JPH0746102B2 - フロ−サイトメトリ用網状赤血球測定試薬 - Google Patents

フロ−サイトメトリ用網状赤血球測定試薬

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JPH0746102B2
JPH0746102B2 JP19241487A JP19241487A JPH0746102B2 JP H0746102 B2 JPH0746102 B2 JP H0746102B2 JP 19241487 A JP19241487 A JP 19241487A JP 19241487 A JP19241487 A JP 19241487A JP H0746102 B2 JPH0746102 B2 JP H0746102B2
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Description

【発明の詳細な説明】 (産業上の利用分野) 本発明はフローサイトメトリ用網状赤血球測定試薬に関
する。より詳細には本発明は炭酸塩を含むことを特徴と
する上記試薬に関する。

(従来の技術) 血液中の未成熟の赤血球は網状赤血球(レチクロサイ
ト、Reticulocyto)と呼ばれ、全赤血球数中に通常0.7
〜2.2%含まれる。網状赤血球数を測定することは急性
内出血、溶血性貧血、再生不良性貧血その他の疾病の診
断を裏付けること、あるいは薬剤投与後の経過を監視す
ること等に役立ち、臨床検査分野において重要視されて
いる。

上記網状赤血球の計数には、従来からメニューメチレン
ブルー、ブリリアントクレシルブルー等の塩基性試料に
より染色された塗抹血液試料を観察し、発色して見られ
る網状赤血球の全赤血球数中に占める割合を求める方法
が用いられていた。

この方法は、染色等の血液試料の前処理および染色後の
目視算定に多大な時間と労力を要し、検体数の多い場合
には不適当なものであった。

そのためフローサイトメトリを利用し網状赤血球計数を
自動化する方法がいくつか提案されている。たとえば、
特開昭61−280565号公報および特開昭62−34058号公報
には、オーラミンO(Auramine O)を含有する螢光染色
試薬を用いフローサイトメトリにより網状赤血球を計数
する方法が示されている。

(発明が解決しようとする問題点) 本発明者らは上記先行文献である特開昭61−280565号公
報及び特開昭62−34058号公報に記載のオーラミンOの
効果をしらべるために、その染色液の一例として下記組
成の試薬を使用してフローサイトメトリによる網状赤血
球測定を次のように行なった: オーラミンO 500ppm エチレングリコール 2.5V/V% ヘペス・水酸化ナトリウム 20mM NaCl 120mM 測定は適切に感度調整されたフローサイトメトリの装置
を用いて、同一血液検体について連続12回行った。毎回
の測定の約20秒前に検体を容れた試料容器を転倒撹拌
し、測定直前に試料容器の栓を開け、中の試料を400μ
ずつ吸引した。

2検体についての測定結果を第1図に示す。2検体と
も、測定を重ねるごとに網状赤血球数(Ret%)が低下
していくことが判明した。この様な状態では、正確な網
状赤血球数を得ることは期待できない。

ところで、上記の測定では全自動のフローサイトメトリ
の装置を使用したため毎回400μという大量の血液を
必要としたが、手動で血液を染色したのちフローサイト
メトリで測定する場合には10μ程度の血液が必要とさ
れるだけである。このように10μずつ血液を吸引する
場合には、第1図に示したような網状赤血球数(%)の
顕著な変化は起らない。仮に非特異染色が起って螢光強
度が全体に上がった場合においても、その状態で装置の
感度調整をしている限りは、ほぼ正しい網状赤血球数
(%)が計数される。

すなわち、非特異染色は毎回大量の血液を吸引して同一
検体を連続測定した場合に限り起る現象である。

(問題を解決するための手段) 上記非特異的染色の問題を明確にするために、さらに次
のような実験を行なった。同一検体を3つに分割し、第
1の試料は試料容器中に密閉して保管し、第2の試料は
試料容器の栓をとり大気中に開放しておき、第3の試料
は試料容器の栓をとりCO2雰囲気中に開放しておき、一
定時間経過後、上記オーラミンO染色液を用いてフロー
サイトメトリにより測定した。その結果を第2(a)、
2(b)、2(c)図に示す。

