JP2011516833A - 蛍光消光及び／又は蛍光退色を用いて個々の細胞又は粒状物質を分析するための方法及び装置 - Google Patents

Abstract

血液試料を分析するための方法であって、ａ）１つ又は複数の第１の構成成分と、１つ又は複数の第２の構成成分であって、第１の構成成分とは異なる第２の構成成分とを有する血液試料を提供するステップと；ｂ）被分析試料を静止状態に保つように構成された分析チャンバに試料を入れるステップであって、チャンバが第１のパネルと第２のパネルとにより画定され、それらのパネルは双方とも透明である、ステップと；ｃ）着色剤を試料と混和するステップであって、この着色剤が、所定の第１の光の波長に曝露すると第１の構成成分及び第２の構成成分に蛍光を発生させるように機能し、及びこの着色剤が、１つ又は複数の所定の第２の光の波長の光を吸収するように機能する、ステップと；ｄ）第１の構成成分と第２の構成成分とを含む試料の少なくとも一部分を第１の波長及び第２の波長で照明するステップと；ｅ）試料の少なくとも一部分を撮像するステップであって、第１の構成成分及び第２の構成成分からの蛍光発光と第１の構成成分及び第２の構成成分の光学濃度とを示す画像信号の生成を含む、ステップと；ｆ）それらの画像信号を用いて、第１の構成成分及び第２の構成成分の各々についての蛍光値を決定するステップと；ｇ）それらの画像信号を用いて、第１の構成成分及び第２の構成成分の各々についての光学濃度値を決定するステップであって、この光学濃度が、構成成分により吸収された着色剤に従い変わる、ステップと；ｈ）決定された蛍光値及び光学濃度値を用いて、第１の構成成分及び第２の構成成分を同定するステップとを含む方法が提供される。
【選択図】図１

Description

本願は、２００８年３月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／０３８，５７８号明細書に開示される本質的主題の利益を享受し、それを参照により援用する。

本発明は、概して血液試料を分析するための装置及び方法に関し、特に、細胞又は粒状物質などの、試料中の構成成分を検出、同定、及び計数するための装置及び方法に関する。

医師、獣医師及び科学者は、構成物質の量を決定し、さらに健常な被験体には見られない異常な構成物質の存在を同定するため、ヒト及び動物の生体体液、特に血液を調べている。一般に計測、定量及び同定される構成物質としては、赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）、及び血小板が挙げられる。ＲＢＣ分析には、ＲＢＣの数、大きさ、容積、形状、ヘモグロビン含有量及び濃度、並びにヘマトクリット（血中血球容積とも称される）の測定が含まれ得る。ＲＢＣ分析にはまた、ＲＢＣにおける住血原虫（例えば、マラリア原虫）か、又はＷＢＣにおける細胞外の、若しくはリーシュマニア症の病原生物であるトリパノソーマ、並びに他の多くの住血原虫の存在の検出及び／又は計数を含め、赤血球細胞中の特定の成分、例えばＤＮＡ、ＲＮＡの存在及び／又は濃度の決定も関わり得る。ＷＢＣ分析には、一般にはＷＢＣ分画と称されるＷＢＣサブタイプの集団内頻度の決定、並びに健常な被験体には見られない任意の異常な細胞タイプの報告が含まれ得る。血小板（又は、鳥類、爬虫類及び魚類を含む特定の動物においては栓球、これは、哺乳類における血小板の機能と同様だが、１０倍程大きく有核である）の分析には、試料中の血小板又は栓球の凝集塊の存在についての決定を含め、血小板の数、大きさ、形状・構造、及び容積の決定が含まれ得る。

「Ｗｉｎｔｒｏｂｅ’ｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ」第１２版などの医学テキストに詳細に記載されている公知の血液検査手法では、概して検査方法は、手動、遠心、及びインピーダンスを用いるタイプの方法に分けられる。手動で行う方法には、典型的には、正確に測定された容積の血液又は体液試料を作成し、それを定量的に希釈して、計数チャンバにおいて目視で数をカウントすることが関わる。手動での検査方法には、末梢血スメアを調べることが含まれ、そこでは目視検査により各粒状物質タイプの相対量が決定される。遠心による検査方法には、試料を遠心し、試料を構成成分の相対密度に従う構成成分層に分離させることが関わる。成分層は染色して、可視性又は検出を高めることができる。インピーダンスによる方法には、計測対象の粒状物質に従い処理された血液の正確な容積を調べることが関わる；例えば、有核細胞を計数するためＲＢＣを溶解し、容積測定に基づき試料を導電性流体中に希釈する。この過程には、典型的には、狭小な通路を通る試料に印加される電流又は電圧をモニタすることにより、粒子が一列で通過するときの電流／電圧に対する粒子の影響を決定することが関わる。他の手法では、光線の中を一列に通過する粒状物質に入射する光の散乱の強度及び角度を分析することが関わる。フローサイトメトリーによる方法もまた用いることができ、これには、各細胞又は粒子タイプに存在する表面エピトープに対する抗体と結合したフルオロフォアにより、懸濁液中の対象の粒状物質を染色し、染色した粒状物質を適切な波長の光で励起して、個々の粒状物質／細胞の発光を分析することが関わる。

