CN1183559A - 早幼白细胞的分类计数法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了1种进行高精度早幼白细胞测定的同时也能对正常白细胞进行分类并计数的方法,是按以下程序进行的早幼白细胞分类计数法:(1)加入溶血剂对血液样品进行处理,使早幼的细胞保持生存状态,而使其它白细胞损伤。(2)用可以将前述损伤白细胞染色的荧光色素进行染色;然后(3)对上述程序处理的白细胞进行至少一次的散射光和一次的荧光测定,以其强度差作白细胞分类计数。

Description

早幼白细胞的分类计数法

本发明涉及以流式细胞测定法(flowcytometry)进行的白细胞分类计数法。

在临床检验领域的白细胞分类计数对于疾病的诊断能够提供非常有用的情报。在通常和正常情况下，末梢血液中的白细胞有淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞等5种。然而，在种种血液疾病的情况下，可见骨髓细胞、骨髓原始细胞等早幼白细胞。这种早幼白细胞出现的检出在疾病的诊断上是很重要的。

以前，为了达到此目的，一般都是将血液制成血涂片，在进行适当的染色后一边用显微镜观察一边进行分类计数。另一方面，近年来由于流式细胞测定原理的应用，发展了种种全自动白细胞分类计数装置。然而，这些装置只能对正常白细胞进行高精度的分类计数，对上述的早幼白细胞不能进行确实的检出分类。

近年来，应用RF/DC测定原理从而提供了对早幼白细胞出现进行高精度检出的试剂和方法。(特开平6-273413号)

上述公报的方法是利用在特定条件下早幼白细胞比正常白细胞不容易被破坏的性质而进行电学测定的。而且它也暗示可以通过散射光信息进行测定。但是，此方法由于是以检出早幼白细胞为目的，对早幼白细胞的检出有优良的性能；在测定早幼白细胞的同时却不能对正常白细胞进行分类计数。正常白细胞的分类计数必须采取其它方法。

特开平6-20792号中，揭示了使白细胞只产生可通过标记物质的损伤的血液分析方法。但是这个方法是对正常白细胞和早幼白细胞造成同样损伤的分析方法，早幼白细胞和正常白细胞的分离不一定良好。而且以这种方法处理的早幼白细胞对作为标记物质的色素有通透性，它不是对早幼白细胞没有损伤的方法。

本发明的目的在于提供一种在进行高精度早幼白细胞测定的同时也能进行正常白细胞分类和计数的方法。

本发明是按以下程序进行的早幼白细胞的分类计数法：(1)加入溶血剂对血液样品进行处理，使早幼白细胞保持生存状态，而使其它白细胞发生损伤；(2)用可以将前述损伤白细胞和损伤细胞染色的荧光色素进行染色；然后(3)对上述程序处理的白细胞进行至少1次的散射光和至少1次的荧光测定，根据其强度差作白细胞的分类计数。

本发明所说的白细胞损伤是指使在通常白细胞生存状态不能透过细胞膜的色素变得可能透过的操作。在本发明中，正常白细胞发生损伤，可以通透色素，另一方面早幼白细胞不发生损伤，处于不能通透色素的状态。

正常的白细胞具有将细胞不需要的物质(例如色素)排除在细胞外的物质排除机能。

一方面，在特定组成溶血剂对细胞进行作用的情况下，虽然作用机制不明确，但可将特定细胞(例如正常白细胞)的细胞膜脂质组成成分部分抽提出来，从而在细胞膜上形成只对特定物质有通透性的细孔。其结果是可使色素分子进入特定细胞内进行染色。另一方面，对早幼白细胞来说，不使它产生对色素可能通透的细孔(此状态在本发明中称为生存状态)，从而不被色素染色。本发明所说的早幼白细胞是通常情况下在骨髓存在的而在末梢血液中不存在的未成熟细胞，例如原始细胞、前骨髓细胞、骨髓细胞、后骨髓细胞等。前骨髓细胞、骨髓细胞可统一归类为幼稚粒细胞。更进一步，原始细胞以前分化阶段的骨髓干细胞(CFU-GENM)、中性粒·巨噬细胞集落形成细胞(CFU-GM)、嗜酸性粒细胞集落形成细胞(CFU-EOS)等白细胞系造血前体细胞也包含在本发明的早幼白细胞范围内。以下述溶血剂和血液样品进行混合，从而使早幼白细胞不被染色而其它白细胞染色。本发明所说的血液样品主要是指末梢血液，但其它如骨髓液、从单采血液成分术等回收的含血液成分的样品、腹腔液和尿液等含有白细胞成分的生物样品等也是适当的样品。