各図において横軸は螢光相対強度を、縦軸は、前方散乱
光相対強度を表わし、各点は各細胞に対応する。図中の
Aは網状赤血球として識別される領域を、Bは赤血球と
して識別される領域を、Cは血小板として識別される領
域を表わす。第2(a)図は密閉容器中に保管した場合
のものであり、第2(b)図は大気中に開放した場合の
もの、第2(c)図はCO2雰囲気中に開放した場合のも
のである。網状赤血球領域Aにおいてカウントされた細
胞数は、第2(a)図の場合が164、第2(b)図の場
合が145、第2(c)図の場合が2579である。第2
(c)図の場合には、赤血球も螢光染色され(非特異染
色)、網状赤血球として誤ってカウントされていること
がわかる。

上記現象および問題点の原因は以下のように説明され
る。

一般に赤血球中には▲HCO- 3▼、CO2が存在している。こ
の赤血球内の▲HCO- 3▼、CO2は血液(血漿)中の陰イオ
ンと平衡関係にある。以下、▲HCO- 3▼とCO2とをまとめ
てCO2と表記する。

仮に、血漿中のCO2濃度が変動すると赤血液中のCO2濃度
もそれに応じて同方向へ変動する。血漿中のCO2濃度は
その血液が共存している雰囲気中のCO2と平衡関係にあ
り、雰囲気のCO2濃度と同じ方向へ変動する。従って、C
O2に富んだ雰囲気中に放置された血液中の赤血球はCO2
に富み、密閉されCO2を少量しか含まない空気(CO2濃度
0.03%)中に保管された血液中の赤血球の中のCO2は減
少する。

染色液中の赤血球も上記と同様のイオン交換反応を行な
う。この状態は以下の様に場合分けされる。

(A) 染色液中のCO2の方が赤血球中よりも多い場
合。

このときは、赤血球中のCO2が増加する。

(B) 染色液中のCO2の方が赤血球中よりも少い場
合。

このときは、赤血球中のCO2が減少し、染色液中の他の
陰イオンと交換される。

さらに、上記(B)の状態は2通にり場合分けされる。

(B1) 染色液がCl-等のハロゲンイオンを含む場合。

このときは、赤血球中のハロゲンイオンが増加する。

(B2) 染色液がハロゲンイオンを含まない場合。

このときは、赤血球中のハロゲンイオンは変化なく、他
の陰イオンが増加する。

赤血球中の上記Cl-等のハロゲンイオンの量は、赤血球
の形態、染料の膜透過性に多大な影響を与える。したが
って、上記(B1)の場合には、染料の取り込み易さや、
赤血球の形が変化する。

一般的には空気中のCO2濃度の方が血球中よりも低い。
したがって血液を空気中に放置した場合には、赤血球中
から空気中へCO2が移動する。密閉した容器内に血液を
保管した場合には、一定の平衡状態に達するまで、赤血
球中から空気中へとCO2が移動する。途中で容器の栓を
開放した場合には、容器内の空気が入れ換えられ、再び
赤血球中から空気中へCO2が移動する。また、栓を開放
するごとに所定量の血液を抜いていくと、容器内の血液
量がしだいに減少し、そのため容器内の空気の量は増大
し容器内は、実質的に大気開放の状態に近づいていく。
このため、赤血球中のCO2の濃度は、血液を空気中に放
置した場合と同レベルにまで減少していく。

前記第1図に示した試薬の場合には、密閉容器の栓を開
放する度に400μの血液を吸引し、フローサイトメト
リ装置による測定に供した。密閉容器中に当初約10ml容
れらていた血液量はこのため急激に減少していき、赤血
球中のCO2量は急激に減少したであろう。このように赤
血球中のCO2量が減少した血液を前記オーラミンO染色
液で染色した場合には、むしろ染色液の方から赤血球中
へCO2が移動するので、染色液中にハロゲンイオンが存
在している場合でもハロゲンイオンは赤血球中へ移動し
ない。