前述の方法は全て、末梢血スメア又は遠心分離を除き、正確な容積の試料を計量分配する必要がある。試料容積が不正確であると、関連する分析において同じ規模の定量誤差が生じ得る。遠心による方法を除き、前述の方法は全て、試料を１つ又は複数の液体試薬又は希釈剤と混合することも必要で、且つ正確な結果を得るために器具のキャリブレーションも必要となる。末梢血スメアの場合、スメアを正しく検査するには高度な訓練が必要とされる。前述の方法の多くは、処理費用が高額な大量の汚染廃棄物が発生する。加えて、赤血球及び栓球が有核である鳥類、爬虫類、魚類、及び赤血球の大きさが極めて小さく、血小板と混同し得る特定の哺乳類では、上述の方法は全血球計算値（ＣＢＣ）の決定には好適でない。

ヒト又は動物の血液検査により決定することのできる情報量は膨大である。特に、ＲＢＣ指数；例えば、個々の細胞の大きさ、個々の細胞のヘモグロビン含有量及び濃度、並びに試料中のＲＢＣの集団統計量の決定が有用である。上記に参照したＷｉｎｔｒｏｂｅのテキスト中の論考によって明らかなとおり、前述のパラメータの各々についての平均及び分散統計量（例えば、変動係数）もまた重要な情報を提供することができ、それにより医師は、ＲＢＣの障害をより適切に分類することが可能となっている。

静止状態の血液試料中の構成成分を分析するための方法及び装置が提供される。本発明の一態様に従えば、血液試料を分析するための方法が提供され、この方法は、ａ）１つ又は複数の第１の構成成分と、１つ又は複数の第２の構成成分であって、第１の構成成分とは異なる第２の構成成分とを有する実質的に無希釈の血液試料を提供するステップと；ｂ）被分析試料を静止状態に保つように構成された分析チャンバに試料を入れるステップであって、チャンバが第１のパネルと第２のパネルとにより画定され、それらのパネルは双方とも透明である、ステップと；ｃ）着色剤を試料と混和するステップであって、この着色剤が、所定の第１の光の波長に曝露すると第１の構成成分及び第２の構成成分に蛍光を発生させるように機能し、及びこの着色剤が、１つ又は複数の所定の第２の光の波長の光を吸収するように機能する、ステップと；ｄ）第１の構成成分と第２の構成成分とを含む試料の少なくとも一部分を第１の波長及び第２の波長で照明するステップと；ｅ）その試料の少なくとも一部分を撮像するステップであって、第１の構成成分及び第２の構成成分からの蛍光発光と第１の構成成分及び第２の構成成分の光学濃度とを示す画像信号の生成を含む、ステップと；ｆ）それらの画像信号を用いて、第１の構成成分及び第２の構成成分の各々についての蛍光値を決定するステップと；ｇ）それらの画像信号を用いて、第１の構成成分及び第２の構成成分の各々についての光学濃度値を決定するステップであって、この光学濃度が、構成成分により吸収された着色剤に従い変わる、ステップと；ｈ）決定された蛍光値と光学濃度値とを用いて、第１の構成成分及び第２の構成成分を同定するステップとを含む。

本発明の別の態様に従えば、血液試料を分析するための方法が提供され、この方法は、ａ）１つ又は複数の第１の粒状物質と、１つ又は複数の第２の粒状物質であって、第１の粒状物質とは異なる第２の粒状物質とを有する実質的に無希釈の血液試料を提供するステップと；ｂ）被分析試料を静止状態に保つように構成された分析チャンバに試料を入れるステップであって、チャンバが第１のパネルと第２のパネルとにより画定され、それらのパネルは双方とも透明である、ステップと；ｃ）着色剤を試料と混和するステップであって、この着色剤が、所定の第１の光の波長に曝露すると第１の粒状物質及び第２の粒状物質に蛍光を発生させるように機能し、及びこの着色剤が、１つ又は複数の所定の第２の光の波長の光を吸収するように機能する、ステップと；ｄ）第１の粒状物質と第２の粒状物質とを含む試料の少なくとも一部分を第１の波長及び第２の波長で照明するステップと；ｅ）その試料の少なくとも一部分を撮像するステップであって、第１の粒状物質及び第２の粒状物質からの蛍光発光と第１の粒状物質及び第２の粒状物質の光学濃度とを示す画像信号の生成を含む、ステップと；ｆ）それらの画像信号を用いて、第１の粒状物質及び第２の粒状物質の各々についての１つ又は複数の蛍光発光値を決定するステップと；ｇ）それらの画像信号を用いて、第１の粒状物質及び第２の粒状物質の各々についての１つ又は複数の光学濃度値を決定するステップであって、この光学濃度が、粒状物質により吸収された着色剤に従い変わる、ステップと；ｈ）決定された蛍光値と光学濃度値とを用いて、第１の粒状物質及び第２の粒状物質を同定するステップとを含む。

