CN117147509A - 一种蟹类血细胞钙稳态的亚细胞评估方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蟹类血细胞钙稳态的亚细胞评估方法，属于生物分析领域。通过采集蟹类血淋巴并将其制备成血细胞悬液，添加不同荧光探针分别获得细胞质、线粒体和内质网的钙离子血细胞检测液，能够同时对细胞质、线粒体和内质网中的钙离子浓度进行激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测，首次在亚细胞水平实现蟹类血细胞钙离子浓度的精准检测，便于系统分析蟹类血细胞钙稳态。通过检测发现，血细胞于检测液中形态正常、结构完整、结果准确且染色效率高，满足高品质实验需求。
Description
技术领域
本发明属于生物分析领域，具体涉及一种蟹类血细胞钙稳态的亚细胞评估方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
钙离子是生物体内的多功能第二信使，广泛参与细胞的兴奋、运动、胞吐、增殖、分化、自噬、凋亡、分泌、转录、应激和免疫等诸多生理过程，在细胞质、线粒体和内质网等细胞结构的调节下，其浓度变化对蟹类的存活、生长和发育等具有重要调控作用。
血细胞作为蟹类免疫的主要参与者，维持钙离子稳态是其正常发挥免疫功能的基础和关键。然而，目前对蟹类血细胞钙离子水平的检测多依赖血淋巴钙离子的总体评估，不仅存在样本不稳定和结果重复性差等系列问题，而且不能在亚细胞水平精准反映细胞质、线粒体和内质网等细胞结构的钙离子特征，限制了相关研究和应用的深入开展，不足以满足当前工作的需要。因此，如何精准测定血细胞内不同结构钙离子水平，系统分析亚细胞水平钙离子通量的变化，成为蟹类血细胞钙稳态分析的关键。
发明内容
为了解决目前蟹类血细胞钙离子水平检测中存在的样本不稳定、结果重复性差、不能反映亚细胞水平变化等问题，本发明旨在提供一种蟹类血细胞钙稳态的亚细胞评估方法，该方法稳定性高、重复性好，且获得的细胞悬液在添加不同荧光探针之后，能够同时用于激光共聚焦显微镜和流式细胞仪分析，以互相印证实验结果。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
本发明的第一个方面，提供一种蟹类血细胞钙稳态的亚细胞评估方法，包括以下步骤：
步骤1，采集蟹类血淋巴；
步骤2，将血淋巴制成蟹类血细胞悬液；
步骤3，检测蟹类血细胞悬液的细胞密度，确保最终细胞密度≥1×106个/mL；
步骤4，蟹类血细胞检测液的制备：
(1)吸取所述血细胞悬液和等体积的细胞核荧光探针于离心管；分别加入等体积的细胞质钙离子荧光探针、线粒体钙离子荧光探针或内质网钙离子荧光探针；混匀；避光孵育；多次离心、去上清、缓慢重悬，得到蟹类血细胞激光共聚焦显微镜检测液；
(2)吸取所述血细胞悬液分别与等体积的细胞质钙离子荧光探针、线粒体钙离子荧光探针或内质网钙离子荧光探针；混匀；避光孵育；多次离心、去上清、缓慢重悬，得到蟹类血细胞流式细胞仪检测液；
步骤5，蟹类血细胞钙离子水平的检测：
(1)采用激光共聚焦显微镜对所述蟹类血细胞激光共聚焦显微镜检测液进行检测，观测血细胞荧光强度，定性钙离子浓度变化；
(2)采用流式细胞仪对所述蟹类血细胞流式细胞仪检测液进行检测，检测血细胞荧光强度，定量其钙离子浓度。
本发明的实施例中，所述采集蟹类血淋巴包括如下步骤：
从蟹类附肢软膜处抽取血淋巴；将血淋巴与离心管中的抗凝剂混匀，得到混合液，即蟹类血淋巴。
其中，血淋巴与抗凝剂的体积比为1：1。
其中，所述抗凝剂的配方如表1所示。
表1抗凝剂配方
本发明的实施例中，所述将血淋巴制成蟹类血细胞悬液包括如下步骤：
