JP3328690B2 - フローサイトメータにおいて粒子カウントの決定に用いる方法および材料 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、２種以上の異なる粒子を含む流体中に懸濁
された粒子の単位容積あたりの総数を正確に測定する方
法に関する。さらに特に、本発明は、フローサイトメー
タシステムで血液細胞の単位試料容積あたりの血球カウ
ントを決定することに関し、ここでフローサイトメータ
は分析している試料を含む懸濁液の容積を評価せずかつ
関連する血液細胞はCD4リンパ球である。さらに、本発
明は、試料を分析する間品質制御チェックとして加えら
れた粒子の使用に関する。

現在一般にヒト免疫不全ウィルス（「HIV」）と称せ
られるHTLV III即ちヒトＴ細胞白血病III型ウィルス
は、ヒト免疫不全症候群またはエイズの原因物質である
と認識されている。アメリカ合衆国および他の国々にお
いて取り上げられている流行性と考えられているエイズ
の慢性の性質が、ヒトの末梢血液中のウィルス抗原およ
びこのような抗原に対する抗体を確実に一貫して検出す
るため診断免疫検出法を開発するための過度の（surfei
t）努力および研究により熟考されている。著しい方法
で、モノクローナル抗体手法がこのような免疫検出法を
開発するため記録されている。

HIVは、レトロウィルス群のウィルスに属する。レト
ロウィルスは、ポジティブストランディッド（positive
−stranded）RNRおよび、ウィルスRNAをDNAに転写する
のに用いられる逆転写酵素と称せられる特定の酵素を核
中に保持する。これは、DNAをRNAに転写する細胞転写の
古典的方法を逆転する（reverse）。

CD4リンパ球の表面のタンパク質がHIVに対するレセプ
ターまたは結合部位として作用するため、HIVがCD4リン
パ球に結合することは知られている［Dalgleish AG等、
Nature 312:763−767（1985）］。また、HIVは、他の細
胞、例えば単球、組織マクロファージ、並びに脳、脊髄
および末梢神経中の細胞に結合し、攻撃することができ
る。HIVのライフサイクルは、ウィルスがホスト患者中
に例えば性行為または輸血を介して進入し、次に単球お
よびリンパ球上のレセプターに結合することを必要とす
る。ウィルスは細胞に進入し、この外皮またはタンパク
質被覆を剥がしてウィルスRNA核に暴露させる。逆転写
酵素は、ウィルスRNA核をDNAに転写し、これはホスト細
胞ゲノムに含まれる。ホスト細胞の膜が破壊されて新た
なウィルス粒子がヒト血液系中に放出されるまで、新た
なウィルス粒子が一定量で生成する。

現在モノクローナル抗体を用いて、ヒトがエイズ疾患
にかかっているかまたはそのウィルスに免疫学的に露出
されているかを判断することができる診断検査は商業的
に入手しうる。疾患の高い感染性および現在その治癒が
科学的可能性の範囲内にないという事実は、生存ウィル
スおよびヒト免疫系に対する悪影響を、好結果が得られ
る診断試験を開発することができるように研究すること
の困難性を増す。

現在、絶対CD4カウントは、臨床HIV疾患の進行の一般
に受け入れられた予測である。この測定の現在の方法
は、多段階試料調製を必要とし、CD4リンパ球の割合と
絶対リンパ球カウントとの両方を決定することに関する
累積的誤差を有することが知られている。この問題を解
決するために試みられた１つの方法は、1991年６月19日
のイタリア国フローレンスにおける第７回エイズ国際会
議における「ポスター」に示された。しかし、開示され
た方法は不完全であった。この理由は、方法を教示せ
ず、方法を実施することを可能としなかったためであ
る。

同様に、他のものは、２種以上の望ましくない粒子を
含む流体中に懸濁された粒子の単位容積あたりの細胞カ
ウントを測定することの一般的問題を解決するため異な
る方法および装置を提供しようと試みた。１つの方法
は、Gronerの米国特許第4,989,978号明細書に記載され
ている。しかし、この方法は、細胞および不所望な粒子
の所定の既知の容積を分析して不所望な粒子の容積を最
初の所定の容積から減じて単位容積あたりの細胞の正確
なカウントを提供しなければならないことを必要とす
る。