本発明のさらに別の態様に従えば、血液試料を分析するための方法が提供され、この方法は、ａ）１つ又は複数の第１の構成成分と、１つ又は複数の第２の構成成分であって、第１の構成成分とは異なる第２の構成成分とを有する実質的に無希釈の血液試料を提供するステップと；ｂ）被分析試料を静止状態に保つように構成された分析チャンバに試料を入れるステップであって、チャンバが第１のパネルと第２のパネルとにより画定され、それらのパネルは双方とも透明である、ステップと；ｃ）着色剤を試料と混和するステップであって、この着色剤が、所定の光の波長に曝露すると第１の構成成分及び第２の構成成分に蛍光を発生させるように機能する、ステップと；ｄ）第１の構成成分と第２の構成成分とを含む試料の少なくとも一部分を、その光の波長で一定のままある期間にわたり照明するステップと；ｅ）その期間内の離散的な時点において試料の少なくとも一部分を撮像し、離散的な時点の各々についての第１の構成成分及び第２の構成成分からの蛍光発光を示す画像信号を生成するステップと；ｆ）離散的な時点の各々についての画像信号を用いて、試料中に静止状態で含まれる第１の構成成分及び第２の構成成分の各々についての１つ又は複数の蛍光発光値を決定し、第１及び第２の構成成分の各々についての離散的な時点間における蛍光発光値の変化率を決定するステップと；ｇ）決定された第１及び第２の構成成分の各々についての蛍光発光値の変化率を用いて、第１の構成成分及び第２の構成成分を同定するステップとを含む。

本発明の利点は、毛細血管を穿刺することにより患者から直接採取され得るか（これは、ポイント・オブ・ケア用途に一層有用となる）、又は必要に応じて静脈血試料から得ることのできる極めて少量の試料容積を使用した血液試料の特性決定に用い得ることである。

本方法の別の利点は、外部及び内部流動体なしに、且つ重力又は向きとは無関係に機能するため、手持ち型機器として微小重力条件下での使用に適応可能なことである。

本方法及びそれに関連する利点が、添付の図面を含め、以下に提供される詳細な説明を考慮することでさらに容易に明らかとなるであろう。

本方法で使用し得る分析チャンバの図式的な断面表示である。 本方法で使用し得る分析チャンバの図式的な断面表示である。 本方法で使用し得る分析チャンバの図式的な断面表示である。 本方法で使用し得る分析チャンバの図式的な断面表示である。 複数の分析チャンバを有するテープの図式的な平面図である。 分析チャンバを有する使い捨て容器の図式的な平面図である。 分析チャンバを有する使い捨て容器の図式的な断面図である。 本方法で使用し得る分析機器の図式的な略図である。 好中球についての時間に伴う蛍光減衰量を図式的に示すグラフである。 リンパ球についての時間に伴う蛍光減衰量を図式的に示すグラフである。

本方法は、実質的に無希釈の抗凝固処理された全血の被分析試料を静止状態に保つように機能する分析チャンバを利用する。このチャンバは、典型的には約０．２〜１．０μｌの試料を保持するサイズであるが、チャンバはいかなる特定の容積容量にも限定されず、容量は分析用途に合わせて変更することができる。語句「実質的に無希釈の」は、本明細書で使用されるとき、全く希釈されていないか、又は意図的に希釈されたわけではないが、分析のためにそこに何らかの試薬が添加されている血液試料を指す。試薬の添加により試料が希釈される程度では、あったとしても、かかる希釈は実施される分析に対して何ら臨床的に有意な影響をもたない。典型的には、本方法の実施に使用され得る試薬は、抗凝固薬（例えば、ＥＤＴＡ、ヘパリン）及び着色剤のみである。これらの試薬は一般に乾燥形態で添加され、試料の希釈を目的とするものではない。ある状況下では（例えば、超高速分析）、抗凝固剤の添加は必要でないこともあるが、試料が分析に適した形態であることを確実にするため、ほとんどの場合には添加することが好ましい。用語「静止状態」は、試料が分析用チャンバの中に入れられ、分析中、その試料がチャンバに対して意図的に動かされることがない；すなわち、試料がチャンバ内に静止状態で存在することを表すために用いられる。血液試料中に存在する運動の程度では、それは主に血液試料の有形の構成成分のブラウン運動によるもので、そうした運動によってこの発明の機器が使用不能になることはない。

血液試料の少なくとも一部分と混和される着色剤（例えば、色素、染色剤等）は、着色剤を吸収する構成成分（例えば、ＷＢＣ及び他の核を含む細胞、並びに血小板を含む粒状物質、並びにＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む他の構成成分−例えば、細胞内又は細胞外の住血原虫−等）の定量分析を促進する。細胞及び粒状物質は、本明細書ではまとめて試料中の「構成成分」と称され得る。着色剤は、特定の波長（例えば、約４７０ｎｍ）に従う光によって励起されると、固有波長（例えば、５３０ｎｍ、５８５ｎｍ、及び６６０ｎｍ）に従う蛍光を発する。細胞が蛍光を発する具体的な波長は、当該の細胞及び励起光の１つ又は複数の波長の特性である。着色剤はまた、細胞内の着色剤濃度に従い１つ又は複数の所定波長の光を吸収する。許容可能な着色剤の例としては、超生体染色色素のアクリジンオレンジ及びアストロゾンオレンジ（ａｓｔｒｏｚｏｎｅ ｏｒａｎｇｅ）が挙げられる。しかしながら、本発明は超生体染色色素に限定されるものではない。

ここで図１を参照すると、分析チャンバ１０は、内表面１４を有する第１のパネル１２と、内表面１８を有する第２のパネル１６とにより画定される。パネル１２、１６は双方とも十分に透明なため、以下に記載される光学濃度分析の実施に十分な量の所定波長に従う光を、それらのパネルに透過させることが可能である。パネル１２、１６の少なくとも一部分は互いに平行であり、その部分の範囲内で内表面１４、１８は高さ２０だけ互いに隔たり、この高さは、既知であり得るか、又は計測可能であり得る。チャンバ１０内に配置されているＲＢＣ２２が示される。

