JPH10282094A - 全血中の網状赤血球、赤血球及び血小板を迅速に同定及び特徴付けるための完全に自動化された方法及びそれらのための試薬組成物 - Google Patents
全血中の網状赤血球、赤血球及び血小板を迅速に同定及び特徴付けるための完全に自動化された方法及びそれらのための試薬組成物Info
- Publication number
- JPH10282094A JPH10282094A JP10108718A JP10871898A JPH10282094A JP H10282094 A JPH10282094 A JP H10282094A JP 10108718 A JP10108718 A JP 10108718A JP 10871898 A JP10871898 A JP 10871898A JP H10282094 A JPH10282094 A JP H10282094A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- reagent composition
- red blood
- cell
- reticulocytes
- reagent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 114
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 112
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 96
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 75
- 239000008280 blood Substances 0.000 title claims abstract description 75
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 title claims abstract description 52
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 140
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 86
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 claims abstract description 29
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 16
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims abstract description 8
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 claims description 138
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 73
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 claims description 41
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 claims description 41
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 claims description 34
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 26
- CIYKWVNUXJDNNK-UHFFFAOYSA-N oxazine-750 Chemical group N1=C2C3=CC=CC=C3C(NCC)=CC2=[O+]C2=C1C=C1CCCN3CCCC2=C13 CIYKWVNUXJDNNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 11
- 239000002888 zwitterionic surfactant Substances 0.000 claims description 11
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 claims description 10
- MRUAUOIMASANKQ-UHFFFAOYSA-O carboxymethyl-[3-(dodecanoylamino)propyl]-dimethylazanium Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CC(O)=O MRUAUOIMASANKQ-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 8
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 claims description 7
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 7
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- -1 alkali metal salt Chemical class 0.000 claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- BHATUINFZWUDIX-UHFFFAOYSA-N Zwittergent 3-14 Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O BHATUINFZWUDIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229940075468 lauramidopropyl betaine Drugs 0.000 claims description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 claims description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims description 4
- 229940100555 2-methyl-4-isothiazolin-3-one Drugs 0.000 claims description 3
- LVDKZNITIUWNER-UHFFFAOYSA-N Bronopol Chemical compound OCC(Br)(CO)[N+]([O-])=O LVDKZNITIUWNER-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 claims description 3
- XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M cyanate Chemical compound [O-]C#N XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- PASCYLAFGHJSHW-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-[(4-methoxyphenyl)methyl]-3-(methylamino)propanoate Chemical compound CCOC(=O)C(CNC)CC1=CC=C(OC)C=C1 PASCYLAFGHJSHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 3
- BEGLCMHJXHIJLR-UHFFFAOYSA-N methylisothiazolinone Chemical compound CN1SC=CC1=O BEGLCMHJXHIJLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 3
- PSBDWGZCVUAZQS-UHFFFAOYSA-N (dimethylsulfonio)acetate Chemical compound C[S+](C)CC([O-])=O PSBDWGZCVUAZQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCCS(O)(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940117986 sulfobetaine Drugs 0.000 claims description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 claims 3
- GYJNVSAUBGJVLV-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylazaniumyl)propane-1-sulfonate Chemical compound CN(C)CCCS(O)(=O)=O GYJNVSAUBGJVLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- ODCDPHBFNDVDGI-UHFFFAOYSA-N C1N(C(=O)N1C1N(C(NC1=O)=O)CO)C1N(C(NC1=O)=O)CO Chemical compound C1N(C(=O)N1C1N(C(NC1=O)=O)CO)C1N(C(NC1=O)=O)CO ODCDPHBFNDVDGI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- RGLRXNKKBLIBQS-XNHQSDQCSA-N leuprolide acetate Chemical compound CC(O)=O.CCNC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CC=C(O)C=C1 RGLRXNKKBLIBQS-XNHQSDQCSA-N 0.000 claims 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims 2
- 238000011166 aliquoting Methods 0.000 claims 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 claims 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 claims 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 claims 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 abstract description 30
- 238000005259 measurement Methods 0.000 abstract description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 10
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 abstract description 3
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 abstract description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 80
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 65
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 11
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 9
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- KSCQDDRPFHTIRL-UHFFFAOYSA-N auramine O Chemical compound [H+].[Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C(=N)C1=CC=C(N(C)C)C=C1 KSCQDDRPFHTIRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004159 blood analysis Methods 0.000 description 6
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 6
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 5
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- CPBQJMYROZQQJC-UHFFFAOYSA-N helium neon Chemical compound [He].[Ne] CPBQJMYROZQQJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M thiazole orange Chemical compound CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1.C1=CC=C2C(C=C3N(C4=CC=CC=C4S3)C)=CC=[N+](C)C2=C1 ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 2
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 2
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 2
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 210000003617 erythrocyte membrane Anatomy 0.000 description 2
- SQHOAFZGYFNDQX-UHFFFAOYSA-N ethyl-[7-(ethylamino)-2,8-dimethylphenothiazin-3-ylidene]azanium;chloride Chemical compound [Cl-].S1C2=CC(=[NH+]CC)C(C)=CC2=NC2=C1C=C(NCC)C(C)=C2 SQHOAFZGYFNDQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N lauryl sulfobetaine Chemical compound CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O IZWSFJTYBVKZNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- INCIMLINXXICKS-UHFFFAOYSA-M pyronin Y Chemical compound [Cl-].C1=CC(=[N+](C)C)C=C2OC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 INCIMLINXXICKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- QJFHHNFQLQKAQP-UHFFFAOYSA-N tetradecyl 3-(dimethylamino)propane-1-sulfonate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCOS(=O)(=O)CCCN(C)C QJFHHNFQLQKAQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 1
- 244000137850 Marrubium vulgare Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- ZAHXYMFVNNUHCP-UHFFFAOYSA-N Naphazoline nitrate Chemical compound O[N+]([O-])=O.C=1C=CC2=CC=CC=C2C=1CC1=NCCN1 ZAHXYMFVNNUHCP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 229910001514 alkali metal chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N argon Substances [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001767 cationic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- DHNRXBZYEKSXIM-UHFFFAOYSA-N chloromethylisothiazolinone Chemical compound CN1SC(Cl)=CC1=O DHNRXBZYEKSXIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 125000000853 cresyl group Chemical group C1(=CC=C(C=C1)C)* 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- IRXRGVFLQOSHOH-UHFFFAOYSA-L dipotassium;oxalate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)C([O-])=O IRXRGVFLQOSHOH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 230000002489 hematologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002433 hydrophilic molecules Chemical class 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- ZCTXEAQXZGPWFG-UHFFFAOYSA-N imidurea Chemical compound O=C1NC(=O)N(CO)C1NC(=O)NCNC(=O)NC1C(=O)NC(=O)N1CO ZCTXEAQXZGPWFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000000990 laser dye Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000002892 organic cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001151 other effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000020477 pH reduction Effects 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 238000012284 sample analysis method Methods 0.000 description 1
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- ZVCDLGYNFYZZOK-UHFFFAOYSA-M sodium cyanate Chemical compound [Na]OC#N ZVCDLGYNFYZZOK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000005563 spheronization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- JADVWWSKYZXRGX-UHFFFAOYSA-M thioflavine T Chemical compound [Cl-].C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=[N+](C)C2=CC=C(C)C=C2S1 JADVWWSKYZXRGX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
- G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
- G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5094—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for blood cell populations
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/583—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with non-fluorescent dye label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
- G01N2015/012—Red blood cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
- G01N2015/012—Red blood cells
- G01N2015/014—Reticulocytes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
- G01N2015/018—Platelets
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
- Y10T436/101666—Particle count or volume standard or control [e.g., platelet count standards, etc.]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
- Y10T436/107497—Preparation composition [e.g., lysing or precipitation, etc.]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
- Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
- Y10T436/108331—Preservative, buffer, anticoagulant or diluent
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Ecology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 全血試料中の網状赤血球、赤血球及び血小板
の計数、及び同定、特徴付けのための、迅速で信頼のお
ける方法及びそれに用いられる試薬組成物を提供する。 【解決手段】 試料を試薬組成物と混合し、散乱／吸収
フローサイトメトリーを用いてその混合物中の細胞の各
々によって散乱及び吸収される光を測定する。この試薬
組成物には、カチオン性染料、球状化剤としての両性イ
オン性界面活性剤及びこの試薬組成物のpH及び浸透圧モ
ル濃度を特定の値に維持するための緩衝剤が含まれる。
の計数、及び同定、特徴付けのための、迅速で信頼のお
ける方法及びそれに用いられる試薬組成物を提供する。 【解決手段】 試料を試薬組成物と混合し、散乱／吸収
フローサイトメトリーを用いてその混合物中の細胞の各
々によって散乱及び吸収される光を測定する。この試薬
組成物には、カチオン性染料、球状化剤としての両性イ
オン性界面活性剤及びこの試薬組成物のpH及び浸透圧モ
ル濃度を特定の値に維持するための緩衝剤が含まれる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、全血試料中の細胞
を同定及び特徴付けるための、より具体的には、光散乱
及び吸収フローサイトメトリー技術により全血試料中の
（i）網状赤血球及び赤血球を同定し、（ii）血小板を
同定及び区別し、並びに（iii）多数の個個の網状赤血
球及び赤血球の容積、ヘモグロビン濃度及びヘモグロビ
ン含量を同時に測定するための、全自動血液分析方法及
びそこで用いられる試薬組成物に関する。
を同定及び特徴付けるための、より具体的には、光散乱
及び吸収フローサイトメトリー技術により全血試料中の
（i）網状赤血球及び赤血球を同定し、（ii）血小板を
同定及び区別し、並びに（iii）多数の個個の網状赤血
球及び赤血球の容積、ヘモグロビン濃度及びヘモグロビ
ン含量を同時に測定するための、全自動血液分析方法及
びそこで用いられる試薬組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】全ての高等動物において、血液は、様々
な種類の小体：赤血球（erythrocyte）、白血球（leuko
cyte）及び血小板が懸濁されている水性液体部（血漿）
からなる。血漿はおおよそ90％の水、9％のタンパク
質、0.9％の塩及び痕跡量の糖、尿素、尿酸等の他の物
質を含む組成を有する。末梢血（すなわち、骨髄外部の
血液）の細胞もしくは小体は2つの主要群：酸素の搬送
を主な目的とする赤血球、及びその主な機能が免疫系及
び体内に侵入した外来物質の破壊に関連する白血球に分
けられる。これらの2つの主要群に加えて、血液は止血
において重要ないわゆる血小板をも含む。
な種類の小体：赤血球（erythrocyte）、白血球（leuko
cyte）及び血小板が懸濁されている水性液体部（血漿）
からなる。血漿はおおよそ90％の水、9％のタンパク
質、0.9％の塩及び痕跡量の糖、尿素、尿酸等の他の物
質を含む組成を有する。末梢血（すなわち、骨髄外部の
血液）の細胞もしくは小体は2つの主要群：酸素の搬送
を主な目的とする赤血球、及びその主な機能が免疫系及
び体内に侵入した外来物質の破壊に関連する白血球に分
けられる。これらの2つの主要群に加えて、血液は止血
において重要ないわゆる血小板をも含む。
【０００３】赤血球の成熟の最終段階は、それらが骨髄
から放出された後、これらの細胞が末梢血中を循環する
間に生じる。これらの幼若赤血球、すなわち「網状赤血
球」はそれらの核を失っており、したがって、分裂する
能力、もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）を合成する能力を失
っている。これらの機能は途絶えているものの、網状赤
血球は依然として代謝的には活性であり、並びにタンパ
ク質を合成し、ヘムの合成のために鉄を取込み、かつエ
ネルギーに富む状態を維持するのに必要な代謝反応を行
うことが可能である。これらの細胞は、通常、カチオン
性染料の溶液にそれらを晒すことにより、成熟赤血球か
ら最も容易に区別される。このカチオン性染料は、網状
赤血球中のアニオン性ＲＮＡと反応し、網状赤血球内に
細かい、もしくは粗い染色された「網状物」として沈殿
するものであり、ここから網状赤血球という名前が付け
られている。網状赤血球は、通常、全赤血球集団の約0.
5ないし2パーセントを構成するが、この割合は異常な条
件の下では劇的に変化し得る。例えば、網状赤血球数の
計測は、特定の悪性疾患の化学療法における早期毒性の
監視に加えて、血液悪液質の研究における診断補助手段
として、出血の後の赤血球の再生の指標として、長年用
いられている。
から放出された後、これらの細胞が末梢血中を循環する
間に生じる。これらの幼若赤血球、すなわち「網状赤血
球」はそれらの核を失っており、したがって、分裂する
能力、もしくはリボ核酸（ＲＮＡ）を合成する能力を失
っている。これらの機能は途絶えているものの、網状赤
血球は依然として代謝的には活性であり、並びにタンパ
ク質を合成し、ヘムの合成のために鉄を取込み、かつエ
ネルギーに富む状態を維持するのに必要な代謝反応を行
うことが可能である。これらの細胞は、通常、カチオン
性染料の溶液にそれらを晒すことにより、成熟赤血球か
ら最も容易に区別される。このカチオン性染料は、網状
赤血球中のアニオン性ＲＮＡと反応し、網状赤血球内に
細かい、もしくは粗い染色された「網状物」として沈殿
するものであり、ここから網状赤血球という名前が付け
られている。網状赤血球は、通常、全赤血球集団の約0.