さらに一般的に、他のものは、試験を行い、フローサ
イトメトリー装置の較正を行う方法で種々の希釈剤に複
数の粒子を添加した。従来技術がこのような開示を多く
含むが、このような例の２つは、Rectenwald等の米国特
許第4,704,891号およびRyanの米国特許第4,331,862号で
ある。さらに、分析前に標準粒子を細胞懸濁液に加える
ことにより、「ビルトイン」基準マークを設け、これを
用いて種々の装置条件下で得られた分布に相関させるこ
とができる。Flow Cytometry and Sorting,John wile
y ＆ Sons出版社、1979において、このビルトイン手法
は、Jensen等、Multiparameter Flow Cytometry Appli
ed Toward Diagnosis of Cervical Squamous Cell Carc
inomaにより教示されている。1977年５月６〜７日のAut
omation of Cancer Cytology and Cell Image Analysis
の自動化についての第２回国際会議議事録。しかし、こ
れらの一般的な文献は、試料容積あたりの細胞カウント
の測定の問題を記載していない。

本発明において、分析している試料を含む懸濁液の容
積を測定しない装置で細胞試料の容積あたりの細胞の総
数を探知する方法を提供し、上記方法は:a）第１光散乱
信号を有する既知の量の粒子を、第１光散乱信号とは異
なる第２光散乱信号を有する既知の容積の粒子と混合し
て試料容積あたりの粒子の一定の濃度を有する懸濁液を
得;b）上記細胞懸濁液の未知の容積部分の上記粒子およ
び細胞の各々を光線を通過させ、上記粒子および細胞に
少なくとも１つの前進光散乱パターンを生じさせ;c）上
記懸濁液の上記未知容積部分の細胞数および粒子の数を
既知方法でカウントし;d）懸濁液の上記部分における粒
子および細胞の数を、上記細胞試料に添加した粒子の既
知の量に相関させることにより、試料の容積あたりの細
胞の全数を決定することを特徴とする。

本発明は、分析している試料を含む懸濁液の容積を測
定せず、最初の全体の既知容積を分析しない装置で細胞
試料の単位容積あたりの全細胞数を正確に測定する方法
に関する。細胞のカウントを別個の粒子のカウントと相
関させて最初の容積あたりの細胞のカウントを決定す
る。本方法は、細胞を感知するため光散乱トリガーを用
い、関連する細胞および添加した別個の粒子をカウント
し、同じく関連する細胞と添加した別個の粒子とを識別
するため光散乱と蛍光の二目盛分析（two scale analys
is）を使用する。さらに好ましい例において、関連する
細胞を、蛍光モノクローナル抗体で標識する。

一例において、この方法は、既知量の別個の粒子の懸
濁液を既知容量の細胞試料と混合して試料容積あたり一
定濃度の粒子を含む懸濁液を得；上記懸濁液の一部分の
細胞および粒子の数をカウントし；試料の単位容積あた
りの細胞の全数を決定することを含む。上記決定は、上
記部分のカウントした細胞かける懸濁液中の粒子の上記
既知量の数対試料容積かける上記部分中のカウントした
粒子の数を相関させることにより得られる。

他の例において、本発明の方法は、第１光散乱信号を
有する既知量の粒子の懸濁液を、第１光散乱信号とは異
なる第２光散乱信号を有する既知の容量の細胞試料と混
合して試料容積あたり一定濃度の粒子を有する懸濁液を
得；上記の粒子および細胞のそれぞれを上記細胞懸濁
液、順次光線に通し、各上記粒子および細胞は少なくと
も１つの前方光散乱パターンを発生し；上記懸濁液の部
分の細胞および粒子の数をカウントし；試料の単位容積
あたりの細胞の総数を、上記細胞試料に加えられた粒子
の既知の量に粒子および細胞の数を相関させることによ
り決定することを含む。

この方法を用いることにより、細胞試料に、細胞の処
理により行われる１つ以上の容積希釈処理を施すことが
できる。さらに特に、最初の細胞試料容積が既知である
場合には、細胞試料は分析することができるか、ステイ
ンまたはモノクローナル抗体によりタグ化された関連す
る細胞を持つかまたは最初の細胞試料容積を未知の容積
に希釈するような他の方法を施すことができる。