本方法は、前記特徴を有する様々な異なる分析チャンバタイプを利用することができ、従っていかなる特定のタイプの分析チャンバにも限定されることはない。平行なパネル１２、１６を有する分析チャンバは、それにより分析が簡略化されるため好ましいが、本発明に必須ではない；例えば、一方のパネルが他方のパネルに対して既知の非平行な角度で配置されたチャンバを使用してもよい。

ここで図２〜５を参照すると、許容可能なチャンバ１０の例が示され、これは、第１のパネル１２と、第２のパネル１６と、パネル１２、１６の間に配置された少なくとも３つのセパレータ２６とを含む。セパレータ２６は、パネル１２、１６の間に配置可能な、パネル１２、１６を互いに離間させるように機能する任意の構造であってよい。パネル１２、１６間に延在するセパレータ２６の寸法２８は、本明細書ではセパレータ２６の高さ２８と称される。セパレータ２６の高さ２８は、典型的には互いに正確に等しいわけではないが（例えば、製造公差）、同様の分析装置に使用される間隔保持手段についての商業的に許容可能な公差の範囲内である。球形ビーズは許容可能なセパレータ２６の一例であり、例えば、Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｏｆ Ｆｉｓｈｅｒｓ、米国Ｉｎｄｉａｎａから市販されている。

図３に示されるチャンバの実施形態では、セパレータ２６は、第１のパネル１２及び第２のパネル１６の一方又は双方と比べて可撓性が高い材料からなる。図３で分かるとおり、より大きいセパレータ２６は、ほとんどのセパレータ２６がパネル１２、１６の内表面に接触している点まで圧縮され、そのためチャンバ高さはセパレータ２６の平均直径よりほんの僅かに小さくなる。図４に示されるチャンバの実施形態では、セパレータ２６は、第１のパネル１２及び第２のパネル１６の一方又は双方と比べて可撓性が低い材料からなる。図４では、第１のパネル１２は球形セパレータ２６及び第２のパネル１６より可撓性の高い材料によって形成され、テントのような形でセパレータ２６に被さる。この実施形態において、チャンバ１０の局所的な小さい領域は所望のチャンバ高さ２０から逸脱し得るが、チャンバ１０の平均高さ２０は、セパレータ２６の平均直径の高さに極めて近似する。分析では、平均チャンバ高さ２０は、この実施形態を使用する４μｍ未満のチャンバ高さにおいて約１パーセント（１％）又はそれ以上まで制御され得ることが示されている。上記の可撓性を有するという特性（並びにセパレータの分布密度などの他の要因）を前提として、セパレータ２６及びパネル１２、１６は様々な材料で作製することができ、但しパネル１２、１６は十分に透明であるものとする。アクリル又はポリスチレンからなる透明プラスチックフィルムが、許容可能なパネル１２、１６の例であり、ポリスチレン、ポリカーボネート、シリコーンなどから作製される球形ビーズが、許容可能なセパレータ２６である。許容可能なセパレータの具体例は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｏｆ Ｆｒｅｍｏｎｔ、米国Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから、カタログ番号４２０４Ａ、直径４ミクロン（４μｍ）で市販されているポリスチレン製の球体である。図５を参照すると、他方の上側に垂直方向に配置されるパネル１２が、等間隔に配置された複数のポート３０（例えば、通気孔として働く）を含み、パネル１２、１６は所定箇所で互いに結合される。いくつかの実施形態では、結合材料３２がチャンバ外壁を形成し、試料３４を分析チャンバ１０内に横方向に収容するように機能する。許容可能な分析チャンバのこの例は、米国特許出願公開第２００７／０２４３１１７号明細書、米国特許出願公開第２００７／００８７４４２号明細書、及び２００８年４月２日に出願された米国仮特許出願第６１／０４１，７８３号明細書；及び２００８年１０月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／１１０，３４１号明細書（これらは全て、全体として参照により本明細書に援用される）にさらに詳細に記載されている。

許容可能なチャンバ１０の別の例は、図６及び図７に示されるとおりの使い捨て容器３６に配置される。チャンバ１０は、第１のパネル１２と第２のパネル１６との間に形成される。第１のパネル１２及び第２のパネル１６の双方とも透明なため、チャンバ１０に光を通過させることができる。第１のパネル１２及び第２のパネル１６の少なくとも一部分は互いに平行であり、その部分の範囲内で内表面１４、１８は高さ２０だけ互いに隔たっている。このチャンバ１０の実施形態は、米国特許第６，７２３，２９０号明細書にさらに詳細に記載されており、この特許は、全体として参照により本明細書に援用される。図２〜図７に示される分析チャンバは、本方法における使用に適したチャンバに相当する。しかしながら、本方法はそれらの特定の実施形態に限定されるものではない。

試料中のＷＢＣは、チャンバパネルの双方の内表面に接触するものもあれば、そうでないものもあると思われる。本発明の目的上、それらが内表面に接触することは必須ではなく、且つチャンバの正確な高さが既知である必要はない。典型的なＷＢＣの大きさと、ＷＢＣはある程度変形し得る（例えば、チャンバ内表面間に部分的に圧縮される）という事実とに基づくと、約２〜６ミクロン（２〜６μ）のチャンバ高さがほとんどの動物種に適している。約３〜５ミクロン（３〜５μ）のチャンバ高さ２０が、特にヒト血液の分析には非常に好適である。ヒトＷＢＣより実質的に大きい、又は小さいＷＢＣを有する動物種の分析は、それぞれ、チャンバ高さがより高い、又はより低いそれぞれのチャンバで実施することができる。