これに対し、容器中に入れられた当初の血液の赤血球中
のCO2量は、染色液中のCO2量よりもはるかに多く、この
血液を上記オーラミンO染色液で染色した場合には、赤
血球中から染色液中へCO2が移動する。このときCO2と交
換に染色液中のハロゲンイオンが赤血球中へ移動する。
上記オーラミンO染色液はCl-イオンを含むので、Cl-
オンが赤血球中へ移動する。すなわち上記(B1)の状態
となる。

このように、赤血球中にCl-イオンを多く含むと、本来
特異的に染色される網状赤血球の他に、成熟赤血球も染
色(非特異染色)されるようになる。このためフローサ
イトメトリにおいては、成熟赤血球の一部も網状赤血球
として誤計数される。第1図で、初期の数回の測定にお
いて、網状赤血球数が異常に高くなっているのは、この
ためである。測定を重ねるごとに網状赤血球数は正常な
値へ安定していく。

また第2(c)図のようにCO2雰囲気中に血液を放置し
た場合には、赤血球中へ多量のCO2が移動する。この赤
血球を上記染色液で染色すると、赤血球中のCO2が多量
に染色液中へ移動し、染色液中からは多量のCl-イオン
が赤血球中へ移動する。Cl-が移動すると螢光染料も赤
血球中へ移動する。このため赤血球の非特異染色が強く
起り、網状赤血球として誤計数される赤血球が異常に増
大する。また、前方散乱光強度分布も第2(c)図では
変化している。これは、赤血球の形態が変化したためで
ある。

なお、上記非特異染色は、成熟赤血球内への染料の取り
込み量の変化あるいは赤血球膜上への染色の付着量の変
化の結果として現われるものである。

ところで、この非特異染色の程度は検体によって異る。
これは、赤血球のCO2量に個人差があり、このCO2量が血
液PH(通常7、4)の保持に関与しているためである。

また、上述の問題はオーラミンO染色液においてのみ起
るものではなく、この種の生体染色を行なう染料全てに
起り得るものである。

そこで、本発明においては炭酸塩含むことを特徴とする
フローサイトメトリ用網状赤血球測定試薬が提供され
る。

該炭酸塩は水性媒体中で▲HCO- 3▼を供与し得るもので
あって、NaHCO3が好ましい。

炭酸塩濃度は試薬中1〜300mMであることが好ましい。

(作 用) 血液中のCO2濃度以上に染色液中にCO2を入れることによ
り、上記染色液で染色しとき、染色液中から赤血球中へ
CO2が移動する。この場合には、仮に染色液中にハロゲ
ンイオンが存在していても赤血球中へは移動しない。ま
た、赤血球中にもともと存在していたハロゲンイオンは
染色液中へ移動するため、赤血球の放置状態の差によっ
て大きくその程度が変動する非特異染色は起らない。

(実験例) 本発明は以下の実施例によりさらに詳しく説明 実施例1 表1に示す7種類の組成の試薬を用いて測定を行なっ
た。

(i)の試薬は従来の組成のものである。(ii)の試薬
は従来の試薬のNaClの量を半分にし、NaHCO3を加えたも
の。(iii)の試薬は従来の試薬からNaClを完全に抜きN
aHCO3を加えたもの。(iv)の試薬はNaClを完全に抜き
ヘペス(HEPES)緩衝液を増量したもの。(v)の試薬
はNaClを完全に抜きNaBrを加えたもの。(vi)の試薬は
NaClを完全に抜きNa2SO4を加えたもの。(vii)の試薬
はNaClを完全に抜きクエン酸を加えたものである。いず
れの試薬もオーラミンOを400ppm含み、PHは8.0であ
る。