さらに、本発明は、カウンティング装置の操作パラメ
ータが明細書（specification）内であることを確実に
してすべての望ましい粒子を正確に感知し、一方同時に
細胞懸濁液の単位容積あたりのカウントを決定する品質
制御方法を提供する。

細胞試料と一緒に蛍光粒子を用いることより、フロー
サイトメータは粒子および細胞が光散乱および蛍光によ
り分析されるように設定したパラメータに対し作動する
光散乱を用いることができる。細胞および粒子が分析中
光散乱および蛍光により感知される場合には、フローサ
イトメータが試料の分析中適切に作動していたことが確
かめられる。

好適例において、本発明の方法はさらに、粒子の上記
光散乱パターンおよび蛍光信号を、最小装置性能（mini
mum instrument performance）のしきい値を示す所定の
比率に対して相関させ、所定の比率が得られない場合に
は、上記装置の操作を調節し、この間粒子は、測定され
た比率が上記所定の比率に到達するまで入射光内にあ
り、これにより装置が細胞懸濁液中の粒子および細胞を
分析する付加的工程を含む。

分析されている試料を含む懸濁液の容積を測定しない
装置において細胞試料の単位容積あたりの細胞の総数を
決定するために、既知の容積の試料を用いて開始するこ
とが必要である。単位容積あたりの細胞カウントを決定
する正確さは部分的に、試料容積の測定の正確さに部分
的に依存する。

単位容積あたり関連する細胞の数を迅速に得るため
に、全血を溶解し、当業者に知られている方法により、
赤血球を除去することが好ましい。これらの方法は、低
浸透圧溶解、酸溶解、並びに磁性粒子または異質細胞集
団から選択された集団を分類し分離するため抗体で被覆
したミクロスフィアを用いることを含む。溶解方法の選
択の唯一の制限要因は、白血球の完全性を保存すること
である。さらに特に、本発明の好適例において、全血の
溶解の好ましい方法は、クールター社のエピックス デ
ィビジョンにより供給されるクールター（登録商標）イ
ムノプレップ エピッタス（登録商標）による方法であ
る（クールターおよびエピックスは、アメリカ合衆国ハ
イアレア州フロリダ所在のクールター社の登録商標であ
る）。当業者に知られているように、この好ましい溶解
方法は、低浸透圧溶解である。

フローサイトメータが全血中の関連する白血球および
赤血球との間の区別が可能であるが、全血試料の評価
は、光散乱トリガーを用いる際には分析するのに長時間
を必要とする。長時間は、赤血球および白血球の両者を
分析しなければならないサイトメータにより決まる。さ
らに特に、正常の血液中の白血球のカウントは、リンパ
球の値20〜40％でマイクロリットル（μＬ）あたり5,00
0〜11,000であり、赤血球はマイクロリットル（μＬ）
あたり4,000,000〜5,000,000である。従って、5,000の
リンパ球のカウントを数えるために、約１千万〜３千万
の細胞を分析する。

全血を溶解した後、残りの白血球を次に、当業者に知
られている方法により同定する。このような同定手段に
は，染色、リガンド、プローブおよびモノクローナル抗
体が含まれる。染色、リガンド、プローブまたはモノク
ローナル抗体の選択により、関連する選択された白血球
の細目を同定し迅速な方法により正確に識別することが
できる。

細胞試料の最初の容積を測定した後、知られている数
の別個の粒子を、随意に溶解し、標識した関連する白血
球を同定した血液試料に加える。

当業者に知られている生物学的および可塑性別個粒子
を本発明において用いることができる。別個粒子は、希
釈される担体並びにカウントする装置の試験プローブに
関して不活性である必要がある。さらに、別個粒子は０
〜30℃の普通の作業温度において安定でなければならな
い。不安定粒子は、ヒストグラム位置でシフトする傾向
があり、試料容積あたりの細胞の測定に対して不明確に
寄与する。本発明の重要な特徴は、粒子が関連する細胞
に類似する性質の特徴を有する必要がないことである。
さらに特に、粒子は関連する細胞の容積、大きさ、蛍
光、光散乱、インピーダンス、またはクールター不透明
性を再現する必要がない。細胞の特徴と異なる特徴を有
する粒子を用いると、細胞の数の重複が除去されて誤っ
たまたは不正確の結果を発生させる。