将所述蟹类血淋巴离心、去掉上清，得到细胞沉淀；利用PBS缓冲液重悬细胞沉淀，得到细胞重悬液；将PBS缓冲液与所述细胞重悬液混合；重复上述操作过程1～2次，得到蟹类血细胞悬液。
本发明的实施例中，所述检测蟹类血细胞悬液细胞密度包括如下步骤：
吸取所述蟹类血细胞悬液于双室细胞计数载玻片中；缓慢摇晃，静置；利用全细胞自动计数仪检测细胞密度；加入适量PBS缓冲液，确保最终细胞密度≥1×106个/mL。
本发明的实施例中，所述细胞核荧光探针、细胞质钙离子荧光探针、线粒体钙离子荧光探针和内质网钙离子荧光探针的荧光不同，以便于区分细胞核、细胞质、线粒体和内质网等不同亚细胞结构。
进一步地，所述细胞核荧光探针为Hoechst 33342细胞核荧光探针。
进一步地，所述细胞质钙离子荧光探针为Fluo-4。
进一步地，所述线粒体钙离子荧光探针为Rhod-2。
进一步地，所述内质网钙离子荧光探针为Mag-Fluo-4。
本发明的实施例中，所述采用激光共聚焦显微镜对所述蟹类血细胞激光共聚焦显微镜检测液进行检测包括如下步骤：
通过DAPI荧光通道激发，定位细胞位置，通过伪明场荧光通道激发，确定细胞结构完整性，通过FITC或ECD等荧光通道激发，观测血细胞荧光强度，定性钙离子浓度变化。
本发明的实施例中，所述采用流式细胞仪对所述蟹类血细胞流式细胞仪检测液进行检测包括如下步骤：
通过前向散射光FSC和侧向散射光SSC激发，确定坐标阈值；通过FSC-SSC点图中细胞聚集结果，设置检测细胞数量为105个，启动流式细胞仪“记录”模式，圈定血细胞亚群；通过FITC或ECD等荧光通道激发，设置检测细胞数量为104个，启动流式细胞仪“记录”模式，检测血细胞荧光强度，定量其钙离子浓度。
本发明的第二个方面，提供一种蟹类血细胞检测液，所述蟹类血细胞检测液是根据上述的一种蟹类血细胞钙稳态的亚细胞评估方法获得的。该蟹类血细胞检测液中的蟹类血细胞活力强、大小类似、形态正常、结构完整、分群明显、染色效率高、适于后续检测。
本发明的第三个方面，提供上述的蟹类血细胞检测液在激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测蟹类血细胞钙离子浓度中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明的蟹类血细胞检测液中蟹类血细胞活力强、大小类似、形态正常、结构完整、分群明显、染色效率高、适于后续检测。该技术能同时支持激光共聚焦显微镜、流式细胞仪的检测印证，且基于细胞质、线粒体和内质网三种亚细胞结构的钙离子浓度变化规律，实现了对蟹类血细胞钙稳态的亚细胞精准评估，有效解决现存技术的问题。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明采用流式细胞仪检测血细胞形态结构结果；
图2为本发明采用激光共聚焦显微镜观察蟹类血细胞结构完整性及细胞质染色情况；
图3为本发明采用流式细胞仪检测细胞质钙离子浓度结果；
图4为本发明采用流式细胞仪检测线粒体钙离子浓度结果；
图5为本发明采用流式细胞仪检测内质网钙离子浓度结果；
图6为本发明采用激光共聚焦显微镜观察细胞质、线粒体和内质网钙离子的染色情况。
具体实施方式
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
本发明以一种氨氮胁迫下三疣梭子蟹血细胞钙稳态的亚细胞评估方法的实施例详细说明一种蟹类血细胞钙稳态的亚细胞评估方法，其具体步骤如下：
步骤1，三疣梭子蟹血细胞的采集：
1.1利用抗凝剂(配方见表1)润洗的2.5mL无菌注射器分别从氨氮胁迫组和对照组三疣梭子蟹附肢软膜处抽取血淋巴；
