った全血サンプルに対するCELL−DYN
3000.1により認められた白血球細胞数対時間のアナロ
グプロットである。ストリップチャートレコーダーの記
録は、本発明方法による計数速度モニターを示す。その
図は、型にはまった計数期のみを使用する１個の細胞分
析サイクルおよび強制による再計数を使用する２個の細
胞分析サイクルを示す。
図10は、慢性リンパ性白血病患者から採った単一の全
血サンプルに対するCELL−DYN 3000.1により認められ
た白血球細胞数対時間の２個のアナログプロットであ
る。第二分析での解像では、３分の１が回収された目に
見える細胞であり、３分の２が消滅した目に見えない細
胞であった。
図11は、CELL−DYN 3000.2に対して行ったサンプル
処理サイクルの計数期に対する計数対時間のlogのデジ
タルプロットを示す。図11Aは、溶解しにくい新生児赤
血球の４個の異なるサンプルを示す。
図11Bは、種々の治療段階にある慢性リンパ性白血病
患者から採った５個の血液サンプルに対する計数対時間
を示す。２個の計数期のみは、CELL−DYN 3000操作の
強制再計数モードに拡張した。
図11Cは、異常ヘモグロビン症の二人の成人患者に対
する計数対時間を示す。なお、縦軸は、解像度をより高
くしてある。
発明の詳細な説明 定義 本明細書および請求の範囲にわたって多くの用語を使
用するが、本発明の内容では独自の意味またはわずかに
異なる意味を有する可能性がある。従って、これらの用
語をここで定義する。
全体にわたって使用する「細胞集団」は、同じ細胞型
のクローン的に均一な集団を意味する。血小板は、壊れ
やすいリンパ球およびモノクローン的に同一であるとみ
なしうるリンパ球の集団（Ｔ細胞のサブセットなど）と
同じように、前記定義の意味において均一である。赤血
球も、たとえ骨髄を離れてからの時間が120日間にわた
り、従ってその時間に基づく相違があるとしても、クロ
ーン的には均一である。
本発明の説明において、赤血球以外の血球集団は全
て、白血球集団の広義のサブ集団とする。なぜならば、
血小板、リンパ球、単球、好中球、好酸球および好塩基
球は、細胞質構造がかなり類似しているからである。例
えば、血液を遠心分離すると、これらの細胞は全て、赤
血球の上の白いバッフィーコート層に蓄積する（米国特
許第3,914,985号参照）。同様に、図１のこれらの集団
は全て、図１の全赤血球を容易に破壊する低張性の類似
溶解に対して耐性を示す傾向がある。赤血球とは対照的
な、全白血球のそのような表面的類似性にもかかわら
ず、本発明の中心となる主義は、各々の均一細胞集団が
各々独自の反応パターンを有するということである。従
って、たとえこの簡素化した命名法を使用しても、基本
は、これらの白血球サブ集団細胞系の各々が自律性の明
確な集団として挙動すると言うことである。白血球サブ
集団が共有する特徴は、全体としてのそれらを、数の上
で優勢な赤血球集団から区別する点にすぎない。
「サンプル溶液」は、液体のサンプルを意味する。こ
の用語は、無傷の細胞または溶解により生じた細胞の残
骸を特定の方法で溶液に懸濁したり、血液または尿など
の生理学的サンプルを請求の範囲の方法を実施する前に
希釈または前処理しなければならないことを意味するも
のではない。従って、サンプル溶液は、未希釈体液（例
えば、全血、精液など）および希釈、保存、処理等を施
した液体サンプルの両方をカバーするものである。ま
た、種々の懸濁物および細胞培養（植物細胞の懸濁物な
ど）も含む。特定のサンプル溶液条件を必要とする方法
の場合は、本明細書の中でその条件を明確に説明する。
「動的溶解（Kinetic lysis）」は、本明細書では、
ある細胞集団の反応現象を特徴付けるために使用し、こ
の場合、大部分の細胞溶解が、その集団を含む種々の細
胞群の中で、進行的速度で起こる。「動的溶解または崩
壊」は、細胞数の情報を得る間、計数速度が安定して一
定であると伝統的に仮定されている同定領域において、
無傷の細胞の消失または細胞の残骸の出現が経時的に連
続することを伝えるものである。
「サンプルの単位体積当たりの細胞数」は、本発明方
法に従って得られる計数データの種類を示すために使用
する。計数手段は典型的には、検出器の観測場の信号検
知部を通過する細胞事象の検出可能な数の計数を行うこ
とを十分理解すべきである。この生データ情報はやがて
分割され、単位時間当たり、分析される体積当たりの細
胞事象の計数を与える。通常利用される計数手段は、一
細胞ずつ検出器の中を流れるように、元のサンプル溶液
の実質的な希釈を必要とすることが多いため、生の計数
情報は元のサンプル溶液の単位体積当たりに戻して相関
させ、計数情報を臨床的に価値のあるものする。従っ
て、実際の計数データは、元のサンプル溶液の単位体積
当たりの細胞数を得るために、希釈度または試薬添加を
考慮して処理する。すなわち、本発明の範囲は、細胞を
計数し、細胞を同定する方法を包含し、その方法は、無
傷の細胞に関する通常の安定な定量的情報に基づいた計
数データを利用するものである。
「細胞溶解」は、細胞を保持している条件がその細胞
溶解閾値を超えるときに生じる。その閾値は、細胞のマ
クロ環境およびミクロ環境の物理化学的関数である。そ
の結果、細胞溶解は、細胞を、細胞溶解閾値を超える細
胞を生じる物理化学的条件を特徴とする溶液または環境
に故意にさらすと生じる。装置の細胞分析サイクルの計
数期に細胞集団の構成員が細胞溶解を受ける程度および
細胞溶解が生じる速度は、ある細胞型の存在の同定、あ
る細胞型における異常の存在、および進行性の動的溶解
を受けていることが認められる分析される細胞集団内で
の初期の細胞数の正確な計数に対して有用な情報を提供
する。
細胞溶解を招く純粋に物理化学的な条件が多く知られ
ている。溶液のイオン強度、pHおよびコロイド浸透圧
（osmotic and oncotic pressure）が細胞保護を高めた
り、細胞溶解を引き起こす条件をつくり出すことは公知
である。さらに、温度は、細胞溶解速度に対して強い影
響を有する。本明細書では、この細胞溶解の原因となる
物理化学的条件に関する伝統的理解を拡張して、自動計
数装置に存在して不注意に細胞溶解を引き起こす可能性
のある溶液処理条件も含める。これらの条件には、装置
の流体部分に存在する一様に激しい混合または一定の攪
乱またはせん断応力が含まれる（例えば、米国特許第3,
871,770号に記載）。さらに、特定の細胞型に対して細
胞溶解性を示す、細胞膜に損傷を与えたり細胞膜を変形
したりする公知の溶解剤がある（例えば、米国特許第4,
962,038号；欧州特許出願第444,241号）。他の試薬およ
び条件は、当業者には周知である。
細胞集団反応、細胞溶解および細胞計数は、本明細書
では、従来の装置のこの問題における一次的、すなわち
細胞の直接的可視化の概念と明瞭に関係する。この「細
胞の直接的可視化」は、特定の信号（interrogation）
に対する細胞集団の反応の間接的検出と対比することが
できる。この二次的な細胞検出は、本発明を、関連する
従来技術と明確に区別するものである。さらに、特定の
細胞懸濁物に対してある細胞計数法を選択する場合、間
接的検出の細胞計数事象は、直接測定可能な信号を生じ
る特定の条件下で生じる。例えば、電気インピーダンス
による細胞の測定では、所定の細胞懸濁物条件および電
気信号条件を使用して、細胞懸濁物中の特定の細胞の存
在を示す測定可能な信号を得る。「観察窓」は先に観察
された反応に基づいて選択され、計数事象は通常、この
窓内に導かれる。
溶解性溶液条件および有効な電気信号を誘発する条件
に対する細胞集団反応は、以前は意図に反するもので
（現在は制御し得る）、現在は、その溶液条件または信
号条件を変えることにより系統的に変えることができ
る。細胞の溶解反応が生じると、細胞の残骸またはゴー
ストにより生じる潜在的な信号が初期の観察窓から移動
する可能性があり、その結果、モニターされる集団が全
く見えなくなり、従って初期の観察窓には存在しなくな
る。実際、無傷の細胞集団の反応は、溶解を受けると一
つの場所から消えるが、得られる細胞残骸、残余または
ゴーストの反応が全く離れた場所に現れる可能性があ
る。この方法では、課した条件に反応した細胞集団の消
失または崩壊の「視覚化」または測定の他に、他の観察
窓における細胞残余の出現を「視覚化」または測定する
こともできる。すなわち、所与の領域でモニターした
「崩壊」速度は、実際には正である可能性すらある。そ
のような正の崩壊速度を説明するある機構では、細胞残
余の局所的な増加および離れた所での無傷の細胞の数の
減少を含む。別の機構では、細胞内の主要な変化（顆粒
または内部ゾル膜成分のエネルギー変換ゲル膜への析出
など）を含むとともに、以前には検出できなかった細胞
が突然、可視細胞に変移することも含む。
本発明では、この相対的可視性における飛躍的変化の
概念を、赤血球破壊テスト中に動的溶解を受ける赤血球
集団に関しての、容易に得られる一次元インピーダンス
データによって説明する。提示された種々の考えを伝え
るために、図１〜３ならびに図４および５の内容を以下
で詳しく説明する。図１〜３の両対数データは、流体力
学に焦点を置いた研究用血球分析器により1970年代に得
られ、Clinical Research,1974,22 page 123Aに記載さ
れている。図４および５のデータは、CELL−DYN 900〜
CELL−DYN 3000のCELL−DYN 装置系で使用されてい
る、赤血球／血小板インピーダンス変換器の１種により
得たものである。これらのインピーダンス変換器は、流
体力学上の前方焦点（front focussing）を使用してお
らず、臨床データの表示は線形である。しかし、他の点
では、基本となる可視化現象は、1970年代の研究装置な
らびに1980年代および1990年代の臨床用CELL−DYN 装
置で特に差はない。図１は、希釈された抗凝固全血にお
けるインピーダンス感知により可視化される全血球を示
す。図１の文字は、血小板（Ｔ）、赤血球（Ｅ）、リン
パ球（Ｌ）、顆粒球（G:好中球、好酸球および好塩基
球）および単球（Ｍ）の頻度分布を表す。
慣例により、既知容積の球状ラテックス粒子を使用し
て、EDTAで取り巻いた血小板のインピーダンスの大きさ
のヒストグラムを検定する（図１および4A）。これらの
粒子はまた、比較的硬い球状白血球のインピーダンスの
大きさのヒストグラムを検量化するためにも使用する
（図1;L、ＧおよびＭ）。こうして、これらの細胞のLat
ex Equivalent Electric Volumefemtoliters（LEEV f
1）において横軸の検量が得られる（von Behrens,1975
Mediterranean Macrothrombocytopenia.Blood 45:19
9）。これらのLEEV検量プロフィルは、図１の濃い影の
部分である。
そのようなラテックス球は、赤血球のインピーダンス
の大きさのヒストグラムを大雑把に検量するためにも使
用される。しかし、赤血球は非回転楕円形に、変形して
おり、とりわけ先に挙げた物理化学的変数に対する赤血
球の容積反応の影響が大きいため、この大雑把なラテッ
クス検定を臨床レベルに高めるには、複雑な形状因子を
使用しなければならない。この形状因子補正は、暗黙の
うちに、形状因子、収縮または膨潤因子および電場誤差
項を含む。しかし、この形状因子は通常、明確にコンピ
ュータ計算されるわけではない。そのかわり、血液分析
器では、EEEV f1、すなわち赤血球等価電気容積f1（Ery
throcyteEquivalent Electric Volume femtoliters）で
直接検量される。この正確な目盛りの確立については、
下記のCELL−DYN 3000装置系の血小板および赤血球集
団パラメータという見出しの箇所で説明する。
多くの血液分析器では、EEEV f1がLEEV f1と約1.5倍
異なる（von Behrens 1975前出）。このことは、図4Bお
よび図１に見られる血小板がEEEV単位ならば、その大き
さが容積にして1.5倍大きくなることを意味する。この
変化は、図4Aおよび4Bのデータの両対数表示である図２
において明らかである。
図１の薄く影をつけた赤血球曲線は、下方の横軸が一
般的な球容積を表し、上方の横軸が一般的な球の直径を
表すように、実際は、その元のパルス位置から1.5倍だ
け右に移動させた。その結果、赤血球はEEEVで表わされ
ている。
十分な有核白血球（すなわち、Ｌ、ＧおよびＭ）を得
て、図１の2,500個／μ１のリンパ球および3,100個／μ
１の顆粒球の実際の分布を図示するために、本発明者ら
は、610万個の赤血球および187,000個の血小板を処理し
なければならなかった。この処理は、46分を要した。
上記で強調したように、市販の血液分析器は「スピー
ドの必要性」のため、図１の両対数曲線のピークを大体
の中心とする各々の窓で赤血球、血小板および有核白血
球を個々に処理する傾向にある。例えば、赤血球は図２
および4Bに示すように見ることができる。すでに述べた
ように、図２は実際は生のデータではなく、図4A（血小
板；図２の濃い方の曲線）および図4B（赤血球；図２の
薄い方の曲線で、図4Bの数の上で少ない血小板も示
す。）の生データを両対数表示したものである。
図４はまた、臨床用CELL−DYN 3000.1インピーダン
ス変換器において得られた細胞データに対する２個の容
積ヒストグラムを示す。図4Aは血小板を示し、図4Bは赤
血球を示し、それらは、ルーチン計数サイクル中に計数
した。両方の図で垂直の点線は種々の細胞集団の計数境
界（即ち観察に便利な窓）を表す。図４の２個のヒスト
グラムを対比すると、赤血球ヒストグラム（4B）の垂直
の点線以下の領域は、少数の血小板を示す。血小板ヒス
トグラム（4A）は、赤血球ヒストグラム（4B）の左側領
域に示されるのと同じ血小板集団に関する情報を報告す
るものである。しかし、図4Aのデータは、かなり小さい
観察窓を表す。検量単位（すなわち、LEEV対EEEV）の相
違の他に、図４の２個のヒストグラムは、それらの横軸
の及び幅が大きく異なる。赤血球ヒストグラムの広い窓
と対比して、血小板のヒストグラムの窓は約５倍狭い。
赤血球ピークの右側の肩（図２および4AのEF）は、装
置に起因するもので、フィールド誤差関数として知られ
る（von Behrens and Edmondson;J.Histochen,Cytochem
24 247−256 1976）。焦点の合っていないインピーダ
ンス系に見られるこの赤血球に生じた肩は、図１の希釈
した全血に存在するリンパ球、顆粒球および単球がたと
え高濃度であったとしても、これらの白血球をかなりお
おい隠すであろう。明らかに、図１の優位を占める赤血
球集団が簡単に溶解される（その結果、完全に消失して
見えなくなる）ならば、両対数の図に示した数少ない血
小板および実際にまれな有核白血球が、便利で費用効果
的な迅速分析処理を受けやすくなる。
残留赤血球ゴーストが検知できない程度の全溶血を可
能にする溶血剤（サポニンなど）がある。しかし、直接
的な細胞可視化および間接的な細胞検出という考えを発
展させるためには、低張性溶液による血液希釈を使用し
て赤血球の観察できる反応を変えることが好ましい。こ
うすると、赤血球の体積が膨張し、循環している元の両
凹型の赤血球円板と同じ膜表面積を有する溶解前の球に
なる。低張性がより強くなると、赤血球は突然、「消失
する」か、図4Bのもとの窓において電気的に「不可視」
になるようにみえる。細胞の可視性が飛躍的に変化する
のは、膜が電流および赤血球細胞質を含むヘモグロビン
分子の溶液に対して突然多孔性になるからである。溶解
前の赤血球は、突然、溶解後の赤血球ゴーストになる。
そのとき、電流は、実質的に細胞の周りよりも細胞の中
を流れる。しかし、図5Aおよび３に示すように、赤血球
のゴーストまたは基質構造は信号を出す。とはいって
も、その電気的大きさは、伝統的な臨床上の赤血球の体
積および計数情報を得るために使用する標準的な観察条
件下では、赤血球からの信号より何倍も小さい。計数プ
ロセス中、赤血球ゴーストの信号は、図5Aおよび３に示
すように、血小板サイズの領域に現れる可能性がある。
溶解前の赤血球のヒストグラム（図5B）は、０〜384
の範囲の「gated out」f1〔LEEV〕のデータを示す。血
小板の小さい集団は、図5Bの垂直の点線の左側にあっ
て、観察領域の「gated out」である。図5Aでは、この
「血小板領域」が観察領域であり、高増幅、従って高分
解能で目盛られている。この場合、赤血球ゴーストが優
勢であることがわかる。図３のグラフは、予期される血
小板領域における細胞集団の性質の組み合わせを示す。
図5Aの比例的縦座標では、血小板集団はほとんど無視さ
れる。図３の対数の縦座標ではそれが明らかである。し
かし、本明細書で使用されるように、血小板は図5Aでは
明らかに目に見える。それらは変換器および回路によっ
て認められ、示された。他方、図5Aの赤血球ゴースト
は、図5Bでは不可視であった。細胞は位置的に飛躍的な
移動または変移を受けた。この優位を占める赤血球ゴー
ストの集団は、赤血球に対する低張性条件の溶解効果の
ために古典的な血小板領域に現れ始めた。
実際、図１および３で使用したものと同じ装置によ
り、赤血球の飛躍的な移動にもかかわらず、図３の細胞
構造全体を同時に計数することができる。そのような観
察条件下では、本発明で開示する崩壊速度が０とかなり
異なるときはいつも、観察される異種集団全体の細胞の
平均の大きさが連続的に減少することは当業者には明ら
かである。飛躍的な溶解細胞分解の広いダイナミックレ
ンジにわたって特定の平均パルスの大きさをモニターす
ることは、間接的または二次的な細胞の可視性変化の別
の形に過ぎない。
この可視性の概念を、ここでは、規範的な一次元の環
境から多次元の空間に拡張する。
図6Aは、全血サンプルの有核白血球の同じ四次元デー
タを表す２個の異なる２次元投影を図示したものであ
る。これらのデータは、CELL−DYN 3000.2から得たも
のである。図6Bは、これらの同じ投影を、５つの領域の
大雑把な二次元表示を行うために書き入れた線と共に図
示するものであり、無傷の有核白血球のサブ集団は、そ
れらの領域で、その装置の計数期の間、四次元空間的に
追跡される。領域Ｌにはリンパ球が存在する。領域Ｎは
好中球を含む。単球は領域Ｍに存在する。領域Eoは好酸
球を含む。好塩基球は領域Baに存在する。大きい血小板
は凝集し、chylomicraは領域Ｔに現れる可能性がある
が、溶解により生存する血球構造の全体には含まれな
い。
領域Ｒは、このサンプルに対して無視できるデータが
得られる場所として図6B上に表示される。これらの分析
条件下では、有核白血球はこの領域で視覚化されない。
本発明で開示する方法によれば、白血球残余、ゴースト
または核が通常は認められない領域（例えば、領域Ｒな
ど）に出現することを使用して、課した条件に対する特
定の細胞集団の反応を測定することができる。一定の領
域における細胞残余、細胞ゴーストまたは細胞核の出現
速度は、処理時間０、すなわち測定可能な反応を得るた
めの条件を課す前にサンプルに最初に存在する細胞の数
を同定・特徴付け・分類・計数するために使用すること
ができるパラメータである。
モニターされる細胞応答速度 本発明は、その最も広い概念において、他の細胞集団
から独立した１個の細胞集団における細胞または同じサ
ンプル溶液に存在する不活性なモニター粒子を同定・計
数する方法を提供する。本発明は、種々の細胞集団の生
存特徴をモニターすることにより、ある細胞集団内の細
胞を同定・特徴付け・分類・計数することができる。次
いで、これらの特徴を使用することにより、測定可能な
反応を引き出すための条件をサンプルに課す前のサンプ
ル溶液に元々存在する細胞集団に関する定量および定性
的情報を引き出すことができる。モニターされる細胞の
生存反応は、図5Bに示すような無傷の細胞の直接的な消
失または図5Aに示すような細胞の構造、残骸、ゴースト
もしくは残余の出現（すなわち、無傷の細胞の間接的な
消失）のいずれかであると考えられる。
本発明方法は、赤血球の壊れやすさの測定および特徴
付けに有利に適用することができる。細胞溶解過程中、
経時的に赤血球をモニターすると、問題の赤血球集団に
関する定量および定性的情報が得られ、それは、診断お
よびそれに続く病気の治療に有用であると考えられる。
本発明方法を使用して赤血球の壊れやすさを評価し、
特徴付けることは、多段希釈を使用して同じ結果を達成
する従来の方法とはかなり異なる。例えば、米国特許第
4,040,742号および同第3,606,539号を参照。本発明方法
によれば、そのような測定を単一の浸透圧（tonicity）
で行うことが可能である。
本発明の別の実施態様では、サンプル溶液に存在する
第一細胞集団があり、その第一集団はいつでも作ること
ができて、特定の溶解剤の添加またはサンプル溶液の物
理化学条件を変えることによりその細胞型の細胞溶解閾
値をかなり超えた場合は全細胞溶解を迅速に示す。細胞
溶解後は従って、この第一細胞集団は、この型の無傷の
細胞の領域での細胞の計数機構に対して確実に目に見え
なくなる。同じサンプル溶液に存在し、第一細胞集団よ
りも複雑であるか異なる細胞質構造を有する第二細胞集
団は、これらの条件下では、同様の非常に急速な全細胞
溶解は示さないが、進行性でゆっくりした（動的）溶解
を示す。例えば、赤血球以外（および同様の構造を有す
る細胞液胞以外）のほとんどの型の細胞は、広範囲にわ
たる水和により膨張する傾向があり、余分の内在化した
細胞膜が次第に外在化する可能性があるため、これらの
いわゆる「最小球（minimum cytes）」よりも溶解する
傾向が小さい。この第二細胞集団が関係する時間枠にお
いてともかく溶解を示すという事実およびこの第二細胞
集団の溶解が起こる割合は共に、無傷の第二細胞集団細
胞、細胞ゴーストまたはその両方を計数することにより
モニターされる。計数は、第一細胞集団の完全細胞溶解
を生じるサンプル溶液の物理化学的調整後に始まる最小
限の少なくとも２回の異なる時間的間隔において行う。
次いで、第二細胞集団の反応または崩壊速度をモニタ
ーして得られた情報を使用して、第二細胞集団中の崩壊
細胞の存在を特徴付け、影響を受けた細胞集団をさらに
特定して同定する。この情報はまた、第一細胞集団を溶
解するためのサンプル溶液の物理化学的調整が起こった
時点と分析サイクルの実際の計数期の始まりとの間に生
じた不注意による第二細胞集団の溶解に対して補正する
ことにより、第二細胞集団に最初に存在する単位体積当
たりの無傷の細胞数を正確に推定するために使用され
る。この二細胞集団の不注意による特性の溶解に対する
一時的な補正により、第二細胞集団の計数の正確性がか
なり改善される。このことは、単に第二細胞集団の計数
情報の臨床上の価値を高めるだけではなく、第二細胞集
団に関する、可能性の大きいどんな重要な計数も実際に
可能にすると考えられる。
別の態様では、本発明を、関連する進行性の飛躍的動
的溶解を共に示す少なくとも２種類の集団を含むサンプ
ル溶液に適用する。各集団の各細胞は、可視性において
突然大きな変化を受けるが、集団全体がほとんど即座に
溶解するわけではない。溶解は、サンプル溶液に残存す
る物理化学的条件の調整に応答して、異なる溶解または
崩壊速度で生じる。崩壊速度および／または細胞残余の
発生速度をいわゆる多区分または集団特異的にモニター
すると、すぐに適用される有用な情報が得られる。
飛躍的集団が細胞である場合、この方法は、サンプル
溶液の簡単な希釈により１種以上の細胞集団に好ましい
細胞溶解条件を作ることができるので適用可能である。
この方法はまた、自動計数システムに残存するサンプル
処理条件により不意に動的飛躍的細胞溶解が生じる場合
にも適用できる。この方法はまた、溶解剤をサンプル溶
液に添加して１種以上の集団の進行性動的溶解を開始さ
せる状況においても適用できる。各々の細胞集団の進行
性動的溶解は、溶解開始後の種々の時間間隔において全
てのデータを得ることによりモニターする。溶解により
生存する細胞が細胞集団に特異的な数で発生すると、集
団に特異的な崩壊パターンを利用して特定の細胞集団の
ある性質を定量することができる。これらのパターンの
範囲は、崩壊速度０（または無視できるほど小さい）か
ら非常に大きく、臨床的にかなり重要な速度にまで及
ぶ。そのような速度およびパターンは、ある疾患に対し
ては特徴的ですらある。さらに、特定の細胞集団の計数
のモニターデータを使用すると、正しく分類し、サンプ
ル溶液を調整して細胞溶解を開始する前のサンプル溶液
に最初に存在した各細胞集団の細胞の数を正確に推定す
ることができる。
本発明方法は、骨髄、全血、血漿、脳脊髄液、関節
液、精液および臓器細胞懸濁物などの生理学的流体の示
差的細胞分析に有利に適用することができる。また、培
地に懸濁した植物細胞培養、有核植物細胞構造との懸濁
物における植物液胞および海洋中の有機体の濃縮物など
の他の異種細胞懸濁物にも適用できる。本発明は、溶解
細胞集団の減少および数分以内の即時測定を用いるシス
テムにおいて有用である。溶解により生存する腫瘍細胞
のその後の成長形態において示差的細胞集団反応を誘発
するために溶解後に数時間のインキュベーションまたは
培養を行う方法は含むものではない。また、本発明は、
存在するバクテリアを続いて培養するために血球を微生
物学的に溶解する方法を含むものではない。
赤血球−白血球系 好ましい態様では、本発明は、全血サンプルに存在す
る白血球サブ集団の分類、特徴付けおよび計数に有利に
適用できる。上述したように、赤血球−白血球系はかな
り研究されており、特に全溶血を使用して白血球を処理
する方法は周知である。
また、どの溶血性希釈剤も幾分かは白血球溶解性であ
り、特に溶血条件が強い場合はそうである。そして結局
は、一定の白血球集団の細胞が、あるとき、それらの特
定の溶血閾値を超える。細胞計数システムが、予想され
る無傷の白血球の存在を記録するために組み立てられる
場合、均一な白血球サブ集団内の各崩壊細胞は、その計
数システムの通常の領域で見ることができない結果、失
われる。これらの白血球細胞は、溶解感度に関して示差
的挙動または相違する成熟を示すので、あるとき、それ
らの溶血閾値に達する。サブ集団の膜には、その集団を
代表する典型的または中位の細胞よりかなり感度が高い
ものもある。他は感度がかなり小さい。これらの白血球
集団の重要な特徴は、それらが溶解の処理を受けると、
どの特定集団も、延長された時間にわたって測定可能な
無傷の細胞の消失または細胞残骸の発生を連続して示
し、この連続した崩壊または発生プロセスを、用いた特
定の細胞溶解条件下で、この特定の集団に対して特徴付
ける重要な特定の速度情報として提示するために使用で
きることである。この特定の速度情報は、最初に存在し
た無傷の細胞集団を正確に計数し、分類するために使用
することができる。また、この特定の速度情報は、病気
の分類、従って患者の治療および患者の継続管理におい
て臨床上重要である細胞集団の、先に測定できなかった
性質を特徴付けるために有用となる。
例えば、多くの壊れやすい細胞を有するサブ集団の細
胞を含むと言われるサンプルでは、壊れやすい細胞とと
もにその細胞集団全体を含む種々のコホート（cohort
s）のこの連続した動的示差挙動が保存される。言い換
えると、そのサブ集団全体は、顕微鏡下で認識される明
らかに壊れやすい細胞だけでなく、変化した特定の挙動
パターンを有する。これらの壊れやすい細胞は氷山の一
角のようである。氷山は、「常に目に触れる以上のも
の」がある。同様に、感受性のあるサブ集団の不規則性
または認識される不均一性に対して均一性も存在する。
この均一性ものは、長年、本発明者の一人が研究してき
た血球集団均一性と類似する（例えば、Homogeneous He
terogeneity of Platelet Populations,W.E.von Behren
s,Proc.Aust.Soc.Med.Res.2:339,1970）。しかし、本発
明ではそれを、信頼性のある細胞計数の困難なプロセス
中の、生か死か、一か八かの動的飛躍現象として初めて
利用するものである。影響を受けるサブ集団細胞クロー
ンはどのコホートも、溶解耐性もしくは影響を受けない
細胞クローンまたは典型的な白血球由来の対応するコホ
ートよりも溶解に対する感受性が大きい。これは、クロ
ーナル集団の単一の均一崩壊速度パラメータの物理的解
釈である。従って、これらの全血サンプルの完全溶血が
行われ得る一方で、分析器によって白血球数が得られる
信号の発生期中に壊れやすい白血球サブ集団が進行性の
動的溶解を受ける可能性がある。（暖かい赤道の水での
氷山の消失に要する時間は、目に見える頂上の大きさに
単に比例する。この消失時間は、最初の頂上を溶融する
のに要する時間よりはるかに長い。）分類可能な均一集
団の進行性溶解の間の２個以上の時点で集団細胞の計数
データを取ると、集団の崩壊または細胞残骸の発生の数
学的表示が得られる。
一方では、この数式化またはパラメータ表示を使用し
て、溶解が始まる前のサンプルに最初に存在するサブ集
団全体の数を正確に推定することができる。これは、崩
壊速度（または発生速度）を分析プロセスの時間０に外
挿することにより行う。この時間０は、溶血を開始する
ためにサンプル溶液に溶血剤を添加した瞬間、またはそ
のサンプル溶液の物理化学的条件の調整を行った瞬間と
して定義し、知られている。他方では、このパラメーラ
表示により、細胞分類および病気の診断の両方において
有用な新規情報が得られる。
本発明を表す、細胞のサブ集団またはクローンが均一
に挙動することは、一般的な生物学的原理の認めるとこ
ろではなく、むしろ、信頼できる細胞計数に関する実験
室での日常的研究の際に、飛躍的な時間的に相違する生
存溶解の関係において利用されるものである。
本発明によれば、細胞の溶解または崩壊速度は、細胞
の純粋または不均一な懸濁物に含まれる個々の細胞（氷
山の頂上または雪片）よりもむしろ細胞の集団全体（氷
山全体）に起因するものであり、それに対して計算され
る。これは、同一の均一なクローナル集団内の細胞同士
の構造的類似性が高いために可能である。無数の研究か
ら、この構造的類似性は、そのような集団の細胞同士の
飛躍的溶解反応が実験的に測定された機能的類似性に反
映されると結論づけられる。本発明方法に従って分析さ
れる、少数の壊れやすい細胞を示す細胞集団（例えば、
慢性リンパ性白血病患者のリンパ球集団）を含むサンプ
ルは、「悪性の」血液皮膜に認められる少数の壊れやす
い細胞ではなく、細胞集団全体が、変化した挙動パター
ンを示す。本発明者らは、血液サンプルのどのサブ集団
のどの細胞も、in vitro血液保存中に同様に影響を受け
て悪性血液皮膜を生じるが、保存血液サンプル内の種々
の血球サブ集団が損傷を受ける速度には相違があること
を知っている。また、新しい血液サンプルにおいて、血
液皮膜に少数の「ストレスにより誘発される」壊れやす
い細胞を示すクローナル細胞集団のどの細胞も、血液皮
膜調製物のせん断応力下で壊れやすい細胞を示さない、
影響を受けない白血球集団（例えば好塩基球または好酸
球）の対応する細胞に比べて溶解に対する感受性が大き
いことを知っている。もちろん、白血球分化の初期段階
では、クローン異常もある。従って、全血球の幹細胞レ
ベルでの突然変異は、ちょうど、不十分な抗凝固法およ
び不利な血液保存条件が多くのサブ集団に同時に影響を
及ぼすように、いくつかの血球集団の溶解特性に同時に
影響を及ぼすことができる。
本発明は、多くの異なる細胞系および多くの異なる細
胞検出系に有利に適用される。本発明は、細胞を希釈す
る公知の細胞分類法のほとんどを使用して行うことがで
きる。この方法はまた、均一で特異的なクローン細胞の
崩壊または発生速度の測定および使用にて依存している
ため、新しく開発される細胞分類法にも将来適用でき
る。これらの速度を得る操作は、細胞型および細胞計数
法に依存しない。本発明は、細胞集団を同定、特徴付
け、分類および計数するための細胞の大きさの測定値と
して電気インピーダンスを使用するもの（例えば、Coul
ter S Plus IV Blood Cell AnalyzerおよびCELL−DYN
1600 Blood Cell Analyzerのインピーダンスおよび光学
変換器モジュール）などの自動細胞計数装置において行
うことができる。
例えば、本発明は、細胞集団の分類・計数を行うため
に選択的蛍光染色法または標識および光散乱または吸収
現象などの光学的流動血球測定法を用いる装置において
行うことができる（Cytometry,3;68−74,1992;Becton−
Dickinson FACScan and FACSort systems and Abbott C
ELL−DYN 3000および4000シリーズの装置）。この装置
の列挙は、本発明方法による細胞の同定、特徴付け、分
類および計数のために使用できる方法を例示するための
ものであって、これらに限定されるものではない。光
学、電気抵抗、電気容量、超音波および他の多くの細胞
を感知するための原理は、同時または逐次的に全てを結
合させて、流体の各要素の、信号を発生する細胞または
細胞様構造の有無（出現または消失）について質疑応答
することができる。これらの構造は、無傷の細胞、凝縮
細胞、種々の分解段階にある死細胞、溶解プロセス開始
後に放出される細胞成分、有核細胞残骸、核を含まない
細胞残余または古典的な細胞ゴーストおよび、特に植物
の場合は細胞の液胞が考えられる。それらは、粒状の、
妨害する構造または関与する構造であってもよく、それ
らは、別の観察窓に見えたり、見えなくなったりする。
記載したこれらの計数システムは、本発明の原理を説
明するための便利な手段として役立つに過ぎない。ある
方法によれば、少なくとも２個の集団を含むサンプル溶
液を計数装置にかける。次いで、ある試薬を添加して一
方（第二）の細胞集団の完全細胞溶解を誘発し、別の
（第一）細胞集団の細胞の同定、分類および計数を行
う。第一細胞集団の崩壊パターンの測定では、通常、溶
解誘導試薬をサンプル溶液に添加する時を、細胞処理サ
イクルの時間０として指定すると都合がよい。ある公知
の計数装置では、希釈し、溶解したサンプル溶液を、本
質的には一細胞ずつ検出部に流し、第一細胞集団の細胞
の細胞型および細胞数に関連した信号を測定する。
しかし、溶解誘導試薬を最初にサンプル溶液に添加し
た後、即座に、希釈し、溶解したサンプルが信号検出部
を流れ始めるわけではない。理想的には、第二細胞集団
の溶解を完全にすべきであるが、希釈し、溶解したサン
プル溶液が検出部を流れ始めるまでに第一細胞集団の崩
壊がいくらか不注意に始まってもよい。伝統的に、正確
に知りたいことは、第一細胞集団（白血球）の数値によ
る細胞濃度である。このために、目に見える各々の細胞
集団の挙動を経時的に観察し、計算する。第二集団の無
傷の細胞および目に見える可能性のある残骸は、第一細
胞集団の数値による推定濃度の正確さを保証するために
必要な情報以上に発見的な情報を提供する可能性があ
る。
一定流量条件を血球計数器または分析器に設けると、
信号検出器が目に見える細胞構造によって生じる信号を
捕獲する。これらの信号は経過処理時間信号を含み、検
出部を通過する各々の細胞構造（または結果としての細
胞群）を独自に固定する。この信号発生および検出期
は、計数期開始後のある時間にわたって継続する。検出
部を連続して定常流量で流れる希釈サンプルの信号発生
・検出期の間、サンプルの単位体積当たりの計数データ
が、２回以上の間隔を置いた計数期中に視野内にある全
細胞構造に関して集められる。特定の時間間隔の間、自
動装置は発生した全信号を使用して、検出部を流れる目
に見える全細胞様構造物に関する計数情報を保存し、提
供する。これらは、別々の体積の希釈サンプルに存在す
る第一または第二細胞集団のいずれかに属する。サンプ
ル分析サイクル（図９および10）の計数期のＡ部分の
間、各細胞集団の生の計数データを使用すると、単位平
均時間Ａ当たり、単位体積当たりの細胞数が得られる。
次に、計数期の後の平均時間Ｂに検出部を通過する希釈
サンプルの第二の別の体積の分析に基づいて、単位体積
当たりの細胞数がその装置から得られる（図９および1
0）。この計数操作は、サンプル溶液が検出部を通過す
るにつれて、計数期の間、短い時間間隔で繰り返しても
よい（図11）。サンプル希釈度および他の試薬の添加に
関する生データに対して調整をする。
次いで、平均時間ＡおよびＢ（および所望により、そ
の後の時間）に得られた細胞計数値を使用して、観察デ
ータの点を通る曲線を作り、その曲線を細胞分析サイク
ルの時間０に延ばすことにより細胞崩壊速度を計算す
る。細胞崩壊速度を得るには、確かに、平均時間Ａおよ
びＢでの計数より多くのデータポイントを使用すること
が考えられる。２個の点および単一の崩壊細胞集団は、
有用な曲線あてはめ法の最少条件を表したに過ぎない。
速度関数は、サンプル溶液に最初に存在する細胞集団の
正確な計数値を得るために、サンプル分析サイクルの時
間０に外挿される。所望の細胞の不注意による溶解また
は妨害する細胞の不完全な溶解のために崩壊速度が重要
（正または負）であるときはいつも、試薬添加により不
正確になる細胞計数値をこの外挿により補正する。この
補正は、無傷の細胞に対しては意味のある（０でない）
負の崩壊速度を利用することができ、分解した細胞、細
胞ゴーストまたは残余などの細胞構造の出現に対して
は、意味のある（０でない）正の発生速度を利用するこ
とができる。関与する最初の細胞に対する崩壊速度の概
念は、これらの変移速度−出現および消失−の両方を含
むものである。
細胞の型および数の指標として種々の細胞感知原理
（光散乱データなど）を使用する従来の流動血球測定装
置には、改良して検出部を通過する各細胞のデータのリ
ストに時間要素を加えることができることがわかった。
次いで、この「時間タグ（time tag）」を使用して、細
胞処理サイクルの時間０に不安定集団に存在する細胞の
数の計算を可能にする細胞崩壊速度を計算する。
しかし、そのようなデジタルデータ処理は本発明の実
施に必須ではない。図９および10に示すように、作動し
ている標準流動血球測定器の適切な細胞溶解モード下で
は、適切に調製したサンプルに関する連続的な２個の計
数により、本発明の実施に必要な最小の情報が得られ
る。以前、図10の第一分析によって示される「不安定
な」計数条件は、ぜひとも避けなければならなかった
が、これは不可能であることが多かった。現在は、その
ような非常に恒常的な不安定性を、図10の第二分析で示
すように系統的に利用することができる。
全血サンプルに存在する白血球細胞集団の固定、特徴
付け、分類および計数に関して、本発明の好ましい態様
を記載する。この細胞系はかなり研究されており、本発
明は、既存の血球計算システムに重要な強化を与えるも
のである。これらの強化は、計数データの正確さを改善
することによりこれらのシステムの能力を伸ばすもので
ある。本発明はさらに、細胞崩壊および／または細胞崩
壊速度の利用に基づいて、ある異常な細胞型または条件
の同定を可能にする。
非常に高価な方法に頼ることなく、赤血球の存在下で
白血球集団を計数するためには、第一に、図１で優位を
占める多数の赤血球を溶解することが必要である。これ
は、比較的単純で、費用効果のある検出原理を利用して
あまり多くない白血球集団の可視化を可能にするために
行う。しかし、赤血球をより溶解耐性にする条件が存在
する。上記ですでに述べたように、赤血球は、ヒト胎
児、ヒト新生児、ヒト以外のある種の哺乳類、ヘモグロ
ビン障害患者および高血漿蛋白濃度の患者から採った血
液サンプル中では溶解がさらに困難である。赤血球の溶
解耐性は、未溶解赤血球がセンサーを浸す傾向にあるた
め、不十分な溶血は不十分な白血球計数情報をもたらす
傾向にあるというジレンマを生じる。他方、完全な溶血
を行うためにより強い溶血剤を使用しても、不注意な白
血球溶解により、白血球計数の正確さには逆効果とな
る。
本発明の一態様によれば、たとえ以前はこれらの溶解
しにくい赤血球のためにかなり困難であった、列挙した
状況においても、完全溶血のために強い溶血剤を使用す
る。強い溶血条件による白血球集団に対する悪影響は、
計算される白血球崩壊速度またはパターンの使用により
補正する。これは、個々の白血球集団基準に関して外挿
することにより、細胞分析サイクルの時間０での白血球
計数値が正確に推定される（図10）。
別の態様によれば、本発明方法を使用して、全血サン
プルに存在するいわゆる壊れやすいリンパ球の存在を検
出する（正確に計数する）。リンパ球は、慢性リンパ性
白血病、感染性単核球症および他の２、３の障害に苦し
む患者では、溶解に敏感であることが知られている。こ
の溶解感受性は、赤血球の細胞溶解閾値を超えるのに必
要な条件下でかなりの数のリンパ球が溶解することを含
む。これは、このクローナルな溶解感受性を完全に妨害
するという無益な試みにおいて、細胞を歪めて固定し、
安定化させるための苦心して作った高価なシステムを使
用するときでさえ生じる。
この態様の実施においては、溶解耐性の赤血球を克服
するための強い溶血剤はやはり使用するが、リンパ球数
は経時的に密接にモニターする。リンパ球の計数は、溶
血剤を添加した後、サンプルを検出部に流しながら、選
択した時間間隔で行う。これらのリンパ球計数値は次い
で、時間の関数として解析し、サンプル溶液に存在する
リンパ球の数において測定可能な分解が有るかどうかを
調べる。次いで、崩壊速度の少なくとも１個の閾値を溶
解感受性リンパ球の存在の指標として確立する。この情
報は、切り取って、サンプを採取した患者の病状の診断
の助けとするため使用することができる。そのようなス
クリーニング情報は極めて価値があると考えられる。ま
た、その情報は、疾病の治療の有効性をモニターするた
めにも使用することができる。既知疾病を新たに可能と
なるサブカテゴリーの間で区別するために使用すること
すらできる。
この態様では、所望により、異なる時間間隔から得た
リンパ球計数情報を使用して、直線カーブフィッティン
グ（linearcurve fitting techniques）によりリンパ球
崩壊速度を得ることができる。これは、計数速度パター
ンを崩壊速度情報によって時間０に外挿することにより
正確なリンパ球数の推定を可能にする。次いで、サンプ
ル溶液に最初に存在する全リンパ球集団の正確な推定も
可能である。
また、完全な溶血は、濾過した海水および蒸留水を、
ほぼ等張性の海水１体積に対して極めて低張性の蒸留水
が４体積を超える割合で混合することにより得ることも
できる。その結果得られる溶血性が強くて非常に低張性
の希釈剤は、低コストで世界的に利用可能であることか
ら、白血球集団を確実に計数するのに有利である。しか
し、この理想の溶血剤は、そのかわりに白血球溶解性も
有するので、今日まで全く受入れられなかった。この白
血球溶解活性は、現在ではモニターすることができ、最
終の白血球数の最終合計および小計において説明するこ
とができる。CELL−DYN 3000シリーズの装置 本発明の好ましい態様では、Abbott CELL−DYN 3000
が、通常は循環しない別の細胞型の認識フラッグを出す
ことにより通常の５個の白血球サブ集団の区別を行う
（NCCLS H20−Ａ）。本明細書に開示した第５番目の時
間的次元を追加する前は、CELL−DYN 3000の白血球示
差データが、染色されていない白血球の４次元光散乱特
性のみに基づくものだった。これ以前の方法は、本出願
人による同時継続中の米国特許出願第07/352,106号（19
89年５月15日出願；発明の名称：流動血球測定の溶解剤
および５種類の白血球の示差計数を可能にする方法）に
記載されている。この特許出願の関連部分は、参考とし
て本明細書に組み入れる。
CELL−DYN 3000では、サンプル処理が150〜350μｌの
全血の吸引（サンプリングモードに依存する）で始ま
る。吸引は、開管または閉管のサンプラーにより行わ
れ、使用する装置の型に応じて手動または自動サンプル
供給を使用する。吸引されたサンプルはせん断バルブに
入り、正確な３個のアリコートが取り出される。32μｌ
のアリコートの血液は溶血剤で250倍に希釈され、全白
血球数（WBC）の測定および白血球の区別のために光学
変換器に送られる。12μｌのアリコートの血液はヘモグ
ロビン試薬で250倍に希釈され、ヘモグロビン計として
公知の分光光度計であるヘモグロビン変換器に送られ
る。0.8μｌのアリコートの血液は、ほぼ正常緊張状態
（normotonic）の血液希釈剤で12,500倍に希釈され、血
小板および赤血球のパルスデータの発生のためにインピ
ーダンス変換器に送られる。
WBCおよび白血球分析 CELL−DYN 3000は、光学変換器を使用して白血球の
光散乱特性を測定するものである。変換器の流動セル10
を図７に図示する。赤血球が名目上は溶解している血液
の懸濁物が低速でサンプルノズル12から噴出される。ノ
ズルでは、該懸濁物が、移動速度の速い層流の被覆流14
と接触する。流体力学焦点法（focussing）として知ら
れる方法では、サンプル流が中央コア16まで細くなる。
溶融シリカ流動セルでは、このコアの直径が25〜30μｍ
である。通常は、この装置により、一定時間にレーザー
ビーム＃の感知領域に存在するのは単一の白血球のみで
ある。従って、同所共在の問題は最小になる。もし、赤
血球が効率的に溶解されていなかったならば、典型的に
は、妨害する100以上の赤血球がこの感知ゾーンに存在
したであろう。さらに、流動チャンネル18は物理的口径
が大きい（250μm2）ので、恐らく詰まることはない。
それにもかかわらず、インピーダンス変換器で使用され
るもっと小さい口径の分解能を得ることができる。
図８は、CELL−DYN 3000光学ベンチの図を示す。本
出願人の米国特許第5,017,497号（「粒子の弁別器およ
び方法」）の明細書を参考として本明細書に組み入れ
る。光源20は、偏光した5mWのヘリウム−ネオンレーザ
ーであり、波長は632.8nmである。レーザーヘッドは、
偏光面が垂直になる方向に向いている。レーザービーム
の向きおよび焦点は、前方表面鏡22、円柱レンズ24、別
の前方表面鏡26、垂直レンズ28およびレンズ30により決
定される。この方向決定により、サンプル流の中央コア
32の領域におけるビームの強さは、必ず、「one over e
squared」直径が約70μｍのガウス分布になる。水平面
では、エネルギープロフィルが、平らな上部の幅が約80
μｍである「シルクハット」状を示す。この配列によ
り、サンプルコアが正常な位置からわずかに逸れたとし
ても、信頼できるデータが装置から得られるようになっ
ている。
焦点に集まったレーザービームが溶解により生存する
白血球に当たると、全ての方向に光が散乱する。光の波
長は細胞の大きさに比べて小さいので、この散乱現象は
Mie理論およMillerマトリックスにより説明される。散
乱光の一部は４個の光検出器により集められる。２個の
シリコン光ダイオード34および36は、レーザービームの
軸に関して約１〜３度および約３〜10度の半分の角度で
散乱する光を測定する。これらの光ダイオード34および
36は、各々「０度」および「10度」の検出器と言う。直
接のレーザー光は遮蔽バー38によってブロックされる。
これらの小さい角度での光散乱は、細胞の大きさに支配
される複雑な作用であり、細胞構造または細胞の複雑さ
がいくらか寄与している。
レーザービームの軸に対して90度で散乱する光は、２
個の光乗算器（PMT）40および42を使用して集められ
る。光ダイオードでない光乗算器は、大きい角度で散乱
する光が比較的少ないので、90度のチャンネルで使用さ
れる。衝突する偏光が単一表面から反射するだけである
ならば、その最初の偏光垂直平面は保持される。しか
し、例えば多くの顆粒または異方性構造によって、１個
のセル内で何回も反射されると、散乱光は偏光角を変え
ることができる。この現象をCELL−DYN 3000で利用す
るために、一方のPMT42の前に水平偏光器41を設ける。
この偏光器は、垂直に偏光された光が光乗算器に当たる
のを防ぐ。従って、「90度の偏光の偏りをなくす」PMT4
2によって検出される光は、細胞構造（通常は白血球）
との相互の作用により「脱偏光」された光である。第二
の光乗算器40（「90度全（90 degree total）」PTMとい
う）は、45度に置いたカバーガラス43に対して反射され
た散乱光を受け入れる。この直交する光の大部分は、ま
だ垂直に偏光されている。従って、このセンサー40は、
直交方向に散乱した光全部の良好なモニターとなる。
直交散乱チャンネルは、対物レンズ44および散乱スト
ップ46により完全なものになる。角度の小さい散乱チャ
ンネルは穴のあいた鏡48も含む。
４個の光センサーから得られるデータを使用して、四
次元の散乱図（図６）を作ることができる。これは、三
次元の「固体」表現を空間で回転させることができるそ
の装置のコンピュータグラフィックを使用して見ること
ができ、第４の次元は、その第４の次元で異なるパルス
の大きさを表す画素に対する種々の色の選択により表現
される。証拠として紙面にのこすために、四次元の散乱
図は、二次元の散乱プロットまたは投影の対を使用者が
６個選択して、また、一次元のヒストグラム投影を使用
者が多数選択して確かめることができる。四次元の散乱
図の２個の二次元表現を図6Aおよび図6Bに二重に示す。
一次元ヒストグラムは、図４および５に示すフォーマッ
トと類似する。
白血球の計数および白血球のサブ集団への分類（また
はWBC）に使用される溶解剤は、白血球を急速かつ完全
に溶解するように調製するのが最良である。CELL−DYN
3000は、芳香族オキシエタノール、有機緩衝液（pHが
8.5またはその付近であり、pH緩衝能を付与し、溶解剤
の電導性を増加させる働きがある。）および非イオン性
洗剤成分の水溶液から成る溶解剤を使用することができ
る。使用される芳香族オキシエタノールは、好ましく
は、２−フェノキシエタノールである。有機緩衝液は、
トリス/HCl、ホウ酸、グリシル／グリシンおよびビシン
（BICENE）から成る群から選択される。非イオン性洗剤
は、Triton X−100、Triton X−114およびポリオキシエ
チレンまたはサッカライド誘導洗剤から成る群から選択
される。本発明が導入される前の好ましい溶解剤は、本
質的に20〜80mMの濃度の２−フェノキシエタノール、ト
リス/HCl緩衝液およびTriton X−100で構成されてい
た。
本発明を利用するための特に好ましい態様では、溶解
剤が、Triton X−100の水溶液、２−フェノキシエタノ
ールおよびトリス/HCl緩衝液を含む。全血を過剰（典型
的には50倍）のこの溶解剤と混合する。赤血球の飛躍的
動的溶解は、浸透圧性の衝撃、非イオン性洗剤の作用お
よび約8.5のpHの組み合わせにより極めて急速に起こ
る。溶解剤の最適組成物は以下の通りである。
２−フェノキシエタノール（25℃で液体） 750ml トリス/HCl緩衝液、pH8.5（500mMトリス） 1MのHClでpH8.5に滴定 1500ml 0.5％（v/v）Triton X−100水溶液 100ml 脱イオン水 100lになる量 最適の組成物において、２−フェノキシエタノールは
約41mMの濃度で存在するが、有用な濃度範囲は20〜80mM
である。トリス緩衝液のpHは、その性能に重要な影響が
ないならばpH8.1まで下げることができる。その緩衝液
のpHが9.0以上に大きくなると、試薬は溶血性がより大
きくなり、より急速な飛躍的動的溶血が生じる。痕跡量
（約５％v/vまでのTriton X−100）または同様の非イオ
ン性洗剤があると、典型的には溶解しにくいとみなされ
ている検体における溶血が完全なものになるが、この存
在は、飛躍的動的溶血の促進もする。本発明以前は、こ
れが、壊れやすい白血球を有する血液サンプルおよび溶
解感受性細胞を有する血液サンプルにおけるジレンマで
あった。血液は４〜６時間以上、invitro保存するから
である。
トリス/HClの代わりに他の有機緩衝液を使用してもよ
い。これらのうち、pHが8.5またはその付近のものは、
ホウ酸、グリシルグリシンおよびビシン（CalBiochem
製）があり、これらを溶解剤に使用してもよい。Triton
X−114は溶解剤の非イオン性洗剤成分として使用でき
る。他の親水性洗剤は、ポリオキシエチレンまたはサッ
カライドヘッド基を有するものから選択することができ
る。
白血球の５種類の示差は、時間および光散乱に基づい
てのみ求められる。細胞化学染色は必要ないので、CELL
−DYN 3000.2は、費用効果の非常に高い、迅速なCBCを
WBC示差とともに提供する。スループット（througlpu
t）は、サンプルの処理法に応じて、１時間につき約100
の血液サンプルである。各白血球の散乱特性によって得
られるデータは、先に説明した４個の光検出器から得ら
れる。
図９は、CELL−DYN 3000.1と連結したストリップチ
ャートレコーダで記録した計数速度を示す。そのデータ
は、３つの異なる全血サンプルを表す。それらのサンプ
ルの全赤血球は、サンプル分析サイクルの計数期の開始
までに急速な溶解による崩壊が完了している。白血球サ
ブ集団はどれも、不注意による重要な崩壊を示さない。
なぜならば、サンプル分析サイクルの型にはまった典型
的な計数期の間、溶解生存細胞数の経時的減少が実質的
にないからである。この計数速度の安定性を強調するた
めに、図９のサンプル２および３に対するサンプル分析
サイクルの間、分析器を強制的に再計数モードにした。
この再計数能は、通常は、サンプルのWBC濃度が非常に
低いときの自動発生に対して備えてある拡張計数モード
である。15秒の日常的再計数時間の間、縦軸上で相対頻
度として、また全血数として示される白血球数において
明らかな崩壊はない。ストリップチャート計数速度で明
らかな少数の異常は、ポアソン型の確率的ランダムさに
基づいて予想される。
図10は、慢性リンパ性白血病であることがわかってい
る患者による対照的なストリップチャート結果を示す。
図９および10に示すデータは、溶血性希釈剤（上述）を
使用して得た。その希釈剤は、最も溶解耐性のある赤血
球さえも充分に溶解することができるように選択した。
図10は、各サンプル分析サイクル中の日常的計数および
強制による再計数を示す。さらに、２個の該分析サイク
ルをそのサンプルに対して行う。再分析中の一致するパ
ターンから明らかな白血球数の減少は、不均一または混
合した白血球集団内に少なくとも一種類の溶解感受性を
有するサブ集団が存在することを示す。壊れやすい均一
なリンパ球集団は、溶解過程にある。図10の第二追跡に
加えた点線は、白血球の崩壊パターンまたは白血球の計
数速度のサンプル分析サイクル時間０への外挿を表す。
２個の外挿により、最初の白血球数が302,000および30
1,000細胞／μｌ全血となった。これらの数字は、骨の
折れる手動法により正しいことが確認された。
図６、９および10を利用すると、この全血サンプル中
の壊れやすいリンパ球の存在を特に同定するために、本
発明方法をどのように使用することができるかを示すこ
とができる。
図９および10のモニタリングは、図6Aに見られる全デ
ータに対して行う。装置が正確に作動しているならば、
この白血球領域での計数の減少が、サンプル中に溶解感
受性を有する細胞が存在することを示す。というのは、
この希釈剤の場合、メカニズムは知られていないが、モ
ニターされる全領域の外側に存在する必要がある目に見
えない細胞から細胞構造が出現することにより、この全
領域の計数速度が増加できるようにこの四次元の全白血
球領域が選択されているからである。言い換えると、特
定の分析条件では、リンパ球の崩壊を、公知の細胞構造
発生または粒子発生により遮蔽することができない。
次に、ソフトウェアのアルゴリズムにより、図6B1の
二次元図で領域Ｒとして投影されるサブ領域に四次元パ
ルスを送ることによって、このサンプルの計数速度パタ
ーンを調べることができる。〔図６のサンプルは、図10
の特定のサンプルを表すものではない。図6Bの領域表示
はかなり動的であり、詳細にはサンプルごとに異なるこ
とを理解しなければならない。〕領域Ｒは、溶解しにく
い赤血球が崩壊パルスパターンの理由となる場合、崩壊
パルス速度が予想される領域である。〔あるいは、動的
に位置するL/R閾値は、本発明によれば、経時的に移動
する。〕領域Ｒはまた、ある無傷の白血球（例えば前骨
髄性白血病由来のもの）が例外的に分解し、核の残りが
この領域に運ばれるとき、計数速度の増加が生じる領域
でもある。その場合、図6Bの領域Ｒの上のモニターされ
る全領域に、少なくともこの大きさの計数減少が現れ
る。
そのような領域Ｒに特異的な計数の増加が、相互領域
Ｍの減少によって説明される場合は、「不安定な細胞領
域で、前単球性白血病と一致する。」という解釈を示唆
することができる。図10の特定の場合は、領域Ｒにおけ
る無視できるほど小さいが安定な計数速度の増加も減少
もなかった。全白血球計数領域における減少全体は、リ
ンパ球領域Ｌでの同様の質疑応答（interrogation）に
より説明された。その結果、壊れやすい、または溶解感
受性を有するリンパ球の集団が見出され、ウィルス性感
染および白血病が考慮されなければならない。全血１μ
ｌにつき299,000という補正された非常に高いリンパ球
数のために、装置のインタープリティブレポートは、
「リンパ球集団は非常に壊れやすく、本発明の分析条件
下（正常値:0）での標準化された崩壊速度は＋＋＋であ
る。」とともに、数値による正しいアウトプットを補充
することができる。報告された全血１μｌにつきリンパ
球299,000という計数は、このinvitro崩壊現象に対して
補正されている。この血液情報は、慢性リンパ性白血病
の診断と一致する。
CELL−DYN 3000.2を使用する本発明のこの好ましい
白血球の態様によれば、溶血により生存する細胞構造全
体が、サンプル処理サイクルの計数期中にモニターされ
る計数速度である。各々500ミリ秒の間隔に対して生き
残る細胞数が、光散乱法によって得られる。
図11は、この方法でCELL−DYN 3000.2により生じる
崩壊速度データの型を示す。図11Aは、いわゆる溶解し
にくい赤血球を有する４個の新生児血液サンプルに対し
て得られた全白血球計数速度を表す。計数減少全体は、
図６の領域ＲおよびＬにおける崩壊によって説明され
た。今、この問題を切り取ると、CELL−DYN 3000.3に
より、図９および10のサンプル分析サイクルの開始後45
秒間待った後、計数期を開始することが可能である。こ
れらの分析条件下では、新生児の赤血球は図６の領域Ｌ
をもはや侵食することはなく、全白血球サブ集団は一般
に、安定した計数速度を与え、そのような新鮮な血液サ
ンプルに関する計数を補正する。
図11Bは、種々の治療段階にある慢性リンパ性白血病
の５人の患者から採った血液サンプルに対して得られた
崩壊パターンを示す。これらの患者の一人は、標準化し
たリンパ球の壊れやすさが＋＋＋＋であり、これは図10
に見られるものに匹敵する。中央の二つは壊れやすさが
＋＋であり、残りの二つは壊れやすさが＋である。その
壊れやすさが統計的に無視できるものではないという事
実は、図11Cと同様に説明される。その図において、縦
軸の目盛りは、かなり高い解像度が示されるようにつけ
てある。図11Aおよび11Bでは、水平線の低い方から高い
方まで、数が10倍増加している。図11Cでは、その増加
がほんの1.5倍である。図11Cの２個のプロットをより解
像度の低い方眼上に表すと、それらは実際、図11BのCLL
プロットの４個のように、ほとんど水平線になるであろ
う。
図11Cに示した患者は、図11Aの患者と同様、溶解しに
くい赤血球を有する。しかし、前者は成人であり、その
メカニズムは、新生児の生理的に異なるヘモグロビンＡ
とそれらの細胞の形状の相違との組み合わせというより
も、異常ヘモグロビン症である。図11Cの場合、崩壊
は、図6B1の領域Ｒにおける崩壊速度によって完全に説
明された。その結果、WBCは、CELL−DYN 3000.1では、
これらのサンプルに対して誤ってはいなかった。他方、
CELL−DYN 3000.2（および3000.2A）に本発明を導入す
ると、これら二人の患者のヘモグロビンにおける先天的
な異常を、全く予期せずにうまく遮ることができた。血
液学レポートのこの費用効果のある注釈は、臨床上、多
くの場合に非常に有用である。それは、図２および５に
関する部分で述べた実験的方法の溶血性白血球分析への
組入れを表す。この新規で有効な赤血球の壊れやすさに
よる方法は、溶血性試薬を適切に選択することによりさ
らに最適化を行うための重要な可能性を有する。
CELL−DYN 3000.1または２は、白血球を流動セルに
一度通して処理する。CELL−DYN 3000Aという名称のCE
LL−DYN 3000の改良型も、本発明方法を利用すること
ができる。CELL−DYN 3000Aは、白血球の処理に２個の
チャンネルを使用する。CELL−DYN 3000の光学チャン
ネルとCELL−DYN 1300のインピーダンスチャンネルで
ある。インピーダンスチャンネルは、粒子が小さい孔を
通過するとき、その粒子によって作られる電気抵抗の変
化を測定するよく知られている方法を使用する。同様の
方法は、本出願人による米国特許第4,710,021号、第4,7
45,071地号および第5,045,474号に記載されている。
CELL−DYN 3000Aにおいて、インピーダンスチャンネ
ルは、溶解した全血を処理して、温和であるが特定の方
法で細胞質が「正常緊張状態によりむき出しに（stripp
ecl narmotonically）」された無傷の細胞由来の白血球
の核を計数することにより全白血球数を得る。こうし
て、光学チャンネルにより外挿された白血球数を、イン
ピーダンスチャンネルにより完全に独立して異なるよう
に最適化された白血球数によって確認することができ
る。正常緊張状態からわずかに高張性のインピーダンス
チャンネルで計数した核は、進行性の白血球溶解に対し
て感受性がないので、確認が可能である。CELL−DYN 3
000.2Aでの二チャンネル法は、光学チャンネルからとイ
ンピーダンスチャンネルからとの生の計数速度間に観察
できる相違があるので、壊れやすい白血球集団の存在を
オペレータが確認することができる。
本発明のこの段階での利用で強調すべきことは、崩壊
補正した光学WBC（WOCと称する）および厳密な、必要で
あれば崩壊補正した核インピーダンスWBC（WICと称す
る）の間に重要な不一致がないことである。しかし、両
方の方法によるデータの利用可能性は、ただ濾過し、部
分的に希釈した海水を利用して全血分析を行うことがで
きる極めて簡単な装置であっても、新しい有効な補正さ
れたWOCの確立を促進する。CELL−DYN 3000AのWOCおよ
びWICチャンネルにおいて溶血方法が別々に調整できる
ことも、新しく可能になった「相対的溶解感受性」崩壊
速度パラメータの確立を可能にする。
ヘモグロビン変換器 CELL−DYN 3000および3000Aの装置は、ヘモグロビン
を、第四アンモニウム塩と関連したヘム−シアニド錯体
として測定する。
12μｌの血液アリコートを溶血性ヘモグロビン試薬で
250倍に希釈し、ヘモグロビン分光光度計に移す。ヘモ
グロビン試薬は、第四アンモニウム塩/KCN溶液と希釈剤
との混合物である。希釈剤のpHは7.4±0.05であり、浸
透圧は340±3mOsmである。その組成物は、NaCl,7.9g/l;
KCl,0.4g/l;NaH2PO4,0.2g/l;Na2HPO4,1.9g/l;Na2EDTA,
0.3g/l;NaF,0.4g/l;2−フェノキシエタノール,3ml/lお
よび1lとするための水である。ヘモグロビン分析の最良
型では、第四アンモニウム塩溶液が臭化テトラデシルト
リメチルアンモニウム90g/lとシアン化カリウム0.75g/l
とを１の脱イオン水に混合したものから成る。この第
四アンモニウム塩溶液2lを10lの希釈剤と混合する。最
後に、Triton X−114を0.25ml/lの濃度で添加する。
この試薬の場合、赤血球がヘモグロビンを急速に放出
し、ヘモグロビンはシアニドおよび第四アンモニウムと
反応して安定な錯体を形成する。この錯体はヘモグロビ
ン変換器を通過し、光路長1cmの流動セル中で540nmで吸
光度を測定することにより測定される。この測定値は、
試薬を含まないブランクに対する同様の測定に対して評
価される。ヘモグロビン結果は、全血中での濃度により
報告される。使用者は、g/dl、g/lまたはミリモル/lの
いずれかの単位を選択することができる。
血小板および赤血球集団パラメータ 0.8μｌの血液アリコートをヘモグロビン測定器の項
で述べた希釈剤で12,500倍に希釈し、血小板および赤血
球パルス発生用のインピーダンス変換器に移す。
インピーダンス感知ゾーンを通過する粒子により発生
する各パルスを増幅し、内部参照電圧と比較する。それ
により、血小板および赤血球を赤血球／血小板チャンネ
ルに分ける。パルス数が細胞数の指標であり、パルスの
振幅は、細胞容積に関係する。パルス振幅の周波数分布
により、図4Aおよび4Bに示す容積ヒストグラムが得られ
る。
図4Aのヒストグラムを使用すると、次の血小板パラメ
ータ:PLT（血小板数）、MPV（平均血小板容積）、PDW
（「血小板分布幅」というより対数正規分布の幾何標準
偏差を10倍としたもの）およびPCT（血小板クリット）
が血小板集団に対する種々の警報とともに誘導される。
図4Bのヒストグラムを使用すると、次の赤血球パラメ
ータ:RBC（「赤血球数」）、MCV（平均血球容積）、RDW
（「赤血球分布幅」というより分布の変動係数）および
HCT（ヘマトクリット）ならびに赤血球集団の種々のイ
ンタープリティブ分析が誘導される。さらに、下記パラ
メータ:MCH（平均の血球ヘモグロビン含量）およびMCHC
（平均の血球ヘモグロビン濃度）ならびに種々のインタ
ープリティブ分析がヘモグロビン値（HGB）とともにコ
ンピュータで計算される。
データを得る間に変換器を通過する希釈血液の容積
は、完全な細胞数を得るために知っておかなければなら
ない。血小板／赤血球チャンネルの場合、これは、米国
特許第4,710,021号に記載の計量管を使用して行う。各
サンプルの分析サイクルの細胞パルスおよび細胞数獲得
期の間は、細胞がインピーダンスの孔を通って引き出さ
れ、液体が計量管を通って引き出される。試薬のメニス
カスが光学検出器を通過するとき、パルス獲得期がスタ
ートして、血小板および赤血球の計数が同時に行われ
る。実際、図4Aおよび4Bの異なる２個の「観察窓」のパ
ルスは、２個の異なる電気回路で処理され、全てのデー
タは、いわゆるリストモードにデジタル値として記憶さ
れる。このパルス獲得は、メニスカスが第二光学検出器
を通過するときに停止する。厳密に100μｌまたは200μ
ｌの希釈血液が、装置に対して選択したマノメータに依
存するこの間隔の間にインピーダンス変換器を通過す
る。計数時間を使用すると、オリフィスで破片を検出す
ることができる。というのは、そのような物質は孔の有
効な直径を小さくし、従って計数時間を増加させるから
である。また、この破片は、サイジングデータに悪影響
を及ぼす可能性がある。
〔本発明は、図10および11に詳述した光学データだけ
でなく、図１〜５で示した血小板および赤血球のインピ
ーダンスデータ全部に適用可能である。〕 CELL−DYN 3000により、赤血球のサイズ分布から平
均細胞容積（MCV）が導かれる。その結果は、前述したE
EEV f1で直接報告される。ヘマトクリット結果は、全血
の単位体積当たりのパーセント充填赤血球または充填赤
血球の比率（1/1）として報告される。
EEEV f1の目盛りは、電気的に得られるヘマトクリッ
トが参照のミクロヘマトクリットまたは遠心により得ら
れる充填細胞容積（PCV）と必ず一致するようにする
と、どの赤血球希釈剤およびインピーダンス分析器に対
しても確立される。典型的な抗凝血化した新鮮なヒト血
液サンプルの場合、そのような平均的な一致は、赤血球
計数および電子MCVから計算されるヘマトクリット（HC
T）がPCVと一致するように検量してある赤血球パルスを
目盛ることにより達成される。
HCT＝（RBC数×MCV）/10＝PCV 赤血球分布幅（RDW）は、赤血球の容積分布から求め
られる。それは、簡単には、注意深く抽出したヒストグ
ラムピークのC.V.（％）である〔C.V.＝（SD/平均）×1
00〕。このパラメータは、赤血球の同種細胞溶解（isoc
ytosis）およびキロ細胞溶解（kilocytosis）の指標で
ある。RDWは、血液のよごれ（blood smear）で見られる
不同赤血球溶解（anisocytosis）（赤血球のサイズの変
化）の程度および変形赤血球溶解（poikilocytosis）
（赤血球の形の変化）の程度の両方により変わる。上記
パラメータは全て臨床的に有用な結果である。
これらの結果は、各サンプル処理または測定サイクル
の完了時にモニター上に表示される。使用者は、このデ
ィスプレイおよび印刷物に現れる結果の順序および様式
に対して自由に調節できる。溶解により生存する白血球
から得られる四次元光散乱データからの抜粋は、二次元
散乱図として（図６に示すように）、および／または選
択可能なヒストグラムとして（本明細書では図示しない
が、図４に示すものと同様）、表示することができる。
絶対的な白血球数は、千個／μｌ全血の単位またはSI単
位などの他の単位で表示することができる。赤血球デー
タは、EEEV flで区分した横軸を有する容積頻度分布ヒ
ストグラムとして表示される（図4Bに例示）。絶対的な
赤血球数は、100万個／μｌ全血の単位またはSI単位な
どの他の単位で表示される。血小板データは、LEEV fl
で区分した横軸を有する容積頻度分布ヒストグラムとし
て表示される（図4Aに例示）。絶対的な血小板数は、千
個／μｌ全血の単位またはSI単位などの他の単位で報告
される。
コントロールおよびデータ処理特性 CELL−DYN 3000の操作は、系の状態をモニターし、
データを記憶し、QCプログラムを実行し、異常データに
対してフラッグを出し、診断上のチェックを行う３個の
マイクロプロセッサにより制御される。データ端局のコ
ンピータを使用して細胞崩壊速度が計算され、これは、
細胞集団の全生存特性の質疑応答に使用される。不注意
による白血球溶解に対して白血球集団数を補正するため
に必要な白血球崩壊速度は、該速度１個のみである。
CELL−DYN 3000は、各測定サイクル後に、使用者が
選択可能な多数組の数値的・グラフ的データを自動的に
表示する。検体の測定は、実行モードの選択により行わ
れる。検体は、次のように同定することができる。患
者、低コントロール、正常コントロール、高コントロー
ル、反復、選択したサンプルの型など。オペレータの識
別、日付、時刻などは、キーボードによって入力でき
る。表示されたデータは、グラフィックプリンターによ
ってＺに折り畳んだ用紙（8.5″×11″）に印刷するこ
とができる（その画面に対して単一のレポート）。ある
いは、マルチコピーチケットレポートも同じプリンター
で印刷できる。
コンピュータのハードディスクに対して選択したサイ
ズに応じて、電流2,000〜10,000サイクルに対するデジ
タル合計データは、自動的に記憶される。このデータ
は、要求に応じて再び呼び出したり、印刷することがで
きる。各データファイルはグラフィックデータを含み、
下記情報を含むことができる。シーケンス番号、検体の
型、検体の識別番号（使用する場合）、日付、時刻、オ
ペレータの識別およびオペレータが上記したものから選
択した全パラメータに対する数値的グラフィックデー
タ。さらに、数値的データは、装置のモニターパラメー
タ、および本発明のパラメータをモニターする細胞集団
崩壊速度を含むことができる。
使用者は、準備モードにより数値的データの範囲をセ
ットすることができる。これらの範囲外のデータは、使
用者が選択可能な目立つ色調でビデオスクリーン上に表
示され、レポートには肉太体で印刷される。赤血球およ
び血小板に対して動的にモニターされたデータまたは溶
解により生存する有核白血球に対する四次元の散乱図の
データがある基準を満たさない場合、影響をうける各領
域は、完全に印字された警報メッセージによりフラッグ
が出される。
本発明を説明するために、代表的な態様および詳細を
示したが、請求の範囲で規定する本発明の範囲から逸脱
しない限り、種々の変形および修正を行うことができ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 グレイジアー，ジヨン アメリカ合衆国、フロリダ、ペンブロウ ク・パインズ、サウス・ウエスト・ワン ハンドレツドアンドサーテイーンス・ア ベニユー・511 (72)発明者 ロシエ，ジヨン・ダブリユ アメリカ合衆国、カリフオルニア・ 95037、モーガン・ヒル、バイア・コー フイノ・15170 (72)発明者 デイレクター，ブルース・エイ アメリカ合衆国、カリフオルニア・ 95951、サンタ・クララ、キーリー・ブ ールバード・938・シー (56)参考文献 特開 昭60−61659（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−199161（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−25144（ＪＰ，Ａ) 特表 昭61−502277（ＪＰ，Ａ) 米国特許4654312（ＵＳ，Ａ)

Claims (31)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】少なくとも２個の細胞集団を有するサンプ
    ル溶液中の第一細胞集団内に元々存在する単位体積当た
    りの細胞数を正確に判定する方法であって、該方法が、 ａ）第一細胞集団および第二細胞集団を有するサンプル
    溶液を提供する段階； ｂ）時間０で該サンプル溶液の物理化学的条件を調整し
    て、該第二細胞集団内の細胞全部を完全かつ実質的に即
    座に溶解し、第一細胞集団内の細胞を動的に溶解する段
    階； ｃ）時間０から時間間隔Ａで、サンプル溶液の単位体積
    当たりの該第一細胞集団内における細胞数を計数する段
    階； ｄ）時間０及び時間間隔Ａから時間間隔Ｂで、サンプル
    溶液の単位体積当たりの該第一細胞集団における細胞数
    を計数する段階； ｅ）段階ｃ）およびｄ）からの細胞数ならびに時間間隔
    ＡおよびＢを使用して、第一細胞集団の細胞崩壊速度を
    時間の関数として計算する段階；および ｆ）計算した第一細胞集団の細胞崩壊速度関数を時間０
    に外挿することによりサンプル溶液の単位体積当たりの
    該第一細胞集団内に元々存在する細胞数を判定する段階 を含むことを特徴とする前記方法。
  2. 【請求項２】サンプル溶液が、生理学的流体、器官細胞
    懸濁物、植物細胞懸濁物、動物細胞懸濁物、培地中の細
    胞培養物およびそれらの混合物から成る群の構成員であ
    ることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】第一細胞集団が白血球であり、第二細胞集
    団が赤血球であることを特徴とする請求項１に記載の方
    法。
  4. 【請求項４】調整段階ｂ）が、サンプル溶液を溶解剤と
    接触させることを含むことを特徴とする請求項１に記載
    の方法。
  5. 【請求項５】細胞計数段階を、サンプル溶液が流れて通
    るオリフィスにかかる電気的インピーダンスを測定し、
    パルスの数および強さを処理して計数データを得ること
    により行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】細胞計数段階を、レーザービームが横切る
    流動セルにサンプル溶液を通し、該流動セルから光散乱
    データを収集し、処理して計数データを得ることにより
    行うことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】細胞崩壊速度の計算に直線カーブフィッテ
    ィング法を利用することを特徴とする請求項１に記載の
    方法。
  8. 【請求項８】サンプル溶液中の第一細胞集団内および第
    二細胞集団内に元々存在する、単位体積のサンプル溶液
    あたりの細胞数を正確に判定する方法であって、該第一
    細胞集団および第二細胞集団が、希釈サンプル溶液にお
    いて、サンプル溶液の希釈により生じる物理化学的条件
    から得られる種々の崩壊速度で、連続的・動的に崩壊す
    る方法において、該方法が、 ａ）第一細胞集団および第二細胞集団を有するサンプル
    溶液を提供する段階； ｂ）時間０で該サンプル溶液を希釈する段階であって、
    該希釈段階により、第一および第二細胞集団両者内の細
    胞が、サンプル溶液中の物理化学的条件の変化のために
    連続的・動的溶解を開始する段階； ｃ）時間０から時間間隔Ａで、希釈サンプル溶液の第一
    部分体積中に存在する、単位体積のサンプル溶液あたり
    の第一および第二細胞集団の各集団の細胞数を計数する
    段階； ｄ）時間０及び時間間隔Ａから時間間隔Ｂで、希釈サン
    プル溶液の第二部分体積中に存在する、単位体積のサン
    プル溶液あたりの第一および第二細胞集団の各集団の細
    胞数を計数する段階； ｅ）段階ｃ）およびｄ）で得た細胞数および時間間隔Ａ
    およびＢを使用して、第一および第二細胞集団の各細胞
    集団の細胞崩壊速度を時間の関数として計算する段階；
    および ｆ）各細胞崩壊速度関数を時間０に外挿することにより
    サンプル溶液の単位体積当たりの第一および第二細胞集
    団の各細胞集団内に元々存在する細胞数を判定する段階 を含むことを特徴とする前記方法。
  9. 【請求項９】第一細胞集団が白血球であり、第二細胞集
    団が赤血球であることを特徴とする請求項８に記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】希釈段階ｂ）が、サンプル溶液を溶解剤
    と接触させることを含むことを特徴とする請求項８に記
    載の方法。
  11. 【請求項１１】細胞計数段階を、サンプル溶液が流れて
    通るオリフィスにかかる電気的インピーダンスを測定
    し、パルスの数および強さを処理して計数データを得る
    ことにより行うことを特徴とする請求項８に記載の方
    法。
  12. 【請求項１２】細胞計数段階を、レーザービームが横切
    る流動セルにサンプル溶液を通し、該流動セルから光散
    乱データを収集し、処理して計数データを得ることによ
    り行うことを特徴とする請求項８に記載の方法。
  13. 【請求項１３】細胞崩壊速度の計算に直線カーブフィッ
    ティング法を利用することを特徴とする請求項８に記載
    の方法。
  14. 【請求項１４】サンプル溶液がヒトの胎児または新生児
    患者から採取され、溶血耐性挙動を示すことを特徴とす
    る請求項８に記載の方法。
  15. 【請求項１５】第一細胞集団内および第二細胞集団内に
    元々存在する、単位体積のサンプル溶液あたりの細胞数
    を正確に判定する方法であって、該第一細胞集団および
    第二細胞集団が種々の連続した動的細胞溶解速度を時間
    の関数として示し、該サンプル溶液の物理化学的条件を
    該第二細胞集団内の細胞に対する細胞溶解閾値を超える
    ように調整すると、該第一細胞集団内および第二細胞集
    団内の細胞が細胞溶解を受ける方法において、該方法
    が、 ａ）第一細胞集団および第二細胞集団を有するサンプル
    溶液を提供する段階； ｂ）サンプル溶液の単位体積当たりの該第一細胞集団内
    および第二細胞集団内の細胞を同定・分類・計数する手
    段を提供する段階； ｃ）サンプル溶液の物理化学的条件を、該第二細胞集団
    内の細胞に対する細胞溶解閾値を超えるように調整し
    て、該第二細胞集団内の細胞の溶解を時間０で開始する
    段階； ｄ）段階ｂ）で提供された手段を使用して、時間０から
    時間間隔Ａで、調整したサンプル溶液の第一部分体積に
    存在する単位体積のサンプル溶液あたりの第一細胞集団
    細胞および単位体積のサンプル溶液あたりの第二細胞集
    団細胞を同定・分類・計数する段階； ｅ）段階ｂ）で提供された手段を使用して、時間０及び
    時間間隔Ａから時間間隔Ｂで、調節したサンプル溶液の
    第二部分体積中に存在する単位体積のサンプル溶液あた
    りの第一細胞集団細胞および単位体積中のサンプル溶液
    あたりの第二細胞集団細胞を同定・分類・計数する段
    階； ｆ）段階ｄ）およびｅ）で得た細胞計数データならびに
    時間間隔ＡおよびＢを使用して、各細胞集団に対する細
    胞集団細胞の崩壊速度を時間の関数として計算する段
    階；および ｇ）各細胞崩壊速度関数を時間０に外挿することによ
    り、サンプル溶液の単位体積当たりの各細胞集団内に元
    々存在する細胞数を判定する段階 を含むことを特徴とする前記方法。
  16. 【請求項１６】第一細胞集団が白血球であり、第二細胞
    集団が赤血球であることを特徴とする請求項15に記載の
    方法。
  17. 【請求項１７】調整段階ｃ）が、サンプル溶液を溶解剤
    と接触させることを含むことを特徴とする請求項15に記
    載の方法。
  18. 【請求項１８】細胞の同定・分類・計数段階を、サンプ
    ル溶液が流れて通るオリフィスにかかる電気的インピー
    ダンスを測定し、パルスの数および強さを処理して計数
    データを得ることにより行うことを特徴とする請求項15
    に記載の方法。
  19. 【請求項１９】細胞の同定・分類・計数段階を、レーザ
    ービームが横切る流動セルにサンプル溶液を通し、該流
    動セルから光散乱データを収集し、処理して計数データ
    を得ることにより行うことを特徴とする請求項15に記載
    の方法。
  20. 【請求項２０】細胞崩壊速度の計算に直線カーブフィッ
    ティング法を利用することを特徴とする請求項15に記載
    の方法。
  21. 【請求項２１】溶解耐性赤血球を含むサンプル溶液中の
    細胞を同定・分類・計数する方法であって、該方法が、 ａ）細胞、赤血球および溶解耐性赤血球を含むサンプル
    溶液を提供する段階； ｂ）サンプル溶液を溶血剤と時間０で接触させて、溶解
    耐性赤血球を含む全赤血球を完全かつ実質的に即座に溶
    解し、計数すべき残存細胞を動的に溶解する段階； ｃ）単位体積のサンプル溶液中に存在する、溶解により
    生存する細胞を同定・分類・計数する手段を提供する段
    階； ｄ）段階ｃ）で提供された手段を使用して、時間０より
    時間間隔Ａでサンプル溶液の第一部分体積中に存在す
    る、サンプル溶液の単位体積あたりの、溶解により生存
    する細胞を同定・分類・計数する段階； ｅ）段階ｃ）で提供された手段を使用して、時間０及び
    時間間隔Ａより時間間隔Ｂでサンプル溶液の第二部分体
    積中に存在する、サンプル溶液の単位体積あたりの、溶
    解により生存する細胞を同定・分類・計数する段階； ｆ）段階ｄ）およびｅ）で得た細胞計数データならびに
    段階ｂ）での溶血剤添加から各計数までの時間間隔を使
    用して、溶解により生存する細胞の崩壊速度を時間の関
    数として計算する段階；および ｇ）計算した細胞崩壊速度関数を時間０に外挿すること
    により、単位体積のサンプル溶液中に元々存在する溶解
    により生存する細胞の数を判定する段階 を含むことを特徴とする前記方法。
  22. 【請求項２２】溶血剤が本質的に、ｉ）芳香族オキシエ
    タノールと、ii）pKaが8.5またはその付近であり、pH緩
    衝能を付与し且つ溶解剤の電導性を高める働きをする有
    機緩衝液とiii）非イオン性洗剤化合物との水溶液から
    なることを特徴とする請求項21に記載の方法。
  23. 【請求項２３】溶血剤が本質的に、２−フェノキシエタ
    ノール、トリス/HCl緩衝液およびTriton X−100洗剤化
    合物の水溶液から成ることを特徴とする請求項21に記載
    の方法。
  24. 【請求項２４】細胞の同定・分類・計数段階を、サンプ
    ル溶液が流れて通るオリフィスにかかる電気的インピー
    ダンスを測定し、パルスの数および強さを処理して計数
    データを得ることにより行うことを特徴とする請求項21
    に記載の方法。
  25. 【請求項２５】細胞の同定・分類・計数段階を、レーザ
    ービームが横切る流動セルにサンプル溶液を通し、該流
    動セルから光散乱データを収集し、処理して計数データ
    を得ることにより行うことを特徴とする請求項21に記載
    の方法。
  26. 【請求項２６】細胞崩壊速度の計算に直線カーブフィッ
    ティング法を利用することを特徴とする請求項21に記載
    の方法。
  27. 【請求項２７】赤血球および壊れやすい白血球をも含む
    全血サンプル中に存在する白血球サブ集団を同定・分類
    ・計数する方法であって、該方法が、 ａ）赤血球および白血球を含む全血サンプルを提供する
    段階； ｂ）全血サンプル中の白血球サブ集団を同定・分類・計
    数するために、サンプル溶液が実質的に１細胞ずつ流動
    できる検出領域、その検出領域を流れて通過する細胞に
    より発生する信号を検出する検出器、および検出された
    信号を処理するプロセッサを有する流動システムを提供
    する段階； ｃ）全血サンプルを溶血剤と時間０で接触させてサンプ
    ル溶液に存在する該赤血球を完全かつ実質的に即座に溶
    解し、該白血球を動的に溶解するサンプル溶液を形成す
    る段階； ｄ）時間０から時間間隔Ａで存在するサンプルの単位体
    積あたりの該サブ集団を通して、該サンプル溶液の第一
    部分体積を通過させる段階； ｅ）該サンプル溶液の第二部分体積を該流動システムに
    通して、時間０及び時間間隔Ａから時間間隔Ｂで、サン
    プルの単位体積あたりの、各白血球サブ集団内に存在す
    る溶解により生存する細胞を計数する段階； ｆ）段階ｄ）およびｅ）で同定・分類・計数した各白血
    球サブ集団に対して、該細胞計数データならびに時間間
    隔ＡおよびＢを使用して、細胞崩壊速度を時間の関数と
    して計算する段階；および ｇ）段階ｄ）およびｅ）で同定・分類・計数した各白血
    球サブ集団に対して、各細胞崩壊速度関数を時間０に外
    挿することにより、サンプルの単位体積あたりの、元々
    存在する白血球の数を判定する段階 を含むことを特徴とする前記方法。
  28. 【請求項２８】溶血剤が本質的に、ｉ）芳香族オキシエ
    タノールと、ii）pKaが8.5またはその付近であって、pH
    緩衝能を付与し且つ溶解剤の電導性を高める働きをする
    有機緩衝液と、iii）非イオン性洗剤化合物との水溶液
    からなることを特徴とする請求項27に記載の方法。
  29. 【請求項２９】溶血剤が本質的に、２−フェノキシエタ
    ノール、トリス/HCl緩衝液およびTriton X−100洗剤化
    合物の水溶液から成ることを特徴とする請求項27に記載
    の方法。
  30. 【請求項３０】流動システムに通して白血球サブ集団を
    計数する段階を、サンプル溶液が流れて通るオリフィス
    にかかる電気的インピーダンスを測定し、パルスの数お
    よび強さを処理して計数データを得ることにより行うこ
    とを特徴とする請求項27に記載の方法。
  31. 【請求項３１】流動システムに通して白血球サブ集団を
    計数する段階を、レーザービームが横切る流動セルにサ
    ンプル溶液を通し、該流動セルから光散乱データを収集
    し、処理して計数データを得ることにより行うことを特
    徴とする請求項27に記載の方法。
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