作为本发明可使用的溶血液，采用含表面活性剂的水溶液、或是用含有以下结构式的聚氧乙烯类非离子表面活性剂的物质都是适用的。特开平6-273413号记载的溶血剂也是合适的。上述公报记载的溶血剂含有：(1)对早幼白细胞细胞质细胞膜进行固定化的聚氧乙烯类非离子表面活性剂；(2)使血细胞细胞膜损伤和缩小化的可溶化剂；(3)对早幼白细胞的细胞质及细胞膜进行固定化的氨基酸；以及(4)pH值为5.0～9.0、渗透压为150～600mOsm/kg、电导为6.0～9.0mS/cm的缓冲液。对于本发明来说，所进行的是光学测定，不受电导的影响，所以电导不必限定在上述范围内。

上述聚氧乙烯类非离子表面活性剂可以用具以下结构式的物质。

R₁-R₂-(CH₂CH₂O)_n-H(式中R₁是碳原子数10～25的烷基、链烯基或炔基；R₂是-O-、-φ-p-O-或-COO-；n等于10～40)

特别是聚氧乙烯(20)十二烷基醚、聚氧乙烯(15)十六烷基醚、聚氧乙烯(16)十六烷基醚等很适合。

对于聚氧乙烯类非离子表面活性剂的浓度来说，由所用物质不同而不同。上述的聚氧乙烯(20)十二烷基醚可以为0.1～2.0g/l(优选0.5～1.5g/l)，聚氧乙烯(15)十六烷基醚可以为1～9g/l(优选3～7g/l)、聚氧乙烯(16)十六烷基醚可以为5～50g/l(优选15～35g/l)。对于聚氧乙烯类非离子表面活性剂来说，如果疏水基团的碳原子数相同，则n值越小细胞损伤能力越强，n值越大细胞损伤能力越弱。另外，在n值相同的情况下，随着疏水基团碳原子数减少细胞损伤能力增加。从这一点上考虑，上述值只是大致标准，可以通过实验简单地求出必要的表面活性剂浓度。

另外，上述可溶化剂可以从以下物质中选择。〔化3〕

(1)如下式的肌氨酸衍生物及其盐

(式中，R₃是碳原子数10～22的烷基，m为1～5)

(2)如下式的胆酸衍生物：

(式中，R为氢原子或羟基)

(3)如下式的甲基葡聚糖酰胺：

(式中，y为5～7)

可溶化剂的优选浓度，对于肌氨酸衍生物及其盐来说为0.2～2.0g/l，对于胆酸衍生物来说为0.1～0.5g/l，对于甲基葡聚糖酰胺来说为1.0～8.0g/l。更具体地说，可使用N-月桂酰肌氨酸钠、月桂酰甲基-β-丙氨酸钠、月桂酰肌氨酸、CHAPS(3-〔(3-胆酰氨基丙基)-二甲基铵基〕-1-丙磺酸盐)、CHAPSO_y(3-〔(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵基〕-2-羟基-1-丙磺酸盐)、EMGA8(辛酰基-N-甲基葡聚糖酰胺)、MEGA9(壬酰基-N-甲基葡聚糖酰胺)、MEGA10(癸酰基-N-甲基葡聚糖酰胺)等是很合适的。其它也可用n-辛基-β-葡萄糖甙、蔗糖单癸酸酯以及N-甲酰甲基亮氨酰丙氨酸等，其优选浓度为0.01～50.0g/l。