表1抗凝剂配方
1.2将10mL血淋巴与10mL抗凝剂在50mL尖底离心管1:1混匀；
1.3利用5mL PBS缓冲液冲洗无菌注射器中残留血细胞于50mL尖底离心管，得到混合液25mL；
1.4利用70μm细胞筛过滤混合液。
步骤2，三疣梭子蟹血细胞悬液的制备：
2.1在4℃下对步骤1制备的混合液进行300g离心处理15min；
2.2利用10mL无菌巴氏吸管去掉上清20mL；
2.3 45度倾斜离心管，利用1000μL移液器去掉上清2mL，得到细胞沉淀；
2.4利用1000μL移液器吸取2mL PBS缓冲液，45度倾斜旋转离心管并不断利用PBS重悬细胞沉淀，得到细胞重悬液5mL；
2.5利用10mL无菌巴氏吸管将20mL PBS缓冲液与细胞重悬液混合；
2.6重复2.1～2.4步骤1～2次，得到三疣梭子蟹血细胞悬液5mL。
步骤3，三疣梭子蟹血细胞悬液的细胞密度检测：
3.1利用10μL移液器吸取步骤2制备的血细胞悬液10μL于双室细胞计数载玻片中；
3.2缓慢手动摇晃10次，静置2min；
3.3利用全细胞自动计数仪检测细胞密度；
3.4利用1000μL移液器加入适量PBS缓冲液，重复3.2～3.3步骤，确保最终细胞密度≥1×106个/mL。
步骤4，三疣梭子蟹血细胞检测液的制备：
4.1三疣梭子蟹血细胞激光共聚焦显微镜检测液的制备：
4.1.1利用200μL移液器吸取血细胞悬液和细胞核荧光探针Hoechst-33342各400μL于1.5mL离心管；
4.1.2重复4.1.1步骤2次，得到3管混合液；
4.1.3利用200μL移液器分别吸取细胞质钙离子荧光探针Fluo-4、线粒体钙离子荧光探针Rhod-2和内质网钙离子荧光探针Mag-Fluo-4三种钙离子荧光探针400μL与3管混合液进一步混合；
4.1.4利用1000μL移液器缓慢混匀，得到3管三疣梭子蟹血细胞激光共聚焦显微镜检测液；
4.1.5在室温下避光环境中孵育1h；
4.1.6在4℃温度环境下进行600g离心处理4min；
4.1.7利用1000μL移液器去掉上清液1000μL；
4.1.8利用200μL移液器吸取PBS缓冲液200μL，缓慢重悬；
4.1.9重复4.1.6步骤，利用200μL移液器去掉上清液，缓慢重悬，得到3管200μL三疣梭子蟹血细胞激光共聚焦显微镜检测液。
4.2三疣梭子蟹血细胞流式细胞仪检测液的制备
4.2.1利用1000μL移液器分别吸取血细胞悬液600μL于3个1.5mL离心管；
4.2.2利用1000μL移液器分别吸取细胞质钙离子荧光探针Fluo-4、线粒体钙离子荧光探针Rhod-2和内质网钙离子荧光探针Mag-Fluo-4三种钙离子荧光探针600μL与3管血细胞悬液混合；
4.2.3利用1000μL移液器缓慢混匀，得到3管三疣梭子蟹血细胞激光共聚焦显微镜检测液；
4.2.4在室温下避光环境中孵育1h；
4.2.5在4℃温度环境下进行600g离心处理4min；
4.2.6利用1000μL移液器去掉上清液1000μL；
4.2.7利用200μL移液器吸取PBS缓冲液200μL，缓慢混匀；
4.2.8重复4.2.5步骤，利用200μL移液器去掉上清液200μL；
4.2.9重复4.2.7步骤，得到3管400μL三疣梭子蟹血细胞流式细胞仪检测液步骤5，三疣梭子蟹血细胞钙离子水平的检测：
5.1采用激光共聚焦显微镜对三疣梭子蟹血细胞激光共聚焦显微镜检测液进行检测
5.1.1通过DAPI荧光通道激发，定位细胞位置；
5.1.2通过伪明场荧光通道激发，确定细胞结构完整性；
5.1.3通过FITC或ECD等荧光通道激发，确定血细胞荧光强度；
5.2采用流式细胞仪对三疣梭子蟹血细胞流式细胞仪检测液进行检测