好ましくは、別個粒子の密度は細胞の密度に近くなけ
ればならない。さらに特に、粒子の密度は1.0グラム／
ミリリットルより大きくなければならない。これは好都
合である。この理由は、密度が試料中の細胞と実質的に
不均衡である場合には、別個粒子が、すぐに分析されな
い場合に試料中に沈降する傾向があるからである。この
ように、別個粒子が細胞の密度と実質的に不均衡である
場合には、不均一な混合物を分析することができず、こ
れは単位容積あたりの細胞の数の不正確な決定の一因と
なる。従って、粒子の密度が細胞試料の密度と20％以上
異なる場合は、細胞−粒子懸濁液を調製の30分以内に分
析しなければならない。さらに好ましくは、粒子の密度
は、細胞と５％未満で異ならなければならず、細胞−粒
子懸濁液を調製して４時間以内に分析しなければならな
い。

本発明の好ましいタイプの粒子はプラスチック微小球
である。このような小球は、ほぼ均一な直径で製造する
のがよく、発蛍光剤または他のマーキング剤が表面に結
合するのに適する表面特性を有するのがよい。0.5〜20
μの直径を有するほぼ球形の小球を形成することができ
る。小球は通常固体形態でつくられるが、これらは内側
が中空であり小嚢または他の微小担体とすることができ
る。さらに、小球は、本発明においての作用をするため
に、完全な球形である必要はない。プラスチック材料例
えばポリスチレン、ポリアクリルアミドおよび他のラテ
ッスク材料を用いて小球をつくることができ、また他の
プラスチック材料例えばポリ塩化ビニル、ポリプロピレ
ン等も用いることができる。

プラスチック粒子を用いる場合には、これらを処理し
て、プラスチック粒子が細胞−粒子試料中の細胞に接着
するのを防止し、かつプラスチック粒子が互いに凝集す
るのを防止する必要がある。これらの２つの障害を除去
して粒子が別個のままであり、正確に区別することがで
きるようでなければならない。

プラスチック粒子が、関連する細胞に接着することを
防止するために、粒子をこの傾向を解消するような物質
で被覆するのがよい。このような物質には、ウシ血清ア
ルブミン、糖脂質、ポリビニルピロリドンまたはプラス
チック粒子の生化学反応性を変化させて関連する細胞に
結合させないようにする他の物質が含まれる。本発明の
目的のため、ウシ血清アルブミンを用いるのが好まし
い。

プラスチック粒子の凝集は、別個プラスチック粒子の
表面変化に起因すると考えられる。この現象は、前記被
覆処理により解決することができることを見出した。し
かし、さらに、担体のpHが凝集問題の解決に寄与すると
考えられる。さらに、非イオン性活性剤を用いることが
この問題の解決に寄与すると考えられる。

粒子の貯蔵および懸濁液の媒質として用いられる担体
は、選択された粒子材料およびカウンティング装置のタ
イプに化学的および物理的に適合しなければならない。
従って、導電性の変化を用いてカウントを計算するこれ
らのカウンティング装置で用いるためには，担体は導電
性でなければならない。導電性の原理を用いるカウンテ
ィング装置を使用する当業者は、担体の導電率は、装置
の示したカウントに大きく影響することがわかる。従っ
て、担体の標準の導電率が用いられ、塩化ナトリウムの
0.8％等モル濃度の導電率である。

一方、光散乱原理を用いるこれらのカウンティング装
置に関して、担体は、光学的に伝導性である（または透
明、即ち極めて低い吸収係数を有する）必要がある。し
かし、光散乱原理を用いるカウンティング装置を用いる
当業者は、あるプラスチック粒子、例えばDNAチェック
ビーズを用いる際に、これらは凝集する傾向があること
がわかる。前記したように、凝集は別個のプラスチック
粒子の静電気的引力に起因し、これは担体中の塩濃度に
関連する。従って、このような粒子を光散乱装置に用い
る際には、担体はプラスチック粒子の凝集を発生させな
い。

本発明の好適例において、担体は加えられた別個粒子
の密度に等しいかまたはこれより大きくなければならな
い。好ましくは、担体の密度は０〜15％であり、さらに
好ましくは別個粒子の密度より０〜５％大きい。担体密
度が別個粒子と実質的に不均衡である場合には、粒子は
担体溶液の底に沈むかまたは上部に浮く傾向があり、こ
の結果、不均質粒子懸濁液となる。均質な粒子懸濁液
は、既知のカウントの粒子を細胞試料に加える操作を容
易にするのに望ましい。

さらに好ましくは、担体はグリセロールの水溶液を含
み、最も好ましくは17〜21容量％の水溶液を含む。しか
し、当業者に知られているように、他の既知の媒体、例
えばスクロース、フィコールハイパック（登録商標）
（ファマシアL.K.Bバイオテクノロジー製）およびパー
コール（登録商標）（ファマシアL.K.Bバイオテクノロ
ジー製）を用いて担体密度を増加させることができる。
DNAチェックビーズが選択した粒子である際には、担体
は、1.03グラム／ミリリットルから５％以内の差異であ
る密度を有する。

粒子および担体の寿命を最大にし、さらに粒子の凝集
を防止するために、担体のpHは担体中の粒子および他の
添加物に適合することが重要である。ラテックス材料の
粒子と一緒に用いるためには、例えば、一般に6.0〜8.0
の範囲内のpHが受け入れられ、好ましい範囲は6.9〜7.3
であることを見出した。担体のpHが高すぎるかまたは低
すぎる場合は、ラテックス粒子が凝集し、これにより粒
子の既知の総数が減少し、さらに凝集体の大きさが、粒
子をカウントする装置の能力の範囲外まで増加すること
を見出した。凝集という用語は広く用いられ、粒子のダ
ブレット（doublet）およびトリプレット（triplet）の
形成を含み、これははるかに大きい粒子の凝集の形成と
して有害であると考えられる。

さらに、担体中に低いが十分な濃度の保存剤を含んで
細菌および菌類の担体中または粒子上での成長を防止す
るのが好ましい。さらに特に、保存剤は、凝集をおこす
かまたは蛍光を加えることにより背景ノイズ（backgrou
nd noise）を増加させない殺菌剤であるのが好ましい。
担体の他の成分および粒子材料と相溶性である任意の添
加剤が受け入れられるが、保存剤をモノアルデヒド例え
ばホルムアルデヒドまたはジアルデヒド例えばグルタル
アルデヒドを含む有機アルデヒド；有機アルコールを含
むアルコール、例えば脂肪族および環式アルコール、例
えばフェノール、トルエン、エタノールおよびプロパノ
ールを含むアルコール；およびフッ化ナトリウムおよび
アジ化ナトリウムから成る群から選ぶのが好ましい。さ
らに好ましくは、選択された添加剤はホルムアルデヒド
であり、担体液体の容積の約0.5〜2.5％の範囲内、好ま
しくは1.0％の量で用いる。

適切な界面活性剤を加えた場合には、担体の安定性を
増加させることができる。しかし、選択された界面活性
剤は、関連する細胞に有害に作用してはならない。好ま
しくは，このような界面活性剤は、非イオン型であり、
粒子凝集を最小にするのに必要な最小の量で存在する。
担体中に界面活性剤が多すぎると泡が発生し、また細胞
の破壊が発生し、一方界面活性剤が少なすぎると所望の
程度の安定性が得られない。

既知のカウントの粒子を細胞試料に加える好ましい操
作は、別個粒子を含む担体の選択された容積をピペット
で入れることを含む。単位容積あたりの細胞カウントを
決定する正確さは、部分的にこの粒子懸濁液の容積測定
の正確さに依存する。この方法により、細胞試料に加え
ることができるビーズの数は、１％以内と知られてい
る。しかし、既知のカウントの粒子を細胞試料に加える
当業者に知られている任意の方法を用いることができ
る。

未知の容積部の細胞試料および粒子を、別個粒子の数
および関連する細胞の数を測定するのに有効な方法によ
り分析する。この方法は、光散乱トリガーリング、次に
光散乱およびフローサイトメータでの蛍光測定を含む。

代表的なフローサイトメータ装置において、細胞およ
び他の別個粒子は液体流に流され、従ってそれぞれの細
胞および粒子は好ましくは１度に１つ、物理的および化
学的特徴の１つ以上を測定する検出領域を通過する。

感知方法は，良く知られたクールター原理；蛍光；吸
光；光散乱；消光；蛍光偏向および蛍光信号波形に基づ
いた粒子容積に関連する電気的インピーダンスを含む。
これらの感知方法の任意の１つ以上を用いて分析の設定
された特定のパラメータを活性化することができる。

討議を確実化する目的および例示的目的のため、フロ
ーサイトメータに言及し、ここで細胞および粒子の液体
流を、シース流体中で覆って、細胞および粒子の流れが
この流れに対して直角に向けられた入射光を通って流れ
る際に流れを水力学的に集中させる。細胞および粒子が
光線を通過するので、各細胞および粒子に関連する光特
性は、装置のオペレータにより最適に選択される分析の
設定される特定のパラメータを誘導する。蛍光および光
散乱が光学的信号であるが、パラメータ設定のトリガー
として用いた際には、それぞれは異なる作用および効果
を有する。

光散乱トリガーを用いた際には、入射光を通過する各
細胞および粒子は、接合シリコンフォトダイオード（ju
nction silicon photodiode）により感知される。光散
乱が粒子の大きさ、形状、密度、色素の取り込みおよび
粒度により影響されるため、これらの１つ以上の基準を
用いて細胞分析を活性化することができる。このように
して、細胞分析を、細胞および粒子をこれらの基準の上
限または下限しきい値に合わせるのに細胞および粒子を
必要とすることにより活性化する。

蛍光トリガーを用いる際には、蛍光を有するこれらの
細胞および粒子のみが、光信号を電気信号に変換する増
倍型光電管により感知される。蛍光細胞および粒子は入
射光を吸収し、入射光源と異なる波長の蛍光信号を発生
する。蛍光は、照度および信号強度の均一性により影響
される。照度均一性は光源の安定性およびその空間強度
分布と関連付けられる。蛍光信号強度は、種々の装置特
性に依存し、励起光強度、試料流速、光源および染料の
励起スペクトル、染料の量効率、光検出オプティックス
の収光および透過効率および光検出器の感度が含まれ
る。このようにして、細胞および粒子分析を、粒子に蛍
光信号強度の上限または下限しきい値を満足することを
要求することにより活性化する。

本発明の目的のために、粒子検出方法は光散乱トリガ
ーを含む。これにより、懸濁液中のすべての粒子を、設
定した選択パラメータにより分析することができる。さ
らに、光散乱トリガーは、蛍光染色の信号強度に依存せ
ず、これは細胞上で細胞基準により変化することができ
る。さらに特に、光散乱トリガーを用いることは、２通
りの利益を与える。

第１に、細胞を分析する際に、光散乱トリガーは、細
胞試料中の３つのタイプの白血球を区別する可能性を提
供し、さらに、マーカーまたはタグを用いることによ
り、選択された白血球のクラスター表示を検出すること
ができる。

第２に、光散乱トリガーを用いることにより、装置性
能の現場での品質管理が可能になる。さらに特に、装置
は最初に細胞および別個の粒子を、これらの特徴により
左右されるが、光散乱により感知し、測定の設定される
あるパラメータをトリガーする。このようなパラメータ
設定は、光散乱および１つ以上の他の感知特性の同時測
定を含む。これは、すべての粒子が検出され、これによ
り試料懸濁液中の粒子および細胞の正確な再現を提供す
るという利点を有する。

さらに、光散乱トリガーは、試料懸濁液の分析中、装
置のオペレータが、装置が性能明細書（performance sp
ecification）内で作動し、試料懸濁液を分析している
ことの保証を持つことができる利点を有する。さらに特
に、試料懸濁液を分析している間、技術者は、ヒストグ
ラムにおける適切な位置で既知の別個の粒子および既知
の別個の粒子の信号強度の増幅を検出し、報告する性能
により、装置の配列を確かめ、所要に応じて調整するこ
とができる。

これらのパラメータは、制限された量の関連する細胞
を含むかまたは制限された量であるかまたは装置により
検出される汚染物を含む試料懸濁液を分析する間は明ら
かでない。基本的に、オペレータは、分析している間測
定によりフォーカスして機械が正確に作動していること
を決定することにより分析を確認することができる。

最も好ましい例において、試料懸濁液を、光散乱およ
び蛍光の同時測定により分析して、光散乱のみまたは蛍
光のみの測定より顕著に正確な細胞の感知を提供する。
従って、赤血球を溶解した細胞懸濁液中の蛍光粒子およ
びCD4リンパ球の蛍光マーカーを用いる際には、別個の
粒子および関連する細胞の光散乱をトリガーし、光散乱
および蛍光で検出を確認することにより品質管理を確か
めることができる。これらの２つの信号を相関すること
により、照度の均一性、信号強度および関連する細胞と
別個の粒子との間の区別の改善を確実にすることができ
る。

本発明の最も好ましい例において、細胞−粒子懸濁液
をさらに分析して、白血球の３つの主な集団（即ちリン
パ球、単球および顆粒球）を区別し、さらに単一アッセ
イによりCD4リンパ球を決定する。この例において、蛍
光トリガーリングは有利でない。この理由は、すべての
関連する細胞および粒子が、正確でかつ再現性の測定が
できる蛍光強度を有するとは限らないからである。

粒子および細胞の測定は、懸濁液が流れの定常状態に
達した後に行う。これにより、懸濁液流の水力学的不安
定性を除去することができる。これらの不安定性は、粒
子および細胞がきつくまたはゆるく結合している際には
分析の最初および最後に最も明らかである。さらに、定
常状態流動の間、懸濁液は測定を妨げる傾向がある気泡
をほとんど含まない。粒子分布の頻度がほぼ等しい場合
には、定常流速が達成される。これは、単位容積あたり
の細胞カウントを決定するのに最も正確な間隔を提供
し、この結果正確さは95％より大である。

本発明の特徴および利点を以下の制限するものでない
実施例によりさらに十分に示す。

実施例１ プラスチックミクロスフィアの製造 材料 1.測定できる程度の蛍光強さを有するプラスチックミク
ロスフィア 2.グリセロール、ACS 3.マンニトール、ACS 4.ウシ血清アルブミン（BSA）（35％溶液） 5.ホルムアルデヒド（36％）,ACS 6.脱イオン化蒸留水 工程 1.プラスチックミクロスフィアを0.1％BSA＋１％マンニ
トールを含む水に懸濁させ、周囲条件で、60分間、揺動
しながら温置した。

2.プラスチックミクロスフィアを、揺りバケット型の遠
心分離機を用いて、周囲条件で、５分間、1000RPM（200
×Ｇ）で、遠心分離した。

3.上澄みを除去して廃棄した。

4.プラスチックミクロスフィアを0.1％BSA＋１％マンニ
トールを含む水に再び懸濁させ、周囲条件で、60分間、
揺動しながら温置した。

5.一晩揺動することを除いて、段階2,3,及び４を繰り返
した。

6.段階２及び３を繰り返した。

7.すべてのプラスチックミクロスフィアの１部に対し
て、0.1％BSA＋１％マンニトール＋1.0％ホルムアルデ
ヒド＋20％グリセロールを含む水50部（瓶詰溶液）割合
で、プラスチックミクロスフィアを再び懸濁した。

8.ガラス瓶に移して、５分間超音波処理をした。

9.遂次稀釈して、100μ あたり10,000プラスチックミ
クロスフィア（＋／−100）がある瓶詰溶液を製造し
た。

実施例２ CD4リンパ球測定用試料懸濁液の製造及び分析 1.全血試料100μ を12×75mmのポリプロピレン試験管
に入れた。

2.CD4リンパ球細胞に標識をつけるために用いられるCD4
モノクローナル抗体試薬10μ を上記の試験管に加えて
懸濁液を形成し、この懸濁液をかきまぜた。

3.周囲条件で10分間培養を続けた。

4.懸濁液を溶解して赤血球を除去した。

5.実施例１で記載したように処理した100,000のプラス
チックミクロスフィアを加えた。

6.試験管の高さの50％まで試料を再びかき混ぜた。

7.分析の前直ちに、５秒間、試験管の高さの50％まで再
びかき混ぜた。

8.次に、、EPICS（登録商標）プロファイル エリト
サイトメータを用いて、当業者に知られているフローサ
イトメトリー法によって、試料懸濁液を分析し、試料単
位容積あたりCD4リンパ球のカウントを得た。

実施例３ 培養された白血球細胞試料の製造及び分析 全血の代わりに培養された白血球細胞100μ を使用
し、かつ、CD4モノクローナル抗体試薬の代わりにヨー
ド化プロピディウム試薬を使用することを除いて、実施
例２の方法を繰り返した。20分間培養して非生存細胞に
ヨウ素を結合させた後、実施例の段階４乃至８を繰り返
した。この結果、試料単位容積あたり生存培養細胞の数
を得た。

実施例４ 網状赤血球試料懸濁液の製造及び分析 全血の使用量が100μ ではなくて単に２μ である
こと、及びCD4試薬の代わりにチアゾル オレンジのよ
うな網状赤血球試薬を使用することを除いて、実施例２
の方法を繰り返した。約10分間の培養をしてから、実施
例２の段階５乃至８を繰り返した。この結果、試料単位
容積あたり網状赤血球の数を得た。

本発明を特定の具体例及び組成によって説明したが、
本発明の範囲に従うと、数多くの変形、変化及び具体化
が可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 15/14 Ｇ０１Ｎ 15/14 Ｐ (72)発明者 ウッド ジェームス シー エス アメリカ合衆国 フロリダ州 33071 コーラル スプリングス エヌ ダブリ ュー ワンハンドレットツェンティシッ クスス ウェイ 1806 審査官 郡山 順 (56)参考文献 欧州特許出願公開470810（ＥＰ，Ａ １) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/49 G01N 15/00 G01N 15/02 G01N 15/14

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】分析している試料を含む懸濁液の容積を測
   定しない装置で細胞試料の容積あたりの細胞の総数を探
   知する方法において： a.第１光散乱信号を有する既知の量の粒子を、第１光散
   乱信号とは異なる第２光散乱信号を有する既知の容積の
   細胞試料と混合して試料容積あたりの粒子の一定の濃度
   を有する懸濁液を得； b.上記細胞懸濁液の未知の容積部分の上記粒子および細
   胞を順次光線を通過させ、上記粒子および細胞が少なく
   とも１つの前進光散乱信号を生じ； c.上記懸濁液の上記未知容積部分の細胞の数および粒子
   の数を、光散乱トリガーを用いるフローサイトメータを
   用いることによりカウントし； d.光散乱測定および蛍光測定を用いて、懸濁液の上記部
   分中の粒子および細胞の数を、上記細胞試料に添加した
   粒子の既知の量と相関させることにより、試料の容積あ
   たりの細胞の総数を決定する ことを特徴とする、分析している試料を含む懸濁液の容
   積を測定しない装置で細胞試料の容積あたりの細胞の総
   数を探知する方法。
2. 【請求項２】分析している試料を含む懸濁液の容積を測
   定しない装置で細胞試料の容積あたりの細胞の総数を探
   知する方法において： a.既知量の粒子を既知の容積の細胞試料と混合して、試
   料容積あたりの粒子の一定の濃度を有する懸濁液を得、
   上記粒子は上記懸濁液中の細胞から分離したままであ
   り； b.上記懸濁液の未知の容積部分中の細胞の数および粒子
   の数を、光散乱トリガーを用いるフローサイトメータを
   用いることによりカウントし； c.光散乱測定および蛍光測定を用いて、懸濁液の上記未
   知容積部分中の粒子および細胞の数を、上記細胞試料に
   添加した粒子の既知の量と相関させることにより、試料
   の容積あたりの細胞の総数を決定する ことを特徴とする、分析している試料を含む懸濁液の容
   積を測定しない装置で細胞試料の容積あたりの細胞の総
   数を探知する方法。
3. 【請求項３】上記粒子が細胞試料中細胞と密度差が20％
   より少ないことを特徴とする請求の範囲１または２記載
   の方法。
4. 【請求項４】さらに（ｅ）粒子の上記光散乱信号および
   蛍光信号を装置性能の最小限界を表す所定の比に相関さ
   せ、（ｆ）所定の比が得られなかった場合には、粒子を
   入射光線の中に置きながら、測定比が上記所定の比に達
   するまで、上記の装置の操作を調節することを特徴とす
   る細胞試料の容積あたり細胞の総数を測定する中、カウ
   ンティング装置の操作パラメータを規定範囲内に維持す
   ることをさらに含み、かつ上記粒子の蛍光が既知波長を
   有する請求の範囲１または２記載の方法。
5. 【請求項５】上記粒子を細胞試料中の細胞に付着しない
   ように処理してあることを特徴とする請求の範囲１記載
   の方法。