CZ100098A3 - Způsob rychlé automatizované identifikace a charakterizace reticulocytů erythrocytů a destiček v krvi, a činidlo pro tento způsob - Google Patents

Způsob rychlé automatizované identifikace a charakterizace reticulocytů erythrocytů a destiček v krvi, a činidlo pro tento způsob Download PDF

Info

Publication number
CZ100098A3
CZ100098A3 CZ981000A CZ100098A CZ100098A3 CZ 100098 A3 CZ100098 A3 CZ 100098A3 CZ 981000 A CZ981000 A CZ 981000A CZ 100098 A CZ100098 A CZ 100098A CZ 100098 A3 CZ100098 A3 CZ 100098A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
reagent
reticulocytes
mixture
reagent composition
cell
Prior art date
Application number
CZ981000A
Other languages
English (en)
Inventor
David Zelmanovic
Lynn Paseltiner
Martin Sorette
Original Assignee
Bayer Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Corporation filed Critical Bayer Corporation
Publication of CZ100098A3 publication Critical patent/CZ100098A3/cs

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
    • G01N15/1456—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals
    • G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5094—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for blood cell populations
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/583—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with non-fluorescent dye label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
    • G01N2015/012—Red blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
    • G01N2015/012—Red blood cells
    • G01N2015/014—Reticulocytes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/01—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials specially adapted for biological cells, e.g. blood cells
    • G01N2015/018—Platelets
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
    • Y10T436/101666—Particle count or volume standard or control [e.g., platelet count standards, etc.]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
    • Y10T436/107497—Preparation composition [e.g., lysing or precipitation, etc.]
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
    • Y10T436/108331—Preservative, buffer, anticoagulant or diluent

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Ecology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)