チャンバ１０内に静止状態で配置された試料の分析は、試料の少なくとも一部分を照明して撮像し、画像に関する分析を実施するように機能する分析機器を使用して実施される。画像は、試料の一部分からの蛍光発光、及びその光学濃度を、ユニット毎ベースで決定することが可能な形で生成される。用語「ユニット毎ベース」又は「画像ユニット」は、試料の画像を解像することのできる定義された増分単位を意味する。「画素」は、特定の撮像システムにおいて個々に処理することのできる画像の最小要素として一般に定義され、画像ユニットの一例であり、また画像ユニットとしては、集合的な単位としての少数の画素も含まれ得る。撮像機器の拡大率は、線形的な関係（例えば、焦点面におけるマイクロメートル毎画素）として表すこともでき、この場合、線の寸法は、画像に適用される直交格子の特定の軸に従う。そのため、焦点面においてセンサの画素により捕捉される実際の試料面積は、撮像機器が適用する拡大倍率に従い変わる。従って、必須ではないが、撮像機器の拡大率が既知であることは有用である。従って、当該の画素に関連する容積は、画素毎の画像の面積にチャンバ高さを掛けたものである。例えば、拡大率が０．５μｍ毎画素であったならば、２００画素を占有する画像の面積は５０平方μｍとなり、容積は５０平方μｍ×チャンバ高さとなる。

ここで図８を参照すると、本方法での使用向けに構成することのできる分析機器４４の例であり、これは、試料照明器４６と、解像装置４８と、プログラム可能分析器５０とを含む。試料照明器４６は、特定の所望の波長に従う光を選択的に発生する光源を含む。例えば、所望の波長（例えば、４２０ｎｍ、４４０ｎｍ、４７０ｎｍ等）を発するＬＥＤを使用することができる。或いは、広い波長範囲（例えば、約４００〜６７０ｎｍ）を生じる光源を使用してもよく、しかし場合によっては、かかる光源はフィルタリングが必要となり得る。分析機器４４は、光を操作するための光学素子を含む。試料照明器４６は透過光源と落射光源とを含み、各々、チャンバ１０内に存在する試料の一部又は全部を照明するように機能する。許容可能な解像装置４８の一例は、試料を通過する光の像を電子データ形式（すなわち、信号）に変換する電荷結合素子（ＣＣＤ）である。プログラム可能分析器５０は中央演算処理装置（ＣＰＵ）を含み、試料照明器４６及び解像装置４８に接続される。ＣＰＵは、本方法の実施に必要な機能を選択的に実行するように構成される（例えば、プログラムされる）。全体として参照により本明細書に援用される、「Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ａｎａｌｙｚｉｎｇ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ Ｆｌｕｉｄｓ」と題される２００５年３月１５日に発行された米国特許第６，８６６，８２３号明細書が、かかる分析機器４４を開示している。

分析機器は、１）試料の少なくとも一部分を撮像し、撮像された試料からの蛍光発光と撮像された試料の光学濃度とを示す画像信号を画素毎ベースで生成し；２）それらの画像信号を用いて、全て静止状態で試料部分内に存在する第１のタイプの１つ又は複数の構成成分及び第２のタイプの１つ又は複数の構成成分についての蛍光値を決定し；３）撮像された第１及び第２のタイプの構成成分の各々についての光学濃度値を決定し；及び４）決定された蛍光値及び光学濃度値を用いて、第１のタイプの構成成分及び第２のタイプの構成成分を同定するように構成される。

本方法に従えば、実質的に無希釈の全血の試料は、チャンバ１０に導入された後、上記のとおり静止状態で存在する。試料のチャンバへの導入前か、又はチャンバへの導入時に、抗凝固剤及び着色剤が試料と混和される。着色剤は、試料中の細胞（例えば、ＷＢＣ及び血小板）により吸収される。以下において個々のＷＢＣを参照する場合、個々の血小板、又は試料中の他の構成成分に対しても同じ手順が適用される。チャンバ内に静止状態で存在する試料の少なくとも一部分が分析機器４４により照明され、それにより試料に光が透過する。チャンバ内に存在する試料の全体を撮像することは必須ではないが、そうすることで、典型的には試料のより完全な分析が提供され、それに伴い精度が増すため、好ましい。

試料は、ＷＢＣにより吸収された着色剤に関連して細胞からの蛍光発光を励起することが分かっている波長によって照明される。アクリジンオレンジで染色されたＷＢＣは、約４７０ｎｍの波長の紫色光で照明すると、蛍光発光を生じる。具体的な発光は、用いられる着色剤と、照明された細胞の細胞内組成とに依存する（例えば、着色剤が細胞のＲＮＡ及び／又はＤＮＡと相互作用すると、発光が生じる）。一部のＷＢＣは、蛍光定量上のシグネチャとして働く蛍光発光を有し、この蛍光発光は当該のＷＢＣに比較的特有であるため、当該のＷＢＣの同定に用いることができる。他のＷＢＣは、互いを容易には識別することのできない蛍光発光シグネチャを有する。こうした「共通の」発光シグネチャを有するＷＢＣは、第１のタイプのＷＢＣ又は第２のタイプのＷＢＣとして分類され得るが、２つのＷＢＣタイプの識別には、何らか別のものが必要である。

