JP2711786B2 - 試薬組成物とその細胞球形化への使用 - Google Patents
試薬組成物とその細胞球形化への使用Info
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Description
【０００１】
【発明の技術分野】本発明は試薬組成物と細胞分析での
その使用、更に特別には、光散乱と吸収および／または
蛍光流通式細胞測定（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）
技術による、多数の細胞の体積及び／または蛋白質濃度
と蛋白質含有量および／または核酸含有量との改良され
た電子光学的測定のための全血試料の調製へのその使用
とに関する。
その使用、更に特別には、光散乱と吸収および／または
蛍光流通式細胞測定（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）
技術による、多数の細胞の体積及び／または蛋白質濃度
と蛋白質含有量および／または核酸含有量との改良され
た電子光学的測定のための全血試料の調製へのその使用
とに関する。
【０００２】
【先行技術の説明】細胞測定分野、即ち光ビームを用い
（通常は種種な顕微鏡を通して）細胞の相互作用を測定
することにより、個個の細胞の性質を定量的に決定する
科学の誕生に当り、Ｃａｓｐｅｒｓｓｏｎ（Ｃａｓｐｅ
ｒｓｓｏｎ Ｔ．，Ｓｋａｎｄ．Ａｒｃｈ．Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．，１９３６，７３ Ｓｕｐｐｌ．８，１−１５
１）は球形細胞の中心に点光源の焦点を合せることによ
って、細胞を通る凡ての光経路は正確に細胞直径と同じ
で等しいと云うことを納得したと指摘した。原則的に、
このことは細胞の測定された光学密度から、光吸収分子
種の濃度の正確な測定を可能にしている（Ｐｏｌｌｉｓ
ｔｅｒ，Ａ．Ｗ．およびＯｒｎｓｔｅｉｎ，Ｌ．，“Ｔ
ｈｅ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａ
ｎａｌｙｓｉｓｏｆ Ｃｅｌｌ”ｉｎ Ｍｅｌｌｏｒ
ｓ，Ｒ．Ｃ．，Ｅｄ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｙｔ
ｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌ
ｌ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９５９，４３１−５１８）。し
かし球形でない細胞の完全な球への制御された変換によ
り細胞により散乱された光の流通式細胞測定データの解
析が非常に改善出来るまでには約５０年すぎた（以下に
議論されるＫｉｍとＯｒｎｓｔｅｉｎおよびＴｙｃｋｏ
を見よ）。本発明のそのような制御された球形化におけ
る尚一層の改善は実質的に細胞の制御された球形化の利
用を、吸収／散乱流通式細胞測定法による細胞内の少量
の吸収分子の鋭敏な測定、並にＴｙｃｋｏ法による、細
胞体積と細胞全蛋白質濃度（あるいは相当して、屈折
率、密度または全細胞固形物）の正確な同時測定のため
への使用にまで拡張する。
（通常は種種な顕微鏡を通して）細胞の相互作用を測定
することにより、個個の細胞の性質を定量的に決定する
科学の誕生に当り、Ｃａｓｐｅｒｓｓｏｎ（Ｃａｓｐｅ
ｒｓｓｏｎ Ｔ．，Ｓｋａｎｄ．Ａｒｃｈ．Ｐｈｙｓｉ
ｏｌ．，１９３６，７３ Ｓｕｐｐｌ．８，１−１５
１）は球形細胞の中心に点光源の焦点を合せることによ
って、細胞を通る凡ての光経路は正確に細胞直径と同じ
で等しいと云うことを納得したと指摘した。原則的に、
このことは細胞の測定された光学密度から、光吸収分子
種の濃度の正確な測定を可能にしている（Ｐｏｌｌｉｓ
ｔｅｒ，Ａ．Ｗ．およびＯｒｎｓｔｅｉｎ，Ｌ．，“Ｔ
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ｎａｌｙｓｉｓｏｆ Ｃｅｌｌ”ｉｎ Ｍｅｌｌｏｒ
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ｏｌｏｇｙ，２ｎｄ Ｅｄ．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌ
ｌ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９５９，４３１−５１８）。し
かし球形でない細胞の完全な球への制御された変換によ
り細胞により散乱された光の流通式細胞測定データの解
析が非常に改善出来るまでには約５０年すぎた（以下に
議論されるＫｉｍとＯｒｎｓｔｅｉｎおよびＴｙｃｋｏ
を見よ）。本発明のそのような制御された球形化におけ
る尚一層の改善は実質的に細胞の制御された球形化の利
用を、吸収／散乱流通式細胞測定法による細胞内の少量
の吸収分子の鋭敏な測定、並にＴｙｃｋｏ法による、細
胞体積と細胞全蛋白質濃度（あるいは相当して、屈折
率、密度または全細胞固形物）の正確な同時測定のため
への使用にまで拡張する。
【０００３】凡ての高等動物においては、血液は種種な
小体、赤色血液細胞（赤血球）と白色血液細胞（白血
球）と血小板とが懸濁されている水性流体部分（血漿）
から成る。血漿は、大約水９０％、蛋白質０．９％およ
び痕跡の他の材料例えば糖、尿素、尿酸などより成る組
成を持っている。
小体、赤色血液細胞（赤血球）と白色血液細胞（白血
球）と血小板とが懸濁されている水性流体部分（血漿）
から成る。血漿は、大約水９０％、蛋白質０．９％およ
び痕跡の他の材料例えば糖、尿素、尿酸などより成る組
成を持っている。
【０００４】末梢血液（即ち、骨髓外部の血液）の細胞
あるいは小体は２つの主要な群、酸素の輸送を主要目的
とする赤血球と主要機能が免疫システムおよび体に異質
な材料の破壊に関する白血球とに分けられる。この２つ
の主要な群に加えて、血液はまた止血で重要な所謂血小
板を含有する。
あるいは小体は２つの主要な群、酸素の輸送を主要目的
とする赤血球と主要機能が免疫システムおよび体に異質
な材料の破壊に関する白血球とに分けられる。この２つ
の主要な群に加えて、血液はまた止血で重要な所謂血小
板を含有する。
【０００５】赤血球の成熟の最終段階はそれが骨髓から
離れた後、末梢血液中を循環し乍ら起る。これらの若い
赤色細胞即ち“網状赤血球”（以下、網赤血球とも言
う）は核を失い、従って分裂する、あるいはリボ核酸
（ＲＮＡ）を合成する能力を失う。これらの機能は止む
けれども、網赤血球は未だ代謝的には活性であり、しば
らく、蛋白質を合成し、ヘム合成のため鉄を取り込みそ
してエネルギー豊富な状態を維持するのに必要な代謝反
応を行うことができる。これらの細胞は通常、網赤血球
中のアニオン性のＲＮＡと反応し、網赤血球中の、網赤
血球にその名を与える、細いあるいは粗い染色された
“細網”中に沈澱するカチオン染料溶液にそれらの細胞
を曝すことにより、容易に成熟赤血球から区別される。
離れた後、末梢血液中を循環し乍ら起る。これらの若い
赤色細胞即ち“網状赤血球”（以下、網赤血球とも言
う）は核を失い、従って分裂する、あるいはリボ核酸
（ＲＮＡ）を合成する能力を失う。これらの機能は止む
けれども、網赤血球は未だ代謝的には活性であり、しば
らく、蛋白質を合成し、ヘム合成のため鉄を取り込みそ
してエネルギー豊富な状態を維持するのに必要な代謝反
応を行うことができる。これらの細胞は通常、網赤血球
中のアニオン性のＲＮＡと反応し、網赤血球中の、網赤
血球にその名を与える、細いあるいは粗い染色された
“細網”中に沈澱するカチオン染料溶液にそれらの細胞
を曝すことにより、容易に成熟赤血球から区別される。
【０００６】網赤血球は正常では全赤色血液細胞個体群
の約０．５〜２％含まれているが、この百分率は、異常
状態では劇的に変り得る。例えば網赤血球数は長年、血
液疾患を研究する場合の診断学的助けとして、そして出
血に引続く赤色血液細胞再生の指数として、並にある種
の悪性疾患の化学療法における早期の毒性の監視のため
に用いられて来た。
の約０．５〜２％含まれているが、この百分率は、異常
状態では劇的に変り得る。例えば網赤血球数は長年、血
液疾患を研究する場合の診断学的助けとして、そして出
血に引続く赤色血液細胞再生の指数として、並にある種
の悪性疾患の化学療法における早期の毒性の監視のため
に用いられて来た。
【０００７】核酸（ＲＮＡとＤＮＡ）は実際上どんなカ
チオン染料でも染色できるポリアニオンである。網赤血
球中のＲＮＡはほんの少しのカチオン染料｛ブリリアン
トクレジルブルー（ＢＣＧ）とニューメチレンブルー
（ＮＭＢ）とオーラミンＯ（ＡｕＯ）とアクリジンオレ
ンジ（ＡＯ）とチアゾールオレンジ（ＴＯ）とピロニン
Ｙ（ＰＹ）とを含む｝でだけ染色できる。その部分集合
はＮＭＢとＡＯとを含む。網赤血球染色の速さと度合い
とは染料の細胞外濃度と網赤血球膜を通しての染料の透
過速度と、そのカチオン染料と網赤血球ＲＮＡとの間の
特異的結合恒数の強さとに左右される。後２者の性質は
異っていて各染料について容易には予言できず、それ故
有用な網赤血球染色を発見するには試行錯誤が必要であ
る。凡てのカチオン物質が本来の赤色細胞（および網赤
血球）膜を透過できるわけでなく、必然的にカチオンを
伴うアニオンの本性がそのカチオン物質が速かに、遅く
あるいは全く透過するか、しないかに影響し得る。疎水
性分子は一般に親水性分子より速く赤色細胞膜を透過
し、小さい分子は一般に大きい分子より速く膜を透過す
る。網赤血球を染色できるカチオン染料と混合された塩
または緩衝剤の部分集団のみが迅速な染色を可能にし、
即ち、“誤った”緩衝剤とでは“正しい”染料でも網赤
血球を染色するに“永久の”時間がかかる。又再び、網
赤血球染色混合物の有用な処方を発見するには試行錯誤
が必要である。それ故、指針として用いることができる
種種な“法則”にも拘らず、特別なカチオン染料が速か
に透過し、網赤血球を染色するかどうか、どう云う条件
の下で速に透過し、染色するかを直観的に予見すること
は未だ出来ない。
チオン染料でも染色できるポリアニオンである。網赤血
球中のＲＮＡはほんの少しのカチオン染料｛ブリリアン
トクレジルブルー（ＢＣＧ）とニューメチレンブルー
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ンジ（ＡＯ）とチアゾールオレンジ（ＴＯ）とピロニン
Ｙ（ＰＹ）とを含む｝でだけ染色できる。その部分集合
はＮＭＢとＡＯとを含む。網赤血球染色の速さと度合い
とは染料の細胞外濃度と網赤血球膜を通しての染料の透
過速度と、そのカチオン染料と網赤血球ＲＮＡとの間の
特異的結合恒数の強さとに左右される。後２者の性質は
異っていて各染料について容易には予言できず、それ故
有用な網赤血球染色を発見するには試行錯誤が必要であ
る。凡てのカチオン物質が本来の赤色細胞（および網赤
血球）膜を透過できるわけでなく、必然的にカチオンを
伴うアニオンの本性がそのカチオン物質が速かに、遅く
あるいは全く透過するか、しないかに影響し得る。疎水
性分子は一般に親水性分子より速く赤色細胞膜を透過
し、小さい分子は一般に大きい分子より速く膜を透過す
る。網赤血球を染色できるカチオン染料と混合された塩
または緩衝剤の部分集団のみが迅速な染色を可能にし、
即ち、“誤った”緩衝剤とでは“正しい”染料でも網赤
血球を染色するに“永久の”時間がかかる。又再び、網
赤血球染色混合物の有用な処方を発見するには試行錯誤
が必要である。それ故、指針として用いることができる
種種な“法則”にも拘らず、特別なカチオン染料が速か
に透過し、網赤血球を染色するかどうか、どう云う条件
の下で速に透過し、染色するかを直観的に予見すること
は未だ出来ない。
【０００８】流通式細胞測定法の基礎的な概念は本質的
に、細胞を１時に１つ特異的センシング領域を通過させ
ることである。典型的には、水力学的集束の方法によ
り、単一の細胞を、集束されている光源と、散乱、吸収
または蛍光を発した光の測定のための検出システムとか
ら成るセンシング帯を通過させる。
に、細胞を１時に１つ特異的センシング領域を通過させ
ることである。典型的には、水力学的集束の方法によ
り、単一の細胞を、集束されている光源と、散乱、吸収
または蛍光を発した光の測定のための検出システムとか
ら成るセンシング帯を通過させる。
【０００９】粒子がさえぎる光に対する影響は多くの方
法で検出できる。一般に粒子はそれが懸濁している媒質
の屈折率とは異る屈折率を持っている。それ故、それは
それが照明されている光を、ある範囲の角度を通し、そ
して屈折率差と粒子寸法とその形と屈折率における内部
変化と構造並に照明する光の波長とに左右されるさまざ
まな強度で散乱することになる。（均一な球に対して
は、Ｍｉｅ散乱理論が散乱光の分布と強度とに関し完全
な記述を与える。）粒子はまた入射光の或る程度を吸収
してもよい。後者の場合、吸収された光の一部は、典型
的には吸収光の波長より長い波長で蛍光として再放射さ
れてもよい。
法で検出できる。一般に粒子はそれが懸濁している媒質
の屈折率とは異る屈折率を持っている。それ故、それは
それが照明されている光を、ある範囲の角度を通し、そ
して屈折率差と粒子寸法とその形と屈折率における内部
変化と構造並に照明する光の波長とに左右されるさまざ
まな強度で散乱することになる。（均一な球に対して
は、Ｍｉｅ散乱理論が散乱光の分布と強度とに関し完全
な記述を与える。）粒子はまた入射光の或る程度を吸収
してもよい。後者の場合、吸収された光の一部は、典型
的には吸収光の波長より長い波長で蛍光として再放射さ
れてもよい。
【００１０】これらおよび他の影響は散乱された光と散
乱されない光と蛍光との種種な角度間隔を測定するため
に備えられている光検出器で測定できる。
乱されない光と蛍光との種種な角度間隔を測定するため
に備えられている光検出器で測定できる。
【００１１】粒子が細胞程、典型的には直径１５μｍ以