血液試料は同一検体を空気中およびCO2雰囲気中に放置
したものを使用した。測定結果を表1の右側に示す。表
中のMRBCはmature RBC(成熟赤血球)を、MFIはMean Fl
uorescence Intensity(平均螢光相対強度)を、FScをF
orward Scattering(前方散乱光相対強度)を表わす。

従来組成の(i)の試薬を用いた場合には、CO2雰囲気
中に放置した血液を測定すると前述のように赤血球が非
特異染色されMRBC−MFI、RET%ともに異常高値を示す。
(v)の試薬を用いた場合も同様の結果であった。この
ことは染色液中にCO2が含まれずハロゲンイオンが存在
すると赤血球の非特異染色が起ることを裏付けている。

(iv)、(vi)、(vii)の試薬を用いた場合には染色
が行なわれず、網状赤血球が測定できなかった。

炭酸イオンを加えた(ii)と(iii)の試薬では、CO2
囲気中に放置した血液を測定した場合でも、赤血球は非
特異染色されず正常な網状赤血球数を示した。

なお、(ii)の試薬を用いて第1図のときと同様な同一
検体を連続測定したときの結果を第3図に示す。網状赤
血球数(%)はほぼ一定の値を示した。

実施例2 CO2雰囲気中に放置した血液検体を下記組成の染色液で
染色して測定した結果を第4に示す。

染色液組成 オーラミンO 400ppm トリス(Tris)緩衝液 20mM NaHCO3 0〜 60mM NaCl 60〜120mM エチレングリコール 2% PH 8.5 (PH調整はトライシン、Tricineを使用) 第4図の横軸はNaHCO3の添加量を表わし、縦軸はRBC−M
FIすなわち赤血球平均螢光相対強度を表わす。NaHCO3
加量0〜2mMでは、赤血球が非特異染色され、RBC−MFI
は高値を示す。4mMでは若干高値を示し、8〜60mMでほ
ぼ一定の値を示す。これよりNaHCO3添加量が約5mM以上
であれば、赤血球の非特異染色が抑えられることがわか
った。

ただし、本実施例は血液をCO2雰囲気中に放置するとい
う極端な条件の場合の結果であり、通常の空気中に放置
する場合にはNaHCO3添加量が約1mM以上であれば、赤血
球の非特異染色は抑えられる。

なお、NaHCO3の添加量の上限は染色液の浸透圧を等張液
の約2倍以内に抑える程度すなわち約300mM以下であれ
ばよい。

【図面の簡単な説明】

第1図は従来技術の組成のオーラミンO染色試薬を使用
して網状赤血球を連続して測定した結果を示すグラフで
あって、縦軸は網状赤血球数(Ret%)であり、横軸は
測定回を示す。 第2(a)、2(b)および2(c)図は、各々、試料
を、試料容器に密閉して保管し;試料容器の柱をとり大
気中に開放しておき;あるいは試料容器の栓をとりCO2
雰囲気中に開放していてから、一定時間経過後、上記オ
ーラミンO染色液を用いてフローサイトメトリにより網
状赤血球数を測定した結果を示すグラフである。図中A
は網状赤血球として識別される領域を示し、Bは赤血球
として識別される領域を示し、Cは血小板として識別さ
れる領域を示す。 第3図は表1の(ii)の試薬を使用して網状赤血球を連
続して測定した結果を示すグラフであって、縦軸及び横
軸は第1図における説明と同じである。 第4図はCO2雰囲気中に放置した血液検体を実施例2の
染色液で染色して測定した結果を示すグラフである。

Claims (3)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】炭酸塩を含むことを特徴とするフローサイ
    トメトリ用網状赤血球測定試薬。
  2. 【請求項2】炭酸塩濃度が1〜300mMである特許請求の
    範囲第1項の試薬。
  3. 【請求項3】炭酸塩がNaHCO3またはNa2CO3である特許請
    求の範囲第1項の試薬。
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