5ないし2パーセントを構成するが、この割合は異常な条
件の下では劇的に変化し得る。例えば、網状赤血球数の
計測は、特定の悪性疾患の化学療法における早期毒性の
監視に加えて、血液悪液質の研究における診断補助手段
として、出血の後の赤血球の再生の指標として、長年用
いられている。
【０００４】核酸（ＲＮＡ及びＤＮＡ）は事実上いかな
るカチオン性染料でも染色することができるポリアニオ
ンである。網状赤血球中のＲＮＡは僅かのカチオン性染
料のみで染色することが可能であり、これには、例え
ば、ブリリアントクレシルブルー（Brilliant Cresyl B
lue）（BCG）、ニューメチレンブルー（New Methylene
Blue）（NMB）、オーラミンO（Auramine O）（AuO）、
アクリジンオレンジ（Acridine Orange）（AO）、チア
ゾールオレンジ（Thiazole Orange）（TO）、オキサジ
ン750、及びピロニンY（Pyronine Y）（PY）が含まれ
る。これらの染料のうち、少数のもののみが迅速に細胞
に浸透させる（したがって染色する）ことができる。網
状赤血球の染色の速度及び程度はその染料の細胞外濃
度、網状赤血球の膜を通してその染料が浸透する速度、
及びそのカチオン性染料と網状赤血球のＲＮＡとの比結
合定数の強さに依存する。後者の2つの特性は異なるも
のであり、各々の染料について容易に推定できるもので
はなく、そのため有用な網状赤血球の染色を発見するの
に試行錯誤が必要である。
るカチオン性染料でも染色することができるポリアニオ
ンである。網状赤血球中のＲＮＡは僅かのカチオン性染
料のみで染色することが可能であり、これには、例え
ば、ブリリアントクレシルブルー（Brilliant Cresyl B
lue）（BCG）、ニューメチレンブルー（New Methylene
Blue）（NMB）、オーラミンO（Auramine O）（AuO）、
アクリジンオレンジ（Acridine Orange）（AO）、チア
ゾールオレンジ（Thiazole Orange）（TO）、オキサジ
ン750、及びピロニンY（Pyronine Y）（PY）が含まれ
る。これらの染料のうち、少数のもののみが迅速に細胞
に浸透させる（したがって染色する）ことができる。網
状赤血球の染色の速度及び程度はその染料の細胞外濃
度、網状赤血球の膜を通してその染料が浸透する速度、
及びそのカチオン性染料と網状赤血球のＲＮＡとの比結
合定数の強さに依存する。後者の2つの特性は異なるも
のであり、各々の染料について容易に推定できるもので
はなく、そのため有用な網状赤血球の染色を発見するの
に試行錯誤が必要である。
【０００５】蛍光に基づく方法及びシステムを用いて全
血の抗凝血試料中の網状赤血球の割合を計数するのに用
いることができる幾つかの半自動法が利用可能である。
このような方法においては、AO、AuOもしくはTOのよう
な有機カチオン性染料を含む希釈液を網状赤血球中のＲ
ＮＡの染色に用いる。染料は細胞膜に浸透してＲＮＡと
結合し、通常、各網状赤血球内に「網状物」を沈殿させ
る。染色されたＲＮＡからの信号の量はＲＮＡの含量に
ほぼ比例する。適正に染色した後、流液中の網状赤血球
の割合を決定するのに適正な励起光源（典型的には、48
8nmで放射するアルゴンイオンレーザー）及び放射光検
出システムを備える（吸収フローサイトメトリーではな
く）蛍光フローサイトメトリーを用いることができる。
血の抗凝血試料中の網状赤血球の割合を計数するのに用
いることができる幾つかの半自動法が利用可能である。
このような方法においては、AO、AuOもしくはTOのよう
な有機カチオン性染料を含む希釈液を網状赤血球中のＲ
ＮＡの染色に用いる。染料は細胞膜に浸透してＲＮＡと
結合し、通常、各網状赤血球内に「網状物」を沈殿させ
る。染色されたＲＮＡからの信号の量はＲＮＡの含量に
ほぼ比例する。適正に染色した後、流液中の網状赤血球
の割合を決定するのに適正な励起光源（典型的には、48
8nmで放射するアルゴンイオンレーザー）及び放射光検
出システムを備える（吸収フローサイトメトリーではな
く）蛍光フローサイトメトリーを用いることができる。
【０００６】全血試料中の網状赤血球を識別するのに蛍
光サイトメトリー法及び蛍光染料が当該技術分野におい
て用いられているが、全自動化散乱／吸収フローサイト
メトリー技術を用いる、網状赤血球、赤血球及び血小板
の総数を決定し、かつ網状赤血球及び赤血球のさらなる
パラメータを評価するための非常に迅速、正確、かつ信
頼のおけるサイトメトリー法は不足している。しかしな
がら、光散乱及び吸収全自動フローサイトメトリーによ
る迅速な全血試料分析のために設計された方法及び試薬
を包含する本発明は、当該技術分野に、必要とされる非
常に有利な血液分析方法及び全自動血液学システムで用
いるための試薬を提供する。本発明は、血液細胞分析の
プロセスの速度を上げてより多くの試料を試験及び分析
することを可能にし、処理時間、及び最終的には、それ
らの結果を臨床医、医師及び患者に知らせる時間をより
早くすることを可能にする。
光サイトメトリー法及び蛍光染料が当該技術分野におい
て用いられているが、全自動化散乱／吸収フローサイト
メトリー技術を用いる、網状赤血球、赤血球及び血小板
の総数を決定し、かつ網状赤血球及び赤血球のさらなる
パラメータを評価するための非常に迅速、正確、かつ信
頼のおけるサイトメトリー法は不足している。しかしな
がら、光散乱及び吸収全自動フローサイトメトリーによ
る迅速な全血試料分析のために設計された方法及び試薬
を包含する本発明は、当該技術分野に、必要とされる非
常に有利な血液分析方法及び全自動血液学システムで用
いるための試薬を提供する。本発明は、血液細胞分析の
プロセスの速度を上げてより多くの試料を試験及び分析
することを可能にし、処理時間、及び最終的には、それ
らの結果を臨床医、医師及び患者に知らせる時間をより
早くすることを可能にする。
【０００７】フローサイトメーターを用いる網状赤血球
の総数の監視における困難は、網状赤血球の検出信号、
成熟赤血球の信号、及びシステムノイズを区別する問題
である。ＲＮＡの染色鎖は幼若網状赤血球において多
く、フローサイトメーターで検出した場合比較的大きな
強度の信号を生じる。しかしながら、より多くの成熟細
胞が含む染色ＲＮＡはより少ないものであり、生じる信
号はより小さいもので、これはフローサイトメーター測
定システムのノイズによって隠されることがある。光散
乱及び吸収フローサイトメトリー技術により、迅速に試
料を処理する全自動システムにおいて、全血試料中の網
状赤血球を迅速に同定し、かつ網状赤血球及び赤血球の
容積、ヘモグロビン濃度及びヘモグロビン含量を同時に
測定するための迅速かつ正確な方法及びそれに用いられ
る試薬に対する必要性が存在する。
の総数の監視における困難は、網状赤血球の検出信号、
成熟赤血球の信号、及びシステムノイズを区別する問題
である。ＲＮＡの染色鎖は幼若網状赤血球において多
く、フローサイトメーターで検出した場合比較的大きな
強度の信号を生じる。しかしながら、より多くの成熟細
胞が含む染色ＲＮＡはより少ないものであり、生じる信
号はより小さいもので、これはフローサイトメーター測
定システムのノイズによって隠されることがある。光散
乱及び吸収フローサイトメトリー技術により、迅速に試
料を処理する全自動システムにおいて、全血試料中の網
状赤血球を迅速に同定し、かつ網状赤血球及び赤血球の
容積、ヘモグロビン濃度及びヘモグロビン含量を同時に
測定するための迅速かつ正確な方法及びそれに用いられ
る試薬に対する必要性が存在する。
【０００８】蛍光染料及び蛍光に基づくフローサイトメ
トリー法を用いる全血試料中の網状赤血球を区別する例
示的方法は、本発明とは異なり、しばしば分析の前に数
十秒から数分の試料のインキュベーション必要とし、こ
れは特許文献に開示されている。例えば、Adams及びKam
entskyの米国特許第3,684,377号は、AOの水溶液を含
み、かつヒト血液の正常な生理学的範囲内にあるpH因子
及び浸透圧モル濃度を有する示差的血液分析のための染
料組成物を開示する。この染料組成物は、蛍光信号の有
無を赤血球の散乱信号と共に測定することにより、網状
赤血球の計数に用いることができる。
トリー法を用いる全血試料中の網状赤血球を区別する例
示的方法は、本発明とは異なり、しばしば分析の前に数
十秒から数分の試料のインキュベーション必要とし、こ
れは特許文献に開示されている。例えば、Adams及びKam
entskyの米国特許第3,684,377号は、AOの水溶液を含
み、かつヒト血液の正常な生理学的範囲内にあるpH因子
及び浸透圧モル濃度を有する示差的血液分析のための染
料組成物を開示する。この染料組成物は、蛍光信号の有
無を赤血球の散乱信号と共に測定することにより、網状
赤血球の計数に用いることができる。
【０００９】Adamsの米国特許第3,883,247号は、ml当り
10-6と10-5グラムとの濃度のAOを含む染料組成物を用い
る、Adams及びKamentskyのものと同様の方法を開示す
る。Nataleの米国特許第4,336,029号は、約7.4のpH及び
等張性浸透圧モル濃度の、染料AO、クエン酸イオン及び
パラホルムアルデヒドの水溶液を含む試薬組成物を開示
する。様々な成分の濃度を網状赤血球及び血小板による
染料の取込みが最大になるように選択した結果、血液試
料及び試薬組成物の混合の2−5分以内に染料が取込まれ
るようになった。Nataleの試薬を利用する血小板及び網
状赤血球を検出するための自動化方法がGershmanらの米
国特許第4,325,706号に開示されている。
10-6と10-5グラムとの濃度のAOを含む染料組成物を用い
る、Adams及びKamentskyのものと同様の方法を開示す
る。Nataleの米国特許第4,336,029号は、約7.4のpH及び
等張性浸透圧モル濃度の、染料AO、クエン酸イオン及び
パラホルムアルデヒドの水溶液を含む試薬組成物を開示
する。様々な成分の濃度を網状赤血球及び血小板による
染料の取込みが最大になるように選択した結果、血液試
料及び試薬組成物の混合の2−5分以内に染料が取込まれ
るようになった。Nataleの試薬を利用する血小板及び網
状赤血球を検出するための自動化方法がGershmanらの米
国特許第4,325,706号に開示されている。
【００１０】Sage, Jr.の米国特許第4,707,451号に開示
される試薬においては、網状赤血球はチオフラビンT又
はクリサニリンで染色される。等張生理食塩水（0.2mg
／ml）中の染料の25μlアリコートを10μlの抗凝血化全
血と混合してこの混合物を約7分間インキュベートする
ことにより、全血試料が効果的に染色されることが見出
された。Leeらの米国特許第4,883,867号はＲＮＡ又はＤ
ＮＡを染色するための染料組成物を開示する。この染色
組成物はTOを好ましい染料化合物として含む。網状赤血
球は30分の最小時間で染色される。
される試薬においては、網状赤血球はチオフラビンT又
はクリサニリンで染色される。等張生理食塩水（0.2mg
／ml）中の染料の25μlアリコートを10μlの抗凝血化全
血と混合してこの混合物を約7分間インキュベートする
ことにより、全血試料が効果的に染色されることが見出
された。Leeらの米国特許第4,883,867号はＲＮＡ又はＤ
ＮＡを染色するための染料組成物を開示する。この染色
組成物はTOを好ましい染料化合物として含む。網状赤血
球は30分の最小時間で染色される。
【００１１】フローサイトメトリー技術を用いて網状赤
血球を計数するための試薬がKurodaの米国特許第4,971,
917号に記載されており、これは、蛍光フローサイトメ
トリーで分析する際に成熟赤血球が網状赤血球として間
違って数えられるのを防ぐために、染料、例えばAuOに
よる成熟赤血球の非特異的な染色を低減させる炭酸塩を
含む。米国特許第4,981,803号には、2種類の溶液、すな
わち染料AuOが非水性溶媒中に溶解している染色のため
のストック溶液及び最適染色条件を満たす緩衝液を含
む、網状赤血球数計測のための試薬が記載されている。
血球を計数するための試薬がKurodaの米国特許第4,971,
917号に記載されており、これは、蛍光フローサイトメ
トリーで分析する際に成熟赤血球が網状赤血球として間
違って数えられるのを防ぐために、染料、例えばAuOに
よる成熟赤血球の非特異的な染色を低減させる炭酸塩を
含む。米国特許第4,981,803号には、2種類の溶液、すな
わち染料AuOが非水性溶媒中に溶解している染色のため
のストック溶液及び最適染色条件を満たす緩衝液を含
む、網状赤血球数計測のための試薬が記載されている。
【００１２】AuOを含む他の蛍光フローサイトメトリー
技術のための別の網状赤血球染色試薬がKurodaらの米国
特許第4,985,176号に開示されている。この特許は、30
秒ないし20分の広い範囲の、蛍光分析のための試薬及び
試料のインキュベーション時間を開示する。網状赤血球
の定量のための四級化AO誘導体がS. Fan及びG. Fischer
の米国特許第5,075,556号に記載されている。このFanら
の試薬は、パラホルムアルデヒド及びシュウ酸カリウム
を含む緩衝液中にml当り10-6グラムのAO誘導体を含み、
網状赤血球を染色して血液試料中の網状赤血球の定量的
蛍光フローサイトメトリー分析を可能にする。
技術のための別の網状赤血球染色試薬がKurodaらの米国
特許第4,985,176号に開示されている。この特許は、30
秒ないし20分の広い範囲の、蛍光分析のための試薬及び
試料のインキュベーション時間を開示する。網状赤血球
の定量のための四級化AO誘導体がS. Fan及びG. Fischer
の米国特許第5,075,556号に記載されている。このFanら
の試薬は、パラホルムアルデヒド及びシュウ酸カリウム
を含む緩衝液中にml当り10-6グラムのAO誘導体を含み、
網状赤血球を染色して血液試料中の網状赤血球の定量的
蛍光フローサイトメトリー分析を可能にする。
【００１３】上述の試薬の中で以下で論じられる配向性
ノイズの問題を防ぐ球状化剤を含むものはなく、細胞ご
とを基準とする網状赤血球及び赤血球の容積及びヘモグ
ロビン濃度のような他の診断上重要なパラメータを同時
に決定することを許容するものはない。さらに、上記の
方法の幾つかは試料の調製、試薬溶液との反応もしくは
インキュベーションの時間を必要とし、これは、より早
い迅速な試料処理時間を必要とする全自動システムにお
いて用いられる非常に迅速な方法には適切ではない。
ノイズの問題を防ぐ球状化剤を含むものはなく、細胞ご
とを基準とする網状赤血球及び赤血球の容積及びヘモグ
ロビン濃度のような他の診断上重要なパラメータを同時
に決定することを許容するものはない。さらに、上記の
方法の幾つかは試料の調製、試薬溶液との反応もしくは
インキュベーションの時間を必要とし、これは、より早
い迅速な試料処理時間を必要とする全自動システムにお
いて用いられる非常に迅速な方法には適切ではない。
【００１４】Shapiro及びStephensは、「オキサジン750
又は関連レーザー染料を用いる633nmh励起でのDNA含量
のフローサイトメトリー」, 7 巻 , 107頁-110頁 (198
6)において、フローサイトメトリーによるＤＮＡ含量の
決定へのオキサジン750の使用を開示する。細胞を10μM
ないし30μMのオキサジン750で染色し、ＤＮＡ測定のた
めにエタノールを添加することによってそれらを固定す
る。Shapiro及びStephensは、オキサジン750が細胞内の
ＲＮＡを染色するものとは思われないと主張する。さら
に、オキサジン750を用いるこのプロトコルは、網状赤
血球の計数又は容積及び細胞ずつを基準とするヘモグロ
ビン濃度のような他の診断上重要な赤血球のパラメータ
の同時測定を許容しない。
又は関連レーザー染料を用いる633nmh励起でのDNA含量
のフローサイトメトリー」, 7 巻 , 107頁-110頁 (198
6)において、フローサイトメトリーによるＤＮＡ含量の
決定へのオキサジン750の使用を開示する。細胞を10μM
ないし30μMのオキサジン750で染色し、ＤＮＡ測定のた
めにエタノールを添加することによってそれらを固定す
る。Shapiro及びStephensは、オキサジン750が細胞内の
ＲＮＡを染色するものとは思われないと主張する。さら
に、オキサジン750を用いるこのプロトコルは、網状赤
血球の計数又は容積及び細胞ずつを基準とするヘモグロ
ビン濃度のような他の診断上重要な赤血球のパラメータ
の同時測定を許容しない。
【００１５】Kim及びOrnsteinの米国特許第4,575,490号
及び同第4,412,004号は、フローサイトメーターでの赤
血球の容積の測定における配向性ノイズを排除するため
の方法及び試薬を教示する。開示される方法は、細胞間
のあらゆる配向性の差異をも排除して細胞容積のより厳
密かつ正確な測定を可能とするための染色されていない
赤血球を等容積測定的な球状化を含む。赤血球の各々
は、界面活性球状化剤により両凹形状から完全な球に変
換される。赤血球の溶解を防ぐため、この球状化剤と共
に「緩衝」タンパク質及び／又はアルデヒド固定化剤を
用いることが必要であることが開示される。Kim及びOrn
steinによって記載される試薬におけるアニオン性界面
活性球状化剤は、染色及び網状物の沈殿に用いられるカ
チオン性染料と急速に反応して沈殿させるため、網状赤
血球の染色に用いることはできない。S. S. Fanらの米
国特許第5,360,739号及び同第5,411,891号は、カチオン
性染料及び蛍光／散乱フローサイトメトリー分析を用い
る網状赤血球の測定のための方法及び試薬組成物を開示
する。
及び同第4,412,004号は、フローサイトメーターでの赤
血球の容積の測定における配向性ノイズを排除するため
の方法及び試薬を教示する。開示される方法は、細胞間