下程に小さい場合、高速での（典型的には広く間隔をあ
けられた細胞毎秒数１００〜数１０００個）通過により
影響され、そして特に懸濁液流の照明されている部分に
落ちる毎秒当りの光子数に比較した。｛そして吸収検出
器（および蛍光検出器）のバックグランド照明に比較し
て｝照明ビーム中の光子数は非常に小であり得る。それ
故粒子間の小さい特別な差異検出感度の限界は決定的に
は光子流束（少くとも光源の本来の“輝度”に左右され
る）と粒子間の他の大小の差により生ずる光子流束の攝
動がどれ程大きいかとにより左右される。
下程に小さい場合、高速での（典型的には広く間隔をあ
けられた細胞毎秒数１００〜数１０００個）通過により
影響され、そして特に懸濁液流の照明されている部分に
落ちる毎秒当りの光子数に比較した。｛そして吸収検出
器（および蛍光検出器）のバックグランド照明に比較し
て｝照明ビーム中の光子数は非常に小であり得る。それ
故粒子間の小さい特別な差異検出感度の限界は決定的に
は光子流束（少くとも光源の本来の“輝度”に左右され
る）と粒子間の他の大小の差により生ずる光子流束の攝
動がどれ程大きいかとにより左右される。
【００１２】吸収、散乱および蛍光流通式細胞測定信号
における妨害雑音の主要な源は各種の信号に対して全く
違う可能性がある。第１次近似で染色された細胞または
染色されていない細胞からの蛍光信号の大きさは、信号
を生じさせる細胞の形または方向によりほとんど影響さ
れないが、散乱と吸収との信号は形と方向とにより非常
に強く影響される。極端な例として、人赤血球の生来の
両凹形はそれが発生する吸収および散乱信号に対し深刻
な影響を持ち、典型的な、古典的に染色した網赤血球の
小さい吸収信号より大きく影響する（図１４〜図１７を
参照）。この事が本発明以前には、網赤血球の計数ある
いは一般的には、細胞中の低濃度の吸収分子の測定に関
し、吸収流通式細胞測定法が有用でなかつた主な理由で
ある。他方、細胞中または（例えば未結合の蛍光染料）
周囲の媒質中の弱い蛍光材料は吸収または散乱信号に対
して実質的には影響しない。
における妨害雑音の主要な源は各種の信号に対して全く
違う可能性がある。第１次近似で染色された細胞または
染色されていない細胞からの蛍光信号の大きさは、信号
を生じさせる細胞の形または方向によりほとんど影響さ
れないが、散乱と吸収との信号は形と方向とにより非常
に強く影響される。極端な例として、人赤血球の生来の
両凹形はそれが発生する吸収および散乱信号に対し深刻
な影響を持ち、典型的な、古典的に染色した網赤血球の
小さい吸収信号より大きく影響する（図１４〜図１７を
参照）。この事が本発明以前には、網赤血球の計数ある
いは一般的には、細胞中の低濃度の吸収分子の測定に関
し、吸収流通式細胞測定法が有用でなかつた主な理由で
ある。他方、細胞中または（例えば未結合の蛍光染料）
周囲の媒質中の弱い蛍光材料は吸収または散乱信号に対
して実質的には影響しない。
【００１３】全血の抗凝固性にされた試料中の網赤血球
の百分率の計数に用い得る幾つかの半自働化された方法
が利用できる。現在の各方法においては、網赤血球内の
ＲＮＡ染色のために、有機カチオン染料例えばＡＯ，Ａ
ｕＯまたはＴＯを含有する希釈剤が用いられる。その染
料は細胞膜を透過し、ＲＮＡと結合し、そして通常各網
赤血球中の“細網”を沈殿させる。染色されたＲＮＡか
らの信号量は大約で、ＲＮＡ含有量に比例する。適当な
染色後、適当な励起光源（典型的には４８８ｎｍで発光
するアルゴンイオンレーザー）と発光検出システムとを
備えた蛍光流通式細胞測定器が流出液中の網赤血球百分
率決定のために使用できる。
の百分率の計数に用い得る幾つかの半自働化された方法
が利用できる。現在の各方法においては、網赤血球内の
ＲＮＡ染色のために、有機カチオン染料例えばＡＯ，Ａ
ｕＯまたはＴＯを含有する希釈剤が用いられる。その染
料は細胞膜を透過し、ＲＮＡと結合し、そして通常各網
赤血球中の“細網”を沈殿させる。染色されたＲＮＡか
らの信号量は大約で、ＲＮＡ含有量に比例する。適当な
染色後、適当な励起光源（典型的には４８８ｎｍで発光
するアルゴンイオンレーザー）と発光検出システムとを
備えた蛍光流通式細胞測定器が流出液中の網赤血球百分
率決定のために使用できる。
【００１４】蛍光染料と流通式細胞測定法とを用いる、
全血試料中の網赤血球の弁別のための説明的方法がこの
特許の文献中で公開されている。
全血試料中の網赤血球の弁別のための説明的方法がこの
特許の文献中で公開されている。
【００１５】例えばＡｄａｍｓとＫａｍｅｎｔｓｋｙと
の米国特許第３，６８４，３７７号は人血に対し正常の
生理学的範囲にあるｐＨと浸透圧モル濃度とを持つ、ア
クリジンオレンジの水性溶液を含む、特異血液分析用染
料組成物を公開している。その染料組成物は赤血球散乱
信号と共に、蛍光信号の存在あるいは不存在を測定する
ことにより網赤血球を計数することに用いることができ
る。
の米国特許第３，６８４，３７７号は人血に対し正常の
生理学的範囲にあるｐＨと浸透圧モル濃度とを持つ、ア
クリジンオレンジの水性溶液を含む、特異血液分析用染
料組成物を公開している。その染料組成物は赤血球散乱
信号と共に、蛍光信号の存在あるいは不存在を測定する
ことにより網赤血球を計数することに用いることができ
る。
【００１６】Ａｄａｍｓの米国特許第３，８８３，２４
７号は、濃度１０-6〜１０-5ｇ／ｍｌでアクリジンオレ
ンジを含む染料組成物を用いる、ＡｄａｍｓとＫａｍｅ
ｎｔｓｋｙとの方法と同様の方法を公開している。
７号は、濃度１０-6〜１０-5ｇ／ｍｌでアクリジンオレ
ンジを含む染料組成物を用いる、ＡｄａｍｓとＫａｍｅ
ｎｔｓｋｙとの方法と同様の方法を公開している。
【００１７】Ｎａｔａｌｅの米国特許第４，３３６，０
２９号はｐＨ約７．４で等張浸透圧モル濃度の、染料Ａ
Ｏとクエン酸イオンとパラホルムアルデヒドとの水性溶
液よりなる試薬組成物を公開している。その種種な成分
の濃度は網赤血球と血小板との染料取込みを最大とする
ように選択され、染料取込みが血液試料と試薬組成物と
の混合２〜５分以内に達成するようにされる。Ｎａｔａ
ｌｅ試薬を利用する血小板と網赤血球との検出のための
自働化された方法はＧｅｒｓｈｍａｎ等の米国特許第
４，３２５，７０６号に公開されている。
２９号はｐＨ約７．４で等張浸透圧モル濃度の、染料Ａ
Ｏとクエン酸イオンとパラホルムアルデヒドとの水性溶
液よりなる試薬組成物を公開している。その種種な成分
の濃度は網赤血球と血小板との染料取込みを最大とする
ように選択され、染料取込みが血液試料と試薬組成物と
の混合２〜５分以内に達成するようにされる。Ｎａｔａ
ｌｅ試薬を利用する血小板と網赤血球との検出のための
自働化された方法はＧｅｒｓｈｍａｎ等の米国特許第
４，３２５，７０６号に公開されている。
【００１８】Ｓａｇｅ，Ｊｒ．米国特許第４，７０７，
４５１号中で公開されている試薬において、網赤血球は
チオフラビンＴまたはクリスアニリンで染色される。全
血試料は、等張食塩水中の染料（０．２ｍｇ／ｍｌ）の
２５μｌアリコートと抗凝固性にされた全血１０μｌと
を混合し、その混合物を約７分間培養することにより効
果的に染色されることが見出された。
４５１号中で公開されている試薬において、網赤血球は
チオフラビンＴまたはクリスアニリンで染色される。全
血試料は、等張食塩水中の染料（０．２ｍｇ／ｍｌ）の
２５μｌアリコートと抗凝固性にされた全血１０μｌと
を混合し、その混合物を約７分間培養することにより効
果的に染色されることが見出された。
【００１９】Ｌｅｅ等の米国特許第４，８８３，８６７
号はＲＮＡまたはＤＮＡの染色のための染料組成物を公
開している。その染色組成物は好ましい染料化合物とし
てＴＯを含んでいる。網赤血球は最低３０分で染色され
る。
号はＲＮＡまたはＤＮＡの染色のための染料組成物を公
開している。その染色組成物は好ましい染料化合物とし
てＴＯを含んでいる。網赤血球は最低３０分で染色され
る。
【００２０】流通式細胞測定技術での網赤血球計数用試
薬がＫｕｒｏｄａの米国特許第４，９７１，９１７号に
記載されていて、それには染料例えばＡｕＯによる成熟
赤血球の非特異的染色を減少させるため、蛍光流通式細
胞測定法により分析する場合成熟赤血球を間違って網赤
血球として計数するのを防止するため炭酸塩が含有され
ている。
薬がＫｕｒｏｄａの米国特許第４，９７１，９１７号に
記載されていて、それには染料例えばＡｕＯによる成熟
赤血球の非特異的染色を減少させるため、蛍光流通式細
胞測定法により分析する場合成熟赤血球を間違って網赤
血球として計数するのを防止するため炭酸塩が含有され
ている。
【００２１】米国特許第４，９８１，８０３号は、２つ
の溶液、即ち染料ＡｕＯを非水性溶剤中に溶解している
染色用原溶液と最適染色条件を満足させる緩衝剤溶液と
から成る、網赤血球計数用試薬を記載している。
の溶液、即ち染料ＡｕＯを非水性溶剤中に溶解している
染色用原溶液と最適染色条件を満足させる緩衝剤溶液と
から成る、網赤血球計数用試薬を記載している。
【００２２】ＡｕＯを含む、蛍光流通式細胞測定技術用
の他の網赤血球染色試薬がＫｕｒｏｄａの米国特許第
４，９８５，１７４号で公開されている。この文献は２
０秒と２０分とのどんな時間でもよい試薬と試料との培
養時間を教えている。
の他の網赤血球染色試薬がＫｕｒｏｄａの米国特許第
４，９８５，１７４号で公開されている。この文献は２
０秒と２０分とのどんな時間でもよい試薬と試料との培
養時間を教えている。
【００２３】上記の如く小さい部分集団のカチオン染料
のみが網赤血球を選択的に染色し、更に小さい部分集団
のものだけが速かに網赤血球を透過する。本発明のカチ
オン染料化合物は５分以内で網赤血球を染色し、それ故
流通式細胞測定法による網赤血球分析を、血液試料と試
薬組成物との１緒にした混合後短時間で行うことが出来
る故に本発明を自働化された手順に容易に適合させる。
のみが網赤血球を選択的に染色し、更に小さい部分集団
のものだけが速かに網赤血球を透過する。本発明のカチ
オン染料化合物は５分以内で網赤血球を染色し、それ故
流通式細胞測定法による網赤血球分析を、血液試料と試
薬組成物との１緒にした混合後短時間で行うことが出来
る故に本発明を自働化された手順に容易に適合させる。
【００２４】文献でここに取入れられている、“化合物
と試薬組成物と全血中の網赤血球の定量測定へのその利
用”と題する、１９８９年１２月１日ＦａｎとＦｉｓｃ
ｈｅｒとにより出願された同時係属米国特許出願第０７
／４４４，２５５号（米国特許第５，０７５，５５６
号）に、網赤血球定量のための４級化されているＡＯ誘
導体が記載されている。Ｆａｎ等の試薬はパラホルムア
ルデヒドと蓚酸カリウムとを含む緩衝剤溶液中に、ＡＯ
誘導体１０−６ｇ／ｍｌ含有する。この試薬組成物は網
赤血球を染色し、血液試料中の網赤血球の定量的蛍光流
通式細胞測定分析を可能にする。この試薬も前記の試薬
のどれも、以下で議論するような方向雑音問題を防止す
るために球形化剤を含有せず、そして他の診断学的に重
要なパラメーター例えば細胞１つずつに基く網赤血球と
赤血球との体積とヘモグロビン濃度との同時決定を可能
にしていない。
と試薬組成物と全血中の網赤血球の定量測定へのその利
用”と題する、１９８９年１２月１日ＦａｎとＦｉｓｃ
ｈｅｒとにより出願された同時係属米国特許出願第０７
／４４４，２５５号（米国特許第５，０７５，５５６
号）に、網赤血球定量のための４級化されているＡＯ誘
導体が記載されている。Ｆａｎ等の試薬はパラホルムア
ルデヒドと蓚酸カリウムとを含む緩衝剤溶液中に、ＡＯ
誘導体１０−６ｇ／ｍｌ含有する。この試薬組成物は網
赤血球を染色し、血液試料中の網赤血球の定量的蛍光流
通式細胞測定分析を可能にする。この試薬も前記の試薬
のどれも、以下で議論するような方向雑音問題を防止す
るために球形化剤を含有せず、そして他の診断学的に重
要なパラメーター例えば細胞１つずつに基く網赤血球と
赤血球との体積とヘモグロビン濃度との同時決定を可能
にしていない。
【００２５】ＳｈａｐｉｒｏとＳｔｅｖｅｎｓとはＦｌ
ｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｏｆＤＮＡ Ｃｏｎｔｅｎ
ｔ Ｕｓｉｎｇ Ｏｘａｚｉｎ ７５０ｏｒ Ｒｅｌａ
ｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｙｅｓ Ｗｉｔｌｒ ６３３ｎ
ｍ Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，第７
巻、１０７−１１０頁（１９８６）において、流通式細
胞測定によるＤＮＡ含有量の測定に対しオキサジン７５
０の使用を公開している。細胞はオキサジン７５０ １
０〜３０μＭにより染色され、ＤＮＡ測定にはエタノー
ルを添加して固定される。ＳｈａｐｉｒｏとＳｔｅｖｅ
ｎｓとはオキサジン７５０はＲＮＡは染色しない様であ
ると主張している。その上、オキサジン７５０を用いる
実験案は網赤血球の計数、あるいは細胞１つずつに基
く、他の診断学的に重要な赤色血液細胞パラメーター例
えば体積とヘモグロビン濃度との同時測定を可能にして
いない。
ｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ｏｆＤＮＡ Ｃｏｎｔｅｎ
ｔ Ｕｓｉｎｇ Ｏｘａｚｉｎ ７５０ｏｒ Ｒｅｌａ
ｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｙｅｓ Ｗｉｔｌｒ ６３３ｎ
ｍ Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，第７
巻、１０７−１１０頁（１９８６）において、流通式細
胞測定によるＤＮＡ含有量の測定に対しオキサジン７５
０の使用を公開している。細胞はオキサジン７５０ １
０〜３０μＭにより染色され、ＤＮＡ測定にはエタノー
ルを添加して固定される。ＳｈａｐｉｒｏとＳｔｅｖｅ