Description

Oblast techniky
Tento vynález se týká plně automatizovaných metod hematologické analýzy a reagenčních směsí, které jsou používané při této metodě pro zjišťování a charakterizaci buněk ve vzorcích čisté krve, a to zejména (i) pro zjišťování retikulocytů a erytrocytů; (ii) pro zjišťování a rozlišování krevních destiček; a (iii) pro současné měření objemu, koncentrace hemoglobinu a obsahu hemoglobinu u velkého množství jednotlivých retikulocytů a erytrocytů ve vzorku čisté krve pomocí technik průtokové cytometrie na bázi rozptylu a absorpce světla.
Dosavadní stav techniky
U všech vyšších zvířat se krev skládá z vodné tekuté Části (plasma), ve které jsou suspendována tělíska různých druhů: červené krvinky (erytrocyty), bílé krvinky (leukocyty) a krevní destičky. Plasma svým složením obsahuje přibližně 90 % vody, 9 % bílkovin, 0,9% solí a stopová množství dalších látek, jako jsou cukry, močovina, kyselina močová a podobně.
Buňky nebo tělíska periferní krve (tj. krev mimo kostní dřeň) se dělí na dvě hlavní skupiny: erytrocyty, jejichž primární funkcí je přenos kyslíku, a leukocyty, jejichž primární funkce souvisí s imunitním systémem a spočívá v ničení látek, které jsou tělu cizí. Kromě těchto dvou hlavních skupin krev obsahuje také tak zvané krevní destičky, které plní důležitou funkci pro městnání krve.
Konečné stadium při dozrávání erytrocytů se objevuje poté, co tyto jsou uvolněny z krevní dřeně, kdy tyto buňky kolují v periferní krvi. Tyto mladé červené krvinky, neboli „retikulocyty“ ztratily svá jádra a tím také svoji schopnost se dělit nebo syntetizovat kyselinu ribonukleovou (RNA). Ačkoliv tyto funkce ustaly, retikulocyty jsou stále metabolicky • ·
aktivní a jsou schopny syntetizovat bílkoviny, vstřebávat železo pro syntézu hemu a uskutečňovat nezbytné metabolické reakce vyžadované k udržení energeticky bohatého stavu. Tyto buňky lze obvykle snadněji rozlišit od zralých erytrocytů, pokud jsou vystaveny roztokům kationaktivních barviv, která reagují s aniontovou RNA v retikulocytech a sráží se do jemného nebo hrubě zbarveného „retikula“ uvnitř retikulocytů, které dává retikulocytům jejich jméno.
Ačkoliv retikulocyty běžně představují asi 0,5 až 2 procenta z celkové populace červených krvinek, toto procentní množství se může za abnormálních podmínek dramaticky změnit. Například počet retikulocytů byl po mnoho let používán jako diagnostická pomůcka při zjišťování vývojových poruch krve, jako ukazatel regenerace červených krvinek po krvácení, stejně jako pro sledování počínající toxicity při chemoterapii určitých zhoubných chorob.
Nukleové kyseliny (RNA a DNA) jsou polyanionty , které mohou být zabarveny prakticky jakýmkoliv kationaktivním barvivém. RNA v retikulocytech může být zabarvena pouze několika málo kationaktivními barvivý, mezi jinými jsou to například brilantní kresylová modř (BCG), nová methylenová modř (NMB), Auramin O (AuO), akridinová oranž (AO), thiazolová oranž (TO), Oxazin 750 a Pyronin Y (PY). Mezi těmito barvivý lze objevit pouze podmnožinu, která způsobí rychlý průnik do buněk (a tedy jejich zabarvení). Rychlost a stupeň zabarvení retikulocytů závisí na mimobuněčné koncentraci barvivá, na rychlosti pronikání barviva skrz membránu retikulocytů a na síle specifické vazebné konstanty mezi kationaktivním barvivém a RNA retikulocytů. Poslední dvě vlastnosti jsou odlišné a nelze je snadno pro jednotlivá barviva předvídat, takže je nutno metodou zkoušek a omylů zjistit vhodné zbarvení retikulocytů.
K dispozici jc několik poloautomatizovaných způsobů, které lze použít pro vypočtení procentního množství retikulocytů v antikoagulovaném vzorku čisté krve za použití metod a systémů založených na fluorescenci. U těchto metod se pro zabarvení RNA v retikulocytech používá ředidlo obsahující organické kationaktivní barvivo, jako jsou AO, AuO nebo TO. Barvivo proniká buněčnou membránou a váže se na RNA a obvykle sráží „retikulum“ uvnitř každého retikulocytu. Velikost signálu, který vysílá zabarvená RNA, je přibližně úměrná obsahu RNA. Po řádném zabarvení lze použít ke stanovení procentního množství retikulocytů při výtoku fluorescenční průtokový cytometr (spíše než absorpční průtokový cytometr) vybavený řádným účinným světelným zdrojem (běžně jde o argonový iontový laser vyzařující při 488 nm) a emisní detekční systém.
Ačkoliv fluorescenční cytometrické metody a fluorescenční barviva jsou používána v tomto oboru k rozlišení retikulocytů ve vzorcích čisté krve, je zde nedostatek velmi rychlých, přesných a spolehlivých cytometrických metod, které využívají plně automatizované průtokové cytometrické techniky založené na rozptylu/absorpci pro určování počtu retikulocytů, červených krvinek a krevních destiček a pro vyhodnocení dalších parametrů u retikulocytů a červených krvinek. Nicméně tento současný vynález, který představuje metodu a reagenční směs určené pro rychlou analýzu vzorků čisté krve prostřednictvím plně automatizované průtokové cytometrie na bázi rozptylu a absorpce světla, poskytuje oboru potřebnou a vysoce prospěšnou metodu rozboru krve a reagenční směs, kterou lze/použít u plně automatizovaných hematologických systémů. Vynález urychluje proces analýzy krvinek, což umožňuje testování a analýzu více vzorků, značně zkracuje celkový čas potřebný ke zpracování a konečně, urychluje informování kliniků, lékařů a pacientů ohledně výsledků.
Obtížnost při sledování počtu retikulocytů pomocí průtokového cytometru je problémem rozlišování mezi detekčními signály retikulocytů, signály zralých červených krvinek a šumem systému.
• · • ·
Zabarvené pásy RNA jsou početné u mladých retikulocytů a když jsou zjištěny průtokovým cytometrem, vytvářejí signály o relativně velké velikosti. Nicméně zralejší buňky obsahují méně zabarvenou RNA a vytvářejí slabší signály, které mohou být překryty šumem měřícího systému průtokového cytometru. Existuje potřeba rychlých a přesných metod a reagenčních směsí, které by mohly být použity pro rychlou identifikaci retikulocytů a současné měření objemu, koncentrace hemoglobinu a obsah hemoglobinu u retikulocytů a erytrocytů v čistém krevním vzorku pomocí technik průtokové cytometrie na bázi měření rozptylu a absorpce světla u plně automatizovaných systémů, které vzorky rychle zpracují.
V patentové literatuře jsou popsány ilustrativní metody pro rozlišení retikulocytů ve vzorcích čisté krve za pomoci fluorescenčních barviv a metod průtokové cytometrie na bázi fluorescence, které jsou jiné než tento vynález a které často vyžadují dobu mnoha vteřin až několika minut pro inkubaci vzorku před rozborem. Např. patent USA č. 3,684,377 udělený Adamsovi a Kamentskému popisuje směs barvivá pro diferenční rozbor krve zahrnující vodný roztok AO a mající faktor pH a osmolalitu v rámci běžných fyziologických mezí platných pro lidskou krev. Směs barviva může být použita pro počítání retikulocytů tak, že měří přítomnost nebo absenci fluorescenčního signálu pomocí rozptylového signálu erytrocytů.
Patent USA č. 3,883,247 udělený Adamsovi popisuje podobnou metodu jako byla metoda Adamse a Kamentského používající směs barviva obsahující AO s koncentrací mezi 10’6 a 10'5 gramů na ml.
Patent USA č. 4,336,029 udělený Natalemu popisuje reagenční směs obsahující vodný roztok barviva AO, iont citronanu a paraformaldehyd a mající pH přibližně 7,4 a isotonickou osmolalitu. Koncentrace různých složek byla vybrána tak, aby maximalizovala vzestup barviva u retikulocytů a krevních destiček, a to s tím výsledkem,
že vzestupu barviva je dosaženo během 2-5 minut míchání krevního vzorku a reagenční směsi. Automatizovaná metoda pro zjišťování krevních destiček a retikulocytů, která využívá reagenční látku podle
Nataleho je popsána v patentu USA č. 4,325,706, který byl udělen
Gershmanovi a kolektivu.
V reagenčním činidle, které je popsáno v patentu USA č. 4,707,451, který byl udělen Sagemu, Jr. jsou retikulocyty zabarvovány thioflavinem T nebo chrysanilinem. Bylo zjištěno, že vzorek čisté krve je účinně zabarven, když se smíchá 25 μΐ alíkvotního množství barviva v isotonickém slaném roztoku (0,2 mg/ml) s 10 μΐ antikoagulované čisté krve a směs je inkubovaná asi na dobu 7 minut.
Patent USA č. 4,883,867 udělený Leeovi a kolektivu popisuje směs barviva pro zabarvení RNA nebo DNA. Barvící směs obsahuje jako preferovanou barvící složku TO. Retikulocyty jsou zabarveny v minimálním čase 30 minut.
Reagenční činidlo pro počítání retikulocytů pomocí technik průtokové cytometrie je popsáno v patentu USA č. 4,971,917, který byl udělen Kurodovi, a toto činidlo obsahuje uhličitanovou sůl ke snížení nespecifického zabarvení zralých erytrocytů barvivém, např. AuO, aby se předešlo tomu, že zralé erytrocyty jsou při rozboru pomocí fluorescenční průtokové cytometrie chybně započteny jako retikulocyty.
Patent USA č. 4,981,803 popisuje reagenční činidlo pro počítání retikulocytů, které se skládá ze dvou roztoků, jmenovitě jde o zásobní roztok pro zabarvení, ve kterém je barvivo AuO rozpuštěno v nevodném rozpouštědle a tlumivý roztok, který zajišťuje optimální podmínky pro zabarvení.
Další reagenční činidlo pro zabarvení retikulocytů při používání techniky fluorescenční průtokové cytometrie, které obsahuje AuO, je popsáno v patentu USA č. 4,985,176, který byl udělen Kurodovi a kolektivu. Tento patent popisuje inkubační dobu reagenčního činidla a
vzorku pro fluorescenční analýzu v širokém rozmezí od 30 vteřin do 20 minut.
Čtverné deriváty AO pro kvantifikaci retikulocytů jsou popsány v patentu USA č. 5,075,556 uděleném S. Fanovi a G. Fischerovi. Reagenční činidlo u Fana a kolektivu obsahuje 10'6 gramů na ml derivátů AO v tlumícím roztoku, který obsahuje paraformaldehyd a šťavelan draselný a zabarvuje retikulocyty tak, že je možno provést kvantitativní analýzu retikulocytů v krevním vzorku pomocí fluorescenční průtokové cytometrie.
Žádné z výše uvedených reagenčních činidel neobsahuje sférické činidlo pro prevenci problémů směrových šumů jak je uvedeno dále, a žádné nedovoluje současné stanovení dalších diagnosticky významných parametrů jako jsou objem a koncentrace hemoglobinu u retikulocytů a erytrocytů na základě metody, která zkoumá jednotlivé buňky po jedné za sebou. Kromě toho, některé z výše uvedených metod vyžadují přípravu vzorku a čas pro reakci nebo inkubaci s reagenčním roztokem, což není vhodné pro velmi rychlou metodu, kterou by bylo možno použít v plně automatizovaných systémech, které pracují s kratšími časy na zpracování vzorku.
Shapiro a Stephens popisují použití Oxazinu 750 pro stanovení obsahu DNA pomocí průtokové cytometrie v publikaci „Průtoková cytometrie zjišťující obsah DNA pomocí Oxazinu 750 nebo příbuzných laserových barviv s excitací 633 nm“, Cytometrie, Sv. 7, str. 107-110 (1986). Buňky jsou zabarveny 10 pm až 30 pm Oxazinu 750 a jsou ustáleny přidáním etanolu, aby mohla být stanovena DNA. Shapiro a Stephens tvrdí, že Oxazin 750 nezabarvuje RNA uvnitř buněk. Kromě toho, takové protokoly s Oxazinem 750 nedovolují počítání retikulocytů ani současné stanovení dalších diagnosticky významných parametrů u červených krvinek, jako je objem a koncentrace hemoglobinu u jednotlivých buněk.
··· ·