另外，氨基酸可用构成蛋白质的氨基酸，如谷氨酸、缬氨酸，特别是甲硫氨酸、胱氨酸及半胱氨酸等含硫氨基酸，其中最优选甲硫氨酸。氨基酸的使用量范围可为1～50g/l。用谷氨酸时为8～12g/l合适；用甲硫氨酸时16～20g/l合适。

缓冲液是向HEPES等良好缓冲液或磷酸缓冲液中加入氢氧化钠等pH调节剂调制而成，在必要的情况下还可加入氯化钠等渗透压调节剂；优选pH为5.0～9.0，渗透压150～600mOsm/Kg。

对于本发明的所用色素来说，只对损伤细胞或早幼白细胞任一方进行染色都可以，但最优选只对损伤细胞进行染色的色素。作为只对损伤细胞进行染色的色素，生存细胞必须对其有很低的通透性。一般来说，生存细胞的细胞膜外和膜内环境有较大差别。细胞膜对不必要的物质不具通透性，具有物质选择的功能。例如，作为细胞膜通透性低的色素可举锥虫蓝一例。这些色素一般是具有酸性官能团例如羧基、硫酸根等的酸性色素。此色素不对生存细胞染色，而能对细胞膜损伤的细胞进行染色。但是，酸性色素具有对血小板等白细胞以外成分进行染色的倾向，因而不适用于本发明。为达到本发明的目的，最好是对白细胞的特有成分进行染色。对作为染色的对象细胞核特别是对DNA有特异性的色素或对RNA有特异性的色素是特别适合的。为了达到此目的，有几种阳离子色素是合适的。

一般情况下阳离子色素可通过生存细胞的细胞膜，使细胞内成分染色。但是已知一些特殊的阳离子色素(例如溴化乙啡啶、碘化丙啡啶等)不通过生存细胞，而能通过损伤细胞使之染色。

为达到本发明的目的，所使用的色素没有特殊的限定，具体的例子如先前所提过的溴化乙啡啶、碘化丙啡啶，还有Molecular Probes公司销售的乙啡啶-吖啶杂二聚体、乙啡啶二嗪(ethidium diazide)、乙啡啶同型二聚体-1(ethidium homodimer-1)、乙啡啶同型二聚体-2(ethidium homodimer-2)、乙啡啶单嗪(ethidium monoazide)、TOTO-1、TO-PRO-1、TOTO-3、TO-PRO-3(Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 5th Edition1992-1994；MOLECOLAR PROBES，INC.1992年记载)等之外，发现如以下结构式(I)表示的色素可以作为光源为氦一氖、红色半导体激光时合适的色素：

(式中R₁为氢原子或低级烷基；R₂及R₃为氢原子、低级烷基或低级烷氧基；R₄为氢原子、酰基或低级烷基；R₅为氢原子、可被取代的低级烷基；Z为硫原子、氧原子或有低级烷基取代的碳原子；n为1或2；X-为阴离子)。

式(I)中R₁所示的低级烷基是指碳原子数为1～6的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等，其中优选甲基和乙基。

R₂和R₃所示的低级烷基意义同上，作为所示的低级烷氧基，指的是碳原子数为1～6的烷氧基，例如，甲氧基、乙氧基、丙氧基等，其中优选甲氧基和乙氧基。另外，更优选R₂和R₃为氢原子。

R₄所示酰基优选为脂肪族羧酸衍生的酰基，例如乙酰基、丙酰基等，其中优选乙酰基。另外，低级烷基含义同上。

R₅所示低级烷基同上所述，所示被取代低级烷基指的是可被1～3个羟基、卤素原子(氟、氯、溴、碘)取代的低级烷基，其中以一个羟基取代的甲基和乙基为优选。

Z所示低级烷基同上所述，Z优选硫原子。

X^-所示阴离子为卤素离子(氟、氯、溴、碘离子)、卤化硼离子(BF₄-、BCl₄ ^-、BBr₄ ^-等)、磷化物离子、卤酸根离子、氟代硫酸离子、甲磺酸根离子、芳香环上有卤素或卤代烷基取代的四苯基硼化合物离子等；其中优选溴离子或BF₄ ^-。