ｎｓとはオキサジン７５０はＲＮＡは染色しない様であ
ると主張している。その上、オキサジン７５０を用いる
実験案は網赤血球の計数、あるいは細胞１つずつに基
く、他の診断学的に重要な赤色血液細胞パラメーター例
えば体積とヘモグロビン濃度との同時測定を可能にして
いない。
【００２６】前記の如く、吸収または散乱光流通式細胞
測定器の使用を通じての網赤血球定量の不利な点は方向
雑音と網赤血球信号との間を弁別する能力がないことで
ある。人および多くの他の哺乳動物赤色血液細胞は両面
がへこんだ円盤の形をもっている。その様な非対称赤色
血液細胞により散乱される光の量は、細胞の方向に従っ
て変る。それ故全く同一の２個の赤色血液細胞であって
も、それらが検出器のセンシング帯を通過する時に同一
の方向を向いていないと、非常に異なる散乱光および吸
収信号が発生することになる。その結果正常な赤色細胞
に関する散乱並に吸収信号の大きさの分布は非常に広
く、２つのモードがあることになる（図１４及び図１５
を参照）。この方向の違いによる分布の広がりを、本明
細書では方向性の雑音又は方向性雑音と言う。一方のみ
に少量の染色された細網が存在するという点を除けば他
の点では同一の２個の赤色血液細胞でも、一般に異なる
方向を向いているので散乱光および吸収検出器に大きい
信号差すなわち方向性雑音が生じてしまい、染色された
細網の存在により発生されるであろう非常に小さい信号
差はこの大きい方向性雑音中に埋没してしまう。
測定器の使用を通じての網赤血球定量の不利な点は方向
雑音と網赤血球信号との間を弁別する能力がないことで
ある。人および多くの他の哺乳動物赤色血液細胞は両面
がへこんだ円盤の形をもっている。その様な非対称赤色
血液細胞により散乱される光の量は、細胞の方向に従っ
て変る。それ故全く同一の２個の赤色血液細胞であって
も、それらが検出器のセンシング帯を通過する時に同一
の方向を向いていないと、非常に異なる散乱光および吸
収信号が発生することになる。その結果正常な赤色細胞
に関する散乱並に吸収信号の大きさの分布は非常に広
く、２つのモードがあることになる（図１４及び図１５
を参照）。この方向の違いによる分布の広がりを、本明
細書では方向性の雑音又は方向性雑音と言う。一方のみ
に少量の染色された細網が存在するという点を除けば他
の点では同一の２個の赤色血液細胞でも、一般に異なる
方向を向いているので散乱光および吸収検出器に大きい
信号差すなわち方向性雑音が生じてしまい、染色された
細網の存在により発生されるであろう非常に小さい信号
差はこの大きい方向性雑音中に埋没してしまう。
【００２７】ＫｉｍとＯｒｎｓｔｅｉｎとの米国特許第
４，５７５，４９０および４，４１０，００４号とは流
通式細胞測定器における赤色血液細胞の体積の測定での
方向雑音方法を教えている。その方法は細胞体積のより
一層精密で正確な測定を可能にするため、細胞間のいか
なる方向差異を除去するのに、未染色赤色血液細胞の等
積的球形化を組入れている。各赤色血液細胞は界面活性
剤球形化剤により両凹形から完全な球へ変換される。赤
血球の溶血防止のため、その球形化剤と共に“緩衝す
る”蛋白質および／またはアルデヒド固定剤が用いられ
る。ＫｉｍとＯｒｎｓｔｅｉｎとにより記載されている
アニオン界面活性剤は、アニオン界面活性剤が細網を染
色し、沈澱するのに用いられるカチオン染料と速かに反
応し、沈澱することが見出されている故に、網赤血球染
色には用いることができない。
４，５７５，４９０および４，４１０，００４号とは流
通式細胞測定器における赤色血液細胞の体積の測定での
方向雑音方法を教えている。その方法は細胞体積のより
一層精密で正確な測定を可能にするため、細胞間のいか
なる方向差異を除去するのに、未染色赤色血液細胞の等
積的球形化を組入れている。各赤色血液細胞は界面活性
剤球形化剤により両凹形から完全な球へ変換される。赤
血球の溶血防止のため、その球形化剤と共に“緩衝す
る”蛋白質および／またはアルデヒド固定剤が用いられ
る。ＫｉｍとＯｒｎｓｔｅｉｎとにより記載されている
アニオン界面活性剤は、アニオン界面活性剤が細網を染
色し、沈澱するのに用いられるカチオン染料と速かに反
応し、沈澱することが見出されている故に、網赤血球染
色には用いることができない。
【００２８】Ｔｙｃｋｏの米国特許第４，７３５，５０
４号は、抗凝固性にされている全血試料中の赤血球の、
個別および平均の赤血球体積（ＭＣＶ）と個別および平
均の小体ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）とを測定する完
全自働化法と手段とを提供する流通式細胞測定器である
ＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１システムの赤色血液細胞チ
ャネルを公開している。この方法においては、全血試料
の２μｌアリコート中の赤色血液細胞をまず希釈し、そ
れからＫｉｍとＯｒｎｓｔｅｉｎとの今記載した方法を
用いて等積的に球形化する。２０秒間培養後これらの細
胞を、本質的には１時に１個、その分析器の赤色細胞チ
ャネル内の照明されている測定帯を通過させる。２つの
隔離した角度間隔中の、これらの細胞により散乱された
光の大きさを測定する。この適用においては光源と検出
角度との選択が決定的である。光源が６３３ｎｍの光を
発光するヘリウムネオンレーザーである場合、２つの散
乱光捕集角度間隔は２〜３度（２°−３°）と５〜１５
度（５°−１５°）である。各間隔の散乱光水準が１つ
の細胞について知れれば、その細胞の体積とヘモグロビ
ン濃度とはＭｉｅの散乱理論で予言される値と比較して
決定される。各細胞の体積（Ｖ）とヘモグロビン濃度
（ＨＣ）とはメモリーに記憶され、ＭＣＶとＭＣＨＣと
は試料測定サイクル終了時、Ｔｙｃｋｏで議論されてい
るごとく、技術で既知の技術により計算される。Ｖおよ
びＨＣ分布サイトグラムおよびＶおよびＨＣヒストグラ
ムはこの計算を用いて作られる。
４号は、抗凝固性にされている全血試料中の赤血球の、
個別および平均の赤血球体積（ＭＣＶ）と個別および平
均の小体ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）とを測定する完
全自働化法と手段とを提供する流通式細胞測定器である
ＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１システムの赤色血液細胞チ
ャネルを公開している。この方法においては、全血試料
の２μｌアリコート中の赤色血液細胞をまず希釈し、そ
れからＫｉｍとＯｒｎｓｔｅｉｎとの今記載した方法を
用いて等積的に球形化する。２０秒間培養後これらの細
胞を、本質的には１時に１個、その分析器の赤色細胞チ
ャネル内の照明されている測定帯を通過させる。２つの
隔離した角度間隔中の、これらの細胞により散乱された
光の大きさを測定する。この適用においては光源と検出
角度との選択が決定的である。光源が６３３ｎｍの光を
発光するヘリウムネオンレーザーである場合、２つの散
乱光捕集角度間隔は２〜３度（２°−３°）と５〜１５
度（５°−１５°）である。各間隔の散乱光水準が１つ
の細胞について知れれば、その細胞の体積とヘモグロビ
ン濃度とはＭｉｅの散乱理論で予言される値と比較して
決定される。各細胞の体積（Ｖ）とヘモグロビン濃度
（ＨＣ）とはメモリーに記憶され、ＭＣＶとＭＣＨＣと
は試料測定サイクル終了時、Ｔｙｃｋｏで議論されてい
るごとく、技術で既知の技術により計算される。Ｖおよ
びＨＣ分布サイトグラムおよびＶおよびＨＣヒストグラ
ムはこの計算を用いて作られる。
【００２９】上記の方法のどれも網赤血球と非網赤血球
とを区別しないし、実施されている前記の方法は細胞１
つずつに基いて、網赤血球と赤血球との診断学的に重要
なパラメーター例えば体積とヘモグロビン濃度とを別別
に決定するには用いることができない。
とを区別しないし、実施されている前記の方法は細胞１
つずつに基いて、網赤血球と赤血球との診断学的に重要
なパラメーター例えば体積とヘモグロビン濃度とを別別
に決定するには用いることができない。
【００３０】流通式細胞測定器による網赤血球数の監視
における困難性の他の１つは網赤血球検出信号と成熟赤
色血液信号とシステム雑音との弁別の困難さである。若
い網赤血球中にはＲＮＡの染色された線状体が多く流通
式細胞測定器により検出する場合相対的に大きい大きさ
の信号を発生する。しかしより一層成熟した細胞はより
少い、染色されたＲＮＡを含有し、流通式細胞測定シス
テムにより遮蔽されてもよいより小さい信号を発生させ
る。
における困難性の他の１つは網赤血球検出信号と成熟赤
色血液信号とシステム雑音との弁別の困難さである。若
い網赤血球中にはＲＮＡの染色された線状体が多く流通
式細胞測定器により検出する場合相対的に大きい大きさ
の信号を発生する。しかしより一層成熟した細胞はより
少い、染色されたＲＮＡを含有し、流通式細胞測定シス
テムにより遮蔽されてもよいより小さい信号を発生させ
る。
【００３１】光散乱と吸収または蛍光流通式細胞測定技
術による、全血試料中の網赤血球の同定と、網赤血球お
よび赤血球の体積とヘモグロビン濃度とヘモグロビン含
有量との同時で個別での測定のために有用な方法と試薬
との必要性が存在している。
術による、全血試料中の網赤血球の同定と、網赤血球お
よび赤血球の体積とヘモグロビン濃度とヘモグロビン含
有量との同時で個別での測定のために有用な方法と試薬
との必要性が存在している。
【００３２】我我は細網染色のための公知の技術の変形
中でカチオン染料を用いたと云う前提で出発した。ま
た、我我は網赤血球検出のために、蛍光および／または
吸収を利用できるであろう流通式細胞測定法を開発する
のに関心があった。その上、吸収の場合には、方向雑音
除去のために赤色細胞の球形化を用いたかった（図１６
及び図１７を参照）。（若し元の細胞体積を同時に回収
し、精密に測定することに関心がなければ、殆んどの方
向雑音の除去のための、等容積的または完全な球形化の
必要はないことに注意のこと。）我我はまた等容積的球
形化とＴｙｃｋｏの前記の方法とを用いることにより、
蛍光並に吸収の方法に関し、選択的に網赤血球を染色す
る染料を用いて、細胞１つずつに基き、網赤血球並に成
熟赤色細胞の体積とヘモグロビンとを同時に測定するこ
とができることを希望した。（若し球形化が完全であれ
ば、等容積的でくても、Ｘが約０．５から２｛０．１５
から０．６０ Ｏｓｍ｝に変る等張性に関する或る既知
の係数Ｘを使って、体積に関しては１／Ｘでの補正、そ
して蛋白質｛例えばヘモグロビン｝濃度に関してはＸで
の補正をするＴｙｃｋｏ法により、元の値を計算出来る
ことに注意）
中でカチオン染料を用いたと云う前提で出発した。ま
た、我我は網赤血球検出のために、蛍光および／または
吸収を利用できるであろう流通式細胞測定法を開発する
のに関心があった。その上、吸収の場合には、方向雑音
除去のために赤色細胞の球形化を用いたかった（図１６
及び図１７を参照）。（若し元の細胞体積を同時に回収
し、精密に測定することに関心がなければ、殆んどの方
向雑音の除去のための、等容積的または完全な球形化の
必要はないことに注意のこと。）我我はまた等容積的球
形化とＴｙｃｋｏの前記の方法とを用いることにより、
蛍光並に吸収の方法に関し、選択的に網赤血球を染色す
る染料を用いて、細胞１つずつに基き、網赤血球並に成
熟赤色細胞の体積とヘモグロビンとを同時に測定するこ
とができることを希望した。（若し球形化が完全であれ
ば、等容積的でくても、Ｘが約０．５から２｛０．１５
から０．６０ Ｏｓｍ｝に変る等張性に関する或る既知
の係数Ｘを使って、体積に関しては１／Ｘでの補正、そ
して蛋白質｛例えばヘモグロビン｝濃度に関してはＸで
の補正をするＴｙｃｋｏ法により、元の値を計算出来る
ことに注意）
【００３３】これらの発明は、本願と同日に出願された
別の２件の特許出願の主題であり、その内容を引用によ
り参照する。
別の２件の特許出願の主題であり、その内容を引用によ
り参照する。
【００３４】Ｔｙｃｋｏの方法の利用には、ヘモグロビ
ンが非常に透明な領域で単色光を発光する光源が必要で
あり、典型的には赤色ヘリウムネオン（ＨｅＮｅ）レー
ザーあるいはより長波長でさえあるレーザーのような光
源である。このことは、若しその波長が吸収測定にも用
いられるならば、その染料は赤色光を強く吸収する青色
染料でなければならないことを意味する。
ンが非常に透明な領域で単色光を発光する光源が必要で
あり、典型的には赤色ヘリウムネオン（ＨｅＮｅ）レー
ザーあるいはより長波長でさえあるレーザーのような光
源である。このことは、若しその波長が吸収測定にも用
いられるならば、その染料は赤色光を強く吸収する青色
染料でなければならないことを意味する。
【００３５】我我カチオン染料との相容性のため、そし
てＫｉｍとＯｒｎｓｔｉｎとの教えにより示唆されるよ
うな赤色細胞球形化剤として非イオン、カチオン並に双
性イオン界面活性剤を探求した。ＫｉｍとＯｒｎｓｔｉ
ｎとの方法におけるごとく、我我は、赤色細胞溶血をお
そくするため、界面活性剤濃度を“緩衝する”蛋白質
（典型的には牛血清アルブミン）を用いた。多数のその
ような界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ×１００とラウ
リルプロピルアミドベタイン）が満足に働いた。我我は
ラウリルプロピルアミドベタインと幾つかの他の双性イ
オン界面活性剤（例えばＤＡＰＳとＴＤＡＰＳ）が、赤
色細胞溶血をおくらすために緩衝する蛋白質を必要とせ
ず、ＫｉｍとＯｒｎｓｔｅｉｎとの方法のための、凡て
の種類の血液細胞に対して理想的な他の球形化剤である
ことを見出した。それは緩衝する蛋白質を必要としない
故に、安定で、より簡単な試薬の製造を可能にする。
（ＫｉｍとＯｒｎｓｔｅｉｎとの固定段階は最早必須で
なく、代りに蛋白質含有試薬中における細菌増殖の問題
がさけられる。）
てＫｉｍとＯｒｎｓｔｉｎとの教えにより示唆されるよ