Patenty USA č. 4,575,490 a 4,412,004 udělené Kimovi a Omsteinovi uvádějí metodu a reagenční činidlo pro eliminaci směrového šumu při měření objemu červených krvinek v průtokovém cytometru. Popisovaná metoda zahrnuje isovolumetrické zakulacování nezabarvených červených krvinek pro eliminaci všech směrových rozdílů mezi krvinkami, což dovolí mnohem precisnější a přesnější měření objemu buňky. Každá červená krvinka je převedena z bikonkávního tvaru na perfektní kulovou plochu pomocí povrchově aktivního sférického činidla. „Tlumící“ bílkovina a /nebo aldehydový ustalovací prostředek jsou popsány jako nutné pro použití se sférickým činidlem pro prevenci lýzy erytrocytů. Aniontová povrchově aktivní sférická činidla v reagenčních směsích popsaných Kimcrn a Omsteinem nelze použít s retikolocytovými barvivý, protože rychle reagují s kationaktivními barvivý a srážejí tato barviva používaná k zabarvení a srážení retikula.
Patenty USA č. 5,360,739 a 5,411,891 udělené S. S. Fanovi a kolektivu popisují metody a reagenční směsi pro stanovení retikulocytů za pomoci kationaktivního barviva a průtokové cytometrické analýzy na bázi fluorescence/rozptylu.
Patent USA č. 4,735,504 udělený Tyckovi popisuje kanálek červených krvinek systému TECHNICON H.l™ , což je průtokový cytometr, který zajišťuje plně automatizovanou metodu a prostředky pro stanovení individuálních a průměrných objemů erytrocytů (MCV) a individuálních a průměrných korpuskulámích . hemoglobinových koncentrací (MCHC) u erytrocytů v antikoagulačně ošetřeném vzorku čisté krve. U této metody jsou červené krvinky ve dvou alikvotních množstvích vzorku čisté krve v řádu mikrolitrů nejdříve rozpuštěny a poté isovolumetricky zakulaceny pomocí metod známých v oboru. Po dvaceti vteřinách inkubační doby jsou tyto buňky propouštěny, po jedné, skrz osvětlenou měřící zónu uvnitř kanálku červených krvinek • ···* analyzátoru. Tyčková metoda nerozlišuje mezi retikulocyty a jinými krvinkami a nestanoví odděleně diagnosticky významné parametry retikulocytů a erytrocytů, jako je objem a koncentrace hemoglobinu u jednotlivých buněk.
Tento vynález nabízí významnou výhodu oboru tím, že poskytuje zdokonalenou a rychlejší metodu stanovení krvinek, která nevyžaduje čas na ruční přípravu vzorku a která umožňuje inkubaění dobu v reakěním roztoku před rozborem krevního vzorku na plně automatizovaných hematologických analyzačních systémech kratší než dvacet vteřin. Kromě toho, vynález poskytuje reprodukovatelné, spolehlivé a přesné výsledky pomocí techniky průtokové cytometrie měřící rozptyi/absorpci. Tyto výsledky jsou dosahovány prokazatelně rychleji, než to jde pomocí stávajících metod průtokové cytometrie založených na rozptylu/absorpci.
Podstata vynálezu
V souladu s tím je základním cílem tohoto vynálezu nabídnout zdokonalenou a rychlou (tj. čas reakce přibližně 20 vteřin nebo méně) metodu a reagenční směs pro rozlišení retikulocytů, červených krvinek a krevních destiček od jiných buněk ve vzorku čisté krve prostřednictvím technik průtokové cytometrie založené na absorpci pomocí plně automatizované analýzy vzorku a vysokorychlostních automatizovaných hematologických analyzátorů.
Dalším cílem tohoto vynálezu je představit, rychlou a citlivou metodu a reagenční směs používanou v rámci této metody pro zjištění počtu retikulocytů, červených krvinek a krevních destiček ve vzorku čisté krve s využitím plně automatizovaných absorpčních průtokových cytometrických analyzátorů, bez potřeby ruční přípravy vzorku, a tedy bez potřeby dalšího času na tuto přípravu před automatizovanou analýzou tohoto krevního vzorku.
• *· φφ ♦· ···♦ • · ♦ · φ ♦ φ · · ·· • * · φ · ·· · ·♦ · φ · · · φ · φ « ·«· ·· φ · · φ · φφ φ · ··· ···· φφ ··Φ· *·
Dalším cílem tohoto vynálezu je zajištění plně automatizované a rychlé metody a reagenční směsi používané v rámci této metodě pro současné zakulacování červených krvinek a retikulocytů a zabarvování retikulocytů a pro získání počtu a ukazatelů retikulocytů a počtu krevních destiček v několika vteřinách ve srovnání s jinými automatizovanými metodami analýzy krvinek pomocí průtokové cytometrie založené na rozptylu/absorpci.
Dalším cílem tohoto vynálezu je zajistit plně automatizovanou a rychlou metodu a její reagenční směs na stanovení takových ukazatelů retikulocytů a červených krvinek, jako jsou průměrný objem buňky, koncentrace hemoglobinu a obsah hemoglobinu ve vzorku čisté krve pomocí průtokové cytometrie založené na absorpci a rozptylu světla. Vynález dále nabízí rozložení výše uvedených parametrů buněk.
A dalším cílem vynálezu je zajistit metodu a reagenční směs v rámci této metody, jak bylo uvedeno výše, pro současné rozlišení červených krvinek, retikulocytů a krevních destiček a zjištění jejich individuálních počtů v rámci krevního vzorku a pro stanovení objemu, obsahu hemoglobinu a koncentrace hemoglobinu, průměrného objemu erytrocytů a průměrné korpuskulámí hemoglobinové koncentrace pro každý typ červených krvinek, který byl stanoven z měření jednotlivě po sobě jdoucích buněk.
Popis výkresů
Výše uvedené a další cíle a významné výhody vynálezu budou určitě jasnější po následujícím podrobném popisu, který se vztahuje k doprovodným nákresům, kde:
Obrázky IA - ID ukazují výsledky analýz rozptylové/absorpční průtokové cytometrie jak byly prováděny na základě tohoto vynálezu. Obrázky IA a 1B zobrazují cytogramy uvádějící rozptylové versus absorpční schémata spojená s analýzou vzorku čisté krve. Oblasti cytogramu odpovídají různým typům krvinek a plochy obrazovky
·· φφ jsou specificky identifikovány na obrázku IA. Oblasti představují: červené krvinky (RBCs), retikulocyty (retics), krevní destičky (PLTs) a koincidenční signály. Koincidenční signály vznikají na základě přítomnosti dvou nebo více částic v oblasti počítání v jednom okamžiku. Obrázky 1C a ID zobrazují sloupkové diagramy, které ukazují rozdělení objemů destiček v rámci vzorků. Obrázek IA představuje vzorek normální krve; obrázek 1B představuje vzorek abnormální krve.
Obrázek 2 představuje rozptylový / absorpční cytogram zobrazující typické výsledky u vzorku normální krve analyzované podle vynálezu pomocí NaN3 v reagenčním prostředku jak uvádí Tabulka 1 v tomto dokumentu. Popisky k cytogramu jsou uvedeny u obrázků 1A a 1B a jsou popsány dále.
Obrázek 3 ukazuje vysokou vzájemnou závislost výsledků srovnávacích studií, kde je využita rychlá automatizovaná metoda a směs podle tohoto vynálezu a ruční metoda analýzy krvinek vzorku čisté krve ke zjištění retikulocytů za pomoci rozptylové / absorpční průtokové cytometríe. V grafu je uvedena rovnice nejmenších čtverců a korelační koeficient (r).
Obrázky 4A a 4B ukazují výsledky stanovení množství červených krvinek (4A) a krevních destiček (4B) pomocí rychlé automatizované metody jak je popsána v tomto dokumentu. Obrázek 4A ukazuje srovnání mezi počty červených krvinek zjištěnými pomocí metody podle tohoto vynálezu a standardní automatizované metody, například s využitím hematologického analyzátoru BAYER Η·31M . Obrázek 4B ukazuje srovnání mezi počty krevních destiček získanými pomocí rychlé automatizované metody podle tohoto vynálezu versus pomocí standardní automatizované metody. Pokud jde o obrázky 4A a 4B, bylo pro každou metodu použito duplicitně deset normálních vzorků. Na grafech je uvedena rovnice nejmenších čtverců a korelační koeficient (O· ·· ·♦
« • ···
Podrobný popis vynálezu
V oblasti hematologické analýzy existuje stále naléhavá potřeba rychlejších zkoušek a metod rozborů pro stanovení absolutních a procentních počtů červených krvinek a retikulocytů a pro stanovení počtu krevních destiček v krevním vzorku, který je odebrán na testování.
Běžně v oboru používané poloautomatizované hematologické analyzátory poskytují údaje o vzorku poté, co je vzorek krve obsahující krvinky smíchán s příslušným reagenčním roztokem, aby se vytvořila reakční směs (tj. reakční suspenze), a to buď uvnitř nebo vně analyzačního systému. Po době inkubace reagenční směsi je směs analyzována v hematologickém analyzačním zařízení. Takto jsou příprava vzorku a jeho inkubace limitujícími faktory přispívajícími k prodloužení doby nutnc pro analýzu krevního vzorku v poloautomatizovaných hematologických zařízeních.
Pro plně automatizované vysokorychlostní analyzátory, jako je například řada analyzátorů TECHNICON H· Systém, jsou nezbytné rychlejší automatizované hematologické a analyzační metody pro přesnou a spolehlivou integraci a zpracování v rychlejších systémech. Tento vynález poskytuje novátorskou metodu, která nevyžaduje žádnou ruční přípravu vzorku mimo systém a představuje takto v podstatě jednokrokový proces analýzy vzorku, který probíhá uvnitř automatizovaného analyzátoru. Metoda a reagenční činidlo při ní používané eliminují ruční přípravu vzorku a dobu zpracování a tak významně a příznivě snižují celkovou dobu potřebnou pro identifikaci a stanovení počtu krvinek, tj. alespoň o řádovou hodnotu ve srovnání s ostatními metodami v oboru, které jsou založeny na rozptylu/absorpci.
V jedné formě tohoto vynálezu je zajištěna rychlá metoda pro stanovení počtů retikulocytů, červených krvinek a krevních destiček a pro stanovení ukazatelů a parametrů retikulocytů a červených krvinek za
4· • 4 «· • 444· • 4·♦ * 4 ·
444 • 4 4»4
44
4«44 pomoci plně automatizovaných analyzátorů, které fungují na principu měření rozptylu a absorpce světla. Zdokonalený proces nabízí oboru, který běžně využívá metodologii založenou na fluorescenci, použití metodologie založené na rozptylu a absorpci světla pro velmi rychlou automatizovanou analýzu vzorku, jaká je popsána v tomto dokumentu.
Metoda vynálezu v sobě zahrnuje použití činidla zabarvujícího retikulocyty, které obsahuje kationaktivní barvivo v takové koncentraci, která je účinné pro zabarvení retikulocytů ve vzorku čisté krve tak, aby bylo možno zjistit počet a charakter krvinek za 5 až 60 vteřin, nejlépe asi mezi 20 až 50 vteřinami, a úplně nejlépe od 20 do 30 vteřin nebo méně počítáno od prvotní reakce s alikvotní částí vzorku čisté krve. Podle vynálezu může být krevní vzorek analyzován v automatizovaném hematologickém analyzátoru asi do 30 vteřin, což zahrnuje přibližně 20 vteřin reakčního času vzorku v reagenční směsi a přibližně 10 vteřin na zjištění počtu, kdy na matematickou analýzu připadá přibližně méně než 0,1 vteřiny.
Jednoduchost a rychlost metody představují výhodu pro zkušeného lékaře. Protože není nutná příprava vzorku, může dokonce i méně zkušený personál obsluhovat plně automatizovaná analyzační zařízení, využít metodu vynálezu a získat přesné a spolehlivé počty a ukazatele krvinek. Kromě toho lze analyzovat mnohem více vzorků za stejnou dobu, která byla dříve při používání poloautomatizovaných systémů potřebná pro provedení méně rozborů krevních vzorků; Například podle tohoto vynálezu se analýza krevního vzorku objeví za méně než 20 až 30 vteřin v plně automatizovaném systém oproti 150 vteřinách u poloautomalizované metody.
Vodná reagenční směs, která se při metodě používá, obsahuje tlumící roztok k udržení pH reakční směsi na hodnotě, která zabrání tomu, aby nespecifické zabarvení zralých červených krvinek narušilo zjišťování počtu retikulocytů a erytrocytů a charakterizační analýzu.
to ·· toto ·· ·· ·· ♦ · · toto· ···· • · · to ««to···· • · ·· toto · · »·· ·· ·· to···«· ··· to··· ·· ·· toto ··
Krevní vzorky mohou být ošetřeny proti srážení tak, jak je v oboru běžné. Činidlo dále obsahuje sférické činidlo, kterým je nejlépe povrchově aktivní látka s obojetným iontem, jak je popsáno v tomto dokumentu, aby bylo možno stanovit ukazatele retikulocytů; reagenční směs je také optimalizována s ohledem na osmolalitu ztlumeného reakčního roztoku.