のあらゆる配向性の差異をも排除して細胞容積のより厳
密かつ正確な測定を可能とするための染色されていない
赤血球を等容積測定的な球状化を含む。赤血球の各々
は、界面活性球状化剤により両凹形状から完全な球に変
換される。赤血球の溶解を防ぐため、この球状化剤と共
に「緩衝」タンパク質及び／又はアルデヒド固定化剤を
用いることが必要であることが開示される。Kim及びOrn
steinによって記載される試薬におけるアニオン性界面
活性球状化剤は、染色及び網状物の沈殿に用いられるカ
チオン性染料と急速に反応して沈殿させるため、網状赤
血球の染色に用いることはできない。S. S. Fanらの米
国特許第5,360,739号及び同第5,411,891号は、カチオン
性染料及び蛍光／散乱フローサイトメトリー分析を用い
る網状赤血球の測定のための方法及び試薬組成物を開示
する。
【００１６】Tyckoの米国特許第4,735,504号は、テクニ
コン（TECHNICON）H・1TMシステムの赤血球チャンネ
ル、抗凝血化全血試料中の個別及び平均赤血球容積（MC
V）、並びに個別及び平均小体ヘモグロビン濃度（MCH
C）を測定するための全自動化方法及び手段を提供する
フローサイトメーターを開示する。この方法において
は、まず全血試料の2μlアリコート中の赤血球を希釈
し、次いで当該技術分野において公知の方法を用いて等
容積測定的に球状化する。20秒インキュベートした後、
これらの細胞を、分析器の赤血球チャンネル内を照射測
定区域を通して本質的には一度に1個づつ通過させる。T
yckoの方法は網状赤血球と非網状赤血球とを区別せず、
容積及び細胞ずつを基準とするヘモグロビン濃度のよう
な網状赤血球及び赤血球の診断上重要なパラメータを別
々に決定することはない。
コン（TECHNICON）H・1TMシステムの赤血球チャンネ
ル、抗凝血化全血試料中の個別及び平均赤血球容積（MC
V）、並びに個別及び平均小体ヘモグロビン濃度（MCH
C）を測定するための全自動化方法及び手段を提供する
フローサイトメーターを開示する。この方法において
は、まず全血試料の2μlアリコート中の赤血球を希釈
し、次いで当該技術分野において公知の方法を用いて等
容積測定的に球状化する。20秒インキュベートした後、
これらの細胞を、分析器の赤血球チャンネル内を照射測
定区域を通して本質的には一度に1個づつ通過させる。T
yckoの方法は網状赤血球と非網状赤血球とを区別せず、
容積及び細胞ずつを基準とするヘモグロビン濃度のよう
な網状赤血球及び赤血球の診断上重要なパラメータを別
々に決定することはない。
【００１７】本発明は、手動の試料調製を必要とせず、
血液試料の分析に先立つ全自動血液分析器システムでの
反応溶液におけるインキュベーション時間を約20秒未満
にすることを可能にする改善されたより迅速な血球測定
方法を提供することにより、当該技術分野に大きな利点
を提供するものである。加えて、本発明は、散乱／吸収
フローサイトメトリー技術を用いて再現性のある、信頼
のおける正確な結果を提供する。このような結果が、既
に存在する散乱／吸収フローサイトメトリー法で得るこ
とができるものよりも明らかに高速に得られる。
血液試料の分析に先立つ全自動血液分析器システムでの
反応溶液におけるインキュベーション時間を約20秒未満
にすることを可能にする改善されたより迅速な血球測定
方法を提供することにより、当該技術分野に大きな利点
を提供するものである。加えて、本発明は、散乱／吸収
フローサイトメトリー技術を用いて再現性のある、信頼
のおける正確な結果を提供する。このような結果が、既
に存在する散乱／吸収フローサイトメトリー法で得るこ
とができるものよりも明らかに高速に得られる。
【００１８】
【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
主な目的は、全自動試料分析及び高速自動血液分析器を
用いる吸収フローサイトメトリー技術により、網状赤血
球、赤血球、及び血小板を全血試料中の他の細胞と区別
するための改善された迅速な（すなわち、約20秒以下の
反応時間）方法及び試薬組成物を提供することにある。
本発明の別の目的は、全自動吸収フローサイトメトリー
分析機を用いて全血試料中の網状赤血球、赤血球及び血
小板を計数するための迅速かつ高感度の方法及びそこで
用いられる試薬組成物であって、自動化血液試料分析に
先立って手動試料調製を必要とせず、したがってさらな
る試料調製時間を必要としない方法及び試薬組成物を提
供することにある。
主な目的は、全自動試料分析及び高速自動血液分析器を
用いる吸収フローサイトメトリー技術により、網状赤血
球、赤血球、及び血小板を全血試料中の他の細胞と区別
するための改善された迅速な（すなわち、約20秒以下の
反応時間）方法及び試薬組成物を提供することにある。
本発明の別の目的は、全自動吸収フローサイトメトリー
分析機を用いて全血試料中の網状赤血球、赤血球及び血
小板を計数するための迅速かつ高感度の方法及びそこで
用いられる試薬組成物であって、自動化血液試料分析に
先立って手動試料調製を必要とせず、したがってさらな
る試料調製時間を必要としない方法及び試薬組成物を提
供することにある。
【００１９】本発明のさらなる目的は、赤血球及び網状
赤血球を同時に球状化して網状赤血球を染色し、かつ僅
か数秒以内に網状赤血球の総数及び指標並びに血小板の
総数を得るための、散乱／吸収フローサイトメトリーを
用いる他の自動化血球分析方法と比較して完全に自動化
された迅速な方法及びそのための試薬組成物を提供する
ことにある。本発明のさらなる目的は、吸収及び散乱光
フローサイトメトリーによって全血試料中の網状赤血球
及び赤血球の指標、例えば、平均細胞容積、ヘモグロビ
ン濃度及びヘモグロビン含量を測定するための完全に自
動化された迅速な方法及びそのための試薬組成物を提供
することにある。本発明は、さらに、上記細胞パラメー
タの分布を提供する。
赤血球を同時に球状化して網状赤血球を染色し、かつ僅
か数秒以内に網状赤血球の総数及び指標並びに血小板の
総数を得るための、散乱／吸収フローサイトメトリーを
用いる他の自動化血球分析方法と比較して完全に自動化
された迅速な方法及びそのための試薬組成物を提供する
ことにある。本発明のさらなる目的は、吸収及び散乱光
フローサイトメトリーによって全血試料中の網状赤血球
及び赤血球の指標、例えば、平均細胞容積、ヘモグロビ
ン濃度及びヘモグロビン含量を測定するための完全に自
動化された迅速な方法及びそのための試薬組成物を提供
することにある。本発明は、さらに、上記細胞パラメー
タの分布を提供する。
【００２０】本発明のさらに別の目的は、血液試料中の
赤血球、網状赤血球、及び血小板を同時に区別して各々
を計数し、かつ容積、ヘモグロビン含量、ヘモグロビン
濃度、平均赤血球容積、及び細胞ずつを基準とした測定
により決定される各赤血球型の平均小体ヘモグロビン濃
度を決定するための上述の方法及び試薬組成物を提供す
ることにある。本発明の上記の、及び他の目的並びに重
要な利点は、添付の図面と共に考慮される以下のそれら
の詳細な説明により明瞭になるものと考えられる。
赤血球、網状赤血球、及び血小板を同時に区別して各々
を計数し、かつ容積、ヘモグロビン含量、ヘモグロビン
濃度、平均赤血球容積、及び細胞ずつを基準とした測定
により決定される各赤血球型の平均小体ヘモグロビン濃
度を決定するための上述の方法及び試薬組成物を提供す
ることにある。本発明の上記の、及び他の目的並びに重
要な利点は、添付の図面と共に考慮される以下のそれら
の詳細な説明により明瞭になるものと考えられる。
【００２１】
【課題を解決するための手段】血液分析の領域において
は、試験のために抜き出された血液試料中の赤血球及び
網状赤血球の絶対総数とそのパーセントを決定し、かつ
血小板の総数を決定するためのより迅速な検定及び分析
方法に対する必要性が常に存在する。
は、試験のために抜き出された血液試料中の赤血球及び
網状赤血球の絶対総数とそのパーセントを決定し、かつ
血小板の総数を決定するためのより迅速な検定及び分析
方法に対する必要性が常に存在する。
【００２２】当該技術分野において用いられる半自動化
血液分析器は、分析器システムの内部もしくは外部のい
ずれかで血球を含む血液試料を適切な試薬溶液と混合し
て試薬混合物（すなわち、反応懸濁液）を形成した後
に、試料データを定型的に提供する。試薬混合物を一定
期間インキュベートした後、この混合物を血液分析装置
で分析する。したがって、試料の調製及びインキュベー
ションが、半自動化血液装置における血液試料の分析に
必要な時間の長さに寄与する制限要素である。
血液分析器は、分析器システムの内部もしくは外部のい
ずれかで血球を含む血液試料を適切な試薬溶液と混合し
て試薬混合物（すなわち、反応懸濁液）を形成した後
に、試料データを定型的に提供する。試薬混合物を一定
期間インキュベートした後、この混合物を血液分析装置
で分析する。したがって、試料の調製及びインキュベー
ションが、半自動化血液装置における血液試料の分析に
必要な時間の長さに寄与する制限要素である。
【００２３】全自動高速分析器、例えば、テクニコンH
・システムシリーズの分析器に対しては、より迅速な自
動化された血液及び全血試料分析方法がこれらの高速シ
ステムにおける正確かつ信頼のおける統合と処理に必要
である。オフラインでの手動での試料調製を必要とせ
ず、そのため本質的に自動化分析器内で生じる一工程プ
ロセスの試料分析である新規の方法が本発明によって提
供される。したがって、用いられる方法及び試薬は手動
の試料調製及び処理時間を排除し、そのため、当該技術
分野における他の散乱／吸収法のものと比較した場合、
血球同定及び測定の時間全体を大きくかつ有利に、すな
わち少なくともマグニチュードのオーダーで、減少させ
る。
・システムシリーズの分析器に対しては、より迅速な自
動化された血液及び全血試料分析方法がこれらの高速シ
ステムにおける正確かつ信頼のおける統合と処理に必要
である。オフラインでの手動での試料調製を必要とせ
ず、そのため本質的に自動化分析器内で生じる一工程プ
ロセスの試料分析である新規の方法が本発明によって提
供される。したがって、用いられる方法及び試薬は手動
の試料調製及び処理時間を排除し、そのため、当該技術
分野における他の散乱／吸収法のものと比較した場合、
血球同定及び測定の時間全体を大きくかつ有利に、すな
わち少なくともマグニチュードのオーダーで、減少させ
る。
【００２４】本発明の一態様において、光散乱及び吸収
の測定に基づく全自動分析器を用いて網状赤血球、赤血
球及び血小板の総数を決定し、かつ網状赤血球及び赤血
球の指標及びパラメータを決定するための迅速な方法が
提供される。本明細書で説明される非常に迅速な自動化
された試料分析に光散乱及び吸収の方法論を用いること
により、蛍光ベースの方法論を定型的に用いる当該技術
分野に改善された方法がもたらされる。
の測定に基づく全自動分析器を用いて網状赤血球、赤血
球及び血小板の総数を決定し、かつ網状赤血球及び赤血
球の指標及びパラメータを決定するための迅速な方法が
提供される。本明細書で説明される非常に迅速な自動化
された試料分析に光散乱及び吸収の方法論を用いること
により、蛍光ベースの方法論を定型的に用いる当該技術
分野に改善された方法がもたらされる。
【００２５】本発明の方法は、全血試料のアリコートと
の初期の反応の約5ないし60秒以内、好ましくは約20な
いし50秒以内、より好ましくは約20ないし30秒以内での
細胞の計数及び特徴付けのために全血試料中の網状赤血
球を染色するのに有効な濃度でカチオン性染料を含む網
状赤血球染色試薬を用いることを包含する。本発明に従
うと、血液試料を自動化血液分析器において約30秒で分
析することが可能であり、これには約20秒の試薬組成物
における試料の反応時間及び約10秒の計数時間が、約0.
1秒未満の数理分析時間と共に含まれる。
の初期の反応の約5ないし60秒以内、好ましくは約20な
いし50秒以内、より好ましくは約20ないし30秒以内での
細胞の計数及び特徴付けのために全血試料中の網状赤血
球を染色するのに有効な濃度でカチオン性染料を含む網
状赤血球染色試薬を用いることを包含する。本発明に従
うと、血液試料を自動化血液分析器において約30秒で分
析することが可能であり、これには約20秒の試薬組成物
における試料の反応時間及び約10秒の計数時間が、約0.
1秒未満の数理分析時間と共に含まれる。
【００２６】この方法の簡潔性及び迅速性は熟練した専
門家にとって有利である。試料の調製が含まれないた
め、熟練度に劣る職員でさえ、この全自動分析器を操作
し、本発明の方法を用いて、正確かつ信頼のおける血球
の総数及び指標を得ることができる。加えて、半自動化
システムを用いてより少ない血液試料の分析を行うのに
従来必要とされたものと同じ期間により多くの試料を分
析することが可能である。例えば、本発明によると、血
液試料の分析は全自動システムにおいて約20ないし30秒
未満内に行われるのに対して、半自動化法では少なくと
も約150秒である。
門家にとって有利である。試料の調製が含まれないた
め、熟練度に劣る職員でさえ、この全自動分析器を操作
し、本発明の方法を用いて、正確かつ信頼のおける血球
の総数及び指標を得ることができる。加えて、半自動化
システムを用いてより少ない血液試料の分析を行うのに
従来必要とされたものと同じ期間により多くの試料を分
析することが可能である。例えば、本発明によると、血
液試料の分析は全自動システムにおいて約20ないし30秒
未満内に行われるのに対して、半自動化法では少なくと
も約150秒である。
【００２７】この方法に関与する水性試薬組成物は、反
応混合物のpHを、成熟赤血球の非特異的染色が網状赤血
球及び赤血球の計数及び特徴付けの分析を妨げるのを防
ぐ値に維持する緩衝剤を含む。血液試料は、当該技術分
野において従来知られるように抗凝血化することができ
る。この試薬は、網状赤血球の指標の測定を可能にする
球状化剤、好ましくは本明細書に記載される両性イオン
性界面活性剤をさらに含む。また、この試薬は、緩衝化
反応溶液の浸透圧モル濃度に関して最適化されている。
応混合物のpHを、成熟赤血球の非特異的染色が網状赤血
球及び赤血球の計数及び特徴付けの分析を妨げるのを防
ぐ値に維持する緩衝剤を含む。血液試料は、当該技術分
野において従来知られるように抗凝血化することができ
る。この試薬は、網状赤血球の指標の測定を可能にする
球状化剤、好ましくは本明細書に記載される両性イオン
性界面活性剤をさらに含む。また、この試薬は、緩衝化
反応溶液の浸透圧モル濃度に関して最適化されている。
【００２８】当業者は、全てのカチオン性化合物が無処
置の赤血球（及び網状赤血球）の膜を透過することがで
きるわけではなく、必然的にカチオンを伴うアニオンの
性質が、そのカチオン性化合物が急速に、もしくは徐々
に浸透し、あるいは全く浸透しないかどうかに影響を与
え得ることを理解するであろう。疎水性分子は一般に親
水性分子よりも速く赤血球膜を透過し、小さい分子は一
般に大きい分子よりも速く膜を透過する。網状赤血球を
染色することが可能なカチオン性染料と混合された塩も
しくは緩衝剤の少数のみが急速な染色を許容する。すな
わち、「誤った」緩衝剤を伴う「正しい」染料では網状
赤血球の染色に非常に長い時間がかかることがある。繰
り返しになるが、有用な網状赤血球染色混合物の処方を
発見するには試行錯誤が必要である。したがって、指針
として用いることができる様々な「規則」にもかかわら
ず、その条件の下で、あらゆる特定のカチオン性染料が
網状赤血球に急速に浸透して染色し得るのかどうかを演
繹的に予測することは困難である。
置の赤血球（及び網状赤血球）の膜を透過することがで
きるわけではなく、必然的にカチオンを伴うアニオンの
性質が、そのカチオン性化合物が急速に、もしくは徐々
に浸透し、あるいは全く浸透しないかどうかに影響を与
え得ることを理解するであろう。疎水性分子は一般に親
水性分子よりも速く赤血球膜を透過し、小さい分子は一
般に大きい分子よりも速く膜を透過する。網状赤血球を
染色することが可能なカチオン性染料と混合された塩も
しくは緩衝剤の少数のみが急速な染色を許容する。すな
わち、「誤った」緩衝剤を伴う「正しい」染料では網状
赤血球の染色に非常に長い時間がかかることがある。繰
り返しになるが、有用な網状赤血球染色混合物の処方を
発見するには試行錯誤が必要である。したがって、指針
として用いることができる様々な「規則」にもかかわら
ず、その条件の下で、あらゆる特定のカチオン性染料が
網状赤血球に急速に浸透して染色し得るのかどうかを演
繹的に予測することは困難である。
【００２９】本発明の方法及び試薬を用いて血液試料の
分析を行うための全自動装置は、一般には、1）反応要
素の各々の適正容積を提供する血液及び試薬秤量装置；
2）それらの要素を適切に混合するための手段；3）反応
チャンバー；及び4）混合物を測定装置に搬送するため
の手段を具備する。測定装置は、計数のためにフローセ
ルを通る細胞含有反応混合物の秤量された流れを提供す
る手段を具備する。一般には、ヘリウム−ネオンレーザ
ー又はレーザーダイオードからの光がフローセルに入射
し、この光がフローセルを通過する血球の移動によって
遮られる。血球はそれらが光を遮る際にそれを散乱さ
せ、染色された網状赤血球の場合にはその上光を吸収す
る。
分析を行うための全自動装置は、一般には、1）反応要
素の各々の適正容積を提供する血液及び試薬秤量装置；
2）それらの要素を適切に混合するための手段；3）反応
チャンバー；及び4）混合物を測定装置に搬送するため
の手段を具備する。測定装置は、計数のためにフローセ
ルを通る細胞含有反応混合物の秤量された流れを提供す
る手段を具備する。一般には、ヘリウム−ネオンレーザ
ー又はレーザーダイオードからの光がフローセルに入射
し、この光がフローセルを通過する血球の移動によって
遮られる。血球はそれらが光を遮る際にそれを散乱さ
せ、染色された網状赤血球の場合にはその上光を吸収す
る。
【００３０】測定装置は3種類の光学検出器を具備す
る。これらの検出器のうちの2種類は、入射軸からそれ
ぞれ1°−3°及び4°−20°、好ましくはそれぞれ2°−
3°及び5°−15°で散乱された光を検出する。第3の検
出器は吸収光の画分を測定する。これらの3種類の検出
器からの信号はコンピュータによって分析され、このコ
ンピュータはミー散乱理論（Mie Scattering Theory）
から導かれた表を用いてこれらの信号をフローセルを通
過する細胞の各々の細胞容積、ヘモグロビン濃度及びヘ
モグロビン含量データに変換する。また、このコンピュ
ータは、細胞懸濁液の5°−15°散乱対吸収の細胞所見
を表示し、数理アルゴリズムを用いて赤血球、網状赤血
球、血小板及び同時発生信号を区別及び識別する。
る。これらの検出器のうちの2種類は、入射軸からそれ
ぞれ1°−3°及び4°−20°、好ましくはそれぞれ2°−
3°及び5°−15°で散乱された光を検出する。第3の検
出器は吸収光の画分を測定する。これらの3種類の検出
器からの信号はコンピュータによって分析され、このコ
ンピュータはミー散乱理論（Mie Scattering Theory）
から導かれた表を用いてこれらの信号をフローセルを通
過する細胞の各々の細胞容積、ヘモグロビン濃度及びヘ
モグロビン含量データに変換する。また、このコンピュ
ータは、細胞懸濁液の5°−15°散乱対吸収の細胞所見
を表示し、数理アルゴリズムを用いて赤血球、網状赤血
球、血小板及び同時発生信号を区別及び識別する。
【００３１】例えば、上述の分析から得られたレポート
スクリーンが図1A及び1Bに示されている。これらのスク
リーンのうちの1つは正常なパーセンテージの網状赤血
球（すなわち、1.4）を有する血液試料について得られ
たデータを報告し、第2のスクリーンは網状赤血球のパ
ーセンテージが11.0である異常血液試料について得られ
たデータを報告する。これらの報告は網状赤血球の指標
を含む。図1A及び1Bについて、報告された結果（これら
は細胞所見と相関する）は以下の通りである。
スクリーンが図1A及び1Bに示されている。これらのスク
リーンのうちの1つは正常なパーセンテージの網状赤血
球（すなわち、1.4）を有する血液試料について得られ
たデータを報告し、第2のスクリーンは網状赤血球のパ
ーセンテージが11.0である異常血液試料について得られ
たデータを報告する。これらの報告は網状赤血球の指標
を含む。図1A及び1Bについて、報告された結果（これら
は細胞所見と相関する）は以下の通りである。
【００３２】図1Aについて：SAMPLE RETICS CHCM 30.04 g/dl CHCM 27.43 g/dL MCV 93.86 fl MCV 115.60 fl MCH 27.60 pg MCH 30.98 gp HDW 2.41 g/dl HDW 2.38 g/dl RDW 13.03 % RDW 17.61 % RBC 5.19 x 106 /μL RETIC 71.97 x 109 /L POS 251 NEG 17860 %POS 1.39% L 96.81% M 2.79% H 0.40% 図1Bについて：SAMPLE RETICS CHCM 30.01 g/dl CHCM 26.81 g/dL MCV 96.94 fl MCV 113.15 fl MCH 28.35 pg MCH 29.56 gp HDW 4.02 g/dl HDW 3.76 g/dl RDW 20.21 % RDW 18.53 % RBC 2.89 x 106 /μL RETIC 318.13 x 109 /L POS 1769 NEG 14280 %POS 11.02% L 60.15% M 29.79% H 10.06% これらの図1A及び1Bに報告された結果は以下の通りであ
る：SAMPLE＝分析した細胞の総数；RETICS＝網状赤血球
として数えられた細胞；CHCM＝細胞ヘモグロビン濃度平
均、これはMCHC、すなわち平均細胞ヘモグロビン濃度と
同じ細胞の特性を測定する；MCV＝（赤血球の）平均細
胞容積；MCH＝平均細胞ヘモグロビン；HDW＝ヘモグロビ
ン分布幅（試料に関する細胞ヘモグロビン濃度のバラツ
キの測定）；RDW＝赤血球分布幅；RBC＝赤血球総数；RE
TIC＝網状赤血球総数；POS＝数えられた網状赤血球の
数；NEG＝数えられた赤血球の数；％POS＝試料中の網状
赤血球のパーセンテージ；L、M、H＝低、中、及び高染
色網状赤血球のパーセンテージ；PLT＝血小板総数；MPV
＝平均血小板容積；PCT＝血小板基準（血小板によって
占められる試料容積のパーセンテージ）；PDW＝血小板
分布幅（試料内での血小板容積の分布）。
る：SAMPLE＝分析した細胞の総数；RETICS＝網状赤血球
として数えられた細胞；CHCM＝細胞ヘモグロビン濃度平
均、これはMCHC、すなわち平均細胞ヘモグロビン濃度と
同じ細胞の特性を測定する；MCV＝（赤血球の）平均細
胞容積；MCH＝平均細胞ヘモグロビン；HDW＝ヘモグロビ
ン分布幅（試料に関する細胞ヘモグロビン濃度のバラツ
キの測定）；RDW＝赤血球分布幅；RBC＝赤血球総数；RE
TIC＝網状赤血球総数；POS＝数えられた網状赤血球の
数；NEG＝数えられた赤血球の数；％POS＝試料中の網状
赤血球のパーセンテージ；L、M、H＝低、中、及び高染
色網状赤血球のパーセンテージ；PLT＝血小板総数；MPV
＝平均血小板容積；PCT＝血小板基準（血小板によって
占められる試料容積のパーセンテージ）；PDW＝血小板
分布幅（試料内での血小板容積の分布）。
【００３３】本発明の測定に適切な例示的測定装置及び
システムはTyckoの米国特許4,735,504号に記載されるよ
うなものであり、この特許は引用することにより本明細
書に組込まれる。本発明の改善された迅速な方法を実施
するため、当業者がTyckoの方法及びシステムを必要に
応じて変更することができることは理解される。Tycko
の方法を利用するには、ヘモグロビンが非常に透過性で
ある領域の単色光を放射する光源、典型的には、赤色ヘ
リウムネオン（HeNe）レーザー又はさらに波長が長いレ
ーザーのような光源が必要である。これは、その波長が
吸収測定にも用いられる場合、染料は赤色光を強く吸収
する青色染料でなければならないことを意味する。染料
オキサジン750が、網状赤血球のＲＮＡ濃度、網状赤血
球の細胞総数、血小板総数並びに細胞−細胞基準での成
熟赤血球及び網状赤血球の容積及びヘモグロビン含量を
決定するための本発明の改善された迅速な吸収／散乱フ
ローサイトメトリー法における好ましい染料及び使用と
して役立つ。
システムはTyckoの米国特許4,735,504号に記載されるよ
うなものであり、この特許は引用することにより本明細
書に組込まれる。本発明の改善された迅速な方法を実施
するため、当業者がTyckoの方法及びシステムを必要に
応じて変更することができることは理解される。Tycko
の方法を利用するには、ヘモグロビンが非常に透過性で
ある領域の単色光を放射する光源、典型的には、赤色ヘ
リウムネオン（HeNe）レーザー又はさらに波長が長いレ
ーザーのような光源が必要である。これは、その波長が
吸収測定にも用いられる場合、染料は赤色光を強く吸収
する青色染料でなければならないことを意味する。染料
オキサジン750が、網状赤血球のＲＮＡ濃度、網状赤血
球の細胞総数、血小板総数並びに細胞−細胞基準での成
熟赤血球及び網状赤血球の容積及びヘモグロビン含量を
決定するための本発明の改善された迅速な吸収／散乱フ
ローサイトメトリー法における好ましい染料及び使用と
して役立つ。
【００３４】より詳細には、フローサイトメトリーの根
本的な概念は、本質的に、細胞が特定の検知区域を一度
に1個づつ通過することである。典型的には、水力学的
合焦により、1個の細胞が、焦点が合わせられた光源並
びに散乱及び吸収光を測定するための検出システムから
なる検知区域を通過する。粒子が光に対して有するそれ
を遮断する効果は多くの方法で検出することができる。
一般には、粒子は、それが懸濁されている媒体とは異な
る屈折率を有する。屈折率nは、実数部nrといわゆる虚
数部niとの2つの部分からなる。niのゼロではない値は
光吸収に関連する。したがって、粒子は、一定の範囲の
角度で、その照射光の波長に加えて屈折率の差、粒子の
大きさ、その形状並びに屈折率及び構造における内部変
動に依存して変化する強度で該粒子を照らす光を散乱及
び吸収する。（均一な球については、ミー散乱理論が散
乱光の分布及び強度の完全な記載を提供する）。
本的な概念は、本質的に、細胞が特定の検知区域を一度
に1個づつ通過することである。典型的には、水力学的
合焦により、1個の細胞が、焦点が合わせられた光源並
びに散乱及び吸収光を測定するための検出システムから
なる検知区域を通過する。粒子が光に対して有するそれ
を遮断する効果は多くの方法で検出することができる。
一般には、粒子は、それが懸濁されている媒体とは異な
る屈折率を有する。屈折率nは、実数部nrといわゆる虚
数部niとの2つの部分からなる。niのゼロではない値は
光吸収に関連する。したがって、粒子は、一定の範囲の
角度で、その照射光の波長に加えて屈折率の差、粒子の
大きさ、その形状並びに屈折率及び構造における内部変
動に依存して変化する強度で該粒子を照らす光を散乱及
び吸収する。（均一な球については、ミー散乱理論が散
乱光の分布及び強度の完全な記載を提供する）。
【００３５】上述のように、粒子は入射光の幾らかを吸
収することもある。後者の場合、吸収された光の一部
が、典型的には吸収された光の波長よりも長い波長で、
蛍光として再放射されることも、されないこともある。
これらの、及び他の効果は、様々な角度の間隔の散乱
光、非散乱光、蛍光及び粒子によって吸収された光の画
分を測定するように配置された光検出器で測定すること
ができる。粒子が血球と同程度に小さい場合、典型的に
は直径が15マイクロメーター未満である場合、それらが
高速で（典型的には、広く間隔をおいた細胞が秒当り数
百ないし数千個）通過することによって影響を受ける照
射ビーム中の光子の数は、とりわけ懸濁液流の照射部に
入射する秒当りの光子数と比較した場合、及び吸収検出
器のバックグラウンド照射と比較した場合、非常に小さ
いものであり得る。したがって、粒子間の小さな特定の
相違の検出の感度の限界は、光子流（これは、少なくと
も光源に固有の「輝度」に依存する）及び粒子間の他の
大小の相違によって生じる光子流の乱れがどの程度の大
きさなのかに大きく依存する。
収することもある。後者の場合、吸収された光の一部
が、典型的には吸収された光の波長よりも長い波長で、
蛍光として再放射されることも、されないこともある。
これらの、及び他の効果は、様々な角度の間隔の散乱
光、非散乱光、蛍光及び粒子によって吸収された光の画
分を測定するように配置された光検出器で測定すること
ができる。粒子が血球と同程度に小さい場合、典型的に
は直径が15マイクロメーター未満である場合、それらが
高速で（典型的には、広く間隔をおいた細胞が秒当り数
百ないし数千個）通過することによって影響を受ける照
射ビーム中の光子の数は、とりわけ懸濁液流の照射部に
入射する秒当りの光子数と比較した場合、及び吸収検出
器のバックグラウンド照射と比較した場合、非常に小さ
いものであり得る。したがって、粒子間の小さな特定の
相違の検出の感度の限界は、光子流（これは、少なくと
も光源に固有の「輝度」に依存する）及び粒子間の他の
大小の相違によって生じる光子流の乱れがどの程度の大
きさなのかに大きく依存する。
【００３６】吸収及び散乱フローサイトメトリー信号に
おける妨害ノイズの主な源は各々の種類の信号で全く異
なることがある。第1オーダーの近似に対しては、染色
細胞または非染色細胞からの散乱及び吸収信号の強度
は、それらの信号が生じる細胞の形状及び配向に非常に
強く影響を受ける。極端な例として、ヒト赤血球の本来
の両凹形状はそれらが生じる吸収及び散乱信号に対する
強い効果を有する。このような効果は、古典的に染色さ
れた網状赤血球の小さな吸収信号よりも大きい。網状赤
血球を測定するための散乱／吸収フローサイトメトリー
分析の説明はG. Colellaらの米国特許5,350,695号及び
5,438,003号に記載されており、その内容は引用するこ
とにより本明細書に組込まれる。
おける妨害ノイズの主な源は各々の種類の信号で全く異
なることがある。第1オーダーの近似に対しては、染色
細胞または非染色細胞からの散乱及び吸収信号の強度
は、それらの信号が生じる細胞の形状及び配向に非常に
強く影響を受ける。極端な例として、ヒト赤血球の本来
の両凹形状はそれらが生じる吸収及び散乱信号に対する
強い効果を有する。このような効果は、古典的に染色さ
れた網状赤血球の小さな吸収信号よりも大きい。網状赤
血球を測定するための散乱／吸収フローサイトメトリー
分析の説明はG. Colellaらの米国特許5,350,695号及び
5,438,003号に記載されており、その内容は引用するこ
とにより本明細書に組込まれる。
【００３７】上述のように、カチオン性染料の少数のみ
が網状赤血球を選択的に染色し、これらの染料のうちの
さらに少数のみが網状赤血球に迅速に浸透する。本発明
の方法において用いられる最適pH及びイオン強度の試薬
組成物と組み合わされているカチオン性染料化合物の集
中が網状赤血球のＲＮＡの迅速な染色及び数秒での試料
の分析を達成する。これは、網状赤血球、赤血球及び血
小板の分析を、全自動フローサイトメトリーによって、
血液試料と本発明において用いられる試薬組成物とを一
緒に混合した後約20ないし30秒未満で行うことを可能に
し、それにより、本発明の速度及び完全に自動化された
手順においてそれをうまく正確に行うことに寄与する。
本発明の方法及び試薬は、当該技術分野における現行の
散乱／吸収フローサイトメトリー法と少なくとも同等か
ら10倍の速さでの血液試料の分析を可能にする。一方、
従来の網状赤血球ＲＮＡ染色手順は、試料及び試薬の混
合及びインキュベーションに少なくとも数分を要する。
が網状赤血球を選択的に染色し、これらの染料のうちの
さらに少数のみが網状赤血球に迅速に浸透する。本発明
の方法において用いられる最適pH及びイオン強度の試薬
組成物と組み合わされているカチオン性染料化合物の集
中が網状赤血球のＲＮＡの迅速な染色及び数秒での試料
の分析を達成する。これは、網状赤血球、赤血球及び血
小板の分析を、全自動フローサイトメトリーによって、
血液試料と本発明において用いられる試薬組成物とを一
緒に混合した後約20ないし30秒未満で行うことを可能に
し、それにより、本発明の速度及び完全に自動化された
手順においてそれをうまく正確に行うことに寄与する。
本発明の方法及び試薬は、当該技術分野における現行の
散乱／吸収フローサイトメトリー法と少なくとも同等か
ら10倍の速さでの血液試料の分析を可能にする。一方、
従来の網状赤血球ＲＮＡ染色手順は、試料及び試薬の混
合及びインキュベーションに少なくとも数分を要する。
【００３８】本発明は、血液試料と自動化血液分析を行
う前にそれと混合される本明細書に記述される試薬組成
物との反応時間を著しく減少させることにより、従来の
方法を大きく改善する。この方法において用いられるカ
チオン性染料の濃度の増加、試薬組成物のpHの低下、及
び最適浸透圧モル濃度の組み合わせの創意に富む発見
が、分析のための試薬組成物を集合して構成する血液試
料と試薬組成物との反応時間を減少させることがわかっ
た。このパラメータの新規の組み合わせは、以下に説明
されるように、成熟赤血球中のヘモグロビンの非特異的
な染色よりも網状赤血球中のＲＮＡの染色に有利に働い
た。
う前にそれと混合される本明細書に記述される試薬組成
物との反応時間を著しく減少させることにより、従来の
方法を大きく改善する。この方法において用いられるカ
チオン性染料の濃度の増加、試薬組成物のpHの低下、及
び最適浸透圧モル濃度の組み合わせの創意に富む発見
が、分析のための試薬組成物を集合して構成する血液試
料と試薬組成物との反応時間を減少させることがわかっ
た。このパラメータの新規の組み合わせは、以下に説明
されるように、成熟赤血球中のヘモグロビンの非特異的
な染色よりも網状赤血球中のＲＮＡの染色に有利に働い
た。
【００３９】興味深いことに、組成物中の染料の濃度を
高めることは、それ自体では、反応媒体と混合した血液
試料の反応時間を減少させはしなかった。これは、最初
の30秒以内では、本発明における使用に必要な高濃度
で、網状赤血球に加えて成熟赤血球が染料（例えば、オ
キサジン750）に著しく結合するためであった。反応媒
体中の血液試料のインキュベーションの時間をより長く
（例えば、30秒を上回る）することで、成熟赤血球によ
る染料の結合は減少した。したがって、他の方法のより
長いインキュベーション時間は、ＲＮＡへのカチオン性
染料の結合を増大させるだけではなく、成熟赤血球の細
胞性ヘモグロビンへの染料の結合を減少させるために必
要であり、これが赤血球の非特異的な染色を引き起こし
ていた。このような非特異的な染色は、吸収信号に関し
て、赤血球と網状赤血球との区別を低下させる。
高めることは、それ自体では、反応媒体と混合した血液
試料の反応時間を減少させはしなかった。これは、最初
の30秒以内では、本発明における使用に必要な高濃度
で、網状赤血球に加えて成熟赤血球が染料（例えば、オ
キサジン750）に著しく結合するためであった。反応媒
体中の血液試料のインキュベーションの時間をより長く
（例えば、30秒を上回る）することで、成熟赤血球によ
る染料の結合は減少した。したがって、他の方法のより
長いインキュベーション時間は、ＲＮＡへのカチオン性
染料の結合を増大させるだけではなく、成熟赤血球の細
胞性ヘモグロビンへの染料の結合を減少させるために必
要であり、これが赤血球の非特異的な染色を引き起こし
ていた。このような非特異的な染色は、吸収信号に関し
て、赤血球と網状赤血球との区別を低下させる。
【００４０】前述の事項にもかかわらず、本発明の方法
及びそこで用いられる組成物は、網状赤血球以外の細胞
による非特異的な染色の悪影響を受けることなしに、速
い反応時間を達成することが可能であった。上述のpHの
低下（例えば、反応媒体のpHを約8.1から約7.4に低下さ
せる）をカチオン性染料の濃度の増加と組み合わせるこ
とにより、20秒未満以内の反応時間で、本発明によって
網状赤血球ＲＮＡに対する親和性は維持されたのに対し
て、赤血球に対する染料の親和性は低下した。本発明に
よると、試薬組成物の水素イオン濃度の増加は、正に荷
電した染料化合物に対するヘモグロビンの親和性を低下
させる可能性がある。さらに、反応媒体のイオン強度の
低下が赤血球のヘモグロビンよりもＲＮＡの染色に都合
が良く、それにより反応時間が減少することが測定され
た。イオン強度の低下は、反応混合物中の他のイオン性
構成要素よりも正に荷電した染料へのＲＮＡの結合に都
合が良い可能性がある。
及びそこで用いられる組成物は、網状赤血球以外の細胞
による非特異的な染色の悪影響を受けることなしに、速
い反応時間を達成することが可能であった。上述のpHの
低下（例えば、反応媒体のpHを約8.1から約7.4に低下さ
せる）をカチオン性染料の濃度の増加と組み合わせるこ
とにより、20秒未満以内の反応時間で、本発明によって
網状赤血球ＲＮＡに対する親和性は維持されたのに対し
て、赤血球に対する染料の親和性は低下した。本発明に
よると、試薬組成物の水素イオン濃度の増加は、正に荷
電した染料化合物に対するヘモグロビンの親和性を低下
させる可能性がある。さらに、反応媒体のイオン強度の
低下が赤血球のヘモグロビンよりもＲＮＡの染色に都合
が良く、それにより反応時間が減少することが測定され
た。イオン強度の低下は、反応混合物中の他のイオン性
構成要素よりも正に荷電した染料へのＲＮＡの結合に都
合が良い可能性がある。
【００４１】本発明の別の側面においては、アジド類
（N3 -）、例えばナトリウムアジド又はシアネート（OCN
-）イオン、例えばシアン酸ナトリウムのような求核試
薬の存在下でヘモグロビンをその酸化（Met）形態に変
換することにより、ＲＮＡの結合に悪影響を及ぼすこと
なく、成熟赤血球に対するカチオン性染料、例えば、オ
キサジン750の結合は減少した。結果として、本発明の
この態様においては、このような求核試薬の非存在下に
おいて用いられる染料の量の約1／5という少ない量を用
いることが可能であった。いかなる特定の理論によって
も結び付けられることを望むものではないが、酸化形態
に結び付くヘモグロビンへの立体配座的な構造変化が試
薬組成物の正に荷電した染料成分に対するヘモグロビン
の親和性を低下させる可能性がある。一般的な指針とし
て、ホームサイトに対して1：1の比のN3 -又は OCN-イオ
ンが存在するという条件の下で、求核性試薬は約20 mM
の濃度で用いられる。求核性試薬及びオキサジン750の
ような染料の両者を含む試薬は保存中は典型的には安定
でないため、これらの試薬を、一緒に添加した場合に必
要とされる最終濃度の成分を生じる2つの部分に分けて
保存することが可能である。このような二剤試薬システ
ムの説明となる例を表1に示す。
（N3 -）、例えばナトリウムアジド又はシアネート（OCN
-）イオン、例えばシアン酸ナトリウムのような求核試
薬の存在下でヘモグロビンをその酸化（Met）形態に変
換することにより、ＲＮＡの結合に悪影響を及ぼすこと
なく、成熟赤血球に対するカチオン性染料、例えば、オ
キサジン750の結合は減少した。結果として、本発明の
この態様においては、このような求核試薬の非存在下に
おいて用いられる染料の量の約1／5という少ない量を用
いることが可能であった。いかなる特定の理論によって
も結び付けられることを望むものではないが、酸化形態
に結び付くヘモグロビンへの立体配座的な構造変化が試
薬組成物の正に荷電した染料成分に対するヘモグロビン
の親和性を低下させる可能性がある。一般的な指針とし
て、ホームサイトに対して1：1の比のN3 -又は OCN-イオ
ンが存在するという条件の下で、求核性試薬は約20 mM
の濃度で用いられる。求核性試薬及びオキサジン750の
ような染料の両者を含む試薬は保存中は典型的には安定
でないため、これらの試薬を、一緒に添加した場合に必
要とされる最終濃度の成分を生じる2つの部分に分けて
保存することが可能である。このような二剤試薬システ
ムの説明となる例を表1に示す。
【００４２】
【表１】 *：ストック溶液の量。蒸留H2O中1mg／mlのTDAPS（テト
ラデシル−N，N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパ
ンスルホネート）。** ：ストック溶液の量。ジメチルホルムアミド4.81ml当
り14.82mgのオキサジン750染料。 図2の細胞所見は、表1に示されるナトリウムアジド処方
を用いて分析した正常試料の代表である。この分析につ
いての反応時間は20秒であった。図2の細胞所見におい
て、図1A及び1Bについて上で定義されるパラメータは以
下の通りである。SAMPLE RETICS CHCM 27.40 g/dl CHCM 24.13 g/dL MCV 96.22 fl MCV 119.13 fl MCH 25.74 pg MCH 27.84 gp HDW 2.71 g/dl HDW 3.62 g/dl RDW 14.31 % RDW 17.50 % RBC 4.15 x 106 /μL RETIC 62.94 x 109 /L POS 276 NEG 17917 %POS 1.52%
ラデシル−N，N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパ
ンスルホネート）。** ：ストック溶液の量。ジメチルホルムアミド4.81ml当
り14.82mgのオキサジン750染料。 図2の細胞所見は、表1に示されるナトリウムアジド処方
を用いて分析した正常試料の代表である。この分析につ
いての反応時間は20秒であった。図2の細胞所見におい
て、図1A及び1Bについて上で定義されるパラメータは以
下の通りである。SAMPLE RETICS CHCM 27.40 g/dl CHCM 24.13 g/dL MCV 96.22 fl MCV 119.13 fl MCH 25.74 pg MCH 27.84 gp HDW 2.71 g/dl HDW 3.62 g/dl RDW 14.31 % RDW 17.50 % RBC 4.15 x 106 /μL RETIC 62.94 x 109 /L POS 276 NEG 17917 %POS 1.52%
【００４３】上述のように、吸収／散乱フローサイトメ
トリー分析のプロセスの改善及び促進、並びに網状赤血
球、赤血球及び血小板を検出する方法及びそこで用いら
れる試薬の開発を研究することにより、全自動血液分析
器に関する特定の用途のために試料を調製する必要もな
しにカチオン性染料によって網状赤血球の網状組織の染
色を包含する本発明の非常に迅速な方法が得られた。加
えて、本発明の改善された迅速な吸収方法においては、
配向性ノイズの排除に赤血球の等容積測定的球状化が用
いられた。等容積測定的球状化及び散乱／吸収法を用い
ることにより、網状赤血球も選択的に染色する試薬を用
いて、網状赤血球及び成熟赤血球の容積及びヘモグロビ
ンを細胞−細胞基準で同時に測定及び定量することが可
能であった。当業者は、球状化が完全であり、かつ等容
積測定的ではないが等張性の既知の因子Xがある場合、T
yckoの方法を容積について1／Xだけ補正し、タンパク
質、例えばヘモグロビン濃度についてXだけ補正して用
いることにより元の値を算出することができることを理
解するであろう。
トリー分析のプロセスの改善及び促進、並びに網状赤血
球、赤血球及び血小板を検出する方法及びそこで用いら
れる試薬の開発を研究することにより、全自動血液分析
器に関する特定の用途のために試料を調製する必要もな
しにカチオン性染料によって網状赤血球の網状組織の染
色を包含する本発明の非常に迅速な方法が得られた。加
えて、本発明の改善された迅速な吸収方法においては、
配向性ノイズの排除に赤血球の等容積測定的球状化が用
いられた。等容積測定的球状化及び散乱／吸収法を用い
ることにより、網状赤血球も選択的に染色する試薬を用
いて、網状赤血球及び成熟赤血球の容積及びヘモグロビ
ンを細胞−細胞基準で同時に測定及び定量することが可
能であった。当業者は、球状化が完全であり、かつ等容
積測定的ではないが等張性の既知の因子Xがある場合、T
yckoの方法を容積について1／Xだけ補正し、タンパク
質、例えばヘモグロビン濃度についてXだけ補正して用
いることにより元の値を算出することができることを理
解するであろう。
【００４４】この方法において用いられる試薬溶液にお
いては、双性イオン性界面活性剤が赤血球及び網状赤血
球の球状化剤として用いられた。これは、それがカチオ
ン性染料に完全に適合し、試薬溶液からの染料の沈殿を
引き起こすことがないためである。このような双性イオ
ン性界面活性剤の非限定的な例には、アルキルアミドベ
タイン又はアルキルベタイン、例えば、ラウラミドプロ
ピルベタイン（LAB）、ココアミドプロピルベタイン（C
APB）、及びココアミドスルホベタイン（CASB）が含ま
れる。他の適切な双性イオン性界面活性剤には、テトラ
デシル−N，N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパン
スルホネート（TDAPS）及びN−ドデシル−N，N−ジメチ
ル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネート（DDAP
S）が含まれる。TDAPS及びDDAPSは、それらにより最も
安定な試料調製品が得られるため、好ましい球状化剤で
ある。本発明によると、赤血球の球状化に有効な量のこ
れらのタイプの界面活性剤及び本明細書で説明される試
薬の仕様を用いることにより、赤血球の溶解を遅らせる
ための試薬混合物におけるタンパク質の緩衝化又は固定
液の必要がなくなる。
いては、双性イオン性界面活性剤が赤血球及び網状赤血
球の球状化剤として用いられた。これは、それがカチオ
ン性染料に完全に適合し、試薬溶液からの染料の沈殿を
引き起こすことがないためである。このような双性イオ
ン性界面活性剤の非限定的な例には、アルキルアミドベ
タイン又はアルキルベタイン、例えば、ラウラミドプロ
ピルベタイン（LAB）、ココアミドプロピルベタイン（C
APB）、及びココアミドスルホベタイン（CASB）が含ま
れる。他の適切な双性イオン性界面活性剤には、テトラ
デシル−N，N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパン
スルホネート（TDAPS）及びN−ドデシル−N，N−ジメチ
ル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネート（DDAP
S）が含まれる。TDAPS及びDDAPSは、それらにより最も
安定な試料調製品が得られるため、好ましい球状化剤で
ある。本発明によると、赤血球の球状化に有効な量のこ
れらのタイプの界面活性剤及び本明細書で説明される試
薬の仕様を用いることにより、赤血球の溶解を遅らせる
ための試薬混合物におけるタンパク質の緩衝化又は固定
液の必要がなくなる。
【００４５】本発明の試薬溶液については、血液試料中
の網状赤血球及び赤血球を等容積測定的に球状化するた
めに、試薬中の球状化剤の濃度は約3.0μg／mlないし約
20μg／ml、好ましくは約4.0ないし約15μg／ml、より
好ましくは約4.1ないし約11.0μg／mlである。TDAPSが
好ましい両性イオン性界面活性球状化剤である。球状化
剤は、好ましくは、約12μg／mlないし約87.5μg／mlの
LAB；約4.1μg／mlないし約11.0μg／mlのTDAPS；約49.
3μg／mlないし約148μg／mlのDDAPS；約8.8μg／mlな
いし約17.5μg／mlのCAPB；又は約12.5μg／mlないし約
15μg／mlのCASBの量で存在する。
の網状赤血球及び赤血球を等容積測定的に球状化するた
めに、試薬中の球状化剤の濃度は約3.0μg／mlないし約
20μg／ml、好ましくは約4.0ないし約15μg／ml、より
好ましくは約4.1ないし約11.0μg／mlである。TDAPSが
好ましい両性イオン性界面活性球状化剤である。球状化
剤は、好ましくは、約12μg／mlないし約87.5μg／mlの
LAB；約4.1μg／mlないし約11.0μg／mlのTDAPS；約49.
3μg／mlないし約148μg／mlのDDAPS；約8.8μg／mlな
いし約17.5μg／mlのCAPB；又は約12.5μg／mlないし約
15μg／mlのCASBの量で存在する。
【００４６】改善された方法の最適の操作性のため、好
ましくは、反応混合物の特定のpH、すなわち約7.2ない
し7.8、好ましくは7.3ないし7.5、より好ましくは、網
状赤血球を染色するための有機カチオン性染料と同様に
7.4、を維持するのに緩衝液が用いられる。好ましい染
料化合物はオキサジン750（オハイオ州デイトンのエキ
サイトロン社（Excitron, Inc.）から入手可能）であ
り、これは下記構造を有する青色吸収染料である。
ましくは、反応混合物の特定のpH、すなわち約7.2ない
し7.8、好ましくは7.3ないし7.5、より好ましくは、網
状赤血球を染色するための有機カチオン性染料と同様に
7.4、を維持するのに緩衝液が用いられる。好ましい染
料化合物はオキサジン750（オハイオ州デイトンのエキ
サイトロン社（Excitron, Inc.）から入手可能）であ
り、これは下記構造を有する青色吸収染料である。
【００４７】
【化３】
【００４８】より具体的には、本発明の方法において用
いられる試薬溶液は、以下の成分：TRIS（トリス［ヒド
ロキシメチル］］−アミノメタン）；TRIS−HCl（トリ
ス［ヒドロキシメチル］−アミノメタン−塩酸）；赤血
球の膜を通しての染料の浸透を容易にするアルカリ金属
塩化塩、例えば、NaCl、KCl等；及び、所望であれば、
微生物の成長を遅らせる坑菌化合物のうちの1以上を含
むことができる。適切な坑菌剤の非限定的な例には、プ
ロクリン（Proclin）150（2−メチル−4−イソチアゾリ
ン−3−オン）及びプロクリン300（5−クロロ−2−メチ
ル−4−イソチアゾリン−3−オン）（ローム＆ハース
（Rohm & Haas）；ジャーマル（Germall）115（N，N’
−メチレンビス［N’−（1−ヒドロキシメチル）−2，5
−ジオキソ−4−イミダゾリジニル］尿素）（サットン
・ラボラトリーズ（Sutton Laboratories））；ドワシ
ル（Dowacil）200（1−（3−クロロアリル）−3，5，7
−トリアザ−1−アゾニアアダマンタン塩化物）（ダウ
ケミカル（Dow Chemical））；及びブロノポル（Bronop
ol）2−ブロモ−2−ニトロプロパン−1，3−ジオール
（C3H6BrNO4）（アンガス・ケミカル社（Angus Chemica
l Company））が含まれる。プロクリン300が本発明にお
いて用いられる試薬組成物に用いるのに好ましい坑菌剤
である。両性イオン性界面活性剤、例えばTDAPS（N−テ
トラデシル−N，N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロ
パンスルホネート）、及びカチオン性染料、例えばオキ
サジン750、も組成物中に含まれる。
いられる試薬溶液は、以下の成分：TRIS（トリス［ヒド
ロキシメチル］］−アミノメタン）；TRIS−HCl（トリ
ス［ヒドロキシメチル］−アミノメタン−塩酸）；赤血
球の膜を通しての染料の浸透を容易にするアルカリ金属
塩化塩、例えば、NaCl、KCl等；及び、所望であれば、
微生物の成長を遅らせる坑菌化合物のうちの1以上を含
むことができる。適切な坑菌剤の非限定的な例には、プ
ロクリン（Proclin）150（2−メチル−4−イソチアゾリ
ン−3−オン）及びプロクリン300（5−クロロ−2−メチ
ル−4−イソチアゾリン−3−オン）（ローム＆ハース
（Rohm & Haas）；ジャーマル（Germall）115（N，N’
−メチレンビス［N’−（1−ヒドロキシメチル）−2，5
−ジオキソ−4−イミダゾリジニル］尿素）（サットン
・ラボラトリーズ（Sutton Laboratories））；ドワシ
ル（Dowacil）200（1−（3−クロロアリル）−3，5，7
−トリアザ−1−アゾニアアダマンタン塩化物）（ダウ
ケミカル（Dow Chemical））；及びブロノポル（Bronop
ol）2−ブロモ−2−ニトロプロパン−1，3−ジオール
（C3H6BrNO4）（アンガス・ケミカル社（Angus Chemica
l Company））が含まれる。プロクリン300が本発明にお
いて用いられる試薬組成物に用いるのに好ましい坑菌剤
である。両性イオン性界面活性剤、例えばTDAPS（N−テ
トラデシル−N，N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロ
パンスルホネート）、及びカチオン性染料、例えばオキ
サジン750、も組成物中に含まれる。
【００４９】説明としての、本発明の、及び本発明の方
法において用いるのに適切な試薬組成物／溶液を、各成
分についての適切な濃度範囲及び各成分についてのリッ
トル当りの量と共に表2に示す。この組成物の最終pHは
約7.4であり、最終浸透圧モル濃度はNaCl又はTDAPS溶液
で292±5mOsmに調整されている。最終pHは、1N HCl又は
1N NaOHを滴下によって添加することにより、適切なp
H、好ましくはpH7.4に調整する。
法において用いるのに適切な試薬組成物／溶液を、各成
分についての適切な濃度範囲及び各成分についてのリッ
トル当りの量と共に表2に示す。この組成物の最終pHは
約7.4であり、最終浸透圧モル濃度はNaCl又はTDAPS溶液
で292±5mOsmに調整されている。最終pHは、1N HCl又は
1N NaOHを滴下によって添加することにより、適切なp
H、好ましくはpH7.4に調整する。
【００５０】 表 2 試薬溶液中の 成分の濃度範囲 リットル当りの量成分 量／リットル （好ましいもの） TRIS 0.7−0.9g 0.806g TRIS−HCl 6.0−8.0g 6.83g NaCl 5.25−7.30g 6.40g プロクリン300 0.15−0.35ml 0.25ml TDAPS （ストック溶液）* 4.1−11.0ml 8.25ml オキサジン750 （ストック溶液）** 2.2−6.6ml 3.3ml 脱イオン水 全量で 950ml* ：脱イオン水中1 mg／mlのTDAPS（N−テトラデシル−N，N−ジメチル−3 −アンモニオ−1−プロパンスルホネート）。** ：ジメチルホルムアミド4.81ml当り14.82mgのオキサジン750。
【００５１】一般には、この試薬溶液は、試薬組成物の
pHを約7.2ないし約7.8に維持し、好ましいpH値は7.4
で、浸透圧モル濃度を約250mOsmないし約320mOsm、好ま
しくは約287mOsmないし297mOsm、より好ましくは約292
±5mOsmとして処方することができる。上述のpH及び浸
透圧モル濃度範囲を有する試薬溶液において、ＲＮＡの
染色に必要なカチオン性染料（例えばオキサジン750）
の濃度は、約6ないし約20μg／ml、好ましくは約6.5μg
／mlないし約19.5μg／ml、より好ましくは約9.0μg／m
lないし約10.5μg／mlの範囲にある。バッファによって
高められた浸透力により、約20ないし30秒未満での網状
赤血球中のＲＮＡの染料染色が生じる。この方法の試薬
中の染料の濃度は成熟赤血球の非網状赤血球染色を最小
に止め、これがノイズバックグラウンドからの良好な信
号の分離をもたらす。試薬の条件を最適化することによ
るこのような迅速な染色は、試薬中の血液試料を試料の
分析を行う前に20秒を超えてインキュベートすることを
不要にし、この方法を完全に自動化された血液学的方法
に対して非常に有利で、許容可能で、かつ適合するもの
とする。
pHを約7.2ないし約7.8に維持し、好ましいpH値は7.4
で、浸透圧モル濃度を約250mOsmないし約320mOsm、好ま
しくは約287mOsmないし297mOsm、より好ましくは約292
±5mOsmとして処方することができる。上述のpH及び浸
透圧モル濃度範囲を有する試薬溶液において、ＲＮＡの
染色に必要なカチオン性染料（例えばオキサジン750）
の濃度は、約6ないし約20μg／ml、好ましくは約6.5μg
／mlないし約19.5μg／ml、より好ましくは約9.0μg／m
lないし約10.5μg／mlの範囲にある。バッファによって
高められた浸透力により、約20ないし30秒未満での網状
赤血球中のＲＮＡの染料染色が生じる。この方法の試薬
中の染料の濃度は成熟赤血球の非網状赤血球染色を最小
に止め、これがノイズバックグラウンドからの良好な信
号の分離をもたらす。試薬の条件を最適化することによ
るこのような迅速な染色は、試薬中の血液試料を試料の
分析を行う前に20秒を超えてインキュベートすることを
不要にし、この方法を完全に自動化された血液学的方法
に対して非常に有利で、許容可能で、かつ適合するもの
とする。
【００５２】この方法及び試薬は、散乱／吸収フローサ
イトメトリーの技術を用いる全血試料中の網状赤血球の
同定及び識別に用いることができる。この方法は、その
広範な用途において、全血のアリコートをこの方法にお
ける使用について説明される試薬組成物に添加すること
を包含する。混合後約20秒未満のインキュベーション時
間で、試料／試薬混合物はフローサイトメトリーの特定
の検知領域を一度に細胞1個づつ通過する。水力学的合
焦によって1個の細胞が検知区域を通過し、そこで適切
な照射波長を有する焦点が合わせられた光源によりそれ
らが照射される。これらの細胞に対して少なくとも2つ
の散乱光信号及び少なくとも1つの吸収信号が細胞−細
胞基準で測定される。これらの測定から、網状赤血球を
赤血球と区別することができる。本発明によると、血小
板が試料中の網状赤血球及び赤血球から、それらの信号
をより大きくより屈折率の高い赤血球の信号から分離す
る大きさ及び屈折率によって区別される。
イトメトリーの技術を用いる全血試料中の網状赤血球の
同定及び識別に用いることができる。この方法は、その
広範な用途において、全血のアリコートをこの方法にお
ける使用について説明される試薬組成物に添加すること
を包含する。混合後約20秒未満のインキュベーション時
間で、試料／試薬混合物はフローサイトメトリーの特定
の検知領域を一度に細胞1個づつ通過する。水力学的合
焦によって1個の細胞が検知区域を通過し、そこで適切
な照射波長を有する焦点が合わせられた光源によりそれ
らが照射される。これらの細胞に対して少なくとも2つ
の散乱光信号及び少なくとも1つの吸収信号が細胞−細
胞基準で測定される。これらの測定から、網状赤血球を
赤血球と区別することができる。本発明によると、血小
板が試料中の網状赤血球及び赤血球から、それらの信号
をより大きくより屈折率の高い赤血球の信号から分離す
る大きさ及び屈折率によって区別される。
【００５３】反応混合物（全血試料及び試薬組成物／溶
液を含む）がフローサイトメトリーの検知領域を通過す
ると、赤血球を網状赤血球から識別し、各網状赤血球又
は赤血球の容積及びヘモグロビン濃度を決定することが
できるように、各々の細胞によって2つの角度の間隔を
通して散乱され、かつ吸収された光が測定される。血小
板は、散乱／散乱／吸収「空間」の異なる領域を占め、
この領域の信号が血小板として数えられる。網状赤血球
及び赤血球の数、並びに網状赤血球又は赤血球のヘモグ
ロビン含量、平均細胞容積、平均小体ヘモグロビン濃
度、及び平均細胞ヘモグロビンは、測定された細胞−細
胞基準の容積及びヘモグロビン濃度から算出する。
液を含む）がフローサイトメトリーの検知領域を通過す
ると、赤血球を網状赤血球から識別し、各網状赤血球又
は赤血球の容積及びヘモグロビン濃度を決定することが
できるように、各々の細胞によって2つの角度の間隔を
通して散乱され、かつ吸収された光が測定される。血小
板は、散乱／散乱／吸収「空間」の異なる領域を占め、
この領域の信号が血小板として数えられる。網状赤血球
及び赤血球の数、並びに網状赤血球又は赤血球のヘモグ
ロビン含量、平均細胞容積、平均小体ヘモグロビン濃
度、及び平均細胞ヘモグロビンは、測定された細胞−細
胞基準の容積及びヘモグロビン濃度から算出する。
【００５４】より詳細には、この方法を実施するため、
全血の2μlのアリコートを自動化血液分析器機、例え
ば、分析ソフトウェアに修正を加えたテクニコンH・3ヘ
マトロジー・システムによって吸引した。この修正に
は、既に約5−90分のオフライン（システム外）での反
応が行われている希釈試料の吸引ではなく、引き続いて
システム内で試薬と混合される全血の吸引が含まれる。
また、この修正された分析により、単に網状赤血球のパ
ーセントだけではなく、それに加えて絶対的な赤血球及
び網状赤血球の総数が得られた。さらに、本発明による
方法により、血小板の総数、平均血小板容積の値及び血
小板容積ヒストグラムが得られた。これらのパラメータ
は、H・3ヘマトロトジー・システムの網状赤血球チャン
ネルでは得られない。
全血の2μlのアリコートを自動化血液分析器機、例え
ば、分析ソフトウェアに修正を加えたテクニコンH・3ヘ
マトロジー・システムによって吸引した。この修正に
は、既に約5−90分のオフライン（システム外）での反
応が行われている希釈試料の吸引ではなく、引き続いて
システム内で試薬と混合される全血の吸引が含まれる。
また、この修正された分析により、単に網状赤血球のパ
ーセントだけではなく、それに加えて絶対的な赤血球及
び網状赤血球の総数が得られた。さらに、本発明による
方法により、血小板の総数、平均血小板容積の値及び血
小板容積ヒストグラムが得られた。これらのパラメータ
は、H・3ヘマトロトジー・システムの網状赤血球チャン
ネルでは得られない。
【００５５】本発明に従い、試料のアリコートを本発明
の試薬組成物と自動的に混合させ、約20秒間放置した。
その後、混合した試料をフローセルを通過させ、次いで
赤血球、網状赤血球及び血小板の分析のためにヘリウム
−ネオンレーザー源又はレーザーダイオード源のいずれ
かに露出させた。したがって、本発明は、以下に実施例
において説明される方法及び試薬を包含し、本発明の範
囲は特許請求の範囲に示されている。
の試薬組成物と自動的に混合させ、約20秒間放置した。
その後、混合した試料をフローセルを通過させ、次いで
赤血球、網状赤血球及び血小板の分析のためにヘリウム
−ネオンレーザー源又はレーザーダイオード源のいずれ
かに露出させた。したがって、本発明は、以下に実施例
において説明される方法及び試薬を包含し、本発明の範
囲は特許請求の範囲に示されている。
【００５６】
【発明の実施の形態】以下の実施例は、吸収／散乱フロ
ーサイトメトリー技術を用いて網状赤血球、赤血球及び
血小板を同定し、かつ網状赤血球及び赤血球を特徴付け
るための方法及びそこで用いられる試薬組成物を説明す
る。可能である場合には、標準的な市販の試薬級の材料
を用いた。実施例1 本発明の方法及び試薬組成物を用いた全血試料中の網状
赤血球及び赤血球を区別するための迅速な自動化散乱及
び吸収測定 オキサジン750染料を2.96 mg／ml N，N−ジメチルホル
ムアミドストック溶液中で保存した。この染料ストック
を、好ましい成分を表2に示される好ましい濃度で含む
緩衝液に添加することにより、作業試薬を作製した。こ
の研究において用いた作業試薬の最終浸透圧モル濃度及
びpHは、それぞれ、292 mmol／kg及び7.4であった。
ーサイトメトリー技術を用いて網状赤血球、赤血球及び
血小板を同定し、かつ網状赤血球及び赤血球を特徴付け
るための方法及びそこで用いられる試薬組成物を説明す
る。可能である場合には、標準的な市販の試薬級の材料
を用いた。実施例1 本発明の方法及び試薬組成物を用いた全血試料中の網状
赤血球及び赤血球を区別するための迅速な自動化散乱及
び吸収測定 オキサジン750染料を2.96 mg／ml N，N−ジメチルホル
ムアミドストック溶液中で保存した。この染料ストック
を、好ましい成分を表2に示される好ましい濃度で含む
緩衝液に添加することにより、作業試薬を作製した。こ
の研究において用いた作業試薬の最終浸透圧モル濃度及
びpHは、それぞれ、292 mmol／kg及び7.4であった。
【００５７】この例においては、試料の各々について、
自動化システムによって吸引された2μlの全血を625μl
の表2の試薬組成物と室温で20秒間混合し、次いでこの
混合物中の細胞を本明細書に説明されるフローサイトメ
トリーによって分析した。10名の正常ドナーの血液試料
（「正常」）及び10名の無作為に選択された院内患者の
血液試料（「異常」）を、本発明の方法及び手を使う方
法により、網状赤血球のパーセントについて分析した。
各試料は自動化機器によって2回分析した（n＝40）。そ
れらの結果を図3にグラフで示す。図3に示されるよう
に、平均網状赤血球パーセンテージは自動化方法では1.
8であったのに対して、手操作の方法では1.7であった。
相関係数は0.87であった。これらの平均の差が小さく、
かつ相関係数が高いことは、この20秒自動化方法によ
り、正常及び異常試料集団の両者に対して、正確な網状
赤血球パーセンテージの値が得られることを示す。
自動化システムによって吸引された2μlの全血を625μl
の表2の試薬組成物と室温で20秒間混合し、次いでこの
混合物中の細胞を本明細書に説明されるフローサイトメ
トリーによって分析した。10名の正常ドナーの血液試料
（「正常」）及び10名の無作為に選択された院内患者の
血液試料（「異常」）を、本発明の方法及び手を使う方
法により、網状赤血球のパーセントについて分析した。
各試料は自動化機器によって2回分析した（n＝40）。そ
れらの結果を図3にグラフで示す。図3に示されるよう
に、平均網状赤血球パーセンテージは自動化方法では1.
8であったのに対して、手操作の方法では1.7であった。
相関係数は0.87であった。これらの平均の差が小さく、
かつ相関係数が高いことは、この20秒自動化方法によ
り、正常及び異常試料集団の両者に対して、正確な網状
赤血球パーセンテージの値が得られることを示す。
【００５８】分析が完了したとき、その生データは赤散
乱対赤吸収細胞所見、例えば図1A及び1B、の形態で表示
された。異なる細胞集団が、それらに特有の散乱及び吸
収信号に基づいて明瞭に観察された。これらの細胞所見
プロットにおいて、赤血球集団は図1Aに「RBCs」と表示
される領域内に入る。これらの細胞は高散乱信号及び低
細胞吸収信号を示す。網状赤血球集団は、「L」、「M」
及び「H」と表示される領域を含む「retics」と表示さ
れる領域内に入る。これらの細胞は、それらのオキサジ
ン750染色ＲＮＡからのより大きい吸収信号により、成
熟赤血球と区別することができる。血小板集団は「PLT
s」と表示される領域に入り、同時発生信号は適切に表
示される領域に入る。血小板は、網状赤血球と比較した
場合、散乱信号が相対的に小さい。
乱対赤吸収細胞所見、例えば図1A及び1B、の形態で表示
された。異なる細胞集団が、それらに特有の散乱及び吸
収信号に基づいて明瞭に観察された。これらの細胞所見
プロットにおいて、赤血球集団は図1Aに「RBCs」と表示
される領域内に入る。これらの細胞は高散乱信号及び低
細胞吸収信号を示す。網状赤血球集団は、「L」、「M」
及び「H」と表示される領域を含む「retics」と表示さ
れる領域内に入る。これらの細胞は、それらのオキサジ
ン750染色ＲＮＡからのより大きい吸収信号により、成
熟赤血球と区別することができる。血小板集団は「PLT
s」と表示される領域に入り、同時発生信号は適切に表
示される領域に入る。血小板は、網状赤血球と比較した
場合、散乱信号が相対的に小さい。
【００５９】成熟赤血球と網状赤血球との吸収分離に基
づき、網状赤血球及び赤血球を同定する散乱光及び吸収
の範囲を決める電気的な「窓」を作製することにより、
患者の試料の網状赤血球の総数を決定することができ
る。各々の「窓」の中に入る網状赤血球、成熟赤血球及
び血小板の数を決定した後、総細胞集団中に存在する網
状赤血球、赤血球及び血小板のパーセンテージを算出す
る。その自動化機器に伴う既知の希釈因子に基づいて、
絶対的な赤血球総数、網状赤血球総数及び血小板総数も
決定する。
づき、網状赤血球及び赤血球を同定する散乱光及び吸収
の範囲を決める電気的な「窓」を作製することにより、
患者の試料の網状赤血球の総数を決定することができ
る。各々の「窓」の中に入る網状赤血球、成熟赤血球及
び血小板の数を決定した後、総細胞集団中に存在する網
状赤血球、赤血球及び血小板のパーセンテージを算出す
る。その自動化機器に伴う既知の希釈因子に基づいて、
絶対的な赤血球総数、網状赤血球総数及び血小板総数も
決定する。
【００６０】臨床試験規格国立委員会（National Commi
ttee for Clinical Laboratory Standards）（NCCLS）
によって推奨される手操作による顕微鏡法を用いて、各
試料中の網状赤血球の参照パーセンテージを測定した。
この方法においては、小容積、例えば100μlの全血を等
容積のニューメチレンブルー染料と混合し、室温で約15
分間反応させた。次いで、この混合物を顕微鏡スライド
に塗抹の形態で塗布し、試料中の網状赤血球のパーセン
テージを顕微鏡を用いて可視化することにより計数し
た。顕微鏡には100×油浸対物レンズ及び10×接眼レン
ズを装着した。計数精度を改善するために顕微鏡の接眼
レンズに挿入されたミラー（Miller）ディスクを用い
て、各試料について最小で1000細胞を数えた。染色の後
に2つ以上の青色物質の粒子を有するあらゆる赤血球を
網状赤血球に分類した。
ttee for Clinical Laboratory Standards）（NCCLS）
によって推奨される手操作による顕微鏡法を用いて、各
試料中の網状赤血球の参照パーセンテージを測定した。
この方法においては、小容積、例えば100μlの全血を等
容積のニューメチレンブルー染料と混合し、室温で約15
分間反応させた。次いで、この混合物を顕微鏡スライド
に塗抹の形態で塗布し、試料中の網状赤血球のパーセン
テージを顕微鏡を用いて可視化することにより計数し
た。顕微鏡には100×油浸対物レンズ及び10×接眼レン
ズを装着した。計数精度を改善するために顕微鏡の接眼
レンズに挿入されたミラー（Miller）ディスクを用い
て、各試料について最小で1000細胞を数えた。染色の後
に2つ以上の青色物質の粒子を有するあらゆる赤血球を
網状赤血球に分類した。
【００６１】実施例2 本発明による方法から得られる赤血球及び血小板の決定 本発明の迅速な自動化方法が、網状赤血球の総数に加え
て赤血球及び血小板の正確な総数を提供することを示す
ため、実験を行った。10の新鮮な試料（すなわち、採取
の後約8時間未満に用いられた試料）を正常ドナーから
採取し、本発明の新規方法及び標準血液分析器、例え
ば、ベイヤー（BAYER）H・3TMヘマトロジー・アナライ
ザーの両者によって分析した。各々の血液試料は、各方
法について合計20回の吸引を2回繰り返して実行した。
これらの分析の結果を図4A及び4Bに示す。これらの結果
は、新規の迅速な方法によって得られた総数が標準法を
用いて得られたものと高度に相関することを示す。
て赤血球及び血小板の正確な総数を提供することを示す
ため、実験を行った。10の新鮮な試料（すなわち、採取
の後約8時間未満に用いられた試料）を正常ドナーから
採取し、本発明の新規方法及び標準血液分析器、例え
ば、ベイヤー（BAYER）H・3TMヘマトロジー・アナライ
ザーの両者によって分析した。各々の血液試料は、各方
法について合計20回の吸引を2回繰り返して実行した。
これらの分析の結果を図4A及び4Bに示す。これらの結果
は、新規の迅速な方法によって得られた総数が標準法を
用いて得られたものと高度に相関することを示す。
【００６２】実施例3 擬似吸収の吸収データの相関 検出光学サブシステムは、フローセル内でレーザービー
ムを通過する細胞からの散乱光及び非散乱光の両者を集
める。細胞は光を全方位に散乱させる。G. Colellaらの
米国特許5,350,695号及び5,438,003号に記載の光学シス
テムにおける比較的開口数（NA）の高いレンズは、光軸
に中心を置き19.5°までの半角を有する円錐体内に入る
散乱された光を受容する。したがって、19.5°を上回る
角度で散乱する光は失われる。その結果、細胞の吸収を
測定しようと試みる際、全く吸収しない細胞が入射光を
数パーセントまで吸収するように「見え」、すなわち、
擬似吸収が生じる。測定された吸収は以下のように表す
ことができる。 吸収信号＝擬似吸収＋ヘモグロビン吸収＋染料吸収
ムを通過する細胞からの散乱光及び非散乱光の両者を集
める。細胞は光を全方位に散乱させる。G. Colellaらの
米国特許5,350,695号及び5,438,003号に記載の光学シス
テムにおける比較的開口数（NA）の高いレンズは、光軸
に中心を置き19.5°までの半角を有する円錐体内に入る
散乱された光を受容する。したがって、19.5°を上回る
角度で散乱する光は失われる。その結果、細胞の吸収を
測定しようと試みる際、全く吸収しない細胞が入射光を
数パーセントまで吸収するように「見え」、すなわち、
擬似吸収が生じる。測定された吸収は以下のように表す
ことができる。 吸収信号＝擬似吸収＋ヘモグロビン吸収＋染料吸収
【００６３】成熟赤血球の擬似吸収信号は、典型的に
は、染色網状赤血球からの実際の吸収信号と同じ強度の
ものである。これは、吸収細胞所見上での染色されてい
ない赤血球からの染色網状赤血球の分離の程度を低下さ
せる。吸収チャンネルの信号対ノイズ比は、信号を補正
して赤血球及び網状赤血球の吸収信号の各々から擬似吸
収及びヘモグロビン吸収成分を除去することにより改善
することができる。擬似吸収及びヘモグロビン吸収の量
は、前述のTycko特許に記述される公知のミー光散乱理
論を用いることにより、あらゆる所定の細胞について算
出することができる。19.5°ないし180°の角度の間隔
及びヘモグロビン吸収成分についての散乱断面Ｓ3は、
以下のように算出することができる。 Ｓ3＝πａ2Ｑext−Ｓ（λ、ｎs、Θ3、ΔΘ3；V、HC） ここで、ａは球状化細胞の半径、λは励起（もしくは照
射）波長、ｎsは試料の流れ及び鞘の屈折率、Ｑextは細
胞の吸光効率、並びに、擬似吸収の場合については、Θ
3＝0°、ΔΘ3＝19.5°である。Ｓ3の値はV及びHCの予
想される全ての値について表になっている。
は、染色網状赤血球からの実際の吸収信号と同じ強度の
ものである。これは、吸収細胞所見上での染色されてい
ない赤血球からの染色網状赤血球の分離の程度を低下さ
せる。吸収チャンネルの信号対ノイズ比は、信号を補正
して赤血球及び網状赤血球の吸収信号の各々から擬似吸
収及びヘモグロビン吸収成分を除去することにより改善
することができる。擬似吸収及びヘモグロビン吸収の量
は、前述のTycko特許に記述される公知のミー光散乱理
論を用いることにより、あらゆる所定の細胞について算
出することができる。19.5°ないし180°の角度の間隔
及びヘモグロビン吸収成分についての散乱断面Ｓ3は、
以下のように算出することができる。 Ｓ3＝πａ2Ｑext−Ｓ（λ、ｎs、Θ3、ΔΘ3；V、HC） ここで、ａは球状化細胞の半径、λは励起（もしくは照
射）波長、ｎsは試料の流れ及び鞘の屈折率、Ｑextは細
胞の吸光効率、並びに、擬似吸収の場合については、Θ
3＝0°、ΔΘ3＝19.5°である。Ｓ3の値はV及びHCの予
想される全ての値について表になっている。
【００６４】擬似吸収の補正は次のように行う。まず、
Tyckoに記述されるように、散乱−散乱細胞所見から、
細胞に由来する2つの散乱信号からV及びHCを決定しなけ
ればならない。次に、検索表エントリの中に測定された
V及びHCのＳ3を見出し、これを吸収チャンネルによって
測定された値から差し引く。その結果が細胞の染色によ
る実際の吸収である。測定された吸収信号を以下の関係
を用いて調整し、各細胞に対して染料吸収だけを残すこ
とができる。 染料吸収＝吸収信号−ヘモグロビン吸収−擬似吸収 ＝吸収信号−Ｓ3
Tyckoに記述されるように、散乱−散乱細胞所見から、
細胞に由来する2つの散乱信号からV及びHCを決定しなけ
ればならない。次に、検索表エントリの中に測定された
V及びHCのＳ3を見出し、これを吸収チャンネルによって
測定された値から差し引く。その結果が細胞の染色によ
る実際の吸収である。測定された吸収信号を以下の関係
を用いて調整し、各細胞に対して染料吸収だけを残すこ
とができる。 染料吸収＝吸収信号−ヘモグロビン吸収−擬似吸収 ＝吸収信号−Ｓ3
【００６５】閾値を決定し、フラグを立てる前に、全て
のデータに対して、調整された値を生データのパラメー
タと置き換える。赤散乱パラメータがV−HCマップに現
われない対象は、いかなるものでもデータ分析スキーム
では無視する。次に、これらのデータを、正しい値を反
映する赤散乱対吸収細胞所見で再表示する。上述の説明
を考慮して、本発明の目的の幾つかが達成され、かつ他
の有利な結果が得られることが分かる。
のデータに対して、調整された値を生データのパラメー
タと置き換える。赤散乱パラメータがV−HCマップに現
われない対象は、いかなるものでもデータ分析スキーム
では無視する。次に、これらのデータを、正しい値を反
映する赤散乱対吸収細胞所見で再表示する。上述の説明
を考慮して、本発明の目的の幾つかが達成され、かつ他
の有利な結果が得られることが分かる。
【００６６】本発明の範囲から逸脱することなく上述の
構成及び方法に様々な改変を加えることができるため、
上記説明に含まれる、又は添付の図面に示される全ての
事項は、説明のためのものであると解釈され、限定を意
味するものとは解釈されないことが意図されている。例
えば、分画された血液試料を同様の方法で処理すること
ができる。本明細書で引用される全ての特許出願、発行
された特許、論文、参考文献、テキスト等の内容は、本
発明が属する技術の現状をより完全に説明するため、引
用することによりその全体が本明細書に組込まれる。
構成及び方法に様々な改変を加えることができるため、
上記説明に含まれる、又は添付の図面に示される全ての
事項は、説明のためのものであると解釈され、限定を意
味するものとは解釈されないことが意図されている。例
えば、分画された血液試料を同様の方法で処理すること
ができる。本明細書で引用される全ての特許出願、発行
された特許、論文、参考文献、テキスト等の内容は、本
発明が属する技術の現状をより完全に説明するため、引
用することによりその全体が本明細書に組込まれる。
【図１】 図1A−1Bは本発明に従って行った場合の散乱
／吸収フローサイトメトリー分析の結果を示す。図1A及
び1Bは、全血試料の分析に関連する散乱対吸収のパター
ンを提示する細胞所見を表す。様々な細胞型と一致する
細胞所見領域及びレポートスクリーン区域が図1Aに明確
に同定されている。これらの領域には赤血球（RBC）、
網状赤血球（retic）、血小板（PLT）及び同時発生信号
が含まれる。同時発生信号は計数領域に一度に2個以上
の粒子が存在することの結果として生じる。図1Aは正常
血液試料を表し、図1Bは異常な血液試料を表す。
／吸収フローサイトメトリー分析の結果を示す。図1A及
び1Bは、全血試料の分析に関連する散乱対吸収のパター
ンを提示する細胞所見を表す。様々な細胞型と一致する
細胞所見領域及びレポートスクリーン区域が図1Aに明確
に同定されている。これらの領域には赤血球（RBC）、
網状赤血球（retic）、血小板（PLT）及び同時発生信号
が含まれる。同時発生信号は計数領域に一度に2個以上
の粒子が存在することの結果として生じる。図1Aは正常
血液試料を表し、図1Bは異常な血液試料を表す。
【図２】 図2A−2Bは本発明に従って行なった場合の散
乱／吸収フローサイトメトリーにおける試料中の血小板
容積の分布を示すヒストグラムを表す。
乱／吸収フローサイトメトリーにおける試料中の血小板
容積の分布を示すヒストグラムを表す。
【図３】 本明細書の表1に示される試薬処方においてN
aN3を用い、本発明に従って分析した正常血液試料につ
いての典型的な結果を示す散乱／吸収細胞所見を示す。
細胞所見の記述子は図1A及び1B並びに下記に説明される
通りである。
aN3を用い、本発明に従って分析した正常血液試料につ
いての典型的な結果を示す散乱／吸収細胞所見を示す。
細胞所見の記述子は図1A及び1B並びに下記に説明される
通りである。
【図４】 散乱／吸収フローサイトメトリーを用いる網
状赤血球の測定の実施に本発明の迅速自動化方法及び組
成物並びに全血試料分析の手動法を用いる比較研究の高
い相関性のある結果を示す。最小二乗等式及び相関係数
（ｒ）がグラフ上に提示されている。
状赤血球の測定の実施に本発明の迅速自動化方法及び組
成物並びに全血試料分析の手動法を用いる比較研究の高
い相関性のある結果を示す。最小二乗等式及び相関係数
（ｒ）がグラフ上に提示されている。
【図５】 図5A及び5Bは、本明細書に説明される迅速自
動化法を用いる赤血球（5A）及び血小板（5B）測定の結
果を示す。図5Aは、本発明による方法及び標準的な自動
化法、例えば、ベイヤーH・3TM血液分析器を用いる赤血
球総数の比較を示す。図5Bは、本発明の迅速自動化法と
標準的な自動化法とを用いて得られた血小板総数の比較
を示す。図5A及び5Bについては、各方法において10の正
常試料を2回実行した。最小二乗等式及び相関係数
（ｒ）がグラフ上に提示されている。
動化法を用いる赤血球（5A）及び血小板（5B）測定の結
果を示す。図5Aは、本発明による方法及び標準的な自動
化法、例えば、ベイヤーH・3TM血液分析器を用いる赤血
球総数の比較を示す。図5Bは、本発明の迅速自動化法と
標準的な自動化法とを用いて得られた血小板総数の比較
を示す。図5A及び5Bについては、各方法において10の正
常試料を2回実行した。最小二乗等式及び相関係数
（ｒ）がグラフ上に提示されている。
フロントページの続き (72)発明者 マーティン、ソレット アメリカ合衆国マサチューシッツ州02115、 ブライトン、カマンウエルス・アヴィニュ ー 1750番
Claims (43)
- 【請求項１】 自動化血液分析器を用いる光散乱及び吸
収フローサイトメトリーによって全血試料中の網状赤血
球、赤血球及び血小板を同定し、定量し、かつ他の細胞
のサブクラスと区別する、血液試料を分析するための迅
速な方法であって、 （ａ）該血液試料のアリコートを、約6ないし約20μg／
mlの量のカチオン性 染料；約4.0ないし約148.0μg／mlの量の球状化剤とし
ての両性イオン性界面 活性剤；該組成物のpHを約7.2ないし7.8に維持するため
の緩衝剤を含有する溶液を含む水性試薬組成物と共に含
む反応混合物を調製する工程であって、該試薬混合物中
の該試薬組成物及び該血液試料アリコートを、該自動化
分析器で該試料分析が行われる前に約20秒を超えて予備
インキュベートすることがなく、又は互いに反応させる
ことがない工程； （ｂ）工程（ａ）の該混合物を、実質的に一度に細胞1
個づつ、焦点が合わせられた光学的照射の領域を通過さ
せる工程； （ｃ）細胞の各々によって2つの角度の間隔内に散乱さ
れた光及び吸収された光を検出して測定する工程；及び （ｄ）該散乱及び吸収光の測定強度に少なくとも部分的
に基づいて、該網状赤血球、赤血球及び血小板サブクラ
スを識別し、かつそれらの細胞総数を得る工程、を包含
し、該血液試料が約20ないし30秒で分析される方法。 - 【請求項２】 前記カチオン性染料が約9μg／mlないし
約10.5μg／mlの量で工程ａ）の前記試薬組成物中に存
在する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記カチオン性染料が下記式を有するオ
キサジン750である、請求項１に記載の方法。 【化１】 - 【請求項４】 工程a）の前記試薬組成物のpHが約7.3な
いし約7.5である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項５】 前記試薬組成物のpHが7.35ないし7.4で
ある、請求項4に記載の方法。 - 【請求項６】 工程ａ）の前記試薬組成物中の前記両性
イオン性界面活性球状化剤がラウラミドプロピルベタイ
ン、Ｎ−テトラデシル−N，N−ジメチル−3−アンモニ
オ−1−プロパンスルホネート、N−ドデシル−N，N−ジ
メチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネート、コ
コアミドプロピルベタイン及びココアミドスルホベタイ
ンからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。 - 【請求項７】 前記界面活性剤がＮ−テトラデシル−
N，N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネ
ートである、請求項６に記載の方法。 - 【請求項８】 前記界面活性剤が約4.0ないし約11.0μg
／mlの量で前記試薬組成物中に存在する、請求項７に記
載の方法。 - 【請求項９】 工程ａ）の前記試薬組成物がアルカリ金
属塩をさらに含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１０】 工程ａ）の前記試薬組成物が塩化ナト
リウム又は塩化カリウムをさらに含む、請求項９に記載
の方法。 - 【請求項１１】 工程ａ）の前記試薬組成物が坑菌化合
物をさらに含む、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１２】 前記坑菌化合物が2−メチル−4−イソ
チアゾリン−3−オン（プロクリン150）；5−クロロ−2
−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン（プロクリン30
0）；N，N’−メチレンビス［N’−（1−ヒドロキシメ
チル）−2，5−ジオキソ−4−イミダゾリジニル］尿素
（ジャーマル115）；1−（3−クロロアリル）−3，5，7
−トリアザ−1−アゾニアアダマンタン塩化物（ドワシ
ル200）；及び2−ブロモ−2−ニトロプロパン−1，3−
ジオール（C3H6BrNO4）（ブロノポル）からなる群より
選択される、請求項１１に記載の方法。 - 【請求項１３】 工程ａ）の試薬組成物の浸透圧モル濃
度が約250ないし300ミリオスモルである、請求項１に記
載の方法。 - 【請求項１４】 工程ａ）の試薬組成物の浸透圧モル濃
度が約287ないし297ミリオスモルである、請求項１３に
記載の方法。 - 【請求項１５】 工程ａ）の試薬組成物の浸透圧モル濃
度が約292±5ミリオスモルである、請求項１４に記載の
方法。 - 【請求項１６】 前記試料を約20秒で分析する、請求項
１に記載の方法。 - 【請求項１７】 前記検出及び測定工程（ｃ）が開口を
有する収集光学系による前記散乱光及び吸収光の収集を
包含し、かつ工程（ｄ）が、収集光学系の開口の外部に
散乱される光による擬似吸収成分を除去するための、擬
似吸収成分を含む吸収信号の強度の補正を包含する、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項１８】 前記細胞のサブクラスが赤血球であ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項１９】 前記細胞のサブクラスが網状赤血球で
ある、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２０】 前記細胞のサブクラスが血小板であ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項２１】 請求項１に記載の方法であって、さら
に以下の工程：（ｅ）前記網状赤血球又は赤血球の数、
容積、ヘモグロビン濃度、及びＲＮＡ濃度を、前記散乱
光及び吸収光の強度に基づいて決定する工程、を包含す
る方法。 - 【請求項２２】 工程（ｂ）における前記光学的照射が
スペクトルの赤色領域に励起波長を有する、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項２３】 工程ａ）の前記試薬組成物が少なくと
も１種の求核試薬をさらに含む、請求項１に記載の方
法。 - 【請求項２４】 前記求核試薬がアジド（N3 -）又はシ
アネート（OCN-）イオンである、請求項２３に記載の方
法。 - 【請求項２５】 前記求核試薬が約20mMの濃度で前記試
薬組成物中に存在する、請求項２３に記載の方法。 - 【請求項２６】 工程ｃ）において、2つの角度の間隔
がそれぞれ1°ないし3°及び4°ないし20°である、請
求項１に記載の方法。 - 【請求項２７】 工程ｃ）において、2つの角度の間隔
がそれぞれ2°ないし3°及び5 °ないし15°である、請
求項26に記載の方法。 - 【請求項２８】 自動化血液分析器により約30秒未満で
全血試料中の網状赤血球、赤血球及び血小板を迅速に同
定及び特徴付けるための試薬組成物であって、水性混合
物中に、約６μg／mlないし約20μg／mlの量のカチオン
性染料；約4μg／mlないし約148μg／mlの量の球状化剤
としての両性イオン性界面活性剤；該組成物のpHを約7.
2ないし7.8に及び浸透圧モル濃度を約250mOsmないし約3
00mOsmに維持するための緩衝剤を含有する試薬組成物。 - 【請求項２９】 前記カチオン性染料が下記式を有する
オキサジン750である、請求項２８に記載の試薬組成
物。 【化２】 - 【請求項３０】 前記カチオン性染料が約9.0ないし約1
0.5μg／mlの濃度で前記組成物中に存在する、請求項２
８に記載の試薬組成物。 - 【請求項３１】 前記両性イオン性界面活性球状化剤が
ラウラミドプロピルベタイン、Ｎ−テトラデシル−N，N
−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロパンスルホネー
ト、N−ドデシル−N，N−ジメチル−3−アンモニオ−1
−プロパンスルホネート、ココアミドプロピルベタイン
及びココアミドスルホベタインからなる群より選択され
る、請求項２８に記載の試薬組成物。 - 【請求項３２】 前記両性イオン性界面活性剤がＮ−テ
トラデシル−N，N−ジメチル−3−アンモニオ−1−プロ
パンスルホネートである、請求項３１に記載の試薬組成
物。 - 【請求項３３】 前記界面活性剤が約4.0ないし約11.0
μg／mlの量で試薬組成物中に存在する、請求項２８に
記載の試薬組成物。 - 【請求項３４】 アルカリ金属塩をさらに含む、請求項
２８に記載の試薬組成物。 - 【請求項３５】 前記アルカリ金属塩が塩化ナトリウム
又は塩化カリウムである、請求項３４に記載の試薬組成
物。 - 【請求項３６】 坑菌化合物をさらに含む、請求項２８
に記載の試薬組成物。 - 【請求項３７】 前記坑菌化合物が2−メチル−4−イソ
チアゾリン−3−オン（プロクリン150）；5−クロロ−2
−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン（プロクリン30
0）；N，N’−メチレンビス［N’−（1−ヒドロキシメ
チル）−2，5−ジオキソ−4−イミダゾリジニル］尿素
（ジャーマル115）；1−（3−クロロアリル）−3，5，7
−トリアザ−1−アゾニアアダマンタン塩化物（ドワシ
ル200）；及び2−ブロモ−2−ニトロプロパン−1，3−
ジオール（C3H6BrNO4）（ブロノポル）からなる群より
選択される、請求項３６に記載の試薬組成物。 - 【請求項３８】 前記pHが約7.3ないし7.5である、請求
項２８に記載の試薬組成物。 - 【請求項３９】 前記pHが7.35ないし7.4である、請求
項３８に記載の試薬組成物。 - 【請求項４０】 前記浸透圧モル濃度が約292±5ミリオ
スモルである、請求項２８に記載の試薬組成物。 - 【請求項４１】 少なくとも１種の求核試薬をさらに含
む、請求項２８に記載の試薬組成物。 - 【請求項４２】 前記求核試薬がアジド（N3 -）又はシ
アネート（OCN-）イオンである、請求項４１に記載の試
薬組成物。 - 【請求項４３】 前記求核試薬が約20mMの濃度で存在す
る、請求項４１に記載の試薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/833,033 US6114173A (en) | 1997-04-03 | 1997-04-03 | Fully automated method and reagent composition therefor for rapid identification and characterization of reticulocytes erythrocytes and platelets in whole blood |
| US08/833033 | 1997-04-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH10282094A true JPH10282094A (ja) | 1998-10-23 |
Family
ID=25263246
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10108718A Withdrawn JPH10282094A (ja) | 1997-04-03 | 1998-04-03 | 全血中の網状赤血球、赤血球及び血小板を迅速に同定及び特徴付けるための完全に自動化された方法及びそれらのための試薬組成物 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6114173A (ja) |
| EP (1) | EP0869347A3 (ja) |
| JP (1) | JPH10282094A (ja) |
| AU (1) | AU750108B2 (ja) |
| BR (1) | BR9806478A (ja) |
| CA (1) | CA2232163A1 (ja) |
| CZ (1) | CZ100098A3 (ja) |
| HU (1) | HUP9800761A3 (ja) |
| IL (1) | IL123717A (ja) |
| PL (1) | PL325686A1 (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008111718A (ja) * | 2006-10-30 | 2008-05-15 | Sysmex Corp | 血小板測定用試薬、血小板測定用試薬キット並びに血小板測定方法 |
| JP2009511861A (ja) * | 2005-09-24 | 2009-03-19 | ベックマン コールター， インコーポレイテッド | 鉄欠乏およびヘモクロマトーシスの検出法 |
| JP2009515194A (ja) * | 2005-11-09 | 2009-04-09 | ベックマン コールター， インコーポレイテッド | 血小板を赤血球と区別するための方法 |
| JP2009092678A (ja) * | 2009-02-04 | 2009-04-30 | Sysmex Corp | 試料分析装置、試料分析方法およびプログラム |
| JP2010500570A (ja) * | 2006-08-09 | 2010-01-07 | ベックマン コールター，インコーポレイティド | 細胞ヘモグロビンの測定方法 |
| JP2015194358A (ja) * | 2014-03-31 | 2015-11-05 | シスメックス株式会社 | 血液分析装置 |
| WO2024095648A1 (ja) * | 2022-11-04 | 2024-05-10 | 株式会社堀場製作所 | 測定方法、測定システムおよび検査用試薬キット |
Families Citing this family (32)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6060322A (en) * | 1998-10-20 | 2000-05-09 | Coulter International Corp. | Method for identification of reticulated cells |
| CA2367780A1 (en) * | 1999-03-31 | 2000-10-05 | Bayer Corporation | Single channel, single dilution detection method |
| JP3817091B2 (ja) * | 1999-07-02 | 2006-08-30 | テルモ株式会社 | 細胞数測定装置 |
| US6623972B2 (en) * | 2000-06-09 | 2003-09-23 | Bayer Corporation | Automated method for detecting, quantifying and monitoring exogenous hemoglobin in whole blood, plasma and serum |
| US20030027347A1 (en) * | 2001-05-25 | 2003-02-06 | Phyllis Shapiro | Automated method for correcting blood analysis parameter results affected by interference from exogenous blood substitutes in whole blood, plasma, and serum |
| US20100160445A1 (en) * | 2002-01-17 | 2010-06-24 | Carlson Paul E | Synergistic Mixtures of OPP and DGH |
| AU2003210557A1 (en) * | 2002-01-17 | 2003-09-02 | Verichem, Inc. | Synergistic mixtures of o-phenylphenol and other microbiocides |
| FR2840995B1 (fr) * | 2002-06-18 | 2004-09-03 | Hemosystem | Procede de denombrement de plaquettes en phase solide |
| US6916662B2 (en) * | 2003-01-31 | 2005-07-12 | Abbott Laboratories | Performance improvement for hematology analysis |
| AU2004243881B2 (en) * | 2003-05-27 | 2010-07-15 | Pointcare Technologies, Inc. | Enhanced cellular assay method for use in flow cytometry or similar instruments using optically resonant particles |
| WO2005017184A2 (en) | 2003-06-26 | 2005-02-24 | Litron Laboratories, Ltd. | Method for the enumeration of micronucleated erythrocyte populations while distinguishing platelets and/or platelet-associated aggregates |
| JP4417143B2 (ja) * | 2004-03-11 | 2010-02-17 | シスメックス株式会社 | 試料分析装置、プログラムおよびそのプログラムを記録した記録媒体 |
| US20080102526A1 (en) * | 2006-10-30 | 2008-05-01 | Sysmex Corporation | Reagent, reagent kit and analyzing method |
| CN101349644B (zh) * | 2007-07-20 | 2012-06-27 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 一种白细胞分类试剂和其使用方法 |
| US8102161B2 (en) * | 2007-09-25 | 2012-01-24 | Tdk Corporation | Stable output in a switching power supply by smoothing the output of the secondary coil |
| CN101475754A (zh) * | 2008-01-04 | 2009-07-08 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 不对称菁类荧光染料,组合物及在生物样品染色中的用途 |
| ES2535012T3 (es) * | 2008-02-18 | 2015-05-04 | Sysmex Corporation | Reactivo para la medición de plaquetas, kit de reactivos para la medición de plaquetas, y método de medición de plaquetas |
| CN101602762B (zh) * | 2008-06-10 | 2013-10-16 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 不对称菁类化合物、其制备方法及应用 |
| CN101726579B (zh) * | 2008-10-17 | 2014-06-18 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 血液检测试剂和方法 |
| US8367358B2 (en) * | 2008-12-17 | 2013-02-05 | Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd. | Reagent, kit and method for differentiating and counting leukocytes |
| WO2010126838A1 (en) | 2009-04-27 | 2010-11-04 | Abbott Laboratories | Method for discriminating red blood cells from white blood cells by using forward scattering from a laser in an automated hematology analyzer |
| CN101988082B (zh) * | 2009-07-31 | 2015-04-08 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 白细胞分类计数试剂、试剂盒及其制备方法和白细胞分类计数的方法 |
| US9280726B2 (en) | 2009-12-18 | 2016-03-08 | Fpinnovation | On-line macrocontaminant analyser and method |
| US8906308B2 (en) * | 2010-01-15 | 2014-12-09 | Abbott Laboratories | Method for determining volume and hemoglobin content of individual red blood cells |
| DE102011003101B4 (de) | 2010-12-23 | 2016-04-07 | Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh | Verfahren zum Nachweis einer Plasmodieninfektion |
| CN112485167A (zh) * | 2013-05-31 | 2021-03-12 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 粒子分析仪的光学系统 |
| WO2017192739A1 (en) * | 2016-05-04 | 2017-11-09 | LabThroughput LLC | System and method for distinguishing blood components |
| CN109682796A (zh) * | 2017-10-02 | 2019-04-26 | 爱科来株式会社 | 糖化蛋白质的测定 |
| CN111602052B (zh) | 2018-04-28 | 2021-10-12 | 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 | 一种血液检测方法及血液分析系统 |
| CN111044718B (zh) * | 2019-12-20 | 2022-05-17 | 北京指真生物科技有限公司 | 一种全血的免疫发光分析用稀释液及其分析方法 |
| CN111721950A (zh) * | 2020-05-29 | 2020-09-29 | 迪瑞医疗科技股份有限公司 | 一种稳定的有形成分分析聚焦液及其制备方法 |
| CN113654955A (zh) * | 2021-09-18 | 2021-11-16 | 迪瑞医疗科技股份有限公司 | 用于网织红细胞计数与分类及光学血小板计数的试剂盒 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3684377A (en) * | 1970-07-13 | 1972-08-15 | Bio Physics Systems Inc | Method for analysis of blood by optical analysis of living cells |
| US3883247A (en) * | 1973-10-30 | 1975-05-13 | Bio Physics Systems Inc | Method for fluorescence analysis of white blood cells |
| US4325706A (en) * | 1980-08-15 | 1982-04-20 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Automated detection of platelets and reticulocytes in whole blood |
| US4336029A (en) * | 1980-08-15 | 1982-06-22 | Ortho Diagnostic Systems Inc. | Method and reagents for quantitative determination of reticulocytes and platelets in whole blood |
| US4412004A (en) * | 1981-06-26 | 1983-10-25 | Technicon Instruments Corporation | Method for treating red blood cells to effect sphering and reagent therefor |
| US4735504A (en) * | 1983-10-31 | 1988-04-05 | Technicon Instruments Corporation | Method and apparatus for determining the volume & index of refraction of particles |
| US4575490A (en) * | 1984-02-29 | 1986-03-11 | Technicon Instruments Corporation | One step method for sphering and fixing whole blood erythrocytes |
| US4707451A (en) * | 1985-09-18 | 1987-11-17 | Becton, Dickinson And Company | Detection of reticulocytes |
| US4883867A (en) * | 1985-11-01 | 1989-11-28 | Becton, Dickinson And Company | Detection of reticulocytes, RNA or DNA |
| JP2549665B2 (ja) * | 1987-07-31 | 1996-10-30 | 東亜医用電子株式会社 | フロ−サイトメトリ用網状赤血球測定試薬 |
| JPH0746102B2 (ja) * | 1987-07-31 | 1995-05-17 | 東亜医用電子株式会社 | フロ−サイトメトリ用網状赤血球測定試薬 |
| US5075556A (en) * | 1989-12-01 | 1991-12-24 | Technicon Instruments Corporation | Acridine orange derivatives and their use in the quantitation of reticulocytes in whole blood |
| US5284771A (en) * | 1991-12-05 | 1994-02-08 | Miles Inc. | Reagent compositions and their use in sphering cells |
| US5360739A (en) * | 1991-12-05 | 1994-11-01 | Miles Inc. | Methods for the identification and characterization of reticulocytes in whole blood |
| US5350695A (en) * | 1991-12-05 | 1994-09-27 | Miles Inc. | Methods for the identification and characterization of reticulocytes in whole blood |
| US5631165A (en) * | 1994-08-01 | 1997-05-20 | Abbott Laboratories | Method for performing automated hematology and cytometry analysis |
| US5691204A (en) * | 1995-04-21 | 1997-11-25 | Abbott Laboratories | Compositions and methods for the rapid analysis of reticulocytes |
| US5830764A (en) * | 1996-11-12 | 1998-11-03 | Bayer Corporation | Methods and reagent compositions for the determination of membrane surface area and sphericity of erythrocytes and reticulocytes for the diagnosis of red blood cell disorders |
-
1997
- 1997-04-03 US US08/833,033 patent/US6114173A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-03-16 CA CA002232163A patent/CA2232163A1/en not_active Abandoned
- 1998-03-17 IL IL12371798A patent/IL123717A/xx active IP Right Grant
- 1998-03-19 AU AU59421/98A patent/AU750108B2/en not_active Ceased
- 1998-03-30 EP EP98105723A patent/EP0869347A3/en not_active Withdrawn
- 1998-04-02 HU HU9800761A patent/HUP9800761A3/hu unknown
- 1998-04-02 PL PL98325686A patent/PL325686A1/xx unknown
- 1998-04-02 CZ CZ981000A patent/CZ100098A3/cs unknown
- 1998-04-03 BR BR9806478-9A patent/BR9806478A/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-04-03 JP JP10108718A patent/JPH10282094A/ja not_active Withdrawn
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009511861A (ja) * | 2005-09-24 | 2009-03-19 | ベックマン コールター， インコーポレイテッド | 鉄欠乏およびヘモクロマトーシスの検出法 |
| JP4743723B2 (ja) * | 2005-09-24 | 2011-08-10 | ベックマン コールター， インコーポレイテッド | 鉄欠乏およびヘモクロマトーシスの検出法 |
| JP2009515194A (ja) * | 2005-11-09 | 2009-04-09 | ベックマン コールター， インコーポレイテッド | 血小板を赤血球と区別するための方法 |
| JP2010500570A (ja) * | 2006-08-09 | 2010-01-07 | ベックマン コールター，インコーポレイティド | 細胞ヘモグロビンの測定方法 |
| JP2008111718A (ja) * | 2006-10-30 | 2008-05-15 | Sysmex Corp | 血小板測定用試薬、血小板測定用試薬キット並びに血小板測定方法 |
| JP2009092678A (ja) * | 2009-02-04 | 2009-04-30 | Sysmex Corp | 試料分析装置、試料分析方法およびプログラム |
| JP2015194358A (ja) * | 2014-03-31 | 2015-11-05 | シスメックス株式会社 | 血液分析装置 |
| WO2024095648A1 (ja) * | 2022-11-04 | 2024-05-10 | 株式会社堀場製作所 | 測定方法、測定システムおよび検査用試薬キット |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU750108B2 (en) | 2002-07-11 |
| HU9800761D0 (en) | 1998-05-28 |
| PL325686A1 (en) | 1998-10-12 |
| EP0869347A3 (en) | 2000-02-23 |
| IL123717A (en) | 2000-02-17 |
| CZ100098A3 (cs) | 1998-10-14 |
| AU5942198A (en) | 1998-10-08 |
| HUP9800761A3 (en) | 2001-01-29 |
| BR9806478A (pt) | 2000-04-11 |
| US6114173A (en) | 2000-09-05 |
| CA2232163A1 (en) | 1998-10-03 |
| IL123717A0 (en) | 1998-10-30 |
| EP0869347A2 (en) | 1998-10-07 |
| HUP9800761A2 (hu) | 1999-02-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6114173A (en) | Fully automated method and reagent composition therefor for rapid identification and characterization of reticulocytes erythrocytes and platelets in whole blood | |
| KR100276144B1 (ko) | 전혈 중 망상 적혈구의 동정 및 특성화에 사용하는 시약 조성물 및 이를 사용한 세포동정방법 | |
| AU775260B2 (en) | Single channel, single dilution detection method | |
| KR100258394B1 (ko) | 전혈 속의 망상 적혈구를 동정하고 특성화하는 방법 및 이에 사용하는 시약 조성물 | |
| US5633167A (en) | Reagent compositions for use in sphering cells | |
| US4882284A (en) | Method for quantitating and differentiating white blood cells | |
| US5175109A (en) | Reagent for classifying leukocytes by flow cytometry | |
| CA1309328C (en) | Method of classifying leukocytes by flow cytometry and reagents used in the method | |
| JP2001524666A (ja) | 赤芽球の識別方法 | |
| JP2002501188A (ja) | 有核の赤血球の識別方法 | |
| WO1996033396A1 (en) | Compositions and methods for the rapid analysis of reticulocytes | |
| BRPI0816016A2 (pt) | kit reagente para analisar uma amostra e método para analisar uma mostra | |
| JP2001524665A (ja) | 赤芽球の識別方法 | |
| JPH0599919A (ja) | 白血球分析方法 | |
| EP0259833B1 (en) | Reagent and method for classifying leukocytes by flow cytometry | |
| Ronot et al. | Assessment of cell viability in mammalian cell lines | |
| Sakata | Reagent characteristics in the XE-2100 NRBC channel |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050331 |
|
| A761 | Written withdrawal of application |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761 Effective date: 20051222 |