うな赤色細胞球形化剤として非イオン、カチオン並に双
性イオン界面活性剤を探求した。ＫｉｍとＯｒｎｓｔｉ
ｎとの方法におけるごとく、我我は、赤色細胞溶血をお
そくするため、界面活性剤濃度を“緩衝する”蛋白質
（典型的には牛血清アルブミン）を用いた。多数のその
ような界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ×１００とラウ
リルプロピルアミドベタイン）が満足に働いた。我我は
ラウリルプロピルアミドベタインと幾つかの他の双性イ
オン界面活性剤（例えばＤＡＰＳとＴＤＡＰＳ）が、赤
色細胞溶血をおくらすために緩衝する蛋白質を必要とせ
ず、ＫｉｍとＯｒｎｓｔｅｉｎとの方法のための、凡て
の種類の血液細胞に対して理想的な他の球形化剤である
ことを見出した。それは緩衝する蛋白質を必要としない
故に、安定で、より簡単な試薬の製造を可能にする。
（ＫｉｍとＯｒｎｓｔｅｉｎとの固定段階は最早必須で
なく、代りに蛋白質含有試薬中における細菌増殖の問題
がさけられる。）
【００３６】
【本発明の要約】従って方向雑音低減または除去のた
め、血液試料中の細胞を球形化するための改良された試
薬組成物と方法とを提供することが本発明の主要目的で
ある。
め、血液試料中の細胞を球形化するための改良された試
薬組成物と方法とを提供することが本発明の主要目的で
ある。
【００３７】本発明の他の目的は赤色血液細胞の球形化
のための、前記のごとき試薬組成物と方法とを提供する
ことにある。
のための、前記のごとき試薬組成物と方法とを提供する
ことにある。
【００３８】尚本発明の他の目的は赤色血液細胞と網赤
血球とを同時に球形化し、網赤血球を染色するための、
前記のような試薬組成物と方法とを提供することにあ
る。
血球とを同時に球形化し、網赤血球を染色するための、
前記のような試薬組成物と方法とを提供することにあ
る。
【００３９】本発明の更にその上の目的は吸収並に散乱
光流通式細胞測定法による、全血試料中の網赤血球と赤
血球との体積とヘモグロビン濃度とヘモグロビン含有量
とを同時に決定するための、前記のような試薬組成物と
方法とを提供することにある。
光流通式細胞測定法による、全血試料中の網赤血球と赤
血球との体積とヘモグロビン濃度とヘモグロビン含有量
とを同時に決定するための、前記のような試薬組成物と
方法とを提供することにある。
【００４０】本発明の尚更に他の目的は関心ある細胞サ
ブクラスと他の細胞サブクラスとを弁別する方法を提供
することにある。本明細書において細胞サブクラスとは
血液中の細胞の部分母集団を意味する。たとえば全血球
を母集団とすれば赤血球はそのサブクラスであり、網赤
血球はそのまたサブクラスである。従って本発明のこの
目的には、血液試料中の赤色血液細胞と網赤血球とのお
のおのの間を同時に区別し、計数し、細胞１つずつに基
いての測定値から決定された各細胞型の体積とヘモグロ
ビン含有量とヘモグロビン濃度と平均赤血球体積と平均
小体ヘモグロビン濃度とを決定するための、前記のよう
な試薬組成物と方法とを提供することが含まれる。
ブクラスと他の細胞サブクラスとを弁別する方法を提供
することにある。本明細書において細胞サブクラスとは
血液中の細胞の部分母集団を意味する。たとえば全血球
を母集団とすれば赤血球はそのサブクラスであり、網赤
血球はそのまたサブクラスである。従って本発明のこの
目的には、血液試料中の赤色血液細胞と網赤血球とのお
のおのの間を同時に区別し、計数し、細胞１つずつに基
いての測定値から決定された各細胞型の体積とヘモグロ
ビン含有量とヘモグロビン濃度と平均赤血球体積と平均
小体ヘモグロビン濃度とを決定するための、前記のよう
な試薬組成物と方法とを提供することが含まれる。
【００４１】本発明の１つの態様に従えば、試薬組成物
は網赤血球を染色するための有機カチオン染料と約６〜
９のｐＨを維持するための緩衝剤溶液とを含んでいる。
その染料は構造式
は網赤血球を染色するための有機カチオン染料と約６〜
９のｐＨを維持するための緩衝剤溶液とを含んでいる。
その染料は構造式
【化１】 を持つ青色吸収染料オキサジン７５０（「オキサジン７
５０」は商品名であり、Ｅｘｃｉｔｏｎ，Ｉｎｃ．ｏｆ
Ｄａｙｔｏｎ，Ｏｈｉｏより入手可能）、あるいは構
造式
５０」は商品名であり、Ｅｘｃｉｔｏｎ，Ｉｎｃ．ｏｆ
Ｄａｙｔｏｎ，Ｏｈｉｏより入手可能）、あるいは構
造式
【化２】 を持つ青色吸収染料ニューメチレンブルーであってもよ
い。
い。
【００４２】試薬組成物の緩衝システムはその試薬組成
物のｐＨを約６〜９に維持するのに適当な緩衝剤を含
む。その溶液はＫＣｌまたはＮａＣｌを用いて約２５０
〜３３０ｍ Ｏｓｍに調節された最終浸透圧モル濃度を
持ち、以下の成分の１つまたはそれ以上を記載の濃度で
含んでいてもよい。
物のｐＨを約６〜９に維持するのに適当な緩衝剤を含
む。その溶液はＫＣｌまたはＮａＣｌを用いて約２５０
〜３３０ｍ Ｏｓｍに調節された最終浸透圧モル濃度を
持ち、以下の成分の１つまたはそれ以上を記載の濃度で
含んでいてもよい。
【００４３】好ましくは、その溶液は試薬組成物のｐＨ
を約７〜８に維持するように処方され、以下の成分の１
つまたはそれ以上を記載の濃度範囲で含んでいてもよ
く、約２８０〜３００ｍ Ｏｓｍの浸透圧モル濃度を維
持する。
を約７〜８に維持するように処方され、以下の成分の１
つまたはそれ以上を記載の濃度範囲で含んでいてもよ
く、約２８０〜３００ｍ Ｏｓｍの浸透圧モル濃度を維
持する。
【００４４】試薬組成物は染料の赤色細胞膜透過助長の
ために或るアニオンとカチオンとを含有すべきことが見
出された。そのようなアニオンには重炭酸イオン、塩素
イオン、硼酸イオン、バルビタール、蓚酸イオン（Ｏ
Ｘ）またはエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）が
含まれてもよい。しかし、凡てのアニオンが細胞膜を通
じての染料の透過を促進するのに有効であるわけではな
い。例えば次のアニオン、リンゴ酸イオン、酒石酸イオ
ン、リン酸イオンの１つまたはそれ以上が唯一の主要ア
ニオンとして試料組成物中に含まれている場合、網赤血
球と赤血球との間を、若しあっても僅しか区別しない。
あり得るカチオンにはカリウムイオン、ナトリウムイオ
ン、トリスヒドロキシメチルアミノ（Ｔｒｉｓ）または
トリエタノールアミン（ＴＥＡ）が含まれる。
ために或るアニオンとカチオンとを含有すべきことが見
出された。そのようなアニオンには重炭酸イオン、塩素
イオン、硼酸イオン、バルビタール、蓚酸イオン（Ｏ
Ｘ）またはエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）が
含まれてもよい。しかし、凡てのアニオンが細胞膜を通
じての染料の透過を促進するのに有効であるわけではな
い。例えば次のアニオン、リンゴ酸イオン、酒石酸イオ
ン、リン酸イオンの１つまたはそれ以上が唯一の主要ア
ニオンとして試料組成物中に含まれている場合、網赤血
球と赤血球との間を、若しあっても僅しか区別しない。
あり得るカチオンにはカリウムイオン、ナトリウムイオ
ン、トリスヒドロキシメチルアミノ（Ｔｒｉｓ）または
トリエタノールアミン（ＴＥＡ）が含まれる。
【００４５】この試薬組成物は散乱／吸収流通式細胞測
定法技術を用いて、全血試料中の網赤血球を同定するの
に用いてもよい。その最も広い適用における方法には全
血のアリコートと前記試薬組成物の１つとを混合するこ
とを含む。適当な培養期間後、試料／試薬混合物を１時
に細胞１個で、流通式細胞測定器の特別なセンシング領
域を通過させる。水力学的集束の方法で、単一細胞がそ
のセンシング帯を通過させられ、そこで適当な照明波長
を持つ集光された光源により照明される。少くとも１つ
の散乱光信号と少くとも１つの吸収信号とが細胞１つず
つに基き測定される。これらの測定から、網赤血球を赤
血球から区別できる。
定法技術を用いて、全血試料中の網赤血球を同定するの
に用いてもよい。その最も広い適用における方法には全
血のアリコートと前記試薬組成物の１つとを混合するこ
とを含む。適当な培養期間後、試料／試薬混合物を１時
に細胞１個で、流通式細胞測定器の特別なセンシング領
域を通過させる。水力学的集束の方法で、単一細胞がそ
のセンシング帯を通過させられ、そこで適当な照明波長
を持つ集光された光源により照明される。少くとも１つ
の散乱光信号と少くとも１つの吸収信号とが細胞１つず
つに基き測定される。これらの測定から、網赤血球を赤
血球から区別できる。
【００４６】本発明の好ましい態様に従えば、前記試薬
組成物は更にその上、赤色血液細胞と網赤血球とを等積
的に球形化するために、双性イオン界面活性剤を含む。
この双性イオン球形化剤は好ましくはアルキルアミドベ
タインまたはアルキルベタイン例えばラウラミドプロピ
ルベタイン（ＬＡＢ）、ココアミドプロピルベタイン
（ＣＡＰＢ）およびココアミドスルホベタイン（ＣＡＳ
Ｂ）である。他の好ましい球形化剤はＮ−テトラデシル
−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンス
ルホナート（ＴＤＡＰＳ）とＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジ
メチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート
（ＤＤＡＰＳ）である。ＴＤＡＰＳとＤＤＡＰＳとは、
それらが最も安定な試料調製を与える故に最も好ましい
球形化剤である。
組成物は更にその上、赤色血液細胞と網赤血球とを等積
的に球形化するために、双性イオン界面活性剤を含む。
この双性イオン球形化剤は好ましくはアルキルアミドベ
タインまたはアルキルベタイン例えばラウラミドプロピ
ルベタイン（ＬＡＢ）、ココアミドプロピルベタイン
（ＣＡＰＢ）およびココアミドスルホベタイン（ＣＡＳ
Ｂ）である。他の好ましい球形化剤はＮ−テトラデシル
−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンス
ルホナート（ＴＤＡＰＳ）とＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジ
メチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート
（ＤＤＡＰＳ）である。ＴＤＡＰＳとＤＤＡＰＳとは、
それらが最も安定な試料調製を与える故に最も好ましい
球形化剤である。
【００４７】血液試料中の網赤血球と赤色血液細胞とを
効果的に等積球形化するためには、試薬組成物中の球形
化剤濃度は約３．９〜１４８μｇ／ｍｌである。球形化
剤は好ましくはＬＡＢ約１２〜８７．５μｇ／ｍｌ、Ｔ
ＤＡＰＳ約３．９〜１１．８μｇ／ｍｌ、ＤＤＡＰＳ約
４９．３〜１４８μｇ／ｍｌ、ＣＡＰＢ約８．８〜１
７．５μｇ／ｍｌまたはＣＡＳＢ約１２．５〜１５μｇ
／ｍｌの量で存在する。
効果的に等積球形化するためには、試薬組成物中の球形
化剤濃度は約３．９〜１４８μｇ／ｍｌである。球形化
剤は好ましくはＬＡＢ約１２〜８７．５μｇ／ｍｌ、Ｔ
ＤＡＰＳ約３．９〜１１．８μｇ／ｍｌ、ＤＤＡＰＳ約
４９．３〜１４８μｇ／ｍｌ、ＣＡＰＢ約８．８〜１
７．５μｇ／ｍｌまたはＣＡＳＢ約１２．５〜１５μｇ
／ｍｌの量で存在する。
【００４８】前記の緩衝システムの存在の下で、ＲＮＡ
染色のために必要な、試薬組成物中のニューメチレンブ
ルー濃度は約１０〜１００μｇ／ｍｌの範囲にある。
染色のために必要な、試薬組成物中のニューメチレンブ
ルー濃度は約１０〜１００μｇ／ｍｌの範囲にある。
【００４９】例えば我我は、前記の緩衝システムの存在
の下で、ＲＮＡ染色のために必要な、試薬組成物中のオ
キサジン７５０濃度は低く、即ち約２〜１５μｇ／ｍｌ
の範囲にあり、緩衝剤で増大された透過により網赤血球
中のＲＮＡの染料染色は５分以内になることを見出し
た。染料のそのような低濃度は成熟赤血球の非網赤血球
染色を最小にし、それが雑音バックグラウンドからの信
号の良好な分離となる。そのような速かな染色はこの試
薬組成物を自働化された方法へ非常に適合させる。
の下で、ＲＮＡ染色のために必要な、試薬組成物中のオ
キサジン７５０濃度は低く、即ち約２〜１５μｇ／ｍｌ
の範囲にあり、緩衝剤で増大された透過により網赤血球
中のＲＮＡの染料染色は５分以内になることを見出し
た。染料のそのような低濃度は成熟赤血球の非網赤血球
染色を最小にし、それが雑音バックグラウンドからの信
号の良好な分離となる。そのような速かな染色はこの試
薬組成物を自働化された方法へ非常に適合させる。
【００５０】この全血／試薬組成物混合物が流通式細胞
測定器のセンシング領域を通過する時、各細胞により散
乱および吸収された光が測定され、赤血球が網赤血球か
ら区別でき、各網赤血球または赤血球の体積とヘモグロ
ビン濃度とが決定される。網赤血球と赤血球との数およ
び網赤血球または赤血球のヘモグロビン含有量と平均細
胞体積と平均小体ヘモグロビン濃度と平均細胞ヘモグロ
ビンとが測定された細胞１つずつの体積とヘモグロビン
濃度とから計算される。
測定器のセンシング領域を通過する時、各細胞により散
乱および吸収された光が測定され、赤血球が網赤血球か
ら区別でき、各網赤血球または赤血球の体積とヘモグロ
ビン濃度とが決定される。網赤血球と赤血球との数およ
び網赤血球または赤血球のヘモグロビン含有量と平均細
胞体積と平均小体ヘモグロビン濃度と平均細胞ヘモグロ
ビンとが測定された細胞１つずつの体積とヘモグロビン
濃度とから計算される。
【００５１】従って、本発明は以下に記載の組成物と方
法とより成り、本発明の範囲は請求事項に示される。
法とより成り、本発明の範囲は請求事項に示される。
【００５２】
【好ましい態様の説明】図１及び図２を参照すると、本
発明の原理を実行するのに用いてもよい流通式細胞測定
装置の部分の様式化された機能および構造の描字を示し
ている。事実、装置は、出願人より販売されている商標
ＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１の下に市場で入手できるシ
ステムの変形である特別なシステムを描いている。
発明の原理を実行するのに用いてもよい流通式細胞測定
装置の部分の様式化された機能および構造の描字を示し
ている。事実、装置は、出願人より販売されている商標
ＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１の下に市場で入手できるシ
ステムの変形である特別なシステムを描いている。
【００５３】装置は細胞分析用の流通式細胞測定法の原
理を組入れていて、特異な型の照明に対する光散乱およ
び光吸収の応答を知覚する能力を含んでいる。本発明に
就いて主要な関心のある構成要素のみが示されている。
それ故図面は装置の種種な構成要素を動かし、制御する
のに必要な機械的および電気的構成要素、即ちモータ
ー、ソレノイド、ポンプ、弁、センサーの凡ては説明し
ていない。これらの構成要素の凡てはどんな既知の在来
の型を持っていてもよく、それは意図する方法で試料を
処理するための、本発明に従う流通式細胞測定装置中の
種種な構成要素の所望の型の操作に関し、以後支えられ
る情報の知識を持つこの技術において正常な塾達さをも
つ人により容易に実現できるものである。
理を組入れていて、特異な型の照明に対する光散乱およ
び光吸収の応答を知覚する能力を含んでいる。本発明に
就いて主要な関心のある構成要素のみが示されている。
それ故図面は装置の種種な構成要素を動かし、制御する
のに必要な機械的および電気的構成要素、即ちモータ
ー、ソレノイド、ポンプ、弁、センサーの凡ては説明し
ていない。これらの構成要素の凡てはどんな既知の在来
の型を持っていてもよく、それは意図する方法で試料を
処理するための、本発明に従う流通式細胞測定装置中の
種種な構成要素の所望の型の操作に関し、以後支えられ
る情報の知識を持つこの技術において正常な塾達さをも
つ人により容易に実現できるものである。
【００５４】最も一般的な用語で記載すれば、シース流
れ流通セル（ｓｈｅａｔｈ−ｓｔｒｅａｍ ｆｌｏｗｃ
ｅｌｌ）とこれを支持する水力学的手段により調製され
た細胞を測定点に運ぶ。その細胞は流通セルの正方形断
面流通チャネルに対し、中央にある円筒状体積に局限さ
れている。流通セル構造はＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１
システム中に用いられるものと同一である。水力学的シ
ステムは全く簡単で、唯２つの蠕動ポンプとそれについ
ている管とより成る。シースポンプ（Ｓｈｅａｔｈ Ｐ
ｕｍｐ）と管とは１．６×１０-7ｍ3／ｓｅｃの速さで
シース（さや）を送り、試料は３．５×１０-10ｍ3／ｓ
ｅｃの速さで運ばれる。流通セル中の流通チャネルは２
５０μｍ×２５０μｍである。シース流れ中軸方向に流
れる、得られる円筒状試料流れは直径７μｍで、速さ
２．５ｍ／ｓを持つ。
れ流通セル（ｓｈｅａｔｈ−ｓｔｒｅａｍ ｆｌｏｗｃ
ｅｌｌ）とこれを支持する水力学的手段により調製され
た細胞を測定点に運ぶ。その細胞は流通セルの正方形断
面流通チャネルに対し、中央にある円筒状体積に局限さ
れている。流通セル構造はＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１
システム中に用いられるものと同一である。水力学的シ
ステムは全く簡単で、唯２つの蠕動ポンプとそれについ
ている管とより成る。シースポンプ（Ｓｈｅａｔｈ Ｐ
ｕｍｐ）と管とは１．６×１０-7ｍ3／ｓｅｃの速さで
シース（さや）を送り、試料は３．５×１０-10ｍ3／ｓ
ｅｃの速さで運ばれる。流通セル中の流通チャネルは２
５０μｍ×２５０μｍである。シース流れ中軸方向に流
れる、得られる円筒状試料流れは直径７μｍで、速さ
２．５ｍ／ｓを持つ。
【００５５】第１の目標はＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１
システムにより提供されている２つの赤色細胞散乱チャ
ネルに加えて、吸収測定を支持することになる光学シス
テムを提供することにある。散乱／吸収流通式細胞測定
器の光学システムは一般的には２つの副次システム
（ａ）照明光学系（図１）と（ｂ）検出光学系（図２）
に分けることができる。
システムにより提供されている２つの赤色細胞散乱チャ
ネルに加えて、吸収測定を支持することになる光学シス
テムを提供することにある。散乱／吸収流通式細胞測定
器の光学システムは一般的には２つの副次システム
（ａ）照明光学系（図１）と（ｂ）検出光学系（図２）
に分けることができる。
【００５６】図１を参照すると、照明光学システムは一
般的に参照番号１０で示されていて、６３３ｎｍで光の
２ｍＷのビームを照射するヘリウム−ネオンレーザー１
２を組込んでいる。そのビームはレーザービームの位置
を調節するための２つの反射鏡１４と１６とで折れ曲げ
られる。その調節でビーム軸を照明光学系の物理的光学
軸と一致させることができる。それからそのビームを１
対の円柱レンズ１８と２０とにより１９２×７７μｍの
楕円形状のビーム（１／ｅ2において）に形づくる。１
９２μｍの寸法は焦点距離１５０ｍｍの円柱レンズ１８
で形成され、それはＡ−１孔口２２の長軸（それは図１
中のページ面に平行）を照明する。７７μｍの寸法は焦
点距離６０ｍｍの円柱レンズ２０により形成され、Ａ−
１孔口の短軸を照明する。Ａ−１孔口は６５３×８９μ
ｍである。照明二重レンズ２３は流通セル２４中に３
７．４×１２．６μｍの楕円形に形成されたガウス強度
分布を作る。楕円の短軸は垂直である流れの方向に平行
で、即ち矢印２６の方向にある。
般的に参照番号１０で示されていて、６３３ｎｍで光の
２ｍＷのビームを照射するヘリウム−ネオンレーザー１
２を組込んでいる。そのビームはレーザービームの位置
を調節するための２つの反射鏡１４と１６とで折れ曲げ
られる。その調節でビーム軸を照明光学系の物理的光学
軸と一致させることができる。それからそのビームを１
対の円柱レンズ１８と２０とにより１９２×７７μｍの
楕円形状のビーム（１／ｅ2において）に形づくる。１
９２μｍの寸法は焦点距離１５０ｍｍの円柱レンズ１８
で形成され、それはＡ−１孔口２２の長軸（それは図１
中のページ面に平行）を照明する。７７μｍの寸法は焦
点距離６０ｍｍの円柱レンズ２０により形成され、Ａ−
１孔口の短軸を照明する。Ａ−１孔口は６５３×８９μ
ｍである。照明二重レンズ２３は流通セル２４中に３
７．４×１２．６μｍの楕円形に形成されたガウス強度
分布を作る。楕円の短軸は垂直である流れの方向に平行
で、即ち矢印２６の方向にある。
【００５７】測定体積を通過する細胞は入射輻射線を散
乱および吸収する。散乱および吸収された光は図２中に
略図で説明されている検出光学系に捕捉され、測定され
る。散乱されない光および１９．５°までに散乱される
光とは高開口数（Ｈｉ−ＮＡ）レンズ２８により集光さ
れ、平行にされる。そのビームは３０／７０（３０％反
射、７０％透過）ビームスプリッター３０により２つの
部分に分割される。ビーム３２はフォトダイオード上に
反射され、吸収測定のために用いられ、一方透過された
ビーム３４は更に２０／８０（２０％反射、８０％透
過）ビームスプリッター３６で分割され、２つの散乱チ
ャネルを作る。反射された散乱チャネル３８は５−１５
°絞り４０を持ち、一方透過チャネル４２は２〜３°絞
り４４を持っている。これらの絞り４０，４４をおのお
の通過した光はレンズ４６と４８とを通り、それぞれフ
ォトダイオード５０と５２との上に焦点を結ぶ。濃度フ
ィルター５４と５６と５７とは各フォトダイオードでの
光水準を標準の検出器と前置増巾器とに適当な水準まで
低下させるのに用いられる。
乱および吸収する。散乱および吸収された光は図２中に
略図で説明されている検出光学系に捕捉され、測定され
る。散乱されない光および１９．５°までに散乱される
光とは高開口数（Ｈｉ−ＮＡ）レンズ２８により集光さ
れ、平行にされる。そのビームは３０／７０（３０％反
射、７０％透過）ビームスプリッター３０により２つの
部分に分割される。ビーム３２はフォトダイオード上に
反射され、吸収測定のために用いられ、一方透過された
ビーム３４は更に２０／８０（２０％反射、８０％透
過）ビームスプリッター３６で分割され、２つの散乱チ
ャネルを作る。反射された散乱チャネル３８は５−１５
°絞り４０を持ち、一方透過チャネル４２は２〜３°絞
り４４を持っている。これらの絞り４０，４４をおのお
の通過した光はレンズ４６と４８とを通り、それぞれフ
ォトダイオード５０と５２との上に焦点を結ぶ。濃度フ
ィルター５４と５６と５７とは各フォトダイオードでの
光水準を標準の検出器と前置増巾器とに適当な水準まで
低下させるのに用いられる。
【００５８】ビーム３２はレンズ５８を通じ検出器／前
置増巾器６０の上に焦点が結ばれる。前置増巾器出力は
システムを通して伝導される光学的力に比例する。それ
は散乱されていない光と、約１９．５°までの角度に散
乱された光とを集める。この角度間隔内に球形化された
赤血球と網赤血球とにより散乱された光の約９８％が集
光される。
置増巾器６０の上に焦点が結ばれる。前置増巾器出力は
システムを通して伝導される光学的力に比例する。それ
は散乱されていない光と、約１９．５°までの角度に散
乱された光とを集める。この角度間隔内に球形化された
赤血球と網赤血球とにより散乱された光の約９８％が集
光される。
【００５９】市場で入手できるＴＥＣＨＮＩＣＯＮ
Ｈ’１機器の吸収チャネルは細胞吸収には最適化されて
いない。吸収信号は吸収前置増巾器上の雑音と同水準で
ある。吸収検出手順の数学的モデルが開発された。この
モデルは、信号は流通セル中のレーザーによる照明面積
の減少につれて劇的に改善されるであろうことを予言し
た。スリットの寸法を見掛で１５０×２０μｍ（ＴＥＣ
ＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１システムにおいて）から見掛け４
０×２０μｍに減少させてＳ／Ｎ比とを係数３．７５も
増加させた。
Ｈ’１機器の吸収チャネルは細胞吸収には最適化されて
いない。吸収信号は吸収前置増巾器上の雑音と同水準で
ある。吸収検出手順の数学的モデルが開発された。この
モデルは、信号は流通セル中のレーザーによる照明面積
の減少につれて劇的に改善されるであろうことを予言し
た。スリットの寸法を見掛で１５０×２０μｍ（ＴＥＣ
ＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１システムにおいて）から見掛け４
０×２０μｍに減少させてＳ／Ｎ比とを係数３．７５も
増加させた。
【００６０】吸収前置増巾器からの信号（パルス高さ）
は２０〜５０ｗＶである。これは処理エレクトロニック
スが要求する信号より非常に小さい。利得約２５の吸収
前置増巾器に第２の利得ステージが加えられた。これが
パルス高さを約１Ｖにした。
は２０〜５０ｗＶである。これは処理エレクトロニック
スが要求する信号より非常に小さい。利得約２５の吸収
前置増巾器に第２の利得ステージが加えられた。これが
パルス高さを約１Ｖにした。
【００６１】各散乱チャネルにおける前置増巾器回路の
利得と濃度フィルターの光学密度とは（Ｔｅｃｈｎｉｃ
ｏｎ（ＴＣＮ）光学試験材料（ＯＴＭ，ＴＣＮ Ｔ０３
−１７０４）を検定する場合、約２Ｖの平均パルス信号
水準を生ずるように選択した。ＯＴＭは球形化され、堅
く固定された赤色血液細胞より成る。この材料はこの出
願人から市場で入手でき、ＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１
システムでの使用に適合している。それから、これは後
段検出信号処理ハードウエアに可変利得増巾器を用い
て、各チャネルの総括利得の細い調節を可能にさせる。
利得と濃度フィルターの光学密度とは（Ｔｅｃｈｎｉｃ
ｏｎ（ＴＣＮ）光学試験材料（ＯＴＭ，ＴＣＮ Ｔ０３
−１７０４）を検定する場合、約２Ｖの平均パルス信号
水準を生ずるように選択した。ＯＴＭは球形化され、堅
く固定された赤色血液細胞より成る。この材料はこの出
願人から市場で入手でき、ＴＥＣＨＮＩＣＯＮ Ｈ’１
システムでの使用に適合している。それから、これは後
段検出信号処理ハードウエアに可変利得増巾器を用い
て、各チャネルの総括利得の細い調節を可能にさせる。
【００６２】後段検出信号処理システムの機能ブロック
図を図３に示す。このシステムは前置増巾器６２と可変
利得増巾器６４とパルス高さ分析器６６とアナログ−デ
ジタル変換器６８とデータ取得ハードウエア（コンピュ
ータ）７０とソフトウエアとより成る。
図を図３に示す。このシステムは前置増巾器６２と可変
利得増巾器６４とパルス高さ分析器６６とアナログ−デ
ジタル変換器６８とデータ取得ハードウエア（コンピュ
ータ）７０とソフトウエアとより成る。
【００６３】このシステムのための電子工学システムは
大部分Ｈｏｗａｒｄ Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｍ．Ｄ．，Ｄ．
Ｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，から入手できる４ｃｙ
ｔｅシステム（４Ｃｙｔｅ Ｍｏｄｅｌ ＦＥ Ｆｒｏ
ｎｔ Ｅｎｄおよび４Ｃｙｔｅ Ｍｏｄｅｌ Ｉ Ｉｎ
ｔｅｒｆａｃｅ Ｃａｒｄ）より成る。パルス高さ分析
器とアナログ−デジタル変換器とデータ取得ソフトウエ
アとは４Ｃｙｔｅシステムの凡ての構成要素である。こ
れらの構成要素は４つの入力信号までのパルス高さを表
わす保持パルスを作り出し、“妥当な”パルス高さしき
い水準を決めることを可能にする。４Ｃｙｔｅインター
フェースカードは４つまでの入力信号のアナログ−デジ
タル変換と、ホストコンピューターのＲＡＭメモリー中
へのこれらの値の捕獲とに関する４Ｃｙｔｅソフトウエ