Ti, kteří mají zkušenosti v oboru, vědí, že ne všechny kationaktivní sloučeniny jsou schopné proniknout neporušenou membránou červených krvinek (a retikulocytů), a povaha anionů, které nezbytně doprovázejí kationy může ovlivnit to, zda kationaktivní sloučenina proniká rychle, pomalu nebo vůbec ne. Hydrofobní molekuly obecně pronikají membránami červených krvinek rychleji než hydrofílní molekuly, a malé molekuly obecně pronikají membránami rychleji než velké molekuly. Pouze určitá podskupina solí nebo tlumících roztoků smíchaných s těmito kationaktivními barvivý, která mohou zabarvit retikulocyty, umožňuje rychlé zabarvení; což znamená, že „správné“ barvivo se „špatným“ tlumícím roztokem může mít za následek příliš dlouhou dobu potřebnou pro zabarvení retikulocytů. Λ zase, pro zjištění vhodného složení směsí pro zabarvování retikulocytů je nezbytná metoda zkoušek a omylů. Takto je navzdory nejrůznějším „pravidlům“, která lze použít jako vodítka, obtížné předpovědět a priori, zda a za jakých podmínek mohou jakákoliv konkrétní kationaktivní barviva rychle pronikat a zabarvovat retikulocyty.
Plně automatizovaný přístroj pro provádění analýzy krevního vzorku, který využívá metody a reagenční směsi podle tohoto vynálezu obecně obsahuje 1) odměmé zařízení pro krev a reagenční směs, aby byl zajištěn správný objemu každé z reakčních složek; 2) prostředek pro dostatečné promíchání všech složek; 3) reakční komoru; a 4) prostředky pro přesun směsi k měřícímu zařízení. Měřící zařízení se skládá z prostředků, které zajišťují měřený průtoku reakční směsi obsahující buňky skrz průtokovou komoru, kde probíhá počítání a výčet. Obecně lze říci, že světlo z heliově-neonového laseru nebo laserové diody dopadá na průtokovou komoru a toto světlo je přerušováno průchodem krvinek skrz tuto průtokovou komoru. Krvinky světlo rozptylují tím, jak jej zadržují a také jej absorbují, to v případě zabarvených retikulocytů.
Měřící zařízení se skládá ze tří optických detektorů. Dva z těchto detektorů zjišťují světlo rozptýlené ph 1°- 3°, resp. 4°-20°, nejlépe při 2°-3°, resp. 5°-15° od osy dopadu. Třetí detektor stanovuje zlomek absorbovaného světla. Signály z těchto tří detektorů jsou analyzovány počítačem, který pro přeměnu signálů na údaje o objemu buněk, koncentraci hemoglobinu a obsahu hemoglobinu pro každou buňku, která projde skrz průtokovou komoru používá tabulky odvozené na základě teorie rozptylu podle Mieho. Počítač také zobrazuje cytogram buněčné suspenze, kde je uveden rozptyl při 5°-15° versus absorpce a používá matematické algoritmy pro odlišení a roztřídění červených krvinek, retikulocytů, krevních destiček a koincidenčních signálů.
Například, vzhled obrazovky při výše uvedené analýze je vidět na obrázcích IA a 1B. Jedna z těchto obrazovek hlásí data získaná z krevního vzorku, který měl normální procento retikulocytů (tj. 1,4); druhá obrazovka hlásí data získaná z abnormálního krevního vzorku, kde je procento retikulocytů 11,0. Hlášení zahrnují indexy retikulocytů. Na obrázcích IA a 1B jsou hlášené výsledky, které korelují s cytogramy, následující:
Pro obrázek 1 A:
VZOREK RETICS
CHCM 30,04 g/dl CHCM 27,43 g/dl
MCV 93,86 fl MCV 115,60 fl
MCH 27,60 pg MCH 30,98 pg
HDW 2,41 g/1 HDW 2,38 g/dl
RDW 13,03 % RDW 17,61 %
RBC 5,19xl06/pL
RETIC 71,97 xl O9/L
POS 251
NEG 17860
%POS 1,39%
L 96,81%
M 2,79 %
H 0,40%
pro obrázek IB:
VZOREK RETICS
CHCM 30,01 g/dl CHCM 26,81 g/dl
MCV 96,94 fl MCV 113,15 fl
MCH 28,35 pg MCH 29,56 pg
HDW 4,02 g/1 HDW 3,76 g/dl
RDW 20,21 % RDW 18,53 %
RBC 2,89 x 106 /pL
RETIC 318,13 x 109/L
POS 1769
NEG 14280
%POS 11,02%
L 60,15%
Μ 29,79 %
Η 10,06%
Tyto hlášené výsledky pro obrázky 1A a 1B jsou následující:
VZOREK = celkové množství analyzovaných buněk; RETICS = buňky započítané jako retikulocyty; CHCM = průměr buněčné koncentrace hemoglobinu, která měří stejné vlastnosti buňky jako MCHC neboli průměrná buněčná koncentrace hemoglobinu; MCV = průměrný objem buňky (u červené krvinky); MCH = průměrný buněčný hemoglobin; HDW = šířka rozdělení hemoglobinu (měřítko variability koncentrace hemoglobinu v buňkách v rámci vzorku); RDW = šířka rozdělení červených krvinek; RBC = počet červených krvinek; RETIC = počet • to· ·· *· *··· ···· · · to · · ·· • · · · ♦·· · · ·· • ··♦··+· ···· ♦ · · * · to to ♦· ··· ···· ·· ·· ·· ·· retikulocytů; POS = množství započtených retikulocytů; NEG = množství započtených červených krvinek; %POS = procentní množství retikulocytů ve vzorku; L, Μ, H = procento slabě, středně a vysoce zabarvených retikulocytů; PLT = počet krevních destiček; MPV = průměrný objem krevních destiček; PCT = krit krevních destiček (procento, které v objemu vzorku zaujímají krevní destičky); PDW = šířka rozdělení krevních destiček (rozdělení objemů krevních destiček v rámci vzorku).
Ilustrativní měřící zařízení a systém vhodný pro analýzy podle tohoto vynálezu jsou ty, které jsou popsány v patentu USA č. 4,735,504 uděleném Tyčkoví, na který je zde v tom dokumentu odkazováno. Je nutné pochopit, že metodu a systém podle Tyčka mohou pracovníci zkušení v oboru modifikovat podle potřeby tak, jak je to nezbytné pro provádění zdokonalené rychlé metody podle tohoto vynálezu.
Aby bylo možno využít metodu podle Tyčka, je nutné mít světelný zdroj, který vysílá jednobarevné světlo v oblasti, kde je hemoglobin dobře propustný pro toto záření; běžně jde o světelný zdroj jako je červený heliově-neonový laser, nebo laser s ještě vyšší vlnovou délkou. To znamená, že pokud má být tato vlnová délka použita také pro měření absorpce, musí být použito barvivo modré barvy se silnou absorpcí červeného světla. Jako preferované barvivo slouží Oxazine 750 a toto barvivo se používá při zdokonalené a rychlé metodě absorpční/rozptylové průtokové cytometrie podle tohoto vynálezu pro stanovení koncentrace RNA v retíkulocytech, zjištění počtu retikulocytů, počtu krevních destiček a zralých červených krvinek a objemu retikulocytů a obsahu hemoglobinu v každé jednotlivé buňce.
Pokud jde o podrobnosti, základní koncepcí průtokové cytometrie je v podstatě procházení buněk, po jedné, skrze specifickou oblast snímání. Běžně se jedná o to, že způsobem hydrodynamického zaostřování jednotlivé buňky procházejí skrz snímací zónu, která se skládá ze zaostřeného světelného zdroje a detekčního systému, kde se měří rozptýlené a absorbované světlo.
φφ • φφ φφ φφ φ · φφφ • φφφ φφφ φ φ φ φ · φ φ · φ φ φφφφ φφφ φφφφ ·· φφ
Účinek toho, že částice má na sobě světlo, které zachytí, lze zjistit několika způsoby. Obecně se jedná o to, že každá částice má index lomu, který se liší od indexu lomu prostředí, ve kterém je suspendována. Index lomu, n, se skládá ze dvou částí: reálné části, nr, a tak zvané imaginární části, ημ Nenulové hodnoty n, jsou spojeny s absorpcí světla. Částice proto tedy rozptýlí a absorbuje světlo, kterým je osvětlována v několika úhlech a s různou intenzitou, které závisí na rozdílu indexu lomu, velikosti částice, jejím tvaru a všech vnitřních odchylkách indexu lomu a struktury, stejně jako na vlnové délce světla, které ji osvětluje. (Pro homogenní kulové plochy poskytuje teorie rozptylu podle Mieho kompletní popis rozdělení a intenzit rozptýleného světla).
Jak bylo uvedeno výše částice může nějaké dopadající světlo také absorbovat. V tomto druhém případě může anebo nemusí být část absorbovaného světla opět vyzářena jako fluorescence, běžně při větších vlnových délkách než je vlnová délka absorbovaného světla. Tyto a další účinky lze měřit detektory světla upravenými pro měření různých úhlových intervalů rozptýleného světla, nerozptýleného světla, fluorescenčního světla a zlomku světla, které bylo absorbováno částicemi.
Když jde o částice tak malé jako jsou krvinky, běžně méně než 15 mikrometrů v průměru, může být počet fotonů ve světelném svazku paprsků ovlivněný jejich průchodem za velké rychlosti (běžně stovky až tisíce řídce rozmístěných buněk za vteřinu) velmi malý, zejména v porovnání s počtem fotonů za vteřinu, které padají na osvětlenou část proudu suspenze a v porovnání s osvětlením pozadí detektoru absorpce. Proto tedy limity citlivosti detekce malých jednotlivých rozdílů mezi částicemi kriticky závisí na proudu fotonů (který závisí alespoň na vlastním Jasu“ světelného zdroje) a na tom, jak velké jsou poruchy proudu fotonů, které jsou zaviněny dalšími malými a velkými rozdíly mezi částicemi.
* 99 *9 9 9 * 9 9 *
9 9 9 · • • * 9 9 9 9
• 9 9 9 9 9 9 9
9 · * • • · 9 99 9 9 9
• · • 9 • · 9 9 9
4*4·*·♦ 9 9 »· 9 9 99
Hlavní zdroje rušivého šumu u průtokové cytometrie u signálů absorpce a rozptylu mohou být zcela jiné pro každý typ signálu. Do přiblížení prvního řádu jsou velikosti rozptylových a absorpčních signálů ze zabarvených nebo nezabarvených buněk velmi silně ovlivněny tvarem nebo orientací buněk, ze kterých signál pochází. Jako extrémní příklad lze uvést, že přirozený bikonkávní tvar lidského erytrocytů má silný účinek na absorpční a rozptylové signály, které vytváří; tento účinek je větší než malé absorpční signály běžně klasicky zabarvených retikulocytů. Popis analýz průtokové cytometrie, která vychází z rozptylu/absorpce, pro stanovení retikulocytů je uveden v patentech USA č. 5,350,695 a 5,438,003, které byly udělené G. Colellovi a kolektivu, a na jejichž obsah se zde odkazuje.
Jak bylo uvedeno výše, pouze malá podmnožina kationaktivních barviv selektivně zabarvuje retikulocyty, a pouze menší podmnožina těchto barviv rychle do retikulocytů proniká. Koncentrace sloučeniny kationaktivního barviva v kombinaci s optimálním pH a iontovou sílou reagenční směsi používané v metodě tohoto vynálezu dosahuje rychlého zabarvení RNA retikulocytů a analýzy vzorku ve vteřinách. To umožňuje, aby analýzy retikulocytů, červených krvinek a krevních destiček proběhly v plně automatizovaném průtokovém cytometru přibližně za méně než 20 až 30 vteřin od smíchání krevního vzorku a použité reagenční směsi, takto se přispívá k rychlosti tohoto vynálezu a úspěšným a přesným výsledkům plně automatizovaných postupů. Metoda a reagenční směs tohoto vynálezu umožňují, aby analýzy byly alespoň o jeden řád rychlejší než současné metody rozptylové/absorpční průtokové cytometrie využívané v oboru. Pro srovnání, dřívější proces zabarvení RNA retikulocytů vyžaduje alespoň několika minut pro smíchání a inkubaci vzorku a reagenční směsi.
Tento vynález významným způsobem zdokonaluje dřívější metody tím, že dosahuje významného snížení času reakce mezi krevním
• 99 *9 9· 99 99
« · · 9 9 9 • 9 9 9
9 9 9 9 ··· 9 9 9 9
9 · 9 9 9 9 9 9 999 9 •
9 9 9 9 9 9 9 9 9
• 99 »9« 9 • 9 • 9 99 9 «
vzorkem a zde popsanou reagenční směsí, se kterou je vzorek smíchán před provedením automatizované hematologické analýzy. Bylo zjištěno, že invenční objevení kombinace zvýšené koncentrace kationaktivního barviva, snížení pH reagenční směsi a optimální rozmezí osmolaiity využívané v metodě snižuje dobu reakce krevního vzorku s reagenční směsí, což souhrnně zahrnuje reakčni směs pro analýzu. Tato novátorská kombinace parametrů zvýhodňuje zabarvování RNA v retikulocytech před nespecifickým zabarvením hemoglobinu ve zralých červených krvinkách, jak bude popsáno dále.
Je zajímavé, že zvýšení koncentrace barviva ve směsi samo nesnížilo dobu reakce krevního vzorku smíchaného s reakčním prostředím. To bylo proto, že během prvních 30 vteřin se zralé červené krvinky stejně jako retikulocyty významně navázaly na barvivo (např. Oxazin 750) při vyšších koncentracích vyžadovaných pro použití v tomto vynálezu. S delším časem inkubace krevního vzorku v reakčním prostředí (např. více než 30 vteřin) vazba barviva zralými červenými krvinkami poklesla. Takto byly delší reakčni časy u jiných metod nutné ne pouze ke zvýšení vazby kationaktivního barviva na RNA, ale také ke snížení vazby barviva na buněčný hemoglobin zralých červených krvinek, takto způsobující nespecifické zabarvení červených krvinek. Toto nespecifické zabarvení snižuje možnost rozlišení mezi červenými krvinkami a retikulocyty pokud jde o absorpční signály.