試料は、蛍光発光を生じさせるために照明されると同時に（又はその後に続いて）、着色剤によって吸収される１つ又は複数の波長に従ってもまた照明される。例えば、アクリジンオレンジで染色されたＷＢＣは、アクリジンオレンジが存在するため、約４２０ｎｍの波長の光を吸収する。光学濃度（ＯＤ）で示され得る吸収量は、ＷＢＣ内の着色剤の濃度及び局所条件（例えば、ｐＨ）に従い変わる。同じ量の着色剤に曝露されたときの、ＷＢＣの着色剤を吸収する性質は、一部のＷＢＣ細胞タイプ間で、細胞の生物学的特性に従い異なる。例えば、ＷＢＣ内の生物学的特性（例えば、核材料、細胞質等）が異なると、吸収する色素の濃度が異なる。各細胞タイプのこうした異なる生物学的特性、及びそれに関連して異なる、それらの特性によって吸収される着色剤の濃度を利用して、特定の細胞タイプを識別することができる。細胞内の着色剤の濃度に従い変わる細胞のＯＤを利用して、種々の細胞タイプを識別及び同定することができる。用途によっては、細胞間のＯＤの違いは、細胞の同定を可能とするのに十分な情報を提供することができる。他の場合には、蛍光定量上のシグネチャと細胞のＯＤとを用いて同定が達成される。

本発明の例を示すため、実質的に無希釈の血液試料をアクリジンオレンジと混和し、２枚の透明パネルを有するチャンバに導入する。試料は静止状態で存在し、試料中の複数のＷＢＣがチャンバの双方の内表面と接触する。試料は、４７０ｎｍ及び４２０ｎｍで照明する。４７０ｎｍでの照明は、蛍光発光を生じさせる。４２０ｎｍでの照明は、着色剤によって吸収される。照明された試料のデジタル画像を取得する。好中球と好酸球とを含むＷＢＣ群が、撮像された試料内に存在するＷＢＣ集団全体の中に同定され、当該の群を画像内で「分離」する；これは例えば、その群のみが見えるように画像をフィルタリングすることによる。好中球及び好酸球の各々は、励起すると、顕著な細胞質の赤色蛍光と核の緑色蛍光とからなるシグネチャ蛍光パターンを生じるため、これらのＷＢＣタイプが同定される。しかしながら、群内の好中球と好酸球との蛍光発光は、互いにかなり類似しているため、ＷＢＣのこの２つのタイプを識別することは困難である。

群内のこの２つのタイプのＷＢＣを識別するため、分離したＷＢＣの光学濃度を比較する。平均して、好酸球中に吸収されたアクリジンオレンジの濃度は、好中球中に吸収されたアクリジンオレンジの濃度より高く、しかし蛍光は同等であり得る。これは、好酸球内の着色剤の蛍光が、好中球内の着色剤の蛍光と比べて、好酸球の細胞内容物に特有の性質に起因して消光されるためである。ＷＢＣの２つの異なるタイプは、例えば、所定のＯＤカットオフ値を用いて；例えば、分離された群内でカットオフ値より大きいＯＤを有する細胞を好酸球と見なし、カットオフ値未満のＯＤを有する細胞を好中球と見なすことにより、別個のサブ群として識別することができる。

或いは、ＷＢＣの２つのタイプは、そのＯＤ計測値を、分析機器；例えばルックアップテーブル等に格納されている実験的に求めたＯＤ値と比較することにより識別することができる。

さらに別のものとして、２つのＷＢＣサブ群は、細胞質蛍光の細胞質ＯＤに対する比（蛍光／ＯＤ）を個々の細胞ベースで決定することにより互いに識別することができる。この比を与えるため、特定の細胞についての画素毎ベースでの蛍光発光値及び光学濃度値を決定して平均値を求めてもよく、その平均値を比に用いることができる。比は、画素毎ベースで比を決定して、画素毎の比の平均値を求めるなど、代替的方法を用いて決定してもよい。蛍光のＯＤに対する比は、特定の細胞内における染色剤の蛍光の消光を定量的に表す。比が低い細胞は、蛍光信号の「消光」を示している。分離した群内の全ての細胞の比を統計的に評価して、２つの集団間の分離点を決定することができる。統計的に分離点を下回る細胞は、その蛍光のＯＤに対する比が好中球の集団に関連する比より低いため、好酸球である。同様に、統計的に分離点を上回る細胞は、その蛍光のＯＤに対する比が好酸球の集団に関連する比より高いため、好中球である。

上記の蛍光／ＯＤ比の分析のさらなる実施形態において、比は、被験細胞からの上記の平均ＯＤ値及び蛍光発光値（又は５０％より大きい割合の範囲内にあるＯＤ値及び蛍光発光値）を用いて決定することができる。説明のため、着色剤に曝露された特定の細胞における着色剤の濃度が、第１の領域（例えば、核の領域）において、第２の領域（例えば、細胞質の領域）より低いものとし得る。結果的に、細胞の第２の領域（例えば細胞質）のＯＤは、細胞の第１の領域（例えば、核）のＯＤより高くなる。同様に、細胞の特定の領域からの蛍光発光が、別の領域からの発光より大きいものとし得る。蛍光発光／ＯＤ値のうち、その値がより高い発光強度又はＯＤを表す部分を選択的に用いると、結果として雑音対信号比が向上し、分析が促進される。この態様は、着色剤が典型的には、例えば細胞の細胞質内の顆粒の中で、選択的に分散するという事実を利用している。