アーと１緒に用いられる。デジタル化された信号は一覧
表形式に記憶される。各細胞に関して、測定された４つ
のパラメーターのおのおのに対して１つと、フラッギン
グ（ｆｅａｇｇｉｎｇ）に対して１つとの５つの８ビッ
トバイトの情報がある。これらの実験のためのホストコ
ンピューターはカラーモニターとマッチ副処理器（ｍａ
ｔｃｈ ｃｏ−ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）を備えているＩＢ
Ｍ ＰＣ／ＸＴクローンである。データ整理はＩＢＭに
相応するどんなコンピューターででも行い得る。
大部分Ｈｏｗａｒｄ Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｍ．Ｄ．，Ｄ．
Ｃ．Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，から入手できる４ｃｙ
ｔｅシステム（４Ｃｙｔｅ Ｍｏｄｅｌ ＦＥ Ｆｒｏ
ｎｔ Ｅｎｄおよび４Ｃｙｔｅ Ｍｏｄｅｌ Ｉ Ｉｎ
ｔｅｒｆａｃｅ Ｃａｒｄ）より成る。パルス高さ分析
器とアナログ−デジタル変換器とデータ取得ソフトウエ
アとは４Ｃｙｔｅシステムの凡ての構成要素である。こ
れらの構成要素は４つの入力信号までのパルス高さを表
わす保持パルスを作り出し、“妥当な”パルス高さしき
い水準を決めることを可能にする。４Ｃｙｔｅインター
フェースカードは４つまでの入力信号のアナログ−デジ
タル変換と、ホストコンピューターのＲＡＭメモリー中
へのこれらの値の捕獲とに関する４Ｃｙｔｅソフトウエ
アーと１緒に用いられる。デジタル化された信号は一覧
表形式に記憶される。各細胞に関して、測定された４つ
のパラメーターのおのおのに対して１つと、フラッギン
グ（ｆｅａｇｇｉｎｇ）に対して１つとの５つの８ビッ
トバイトの情報がある。これらの実験のためのホストコ
ンピューターはカラーモニターとマッチ副処理器（ｍａ
ｔｃｈ ｃｏ−ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ）を備えているＩＢ
Ｍ ＰＣ／ＸＴクローンである。データ整理はＩＢＭに
相応するどんなコンピューターででも行い得る。
【００６４】以下の実施例は試薬組成物と、吸収流通式
細胞測定技術を用いる、網赤血球の同定と、網赤血球と
赤色血液細胞との特性表示のための、同じ試薬組成物を
組込んだ方法とを説明する。可能の場合には標準的な、
市場で入手できる試薬級材料を用いた。次の処方と手順
とは唯説明の目的のために提供されていること、および
本発明の開示に従い他の成分と割合と手順とが採用でき
ることは理解できよう。
細胞測定技術を用いる、網赤血球の同定と、網赤血球と
赤色血液細胞との特性表示のための、同じ試薬組成物を
組込んだ方法とを説明する。可能の場合には標準的な、
市場で入手できる試薬級材料を用いた。次の処方と手順
とは唯説明の目的のために提供されていること、および
本発明の開示に従い他の成分と割合と手順とが採用でき
ることは理解できよう。
【００６５】
【実施例１】本発明の試薬組成物と方法とを用いる、血
液試料中の網赤血球と赤血球との区別のための散乱並に
吸収測定 オキサジン７５０は１ｍｇ／ｍｌＮ，Ｎ−ジメチルホル
ムアミド原溶液中に貯える。作業試薬はその染料原液
を、次の成分を記載の濃度で含有する緩衝剤溶液に加え
て作る。 オキサジン ７５０ ６μｇ／ｍｌ 塩化カルシウム ０．３ｍＭ 塩化カリウム ４．０ｍＭ 塩化マグネシウム ８８．０ｍＭ リン酸ナトリウム（三塩基） ０．５ｍｍ 重炭酸ナトリウム ２０．０ｍＭ
液試料中の網赤血球と赤血球との区別のための散乱並に
吸収測定 オキサジン７５０は１ｍｇ／ｍｌＮ，Ｎ−ジメチルホル
ムアミド原溶液中に貯える。作業試薬はその染料原液
を、次の成分を記載の濃度で含有する緩衝剤溶液に加え
て作る。 オキサジン ７５０ ６μｇ／ｍｌ 塩化カルシウム ０．３ｍＭ 塩化カリウム ４．０ｍＭ 塩化マグネシウム ８８．０ｍＭ リン酸ナトリウム（三塩基） ０．５ｍｍ 重炭酸ナトリウム ２０．０ｍＭ
【００６６】この研究に用いた作業試薬の最終浸透圧モ
ル濃度とｐＨとはそれぞれ２７２ｍｍｏｌ／ｋｇと８．
１であった。
ル濃度とｐＨとはそれぞれ２７２ｍｍｏｌ／ｋｇと８．
１であった。
【００６７】試料は自働化されたＴＥＣＨＮＩＣＯＮ
Ｈ’１システムの赤色細胞試料処理計画をまねた方法で
手で混合した。ガラス試験管に作業試薬５ｍｌを満す。
それから血液試料５μｌを、試薬を渦流混合機上で撹拌
し乍らピペットでその試薬に入れる。血液の１：１００
０希釈液を流通式細胞測定装置の試料ラインに挿入す
る。約２分間以内に試料は流通セルを通過し、赤血球と
網赤血球との分析のためのヘリウム−ネオンレーザー光
源に曝される。各試料はその体積が許すならば２回測定
する。顕微鏡調査では、この混合物中の殆んどの細胞は
部分的に球形化されていることが示めされた。
Ｈ’１システムの赤色細胞試料処理計画をまねた方法で
手で混合した。ガラス試験管に作業試薬５ｍｌを満す。
それから血液試料５μｌを、試薬を渦流混合機上で撹拌
し乍らピペットでその試薬に入れる。血液の１：１００
０希釈液を流通式細胞測定装置の試料ラインに挿入す
る。約２分間以内に試料は流通セルを通過し、赤血球と
網赤血球との分析のためのヘリウム−ネオンレーザー光
源に曝される。各試料はその体積が許すならば２回測定
する。顕微鏡調査では、この混合物中の殆んどの細胞は
部分的に球形化されていることが示めされた。
【００６８】分析が終ると、粗データは赤色散乱対赤色
吸収サイトグラムの形、図４に表示される。明瞭な細胞
個体群がその特別な散乱と吸収との信号に基いて明らか
に観察される。赤色球個体群は縦軸と垂直線Ｘとの間の
領域Ａ中に落ちる。これらの細胞は高い散乱信号と低い
細胞吸収信号とを示す。網赤血球の大部分はＸの右の領
域、領域Ｂに落ちる。これらの細胞はそのオキサジン７
５０染色ＲＮＡからの、より高い吸収信号により成熟赤
血球と区別できる。血小板個体群は線Ｙ以下の領域Ｃ中
にあり、共在領域は線Ｚの上の領域Ｄにある。血小板は
網赤血球に比較すると相対的に低い散乱信号をもつ。
吸収サイトグラムの形、図４に表示される。明瞭な細胞
個体群がその特別な散乱と吸収との信号に基いて明らか
に観察される。赤色球個体群は縦軸と垂直線Ｘとの間の
領域Ａ中に落ちる。これらの細胞は高い散乱信号と低い
細胞吸収信号とを示す。網赤血球の大部分はＸの右の領
域、領域Ｂに落ちる。これらの細胞はそのオキサジン７
５０染色ＲＮＡからの、より高い吸収信号により成熟赤
血球と区別できる。血小板個体群は線Ｙ以下の領域Ｃ中
にあり、共在領域は線Ｚの上の領域Ｄにある。血小板は
網赤血球に比較すると相対的に低い散乱信号をもつ。
【００６９】成熟赤血球と網赤血球との間の吸収区画に
基き、網赤血球と赤血球とを同定する散乱光と吸収との
領域を定める電子工学的“窓”を創ることにより患者試
料の網赤血球数を決定してもよい。各“窓”内に落ちる
網赤血球と成熟赤血球の数が決定され、それで全細胞個
体群中に存在する網赤血球と赤血球との百分率が計算さ
れる。図４の（１）においては、網赤血球“窓”は領域
Ｂで、成熟赤血球“窓”は領域Ａできめられている。図
４の（２）および凡ての以下の散乱／散乱サイトグラム
において、非線形のグリッド重複は前記のＴｙｃｋｏ法
に従う完全な球に関する一定体積と一定屈折率の場所と
を示していることに注意。
基き、網赤血球と赤血球とを同定する散乱光と吸収との
領域を定める電子工学的“窓”を創ることにより患者試
料の網赤血球数を決定してもよい。各“窓”内に落ちる
網赤血球と成熟赤血球の数が決定され、それで全細胞個
体群中に存在する網赤血球と赤血球との百分率が計算さ
れる。図４の（１）においては、網赤血球“窓”は領域
Ｂで、成熟赤血球“窓”は領域Ａできめられている。図
４の（２）および凡ての以下の散乱／散乱サイトグラム
において、非線形のグリッド重複は前記のＴｙｃｋｏ法
に従う完全な球に関する一定体積と一定屈折率の場所と
を示していることに注意。
【００７０】各試料中の網赤血球の参照百分率はＮａｔ
ｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃ
ａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｎ
ＣＣＬＳ）により推薦されている手動の顕微鏡法を用い
ることにより決定される。この方法においては小体積の
試料が調製され、試料中の網赤血球の百分率は顕微鏡を
使って計数する。その顕微鏡は１００×油浸対物レンズ
と１０×接眼レンズとを備えている。各試料について最
少１０００個の細胞を教える。計数精度を改善するため
にミラーディスクを顕微鏡接眼レンズ中に挿入する。染
色後青色物質の２つまたはそれ以上を含有する赤色細胞
はどれも網赤血球と分類する。
ｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃ
ａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（Ｎ
ＣＣＬＳ）により推薦されている手動の顕微鏡法を用い
ることにより決定される。この方法においては小体積の
試料が調製され、試料中の網赤血球の百分率は顕微鏡を
使って計数する。その顕微鏡は１００×油浸対物レンズ
と１０×接眼レンズとを備えている。各試料について最
少１０００個の細胞を教える。計数精度を改善するため
にミラーディスクを顕微鏡接眼レンズ中に挿入する。染
色後青色物質の２つまたはそれ以上を含有する赤色細胞
はどれも網赤血球と分類する。
【００７１】患者試料の網赤血球数はこの流通式細胞測
定技術により２．３％と測定された。同じ血液試料がＮ
ＣＣＬＳ法ででも分析された。その結果は網赤血球数
１．７％であった。
定技術により２．３％と測定された。同じ血液試料がＮ
ＣＣＬＳ法ででも分析された。その結果は網赤血球数
１．７％であった。
【００７２】第２の実験が、細胞を、ニューメチレンブ
ルーで染色し、散乱／吸収流通式細胞測定器で測定した
場合の網赤血球と赤血球との個体群間の弁別のために行
われた。緩衝剤処方はオキサジン７５０を含有する試薬
組成物に対するものと同じである。オキサジン７５０を
おきかえた。作業試薬中のニューメチレンブルー染料の
濃度は６０μｇ／ｍｌである。前記の試料調製および分
析案を踏嚢した。しかし、顕微鏡調査では、赤色細胞と
網赤血球とはオキサジン７５０混合物におけるより球形
化されていないことが示めされた。その分析からの粗デ
ータは赤色散乱対赤色吸収サイトグラム（図５の
（１））の形で表示される。図４の（１）に比較して、
多分方向雑音のために、吸収および散乱信号ともより広
がっていることに注意。赤血球と網赤血球との間の吸収
区画に基き、患者試料の網赤血球数は２．２％と測定さ
れた。ＮＣＣＬＳ法で分析すると、網赤血球１．７％を
得た。
ルーで染色し、散乱／吸収流通式細胞測定器で測定した
場合の網赤血球と赤血球との個体群間の弁別のために行
われた。緩衝剤処方はオキサジン７５０を含有する試薬
組成物に対するものと同じである。オキサジン７５０を
おきかえた。作業試薬中のニューメチレンブルー染料の
濃度は６０μｇ／ｍｌである。前記の試料調製および分
析案を踏嚢した。しかし、顕微鏡調査では、赤色細胞と
網赤血球とはオキサジン７５０混合物におけるより球形
化されていないことが示めされた。その分析からの粗デ
ータは赤色散乱対赤色吸収サイトグラム（図５の
（１））の形で表示される。図４の（１）に比較して、
多分方向雑音のために、吸収および散乱信号ともより広
がっていることに注意。赤血球と網赤血球との間の吸収
区画に基き、患者試料の網赤血球数は２．２％と測定さ
れた。ＮＣＣＬＳ法で分析すると、網赤血球１．７％を
得た。
【００７３】
【実施例２】双性イオン界面活性剤を含有する、実施例
１の試薬組成物を用いる、血液試料中の網赤血球と赤血
球とを区別するための散乱／吸収測定 ２つめの実験セットが実施例１の試薬組成物を用いて、
しかし、その上に赤色血液細胞と網赤血球を等積的に球
形化するために双性イオン界面活性剤を含有させて行わ
れた。
１の試薬組成物を用いる、血液試料中の網赤血球と赤血
球とを区別するための散乱／吸収測定 ２つめの実験セットが実施例１の試薬組成物を用いて、
しかし、その上に赤色血液細胞と網赤血球を等積的に球
形化するために双性イオン界面活性剤を含有させて行わ
れた。
【００７４】各実験に対し、作業試薬は試薬中の界面活
性剤の最終濃度６３μｇ／ｍｌであるように、試薬組成
物に界面活性剤ラウラミドプロピルベタインを添加して
作った。
性剤の最終濃度６３μｇ／ｍｌであるように、試薬組成
物に界面活性剤ラウラミドプロピルベタインを添加して
作った。
【００７５】実施例１に関し記載したような試料調製に
従った。顕微鏡を通して見ると、調製された試料中の成
熟赤色細胞と網赤血球とは完全に球形化され、網赤血球
は染色されていることが示めされた。球形化の完全さの
増加と共に方向雑音の低減さの増加を示す図１４、図１
５、図４〜図７の差異に注意。
従った。顕微鏡を通して見ると、調製された試料中の成
熟赤色細胞と網赤血球とは完全に球形化され、網赤血球
は染色されていることが示めされた。球形化の完全さの
増加と共に方向雑音の低減さの増加を示す図１４、図１
５、図４〜図７の差異に注意。
【００７６】図６の（１）は細胞をオキサジン７５０染
料および前記界面活性剤を含有する試薬組成物で染色し
た場合の、網赤血球と赤血球との個体群間の区別のより
高い度合を示している。図１６において未染色対照、領
域Ｂには細胞がないことに注意。
料および前記界面活性剤を含有する試薬組成物で染色し
た場合の、網赤血球と赤血球との個体群間の区別のより
高い度合を示している。図１６において未染色対照、領
域Ｂには細胞がないことに注意。
【００７７】患者試料の網赤血球数はこの技術で８．０
％と測定された。同じ血液試料はまたＮＣＣＬＳ法でも