Navzdory dříve zmíněným skutečnostem byla tato současná metoda a v jejím rámci používaná směs schopna dosáhnout krátkou dobu reakce bez nepříznivého účinku na nespecifické zabarvení jiných buněk než jsou retikulocyty. Afinita barviva pokud jde o červené krvinky byla snížena, zatímco odpovídající afinita pro RNA retikulocytů byla udržena prostřednictvím vynálezu v mezích 20 vteřinové nebo kratší doby reakce prostřednictvím výše uvedeného snížení pH (např. snížení pH reakčního prostředí z přibližně 8,1 na 7,4) v kombinaci se zvýšenou koncentrací
• ·· 00 ·· 00 0*
·· 0 · 0 0 0 0 0 0 0
• 0*0 • 0 *0
• 0 0 0 0 • · 0 ··* • 0
*· 0 0 Φ 0 • * 0
000 ··*· «0 00 0* • 0
kationaktivního barviva. Podle tohoto vynálezu může zvýšená koncentrace vodíkových iontů u reagenční směsi snížit afinitu hemoglobinu pro kladně nabité barvivo.
Kromě toho bylo stanoveno, že snížení iontové síly reakčního prostředí podporuje zabarvení RNA proti zabarvení hemoglobinu u červených krvinek a takto snižuje dobu reakce. Snížená iontová síla může podpořit vazbu RNA na kladně nabité barvivo spíše než na jiné iontové složky v reagenční směsi.
V jiném aspektu tohoto vynálezu byla vazba kationaktivního barviva, např. Oxazinu 750, na zralé červené krvinky snížena bez nepříznivého účinku na vazbu na RNA přeměnou hemoglobinu na jeho oxidační formu (Met) v přítomnosti nukleofilů jako jsou azidy (Nf), např. azid sodný, nebo iont kyanatanu (OCN’), např. kyanatanu sodného. Viz Tabulka 1 a Obrázek 2. Výsledek je ten, že jen tak málo jako je asi jedna pětina množství barviva použitá v nepřítomnosti těchto nukleofilů může být použita v této formě tohoto vynálezu. Bez toho, abychom se vázali na nějakou konkrétní teorii, je možné, že přizpůsobivá strukturální změna hemoglobinu vztahující se k oxidační formou může snížit afinitu hemoglobinu pro kladně nabité barvivo v reagenční směsi. Jako obecné pravidlo jsou nukleofily používány v koncentraci přibližně 20 mM za předpokladu poměru 1:1 pro N3’ nebo ionty OCN* k vlastním místům. Protože činidla, která obsahují jak nukleofily, tak i barviva jako je Oxazine 750, nejsou běžně stabilní během skladování, mohou být činidla skladována ve dvou částech, které po smíchání dohromady dají požadovanou finální koncentraci jednotlivých složek. Ilustrativní příklad takovéhoto dvousložkového reagenčního systému je uveden v tabulce 1:
Tabulka 1
I Reagenční | složka Část 1 (na 1 litr) Rozpětí (na 1 litr) | Část 2 (na 1 litr) Rozpětí 1 (na 1 litr) |
|tris 0,81 g 0,7 - 0,9 g |0,81 g 0,7 - 0,9 g |
φ φ
TRIS-HC1 6,83 g 6,0 - 8,0 g 6,83 g 6,0 - 8,0 g
NaCl 6,40 g 5,25 -7,30 g 5,82 g 4,67 - 6,72 g
Proclin 300 0,25 ml 0,15-0,35 ml
NaNj nebo NaOCN 1,303 g 1,10 -1,50 g
TDAPS* 16,5 ml 8,2 - 22,0 ml
Oxazine 750** 2,2 ml 1,8 - 6,6 ml
deionizovaná H2O 950 ml 950 ml - “
*: Množství zásobního roztoku, lmg/ml TDAPS (tetradecyl-n,ndimethyl-3-amonno-l-propansulfonát) v destilované H2O **: Množství zásobního roztoku. 14,82 mg barviva Oxazin 750 na 4,81 ml dimethylformamidu.
Cytogram na obrázku 2 představuje normální vzorek, který byl analyzován pomocí azidu sodného, který je uveden v tabulce 1. Doba reakce pro analýzu byla 20 vteřin. Na cytogramu na obrázku 2 nabývají parametry, které jsou definované výše pro obrázky IA a IB, následujících hodnot:
VZOREK RETICS
CHCM 27,40 g/dl CHCM 24,13 g/dl
MCV 96,22 fl MCV 119,13 fl
MCH 25,74 pg MCH 27,84 pg
HDW 2,71 g/1 HDW 3,62 g/dl
RDW 14,31 % RDW 17,50%
RBC 4,15 x 106 /pL
RETIC 62,94 x 109 /L
ÍOS 276
NEG 17917
%POS 1,52%
Jak bylo popsáno výše, výzkumy na zdokonalení a urychlení procesu analýzy absorpce/rozptylu světla při průtokové cytometrii a vyvinutí metod a reagenčních činidel používaných v této metodě ke zjištění retikulocytů, erytrocytů a krevních destiček vyústily v tuto extrémně rychlou metodu, která zahrnuje zabarvení retikula retikulocytů kationaktivním barvivém bez požadavku na přípravu vzorku pro jednotlivé použití pomocí plně automatizovaných hematologických analyzátorů. Kromě toho, při zdokonalené a rychlé absorpční metodě podle tohoto vynálezu bylo k eliminaci směrového šumu použito isovolumetrického zakulacování červených krvinek. Pomocí isovolumetrického zakulacování a rozptylových/absorpčních metod lze současně měřil a buňku po buňce kvantifikovat objem retikulocytů a zralých červených krvinek a hemoglobin za pomoci reagenčního činidla, které také selektivně zabarvilo retikulocyty. Zkušení odborníci v oboru jsou si vědomi, že pokud je zakulacování úplné a ne isovolumetrické, ale má jakýsi známý faktor isotonicity X, potom pomocí Tyckovy metody s korekcí o 1/X pro objem a korekcí o X pro bílkovinu, např. koncentraci hemoglobinu, lze vypočítat původní hodnoty.
V reagenčním roztoku, který se využívá v této současné metodě, byla použita povrchově aktivní látka s obojetným iontem jako sférovací činidlo pro červené krvinky a retikulocyty, protože je plně kompatibilní s kationaktivními barvivý a nezpůsobuje srážení barviva mimo reagenční roztok. Nelimitující příklady těchto povrchově aktivních činidel s obojetným iontem zahrnují alkylamidobetainy nebo alkylbetainy, jako jsou lauramidopropylbetain (LAB), kokoamidopropylbetain (CAPB) a kokoamidosulfobetain (CASB). Další vhodné povrchově aktivní látky s obojetným iontem zahrnují: tetradccyl-n,n-dimethyl-3-amonno-lpropansulfonát (TDAPS) a n-dodecyl-n,n-dimethyl-3-amonno-lpropansulfonát (DDAPS). TDAPS a DDAPS jsou nejlepšími sférickými činidly, protože umožňují nejstabilnější přípravu vzorku. Podle tohoto • · · · · « ♦ vynálezu je možno použitím sféricky účinného množství těchto typů povrchově aktivních látek pro červené krvinky a specifikací reagenčních činidel, jak bylo uvedeno zde v tomto dokumentu, předcházet potřebě ztlumení proteinů nebo použití ustalovačů v reagenční směsi k pozdržení lýzy červených krvinek.
Pokud jde o reagenční roztok podle tohoto vynálezu a o isovolumetrické zakulacování retikulocytů a červených krvinek v rámci krevního vzorku, pohybuje se koncentrace sférického činidla v reagenčním činidle přibližně od 3,0 pg/ml do 20 pg/ml, preferovaně asi od 4,0 do 15 pg/m, a nejlépe přibližně od 4,1 do 11,0 pg/ml. TDAPS je povrchově aktivní látkou s obojetným iontem, která je preferovaná jako sférické činidlo. Sférické činidlo je preferovaně přítomno v množství přibližně 12 pg/ml až 87,5 pg/ml u LAB; přibližně od 4,1 pg/ml do 11,0 pg/ml u TDAPS; přibližně od 49,3 pg/ml do 148 pg/ml u DDAPS; přibližně od 8,8 pg/ml do 17,5 pg/ml u CAPB; nebo přibližně od 12,5 pg/ml do 15 pg/ml u CASB.
Kvůli optimální operativnosti zdokonalené metody je preferovaně použito tlumícího roztoku pro udržení specifického pH reakční směsi, tj. okolo 7,2 až 7,8, ještě lépe 7,3 - 7,5, a nejlépe 7,4, jako je organické kationaktivní barvivo pro zabarvování retikulocytů. Preferovaným barvivém je Oxazin 750 (k dispozici od firmy Excitron, Inc.,z Daytonu, Ohio), které je modrým absorpčním barvivém, které má tuto strukturu:
Podrobněji lze říci, že reagenční roztok používaný pro metodu tohoto vynálezu může obsahovat jednu nebo více následujících složek: TRIS (Tri[hydroxymethyl]-aminomethan); TRIS-I1C1 (kyselina tri[hydroxymethyl]-aminomethan-chlorovodíková); chloridová sůl alkalického kovu, např. NaCl, KC1 a podobně, pro usnadnění průniku barviva skrz membránu červené krvinky; a pokud je to žádoucí antimikrobiální sloučeninu pro zpomalení mikrobiálního růstu.
φ ·
Nelimitující příklady vhodných antimikrobiálních látek zahrnují Proclin 150 (2-methyl-4-isothiazolin-3- jeden) a Proclin 300 (5-chloro-2-methyl4-ísothiazolin-3-jeden) (Rohm & Haas); Germall 115 (n,n’-methylenbis [η’- (1- (hydroxymethy!)-2,5-dioxo-4-imidazolidinyl] močovina) (Sutton Laboratoři es); Dowacil 200 (1- (3-chlorallyl) - 3,5,7 - triaza - 1 azoniaadamantan chlorid) (Dow Chemical); a Bronopol 2-bromo-2nitropropan-1, 3 - diol (^Η6ΒγΝΟ4), (Angus Chemical Company). Proclin 300 je preferovanou antimikrobiální látkou pro použití v reagenční směsi využívané v tomto vynálezu. Ve směsi je také obsažena povrchově aktivní látka s obojetným iontem, např. TDAPS (n-tetradecyl-n,n-dimethyl-3-amonno-l-propansulfonát); a kationaktivní barvivo, např. Oxazin 750.
Ilustrativní reagenční směs/roztok pro tento vynález a vhodný pro použití v této metodě jc uveden v Tabulce 2. s příslušným rozpětím koncentrace pro každou složku a množstvím na 1 litr u každé složky. Finální pH směsi je přibližně 7,4 a konečná osmolalita je upravena buď pomocí roztoku NaCl nebo TDAPS, na hodnotu 292 ± 5 mOsm. Konečné pH je upraveno na příslušnou hodnotu, nejlépe 7,4 přidáním 1 N HC1 nebo 1 N NaOH, po kapkách.
Tabulka 2
Složky v reagenčním roztoku
TRIS
TRIS-HC1
NaCl
PROCLIN 300
TDAPS (zásobní roztok)* Oxazin 750 (zásobní roztok)** Deionizovaná voda
Rozmezí koncentrace složek množství na 1 litr 0,7-0,9 g 6,0 - 8,0 g
5,25 -7,30 g 0,15-0,35 ml
4.1 - 11,0 ml
2.2 - 6,6 ml na objem
Množství na 1 litr (preferované) . 0,806 g
6,83 g
6,40 g
0,25 ml
8,25 ml
3.3 ml
950 mí *; Img/ml TDAPS (n-tetradccyl-n,n-dimethyl-3-amonno-lpropansulfonát) v destilované vodě **: 14,82 mg barviva Oxazin 750 na 4,81 ml dimethylformamidu.
Obecně může mít reagenční roztok takové složení, aby udržoval pH reagenční směsi přibližně mezi 7,2 až 7,8, kdy 7,4 je preferovaná hodnota pH, s hodnotou osmolality přibližně od 250 mOsm do 320 mOsm, preferováno je přibližně od 287 mOsm do 297 mOsm, nejlépe okolo 292 ± 5 mOsm.
U reagenčních roztoků, které mají pH a osmolalitu v takovém rozmezí, jak bylo uvedeno výše, je koncentrace kationaktivního barviva, např. Oxazinu 750, požadovaná pro zabarvení RNA v rozmezí přibližně od 6 do 20 pg/ml, preferováno je od 6,5 pg/ml do 19,5 pg/ml, nejlépe od 9,0 pg/ml do 10,5 pg/ml. Zvýšené pronikání dosažené pomocí tlumícího roztoku má ten výsledek, že barvivo zabarví RNA v retikulocytech do 20 až 30 vteřin, nebo méně. Koncentrace barviva v reagenčním činidle u této metody minimalizuje zabarvení zralých erytrocytů jako retikulocytů, což vede ke dobré separaci signálu od šumu pozadí. Toto rychlé zabarvení díky optimalizovaným podmínkám reagenčního činidla předchází tomu, aby krevní vzorek byl inkubován v reagenčním činidle déle než asi 20 vteřin před tím, než proběhne analýza vzorku a metodu takto činí vysoce výhodnou, přijatelnou a kompatibilní pro plně automatizované hematologické metody.
Metoda a reagenční směs mohou být použité pro identifikaci a rozlišení retikulocytů ve vzorku čisté krve pomocí absorpční/rozptylové průtokové cytometrie. Metoda ve své nejširší aplikaci zahrnuje přidávání alikvotního množství čisté krve do reagenční směsi jak byla popsána pro použití u této metody. Po uplynutí inkubační doby po smíchání, která je kratší než 20 vteřin, je směs vzorek/reagenční činidlo pouštěn, po jednotlivých buňkách, skrz specifické snímací pole průtokového cytometru. Pomocí hydrodynamického zaostření procházejí jednotlivé buňky skrz snímací zónu, kde jsou osvětlovány zaostřeným světelným zdrojem o vhodné vlnové délce. U buněk, které po jedné procházejí, jsou měřeny alespoň dva signály rozptýleného světla a alespoň jeden • · · φ · φ· • · · φ ···* • · «4 ·· · ·· · • · « · · · • •α ·«·· ·· ··*· absorpční signál. Na základě těchto měření lze retikulocyty odlišit od erytrocytů.