上述式(I)中色素的具体例子如以下的色素A、色素B和色素C。对这些色素A、色素B、色素C来说，特开平9-104683号记载了详细的合成方法。

作为合成方法的一例，式(I)中n＝1的化合物是由式(II)所示的化合物和N，N-二取代甲脒反应所得产物再和式(III)所示的喹啉衍生物反应，最后经氟硼酸钠处理而得。

另外，式(I)所示化合物中，n＝2的化合物是将上述反应中的N，N-双取代甲脒用比如丙醛酸双苯基亚胺(malonaldehydebis(phenylimine))盐等物质代替从而反应得到。

还有，前述的MOLECULAR PROBES，INC的手册中也记载了几种色素。上述色素只是一些例子，本发明并不受这些所限制。

在配制测定用样品时，只要将溶血剂、含色素的溶液以及血液样品混合就行。或者，将色素用乙二醇等水溶性有机溶剂溶解后，使用时和溶血剂混合也可以。这样操作能使色素保持较高的稳定性。对于所使用色素相应的合适浓度来说，操作者能很容易地从实验中求出。例如，用溴化乙啡啶时0.01～100ppm的范围合适，优选0.1～30ppm。

此外，血液样品和含色素的溶血剂溶液的混合比是1∶10～1∶1000，反应温度为20～40℃，反应时间为5秒～5分钟。反应温度高时可望相应缩短反应时间。

对配制好的样品进行测定时，可使用如图1所示结构的流式细胞计。市售的流式细胞计(例如FACScan，Becton Dickinson公司制)不必作特殊的改良就可以使用。光源可选择和所使用的荧光色素激发波长相适应的光源。

对于散射光的检出来说，前方散射光(小角度或大角度)和侧方散射光都是可以的。

以下通过实施例来说明本发明，但本发明范围并不受这些所限制。实施例1测定用试剂聚氧乙烯(16)十六烷基醚    24.0g/lN-月桂酰肌氨酸钠          1.5g/lDL-甲硫氨酸               20.0g/lHEPES                     12.0g/l1N-NaOH                   0.3g/lNaCl                      4.0g/l色素A                     3.0mg/l

上述试剂1ml与血液33μl混合，10秒钟后用流式细胞计测定侧方散射光和红色荧光(光源：红色半导体激光，波长：633nm)。

所得结果如图2(A-c)所示。A是正常血液的测定结果，B是出现早幼粒细胞的血液，C是出现早幼粒细胞和原始细胞的样品的测定结果。图中Lymph表示淋巴细胞，Mono表示单核细胞，Gran表示粒细胞，IG表示早幼粒细胞，Blast表示原始细胞。

图2的A中白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、粒细胞3类。B中除了正常的3类分布区域外还有早幼粒细胞的分布区域。C除了正常的3类分布区域外还有早幼粒细胞和原始细胞的分布区域。

接下来，将本发明方法测定的结果和现有方法的测定结果进行比较，作出相关分析。现有方法是用多功能自动血细胞分析装置(SE-9000，东亚医用电子株式会社)进行测定。

所得结果如图3(A～D)所示。淋巴细胞(A)、单核细胞(B)及粒细胞(C)的比例，还有白细胞总数(WBC，图3的D所示)中的任一个都可见以前方法和本发明的方法有良好的相关性。另外，SE-9000的粒细胞数是以NEUT(中性粒细胞)+EO(嗜酸性细胞)+BA(嗜碱性粒细胞)而求得。实施例2

所用试剂和实施例1中相同，在给与G-CSF之后出现造血前体细胞的检品用流式细胞计进行侧方散射光和红色荧光的测定。结果如图4所示。确认荧光强度低的区域，细胞群是早幼白细胞区域。