5.2.1通过前向散射光(FSC)和侧向散射光(SSC)激发，确定坐标阈值；
5.2.2通过FSC-SSC点图中细胞聚集结果，设置检测细胞数量为105个，启动流式细胞仪的“记录”模式，圈定血细胞亚群；
5.2.3通过FITC或ECD等荧光通道激发，设置检测细胞数量为104个，启动流式细胞仪的“记录”模式，检测血细胞荧光强度。
检测结果：
1.利用流式细胞仪检测三疣梭子蟹血细胞细胞质钙离子流式细胞仪检测液，观察血细胞形态结构。
检测结果如图1所示，其中，方框中的点代表经过流式细胞仪测定的全部颗粒，蓝色区域代表最终确定的三疣梭子蟹血细胞亚群。三疣梭子蟹血细胞亚群聚集明显，细胞致密程度和复杂程度均相近，代表细胞形态类似且结构完整。
2.利用10μL移液器吸取10μL三疣梭子蟹血细胞细胞质钙离子激光共聚焦显微镜检测液于玻片上，观察细胞结构完整性及染色情况。
检测结果如图2所示，其中，A中绿色部分为细胞质钙离子，B中蓝色部分为细胞核，C为伪明场下血细胞照片，D为ABC叠加结果。三疣梭子蟹血细胞形态正常、结构完整、染色清晰。经互相印证，该结果与检测结果1规律一致。
3.利用流式细胞仪检测三疣梭子蟹血细胞细胞质钙离子流式细胞仪检测液，定量细胞质钙离子浓度。
检测结果如图3所示，随着氨氮胁迫浓度升高(0～45mg·L-1)，三疣梭子蟹血细胞细胞质钙离子浓度呈现升高趋势。
4.利用流式细胞仪检测三疣梭子蟹血细胞线粒体钙离子流式细胞仪检测液，定量线粒体钙离子浓度。
检测结果如图4所示，随着氨氮胁迫浓度升高(0～45mg·L-1)，三疣梭子蟹血细胞线粒体钙离子浓度呈现降低趋势。
5.利用流式细胞仪检测三疣梭子蟹血细胞内质网钙离子流式细胞仪检测液，定量内质网钙离子浓度。
检测结果如图5所示，随着氨氮胁迫浓度升高(0～45mg·L-1)，三疣梭子蟹血细胞内质网钙离子浓度呈现降低趋势。
6.利用10μL移液器分别吸取10μL三疣梭子蟹血细胞细胞质钙离子激光共聚焦显微镜检测液、血细胞线粒体钙离子激光共聚焦显微镜检测液和血细胞内质网钙离子激光共聚焦显微镜检测液于载玻片上，观察细胞结构完整性及染色情况。
检测结果如图6所示，其中，A1中绿色部分为氨氮浓度为5mg·L-1时的细胞质钙离子，A2中绿色部分为氨氮浓度为45mg·L-1时的细胞质钙离子，B1中红色部分为氨氮浓度为5mg·L-1时的线粒体钙离子，B2中红色部分为氨氮浓度为45mg·L-1时的线粒体钙离子，C1中绿色部分为氨氮浓度为5mg·L-1时的内质网钙离子，C2中绿色部分为氨氮浓度为45mg·L-1时的内质网钙离子。随着氨氮胁迫浓度升高(0～45mg·L-1)，三疣梭子蟹血细胞的细胞质(A1～A2)、线粒体(B1～B2)和内质网(C1～C2)钙离子浓度最终分别呈现升高、降低和降低趋势。经互相印证，该结果与检测结果3、4和5的规律一致。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围内。
Claims (10)
1.一种蟹类血细胞钙稳态的亚细胞评估方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，采集蟹类血淋巴；
步骤2，将血淋巴制成蟹类血细胞悬液；
步骤3，检测蟹类血细胞悬液的细胞密度，确保最终细胞密度≥1×106个/mL；
步骤4，蟹类血细胞检测液的制备：
(1)吸取所述血细胞悬液和等体积的细胞核荧光探针于离心管；分别加入等体积的细胞质钙离子荧光探针、线粒体钙离子荧光探针或内质网钙离子荧光探针；混匀；避光孵育；多次离心、去上清、缓慢重悬，得到蟹类血细胞激光共聚焦显微镜检测液；
(2)吸取所述血细胞悬液分别与等体积的细胞质钙离子荧光探针、线粒体钙离子荧光探针或内质网钙离子荧光探针；混匀；避光孵育；多次离心、去上清、缓慢重悬，得到蟹类血细胞流式细胞仪检测液；
步骤5，蟹类血细胞钙离子水平的检测：
(1)采用激光共聚焦显微镜对所述蟹类血细胞激光共聚焦显微镜检测液进行检测，观测血细胞荧光强度，定性钙离子浓度变化；
(2)采用流式细胞仪对所述蟹类血细胞流式细胞仪检测液进行检测，检测血细胞荧光强度，定量其钙离子浓度。
2.如权利要求1所述的一种蟹类血细胞钙稳态的亚细胞评估方法，其特征在于，所述采集蟹类血淋巴包括如下步骤：
从蟹类附肢软膜处抽取血淋巴；将血淋巴与离心管中的抗凝剂混匀，得到混合液，即蟹类血淋巴。
3.如权利要求2所述的一种蟹类血细胞钙稳态的亚细胞评估方法，其特征在于，血淋巴与抗凝剂的体积比为1：1；
进一步地，所述抗凝剂组成为：氯化钠0.21g、柠檬酸钠0.40g、葡萄糖1.03g、无菌纯水定容至50mL。
4.如权利要求1所述的一种蟹类血细胞钙稳态的亚细胞评估方法，其特征在于，所述将血淋巴制成蟹类血细胞悬液包括如下步骤：
将所述蟹类血淋巴离心、去掉上清，得到细胞沉淀；利用PBS缓冲液重悬细胞沉淀，得到细胞重悬液；将PBS缓冲液与所述细胞重悬液混合；多次离心、去上清、缓慢重悬，得到蟹类血细胞悬液。
5.如权利要求1所述的一种蟹类血细胞钙稳态的亚细胞评估方法，其特征在于，所述检测蟹类血细胞悬液的细胞密度包括如下步骤：
吸取所述蟹类血细胞悬液于双室细胞计数载玻片中；缓慢摇晃，静置；利用全细胞自动计数仪检测细胞密度；加入适量PBS缓冲液，重复，确保最终细胞密度≥1×106个/mL。
6.如权利要求1所述的一种蟹类血细胞钙稳态的亚细胞评估方法，其特征在于，所述细胞核荧光探针的荧光与细胞质钙离子荧光探针、线粒体钙离子荧光探针或内质网钙离子荧光探针的荧光不同；
进一步地，所述细胞核荧光探针为Hoechst 33342细胞核荧光探针；
进一步地，所述细胞质钙离子荧光探针为Fluo-4；
进一步地，所述线粒体钙离子荧光探针为Rhod-2；
进一步地，所述内质网钙离子荧光探针为Mag-Fluo-4。
7.如权利要求1所述的一种蟹类血细胞钙稳态的亚细胞评估方法，其特征在于，所述采用激光共聚焦显微镜对所述蟹类血细胞激光共聚焦显微镜检测液进行检测包括如下步骤：
通过DAPI荧光通道激发，定位细胞位置，通过伪明场荧光通道激发，确定细胞结构完整性，通过FITC或ECD等荧光通道激发，观测血细胞荧光强度，定性钙离子浓度变化。
8.如权利要求1所述的一种蟹类血细胞钙稳态的亚细胞评估方法，其特征在于，所述采用流式细胞仪对所述蟹类血细胞流式细胞仪检测液进行检测包括如下步骤：
通过前向散射光FSC和侧向散射光SSC激发，确定坐标阈值；通过FSC-SSC点图中细胞聚集结果，设置检测细胞数量为105个，启动流式细胞仪“记录”模式，圈定血细胞亚群；通过FITC或ECD等荧光通道激发，设置检测细胞数量为104个，启动流式细胞仪“记录”模式，检测血细胞荧光强度，定量其钙离子浓度。
9.一种蟹类血细胞检测液，其特征在于，所述蟹类血细胞检测液是根据权利要求1-8任一所述的一种蟹类血细胞钙稳态的亚细胞评估方法获得的。
10.如权利要求9所述的蟹类血细胞检测液在采用激光共聚焦显微镜或流式细胞仪检测蟹类血细胞钙离子浓度中的应用。
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| CN202310938442.XA CN117147509A (zh) | 2023-07-27 | 2023-07-27 | 一种蟹类血细胞钙稳态的亚细胞评估方法 |
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