Podle tohoto vynálezu jsou krevní destičky odlišovány od retikulocytů a červených krvinek ve vzorku podle velikosti a indexu lomu, což odděluje jejich signály od těch, které pocházejí od větších a lámavějších červených krvinek.
Když reakční směs (obsahující vzorek čisté krve a reagenční směs/roztok) prochází skrz snímací pole průtokového cytometru, je měřeno světlo rozptýlené přes dva úhlové intervaly a absorbované každou buňkou, takže erytrocyty mohou být odlišeny od retikulocytů a lze stanovit objem a koncentraci hemoglobinu u každého retikulocytů nebo erytrocytů. Krevní destičky zaujímají jinou oblast „prostoru'' rozptyl/rozptyl/absorpce: signály z této oblasti jsou započítány jako krevní destičky. Z naměřeného objemu a koncentrace hemoglobinu jednotlivých po sobě jdoucích buněk je vypočítán počet retikulocytů a erytrocytů a obsah hemoglobinu, průměrný objem buňky, průměrná korpuskulámí koncentrace hemoglobinu a průměrný buněčný hemoglobin u retikulocytů a erytrocytů
Podrobnější popis uvádí, že k provedení této metody bylo 2 μΙ alikvotního množství čisté krve odsáto automatizovaným hematologickým analyzačním přístrojem, např. TECHNICON H.3 Hematalogy Systém, který byl modifikován pokud jde software analýzy. Modifikace zahrnovaly odsátí čisté krve, které byla následně smíchána ve vlastním systému s reagenčním činidlem, spíše než odsátí zředěného vzorku, který již prošel 5-90 minutami reakce mimo systém. Také modifikovaná analýza poskytla absolutní počty červených krvinek a retikulocytů, stejně jako procentní množství retikulocytů, spíše než pouhé procentní množství retikulocytů. Dále metoda na základě tohoto vynálezu poskytla počty krevních destiček, hodnoty středního objemu destiček a sloupcové diagramy objemu destiček. Kanál pro retikulocyty v zařízení H.3 Hematalogy Systém tyto parametry neposkytuje * 4
Podle tohoto vynálezu byla alikvotní množství vzorku automaticky smíchána s reagenční směsí podle tohoto vynálezu a 20 vteřin stála. Poté byl smíchaný vzorek propouštěn skrz průtokovou komoru a poté byl vystaven působení buď heliově-neonového laserového zdroje nebo laserové diody a probíhala analýza červených krvinek, retikulocytů a krevních destiček.
Vynález odpovídajícím způsobem zahrnuje metody a reagenční činidla popsaná zde v tomto dokumentu v příkladech, rozsah vynálezu je indikován v patentových nárocích.
Příklady provedení vynálezu
Následující příklady uvádějí metodu a reagenční směs používanou v rámci této metody pro identifikaci retikulocytů, červených krvinek a krevních destiček a pro charakterizaci retikulocytů a červených krvinek pomocí technik absorpční/rozptylové průtokové cytometrie. Tam, kde to bylo možné, byly použity standardní komerčně dostupné reagenční materiály.
Příklad 1
Rychlá automatizovaná měření rozptylu a absorpce pro rozlišení retikulocytů a erytrocytů ve vzorku čisté krve pomocí metody a reagenční směsi podle tohoto vynálezu
Barvivo Oxazin 750 bylo uskladněno v zásobním roztoku 2,96 mg/ml η,η,-dimethylformamidu. Fungující reagenční činidlo bylo vytvořeno přidáním zásobního barviva do tlumícího roztoku, který obsahoval preferované složky a v preferovaných koncentracích uvedených v Tabulce 2. Konečná osmolalita a pH funkčního reagenčního činidla použitého v této studii byly 292 mmol/kg, resp. 7,4.
V tomto příkladu byio pro každý vzorek smícháno 2 μΐ čisté krve odsáté automatizovaným systémem s 625 μΐ reagenční směsi z Tabulky 2 a ponecháno 20 vteřin při pokojové teplotě a buňky ve směsi byly poté analyzovány prostřednictvím průtokové cytometrie zde popsané. Deset • to vzorků krve od normálních dárců („normální“) a deset náhodně vybraných krevních vzorků od pacientů nemocnice („abnormální“) bylo analyzováno kvůli procentnímu množství retikulocytů metodou podle tohoto vynálezu a ruční metodou. Každý vzorek byl duplikátně analyzován automatizovaným přístrojem (n = 40). Výsledky jsou graficky znázorněny na obrázku 3. Jak je vidět na obrázku 3, bylo průměrné procento retikulocytů 1,8 u automatizované metody a 1,7 u ruční metody. Korelační koeficient byl 0,87. Malý rozdíl mezi průměry a vysoký koeficient korelace dokazují, že 20 vteřinová automatizovaná metoda poskytuje přesné hodnoty pro procentní množství retikulocytů jak u normální, tak u abnormální vzorové populace.
Po dokončení analýzy byla prvotní data zobrazena ve formě cytogramu, kde je uveden červený rozptyl versus červená absorpce, např. obrázky IA a 1B. Rozdílné buněčné populace byly jasně vidět na základě rozptylových a absorpčních signálů svých částic. V těchto diagramech populace erytrocytů spadá do oblasti označené „RBCs“ na obrázku IA. Tyto buňky vykazují vysoké rozptylové signály a nízké absorpční signály buněk. Populace retikulocytů spadá do oblasti označené „retics“ včetně oblastí označených „L“, „M“ a „H“. Tyto buňky lze odlišit od zralých erytrocytů díky vyšším absorpčním signálům ze své RNA zabarvené Oxazinem 750. Populace krevních destiček leží v oblasti označené „PLTs“ a koincidenční signály jsou v příslušně označeném místě. Krevní destičky mají relativně nízké rozptylové signály ve srovnání s retikulocyty.
V závislosti na absorpční separaci mezi zralými erytrocyty a retikulocyty může být počet retikulocytů u vzorku pacientů stanoven prostřednictvím vytvoření elektronických „oken“, která definují oblasti rozptýleného světla a absorpce identifikující retikulocyty a erytrocyty. Je stanoven počet retikulocytů, zralých erytrocytů a krevních destiček, které spadají do každého „okna“ tak, aby poté mohlo být vypočítáno procentní • · · · * · · · * ·· toto to to to ·· ♦ · · ♦ to · to to > to to · ·♦· to · ·· to· ♦· ··· to to· to to · to ··· toto toto·· »· toto ** ·· množství retikulocytů, erytrocytů a krevních destiček v celkové buněčné populaci. Jsou také stanoveny absolutní počty červených krvinek, retikulocytů a krevních destiček, na základě známých faktorů zředění ve spojitosti s automatizovanými přístroji.
Referenční procentní množství retikulocytů v každém vzorku bylo stanoveno pomocí ručního mikroskopického postupu, který doporučuje Národní výborem pro klinické laboratorní standardy (National Committee for Clinical Laboratory Standarde - NCCLS). Při tomto postupu byl malý objem, např. 100 μΐ čisté krve smíchán se stejným objemem nové methylenové modři a tyto složky spolu reagovaly asi 15 minut při pokojové teplotě. Tato směs byla potom rozmazána na podložní mikroskopické sklíčko a procentní množství retikulocytů ve vzorku bylo spočítáno po prohlédnutí pod mikroskopem. Mikroskop byl vybaven olejovým objektivem 100X a okulárem 10X. Minimálně 1000 buněk bylo spočítáno pro každý vzorek pomocí Millerova kotouče vloženého do okuláru mikroskopu ke zlepšení přesnosti počítání. Každá červená krvinka obsahující dvě nebo více částic modrého materiálu byla označena jako retikulocyt.
Příklad 2
Určení červených krvinek a krevních destiček získaná na základě metody podle tohoto vynálezu
Byly provedeny pokusy, aby se prokázalo, že rychlá automatizovaná metoda podle tohoto vynálezu poskytuje přesné počty červených krvinek a krevních destiček, stejně jako počty retikulocytů. Deset čerstvých vzorků (tj. vzorků, které byly použity dříve než přibližně osm hodin po odběru) bylo odebráno od normálních dárců a analyzováno jak pomocí nové metody podle vynálezu, tak i pomocí standardního hematologického analyzátoru, např. hematologický analyzátor BAYER
H.3™. Každý krevní vzorek byl sledován duplicitní, šlo tedy o celkové množství dvaceti odsátí pro každou metodu. Výsledky těchto analýz jsou ·· · to • * to ·
uvedeny na obrázcích 4A a 4B. Výsledky ukazují, že počty získané novou a rychlou metodou vysoce korelují s těmi, které byly získány za pomoci standardní metody.
Příklad 3
Korekce dat absorpce kvůli pseudoabsorpci
Detekční optický subsystém zachycuje jak rozptýlené, tak i nerozptýlené světlo od buněk, které procházejí skrz laserový svazek v průtokové komoře. Buňky rozptylují světlo do všech směrů. Čočky s relativně vysokou číselnou aperturou (NA) v optickém systému, který popisují patenty USA č. 5,350, 695 a 5,438,003 udělené G.Colellovi a kolektivu, přijímají světlo, které je rozptýleno do kuželu, který je vystředěn na optické ose s polovičním úhlem až do 19,5 stupně. Takto je světlo, které je rozptýleno do úhlů větších než 19,5 stupně, ztraceno. Výsledek je ten, že když se pokoušíme měřit buněčnou absorpci, “jeví se“ zcela neabsorbující buňky jako buňky, které absorbují až několik procent dopadajícího světla, tj. jde o tzv. pseudoabsorpci. Měřená absorpce může být vyjádřena takto:
Absorpční = pseudo- + absorpce + absorpce hemoglobinem barvivém signál absorpce
Pseudoabsorpční signál zralých červených krvinek má typicky stejnou velikost jako skutečný absorpční signál ze zabarveného retikulocytů. Toto snižuje na absorpčním cytogramu stupeň separace zabarvených retikulocytů od nczabarvených červených krvinek. Signál do šumového poměru absorpčního kanálu může být vylepšen korekcí signálu, aby došlo k odstranění složek pseudoabsorpce a hemoglobinové absorpce z každého absorpčního signálu červené krvinky a retikulocytů. Množství pseudoabsorpce a absorpce hemoglobinem lze vypočítat pro každou danou buňku pomocí známé teorie rozptylu světla podle Mieho, která je popsána ve výše uvedeném Tyčkově patentu. Účinný průřez rozptylu pro úhlové intervaly 19,5° až 180° plus složka absorpce hemoglobinem, S3, může být vypočten následovně:
S3 = π a2 Qext - S (λ, ns, Θ3, δ θ.ύ v, HC) kde a je poloměr zakulacené buňky, λ je excitační (nebo osvětlující) vlnová délka , ns je index lomu vzorového proudu a pláště, Qext je extinkční účinnost buňky a pro případ pseudoabsorpce, Θ3 = 0° a δ Θ3 = 19,5°. Hodnoty S3 byly uspořádány do tabulky pro všechny očekávané hodnoty V a HC.
Korekce pseudoabsorpce se provádí následovně: V a HC musí být nejdříve určeny ze dvou rozptylových signálů od buňky z cytogramu rozptyl-rozptyl, jak popisuje Tyčko. S3 je poté zjištěn ve vyhledávací tabulce pro naměřené hodnoty V a HC, a odečten od hodnoty naměřené v absorpčním kanále. Výsledkem je skutečná absorpce způsobená zabarvením buňky. Naměřený absorpční signál může být upraven pomocí následujícího vztahu, aby byla pro každou buňku ponechána pouze absorpce barvivém:
Absorpce = absorpční - absorpce - pseudo = absorpční - S3 barvivém signál hemoglobinem absorpce signál
Pro všechna data je upravená hodnota substituována za parametr prvotních dat před stanovením prahu a označením indikátory. Všechny předměty, jejichž červené parametry rozptylu se neobjeví na mapě V-HC jsou ve schématu datové analýzy ignorovány. Tato data jsou poté opět zobrazena u červeného cytogramu rozptyl versus absorpce a odrážejí opravené hodnoty.
Vzhledem k výše uvedenému bude zřejmé, že je dosaženo několika cílů vynálezu a získali jsme další příznivé výsledky.
Protože lze provést nejrůznější změny ve výše uvedených konstrukcích a metodách bez odchýlení se od rámce tohoto vynálezu, je určeno, že všechny záležitosti obsažené ve výše uvedeném popisu, nebo uvedené na doprovodných nákresech budou interpretovány jako ilustrativní, a to nikoliv ve smyslu limitujícím. Například frakcionované vzorky krve mohou být zpracovávány podobně.
• 44 ·· ·· 44 4«
· · 4 * 4 • · 4 4 4 •
• 4 • 4 ··· • ·
• 4 4 • 4 • 4 • ··· • •
• 4 • 4 • 4 4 • 4
··· «444 44 ·· • 4 4 ·
Obsah všech patentových přihlášek, vydaných patentů, články, reference, texty a podobně, které jsou citovány v tomto dokumentu, jsou zde tímto pomocí odkazů začleněny ve své celistvosti, aby tak mnohem úplněji podaly popis stavu v oboru, kterého se týká tento vynález.