分析された。その結果は網赤血球９．１％であった。
％と測定された。同じ血液試料はまたＮＣＣＬＳ法でも
分析された。その結果は網赤血球９．１％であった。
【００７８】図７の（１）は細胞をニューメチレンブル
ー染料と前記の界面活性剤とを含有する試薬組成物で染
色した場合の、網赤血球と赤血球との個体群間の区別の
度合いを示している。
ー染料と前記の界面活性剤とを含有する試薬組成物で染
色した場合の、網赤血球と赤血球との個体群間の区別の
度合いを示している。
【００７９】患者試料の網赤血球数はこの技術で５．０
％と測定された。同じ血液試料はまたＮＣＣＬＳ法でで
も分析された。結果は網赤血球数９．１％であった。
％と測定された。同じ血液試料はまたＮＣＣＬＳ法でで
も分析された。結果は網赤血球数９．１％であった。
【００８０】
【実施例３】擬吸収に対する補正を行った吸収データを
用いる、本発明の試薬組成物および方法とＮＣＣＬＳ参
照法との相関研究 検出光学副次システムは流通セルでのレーザービームを
通過する細胞からの散乱および未散乱光の両方を集め
る。細胞は凡ての方向に光を散乱する。前記した光学シ
ステム中の相対的Ｈｉ−ＮＡレンズは、１９．５度まで
の半角を持って光学軸の中央にある円錐中に散乱される
光を受入れる。それ故、１９．５度より大きい角度に散
乱される光は失われる。その結果、細胞吸収を測定しょ
うとする場合、完全に非吸収の細胞は数％の入射光を吸
収するように“見える”（擬吸収）。測定される吸収は
次の如く表わされる。
用いる、本発明の試薬組成物および方法とＮＣＣＬＳ参
照法との相関研究 検出光学副次システムは流通セルでのレーザービームを
通過する細胞からの散乱および未散乱光の両方を集め
る。細胞は凡ての方向に光を散乱する。前記した光学シ
ステム中の相対的Ｈｉ−ＮＡレンズは、１９．５度まで
の半角を持って光学軸の中央にある円錐中に散乱される
光を受入れる。それ故、１９．５度より大きい角度に散
乱される光は失われる。その結果、細胞吸収を測定しょ
うとする場合、完全に非吸収の細胞は数％の入射光を吸
収するように“見える”（擬吸収）。測定される吸収は
次の如く表わされる。
【数１】
【００８１】成熟赤色血液細胞の擬吸収信号は典型的に
は染色された網赤血球からの実際の吸収信号と同じ大き
さである。これが染色された網赤血球の未染色の赤色血
液細胞との、吸収サイトグラムでの区別の度合を低下さ
せている。吸収チャネルのＳ／Ｎ比は各赤色細胞および
網赤血球吸収信号から擬吸収およびヘモグロビン吸収成
分を除くために、信号を補正することにより改善でき
る。擬吸収およびヘモグロビン吸収の量は与えられるど
んな細胞に対しても、前記のＴｙｃｋｏの特許中に記載
の公知のＭｉｅの光散乱理論を用いることにより計算で
きる。角度間隔１９．５°〜１８０°に対する散乱断面
並にヘモグロビン吸収成分Ｓ3は次のように計算でき
る。
は染色された網赤血球からの実際の吸収信号と同じ大き
さである。これが染色された網赤血球の未染色の赤色血
液細胞との、吸収サイトグラムでの区別の度合を低下さ
せている。吸収チャネルのＳ／Ｎ比は各赤色細胞および
網赤血球吸収信号から擬吸収およびヘモグロビン吸収成
分を除くために、信号を補正することにより改善でき
る。擬吸収およびヘモグロビン吸収の量は与えられるど
んな細胞に対しても、前記のＴｙｃｋｏの特許中に記載
の公知のＭｉｅの光散乱理論を用いることにより計算で
きる。角度間隔１９．５°〜１８０°に対する散乱断面
並にヘモグロビン吸収成分Ｓ3は次のように計算でき
る。
【数２】 この式で、ａは球形化された細胞の半径であり、λは励
起（または照明）波長であり、ηｓは試料流およびシー
スの屈折率であり、Ｑextは細胞の励起効率であって、
擬吸収の場合はθ3＝０°でΔθ3＝１９．５°である。
Ｓ3の値はＶおよびＨＣの凡ての予期される値に対し表
にされている。
起（または照明）波長であり、ηｓは試料流およびシー
スの屈折率であり、Ｑextは細胞の励起効率であって、
擬吸収の場合はθ3＝０°でΔθ3＝１９．５°である。
Ｓ3の値はＶおよびＨＣの凡ての予期される値に対し表
にされている。
【００８２】擬吸収補正は次の如く行う。先ずＴｙｃｋ
ｏにおいて記載されるごとく、散乱−散乱サイトグラム
から、ＶとＨＣとを細胞からの２つの散乱信号から決定
しなければならない。それからＳ3を、測定されたＶと
ＨＣとに対するルックアップ表記載条項中に見出し、吸
収チャネルにより測定された値から差引く。その結果が
細胞の染色による実際の吸収である。測定された吸収信
号は唯各細胞に関する染料吸収のみを残すため次の関係
を用いて調整する。
ｏにおいて記載されるごとく、散乱−散乱サイトグラム
から、ＶとＨＣとを細胞からの２つの散乱信号から決定
しなければならない。それからＳ3を、測定されたＶと
ＨＣとに対するルックアップ表記載条項中に見出し、吸
収チャネルにより測定された値から差引く。その結果が
細胞の染色による実際の吸収である。測定された吸収信
号は唯各細胞に関する染料吸収のみを残すため次の関係
を用いて調整する。
【数３】
【００８３】凡てのデータに関し、調整された値で、ス
レショールディングとフラギングに先立ち粗データパラ
メーターに替える。赤色散乱パラメーターがＶ−ＨＣ図
上に見えないどんな対象もデータ分析案では無視されて
いる。このデータは図１０と１１との中で示されている
ように、補正された値を反映する赤色散乱対吸収サイト
グラムで再表示される。
レショールディングとフラギングに先立ち粗データパラ
メーターに替える。赤色散乱パラメーターがＶ−ＨＣ図
上に見えないどんな対象もデータ分析案では無視されて
いる。このデータは図１０と１１との中で示されている
ように、補正された値を反映する赤色散乱対吸収サイト
グラムで再表示される。
【００８４】散乱／吸収流通式細胞測定器中に試料組成
物を用いた場合のオキサジン７５０の性能をＮＣＣＬＳ
手動法と比較するための研究を行った。血液試料はその
試薬組成物で染色した。同じセットの血液試料中の網赤
血球をＮＣＣＬＳ法を用いて計数した。
物を用いた場合のオキサジン７５０の性能をＮＣＣＬＳ
手動法と比較するための研究を行った。血液試料はその
試薬組成物で染色した。同じセットの血液試料中の網赤
血球をＮＣＣＬＳ法を用いて計数した。
【００８５】試料調製と分析案とは擬吸収補正を付加し
たほかは、実施例２に関し記載したものと同じである。
顕微鏡を通して見ると調製した試料中の成熟赤血細胞と
網赤血球とは完全に球形化されていて、網赤血球は染色
されていることが判った。
たほかは、実施例２に関し記載したものと同じである。
顕微鏡を通して見ると調製した試料中の成熟赤血細胞と
網赤血球とは完全に球形化されていて、網赤血球は染色
されていることが判った。
【００８６】これら２つの方法から得られた百分率網赤
血球数を図１２で比較する。試薬組成物中オキサジン濃
度２μｇ／ｍｌで、この試薬組成物と図１〜図３の流通
式細胞測定装置とを用いた測定値とＮＣＣＬＳ参照法に
より得られた測定値との間に密接な相関が存在すること
が示めされている。直交回帰分析により得られる、測定
値の相関係数は０．９２であった。
血球数を図１２で比較する。試薬組成物中オキサジン濃
度２μｇ／ｍｌで、この試薬組成物と図１〜図３の流通
式細胞測定装置とを用いた測定値とＮＣＣＬＳ参照法に
より得られた測定値との間に密接な相関が存在すること
が示めされている。直交回帰分析により得られる、測定
値の相関係数は０．９２であった。
【００８７】
【実施例４】擬吸収に対する補正を行った吸収データを
用いた吸収流通式細胞測定器とＴＥＣＨＮＩＣＯＮ
Ｈ’１参照法とに関する相関研究 擬吸収補正と適当なゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）との
後、赤血球と網赤血球との指数ＭＣＶとＭＣＨＣとを個
別に測定し、散乱／吸収流通式細胞測定器に本発明の試
薬組成物を用いて得られた値とＴＥＣＨＮＩＣＯＮ
Ｈ’１測定値との間を比較した。図８と図９とはそれぞ
れ全赤色血液細胞ＭＣＶとＭＣＨＣとに関する相関を示
している。
用いた吸収流通式細胞測定器とＴＥＣＨＮＩＣＯＮ
Ｈ’１参照法とに関する相関研究 擬吸収補正と適当なゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）との
後、赤血球と網赤血球との指数ＭＣＶとＭＣＨＣとを個
別に測定し、散乱／吸収流通式細胞測定器に本発明の試
薬組成物を用いて得られた値とＴＥＣＨＮＩＣＯＮ
Ｈ’１測定値との間を比較した。図８と図９とはそれぞ
れ全赤色血液細胞ＭＣＶとＭＣＨＣとに関する相関を示
している。
【００８８】図１３は網赤血球をＨＣ対Ｖサイトグラム
中“＋”で示している。
中“＋”で示している。
【００８９】前記の説明から明らかな、本発明の幾つか
の有利さには、吸収流通式細胞測定技術による網赤血球
と赤血球との体積とヘモグロビン含有量とヘモグロビン
濃度との電子光学的同時定量のための、全血試料調製用
の試料組成物と方法とを含んでいる。
の有利さには、吸収流通式細胞測定技術による網赤血球
と赤血球との体積とヘモグロビン含有量とヘモグロビン
濃度との電子光学的同時定量のための、全血試料調製用
の試料組成物と方法とを含んでいる。
【００９０】上記の見地から、本発明の幾つかの目的は
達成され、他の有利な結果が得られることが判るであろ
う。
達成され、他の有利な結果が得られることが判るであろ
う。
【００９１】前記の構成と方法とにおいて本発明の範囲
を逸脱することなく種種な変更が行われ得るから、上記
の説明に含有され、あるいは付随する図面に示される凡
ての事項は説明としてであって、限定する意味でないと
解釈すべきものとする。
を逸脱することなく種種な変更が行われ得るから、上記
の説明に含有され、あるいは付随する図面に示される凡
ての事項は説明としてであって、限定する意味でないと
解釈すべきものとする。
【図１】本発明の原理を実行するための、散乱／吸収流
通式細胞測定器の照明光学系の説明図である。
通式細胞測定器の照明光学系の説明図である。
【図２】本発明の原理を実行するための、散乱／吸収流
通式細胞測定器の検出光学系の説明図である。
通式細胞測定器の検出光学系の説明図である。
【図３】本発明の原理を実行するための、散乱／吸収流
通式細胞測定器の検出信号処理システムの説明図であ
る。
通式細胞測定器の検出信号処理システムの説明図であ
る。
【図４】実施例１に従い、オキサジン７５０により染色
された、部分的に球形化されている赤色血液細胞と網赤
血球とを含有する前血試料についてのサイトグラムであ
る。（１）は赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムであ
り、（２）は赤色光低角度散乱対赤色光高角度散乱のサ
イトグラムである。
された、部分的に球形化されている赤色血液細胞と網赤
血球とを含有する前血試料についてのサイトグラムであ
る。（１）は赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムであ
り、（２）は赤色光低角度散乱対赤色光高角度散乱のサ
イトグラムである。
【図５】実施例１に従い、ニューメチレンブルーにより
染色された部分的に球形化されている赤色血液細胞と網
赤血球とを含有する全血試料についてのサイトグラムで
ある。（１）は赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムで
あり、（２）は赤色光低角度散乱対赤色光高角度散乱の
サイトグラムである。
染色された部分的に球形化されている赤色血液細胞と網
赤血球とを含有する全血試料についてのサイトグラムで
ある。（１）は赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムで
あり、（２）は赤色光低角度散乱対赤色光高角度散乱の
サイトグラムである。
【図６】実施例２に従い、オキサジン７５０により染色
された、完全に球形化された赤色血液細胞と網赤血球と
を含有する全血試料についてのサイトグラムである。
（１）は赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムであり、
（２）は赤色光低角度散乱対赤色光高角度散乱のサイト
グラムである。
された、完全に球形化された赤色血液細胞と網赤血球と
を含有する全血試料についてのサイトグラムである。
（１）は赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムであり、
（２）は赤色光低角度散乱対赤色光高角度散乱のサイト
グラムである。
【図７】実施例２に従い、ニューメチレンブルーにより
染色された完全に球形化された赤色血液細胞と網赤血球
とを含有する全血試料についてのサイトグラムである。
（１）は赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムであり、
（２）は赤色光低角度散乱対赤色光高角度散乱のサイト
グラムである。
染色された完全に球形化された赤色血液細胞と網赤血球
とを含有する全血試料についてのサイトグラムである。
（１）は赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムであり、
（２）は赤色光低角度散乱対赤色光高角度散乱のサイト
グラムである。
【図８】実施例４に従う、オキサジン７５０染料により
染色されている網赤血球に関する、ＭＣＶの相関を示
す。
染色されている網赤血球に関する、ＭＣＶの相関を示
す。
【図９】実施例４に従う、オキサジン７５０染料により
染色されている網赤血球に関する、ＭＣＨＣの相関を示
す。
染色されている網赤血球に関する、ＭＣＨＣの相関を示
す。
【図１０】実施例３に従う、擬似吸収補正をしたオキサ
ジン７５０で染色された、完全に球形化された赤色血液
細胞と網赤血球とを含有する全血試料に関するサイトグ