本発明のさらなる実施形態において、試料中の細胞は、着色剤と混和した細胞を、蛍光発光を励起する波長（例えば、４７０ｎｍ）の光を一定に放射して「退色」させ、ある期間内の離散的な時点で発光の大きさを検知することにより、互いに識別することができる。特定の細胞タイプからの蛍光発光強度の平均低下率は、当該の細胞タイプについて一定であり、しかしこの平均の率は、細胞のタイプによって異なる。従って、発光強度の減少率を用いて細胞タイプを識別することができる。例えば、図９は、光退色に供された個々の好中球についての緑色蛍光発光の減衰率５２、５４、５６と、それらの好中球についての平均減衰率５８とを示す。図１０は、同じ光退色に供された個々のリンパ球についての緑色蛍光発光の減衰率６０、６２と、それらのリンパ球の平均値６４とを示す。図９及び図１０に示される曲線は、異なる細胞タイプについては減衰率が異なり、そうした異なる減衰率を用いて被分析細胞のタイプを同定し得ることを明らかに示している。発光の減少率を用いると、年齢などの他の特徴により細胞を識別することもできる；例えば、あるタイプの、但し年齢が異なる細胞は、固有の発光減少率を有し、これを用いて様々な異なる年齢群を識別することができる。

本発明は、その詳細な実施形態に関して図示及び説明されているが、当業者は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な形態及び詳細の変更が行われ得ることを理解するであろう。

特許請求の範囲は以下のとおりである。

Claims (32)

1. 血液試料を分析するための方法であって、
   被分析試料を静止状態に保つように構成された分析チャンバに前記試料を入れるステップであって、前記チャンバが第１のパネルと第２のパネルとにより画定され、それらのパネルの双方とも透明であり、前記試料が、１つ又は複数の第１の構成成分と、１つ又は複数の第２の構成成分であって、前記第１の構成成分とは異なる第２の構成成分とを有する、ステップと、
   着色剤を前記試料と混和するステップであって、この着色剤が、所定の第１の光の波長に曝露すると前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分に蛍光を発生させるように機能し、及びこの着色剤が、１つ又は複数の所定の第２の光の波長の光を吸収するように機能する、ステップと、
   前記第１の構成成分と前記第２の構成成分とを含む前記試料の少なくとも一部分を前記第１の波長及び前記第２の波長で照明するステップと、
   前記試料の前記少なくとも一部分を撮像するステップであって、前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分からの蛍光発光と前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分の光学濃度とを示す画像信号の生成を含む、ステップと、
   前記画像信号を用いて、前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分の各々についての１つ又は複数の蛍光発光値を決定するステップと、
   前記画像信号を用いて、前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分の各々についての１つ又は複数の光学濃度値を決定するステップであって、この光学濃度が、前記構成成分により吸収された前記着色剤に従い変わる、ステップと、
   前記決定された蛍光発光値と光学濃度値とを用いて、前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分を同定するステップと、
   を含む、方法。
2. 前記血液試料が実質的に無希釈である、請求項１に記載の方法。
3. 前記血液試料が全血である、請求項１に記載の方法。
4. 前記第１及び第２の構成成分が、白血球及び粒状物質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
5. 前記第１及び第２の構成成分が、白血球の各タイプである、請求項４に記載の方法。
6. 前記第１の構成成分の各々及び前記第２の構成成分の各々についての前記１つ又は複数の蛍光発光値が、画素毎ベースで決定される、請求項５に記載の方法。
7. 第１及び第２の構成成分の各々の少なくとも１つが、当該の構成成分の他の領域の蛍光値と比べて、蛍光発光値の強度が平均値を上回る当該の構成成分内の領域から決定された蛍光発光値を用いて同定される、請求項６に記載の方法。
8. 前記第１の構成成分の各々及び前記第２の構成成分の各々についての前記１つ又は複数の光学濃度値が、画素毎ベースで決定される、請求項７に記載の方法。
9. 第１及び第２の構成成分の各々の少なくとも１つが、当該の構成成分の他の領域の光学濃度値と比べて、光学濃度値の大きさが平均値を上回る当該の構成成分内の領域から決定された光学濃度値を用いて同定される、請求項８に記載の方法。
10. 前記第１及び第２の構成成分の各々の少なくとも一部分の範囲内における前記決定された光学濃度値の平均値を求めるステップをさらに含む、請求項７に記載の方法であって、 前記決定された蛍光発光値及び光学濃度値を用いて前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分を同定するステップが、前記各構成成分について決定された平均光学濃度値を、所定の光学濃度値と比較することを含む、方法。
11. 前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分が、好酸球、好中球、及び好塩基球からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記第１及び第２の構成成分の各々の少なくとも一部分の範囲内における前記決定された光学濃度値の平均値を求めるステップをさらに含む、請求項５に記載の方法であって、 前記決定された蛍光発光値及び光学濃度値を用いて前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分を同定するステップが、前記決定された光学濃度値を実験上のデータと比較することにより、前記第１の構成成分を前記第２の構成成分と識別することを含む、方法。
13. 前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分が、好酸球、好中球、及び好塩基球からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記決定された蛍光発光値及び光学濃度値を用いて前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分を同定するステップが、特定の細胞について決定された蛍光発光値の、決定された光学濃度値に対する比を決定することを含む、請求項５に記載の方法。
15. 前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分が、好酸球、好中球、及び好塩基球からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記比が、ある細胞について決定された蛍光発光値の平均値の、当該の細胞について決定された光学濃度値の平均値に対する比である、請求項１４に記載の方法。
17. 前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分の各々について決定された蛍光発光値の、決定された光学濃度値に対する比を決定し、前記比を統計的に評価して、前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分を同定するステップをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
18. 前記決定された蛍光発光値及び光学濃度値を用いて前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分を同定するステップが、前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分の各々の細胞質領域のみの蛍光発光及び光学濃度を利用する、請求項５に記載の方法。
19. 前記決定された蛍光発光値及び光学濃度値を用いて前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分を同定するステップが、前記撮像された試料内の実質的に全ての構成成分の蛍光発光値を比較するステップを含む、請求項５に記載の方法。
20. 前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分が、実質的に同様の蛍光発光値パターンを有する、請求項１９に記載の方法。
21. 前記第１及び第２の構成成分の各々の少なくとも一部分の範囲内における前記決定された光学濃度値の平均値を求めるステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法であって、
    前記決定された蛍光発光値及び光学濃度値を用いて前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分を同定するステップが、前記第１の構成成分の少なくとも１つ及び前記第２の構成成分の少なくともについての前記決定された平均光学濃度値を、所定の光学濃度値と比較することを含む、方法。
22. 前記第１及び第２の構成成分が、粒状物質の各タイプである、請求項４に記載の方法。
23. 前記第１及び第２の粒状物質が、血小板及び住血原虫からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
24. 血液試料を分析するための方法であって、
    被分析試料を静止状態に保つように構成された分析チャンバに試料を入れるステップであって、前記チャンバが第１のパネルと第２のパネルとにより画定され、それらのパネルの双方とも透明であり、前記試料が、１つ又は複数の第１の構成成分と、１つ又は複数の第２の構成成分であって、前記第１の構成成分とは異なる第２の構成成分とを有する、ステップと、
    着色剤を前記試料と混和するステップであって、この着色剤が、所定の光の波長に曝露すると前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分に蛍光を発生させるように機能する、ステップと、
    前記第１の構成成分と前記第２の構成成分とを含む前記試料の少なくとも一部分を前記光の波長で一定のままある期間にわたり照明するステップと、
    前記期間内の離散的な時点において前記試料の前記少なくとも一部分を撮像し、離散的な時点の各々についての前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分からの蛍光発光を示す画像信号を生成するステップと、
    前記離散的な時点の各々についての画像信号を用いて、前記試料中に静止状態で含まれる前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分の各々についての１つ又は複数の蛍光発光値を決定し、前記第１及び第２の構成成分の各々についての前記離散的な時点間における蛍光発光値の変化率を決定するステップと、
    前記第１及び第２の構成成分の各々についての前記決定された蛍光発光値の変化率を用いて、前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分を同定するステップと、
    を含む、方法。
25. 前記血液試料が実質的に無希釈である、請求項２４に記載の方法。
26. 前記血液試料が全血である、請求項２４に記載の方法。
27. 前記第１及び第２の構成成分が、白血球及び粒状物質からなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
28. 前記第１及び第２の構成成分が、白血球の各タイプである、請求項２７に記載の方法。
29. 前記第１及び第２の構成成分が、粒状物質の各タイプである、請求項２７に記載の方法。
30. 前記第１及び第２の粒状物質が、血小板及び住血原虫からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
31. 血液試料を分析するための装置であって、
    前記試料を静止状態に保つように構成されたチャンバと、
    １つ又は複数の蛍光励起波長と１つ又は複数の吸収波長とに従い前記試料を照明するように機能する照明器と、
    前記試料を撮像し、前記試料内に含まれる第１の構成成分及び第２の構成成分からの蛍光発光、及びその光学濃度を示す画像信号を生成するように機能する解像装置であって、前記第１の構成成分が前記第２の構成成分とは異なる、解像装置と、
    前記画像信号を用いて、前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分の各々についての１つ又は複数の蛍光発光値を決定し、且つ前記画像信号を用いて、前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分の各々についての１つ又は複数の光学濃度値であって、前記構成成分により吸収された前記着色剤に従い変わる光学濃度を決定し、前記決定された蛍光発光値及び光学濃度値を用いて前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分を同定するように構成された分析機器と、
    を含む、装置。
32. 第１の構成成分と、第２の構成成分であって、前記第１の構成成分とは異なる第２の構成成分とを有する血液試料を分析するための装置であって、
    前記試料を静止状態に保つように構成されたチャンバと、
    １つ又は複数の第１の構成成分と１つ又は複数の第２の構成成分とを含む前記試料の少なくとも一部分を、１つ又は複数の蛍光励起波長に従い一定のままある期間にわたり照明するように機能する照明器と、
    前記期間内の離散的な時点において前記試料の前記少なくとも一部分を撮像し、離散的な時点の各々についての前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分からの蛍光発光を示す画像信号を生成するように機能する解像装置と、
    前記離散的な時点の各々についての画像信号を用いて、前記試料中に静止状態で含まれる前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分の各々についての１つ又は複数の蛍光発光値を決定して、前記第１及び第２の構成成分の各々についての前記離散的な時点間における蛍光発光値の変化率を決定し、及び前記第１及び第２の構成成分の各々についての前記決定された蛍光発光値の変化率を用いて、前記第１の構成成分及び前記第２の構成成分を同定するように構成された分析機器と、
    を含む、装置。