此外，还可利用造血前体细胞对CD34反应阳性的性质，将造血前体细胞进行分离测定。首先用血液成分分析装置配制富含单核细胞的样品；然后，将样品和结合有抗CD34单克隆抗体(Beaton DickinsonImmunocytometry System Co.，Ltd公司制)的磁珠(DynabeadsTM；DYNAL及市售的)反应，接着用磁细胞分离器(IsolexTM；Baxter Co.，Ltd.)将CD34反应阳性的造血前体细胞分离。然后用酶(木瓜凝乳蛋白酶)处理将CD34阳性细胞从磁珠上分离下来。

这样配制的样品用同样的试剂，也用流式细胞计测定出侧方散射光和红色荧光。结果如图5所示。同样可见荧光强度低的区域的细胞群是早幼白细胞区域。

本发明所进行的加溶血剂的处理、对损伤细胞进行染色、以及散射光和荧光的组合测定等使以前方法不可能同时进行的正常白细胞分类计数和早幼白细胞分类计数成为可能，从而使白细胞计数一体化成为可能。

附图的简要说明

〔图1〕

所示的为本发明方法使用的流式细胞计概略图。

〔图2〕

所示的为用本发明方法测定的结果。A为正常血液测定结果，B为出现早幼粒细胞的血液测定结果，C为出现早幼粒细胞、原始白细胞的样品的测定结果。

〔图3〕

所示的为本发明测定法的结果和以前方法测定结果进行比较所得的相关分析结果。

〔图4〕

所示的为用本发明方法对G-CSF给与后出现造血前体细胞的样品进行测定的结果。

〔图5〕

所示的为CD34阳性的造血前体细胞分离之后，用本发明的方法测定而得的结果。

Claims (5)

1.1种早幼白细胞分类计数法，其特征在于，是按以下程序进行的：(1)加入血液学试剂溶血剂对血液样品进行处理，使早幼白细胞保持生存状态，而使其它白细胞损伤。(2)用可以将前述损伤白细胞和损伤细胞染色的荧光色素进行染色；然后(3)对上述程序处理的白细胞进行至少一次的散射光和一次的荧光测定，以其强度差作白细胞分类计数。

2.根据权利要求1记载的方法，其特征在于，可以在对早幼白细胞分类计数同时检测正常白细胞进行，对全体白细胞进行计数。

3.根据权利要求2记载的方法，其特征在于，对正常白细胞至少3种进行分类计数。

4.根据权利要求1～3任一项记载的方法，其特征在于，所用的溶血剂含有以下成分：(1)对早幼白细胞的细胞质及细胞膜进行固定的聚氧乙烯类非离子型表面活性剂；(2)对血细胞细胞膜进行损伤及缩小化的可溶化试剂；(3)对早幼白细胞的细胞质及细胞膜进行固定化的氨基酸；以及(4)pH5.0～9.0，渗透压为150～600mOsm/kg的缓冲液。

5.根据权利要求1～4任一项记载的方法，其特征在于，荧光色素是从以下组中选择的：

(1)如式(I)的化合物

(式中R₁为氢原子或低级烷基；R₂以及R₃为氢原子、低级烷基或低级烷氧基；R₄为氢原子、酰基或低级烷基；R₅为氢原子、可被取代的低级烷基；Z为硫原子、氧原子或低级烷基取代的碳原子；n为1或2；X-为阴离子)；(2)溴化乙啡啶、碘化丙啡啶(3)乙啡啶-吖啶杂二聚体(ethidium-acridine heterodimer)、乙啡啶二嗪(ethidium diazide)、乙啡啶同型二聚体-1(ethidiumhomodimer-1)、乙啡啶同型二聚体-2(ethidium homodimer-2)、乙啡定单嗪(ethidium monoazide)、TOTO-1、TO-PRO-1、TOTO-3、TO-PRO-3

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