Claims (42)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Rychlá metoda analýzy krevního vzorku, pomocí které jsou retikulocyty, erytrocyty a krevní destičky identifikovány, kvantifikovány a rozlišeny od ostatních podtříd buněk ve vzorku čisté krve pomocí průtokové cytometrie založené na rozptylu a absorpci světla prostřednictvím automatizovaného hematolog!ckého analyzátoru, a která zahrnuje následující kroky :
    (a) příprava reakčni směsi obsahující alikvotní množství uvedeného krevního vzorku a vodnou reagenční směs, kde uvedená reagenční směs obsahuje roztok obsahující kationaktivní barvivo v množství přibližně od 6 do 20 pg/ml; povrchově aktivní látku s obojetným iontem jako sférické činidlo v množství přibližně od 4,0 do 148,0 pg/ml; tlumící roztok pro udržení pH uvedené směsi v hodnotě přibližně od 7,2 do 7,8; kde uvedená reagenční směs a uvedené alikvotní množství krevního vzorku v uvedené reakčni směsi neprocházejí předběžnou inkubací ani spolu nereagují po dobu delší než 20 vteřin před tím, než proběhne uvedená analýza vzorku v uvedeném automatizovaném analyzátoru;
    (b) průchod uvedené směsí z kroku (a) po jednotlivých buňkách skrz oblast soustředěného optického osvětlení;
    (c) detekce a měření světla rozptýleného do dvou úhlových intervalů a světla absorbovaného každou buňkou; a (d) rozlišení a získání počtů buněk uvedených podtříd retikulocytů, erytrocytů a krevních destiček, alespoň částečně na základě měřených velikostí uvedeného rozptýleného a absorbovaného světla; kde uvedený krevní vzorek je analyzován asi ve 20 až 30 vteřinách.
  2. 2. Metoda podle patentového nároku 1, kde uvedené kationaktivní barvivo je přítomno v uvedené reagenční směsi z kroku (a) v množství přibližně od 9 pg/ml do 10,5 pg/ml.
  3. 3. Metoda podle patentového nároku 1, kde uvedeným kationaktivním barvivém je Oxazíne 750 mající vzorec :
    • 0# *0 • 0 00 »0 ·· · 0 • · • • 0 • • * • 0 ·*· 0 • • 0 • 0 · 0 0 • 0 • ·* 0 0 • · • 0 • · • • • 0* 00·· 00 «0 ·· • 0
  4. 4. Metoda podle patentového nároku 1, kde pH uvedené reagenční směsi z kroku (a) je přibližně 7,3 až 7,5.
  5. 5. Metoda podle patentového nároku 4, kde pH uvedené reagenční směsi je 7,35 až 7,4.
  6. 6. Metoda podle patentového nároku 1, kde uvedené sférické povrchově aktivní činidlo s obojetným iontem v uvedené reagenční směsi z kroku (a) je vybráno zc skupiny zahrnující lauramidopropylbetaine, n - tetradecyl -n,n- dimethyl - 3 - amonno - 1 propansulfonát, n - dodecy! -n,n- dimethyl - 3 - amonno - l propansulfonát, kokoamidopropylbetaine a kokoamidosulfobetain,
  7. 7. Metoda podle patentového nároku 6, kde uvedeným povrchově aktivním činidlem je n-tctradecyl-n, n-dimcthyl-3-amonno-lpropansulfonát.
  8. 8. Metoda podle patentového nároku 7, kde uvedená povrchově aktivní látka je v reagenční směsi přítomna v množství přibližně od 4,0 do 11,0 pg/ml.
  9. 9. Metoda podle patentového nároku 1, kde uvedená reagenční směs z kroku (a) dále obsahuje sůl alkalického kovu.
  10. 10. Metoda podle patentového nároku 9, kde uvedená reagenční směs z kroku (a) dále obsahuje chlorid sodný nebo chlorid draselný.
  11. 11. Metoda podle patentového nároku 1, kde uvedená reagenční směs z kroku (a) dále obsahuje antimikrobiální sloučeninu.
  12. 12. Metoda podle patentového nároku 11, kde uvedená antimikrobiální sloučenina je vybrána ze skupiny zahrnující 2-methyl-4isothiazolin-3-jeden (Proclin 150); 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3jeden (Proclin 300); (n,n’-methylenbis[nM(hydroxymethyl)-2,5-dioxo4-imidazolidinyl] močovina (Germall 115); l-(3-chloraiiyi)-3,5,7-triaza1-azoniaadamantanchlorid (Dowacil 200); a 2-bromo-2-nitropropan-l, 3diol (CjHůBrNCh) (Bronopol).
    » · · 44 • 4 44 4· > * * 4 4 4 4 • 4 4 4 * 4 • 4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 * · 4 4 · 4 4*4 4 4 4 4 4 • 4 * • 4 4 44 · 4 4 4 4 4 4 *4 44 • 4
  13. 13. Metoda podle patentového nároku 1, kde osmolarita reagenční směsi podle kroku (a) je přibližně 250 až 300 miliosmolů.
  14. 14. Metoda podle patentového nároku 13, kde osmolarita reagenční směsi podle kroku (a) je přibližně 287 až 297 miliosmolů.
  15. 15. Metoda podle patentového nároku 14, kde osmolarita reagenční směsi podle kroku (a) je přibližně 292 ± 5 miliosmolů.
  16. 16. Metoda podle patentového nároku 1, kde uvedený vzorek je analyzován přibližně do 20 vteřin.
  17. 17. Metoda podle patentového nároku 1. kde uvedený krok detekce a měření (c) zahrnuje zachycení uvedeného rozptýleného a absorbovaného světla pomocí sběrné optiky, která zahrnuje aperturu, a krok (d) zahrnuje korekci velikosti absorpčního signálu, který obsahuje pseudoabsorpční složku, aby byla odstraněna tato pseudoabsorpční složka vznikající následkem světla rozptýleného mimo aperturu sběrné optiky.
  18. 18. Metoda podle patentového nároku 1, kde uvedenou podtřídou buněk jsou erytrocyty.
  19. 19. Metoda podle patentového nároku 1, kde uvedenou podtřídou buněk jsou retikulocyty.
  20. 20. Metoda podle patentového nároku 1, kde uvedenou podtřídou buněk jsou krevní destičky.
  21. 21. Metoda podle patentového nároku 1, dále obsahující krok:
    (e) stanovení počtu, objemu, koncentrace hemoglobinu a koncentrace RNA u uvedených retikulocytů nebo erytrocytů na základě měřených velikostí uvedeného rozptýleného nebo absorbovaného světla.
  22. 22. Metoda podle patentového nároku 1, kde uvedené optické osvětlení v kroku (b) má excitační vlnovou délku v červené části spektra.
  23. 23. Metoda podle patentového nároku 1, kde uvedená reagenční směs podle kroku (a) dále obsahuje alespoň jeden nukleofil.
    • ·* ·« ·· ·· ·· · · • * • * « ·· * • · • · • · » · • · • ··· • • Φ · * · • · • • • ·*· ···· ·· ·· ··
  24. 24. Metoda podle patentového nároku 23, kde uvedeným nukleofilem je azid (NV) nebo iont kyanátu (OCN’).
  25. 25. Metoda podle patentového nároku 23, kde uvedený nukleofil je přítomen v uvedené reagenční směsi v koncentraci přibližně 20mM.
  26. 26. Metoda podle patentového nároku 1, kde v kroku c) dva úhlové intervaly jsou 1 až 3 stupně, resp. 4 až 20 stupňů.
  27. 27. Metoda podle patentového nároku 26, kde v kroku c) dva úhlové intervaly jsou 2 až 3 stupně, resp. 5 až 15 stupňů.
  28. 28. Reagenční směs pro rychlou identifikaci a charakterizaci retikulocytů, erytrocytů a krevních destiček ve vzorku čisté krve do méně než 30 vteřin prostřednictvím automatizovaného hematologického analyzátoru, který obsahuje ve vodné příměsi: kationaktivní barvivo v množství přibližně 6 pg/ml až 20 pg/ml; povrchově aktivní látku s obojetným iontem jako sférické činidlo v množství přibližně od 4 pg/ml do 148 pg/ml; tlumící roztok pro udržení pH uvedené směsi na hodnotách přibližně 7,2 až 7,8 a osmolaritu přibližně na hodnotách 250 mOsm až 300 mOsm.
  29. 29. Reagenční směs podle patentového nároku 28, kde uvedeným kationaktivní barvivo je ve směsi přítomno v koncentraci přibližně 9,0 až 10,5 pg/ml.
  30. 31.Reagenční směs podle patentového nároku 28, kde uvedené povrchově aktivní sférické činidlo s obojetným iontem je vybráno ze skupiny obsahující lauramidopropylbetaine, n-tetradecyl-n,n-dimethyl-3amonno-l-propansulfonát, n - dodecyl -n.n- dimethy! - 3 - amonno-1propansulfonát, kokoamidopropylbetaine a kokoamidosulfobetain.
    • ♦· ·· ··
    9* ♦ · · · 9
    9 9 · 9 *··
  31. 32. Reagenční směs podle patentového nároku 31, kde uvedeným povrchově aktivním činidlem s obojetným iontem je n-tetradecyl-n,ndimethyl-3-amonno-l-propansulfonát.
  32. 33. Reagenční směs podle patentového nároku 28, kde uvedené povrchově aktivní činidlo je v reagenční směsi přítomno v množství přibližně 4,0 až 11,0 pg/ml.
  33. 34. Reagenční směs podle patentového nároku 28, dále obsahující sůl alkalického kovu.
  34. 35. Reagenční směs podle patentového nároku 34, kde uvedenou solí alkalického kovu je chlorid sodný nebo chlorid draselný.
  35. 36. Reagenční směs podle patentového nároku 28, dále obsahující antimikrobiální sloučeninu.
  36. 37. Reagenční směs podle patentového nároku 36. kde uvedená antimikrobiální sloučenina je vybrána ze skupiny zahrnující 2-methyl-4isothiazolin-3-jeden (Proclin 150); 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3jeden (Proclin 300); (n,n’-methylenbis[n’-l-(hydroxymethyl)-2,5-dioxo4-imidazolidinyl] močovina (Germall 115); l-(3-chlorallyl)-3,5,7-triaza1 -azoniaadamantanchlorid (Dowacil 200); a 2-bromo-2-nitropropan-l, 3diol (CaHůBrNOí) (Bronopol).
  37. 38. Reagenční směs podle patentového nároku 28, kde pH se pohybuje přibližně od 7,3 do 7,5.
  38. 39. Reagenční směs podle patentového nároku 38, kde pH se pohybuje od 7,35 do 7,4.
  39. 40. Reagenční směs podle patentového nároku 28, jejíž osmolarita je přibližně 292 ± 5 miliosmolů.
  40. 41. Reagenční směs podle patentového nároku 28, dále obsahující alespoň jeden nukleofil.
  41. 42. Reagenční směs podle patentového nároku 41, kde uvedeným nukleofilem je azid (N/) nebo iont kyanátu (OCN’).
  42. 43.Reagenční směs podle patentového nároku 41, kde uvedený nukleofil je přítomen v koncentraci přibližně 20 mM.
CZ981000A 1997-04-03 1998-04-02 Způsob rychlé automatizované identifikace a charakterizace reticulocytů erythrocytů a destiček v krvi, a činidlo pro tento způsob CZ100098A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/833,033 US6114173A (en) 1997-04-03 1997-04-03 Fully automated method and reagent composition therefor for rapid identification and characterization of reticulocytes erythrocytes and platelets in whole blood

