JPS61502277A - 白血球を４種の集団に示差定量する方法およびこれに使用する試薬系 - Google Patents

白血球を４種の集団に示差定量する方法およびこれに使用する試薬系

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JPS61502277A JP60502359A JP50235985A JPS61502277A JP S61502277 A JPS61502277 A JP S61502277A JP 60502359 A JP60502359 A JP 60502359A JP 50235985 A JP50235985 A JP 50235985A JP S61502277 A JPS61502277 A JP S61502277A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 白血球を４種の集団に示差定量する方法およびこれに使用する試薬系 白血球をフロー（ｆｌｏｗ）技術によって研究できるように全血から赤血球を除 去する方法は数多く用いられている。沈降または遠心分離または密度勾配、赤血 球の凝集および他の物理的技術による物理的分離は研究目的には有用であるが、 自動化された臨床的白血球分析にとっては速度が遅すぎ、かつ困難すぎる。第四 級アンモニウム塩洗浄剤は極めて有効な溶解剤であるが、白血球に大きな損傷を 与えすぎるので、最良の場合でも、ＤＣボリウム分析（ｖｏｌｕｍｅ　ａｎａ− Ｉｙｉｓ）によって、リンパ球、単球および顆粒球に相当する白血球の３種の集 団が得られるにすぎないことが見い出されている。
キム（Ｋｉｍ）の米国特許第４．０９９．９１７号（１９７ｇ）には、赤血球を 非イオン洗浄剤で感作させ、ホルムアルデヒド固定剤を転化し、この血液を５８ ℃に装置して赤血球を選択的に溶解し、白球血および血小板を光散乱の測定のた めにそのまま残す方法が記載されている。この方法は速度がかなり遅く、約３分 を要し、赤血球を光学的測定に対して透明にするのに充分であることがあるが、 赤血球支質を一層充分に溶解することが必要である電子的測定に対してはそうで はない。同じことが他の溶解方法、例えば低張溶解（ｈｙｐｏｔｏ−ｎｉｃ　１ ｙｓｉｓ）、塩化アンモニウム溶解、およびエチレングリコールまたはプロピレ ングリコールによる処理の場合にもあてはまり、かかる溶解方法は赤血球を光学 的測定、すなわち光散乱の測定、ケイ光の測定に対して透明にするが、電子的測 定パラメータ、すなわちＤＣボリウムパラメータおよびＲ，Ｆ、ボリウムパラメ ータに対してはそうではない。
サポニンとして知られている天然物は長い開光血球溶解剤として使用されている 。サポニンは化学的には種々の単糖類または多糖類とステロイドまたはトリテル ペンアルコールとのグリコシドの１種として定義されている。キラヤ（ｑｕｉｌ ｌａｊａ）サポニンはキラヤの木の樹皮から天然物として単離される。このサポ ニンは洗浄剤の様な性質を有し、イオンおよび非イオンの合成溶血剤と比較して 極めて低い濃度で使用した場合に赤血球を溶血する。しかし、市販のキラヤサポ ニンの化学的処理、構造および純度は普通特定または試験されておらず、この物 質はロットによって変動する。
サポニンの活性は第四級アンモニウム塩洗浄剤より赤血球に対する選択性が大き い。不幸なことには、従来知られている溶解方法を使用することによっては、白 血球にある付随的損傷を与えることなしに、赤血球を含んでいない白血球を得る ことはできなかった。
いくつかの報告書にはサポニンを白血球の損傷を遅延させる第二試薬と併用する ことが記載されている。ヒユーズ・ジョーンズ（ｌ（ｕｇｈｅｓ−Ｊｏｎｅｓ） は、「ジャーナル・オブ・クリニカル・バソロジ−（Ｊ、　ＣＩ　ｉｎ、Ｐａｔ ｈ、　）Ｊ第２７巻、第６２３頁（１９７４）に、稀釈した全血をサポニン溶液 で処理し、次いでサポニン活性を抑制する血清で３分間処理することを報告して いる。直流ボリウム分析が白血球について行われた。
オルンスタイン（０「口５ｔｅｉｎ）は、「ブラッド・セル７（ＢｌｏｏｄＣｅ ｌｌｓ）Ｊ第２５巻、第５７頁（１９７６）に記載されているように、サポニン 、ホルムアルデヒドおよび他の成分の溶液を使用し、次いで２０秒間酵素染色を 行って種々の白血球のタイプを検出している。ハンフリーズ（Ｈｕｍｐｈｒ　１ ｅｓ）等は、［セル・ヘマト　（Ｓｅｒ、　Ｈａｅｍａｔ、　）　Ｊ第Ｖ−２巻 、第１４２頁（１９７２）に記載されているように、稀釈した全血をサポニンで 処理し、次いで３０秒の間冷リン酸塩緩衝剤処理食塩水中に稀釈して溶解作用を 抑制している。他の報告書としてはラブインスキー（Ｌａｄｉｎｓｋｙ）　ｒカ ンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）　Ｊ第２７巻、第１６８９頁（１ ９６７）及びファン・タイプ（Ｖａｎ　Ｄｉｌｌａ）［プロシーデインダス・オ ブ・ソサイエティ・フォア・エクスペリメンタル・バイオロジ（Ｐｒｏｃ、ＳＯ Ｃ，ＥＸｐ、　Ｂｉｏｌ、　）　（＝ニーヨーク）」第１２５巻、第３６７頁＜ １９６７）がある。
米国特許第２．６５６．５０８号および同第３．２５９．８４２号の教示を使用 する商業的装置はクールター・カウンタ（ＣＤ［ＩＬＴＥＲ・Ｃ０ＵＮＴＰ、Ｒ ■）という商標名で知られ、これらの操作の原理は普通り−ルターの原理として 知られている。
米国特許第２．６５６．５０８号（１９５３）として最初に特許になったクール ターの原理によれば、顕微鏡的大きさの粒子をその寸法に近い小さい寸法の電界 に通した場合に、電気的インピーダンスに瞬間的変化が生ずる。電界を直流（Ｄ Ｃ）電流または低周波数電流によって励起した場合には、電気的変化は粒子容積 に厳密に比例する。商業的装置では、変化をある適当な手段によって検出し、か かる変化を利用して計数装置および分析装置を作動させる。かかる装置き組み合 わされた分析装置は粒子容積に基づいて粒子を集団に分類し、得られたデータを 記録する。
この発明は米国特許第３．５０２．９７４号（クールター等、１９７０　）にお いて著しく拡張され、この米国特許では直流電流のほかに無線周波数（ＲＦ　） 電流による電界励起を使用して被検粒子に関するＤＣボリウム情報のほか、粒子 を構成する物質の組成および性質に起因する情報を提供している。この特許は大 きさは同じであるが物質の異なる粒子を区別できる装置を開示している。低周波 数または直流（ＤＣ）の電流および無線周波数電流の両者で励起することにより 粒子感知電界を発生させることにより、１個の粒子の電界通過から２種以上の互 いに関連する出力信号を得ることができる。これは、該粒子はほとんど常に低周 波または直流の電流による電界に関しては絶縁物質であるが、該粒子は周囲の電 解質とは異なったように無線周波数電流を搬送または妨害することができること による。これは均一粒子の場合には誘電率の差異に起因することがあり、あるい は極めて薄い膜内に封入されていて電解質とは異なる導電性を有する内容物を有 する血球の場合には嚢（ｓａｃ）棟構造に起因することがある。従って、ＤＣ電 流はすべて血球のまわりを進むが、ＲＦ雷電流ある部分は血球を通過する。ＲＦ 雷電流通過する容易さが、光の透過性と同様にその「電気的透明性」、または単 に［透明性−］と呼ばれるものの尺度になり；他方粒子のＲＦ雷電流妨害する能 力は「不透明度」と呼ばれる。後者特大昭６１−５０２２７７　（３） の刊行物では、「不透明度」はＲＦインピー・ダンスをＤＣインピーダンスで除 したものであると定義されている。
粒子の相対的な電気的不透明度は粒子含有量、従って分類するための粒子タイプ を確認する特性になる。タイプの異なる粒子がそれぞれ異なる不透明度を有して いる限り、その差を検出することができる。しかし、有意に異なる粒子が実質的 に同一の不透明度を有していることがあり、かかる粒子はこの方法では効果的に は分類できない。米国特許第３．８３６．８４９号（１９７４）において、クー ルター等は粒子を処理することにより粒子タイプの不透明度を選択的に変えて検 出可能な差異を生じさせることができることを教示している。
赤血球及び白血球は名目上具なる大きさを有しているが、これらの大きさは重複 する傾向があり、あるいは少なくともある健康状態下では重複することがある。
しかもこれらの２種のタイプの血球も重複することがある。
アンスライ（Ａｎｓｌｅｙ＞の米国特許第３．７４１．８７５号（１９７３）に は微分（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）白血球数をめる方法が記載されている。ホ ルムアルデヒドのようなモノアルデヒドである細胞学的固定剤を血球に添加する 。次いで固定工程後に溶血剤を添加して赤血球のヘモグロビン含有量を溶液中に 放出させる。特異的な細胞化学的基質、色素生産性の（ｃｈｒｏｍｏ−ｇｅｎｉ ｃ）沈殿生成・カップリング剤およびｐＨ緩衝剤を添加して固定化酵素を含有す る特定のタイプの細胞中で不溶性色素を析出させる。次いで染色された血球を含 有する溶液を測光式計数装置に通す。特定の種類の細胞中に含有されている異な る酵素に対して異なる特異的基質を使用して異なる種類の細胞の絶対的または相 対的な数を得る。細胞学的固定液としてはモノアルデヒドのみを使用する。ジア ルデヒドは不適当であるといわれており、その理由はジアルデヒドが架橋結合し 、細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）沈殿を生成するからである。
全血から出発して赤血球を溶血する必要があり、その理由は２個以上の赤血球が 測光式計数ステーションを同時に通過すると染色された白血球あるいは異常細胞 と間違えられる危険があるからである。この問題を解決する好ましい方法は血球 の懸濁液に試薬を加えて赤血球を破壊し、そのヘモグロビン含有量を溶液中に放 出させることである。
レゾイス（Ｌｅｄｉｓ）等の米国特許第４．２８６．９６３号（１９８１）は、 クールターカウンタ分析装置を使用する白血球の二容積分析法を教示しており、 この方法ではＤＣ電解励起装置のみを使用し、かつ溶解剤として第四級アンモニ ウム塩を使用している。
クールター・エレクトロニクス社所有のレゾイス等の米国特許第４．４８５．１ ７５号は、白血球のリンパ球、単球および顆粒球の集団の三容積示差定量法およ びこれに使用する試薬系に関するもので、この方法では溶解剤として第四級アン モニウム塩を使用しかつクールターカウンタ・モデルＳプラス自動式血液計数装 置を使用しており、この装置は直流電界励起のみを使用している。
ＤＣボリウムまたは種々の角度における光散乱を使用する従来の白血球フロー分 析法はリンパ球、単球ならびに好中球および好酸球を包含する顆粒球に相当する ３種のみの白血球クラスタを示している。好酸球は特殊螢光技術を使用すること により別個の集団として観察されている。
白血球示差分析用の他の色素組成物としては、アクリジンオレンジのような異染 性螢光色素の低張水溶液がある（アダムス（Ａｄａｍｓ）の米国特許第３．８８ ３．２４７号）。白血球の分析は、新鮮な血液試料を色素溶液中に懸濁させ、生 成した懸濁液を、色素摂取平衡に対する前に光源からの色素吸収範囲内の波長を 有する放射、例えば、青色レーザーからの放射に曝し、螢光、例えば緑色対赤色 の螢光を検出することにより、白血球を他の血液粒子から区別することにより実 施される。
特異的に染色される好酸球の顆粒に適当な螢光色素はアニリノまたはトルイジノ ナフタレンスルホン酸およびそのアルキル、アルコキシまたはハロゲン置換誘導 体である。
さらに細胞の自動式マルチパラメータ分析用装置および螢光色素の開発について はアール・シー・リーフ（Ｒ，Ｃ，Ｒｅ　ｉｆ　）等が［クリニカル・ケミスト リー（Ｃ１ｉｎｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）Ｊ、第２３巻、第１４９２〜９ ８頁（１９７７）中に記載している。
また好酸球はテクニコン−へ７０グ（Ｔｅｃｈｎｉｃｏｎ　Ｈｅｍａｌｏｇ）Ｄ および）ｌ　６０００装置によるような酵素染色によっても観察されている（ア ンスライおよびオルンシュタイン「アドバンス・オートメイテッド・アナリシス （Ａｄｖ、　ＡｕｔｏｍａｔｅｄＡｎａｌ、）Ｊ第１巻、第４３７頁（１９７１ ）、カブロウ（Ｋａｐｒｏｗ）　「７クロフアージス・アンド・リンホサイテス ０＋ｌａｃｒｏｐｈａｇｅｓａｎｄ　Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）　Ｊパー）Ａ、 ２１１プレナム（Ｐｌｅｎｕｍ）１９８０）　）。
特定の白血球の集団およびヒトの血液試料におけるこれらの集団の互に一致する 関係の検出が医学研究およびヒトのある疾病の診断に重要である。かかるデータ は異常な白血球比に注意を促すスクリーニング手段として有用である。
この方法によってｍｔｉされる異常な状態は診断上意味のある情報を与え、技術 者にさらに検討する必要性を警告する。
本発明はフロー分析装置を使用して白血球の少なくとも４種の集団を分類し、計 数するための試薬系および方法に関するものである。特に本発明は全血試料中の 赤血球を迅速に消滅させ、かつ（１）リンパ球、（２）単球、（３）好中球およ び（４）好酸球として５ｆ！認されている４種の主なカテゴリーにフロー分析に よって分類するのに適したように白血球を維持および変性するための多成分試薬 系に関するものである。
本発明の試薬系は、（ａ）サポニン含有溶解稀釈剤；または血液稀釈剤に続くサ ポニン含有溶解剤および（ｂ）グルタルアルデヒドのような架橋剤化合物を含有 する固定剤の水溶液からなり、これらの２成分はそれぞれ所定の濃度、ｐＨおよ びオスモル濃度に維持されている。この方法は迅速であり、信頼性が大きくかつ 正常および異常な血液および血液制御物質にとって有効である。防腐剤（ｐｒｅ ｓｅｒｖａｔｉｖｅ）を添加して微生物の成長を抑制することができる。また、 他の添加剤を含有させることもできる。螢光による測定を行って検討する場合に は螢光色素を溶解稀釈剤中に含有させる。
溶解および固定された血液試料は稀釈剤を使用してフロー分析に適当な濃度にす るが、稀釈剤は＾・モグロビンをへ特大昭６Ｌ−５０２２７７（４） モグロビノメ　トリーに適当な色原体に転化するクエリシアン化カリウムおよび ンアン化カリウムを含有することもできる。
また、本発明はＤＣボリウム、ＲＦサイズ（ｓｉｚｅ）、螢光および光散乱とい う一層パラメータの内の２種以上を測定し、かつこれらの−次パラメータの選択 された数学的組合せに基づくヒストグラムを与えるフロー分析装置によって白血 球の主なカテゴリーを識別する方法に関するものである。
次に本発明を図面を参照して例について説明する：第１図〜第５図は本発明方法 によって達成された白血球の部分集団（ｓｕｂｐｏｐｕ　Ｉａｔ　１ｏｎ）の確 認結果を示す。これらの図面において包囲されている区域はデータ点の蓄積によ って生じた細胞集団または細胞クラスタを示し、各データ点はある細胞パラメー タに比例している座標によってめられている。かかる図面の形態はシトグラム（ ｃｙｔｏｇｒａｍ）として知られている。以下に示す実施例は各図面を説明する ものである。
本発明の目的は白血球を残しかつ／または変性して白血球を部分集団に区別また は分類できるように、全血中の赤血球を迅速に溶解する方法を提供することにあ る。本発明においては全血を溶解試薬で処理する。かかる溶解試薬は（１）全血 試料を稀釈すると同時にその赤血球の支質を溶解する作用をするサポニン含有溶 解稀釈剤または（２）非溶解性血液稀釈剤に続くサポニン含有溶解試薬からなる ２部分系という２種の形態を有する。溶解試薬に続いて架橋性固定試薬で処理す ると白血球に変化が起こって、白血球を区別しかつ分類できるように種々の白血 球の部分集団が変性される。ある例では、フロー分析装置は無線周波数（ＲＦ） 電流ならびに直流（ＤＣ）電流による電界励起を利用して測定データを得ている 。他の例ではＤＣ電流による電界励起を行うか行わずに光学的検出を利用してい る。所望のパラメータは直接測定するか、あるいは直接の測定結果から数学的計 算を行うことによりめることができる。
第１図〜第５図は正常な血液試料から得られたシトグラムからのものである。シ トグラムは複数個の点およびドツトによって作られ、シトグラムにおける各ドツ トは１個の細胞を示し、ドツト位置は選定された細胞パラメータ、例えば、装置 内の細胞によって生ずる直角および前方への光散乱の強さに比例する座標によっ て与えられる。このようにして、ドツトまたは細胞からなる４種のクラスタが生 成し、これらのクラスタの区域は第１図〜第５図において包囲されており、これ らの区域はいずれも白血球として、すなわち白血球の４種の主なカテゴリーであ る（１）リンパ球、（２）単球、（３）好中球および（４）好酸球として？１ｔ ｉＪされている。
赤血球の支質を迅速に溶解するには高濃度のサポニンが必要になるので、迅速に 作用する架橋性固定剤を使用して白血球を損傷から保護する必要がある。緩慢に 作用するモて白血球を残しておくのに有効ではない。赤血球の支質を溶解するの に丁度充分なだけの分量でサポニン単独を添加すると約２０分という極めて長い 時間を要する。サポニンを過剰に使用した場合には、サポニンは迅速溶解剤では あるが赤血球の支質の溶解後すぐに白血球に大きな損傷を与える。
以下の実施例ではある一般的な考察を考慮に入れて配合を調整した。
市販のサポニンは純物質ではないので、供給されたサポニン粉末の種々のロット に対して濃度調整が必要になることがある。サポニン試薬の容積を相殺するよう に変化させる場合には限界内において、所定の血液試料に添加するサポニン濃度 を変化させることができる。溶解稀釈剤中のサポニン濃度は普通０．１５５〜０ ．４０％Ｗ／Ｖの範囲内とする。
血液試料を非溶解性稀釈剤で予備稀釈する場合には、溶解剤は約０．３０〜４． ０％という一層高い濃度のサポニンを含有することができ、アルカリ性緩衝液を 予備稀釈剤中に含有させるのが最も良い。
防腐剤を溶解稀釈剤および溶解剤に添加して微生物の成長を抑制することができ る。メチルパラベン、プロピルパラベン、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド 、ジメチロール尿素、２−ピリジンチオール−１−オキシド、ソルビン酸および ソルビン酸カリウムのような水溶性防腐剤を使用することができる。
溶解試薬に対する添加剤は４種の主な白血球クラスタの分離を著しく改善するこ とができる。２−フェノキシエタノールを０．３〜０．８％Ｖ／Ｖの範囲で使用 すると大部分の血液試料の場合に改善されたヒストグラムが得られる。他の関連 する化合物、例えば、１−フェニル−２−プロパツール、２−フェニル−１−プ ロパツール、３−フェノキシ−１−プロパノールおよび３−フェニル−１−プロ パツールも同一濃度範囲で白血球ヒストグラムに同様な改善をもたらす。また、 かかる添加剤としてグルコース、ラクトースおよびスクロースのようなポリヒド ロキシ化合物を２〜８％の濃度範囲で使用することができる。２種以上の添加剤 の混合物も改善された結果を与えることができる。
サポニン含有溶解稀釈剤は測定すべきパラメータについて配合する。螢光を測定 する場合には、サポニン濃度を０゜１５〜０．２５％Ｗ／Ｖ　（７）範囲とし、 塩化ナトリウムを０．２〜０．６％Ｗ／Ｖの範囲とし、螢光色素を後述のように 含有させる。
普通シアニン色素を使用するが、この色素はスルホン酸側鎖を有し、青〜緑色の 範囲４８８〜５４０　ｎｍで励起させることにより、あるいは６３０〜６４０ｎ ｍの赤色光で励起させることにより適当に螢光を発し、かつ水溶液中で充分安定 である。
かかる色素の例としては次のものがある：Ａ、　ｍＷ約Ｉｘ　］、ｏ−’Ｍ〜！ ５ｘ　１０−５Ｍ　（７）　’ｙ　７　二ン（７）色素Ｄｉｌ　Ｃ３５Ｏ３−（ ３） ＤｉＯＣ３５Ｏ３−（３） ＤｉＳ　Ｃ３５Ｏ３−（３） ＯＣ３Ｏ，＝　ＴＢＡ−Ｃ，（４） および多くのその他のもの。これらのものはＨｅ／Ａｒレーザーの場合に４８８ または５１４ｎｍの光において使用することができる。
Ｂ、　ａ度約Ｉ　Ｘ　１０−５Ｍ　（Ｄ　シフ　＝　ン色素：０１１　Ｃ３５Ｏ ３−（５） 特衣昭６１−５０２２７’；’　（５）ＤｉＳ　Ｃ３５Ｏ３−（５） これらのものはＨｅ／Ｎｅレーザーの場合に６３３ｎｍの光において使用するこ とができる。
Ｃ、チアジン色素、例えば、スルホローダミツ８０色素に関する略語はγラン・ ワゴナー（Ａｌａｎ　Ｗａｇｇｏｎｅｒ）　：「バイオケミストリー（Ｂｉｏｃ ｈｅｍ）　Ｊ　１３．３３１５＜１９７４）により使用されているものである。
Ｈｅ／Ａｒはヘリウム／アルゴンを意味し；またｌ（ｅ／Ｎｅはヘリウム／ネオ ンを意味する。
グルタルアルデヒドは好ましい架橋性固定剤である。他の架橋性ジアルデヒドと してはグリオキサール、マロンアルデヒド等がある。アクロレインまたはメタク ロレインのような不飽和モノアルデヒドも同様に使用することができる。アクロ レインはある条件下において二官能性架橋剤であることが知られている。
溶解された血液試料に添加するのに好適な架橋剤はグルタルアルデヒドを０．５ 〜４．０％Ｖ／Ｖの濃度範囲で含有する。
またこの溶液は塩化ナトリウムを０．２〜０．６％Ｗ／Ｖの範囲で含有すること ができ、かつ緩衝剤を含有させてｐＨを７．０〜８．０に維持する。緩衝剤とし ては重炭酸ナトリウム、リン酸塩、またはグツドの緩衝液、例えばモルホリノプ ロパンスルホン酸を使用することができる。試薬系のｐ）Ｉが７より充分低い場 合には、溶解されかつ固定された血液溶液はゲル化する傾向がある。操作中ｐＨ は７．０〜８．０の範囲内に維持する。オスモル濃度は普通１５０〜３５０ｍＯ ｓ／Ｌの範囲内に入る。
塩化ナトリウム溶液は細胞濃度を計数に適したレベルにするのに必要で、この溶 液はフェリシアン化カリウムおよびシアン化カリウムを含有することができる。
焦点の合っている開口（ｆｏｃｕｓｅｄ　ａｐｅｒｔｕｒｅ）を使用する場合に は、溶解されかつ固化された血液溶液の導電率をシース（ｓｈｅａｔｈ）流体の 導電率と同じになるように調整する。フェリシアン化カリウムおよびシアン化カ リウムを配合してオキシヘモグロビンを適当な色原体に転化させることができ、 フェリシアン化カリウムおよびシアン化カリウムはそれぞれ０．０５〜５％Ｗ／ Ｖおよび０．０１〜０．２％Ｗ／Ｖの範囲で配合する。
溶解されかつ固定された血液溶液の加熱は白血球の変性を促進しかつフロー分析 に安定なりラスタを迅速に与えるのに有用であることが多い。７０〜７５℃に約 １０秒間加熱すると最良の結果が得られる。手作業で加熱処理する場合には、ガ ラス試験管に入れた血液溶液を７０〜７５℃の水浴中にかきまぜながら浸漬する ことにより加熱を達成するのが好都合である。自動化された装置の場合には、試 料室の回りに巻付けた電気抵抗線を使用するか、あるいは他の適当な手段によっ て加熱を達成することができる。
実施例１ クールター・エピクス（ＥＰＩＣ３■　）Ｖ・フロー・シトメータ（Ｆ］ｏｗ　 Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を使用した場合の螢光と光散乱とによる白血球シトグラム 。
配　合 溶解稀釈剤　サポニン０．２％Ｗ／Ｖ 塩化ナトリウム０．６％Ｗ／Ｖ ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）緩衝剤　１．０％シアニン色素１ｘｌＯ−’ＭＤｉｌ−Ｃ ｓＳＯｓ　（３）塩化ナトリウムによりｐＨを７．２に調整固定剤　グルタルア ルデヒド０．５％Ｖ／Ｖ重炭酸ナトリウム１．５％Ｗ／Ｖ 試験管中の溶解稀釈剤０．６ｍ　ｌにＥＤＴＡで凝血を阻止した全血５０μｌを かきまぜながら添加した。生成した血液溶液が約５〜１０秒で透明になるとすぐ に、かきまぜながら固定剤２、Ｏｎｌを添加した。１５秒後に、この混合物を７ ０℃の水浴中で１５秒間かきまぜながら加熱した。
生成物はエピクス■シトメトリー系（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍ）に おいて５１４ｎｍの２００ｍＷ　Ｈｅ／Ａｒレーザー光を使用して分析した。５ ４０ｎｍ干渉フィルタおよび５７０ｎｍロングパス（ｌｏｎｇ。
ｐａｓｓ）フィルタを螢光通路中に置いた。白血球ヒストグラムは、第１図に示 すように、螢光対光散乱（２°〜２０°）として、あるいは螢光／光散乱対光散 乱として集めた。
白血球の４種の異なるクラスタが観察された。細胞をこれらの各クラスタに分類 し、顕微鏡検査を行った結果、細胞は低い光散乱−低い螢光においてりンバ球で あり；中程度の光散乱−中程度の螢光において単球であり：高い光散乱−高い螢 光において好中球であり；高い光散乱−非常に高い螢光において好酸球であるこ とが分った。色素は好酸球および好中球の顆粒を強く染色し、すべての白血球の 細胞質を弱く染色した。
第５番目のクラスタは図示されていないが、低い光散乱−中程度の螢光において 観察されることがあった。
実施例２ ６３３ｎｍの３０ｍＷ　ＨｅＮｅレーザーを装着したクールターＴＰＳ−１を使 用した場合の螢光と光散乱とによる白血球ヒストグラム。
配　合 溶解稀釈剤　サポニン０．２％Ｗ／Ｖ 硫酸ナトリウム０．５％Ｗ／Ｖ スフＤ−４３，０％Ｗ／Ｖ シアニン色素Ｉ　Ｘ　１０−’ＭＤ＋　ｌ−Ｃｓ５Ｏｓ−（５）固定剤　グルタ ルアルデヒド１゜０％Ｖ／Ｖ塩化ナトリウム０．８％Ｗ／Ｖ 重炭酸ナトリウム０．５％Ｗ／Ｖ 試験管中の溶解稀釈剤１．　Ｏｍ　１にＥＤＴＡで凝血を阻止した全血０，１ｍ ｊ！をかきまぜながら添加した。生成した血液溶液が約５〜７秒で透明になると すぐにかきまぜながら固定剤２８０ｍ１を添加した。１５秒後に、この混合物を ６０〜７０℃の水浴中で３０秒間かきまぜながら加熱した。この生成物を３０ｍ Ｗ　Ｈｅ／Ｎｅレーザーを装着したクールターＴＰＳ−４フローシトメータによ り分析した。前方への光散乱を２°〜２０°の角度範囲で測定した。６６５ｎｍ ロングパスフィルタを使用して螢光を測定した。
シトグラムは、第２図に示すように、螢光対光散乱として集められており、これ は４種の異なるクラスタを示した。
リンパ球は低い螢光−低い光散乱において現われ；単球は中程度の螢光−中程度 の光散乱において現われ；好中球は中程度の螢光−高い光散乱において現われ； 好酸球は高い螢光−高い光散乱において現われた。
実施例３ 四角孔のフローシトメータを使用した場合の光散乱対ＤＣボリウムによる白血球 ヒストグラム。
配　合 溶解稀釈剤　サポニン０．１６％Ｗ／Ｖ硫酸ナトリウム０．２％Ｗ／Ｖ スクロース４．０％智／Ｖ 固定剤　グルタルアルデヒド１．５％Ｖ／Ｖ重炭酸ナトリウム０．１％Ｗ／Ｖ 塩化ナトリウム０，４％Ｗ／Ｖ 試験管中の溶解稀釈剤１．５＋ｒ＋ｊ！にＥＤＴＡで凝血を阻止した全血０，１ ｍｊ？をかきまぜながら添加した。生成した血液溶液が約５〜７秒で透明になる とすぐに、かきまぜながら固定剤２０＋ｎ　ｊ２を添加した。この溶液に適当な 容積の１．６％Ｗ／Ｖ塩化ナトリウムを添加することにより、この溶液をシース 流体と同じ導電率＜１ｓｏｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）にした。
生成物は、四角の断面を有するクールター開口からなり、フローセル（ｆｌｏｗ 　ｃｅｌｌ）を具え、］、　ｍＷ　ｔｌｅ　Ｎｅレーザーを使用して電気・光学 的測定を行うことができるクールタータイプのフローシトメータによって分析し た。前方への光散乱、ＤＣボリウムおよびＲＰサイズをこの装置によって同時に 測定することができた。マスクを使用して幅狭の前方への角度の散乱（ａｎｇｌ ｅ　ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）を妨げて、光散乱をほぼ１０″〜２０°または１０ °〜１５°の範囲に集めることができた。白血球ヒストグラムは光散乱対ＤＣボ リウムとして集められ、第３図に示すように、４種の異なるクラスタを示した。
リンパ球は低い光散乱−低いボリウムにおいて認められ；単球は低い光散乱−高 いボリウムにおいて認められ、好中球は中程度の光散乱−中程度のボリウムにお いて認められ、好酸球は高い光散乱−中程度のボリウムにおいて存在していた。
四角孔のフローシトメータおよびその使用についてはアール・ニーートーマス（ Ｒ，Ａ、　Ｔｈｏｍａｓ）　、ティー・ニー・ヨップ（Ｔ、　Ａ、　Ｙｏｐｐ） 　、ビー・ディー・ワトソン（Ｂ、　Ｄ、　Ｗａｔｓｏｎ）、ディー・エッチ・ ケイ・ヒントマン（Ｄ、Ｈ−に、Ｈｉｎｄｍａｎ）　、ビー・エフ・キヤメロン （Ｂ、Ｆ、Ｃａｍｅｒｏｎ）　、ｘス：ビー・リーフ（Ｓ、　Ｂ、Ｌｅｉｆ）、 ビー・シー・リーフ（Ｂ、　Ｃ，Ｌｅｉｆ）、エル・ローフ（Ｌ、　Ｒｏｑ、ｕ ｅ）およびダブリュ・ブリット（Ｗ、Ｂｒ１ｔｔ）が「ジャーナル・オブ・ヒス トケミストリー・アンド・シトケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｉｓｔ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　Ｊ第２５巻、 冥Ｈ号、第８２′７〜８３″５頁（’ｉ！Ｊ７７）に−詳細に記載している。
またシトグラムは光散乱／ＤＣボリウム対Ｄ対水Ｃボリウムて集めることができ た。
実施例４ 四角孔のフローセル、ＨｅＮｅレーザーを使用した場合の不透明度（ＲＰサイズ ／ＤＣボリウム）およびＤＣボリウムによる白血球ヒストグラム。
配　合 溶解稀釈剤　サポニン０．４％Ｗ／Ｖ 塩化ナトリウム０゜２％Ｗ／Ｖ ２−フェノキシエタノール０．５％Ｖ／Ｖメチルパラベン防腐剤０．３％Ｗ／Ｖ 固定剤　グルタルアルデヒド２．０％Ｖ／Ｖ塩化ナトリウム０．４％Ｗ／Ｖ 重炭酸ナトリウム０，１％Ｗ／Ｖ 試験管中の溶解稀釈剤０．６＋＋＋ｊ！にＥＤＴＡで凝血を阻止した全血０．１ ０ｍβをかきまぜながら添加した。１０秒後に、固定剤１゜Ｏｍｌをかきまぜな がら添加した。この混合物を７０℃の水浴中で１５秒間加熱した。この溶液に適 当な容積の１．６％Ｗ／Ｖ塩化ナトリウムを添加することにより、この溶液をシ ース流体と同じ導電率にした。
生成物は実施例３に記載した装置で不透明度対ＤＣボリウムを測定することによ り分析した。第４図に示すように、白血球の４種の異なるクラスタが観察された 。リンパ球は低い不透明度ないし高い不透明度−低いボリウムにおいて現われ； 単球は低い不透明度−高いボリウムにおいて認められ；好中球は中程度の不透明 度−高いボリウムにおいて認められ；好酸球は高い不透明度−高いボリウムにお いて認められた。
またかかる操作は１０°〜２０°の光散乱対ＤＣボリウムのパラメータにおいて 良好なシトグラムを与えた。ＲＦ、　ＤＣおよび光散乱のパラメータを同時に集 め、ホーミング比（ｆｏｒｍｉｎｇｒａｔｉｏ）によるかあるいは選択的ゲーテ ィング（ｇａｔｉｎｇ）により一緒に使用して改善されたクラスタの限定を得る ことが焦点の合っている四角孔の７０−セルまたは焦点の合っていない標準クー ルター開口を使用した場合の不透明度（ＲＦサイズ／ＤＣボリウム）対ＤＣボリ ウムによる白血球ヒストグラム。予備稀釈法の説明。
配　合 予備稀釈剤　塩化ナトリウム０．３％Ｗ／Ｖ重炭酸ナトリウム０．１％Ｗ／Ｖ 溶解剤　サポニン２．５％Ｗ／Ｖ 塩化ナトリウム０，４％Ｗ／Ｖ ソルビン酸（防腐剤）０．１％Ｗ／Ｖ 固定剤　グルタルアルデヒド２．０％Ｖ／Ｖ塩化ナトリウム０．４％Ｗ／Ｖ 予備稀釈剤１．０ｍＡにＥＤＴＡで凝血を阻止した全血０．１０ｍ　１２、次い で溶解剤０．１０ｍＡをかきまぜながら添加した。１０秒後に、固定剤１．０＋ ｎＡ！をかきまぜながら添加し、次いでこの試料を７０℃の水浴中で１５秒間加 熱した。焦点の合っている四角孔開口を使用した場合には、０，９％Ｗ／Ｖの塩 化ナトリウムで試料を１：１に稀釈し、２．０％１１／Ｖの塩化す）　ＩＪウム を適当に添加することにより導電率をシース流体の導電率と同じになるように調 整した。
開口浴（ａｐｅｒｔｕｒｅ　ｂａｔｈ）中の焦点の合っていない開口を使用した 場合には、試料を低張稀釈剤で１０倍に稀釈した。
導電率に対する補正は必要でなかった。不透明度（ＲＰサイ・　特衣口胚１−５ ０２２７７　（７）ズ／ＤＣボリウム）対ＤＣボリウムをめ、第５図に示すよう な、白血球の４種のクラスタを得た。リンパ球は低い不透明度ないし高い不透明 度−低いボリウムにおいて現われ、単球および好中球は中程度の不透明度−高い ボリウムにおいて明瞭に分離された集団として認められ薯好酸球は高い不透明度 −高いボリウムに位置していた。
実施例６ 混合室および焦点の合っている開口アダブチ−ジョン（ａｄａｐｔａｔ　１ｏｎ ）を有するクールターカウンタ・モデルＳプラスを使用した場合の不透明度（Ｒ Ｆサイズ／ＤＣボリウム）対ＤＣボリウムによる白血球ヒストグラム。
配　合 予備稀釈剤　塩化ナトリウム０．３％Ｗ／Ｖ重炭酸ナトリウム０．４％Ｉｌｌ／ Ｖ 溶解剤　サポニン０．３５％Ｗ／Ｖ 硫酸ナトリウム０．４％Ｗ／Ｖ アセトアルデヒド防腐剤０．１％Ｗ／Ｖ固定剤　グルタルアルデヒド３．０％Ｖ ／Ｖ塩化ナトリウム０．４％Ｉｌｌ／Ｖ 稀釈剤　塩化ナトリウム４．０％Ｗ／ＶＥＤＴＡで凝血を阻止した全血試料を装 置によってサンプリングループ内に吸引し、このなかに２８μｌの血液を分取し た。溶解剤の１７０μｌの部分を試料室に供給し、次いで直ちに予備稀釈剤１５ ０μｌによって同伴される全血試料を試料室に供給した。章動（ｎｕｔａｔｉｏ ｎ）による試料室の混合を開始し、直ちに溶解剤１００μ！を添加した。７秒の 溶解時間の後に固定剤の２５０μβの部分を添加した。直ちに加熱を開始し、試 料を約７秒間で７０℃にした。この温度にさらに７秒間維持した後に、稀釈剤１ ７０μｌを添加して導電率を調整し、混合を止め、試料を焦点の合っているフロ ーセル内に供給してパラメーターであるＤＣボリウムおよびＲＦサイズを測定し た。試料採取後に、底部排出管を開き、過剰の試料を試料室から取り出し、次い で試料室を洗浄して「持越し部分（ｃａｒｒｙ−ｏｖｅｒ）　Ｊを減少し、試料 室を冷却して次の試料の準備をした。
パラメーターであるＤＣボリウムおよびＲＦサイズを測定することにより上述の 実施例に記載しかつ第５図に示すように白血球の４種の集団を識別することがで きた。
上述の明細書において、本発明の詳細な説明は例示のため行われており、当業者 は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、ここに記載した詳細な説明に 多くの変更を加えることができる。
ＦＩＧ、Ｉ　ＦＩＬ２ ＦＩＧ、５ 国際調査報告 、　■表昭ｅ１−５０２２７７　（８）

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. １．全血試料中の赤血球の支質を溶解し、かつ主なカテゴリーにフロー分析によ って分類するのに適したように白血球を維持および変性するための多成分試薬系 において、（Ａ）サポニン含有溶解稀釈剤および予備稀釈剤に続くサポニン含有 溶解稀釈剤からなる群から選定された溶解剤および （Ｂ）架橋剤化合物を含有する固定剤 の水溶液からなり、前記成分（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれ所定の濃度、ｐＨお よびオスモル濃度に維持されていることを特徴とする多成分試薬系。
  2. ２．前記溶解稀釈剤は全血の存在下に０．１５〜０．４％Ｗ／Ｖのサポニン濃度 を与え、かつ全血１００μｌのそれぞれに対しサポニン０．００２０〜０．００ ２５ｇのサポニン量を含有している請求の範囲第１項記載の試薬系。
  3. ３．前記溶解剤が０．３０〜４．０％Ｗ／Ｖの濃度範囲のサポニンを含有してい る請求の範囲第１項記載の試薬系。
  4. ４．予備稀釈された血液に対する溶解剤の添加容積が全血試料の容積の約１〜１ ０倍であり、さらに溶解剤中の所定サポニン濃度に応じて、溶解剤中に存在する サポニン量が全血１００μｌ当０．００２０〜０．００２５ｇとなりかつ溶解剤 中のサポニン濃度が０．１５〜０．４％Ｗ／Ｖになるように調整されている請求 の範囲第１項記載の試薬系。
  5. ５．細胞の分類を改善するために、フェニル基またはフェノキシ基で置換された 短鎖アルカノールおよびポリヒドロキシ化合物からなる群から選定された少なく とも１種の添加剤を含有している請求の範囲第１〜４項のいずれか一つの項に記 載の試薬系。
  6. ６．螢光色素を含有している請求の範囲第１〜５項のいずれか一つの項に記載の 試薬系。
  7. ７．前記架橋剤化合物がグルタルアルデヒドである請求の範囲第１〜６項のいず れか一つの項に記載の試薬系。
  8. ８．前記固定剤は濃度範囲０．５〜４．０％８６５０２２６２Ｖ／Ｖのグルタル アルデヒドと、濃度範囲０．２〜０．８％Ｗ／Ｖのアルカリ金属の塩化物または 硫酸塩と、ｐＨを７．０〜８．０の範囲に維持するための濃度範囲０．０〜２． ０％Ｗ／Ｖの緩衝剤塩とからなり、溶解した全血に対する固定剤溶液の添加容積 は、溶解され固定された血液溶液中のグルタルアルデヒドの濃度が０．２０〜２ ．０％Ｖ／Ｖの範囲になるように、前記溶解された溶液の容積の１〜５倍である 請求の範囲第１〜７項のいずれか一つの項に記載の試薬系。
  9. ９．フロー分析装置によって白血球の主なカテゴリーを識別するに当り、（Ａ） サポニン含有溶解稀釈剤および予備稀釈剤に続くサポニン含有稀釈剤からなる群 から選定された溶解剤；および （Ｂ）架橋剤化合物を含有する固定剤 の水溶液からなり、前記成分（Ａ）および（Ｂ）はそれぞれ所定の濃度、ｐＨお よびオスモル濃度に維持されていて、赤血球の支質を溶解しかつ白血球を主なカ テゴリーに分類することを可能にする試薬系を使用して全血試料を処理し； ＤＣポリウム、ＲＦサイズ、螢光および光散乱のうちの少なくとも２種の一次パ ラメータを前記装置によって測定して白血球のカテゴリーのデータを得ることを 特徴とする白血球の主なカテゴリーを識別する方法。
  10. １０．前記処理された血液を高い温度で数秒間加熱する請求の範囲第９項記載の 方法。
  11. １１．前記一次パラメータの選定された数学的組合せに基づいたシトグラムを前 記装置によって得る請求の範囲第９項または第１０項記載の方法。
  12. １２．ＲＦサイズ／ＤＣポリウム対ＤＣポリウム、光散乱対ＤＣポリウム、光散 乱／ＤＣポリウム対ＤＣポリウム、螢光対光散乱または螢光／光散乱対光散乱の うちの少なくとも１種の測定されたパラメータを相関させる請求の範囲第９項記 載の方法。
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