ラムである。（１）は赤色光散乱対赤色吸収のサイトグ
ラムであり、（２）は赤色光低角度散乱対赤色光高角度
散乱のサイトグラムである。
ジン７５０で染色された、完全に球形化された赤色血液
細胞と網赤血球とを含有する全血試料に関するサイトグ
ラムである。（１）は赤色光散乱対赤色吸収のサイトグ
ラムであり、（２）は赤色光低角度散乱対赤色光高角度
散乱のサイトグラムである。
【図１１】実施例３に従う、擬似吸収相関を持つ、ニュ
ーメチレンブルーで染色された、完全に球形化された赤
色血液細胞と網赤血球とを含有する全血試料に関するサ
イトグラムである。（１）は赤色光散乱対赤色吸収のサ
イトグラムであり、（２）は赤色光低角度散乱対赤色光
高角度散乱のサイトグラムである。
ーメチレンブルーで染色された、完全に球形化された赤
色血液細胞と網赤血球とを含有する全血試料に関するサ
イトグラムである。（１）は赤色光散乱対赤色吸収のサ
イトグラムであり、（２）は赤色光低角度散乱対赤色光
高角度散乱のサイトグラムである。
【図１２】実施例３に従う、本発明の試薬を含有するオ
キサジン７５０とＮＣＣＬＳ参照方法とを用いた、全血
試料中に検出された網赤血球百分率の比較である。
キサジン７５０とＮＣＣＬＳ参照方法とを用いた、全血
試料中に検出された網赤血球百分率の比較である。
【図１３】網赤血球（＋字で示す）と赤色細胞（黒塗正
方形で示す）とに関する、ＨＣ対Ｖのサイトグラムであ
る。
方形で示す）とに関する、ＨＣ対Ｖのサイトグラムであ
る。
【図１４】未染色で球形化されていない赤色血液細胞に
関する、赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムである。
関する、赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムである。
【図１５】未染色で球形化されていない赤色血液細胞に
関する、赤色光高角度散乱対赤色光低角度散乱のサイト
グラムである。
関する、赤色光高角度散乱対赤色光低角度散乱のサイト
グラムである。
【図１６】未染色で球形化されている赤色血液細胞に関
する、赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムであり、擬
似吸収に対して補正してある。
する、赤色光散乱対赤色吸収のサイトグラムであり、擬
似吸収に対して補正してある。
【図１７】未染色で球形化されている赤色血液細胞に関
する、赤色光高角度散乱対赤色光低角度散乱のサイトグ
ラムである。
する、赤色光高角度散乱対赤色光低角度散乱のサイトグ
ラムである。
１０ 照明光学システム １２ Ｈｅ−Ｎｅレーザー １４ 反射鏡 １６ 反射鏡 １８ 円柱レンズ ２０ 円柱レンズ ２２ 孔口 ２３ 照明二重レンズ ２４ 流通セル ２６ 矢印
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/68 Ｇ０１Ｎ 33/68 (72)発明者 ソフィー、エス、ファン アメリカ合衆国ニューヨーク州10546、 ミルウッド、グレンウッド・ロゥド 21 番 (72)発明者 ダニュアル、ベン・デイヴィド アメリカ合衆国ニューヨーク州10588、 シュラブ・オゥク、アスペン・ロゥド 1335番 (72)発明者 アルバト、キューポ アメリカ合衆国ニューヨーク州10583、 スカースデイル、ウインディング・レイ ン 11番 (72)発明者 ジェナ、フィシァ アメリカ合衆国ニュージャーズィ州 07640、ハリングタン・パーク、ノー マ・ロゥド 144番 (72)発明者 グレイス、イー、マーティン アメリカ合衆国ニューヨーク州10549、 マウント・キスコ、パーク・ドライヴ 99番 (72)発明者 レナド、オーンスタイン アメリカ合衆国ニューヨーク州10607、 ホワイト・プレインズ、ビルタム・ロゥ ド ５番 (72)発明者 グレガリ、エム、コゥレラ アメリカ合衆国ニュージャーズィ州 07003、ブルームフィールド、ニューエ ル・ドライヴ 61番
Claims (22)
- 【請求項１】 双性イオン球形化剤を含有する単一の試
薬溶液で、非凝固性にされた全血試料を処理することに
より、その試料と試薬とを流通式細胞測定の光測定にか
けた場合の方向性の雑音を除去する、全血試料中の哺乳
動物赤色血液細胞の処理方法であつて、該球形化剤とし
て、添加された緩衝用蛋白質も添加された固定剤も含ま
ないものを、全血試料中の成熟赤血球と網状赤血球との
実質的球形化を与える濃度で該試薬中に存在させる、該
赤色血液細胞を後で効果的に電気光学的に測定できるよ
うにする処理方法。 - 【請求項２】 稀釈された試料中の双性イオン球形化剤
濃度が約３．９〜１４８μｇ／ｍｌである、請求項１に
記載の方法。 - 【請求項３】 （ａ）双性イオン球形化剤を含むが、添
加された緩衝用蛋白質も添加された固定剤も含まない、
等張の約０．５〜２．０倍の張度をもつ単一の水性試薬
組成物と、血液試料のアリコートとを混合して懸濁液を
形成する工程、 （ｂ）工程（ａ）の前記懸濁液を、一時に実質的に１個
の細胞ずつ、集束された光学的照明領域を通す工程、 （ｃ）各細胞により散乱された光を検出し測定する工
程、及び （ｄ）前記の散乱された光の測定された大きさに少くと
も部分的に基いて、関心のある細胞サブクラスを識別す
る工程、 を含んで成る、流通式細胞測定法による、非凝固性にさ
れた血液試料中の関心ある細胞サブクラスの識別法。 - 【請求項４】 工程（ａ）が、関心ある細胞サブクラス
を選択的に染色する染料化合物を添加することを含み、
工程（ｃ）が各細胞により散乱される光と吸収される光
とを検出し、測定することを含み、そして工程（ｄ）が
前記の散乱および吸収された光との測定された大きさに
少くとも部分的に基いて、関心ある細胞サブクラスを識
別することを含む、請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】 （ａ）細胞の核酸を染色する染料化合物
と、約６〜９のｐＨを維持するための非蛋白質ｐＨ緩衝
剤と、添加された緩衝用蛋白質も添加された固定剤も含
まない双性イオン球形化剤とよりなる水性試薬組成物と
血液試料のアリコートとを混合して懸濁液を形成する工
程、 （ｂ）工程（ａ）の懸濁液を、実質的に１時に細胞１個
ずつ、集束された光学的照明領域を通す工程、 （ｃ）各細胞により散乱された光と吸収された光とを検
出し測定する工程、及び （ｄ）前記の散乱および吸収された光の測定された大き
さに少くとも部分的に基いて、関心ある細胞サブクラス
を識別する工程、 を含んで成る、流通式細胞測定法による、非凝固性にさ
れた血液試料中の関心ある細胞サブクラスの識別法。 - 【請求項６】 工程（ａ）に記載の染料化合物がカチオ
ン染料であり、全緩衝剤濃度が等張であって、血液試料
中の細胞を等容積的に球形化する、請求項５に記載の方
法。 - 【請求項７】 工程（ａ）の球形化剤を、ラウラミドプ
ロピルベタインとＮ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル
−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナートとＮ−ド
デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロ
パンスルホナートとココアミドプロピルベタインとココ
アミドスルホベタインとより成る群から選択する、請求
項５に記載の方法。 - 【請求項８】 （ａ）網状赤血球のリボ核酸を染色する
有機カチオン染料化合物と、添加された緩衝用蛋白質も
添加された固定剤も含まない双性イオン球形化剤と、非
蛋白質緩衝剤溶液とより成る試薬組成物と血液試料のア
リコートとを混合して懸濁液を形成する工程、 （ｂ）工程（ａ）の懸濁液を、１時に実質的に細胞１個
ずつ、集束した光学的照明領域を通す工程、 （ｃ）各細胞により散乱された光と吸収された光とを検
出し測定する工程、 （ｄ）前記の散乱および吸収された光との測定された大
きさに基き、染色された細胞と染色されていない細胞と
を識別する工程、及び （ｅ）散乱および吸収された光の測定された大きさに基
き、各網状赤血球と赤血球との数と体積とヘモグロビン
濃度とＲＮＡ濃度とを決定する工程、 を含んで成る、流通式細胞測定法による、非凝固性にさ
れた全血試料中の網状赤血球と赤血球との特性判別方
法。 - 【請求項９】 工程（ａ）に記載の球形化剤がアルキル
ベタインまたはアルキルアミドベタインである、請求項
８に記載の方法。 - 【請求項１０】 工程（ａ）に記載の球形化剤を、ラウ
ラミドプロピルベタインとＮ−テトラデシル−Ｎ，Ｎ−
ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナート
とＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−
１−プロパンスルホナートとココアミドプロピルベタイ
ンとココアミドスルホベタインとより成る群から選択す
る、請求項８に記載の方法。 - 【請求項１１】 工程（ａ）に記載の球形化剤が約３．
９〜１４８μｇ／ｍｌの量で存在する、請求項８に記載
の方法。 - 【請求項１２】 試料と試薬とを流通式細胞測定の光測
定にかけた場合の方向性の雑音を除去する球形化剤とし
て、双性イオン界面活性剤を、全血試料中の成熟赤血球
と網状赤血球との実質的球形化を与える濃度で含有する
が、添加された緩衝用蛋白質も添加された固定剤もを含
まない、非凝固性にされた全血試料中の哺乳動物赤色血
液細胞を後に効果的に電気光学的に測定できるように処
理するための試薬組成物。 - 【請求項１３】 双性イオン界面活性剤の濃度が約３．
９〜１４８μｇ／ｍｌである、請求項１２に記載の試薬
組成物。 - 【請求項１４】 ｐＨ値を約６〜９に維持するためのｐ
Ｈ緩衝剤を含む、請求項１２に記載の試薬組成物。 - 【請求項１５】 網状赤血球中のリボ核酸を染色するた
めに充分な量の染料化合物と、網状赤血球と赤血球を等
容積的に球形化するために充分な量の球形化剤としての
双性イオン界面活性剤とを含むが、添加された緩衝用蛋
白質も添加された固定剤も含まない、流通式細胞測定法
による非凝固性にされた全血試料中の網状赤血球の特定
のための試薬組成物。 - 【請求項１６】 染料化合物がカチオン染料である、請
求項１５に記載の試薬組成物。 - 【請求項１７】 等張の約０．５〜２．０倍の張度をも
つ溶液から成る、請求項１５または１６に記載の試薬組
成物。 - 【請求項１８】 双性イオン界面活性剤が約３．９〜１
４８μｇ／ｍｌの量で存在する、請求項１５に記載の試
薬組成物。 - 【請求項１９】 ｐＨ値を約６〜９に維持するためのｐ
Ｈ緩衝剤を含む、請求項１５に記載の試薬組成物。 - 【請求項２０】 双性イオン界面活性剤がアルキルベタ
インまたはアルキルアミドベタインである、請求項１１
〜１９のいずれかに記載の試薬組成物。 - 【請求項２１】 双性イオン界面活性剤を、ラウラミド
プロピルベタイン、ココアミドプロピルベタインおよび
ココアミドスルホベタインから成る群から選択する、請
求項２０に記載の試薬組成物。 - 【請求項２２】 双性イオン界面活性剤を、Ｎ−テトラ
デシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロ
パンスルホナートおよびＮ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチ
ル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホナートから成
る群から選択する、請求項１１〜１９のいずれかに記載
の試薬組成物。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US7/802674 | 1991-12-05 | ||
| US07/802674 | 1991-12-05 | ||
| US07/802,674 US5284771A (en) | 1991-12-05 | 1991-12-05 | Reagent compositions and their use in sphering cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06180316A JPH06180316A (ja) | 1994-06-28 |
| JP2711786B2 true JP2711786B2 (ja) | 1998-02-10 |
Family
ID=25184391
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4350138A Expired - Lifetime JP2711786B2 (ja) | 1991-12-05 | 1992-12-04 | 試薬組成物とその細胞球形化への使用 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5284771A (ja) |
| EP (1) | EP0545313B1 (ja) |
| JP (1) | JP2711786B2 (ja) |
| KR (1) | KR100276145B1 (ja) |
| AT (1) | ATE155887T1 (ja) |
| AU (1) | AU661728B2 (ja) |
| CA (1) | CA2077790C (ja) |
| DE (1) | DE69221086T2 (ja) |
| DK (1) | DK0545313T3 (ja) |
| ES (1) | ES2104802T3 (ja) |
| IL (1) | IL103056A (ja) |
| TW (1) | TW265412B (ja) |
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