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ100098A3 true CZ100098A3 (cs) 1998-10-14

Family

ID=25263246

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ981000A CZ100098A3 (cs) 1997-04-03 1998-04-02 Způsob rychlé automatizované identifikace a charakterizace reticulocytů erythrocytů a destiček v krvi, a činidlo pro tento způsob

Country Status (10)

Country Link
US (1) US6114173A (cs)
EP (1) EP0869347A3 (cs)
JP (1) JPH10282094A (cs)
AU (1) AU750108B2 (cs)
BR (1) BR9806478A (cs)
CA (1) CA2232163A1 (cs)
CZ (1) CZ100098A3 (cs)
HU (1) HUP9800761A3 (cs)
IL (1) IL123717A (cs)
PL (1) PL325686A1 (cs)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6060322A (en) * 1998-10-20 2000-05-09 Coulter International Corp. Method for identification of reticulated cells
AU775260B2 (en) * 1999-03-31 2004-07-29 Bayer Corporation Single channel, single dilution detection method
JP3817091B2 (ja) * 1999-07-02 2006-08-30 テルモ株式会社 細胞数測定装置
US6623972B2 (en) * 2000-06-09 2003-09-23 Bayer Corporation Automated method for detecting, quantifying and monitoring exogenous hemoglobin in whole blood, plasma and serum
US20030027347A1 (en) * 2001-05-25 2003-02-06 Phyllis Shapiro Automated method for correcting blood analysis parameter results affected by interference from exogenous blood substitutes in whole blood, plasma, and serum
US20100160445A1 (en) * 2002-01-17 2010-06-24 Carlson Paul E Synergistic Mixtures of OPP and DGH
US7262222B2 (en) * 2002-01-17 2007-08-28 Verichem, Inc. Synergistic mixtures of o-phenylphenol and other nitrogen and aldehyde microbiocides
FR2840995B1 (fr) * 2002-06-18 2004-09-03 Hemosystem Procede de denombrement de plaquettes en phase solide
US6916662B2 (en) * 2003-01-31 2005-07-12 Abbott Laboratories Performance improvement for hematology analysis
WO2004106535A2 (en) * 2003-05-27 2004-12-09 Pointcare Technologies, Inc. Enhanced cellular assay method for use in flow cytometry or similar instruments using optically resonant particles
US7425421B2 (en) 2003-06-26 2008-09-16 Litron Laboratories, Ltd. Method for the enumeration of micronucleated erythrocyte populations while distinguishing platelets and/or platelet-associated aggregates
JP4417143B2 (ja) * 2004-03-11 2010-02-17 シスメックス株式会社 試料分析装置、プログラムおよびそのプログラムを記録した記録媒体
US7541190B2 (en) * 2005-02-07 2009-06-02 Beckman Coulter, Inc. Method of measurement of cellular hemoglobin
US7609369B2 (en) * 2005-09-24 2009-10-27 Beckman Coulter, Inc. Methods of detection of iron deficiency and hemochromatosis
US7344890B2 (en) * 2005-11-09 2008-03-18 Beckman Coulter, Inc. Method for discriminating platelets from red blood cells
JP4794414B2 (ja) * 2006-10-30 2011-10-19 シスメックス株式会社 血小板測定用試薬、血小板測定用試薬キット並びに血小板測定方法
US20080102526A1 (en) 2006-10-30 2008-05-01 Sysmex Corporation Reagent, reagent kit and analyzing method
CN101349644B (zh) * 2007-07-20 2012-06-27 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 一种白细胞分类试剂和其使用方法
US8102161B2 (en) * 2007-09-25 2012-01-24 Tdk Corporation Stable output in a switching power supply by smoothing the output of the secondary coil
CN101475754A (zh) * 2008-01-04 2009-07-08 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 不对称菁类荧光染料,组合物及在生物样品染色中的用途
ES2535012T3 (es) 2008-02-18 2015-05-04 Sysmex Corporation Reactivo para la medición de plaquetas, kit de reactivos para la medición de plaquetas, y método de medición de plaquetas
CN101602762B (zh) * 2008-06-10 2013-10-16 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 不对称菁类化合物、其制备方法及应用
CN101726579B (zh) * 2008-10-17 2014-06-18 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 血液检测试剂和方法
CN101750274B (zh) * 2008-12-17 2014-06-25 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 白细胞分类计数试剂、试剂盒以及白细胞分类计数的方法
JP4969596B2 (ja) * 2009-02-04 2012-07-04 シスメックス株式会社 試料分析装置、試料分析方法およびプログラム
US8906309B2 (en) * 2009-04-27 2014-12-09 Abbott Laboratories Method for discriminating red blood cells from white blood cells by using forward scattering from a laser in an automated hematology analyzer
CN101988082B (zh) * 2009-07-31 2015-04-08 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 白细胞分类计数试剂、试剂盒及其制备方法和白细胞分类计数的方法
WO2011072396A1 (en) 2009-12-18 2011-06-23 Fpinnovations An on-line macrocontaminant analyser and method
US8906308B2 (en) 2010-01-15 2014-12-09 Abbott Laboratories Method for determining volume and hemoglobin content of individual red blood cells
DE102011003101B4 (de) 2010-12-23 2016-04-07 Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh Verfahren zum Nachweis einer Plasmodieninfektion
CN104215562A (zh) * 2013-05-31 2014-12-17 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 粒子分析仪的光学系统
JP6170865B2 (ja) * 2014-03-31 2017-07-26 シスメックス株式会社 血液分析装置
CA3022798A1 (en) * 2016-05-04 2017-11-09 LabThroughput LLC System and method for distinguishing blood components
CN109682796A (zh) * 2017-10-02 2019-04-26 爱科来株式会社 糖化蛋白质的测定
WO2019206300A1 (zh) 2018-04-28 2019-10-31 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 一种血液检测方法及血液分析系统
CN111044718B (zh) * 2019-12-20 2022-05-17 北京指真生物科技有限公司 一种全血的免疫发光分析用稀释液及其分析方法
CN111721950A (zh) * 2020-05-29 2020-09-29 迪瑞医疗科技股份有限公司 一种稳定的有形成分分析聚焦液及其制备方法
CN115541860A (zh) * 2021-06-30 2022-12-30 深圳市瑞图生物技术有限公司 血液溯源方法
CN113654955A (zh) * 2021-09-18 2021-11-16 迪瑞医疗科技股份有限公司 用于网织红细胞计数与分类及光学血小板计数的试剂盒
EP4365570A1 (en) * 2022-11-04 2024-05-08 Horiba, Ltd. Measurement method, measurement system, and test reagent kit

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3684377A (en) * 1970-07-13 1972-08-15 Bio Physics Systems Inc Method for analysis of blood by optical analysis of living cells
US3883247A (en) * 1973-10-30 1975-05-13 Bio Physics Systems Inc Method for fluorescence analysis of white blood cells
US4336029A (en) * 1980-08-15 1982-06-22 Ortho Diagnostic Systems Inc. Method and reagents for quantitative determination of reticulocytes and platelets in whole blood
US4325706A (en) * 1980-08-15 1982-04-20 Ortho Diagnostic Systems Inc. Automated detection of platelets and reticulocytes in whole blood
US4412004A (en) * 1981-06-26 1983-10-25 Technicon Instruments Corporation Method for treating red blood cells to effect sphering and reagent therefor
US4735504A (en) * 1983-10-31 1988-04-05 Technicon Instruments Corporation Method and apparatus for determining the volume & index of refraction of particles
US4575490A (en) * 1984-02-29 1986-03-11 Technicon Instruments Corporation One step method for sphering and fixing whole blood erythrocytes
US4707451A (en) * 1985-09-18 1987-11-17 Becton, Dickinson And Company Detection of reticulocytes
US4883867A (en) * 1985-11-01 1989-11-28 Becton, Dickinson And Company Detection of reticulocytes, RNA or DNA
JP2549665B2 (ja) * 1987-07-31 1996-10-30 東亜医用電子株式会社 フロ−サイトメトリ用網状赤血球測定試薬
JPH0746102B2 (ja) * 1987-07-31 1995-05-17 東亜医用電子株式会社 フロ−サイトメトリ用網状赤血球測定試薬
US5075556A (en) * 1989-12-01 1991-12-24 Technicon Instruments Corporation Acridine orange derivatives and their use in the quantitation of reticulocytes in whole blood
US5284771A (en) * 1991-12-05 1994-02-08 Miles Inc. Reagent compositions and their use in sphering cells
US5360739A (en) * 1991-12-05 1994-11-01 Miles Inc. Methods for the identification and characterization of reticulocytes in whole blood
US5350695A (en) * 1991-12-05 1994-09-27 Miles Inc. Methods for the identification and characterization of reticulocytes in whole blood
US5631165A (en) * 1994-08-01 1997-05-20 Abbott Laboratories Method for performing automated hematology and cytometry analysis
US5691204A (en) * 1995-04-21 1997-11-25 Abbott Laboratories Compositions and methods for the rapid analysis of reticulocytes
US5830764A (en) * 1996-11-12 1998-11-03 Bayer Corporation Methods and reagent compositions for the determination of membrane surface area and sphericity of erythrocytes and reticulocytes for the diagnosis of red blood cell disorders

Also Published As

Publication number Publication date
AU5942198A (en) 1998-10-08
IL123717A (en) 2000-02-17
IL123717A0 (en) 1998-10-30
EP0869347A2 (en) 1998-10-07
HUP9800761A2 (hu) 1999-02-01
EP0869347A3 (en) 2000-02-23
HUP9800761A3 (en) 2001-01-29
JPH10282094A (ja) 1998-10-23
AU750108B2 (en) 2002-07-11
HU9800761D0 (en) 1998-05-28
CA2232163A1 (en) 1998-10-03
BR9806478A (pt) 2000-04-11
US6114173A (en) 2000-09-05
PL325686A1 (en) 1998-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU750108B2 (en) Fully automated method and reagent composition therefor for rapid identification and characterization of reticulocytes, erythrocytes and platelets in whole blood
AU775260B2 (en) Single channel, single dilution detection method
KR100258394B1 (ko) 전혈 속의 망상 적혈구를 동정하고 특성화하는 방법 및 이에 사용하는 시약 조성물
EP0545314B1 (en) Reagent compositions and their use in the identification and characterization of reticulocytes in whole blood
US5633167A (en) Reagent compositions for use in sphering cells
EP1131629B1 (en) Reagent composition and method for identification of reticulated cells
US4882284A (en) Method for quantitating and differentiating white blood cells
US5773299A (en) Methods for the rapid analysis of the reticulocytes
EP2798087B1 (en) Cellular analysis of body fluids
JP2001524665A (ja) 赤芽球の識別方法
Davis et al. Clinical flow cytometric reticulocyte analysis

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic