DE60308259T2 - Immunologische Verfahren, Vorrichtungen und Reagenzien - Google Patents

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antigen
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Yasunori Kakogawa-shi Kawate
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex

Description

  • Hintergrund der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Immunassayverfahren, Immunassayvorrichtungen und Reagenzien für Immunassays unter Verwendung der Teilchenagglutination eines Trägerteilchens, auf dem ein Antigen oder Antikörper gegen eine Substanz, enthaltend in einer Probe wie Blut, Urin, Aszites oder dergleichen, immobilisiert ist.
  • Immunassayverfahren, um bestimmte Substanzen in einer Probe wie Blut zu detektieren unter Verwendung einer Antigen-Antikörper-Reaktion, sind im Bereich der klinischen Laboruntersuchungen verwendet worden. Beispiele umfassen Radioimmunassays (RIA), Enzymimmunassays (EIA), fluorometrische Immunassays (FIA) und Teilchenagglutination. In dem Teilchenagglutinationsverfahren wird eine Probe, von der angenommen wird, dass sie eine zu messende Zielsubstanz enthält, mit Trägerteilchen vermischt, auf welchen ein Antikörper oder ein Antigen, mit der zu messenden Zielsubstanz reagierend, immobilisiert ist. Da die Trägerteilchen durch die Antigen-Antikörper-Reaktion agglutiniert werden, falls die zu messende Zielsubstanz in der Probe existiert, wird ihre Agglutination optisch detektiert.
  • Serum oder Plasma, erhalten durch Eliminieren von Blutzellen aus Vollblut wird im Allgemeinen als Probe für immunologische Untersuchungen verwendet; wenn jedoch Teilchen wie Erythrozyten, Fettteilchen und Bakterien nicht eliminiert worden sind, beeinflussen sie die optische Detektion der Trägerteilchenagglutination. Zusätzlich enthält Vollblut große Mengen von Erythrozyten; diese beeinflussen somit, falls Vollblut als Probe verwendet wird, ebenfalls die optische Detektion der Trägerteilchenagglutination. In einer Notfalluntersuchung ist jedoch ein Assay, welcher Vollblut verwendet, welcher nicht den zusätzlichen Schritt des Eliminierens der Blutzellen benötigt, wünschenswert.
  • Ein Immunassayverfahren, das die Verwendung von Vollblut auf Basis eines Zählimmunassays unter Verwendung von Trägerteilchen, die in Größe unterschiedlich sind, zu Erythrozyten ermöglicht, ist in WO 01/96868 beschrieben. In diesem Verfahren ist es jedoch nötig, Trägerteilchen auszuwählen, welche in ihrer Größe nicht mit Erythrozyten überlappen.
  • US 5,405,784 betrifft ein Immunagglutinationsverfahren auf Basis von verschiedenen homogenen Populationen von fluoreszierenden Kügelchen, welche spezifisch mit einem oder mehreren Liganden interagieren. Die Mischung von Probe und Kügelchen wird auf Basis eines einzelnen Parameters analysiert, Fluoreszenz pro Ligand, um die Anzahl von nicht-agglutinierten Kügelchen und die Anzahl von agglutinierten Kügelchen zu bestimmen.
  • In der Patentanmeldung GB 2 123 146 A wird ein Zwei-Parameter-Flussimmunassay mit Teilchen offenbart, welche eine detektierbare, unterschiedliche Eigenschaft wie Größe und Fluoreszenz aufweist. Die Bildung von Aggregaten der zwei unterschiedlichen Arten von Teilchen wird durch Detektion der Teilchen mit gemischten Eigenschaften gemessen.
  • Darüber hinaus sind verschiedene Parameter wie mit einer Infektion zusammenhängende Substanzen, mit Tumoren zusammenhängende Substanzen und Hormone als Messparameter in immunologischen Untersuchungen verwendet worden. Ein automatischer Analyseapparat für mehrere Parameter ist für die Verwendung in immunologischen Untersuchungen beliebt geworden und umfasst üblicherweise die folgenden Schritte:
    Eine Probe wird auf mehrere Reaktionsgefäße verteilt, in Abhängigkeit der Anzahl der zu messenden Parameter; Reagenzien werden gemäß den spezifischen Messparametern verteilt; die vorgeschriebenen Reaktionsbehandlungen werden sukzessive durchgeführt; und die jeweiligen Reaktionsproben werden gemessen. Solche automatischen Analyseapparate für mehrere Parameter benötigen viele Messreagenzien und viele Reaktionsgefäße, was in einem großen und komplizierten Design resultiert.
  • Zusätzlich vergrößert sich die Menge an benötigter Probe für eine Untersuchung mit der Anzahl der Messparameter, wodurch die Belastung des Patienten ansteigt. So war ein Immunassayverfahren zum simultanen Messen mehrerer Parameter in einer Probe wünschenswert. Ein Beispiel eines solchen Immunassayverfahrens wird in der ungeprüften japanischen Patentveröffentlichung Sho 61-132870 beschrieben. In diesem Verfahren sind auf einem Reagens und Trägern wie Latex mit unterschiedlichen Teilchendurchmessern mehrere Arten von Antikörpern immobilisiert. Ein Antikörper, der mit einer Markierungssubstanz markiert ist, und Proben werden miteinander reagieren gelassen, so dass sie einen Immunkomplex bilden aus mit Antikörpern immobilisierten Trägern, der zu messenden Zielsubstanz-Antigene und markierten Antikörpern. Teilchen mit Markierungsinformation werden auf Basis des Teilchendurchmessers durch Messen von Parametern und Erhalten von Information für Teilchendurchmesser und Markierungssubstanz analysiert.
  • In der oben beschriebenen Methode bildet jedoch nicht jeder Träger notwendigerweise einen Immunkomplex, und Agglutination der Träger tritt auf durch Reagieren des Antigens der zu messenden Zielsubstanz mit Antikörpern von mehreren Trägern. Darüber hinaus verursachen Latexpartikel Agglutination durch den Einfluss von Oberflächenladungen. Wenn die Träger agglutiniert sind, wird der scheinbare Teilchendurchmesser groß und eine Unterscheidung der Messparameter auf Basis des Teilchendurchmessers wird unmöglich. Des Weiteren wird als Reagens zum Detektieren des Antigens ein mit einer Markierungssubstanz markierter Antikörper zusätzlich zu den Trägerteilchen benötigt, welche mit dem Antikörper, der auf das Antigen reagiert, immobilisiert sind.
  • Zusammenfassung
  • Der Umfang der vorliegenden Erfindung wird nur durch die angefügten Ansprüche definiert und wird nicht in irgendeinem Maße durch die Aussagen in dieser Zusammenfassung beeinträchtigt.
  • In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung Immunassayverfahren, umfassend:
    • (a) Herstellen einer Messprobe durch Mischen einer Probe mit Trägerpartikeln; wobei die Probe eine zu messende Zielsubstanz und co-existierende Partikel umfasst; wobei ein Antikörper oder ein Antigen gegen die zu messende Zielsubstanz auf den Trägerpartikeln immobilisiert ist; wobei die Trägerpartikel eine andere physikalische Eigenschaft haben als die co-existierenden Partikel; wobei diese andere physikalische Eigenschaft ausgewählt ist aus Fluoreszenz, Absorption, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder biologischer Lumineszenz, und wobei die Trägerpartikel agglutiniert sind, wenn die zu messende Zielsubstanz in der Probe vorhanden ist;
    • (b) Nachweisen einer ersten und zweiten optischen Information der co-existierenden Partikel und der Trägerpartikel in der Messprobe, wobei die erste optische Information ausgewählt ist aus Fluoreszenz, Absorption, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder biologischer Lumineszenz, und die zweite optische Information Streulicht ist;
    • (c) Unterscheiden der Trägerpartikel von den co-existierenden Partikeln auf Grundlage der ersten optischen Information;
    • (d) Nachweisen eines Agglutinierungsniveaus der Trägerpartikel auf Grundlage der zweiten optischen Information; und
    • (e) Analysieren auf Grundlage des Agglutinierungsniveaus der Trägerpartikel, ob die zu messende Zielsubstanz in der Probe vorhanden ist oder nicht.
  • In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Immunassayverfahren, umfassend:
    • (a) Herstellen einer Messprobe durch Mischen einer Probe, die eine erste und zweite zu messende Zielsubstanz und co-existierende Partikel umfasst und erste und zweite Trägerpartikel; wobei ein Antikörper oder ein Antigen gegen die erste zu messende Zielsubstanz auf den ersten Trägerpartikeln immobilisiert ist und die ersten Trägerpartikel agglutinieren, wenn die erste zu messende Zielsubstanz vorhanden ist; wobei ein Antikörper oder ein Antigen gegen die zweite zu messende Zielsubstanz auf den zweiten Trägerpartikeln immobilisiert ist und die zweiten Trägerpartikel agglutinieren, wenn die zweite zu messende Zielsubstanz vorhanden ist; wobei die ersten und zweiten Trägerpartikel verschiedene optische Informationen als die co-existierenden Partikel umfassen; und wobei die ersten Trägerpartikel eine andere physikalische Eigenschaft haben als die zweiten Trägerpartikel, wobei die andere physikalische Eigenschaft ausgewählt ist aus Fluoreszenz, Absorption, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder biologischer Lumineszenz;
    • (b) Nachweisen der ersten und zweiten optischen Information der ersten und zweiten Trägerpartikel und der co-existierenden Partikel in der Messprobe, wobei diese erste optische Information ausgewählt ist aus Fluoreszenz, Absorption, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder biologischer Lumineszenz und diese zweite optische Information Streulicht ist;
    • (c) Unterscheiden der ersten Trägerpartikel, der zweiten Trägerpartikel und der co-existierenden Partikel auf Grundlage der ersten optischen Information;
    • (d) Nachweisen der jeweiligen Agglutinierungsniveaus der ersten und zweiten Trägerpartikel auf Grundlage der zweiten optischen Information; und
    • (e) Analysieren auf Grundlage der jeweiligen Agglutinierungsniveaus, ob mindestens eine der ersten und zweiten zu messenden Zielsubstanzen in der Probe vorhanden ist oder nicht.
  • Des Weiteren betrifft die Erfindung eine Immunassayvorrichtung, umfassend:
    • (a) eine Messprobeneinheit zum zur Verfügung stellen einer Messprobe, wobei die Messprobe eine Mischung einer Probe mit Trägerpartikeln ist; wobei die Probe eine zu messende Zielsubstanz und co-existierende Partikel umfasst; wobei ein Antikörper oder ein Antigen gegen die zu messende Zielsubstanz auf den Trägerpartikeln immobilisiert ist; wobei die Trägerpartikel eine andere physikalische Eigenschaft haben als die co-existierenden Partikel, wobei diese physikalische Eigenschaft ausgewählt ist aus Fluoreszenz, Absorption, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder biologischer Lumineszenz; und wobei die Trägerpartikel agglutiniert sind, wenn die zu messende Zielsubstanz in der Probe vorhanden ist;
    • (b) einen Detektor für optische Information zum Nachweisen einer ersten und zweiten optischen Information der co- existierenden Partikel und der Trägerpartikel in der Messprobe, wobei besagte erste optische Information ausgewählt ist aus Fluoreszenz, Absorption, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder biologischer Lumineszenz und die zweite optische Information Streulicht ist;
    • (c) eine Kontrolleinheit, welche die Trägerpartikel von den co-existierenden Partikeln auf Grundlage der ersten optischen Information unterscheidet, das Agglutinierungsniveau der Trägerpartikel auf Grundlage der zweiten optischen Information berechnet und auf Grundlage des Agglutinierungsniveaus der Trägerpartikel analysiert, ob die zu messende Zielsubstanz in der Probe vorhanden ist oder nicht.
  • In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung eine Immunassayvorrichtung, umfassend:
    • (a) eine Messprobeneinheit zum zur Verfügung stellen einer Messprobe, wobei die Messprobe eine Mischung einer Probe mit ersten und zweiten Trägerpartikeln ist, wobei die Probe eine erste und zweite zu messende Zielsubstanz und co-existierende Partikel umfasst; wobei ein Antikörper oder ein Antigen gegen die erste zu messende Zielsubstanz auf den ersten Trägerpartikeln immobilisiert ist und die ersten Trägerpartikel agglutinieren, wenn die erste zu messende Zielsubstanz vorhanden ist; wobei ein Antikörper oder ein Antigen gegen die zweite zu messende Zielsubstanz auf den zweiten Trägerpartikeln immobilisiert ist und die zweiten Trägerpartikel agglutinieren, wenn die zweite zu messende Zielsubstanz vorhanden ist; und wobei die ersten Trägerpartikel eine andere physikalische Eigenschaft haben als die zweiten Trägerpartikel, wobei die andere physikalische Eigenschaft ausgewählt ist aus Fluoreszenz, Absorption, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder biologischer Lumineszenz;
    • (b) einen Detektor für optische Information zum Detektieren der ersten und zweiten optischen Information der ersten und zweiten Trägerpartikel, wobei die erste optische Information ausgewählt ist aus Fluoreszenz, Absorption, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder biologischer Lumineszenz und die zweite optische Information Streulicht ist;
    • (c) eine Kontrolleinheit, die die ersten Trägerpartikel, die zweiten Trägerpartikel und die co-existierenden Partikel auf Grundlage der ersten optischen Information unterscheidet, die entsprechenden Agglutinierungsniveaus der ersten und zweiten Trägerpartikel auf Grundlage der zweiten optischen Information berechnet; und auf Grundlage der entsprechenden Agglutinierungsniveaus analysiert, ob mindestens eine der ersten und zweiten zu messenden Zielsubstanzen in der Probe vorhanden ist.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 zeigt ein zweidimensionales Scattergramm, worin Trägerteilchen und andere Teilchen als die Trägerteilchen, die in der Probe enthalten sind, in unterschiedlichen Positionen auftreten.
  • 2 zeigt ein Histogramm der Teilchen, die in den auf dem zweidimensionalen Scattergramm gesetzten Regionen auftraten.
  • 3 zeigt ein zweidimensionales Scattergramm, in welchem die ersten und zweiten Trägerteilchen in unterschiedlichen Positionen auftraten.
  • 4 zeigt ein Histogramm der Teilchen, die in den auf dem zweidimensionalen Scattergramm gesetzten Regionen auftraten.
  • 5 zeigt eine perspektivische Ansicht einer automatischen Immunassayvorrichtung, die Merkmale der vorliegenden Erfindung verkörpert.
  • 6 zeigt eine Illustration der inneren Konfiguration einer automatischen Immunassayvorrichtung, die Merkmale der vorliegenden Erfindung verkörpert.
  • 7 zeigt eine perspektivische Ansicht eines Probenvorbereitungsteils einer automatischen Immunassayvorrichtung, die Merkmale der vorliegenden Erfindung verkörpert.
  • 8 zeigt eine auseinander genommene perspektivische Ansicht des Lichtdetektionsteils einer automatischen Immunassayvorrichtung, die Merkmale der vorliegenden Erfindung verkörpert.
  • 9 zeigt eine schematische Darstellung eines Kontrollteils einer automatischen Immunassayvorrichtung, die Merkmale der vorliegenden Erfindung verkörpert.
  • 10 zeigt eine schematische Darstellung der Gesamtkontrolle einer automatischen Immunassayvorrichtung, die Merkmale der vorliegenden Erfindung verkörpert.
  • 11 zeigt eine schematische Darstellung der Kontrolle des Analyseteils einer automatischen Immunassayvorrichtung, die Merkmale der vorliegenden Erfindung verkörpert.
  • 12 zeigt eine Darstellung eines Bildschirms, wie er auf einem Flüssigkristall-Touchpanel einer automatische Immunassayvorrichtung, die Merkmale der vorliegenden Erfindung verkörpert, ausgegeben wird.
  • 13 zeigt die schematische Darstellung der Konfiguration eines Durchflusszytometers, das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird.
  • 14 zeigt ein zweidimensionales Scattergramm, erhalten gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 15 zeigt ein Histogramm, erhalten gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 16 zeigt ein zweidimensionales Scattergramm, erhalten gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 17 zeigt ein zweidimensionales Scattergramm, erhalten gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 18 zeigt ein, erhalten gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 19 zeigt ein Histogramm, erhalten gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 20 zeigt ein Histogramm, erhalten gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 21 zeigt ein Histogramm, erhalten gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 22 zeigt ein zweidimensionales Scattergramm, erhalten gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 23 zeigt ein zweidimensionales Scattergramm, erhalten gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 24 zeigt ein Histogramm, erhalten gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 25 zeigt ein Histogramm, erhalten gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 26 zeigt ein Histogramm, erhalten gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 27 zeigt ein Histogramm, erhalten gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 28 zeigt ein zweidimensionales Scattergramm, erhalten gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 29 zeigt ein zweidimensionales Scattergramm, erhalten gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 30 zeigt ein Histogramm, erhalten gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 31 zeigt ein Histogramm, erhalten gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 32 zeigt ein Histogramm, erhalten gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 33 zeigt ein Histogramm, erhalten gemäß der vorliegenden Erfindung.
  • 34 zeigt eine perspektivische Ansicht eines modifizierten Beispiels des in 7 gezeigten Probenvorbereitungsteils.
  • Detaillierte Beschreibung der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen
  • Die vorliegende Erfindung stellt Immunassayverfahren, Vorrichtungen und Reagenzien zur Verfügung, in welchen Teilchen, die anders sind als die zu messende Zielsubstanz, welche in einer Probe enthalten sein können, einen minimalen Effekt haben, wobei eine hohe Flexibilität bei der Auswahl der Größe der Trägerteilchen ermöglicht wird, die in einem Teilchenagglutinations-Immunassayverfahren verwendet werden.
  • Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung Immunassayverfahren, Vorrichtungen und Reagenzien zur Verfügung, die in der Lage sind, simultan mehrere Parameter aus einer Probe zu messen, ohne einen markierten Antikörper zu benötigen.
  • Das Immunassayverfahren der vorliegenden Erfindung verwendet Teilchenagglutinationsverfahren. Trägerteilchen, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen solche, die im allgemeinen in Teilchenagglutinationsverfahren verwendet werden, umfassend, aber nicht limitiert auf Latexteilchen, Polystyrolteilchen, magnetische Teilchen, Glasteilchen, Dendrimere und dergleichen, sowie Kombinationen davon.
  • Mit Bezug auf das Antigen oder den Antikörper, die immobilisiert sind auf den Trägerteilchen, wird, falls die zu messende Zielsubstanz ein Antikörper ist, ein Antigen, welches spezifisch mit dem Antikörper reagiert, verwendet. Falls die zu messende Zielsubstanz ein Antigen ist, wird ein Antikörper, welcher spezifisch mit dem Antigen reagiert, verwendet. Zum Beispiel, falls der zu messende Parameter das CEA-Antigen (Krebs-embryonales Antigen) ist, wird Anti-CEA-Antikörper immobilisiert. Falls der zu messende Parameter Anti-HBs-Antikörper ist, wird HBs-Antigen immobilisiert.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine physikalische Eigenschaft der Trägerteilchen detektiert. Die Trägerteilchen werden von anderen Teilchen als die zu messende Zielsubstanz, die in der Probe enthalten sind, differenziert auf Basis der detektierten physikalischen Eigenschaft. Wenn mehrere Arten von Trägerteilchen verwendet werden, um eine Vielzahl von zu messenden Zielsubstanzen zu detektieren, wird jede Art von Teilchen differenziert durch die physikalischen Eigenschaften, die von den Trägerteilchen detektiert werden. Die physikalische Eigenschaft ist optische Information, ausgewählt aus vorwärts gestreutem Licht, seitwärts gestreutem Licht, Fluoreszenz, Absorption, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz und biologische Lumineszenz. Ein Durchflusszytometer ist ein Beispiel einer Vorrichtung, die verwendet werden kann, um derartige optische Information zu detektieren. Diese Vorrichtung detektiert optische Information, wie Fluoreszenzintensität, vorwärts gestreute Lichtintensität und seitwärts gestreute Lichtintensität, detektiert von den jeweiligen Teilchen durch Fließen einer Probe, enthaltend die Trägerteilchen, in eine Durchflusszelle, Bestrahlen mit Laserlicht und Empfangen von Fluoreszenz und vorwärts gestreutem Licht, generiert, wenn das Trägerteilchen durch das Laserlicht hindurch tritt, gefolgt durch fotoelektrischen Transfer. Die Vorrichtung kann Spannungsveränderungen verwenden, welche auftreten, wenn die Teilchen durch eine Mikropore hindurchtreten, dadurch dass die Teilchen durch die Mikropore hindurchtreten gelassen werden, an welche eine Spannung angelegt wird, als eine physikalische Eigenschaft. Gemäß der vorliegenden Erfindung können mehrere physikalische Eigenschaften, wie oben beschrieben, von jedem Teilchen detektiert werden, und die Unterscheidung der Teilchen und Detektion des Agglutinationsniveaus werden durch die Kombination davon durchgeführt, wie in den Ansprüchen beschrieben.
  • Wenn mehrere optische Informationen als die Quelle mehrerer physikalischer Eigenschaften verwendet werden, werden die Trägerteilchen von anderen Teilchen in der Probe differenziert auf der Basis der ersten optischen Information, worin besagte erste optische Information ausgewählt ist aus Fluoreszenz, Absorption, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder biologische Lumineszenz. Ein Fluoreszenzfarbstoff, Färbemittel, lumineszierendes Substrat oder dergleichen ist geeigneterweise in den Trägerteilchen enthalten. Somit tritt eine hohe Signalintensität von Trägerteilchen auf durch Verwendung von Fluoreszenz, Absorption, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder biologischer Lumineszenz. Da andere Teilchen als die zu messende Zielsubstanz, z.B. Erythrozyten, Blutplättchen und Chylomikrone, eine geringe Intensität an Fluoreszenz, Absorption, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder biologischer Lumineszenz aufweisen, werden sie von den Trägerteilchen anhand der ersten optischen Information unterschieden. Somit ist die vorliegende Erfindung vorteilhaft, indem weniger Restriktionen benötigt werden, wenn die Größe der Trägerteilchen ausgewählt wird, da die Unterscheidung der Teilchen durchgeführt wird, ohne die Verwendung einer physikalischen Eigenschaft, die die Größe der Teilchen widerspiegelt. Zum Beispiel können, wenn der Immunassay ausgeführt wird unter Verwendung einer Blutplättchen enthaltenden Probe, selbst wenn die verwendeten Trägerteilchen Größen haben, die ähnlich sind zu jenen der Blutplättchen, die Trägerteilchen von den Blutplättchen differenziert werden durch physikalische Eigenschaften, wie Fluoreszenz, die von den Trägerteilchen detektiert wird. In diesem Fall ist es nicht notwendig, einen zusätzlichen markierten Antikörper oder dergleichen zu verwenden, da eine physikalische Eigenschaft des Trägerteilchens per se detektiert wird.
  • Die zweite optische Information wird für die Detektion des Agglutinationsniveaus der Trägerteilchen verwendet. Die zweite optische Information ist gestreutes Licht. Der Begriff "Agglutinationsniveau" bezieht sich auf den Grad der Teilchenagglutination auf Basis einer Antigen-Antikörper- Reaktion. Wenn Information, die die anscheinende Größe der Trägerteilchen widerspiegelt, d.h. gestreutes Licht, insbesondere vorwärts gestreutes Licht, verwendet wird als die zweite optische Information, können nicht-agglutinierte Trägerteilchen unterschieden werden von agglutinierten Trägerteilchen, und das Agglutinationsniveau der Trägerteilchen kann erhalten werden. Wenn gleichmäßig kugelförmige Teilchen, wie Latexteilchen, als die Trägerteilchen verwendet werden, kann in ähnlicher weise seitwärts gestreutes Licht verwendet werden als die Information, die die Größe der Trägerteilchen widerspiegelt. Es ist möglich, als dieses Agglutinationsniveau eine Agglutinationsrate, erhalten durch das folgende Verfahren, zu verwenden: (a) erhalte die Streulichtintensität der jeweiligen Teilchen durch Durchflusszytometrie; (b) unterscheide die nicht-agglutinierten einzelnen Teilchen von den agglutinierten Teilchen, generiert durch die Agglutination von mehreren Trägerteilchen, durch die Intensität des gestreuten Lichts der jeweiligen Teilchen und zähle die Anzahl der einzelnen Teilchen (M) und der agglutinierten Teilchen (P); (c) erhalte die Gesamtteilchenanzahl (T), welche die Summe von M und P ist, um P/T zu berechnen, welches die Agglutinationsrate ist.
  • Da eine Reaktion in einem Stadium erfasst werden kann, wo zwei Trägerteilchen agglutinieren, wird ein Immunassay von extrem hoher Sensitivität in diesem Verfahren möglich. Es ist möglich, verschiedene Verfahren zur Messung des Agglutinationsniveaus zu verwenden, in Abhängigkeit von dem Messkonzentrationsbereich der zu messenden Zielsubstanz (z.B., ein Verfahren, das Teilchenniveaus misst, die mit einer bestimmten Anzahl oder mehr agglutiniert sind).
  • Ein Beispiel eines Scattergramms, welches ein Messbeispiel gemäß der vorliegenden Erfindung ist, wird in 1 gezeigt. Latexteilchen, enthaltend Fluoreszenzfarbstoff, als Trägerteilchen wurden mit einer Blutprobe gemischt, um eine Probenflüssigkeit zu ergeben. Unter Verwendung eines Durchflusszytometers wurde die Intensität der Fluoreszenz und des vorwärts gestreuten Lichts als optische Information von der Probenflüssigkeit detektiert. Mit der detektierten optischen Information wurde das Scattergramm in 1 erhalten unter Verwendung der Fluoreszenzintensität als vertikale Achse und der vorwärts gestreuten Lichtintensität als der horizontalen Achse. Die Trägerteilchen unterscheiden sich in der vorwärts gestreuten Lichtintensität in Abhängigkeit von den Mustern der Agglutination, wie nicht-agglutinierte einzelne Teilchen 11, agglutinierte Doppelteilchen 12, resultierend aus der Agglutination von zwei Teilchen, und agglutinierte Trägerteilchen 13, resultierend aus der Agglutination von drei Trägerteilchen. Die respektiven Trägerteilchen treten als segregierte Populationen in dem Scattergramm auf. Chylomikrone 14 und Erythrozyten 15 erscheinen als Teilchen, die anders sind als die zu messende Zielsubstanz in der Probe; jedoch sind beide von geringer Fluoreszenzintensität und können von den Trägerteilchen unterschieden werden.
  • Ein Bereich wird auf dem Scattergramm bestimmt, um die jeweiligen Trägerteilchen zu umgeben. Ein Beispiel der Teilchengrößenverteilung der Trägerteilchen, die in der festgelegten Region G1 auftreten, wird in dem Histogramm in 2 gezeigt. Die vertikale Achse bezeichnet die Anzahl der Teilchen (Frequenz) und die horizontale Achse bezeichnet die Intensität des vorwärts gestreuten Lichts. Die agglutinierten Teilchen und die einzelnen Teilchen können unterschieden werden durch Setzen eines Grenzwerts für die Intensität des vorwärts gestreuten Lichts.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die ersten und zweiten Trägerteilchen auf Basis der ersten optischen Information unterschieden. Der Fluoreszenzfarbstoff, Färbemittel, lumineszentes Substrat oder dergleichen ist in den ersten und zweiten Trägerteilchen enthalten, und es ist auf der Basis eines solchen, dass die ersten und zweiten Trägerteilchen unterschieden werden, durch geeignetes Auswählen der Art und des Gehalts. Die ersten und zweiten Trägerteilchen können unterschieden werden durch Verwendung der Fluoreszenz, Absorption, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz, biologische Lumineszenz als der ersten optischen Information.
  • Ein Beispiel eines Scattergramms, welches ein Messbeispiel gemäß der vorliegenden Erfindung ist, wird in 3 gezeigt. Zwei Arten von Latexteilchen, enthaltend Fluoreszenzfarbstoff in verschiedenen Konzentrationen, wurden verwendet, was die ersten bzw. zweiten Trägerteilchen ergab. Die ersten und zweiten Trägerteilchen wurden simultan mit einer Probe reagieren gelassen, was eine Probenflüssigkeit ergab, und die Fluoreszenzintensität und die Intensität vorwärts gestreuten Lichts wurden als die optische Information durch ein Durchflusszytometer detektiert. Mit der detektierten optischen Information wurde das Scattergramm in 3 erhalten unter Verwendung der Fluoreszenzintensität als der vertikalen Achse und der vorwärts gestreuten Lichtintensität als der horizontalen Achse.
  • Die ersten Trägerteilchen (31, 32 und 33) und die zweiten Trägerteilchen (34, 35 und 36) zeigen unterschiedliche Niveaus an Fluoreszenzintensität und erschienen an unterschiedlichen Stellen des Scattergramms infolge des Unterschieds an Konzentration des enthaltenen Fluoreszenzfarbstoffs. So ist es möglich, die ersten und zweiten Trägerteilchen in dem Scattergramm zu unterscheiden. Darüber hinaus erscheinen die jeweiligen Trägerteilchen (z.B. nicht-agglutinierte einzelne Teilchen, Doppelteilchen, resultierend aus der Agglutination von zwei Trägerteilchen und Dreifachteilchen, resultierend aus der Agglutination von drei Teilchen) an verschiedenen Positionen als jeweilige Populationen in dem Scattergramm, in Abhängigkeit von dem Unterschied in der Intensität des vorwärts gestreuten Lichts.
  • In der Abbildung erscheinen die einzelnen Teilchen 31 der ersten Trägerteilchen, die agglutinierten Doppelteilchen 32 der ersten Trägerteilchen und die agglutinierten Dreifachteilchen 33 der ersten Trägerteilchen in den jeweiligen getrennten Populationen infolge des Unterschieds an vorwärts gestreuter Lichtintensität. Genauso erscheinen die einzelnen Teilchen 34 der zweiten Trägerteilchen, die agglutinierten Doppelteilchen 35 der zweiten Trägerteilchen und die agglutinierten Dreifachteilchen 36 der zweiten Trägerteilchen auch in jeweils segregierten Populationen infolge des Unterschieds an vorwärts gestreuter Lichtintensität.
  • In diesem Fall werden Bereiche auf dem Scattergramm bestimmt, um die ersten bzw. zweiten Trägerteilchen zu umgeben. Ein Histogramm wird erstellt, welches die Teilchengrößenverteilung der Trägerteilchen darstellt, welche in jeder Region auftreten. 4 zeigt ein Beispiel eines Histogramms, das auf Basis der vorwärts gestreuten Lichtintensität erstellt wurde, welches in dem Bereich G31 der ersten Trägerteilchen auftrat. Die vertikale Achse bezeichnet die Frequenz (Teilchenanzahl), und die horizontale Achse bezeichnet die vorwärts gestreute Lichtintensität. Die agglutinierten Teilchen und einzelnen Teilchen können unterschieden werden durch Setzen eines Grenzwerts für die vorwärts gestreute Lichtintensität.
  • Die folgenden Beispiele illustrieren Merkmale gemäß der vorliegenden Erfindung und sind einzig zur Illustration zur Verfügung gestellt. Sie sind nicht dazu gedacht, den Umfang der beigefügten Ansprüche oder ihrer Äquivalente zu limitieren.
  • Beispiele
  • Latexteilchen, in welchen eine bestimmte Konzentration von Fluoreszenzfarbstoff, der von Laserlicht erregt werden kann, enthalten ist (im Weiteren als "fluoreszierende Latexteilchen" bezeichnet) wurden als Trägerteilchen verwendet. Die Trägerteilchen werden mit einem Antikörper (oder Antigen) immobilisiert, welcher mit einem Antigen (oder Antikörper) reagiert, welcher die zu detektierende Zielsubstanz darstellt, um eines fluoreszierendes Latexreagens zu ergeben. Eine Probe, enthaltend ein Antigen (oder Antikörper), welches die zu messende Zielsubstanz ist, das fluoreszierende Latexreagens und ein Reaktionspuffer wurden gemischt, um eine Probenflüssigkeit zu ergeben, und das vorwärts gestreute Licht und die Fluoreszenz der Probenflüssigkeit wurden detektiert. Die zu messende Zielsubstanz in der Probe wurde detektiert durch Erstellen eines zweidimensionalen Scattergramms, in welchem das detektierte vorwärts gestreute Lichtsignal und Fluoreszenzsignal Parameter darstellten, und analysiert.
  • 1. Vorrichtung
  • Ein kommerziell erhältliches Flusszytometer, FACSCalibur (von Becton Dickinson) und eine automatische Immunassayvorrichtung, hergestellt von den vorliegenden Erfindern, wurde in den Beispielen hierin verwendet. Bei der Verwendung von FACSCalibur ist es nötig, die Probenflüssigkeit durch Mischen und Inkubieren der Probe und des Reagens zuvor manuell herzustellen. Wenn die hergestellte Probenflüssigkeit verwendet wird und eine Messoperation durchgeführt wird, detektiert die Vorrichtung das vorwärts gestreute Licht und Fluoreszenz und führt die Erzeugung des zweidimensionalen Scattergramms durch. Auf der anderen Seite funktioniert die automatische Immunassayvorrichtung, die von den vorliegenden Erfindern hergestellt wird, um die Probenflüssigkeit automatisch herzustellen und automatisch Handlungen durchzuführen, die von der Herstellung der Probenflüssigkeit und der Detektion des vorwärts gestreuten Lichts und Fluoreszenz bis zur Erzeugung und Analyse eines zweidimensionalen Scattergramms und der Analyse reichen.
  • Die automatische Immunassayvorrichtung, hergestellt durch die vorliegenden Erfinder, wird beschrieben. Diese Vorrichtung führt gleichzeitig für eine Probe vier Immunassayparameter aus, und das fluoreszierende Latexreagens, das in der Vorrichtung verwendet wird, umfasst vier Arten von fluoreszierenden Latexpartikeln in Abhängigkeit des Messparameters. Die vier Arten von fluoreszierenden Latexpartikeln enthalten den Fluoreszenzfarbstoff bei unterschiedlichen Konzentrationen zueinander in Abhängigkeit von der Art und sind mit Antikörpern (oder Antigenen) immobilisiert, die mit den Messparametern reagieren, in Abhängigkeit von der Art. Details dieses fluoreszierten Latexreagens werden unten beschrieben.
  • 5 zeigt die Oberflächenerscheinung einer automatischen Immunassayvorrichtung 100. Eine vordere Oberfläche umfasst einen Flüssigkristall-Touchscreen 101 zum Eingeben verschiedener Einstellungen und zum Anzeigen von ausgegebenen Messergebnissen, einem Deckel 102, welcher eine Probenvorbereitungseinheit 200, die unten beschrieben wird, bedeckt und einen Startschalter 103.
  • 6 zeigt die innere Konfiguration der automatischen Immunassayvorrichtung 100. Ein Kontrollteil 400, welcher die Operation der Vorrichtung und das Prozessieren bei der Analyse durchführt, ist in einem Bereich an der rechten Seite der Vorrichtung enthalten. Eine Lichtdetektionseinheit 300 zum Detektieren von Signalen aus der Probenflüssigkeit ist in einem linken unteren Bereich der Vorrichtung enthalten. Zusätzlich enthält der verbleibende Bereich die Probenvorbereitungseinheit 200 zum Vorbereiten der Probenflüssigkeit.
  • Die jeweiligen Teile der Probenvorrichtungseinheit 200, der Lichtdetektionseinheit 300 und der Kontrolleinheit 400 werden unten beschrieben.
  • Konfiguration der Probenvorbereitungseinheit 200
  • 7 ist eine Darstellung, die die Probenvorbereitungseinheit 200 zeigt. Sie umfasst eine Probeneinsetzeinheit 221 an der vorderen rechten Seite, eine Reagenseinsetzeinheit 222 an der vorderen linken Seite und einen Inkubator 223 an der Hinterseite. Zusätzlich enthält es eine Verteilungsvorrichtung 224, welche sowohl auf und ab als auch von Seite zu Seite beweglich ist. Sie ist so konfiguriert, dass durch Öffnen des Deckels 102 in 6 die Probenvorbereitungseinheit 200, die in 7 gezeigt wird, erscheint, und ein Benutzer verschiedene Gefäße, wie unten beschrieben, einsetzt. Sie ist so konfiguriert, dass ein Probengefäß 225, in welchem die Probe platziert ist, in die Probeneinsetzeinheit 221 eingesetzt wird, und ein Reaktionsgefäß 226 bei dem Inkubator 223 eingesetzt wird. Zusätzlich ist sie so konfiguriert, dass ein Reagensgefäß 227, in welchem das fluoreszierende Latexreagens platziert ist, und ein Reagensgefäß 231, in welchem der Reaktionspuffer platziert ist, in die Reagenseinsetzeinheit 222 eingesetzt werden. Der Inkubator 223 ist so konfiguriert, dass eine Flüssigkeit in dem eingesetzten Reagensgefäß 226 geschüttelt wird und gerührt wird, während sie bei einer vorgeschriebenen Temperatur gehalten wird. Die Verteilungsvorrichtung 224 saugt eine vorgeschriebene Menge Flüssigkeit auf und stößt diese an ihrem vorderen Ende wieder aus, und ist so konfiguriert, dass sie sowohl auf und ab als auch von Seite zu Seite bewegbar ist durch eine Bewegungseinheit, die nicht in der Abbildung gezeigt wird. Das Probengefäß 233 ist verbunden mit einer Durchflusszelle 301 der Lichtdetektionseinheit 300, die unten beschrieben wird.
  • Konfiguration der Lichtdetektionseinheit 300
  • 8 ist eine Darstellung, die die Konfiguration der Lichtdetektionseinheit 300 zeigt. Die Lichtdetektionseinheit 300 hat eine Durchflusszelle 301 zum Fließen der Probenflüssigkeit. Die Durchflusszelle 301 hat einen Öffnungsteil 302, welcher ein Teil ist, auf den Laserlicht gestrahlt wird, und einen inneren Flussweg, welcher dünn verengt ist, eine Düse 303, welche einen Strahl der Probenflüssigkeit aufwärts zu dem Öffnungsteil ausstößt, eine Versorgungsöffnung 304 einer Hüllflüssigkeit, und der Abfallflüssigkeitsöffnung 305. Zusätzlich hat die Lichtdetektionseinheit 300 eine Laserlichtquelle 306 zum Bestrahlen von Laserlicht (es ist eine rote Halbleiterlaserlichtquelle, welche Laserlicht bei einer Wellenlänge von 635 nm ausstrahlt), eine Kondensierlinse 307, welche das Laserlicht, das von der Laserlichtquelle zu der Umhüllungsdurchflusszelle ausgestrahlt wird, kondensiert, eine Fotodiode 308, welche das vorwärts gestreute Licht von den Teilchen auffängt und es in elektrische Signale umwandelt, eine Sammellinse 309 und ein Nadelloch 310, um das vorwärts gestreute Licht auf die Fotodiode zu kondensieren, eine Fotoverstärkerröhre 311, welche die Fluoreszenz empfängt und sie in elektrische Signale umwandelt, eine Sammellinse 312, einen Filter 313, ein Nadelloch 314, um die Fluoreszenz zu kondensieren, auf die Fotoverstärkerröhre und Verstärker 315 und 316, welche die elektrischen Signale, die von der Fotodiode 308 und der Fotoverstärkerröhre 311 verstärken und an die Kontrolleinheit 400 ausgeben.
  • Konfiguration der Kontrolleinheit 400
  • 9 ist ein Blockdiagramm, das die Konfiguration der Kontrolleinheit 400 zeigt und das Verhältnis der Kontrolleinheit 400 zu den jeweiligen Teilen der Vorrichtung. Die Kontrolleinheit 400 hat einen Mikrocomputer mit einer zentralen Prozessiereinheit (CPU) und Speichervorrichtungen, wie ROM- und RAM-Schaltkreise, welche Signale verarbeiten, die von der Lichtdetektionseinheit 300 gesendet werden, etc. Die Kontrolleinheit 400 führt Funktionen aus, wie eine Speichereinheit 441, eine Analyseeinheit 442 und eine Operationskontrolleinheit 443. Die Speichereinheit 441 speichert Analyseprogramme für die Analyse von Signalen, erhalten von den Teilchen in der Probe und Kontrollprogramme, um die jeweiligen Teile der Vorrichtung zu kontrollieren. Zusätzlich speichert sie Signaldaten, detektiert an der Lichtdetektionseinheit 300, und Resultate, die durch die Analyseprogramme prozessiert wurden. Die Analyseeinheit 442 prozessiert die Signale, die von der Lichtdetektionseinheit 300 durch Messen der Probenflüssigkeit detektiert wurden und analysiert die Signale nach dem Prozessieren. Die analysierten Ergebnisse der Analyseeinheit 442 werden ausgegeben auf dem Flüssigkristall-Touchscreen 101. Die Operationskontrolleinheit 443 kontrolliert die Operationen der verschiedenen Teile der Vorrichtung auf Basis der Kontrollprogramme, die in der Speichereinheit 441 gespeichert sind.
  • Funktionen der Vorrichtungen
  • 10 ist ein Flussdiagramm, das die Gesamtkontrolle der automatischen Immunassayvorrichtung 100 durch die Kontrollprogramme zeigt. Wenn der Benutzer den Startschalter 103 drückt, werden die Kontrollprogramme gestartet, und S1 (Kontrolle der Probenvorbereitungseinheit), S2 (Kontrolle der Lichtdetektionseinheit) und S3 (Kontrolle der Analyseeinheit) werden sequenziell durchgeführt. Dies kontrolliert die Probenvorbereitungseinheit 200, die Lichtdetektionseinheit 300 und die Analyseeinheit 442, und eine Serie von Funktionen der automatischen Immunassayvorrichtung 100 wird automatisch durchgeführt. Die Funktion von jedem Teil der Vorrichtung durch S1, S2 und S3 wird nachstehend beschrieben.
  • S1 (Kontrolle der Probenvorbereitungseinheit)
  • Die Funktion der Probenvorbereitungseinheit 200 durch Kontrolle der Probenvorbereitungseinheit wird beschrieben unter Verwendung von 7. Zunächst saugt die Verteilungsvorrichtung 224 80 μl eines Reaktionspuffers aus dem Probengefäß 231 bei dem Probeneinsetzteil 222, und saugt als Nächstes 10 μl einer Probe aus dem Probengefäß 225, eingesetzt an dem Probeneinsetzteil 221. Der Reaktionspuffer und die aufgesaugte Probe werden in das Reaktionsgefäß 226 ausgestoßen, das bei dem Inkubator 223 eingesetzt ist. Als Nächstes saugt die Verteilungsvorrichtung 224 10 μl eines fluoreszierenden Latexreagens aus dem Reagensgefäß 227 bei dem Reagenseinsetzteil 222, und stößt es in das Reaktionsgefäß 226 aus. Anschließend inkubiert der Inkubator 223 das Reaktionsgefäß 226, in welchem die Probe, das fluoreszierende Latexreagens und der Reaktionspuffer platziert sind, durch Schütteln/Rühren für 15 Minuten, während die Temperatur bei 45°C gehalten wird, um eine Probenflüssigkeit vorzubereiten. Die Verteilungsvorrichtung 224 saugt die Probenflüssigkeit nach der Inkubation auf und stößt sie in das Probengefäß 233 aus. Eine Verdünnungsflüssigkeit wird zuvor ihn das Probengefäß 233 platziert, und die ausgestoßene Probenflüssigkeit wird 51-fach verdünnt. Die Probenflüssigkeit, verdünnt in dem Probengefäß 233, fließt zu der Durchflusszelle 301 des Lichtdetektionsteils 300.
  • S2 (Kontrolle der Lichtdetektionseinheit)
  • Das Funktionieren der Lichtdetektionseinheit 300 durch Kontrolle der Lichtdetektionseinheit wird in 8 dargestellt. Wie oben beschrieben, wird, wenn die Probenflüssigkeit in das Probengefäß 233 gebracht wird, die Probenflüssigkeit zu der Düse 303 geführt durch das Wirken von Pumpen und Ventilen, die nicht in der Abbildung gezeigt werden. Die Probenflüssigkeit wird aus der Düse 303 in die Durchflusszelle 301 ausgestoßen. Gleichzeitig wird eine Hüllflüssigkeit aus dem Hüllflüssigkeitsgefäß, das nicht in der Abbildung gezeigt ist, der Durchflusszelle 301 über den Hüllflüssigkeitszugang 304 zur Verfügung gestellt. In dieser Weise ist Probenflüssigkeit mit der Hüllflüssigkeit in der Durchflusszelle 301 enthalten und fließt durch das dünn verengte Öffnungsteil 302. Das Verengen eines Flusses der Probenflüssigkeit zu einer Größe die ungefähr dem Teilchendurchmesser entspricht, kann die Teilchen, die in der Probenflüssigkeit enthalten sind, in einer Reihe durch den Öffnungsteil 302 fließen. Das von der Laserlichtquelle 306 ausgestrahlte und an der Kondensierlinse 307 verengte Laserlicht wird auf die Probenflüssigkeit, welche in dem Öffnungsteil 302 fließt, gestrahlt. Das vorwärts gestreute Licht, ausgestrahlt von den Teilchen in der Probenflüssigkeit, die von dem Laserlicht getroffen wurden, wird durch die Sammellinse 309 gesammelt. Das vorwärts gestreute Licht, welches durch das Nadelloch 310 hindurch getreten ist, wird von der Fotodiode 308 aufgefangen und fotoelektrisch umgewandelt, um ein vorwärts gestreutes Lichtsignal zu werden. Die Fluoreszenz, ausgestrahlt von den Teilchen in der Probenflüssigkeit, die mit dem Laserlicht bestrahlt wurden, wird durch die Kontaktlinse 312 gesammelt. Die Fluoreszenz, welche durch den Filter 313 und durch das Nadelloch 314 hindurchgetreten ist, wird aufgefangen von der Fotoverstärkerröhre 311, und fotoelektrisch in ein Fluoreszenzsignal umgewandelt. Das vorwärts gestreute Lichtsignal und das Fluoreszenzsignal werden verstärkt von den Verstärkern 315 bzw. 316, anschließend zu der Kontrolleinheit 400 gesandt und in der Speichereinheit 441 gespeichert als Daten für jedes Teilchen.
  • S3 (Kontrolle des Analyseteils)
  • Details der Kontrolle des Analyseteils werden illustriert in dem Flussdiagramm der 11. Die jeweiligen Schritte in dem Flussdiagramm sind wie folgt.
  • S11: Die Daten des vorwärts gestreuten Lichtsignals und des Fluoreszenzsignals werden aus der Speichereinheit gelesen.
  • S12: Eine vorwärts gestreute Lichtintensität (Fsc) und eine Fluoreszenzintensität (FL) werden für jedes Teilchen berechnet auf der Basis der Spitzenniveaus des vorwärts gestreuten Lichtsignals bzw. des Fluoreszenzsignals.
  • S13: Ein zweidimensionales Scattergramm wird hergestellt unter Verwendung von Fsc und FL für jedes Teilchen, berechnet an S12, als Parameter. Bereiche, in welchen das Auftreten von vier Arten von fluoreszierenden Latexteilchen, welche auf die Messparameter reagieren, vorhergesagt ist, sind in diesem Scattergramm vorherbestimmt worden.
  • S14: Ein Histogramm von Teilchen, welche in den jeweiligen in dem zweidimensionalen Scattergramm vorherbestimmten Regionen aufgetreten sind, wird hergestellt, um die Teilchengrößenverteilung zu erhalten.
  • S15: Die Anzahl von einzelnen Teilchen (M) und agglutinierten Teilchen (P) in den jeweiligen Regionen, und die Summe derselben (T) werden erhalten, und die Agglutinationsrate (P/T) der Teilchen, welche in jeder Region aufgetreten sind, wird berechnet.
  • S16: Das zweidimensionale Scattergramm, das oben hergestellte Histogramm der entsprechenden Regionen, die Agglutinationsrate und das oben berechnete P/T werden ausgegeben und angezeigt auf dem Flüssigkristall-Touchscreen 101.
  • 12 ist eine Abbildung, die einen Bildschirm zeigt, umfassend die Scattergramme, hergestellt in S13, die Histogramme, hergestellt in S14, und die Agglutinationsraten (P/T), berechnet in S15, ausgegeben auf dem Flüssigkristall-Touchscreen in S16. Auf diesem Bildschirm sind die zweidimensionalen Scattergramme Sc1 und Sc2 angezeigt in der oberen und unteren Hälfte. Diese korrespondieren dazu, wo die Messergebnisse, erhalten von derselben Probe, ausgegeben werden, durch Verändern der Ausgabemuster. Für beide bezeichnet die horizontale Achse Fsc und die vertikale Achse bezeichnet Fl. Da jedoch die Werte (Fl) auf der vertikalen Achse, in dem in der unteren Hälfte gezeigten Scattergramm log-transformiert sind, sind die Anteile der niedrigen Werte von FL relativ vergrößert und ausgegeben, im Vergleich zu höheren Wertanteilen. So werden unter vier Arten von fluoreszierenden Latexteilchen, enthalten in dem fluoreszierenden Latexreagens, für zwei Arten der fluoreszierenden Latexteilchen, in denen die Konzentration des enthaltenen Fluoreszenzfarbstoffs höher ist, die Bereiche, in denen die Teilchen auftreten, eingestellt und angezeigt in dem zweidimensionalen Scattergramm, so dass Sc1 angezeigt wird an der oberen Hälfte (Region 1, Region 2). Zusätzlich wird für zwei Arten von fluoreszierenden Latexteilchen, in denen die Konzentration des enthaltenen Fluoreszenzfarbstoffs niedriger ist, die Regionen, in welchen die Teilchen auftreten, bestimmt und angezeigt in dem zweidimensionalen Scattergramm, so dass Sc2 angezeigt wird an der unteren Hälfte (Region 3, Region 4). Region 1 ist eine Region, in der die fluoreszierenden Latexteilchen, in welchen die Konzentrationen des Fluoreszenzfarbstoffs unter den vier Arten am höchsten sind, auftreten. Region 2 ist eine Region, in denen die fluoreszierenden Latexteilchen, in welchen die Konzentrationen des Fluoreszenzfarbstoffs unter den vier Arten am zweithöchsten sind, auftreten. Region 3 ist eine Region, in der die fluoreszierenden Latexteilchen, in welchen die Konzentrationen des Fluoreszenzfarbstoffs unter den vier Arten am dritthöchsten sind, auftreten. Region 4 ist eine Region, in welcher die fluoreszierenden Latexteilchen, in welchen die Konzentrationen des Fluoreszenzfarbstoffs unter den vier Arten am niedrigsten sind, auftreten. Zusätzlich werden die Histogramme 1 bis 4 und die Agglutinationsraten, die zu den Regionen 1 bis 4 korrespondieren, auf dem Bildschirm angezeigt.
  • 2. Herstellung der Reagenzien
  • Die Reagenzien, die verwendet werden für die Immunassays in FACSCalibur und der automatischen Immunassayvorrichtung umfassend das fluoreszierende Latexreagens, Reaktionspuffer und Verdünnungsflüssigkeit, wurden nachstehend beschrieben.
  • Fluoreszierendes Latexreagens
  • Ein fluoreszierendes Latexteilchen, welches ein Latexteilchen ergibt, in welchem der Teilchendurchmesser 0,78 μm ist und die Oberfläche Sulfat ist, enthaltend einen roten Fluoreszenzfarbstoff (erregbar mit Laserlicht bei einer Wellenlänge von 640 nm) in einer vorgeschriebenen Konzentration wurde als Trägerteilchen verwendet. Das Trägerteilchen ist immobilisiert mit einem Antikörper (oder Antigen), welches reagiert auf ein Antigen (oder einen Antikörper), welches eine zu messende Zielsubstanz ist. Ein Anti-HBs-Antikörper, TP-Antigen, Anti-CEA-Antikörper, Anti-AFP-Antikörper, HCV-Antigen, HIV-Antigen, Anti-FRN-Antikörper, Anti-PSA-Antikörper oder dergleichen wird jeweils immobilisiert durch hydrophobische Bindungen an die unterschiedlichen fluoreszierenden Latexteilchen. Sie werden allein oder in Kombination verwendet durch Mischen in einer Flüssigkeit, um verschiedene Latexreagenzien zuzubereiten. Die Zubereitung von jedem Latexreagens wird wie in (1)–(8) unten beschrieben durchgeführt.
  • (1) Zubereitung des fluoreszierenden Latexreagens für die Detektion von HBs-Antigen
  • Das fluoreszierende Latexreagens zum Detektieren des HBs-Antigens wurde hergestellt durch Immobilisieren des Anti-HBs-Antikörpers auf die fluoreszierenden Latexteilchen mit einer Fluoreszenzfarbstoffkonzentration von 1% (G/V). Zunächst wurden 50 μl einer 10%igen fluoreszierenden Latexteilchensuspension (G/V) hinzugefügt zu 950 μl eines GTA-Puffers (0,53 mg/ml 3,3-Dimethylglutarsäure, 0,4 mg/ml Tris, 0,35 mg/ml 2-Amino-2-methyl-l,3-propandiol, pH 4,6), enthaltend 60 μg Anti-Hbs-Antikörper (mausmonoklonaler Antikörper, kommerziell erhältliches Produkt), und bei 20°C für 2 Stunden gehalten. Diese wurde zentrifugiert bei 10.000 xg für 10 Minuten, der Überstand wurde verworfen, 1 ml GTA Puffer, enthaltend 1% (G/V) Rinderserumalbumin (kommerziell erhältliches Produkt) wurde zu dem Pellet hinzugefügt, und zum Dispergieren mit Ultraschall behandelt. Die Schritte des Zentrifugierens bis Dispergierens wurden mehrere Male wiederholt. Schließlich wurde nach dem Zentrifugieren und Verwerfen des Überstands 1 ml GTA-Puffer (pH 6,2), enthaltend 220 mg/ml Glycerin und 0,3% (G/V) Rinderserumalbumin zu dem Pellet hinzugefügt, und zum Dispergieren mit Ultraschall behandelt. Dies ergab das fluoreszierende Latexreagens zur Detektion des HBs-Antigens.
  • (2) Herstellung des fluoreszierenden Latexreagens für die Detektion von Anti-TP-Antikörper
  • Das fluoreszierende Latexreagens zum Detektieren des Anti-TP-Antikörpers wurde hergestellt durch Immobilisieren des TP-Antigens auf den fluoreszierenden Latexteilchen mit einer Fluoreszenzfarbstoffkonzentration von 0,1% (G/V). Zunächst wurden 50 μl einer 10%igen fluoreszierenden Latexteilchensuspension (G/V) zu 950 μl 10 mM PBS (pH 4,0), enthaltend 50 μg TP-Antigen (kommerziell erhältliches Produkt) hinzugefügt, und bei 4°C 24 Stunden gehalten. Diese wurde zentrifugiert bei 10000 xg für 10 Minuten, der Überstand wurde verworfen, 1 ml 0,1 M PBS-Puffer (pH 7,0), enthaltend 1 mg/ml Rinderserumalbumin, wurde zu dem Pellet hinzugefügt, und zum Dispergieren mit Ultraschall behandelt. Die Schritte des Zentrifugierens bis Dispergierens wurden mehrere Male wiederholt. Schließlich wurde nach dem Zentrifugieren und Verwerfen des Überstand 1 ml PBS-Puffer (pH 7,0), enthaltend 1 mg/ml Rinderserumalbumin, hinzugefügt, und zum Dispergieren mit Ultraschall behandelt. Dies ergab das fluoreszierende Latexreagens zum Detektieren des Anti-TP-Antikörpers.
  • (3) Herstellung des fluoreszierenden Latexreagens für die Detektion von AFP-Antigen
  • Das fluoreszierende Latexreagens zur Detektion des AFP-Antigens wurde hergestellt durch Immobilisieren des Anti-AFP-Antikörpers auf die fluoreszierenden Latexteilchen mit einer Fluoreszenzfarbstoffkonzentration von 0,01% (G/V). Zunächst wurden 50 μl einer 10%igen fluoreszierenden Latexteilchensuspension (G/V) zu 950 μl eines GTA-Puffer (0,53 mg/ml 3,3-Dimethylglutarsäure, 0,4 mg/ml Tris, 0,35 mg/ml 2-Amino-2-methyl-l,3-propandiol, pH 4,6), enthaltend 60 μg Anti-CEA-Antikörper (polyklonaler Ziegenantikörper, kommerziell erhältliches Produkt), hinzugefügt und bei 20°C für 2 Stunden gehalten. Diese wurde bei 10000 xg für 10 Minuten zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen, 1 ml GTA-Puffer, enthaltend 1% (G/V) Rinderserumalbumin (kommerziell erhältliches Produkt), wurde zu dem Pellet hinzugefügt, und zum Dispergieren mit Ultraschall behandelt. Die Schritte des Zentrifugierens bis Dispergierens wurden mehrere Male wiederholt. Schließlich wurde nach dem Zentrifugieren und Verwerfen des Überstands 1 ml GTA-Puffer (pH 6,2), enthaltend 220 mg/ml Glycerin und 0,3% (G/V) Rinderserumalbumin, zu dem Pellet hinzugefügt, und zum Dispergieren mit Ultraschall behandelt. Dies ergab das fluoreszierende Latexreagens zum Detektieren des AFP-Antigens.
  • (4) Herstellung des fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des CEA-Antigens
  • Das fluoreszierende Latexreagens zum Detektieren des CEA-Antigens wurde hergestellt durch Immobilisieren des Anti-CEA-Antikörpers auf fluoreszierende Latexteilchen mit einer Fluoreszenzfarbstoffkonzentration von 0,001% (G/V). Zunächst wurden 50 μl einer 10%igen fluoreszierenden Latexteilchensuspension (G/V) zu 950 μl eines GTA-Puffer (0,53 mg/ml 3,3-Dimethylglutarsäure, 0,4 mg/ml Tris, 0,35 mg/ml 2-Amino-2-methyl-l,3-propandiol, pH 4,6), enthaltend 60 μg Anti-CEA-Antikörper (polyklonaler Hasenantikörper, kommerziell erhältliches Produkt), hinzugefügt und bei 20°C für 2 Stunden gehalten. Diese wurde bei 10000 xg für 10 Minuten zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen, 1 ml GTA-Puffer, enthaltend 1% (G/V) Rinderserumalbumin (kommerziell erhältliches Produkt), wurde zu dem Pellet hinzugefügt, und zum Dispergieren mit Ultraschall behandelt. Die Schritte des Zentrifugierens bis Dispergierens wurden mehrere Male wiederholt. Schließlich wurde nach dem Zentrifugieren und Verwerfen des Überstands 1 ml GTA-Puffer (pH 6,2), enthaltend 220 mg/ml Glycerin und 0,3% (G/V) Rinderserumalbumin, zu dem Pellet hinzugefügt, und zum Dispergieren mit Ultraschall behandelt. Dies ergab das fluoreszierende Latexreagens zum Detektieren des CEA-Antigens.
  • (5) Herstellung des Reagens für die simultane Messung von vier Parametern von Infektionsmarkern
  • Die fluoreszierenden Latexteilchen zum Detektieren des HBs-Antigens, die fluoreszierenden Latexteilchen zum Detektieren des Anti-TP-Antikörpers, die fluoreszierenden Latexteilchen zum Detektieren des Anti-HCV-Antikörpers und die fluoreszierenden Latexteilchen zum Detektieren des Anti-HIV-Antikörpers wurden hergestellt, und in einer Flüssigkeit gemischt, um das fluoreszierende Latexreagens zur gleichzeitigen Detektion des HBs-Antigens, Anti-TP-Antikörpers, Anti-HCV-Antikörpers und Anti-HIV-Antikörpers herzustellen.
  • Als das fluoreszierende Latexreagens zur Detektion des HBs-Antigens und des fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des Anti-TP-Antikörpers wurden jene hergestellt in (1) und (2), oben, verwendet.
  • Die fluoreszierenden Latexteilchen zur Detektion des Anti-HCV-Antikörpers wurden hergestellt durch Immobilisieren des HCV-Antigens auf fluoreszierende Latexteilchen mit einer Fluoreszenzfarbstoffkonzentration von 3% (G/V). Zunächst wurden 50 μl einer 10%igen Fluoreszenzlatexteilchensuspension (G/V) hinzugefügt zu 950 μl 10 mM Glycinpuffer (pH 2,0), enthaltend 8 Arten von Komplexantigenen, d.h. zwei Arten von rekombinanten Antigenen, korrespondierend zu viralem Protein, abgeleitet aus NS3 der HCV-nicht-strukturellen Region, zwei synthetische Peptidantigene, korrespondierend zu viralem Protein, abgeleitet von der NS4-Inklusion, und eine Art synthetisches Peptidantigen, korrespondierend zu dem viralen Protein, abgeleitet von NS5, sowie 3 Arten synthetischer Peptidantigene, korrespondierend zu viralen Proteinen, abgeleitet aus dem Kern der strukturellen Region, und wurde bei 37°C für 1 Stunde gehalten. Dies wurde bei 10000 xg für 10 Minuten zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen, 1 ml eines 1,2%igen (G/V) Tris-Puffers (pH 8,0), enthaltend 2 Rinderserumalbumin (kommerziell erhältliches Produkt), wurde zu dem Pellet hinzugefügt, und zum Dispergieren mit Ultraschall behandelt, und bei 45°C für 2 Stunden inkubiert, um das Blockieren durchzuführen. Die Schritte des Zentrifugierens bis Dispergierens wurden mehrere Male wiederholt. Schließlich wurde nach dem Zentrifugieren und Verwerfen des Überstands 1 ml 1,2%iger (G/V) Tris-Puffer (pH 8,0), enthaltend 220 mg/ml Glycerin und 0,3% (G/V) Rinderserumalbumin, zu dem Pellet hinzugefügt, und mit Ultraschall behandelt zum Dispergieren der fluoreszierenden Latexteilchen zum Detektieren von Anti-HCV-Antikörper in einer Flüssigkeit.
  • Die fluoreszierenden Latexteilchen zum Detektieren des Anti-HIV-Antikörpers wurden hergestellt durch Immobilisieren des HIV-Antigens auf fluoreszierende Latexteilchen mit einer Fluoreszenzfarbstoffkonzentration von 5% (G/V). Zunächst wurden 50 μl einer l0%igen fluoreszierenden Latexteilchensuspension (G/V) zu 950 μl 10 mM Glycinpuffer (pH 2,0) hinzugefügt, enthaltend HIV-1 gag (gruppenspezifisches Antigen)-Regionantigen, HIV-1 env (Envelop)-Regionantigen, HIV-1 pol (Polymerase)-Regionantigen und HIV-2 env-Antigen, und wurde bei 37°C für 1 Stunde gehalten. Dieses wurde bei 10000 xg für 10 Minuten zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen, 1 ml 1,2 (G/V) Tris-Puffer (pH 8,0), enthaltend 2% Rinderserumalbumin (kommerziell erhältliches Produkt), wurde zu dem Pellet hinzugefügt, und zum Dispergieren mit Ultraschall behandelt, und bei 45°C für 2 Stunden inkubiert, um das Blocken durchzuführen. Die Schritte des Zentrifugierens bis Dispergierens wurden mehrere Male wiederholt. Schließlich wurde nach dem Zentrifugieren und Verwerfen des Überstand 1 ml 1,2% (G/V) Tris-Puffer (pH 8,0), enthaltend 220 mg/ml Glycerin und 0,3% (G/V) Rinderserumalbumin, zu dem Pellet hinzugefügt mit Ultraschall behandelt und zum Dispergieren der fluoreszierenden Latexteilchen zum Detektieren der Anti-HIV-Antikörper in einer Flüssigkeit.
  • Gleiche Mengen der obigen Flüssigkeit, in welcher das fluoreszierende Latexreagens zum Detektieren der Anti-HCV-Antikörper dispergiert waren, der obigen Flüssigkeit, in welcher die fluoreszierenden Latexteilchen zum Detektieren des Anti-HIV-Antikörpers dispergiert waren, des obigen fluoreszierenden Latexreagens zum Detektieren des HBs- Antigens, und des obigen fluoreszierenden Latexreagens zum Detektieren der Anti-TP-Antikörper wurden gemischt, um das fluoreszierende Latexreagens für die gleichzeitige Bestimmung der vier Parameter für Infektionsmarker zu ergeben.
  • (6) Herstellung des Reagens für die gleichzeitige Messung von vier Parametern von Tumormarkern
  • Das fluoreszierende Latexreagens für die gleichzeitige Detektion des FRN-Antigens, CEA-Antigens, AFP-Antigens und PSA-Antigens wurden hergestellt durch Herstellen der fluoreszierenden Latexteilchen zum Detektieren des FRN-Antigens, der fluoreszierenden Latexteilchen zum Detektieren des CEA-Antigens, der fluoreszierenden Latexteilchen zum Detektieren des AFP-Antigens und der fluoreszierenden Latexteilchen zum Detektieren des PSA-Antigens, und Mischen derselben in einer Flüssigkeit.
  • Die fluoreszierenden Latexteilchen zum Detektieren des FRN-Antigens wurden hergestellt durch Immobilisieren der Anti-FRN-Antikörper auf fluoreszierende Latexteilchen mit einer Fluoreszenzfarbstoffkonzentration von 0,1% (G/V). Zunächst wurden 50 μl einer 10%igen fluoreszierenden Latexteilchensuspension (G/V) zu 950 μl eines GTA-Puffer (0,53 mg/ml 3,3-Dimethylglutarsäure, 0,4 mg/ml Tris, 0,35 mg/ml 2-Amino-2-methyl-l,3-propandiol, pH 4,6), enthaltend 50 μg Anti-FRN-Antikörper (polyklonaler Ziegenantikörper, kommerziell erhältliches Produkt), hinzugefügt und bei 20°C für 2 Stunden gehalten. Diese wurde bei 10000 xg für 10 Minuten zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen, 1 ml GTA-Puffer, enthaltend 1% (G/V) Rinderserumalbumin (kommerziell erhältliches Produkt), wurde zu dem Pellet hinzugefügt, und zum Dispergieren mit Ultraschall behandelt. Die Schritte des Zentrifugierens bis Dispergierens wurden mehrere Male wiederholt. Schließlich wurde nach dem Zentrifugieren und Verwerfen des Überstands 1 ml GTA-Puffer (pH 6,2), enthaltend 220 mg/ml Glycerin und 0,3% (G/V) Rinderserumalbumin, zu dem Pellet hinzugefügt, und zum Dispergieren mit Ultraschall behandelt. Dies ergab das fluoreszierende Latexreagens zum Detektieren des FRN-Antigens in einer Flüssigkeit.
  • Die fluoreszierenden Latexteilchen zum Detektieren des CEA-Antigens wurden hergestellt durch Immobilisieren des Anti-CEA-Antikörpers auf fluoreszierende Latexteilchen mit einer Fluoreszenzfarbstoffkonzentration von 1% (G/V) durch ein ähnliches Verfahren wie jenes, das bei der Herstellung des fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des CEA-Antigens in (4) oben verwendet wurde.
  • Die fluoreszierenden Latexteilchen zur Detektion des AFP-Antigens wurden hergestellt durch Immobilisieren des Anti-AFP-Antikörpers auf fluoreszierende Latexteilchen mit einer Fluoreszenzfarbstoffkonzentration von 3% (G/V) durch ein ähnliches Verfahren wie jenes, das in der Herstellung des fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des AFP-Antigens in (3) oben verwendet wurde.
  • Das fluoreszierende Latexreagens zur Detektion des PSA-Antigens wurde hergestellt durch Immobilisieren des Anti-PSA-Antikörpers auf fluoreszierende Latexteilchen mit einer Fluoreszenzfarbstoffkonzentration von 5% (G/V). Zunächst wurden 50 μl einer 10%igen fluoreszierenden Latexteilchensuspension (G/V) zu 950 μl eines GTA-Puffer (0,53 mg/ml 3,3-Dimethylglutarsäure, 0,4 mg/ml Tris, 0,35 mg/ml 2-Amino-2-methyl-l,3-propandiol, pH 4,6), enthaltend 60 μg Anti-PSA-Antikörper (polyklonaler Hasenantikörper, kommerziell erhältliches Produkt), hinzugefügt und bei 20°C für 2 Stunden gehalten. Diese wurde bei 10000 xg für 10 Minuten zentrifugiert, der Überstand wurde verworfen, 1 ml GTA-Puffer, enthaltend 1% (G/V) Rinderserumalbumin (kommerziell erhältliches Produkt), wurde zu dem Pellet hinzugefügt, und zum Dispergieren mit Ultraschall behandelt. Die Schritte des Zentrifugierens bis Dispergierens wurden mehrere Male wiederholt. Schließlich wurde nach dem Zentrifugieren und Verwerfen des Überstands 1 ml GTA-Puffer (pH 6,2), enthaltend 220 mg/ml Glycerin und 0,3% (G/V) Rinderserumalbumin, zu dem Pellet hinzugefügt, und zum Dispergieren mit Ultraschall behandelt. Dies ergab das fluoreszierende Latexreagens zum Detektieren des PSA-Antigens in einer Flüssigkeit.
  • Gleiche Mengen der Flüssigkeiten, die oben hergestellt wurden, in welchen die fluoreszierenden Latexteilchen zur Detektion des FRN-Antigens, die fluoreszierenden Latexteilchen zur Detektion des CEA-Antigens, die fluoreszierenden Latexteilchen zur Detektion des AFP-Antigens und die fluoreszierenden Latexteilchen zur Detektion des PSA-Antigens dispergiert waren, wurden gemischt, um das fluoreszierende Latexreagens für die gleichzeitige Detektion der vier Tumormarker-Parameter zu ergeben.
  • Reaktionspuffer
  • Der Reaktionspuffer wurde wie folgt hergestellt: 1,6 mg/ml 3,3-Dimethylglutarsäure, 1,1 mg/ml 2-Amino-2-methyl-l,3-propandiol, 18,18 mg/ml Tris, 5% (G/V) Rinderserumalbumin, 0,6% (G/V) Dextran (kommerziell erhältliches Produkt), 15 (G/V) hitzebehandeltes Rinderserumalbumin, 40% (G/V) pepsinbehandeltes Rinderserumalbumin, 0,4% (G/V) PVA (kommerziell erhältliches Produkt), 0,15% (G/V) Natriumchlorid und 0,045% (G/V) Natriumazid, pH 6,0. Der Reaktionspuffer kann zusammen mit dem fluoreszierenden Latexreagens zu der Probe hinzugefügt werden, welche das Messobjekt wird.
  • Verdünnungsflüssigkeit
  • In der automatischen Immunassayvorrichtung 100 wird eine vorgeschriebene Menge Verdünnungsflüssigkeit in dem Probengefäß 233 vor der Messung platziert. Die Probenflüssigkeit, die hergestellt wird durch Mischen und Inkubieren der Probe mit dem fluoreszierenden Latexreagens und dem Reaktionspuffer, wie oben beschrieben, wird auf eine vorgeschriebene Konzentration verdünnt, dadurch dass sie in das Probengefäß 233 gegeben wird. Eine reine Hüllflüssigkeit (Sysmex Corporation) wurde als diese Verdünnungsflüssigkeit verwendet.
  • 3. Einzelparameter-Messung
  • Die Ergebnisse des Assays durch FACSCalibur unter Verwendung des fluoreszierenden Latexreagens, welches einen einzelnen Messparameter unterstützt, werden gezeigt. Die Proben wurden als Messobjekte hergestellt wie folgt.
  • Proben
  • Menschliches normales Vollblut und menschliches normales Vollblut, zu welchem HBs-Antigene bei sechs verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt worden waren, wurden hergestellt, um die Probenserie, enthaltend HBs-Antigen (HBs 1 bis HBs 7) zu ergeben. Die Konzentration von HBs-Antigen in jeder Probe in der Probenserie, enthaltend HBs-Antigen, ist wie folgt:
    HBs 1: 0 U/ml, HBs 2: 1 U/ml, HBs 3: 3 U/ml, HBs 4: 9 U/ml, HBs 5: 27 U/ml, HBs 6: 81 U/ml und HBs 7: 243 U/ml.
  • Zusätzlich wurde normales menschliches Vollblut und normales menschliches Vollblut, zu welchem Anti-TP-Antikörper bei sechs verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt worden waren, hergestellt, um die Probenserie, enthaltend Anti-TP-Antikörper (TP 1 bis TP 7) zu ergeben. Die Konzentration des Anti-TP-Antikörpers in jeder Probe in der Probenserie, enthaltend die Anti-TP-Antikörper, ist wie folgt:
    TP 1: 0 mIU, TP 2: 16,5 mIU, TP 3: 41,2 mIU, TP 4: 103,1 mIU, TP 5: 257,6 mIU, TP 6: 644 mIU und TP 7: 1610 mIU.
  • Zusätzlich wurde normales menschliches Vollblut und normales menschliches Vollblut, zu welchem AFP-Antigene bei sechs verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt worden war, waren hergestellt und die Probenserie, enthaltend das AFP-Antigen (AFP 1 bis AFP 7), ergeben. Die Konzentration des AFP-Antigens in jeder Probe in der Probenserie, enthaltend das AFP-Antigen, ist wie folgt:
    AFP 1: 0 ng/ml, AFP 2: 2 ng/ml, AFP 3: 8 ng/ml, AFP 4: 32 ng/ml, AFP 5: 128 ng/ml, AFP 6: 512 ng/ml und AFP 7: 2048 ng/ml.
  • Zusätzlich wurde normales menschliches Vollblut und normales menschliches Vollblut, zu welchem CEA-Antigene bei sechs verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt wurden, hergestellt, um die Probenserie, enthaltend das CEA-Antigen (CEA 1 bis CEA 7), zu ergeben. Die Konzentration des CEA-Antigens jeder Probe in der Probenserie, enthaltend das CEA-Antigen, ist wie folgt:
    CEA 1: 0 ng/ml, CEA 2: 0,5 ng/ml, CEA 3: 2 ng/ml, CEA 4: 8 ng/ml, CEA 5: 32 ng/ml, CEA 6: 128 ng/ml und CEA 7: 512 ng/ml.
  • Zusätzlich wurde die Probe S1, in welcher vier Arten von Antigenen oder Antikörper (d.h. HBs-Antigen, Anti-TP-Antikörper, AFP-Antigen und CEA-Antigen) hergestellt in menschlichem normalen Vollblut, so dass die Konzentration die gleiche war wie in 4 der obigen Probenserien (d.h. die Probe S1 enthält 9 U/ml HBs-Antigen, 103,1 mIU Anti-TP-Antikörper, 32 ng/ml AFP-Antigen und 8 ng/ml CEA-Antigen). Die Probe S2 wurde hergestellt, so dass die Konzentration dieselbe war wie jene in 7 (d.h. die Probe S2 enthält 243 U/ml HBs-Antigen, 1610 mIU Anti-TP-Antikörper, 2048 ng/ml AFP-Antigen und 512 ng/ml CEA-Antigen).
  • Messung
  • Zu jeder der oben hergestellten 28 Proben (je 40 μl) wurden 10 μl des fluoreszierenden Latexreagens hinzugefügt, welches mit der zu messenden Zielsubstanz, enthaltend in jeder Probenserie, reagiert, und 350 μl des Reagenspuffers. Die resultierende Mischung wurde bei 45°C für 15 Minuten inkubiert und dann mit 10 mM PBS-Puffer 51-fach verdünnt, um insgesamt 28 Proben zur Messung herzustellen. Jede hergestellte Probenflüssigkeit wurde mit FACSCalibur gemessen.
  • FACSCalibur ist ein Durchflusszytometer mit der Funktion, einen Laser mit der Wellenlänge von 635 nm aus der roten Halbleiterlaserlichtquelle zu strahlen und das vorwärts gestreute Lichtsignal und das Seitenfluoreszenzsignal aus der Probe, enthaltend das fluoreszierende Latexreagens, zu detektieren. 13 ist eine schematische Ansicht, die das Detektionssystem von FACSCalibur zeigt. Die Probe, enthaltend die Trägerteilchen 51, wird zu einer Durchflusszelle 52 geführt und bildet den Probenfluss 53. Das von der roten Halbleiterlaserlichtquelle 54 ausgestrahlte Laserlicht bestrahlt den Probenfluss 53 in der Durchflusszelle 52. Die Fluoreszenz und vorwärts gestreutes Licht, welche auf treten, wenn die Trägerteilchen 51 durch den Strahlbereich des Laserlichts hindurchtreten, werden von einer Fotoverstärkerröhre 55 bzw. einer Fotodiode 56 empfangen, und fotoelektrisch transformiert, um elektrische Signale zu werden, welche dann prozessiert und analysiert werden. In dieser Weise werden das Fluoreszenzsignal und vorwärts gestreutes Lichtsignal detektiert und in elektrische Signale umgewandelt.
  • Analyse
  • Ein zweidimensionales Scattergramm wurde hergestellt unter Verwendung des vorwärts gestreuten Lichtsignals und Fluoreszenzsignals, detektiert von jeder Probe als Parameter. 14 ist ein zweidimensionales Scattergramm, erhalten durch Messen der Probe, in welcher das fluoreszierende Latexreagens zum Detektieren des HBs-Antigens zu HBs 4 hinzugefügt wurde, welches eine Probe, enthaltend das HBs-Antigen, ist. Die vertikale Achse zeigt die Fluoreszenzintensität, und die horizontale Achse zeigt die Intensität des vorwärts gestreuten Lichts. Infolge des Unterschieds in der vorwärts gestreuten Lichtintensität treten nicht-agglutinierte einzelne Teilchen, agglutinierte Doppelteilchen und agglutinierte Triplettteilchen in jeweils getrennten Populationen in dem Scattergramm auf. Blutplättchen, die in der Probe enthalten sind, haben kaum Fluoreszenzintensität und daher ist der Ort ihres Auftretens der Ort der zu geringen Werten von Fluoreszenzintensität korrespondiert, welcher beinahe mit der horizontalen Achse überlappt. So wurden sie nicht als eine klare Population auf dem Scattergramm von 14 ausgewiesen. Erythrozyten in der Probe haben kaum Fluoreszenzintensität. Zusätzlich sind die Erythrozyten größer als die agglutinierten Triplettteilchen. Somit sind sie außerhalb des angezeigten Bereichs des Scattergramms in 14.
  • Die Region G6 wurde gesetzt, um die jeweiligen Populationen der Trägerteilchen zu umgeben, welche in dem Scattergramm auftraten, und eine Teilchengrößenverteilung in der Region G6 wurde erhalten. 15 ist ein Histogramm, korrespondierend zur Region G6 in 14. Die vertikale Achse zeigt die Frequenz (Teilchenanzahl) und die horizontale Achse zeigt die Intensität des vorwärts gestreuten Lichts (d.h. Größe der Teilchen). Die Anzahl von einzelnen Teilchen M und agglutinierten Teilchen P und die Summe von diesen T wurde erhalten auf Basis dieses Histogramms, und die Agglutinationsraten P/T der Teilchen, welche in der Region G6 auftraten, wurden berechnet. Genauso wurden Agglutinationsraten erhalten für die jeweiligen Proben, hergestellt unter Verwendung der Proben bei anderen Konzentrationen der Probenserien, enthaltend das HBs-Antigen und für jeweilige Proben, hergestellt unter Verwendung der Proben von anderen Arten der Probenserien.
  • In der folgenden Tabelle 1 werden Agglutinationsraten (P/T) gezeigt für die Teilchen in dem fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des HBs-Antigens, erhalten durch Messen der Proben, hergestellt unter Verwendung der jeweiligen Proben der Probenserien, enthaltend das HBs-Antigen (HBs 1 bis HBs 7).
  • (Tabelle 1)
    Figure 00410001
  • Zusätzlich werden in der folgenden Tabelle 2 die Agglutinationsraten (P/T) gezeigt für Teilchen in dem fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des Anti-TP-Antikörpers, erhalten durch Messung der Proben, hergestellt unter Verwendung der jeweiligen Proben der Probenserie, enthaltend den Anti-TP-Antikörper (TP 1 bis TP 7).
  • (Tabelle 2)
    Figure 00420001
  • Zusätzlich werden in der folgenden Tabelle 3 die Agglutinationsraten (P/T) gezeigt für Teilchen in dem fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des AFP-Antigens, erhalten durch Messung der Proben, hergestellt unter Verwendung der jeweiligen Proben der Probenserie, enthaltend das AFP-Antigen (AFP 1 bis AFP 7).
  • (Tabelle 3)
    Figure 00420002
  • Zusätzlich werden in der folgenden Tabelle 4 die Agglutinationsraten (P/T) gezeigt für Teilchen in dem fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des CEA-Antigens, erhalten durch Messung der Proben, hergestellt unter Verwendung der jeweiligen Proben der Probenserie, enthaltend das CEA-Antigen (CEA 1 bis CEA 7).
  • (Tabelle 4)
    Figure 00430001
  • Wie durch die oben gemessenen Ergebnisse gezeigt, nehmen die Agglutinationsraten der Teilchen des fluoreszierenden Latexreagens für jeden gemessenen Parameter zu in Abhängigkeit der Konzentration des in der Probe enthaltenen Antigens (Antikörpers). Zusätzlich wurden für jeden Messparameter unterschiedliche Agglutinationsraten erhalten zwischen Proben, die Antigen (Antikörper) enthalten und Proben, die Antigen (Antikörper) nicht enthalten. Anhand dieser Ergebnisse kann gesagt werden, dass die Antigen(Antikörper) Konzentration von jedem immunologischen Parameter erhalten werden kann durch Herstellen einer Standardkurve aus den Agglutinationsraten für jeden Messparameter und Umwandeln in eine Konzentration auf Basis der Standardkurve.
  • 4. Simultane Messung multipler Parameter
  • Die FACSCalibur-Messergebnisse unter Verwendung mehrerer Arten von fluoreszierender Latexreagenzien für eine Probe werden gezeigt. Die Proben, welche Messobjekte waren, wurden wie folgt hergestellt.
  • Proben
  • Wie bei der oben beschriebenen Einzelparameter-Messung der Fall war, wurden insgesamt 28 Proben verwendet (d.h. die Proben, enthaltend HBs-Antigen; HBs 1 bis HBs 7, die Proben, enthaltend den Anti-TP-Antikörper, TP 1 bis TP 7, die Proben, enthaltend das AFP-Antigen, AFP 1 bis AFP 7, und die Proben, enthaltend das CEA-Antigen, CEA 1 bis CEA 7). Zusätzlich wurde die Probe S1 hergestellt, in welcher vier Arten von Antigenen oder Antikörpern (d.h. das HBs-Antigen, Anti-TP-Antikörper, AFP-Antigen und CEA-Antigen), in normalem menschlichem Vollblut hergestellt, so dass die Konzentration die gleiche war in 4 der obigen Probenserien (d.h. die Probe S1 enthält 9 U/ml HBs-Antigen, 103,1 mIU Anti-TP-Antikörper, 32 ng/ml AFP-Antigen und 8 ng/ml CEA-Antigen). Die Probe S2 wurde hergestellt, so dass die Konzentration die gleiche war wie in 7 (d.h. die Probe S2 enthält 243 U/ml HBs-Antigen, 1610 mIU Anti-TP-Antikörper, 2048 ng/ml AFP-Antigen und 512 ng/ml CEA-Antigen).
  • Messung
  • Auf 40 μl jeder Proben wurden 10 μl von jedem der fluoreszierenden Latexreagenzien zur Detektion des HBs-Antigens, des fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des Anti-TP-Antikörpers, des fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des AFP-Antigens und des fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des CEA-Antigens (insgesamt 40 μl der fluoreszierenden Latexreagenzien) und 320 μl des Reaktionspuffers inkubiert bei 45°C für 15 Minuten. Die Mischung wurde anschließend mit 10 mM PBS-Puffer verdünnt, um die Probe zur Messung zu ergeben. Wie oben, wurde die Fluoreszenzintensität und die Intensität von vorwärts gestreutem Licht erhalten von der Probe zur Messung, und ein Scattergramm wurde unter Verwendung von FACSCalibur erzeugt.
  • Analyse
  • 16 ist ein zweidimensionales Scattergramm, erhalten durch Messen einer Probe, vorbereitet durch Hinzufügen von vier Arten von fluoreszierenden Latexreagenzien (z.B. das fluoreszierende Latexreagens zur Detektion des HBs-Antigens, des fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des Anti-TP-Antikörpers, das fluoreszierende Latexreagens zur Detektion des AFP-Antigens und des fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des CEA-Antigens) zu HBs 4, welches die Probe war, enthaltend das HBs-Antigen. Die vertikale Achse zeigt Fluoreszenzintensität und die horizontale Achse zeigt vorwärts gestreute Lichtintensität. Infolge des Unterschieds an Fluoreszenzintensität erscheinen die Teilchen in den vier Arten von fluoreszierenden Latexreagienzien (d.h. das fluoreszierende Latexreagens zur Detektion des HBs-Antigens, des fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des Anti-TP-Antikörpers, des fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des AFP-Antigens und das fluoreszierende Latexreagens zur Detektion des CEA-Antigens) in der Richtung der vertikalen Achse segregiert auf. Die Region G81 wird gesetzt, um die Populationen der einzelnen Teilchen, agglutinierten Doppelteilchen und agglutinierten Triplettteilchen des fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des HBs-Antigens zu enthalten, und die Teilchengrößenverteilung der Teilchen in der Region G81 wird erhalten. In ähnlicher Weise wird für das fluoreszierende Latexreagens wie das fluoreszierende Latexreagens zur Detektion des Anti-TP-Antikörpers, des fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des AFP-Antigens und das fluoreszierende Latexreagens zur Detektion des CEA-Antigens, die Regionen G82, G83 bzw. G84 gesetzt, und ein Histogramm der Teilchen in jeder Region wurde erzeugt, um die Teilchengrößenverteilung zu erhalten. Aus diesem Histogramm wurde die Anzahl einzelner Teilchen M und agglutinierter Teilchen P und die Summe dieser T erhalten und die Agglutinationsrate P/T der Teilchen, welche in jeder Region auftraten, wurde berechnet.
  • 17 ist ein zweidimensionales Scattergramm, erhalten durch Messen der Probe, vorbereitet durch Hinzufügen von vier Arten von fluoreszierenden Latexreagenzien zu der Probe S1. Die vertikale Achse zeigt Fluoreszenzintensität, und die horizontale Achse zeigt vorwärts gestreute Lichtintensität. Infolge des Unterschieds der Fluoreszenzintensität erscheinen die Teilchen der vier Arten von fluoreszierenden Latexreagenzien (z.B. des fluoreszierende Latexreagens zur Detektion des HBs-Antigens, des fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des Anti-TP-Antikörpers, des fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des AFP-Antigens und das fluoreszierende Latexreagens zur Detektion des CEA-Antigens) in der Richtung der vertikalen Achse segregiert auf. Zusätzlich sind in jedem fluoreszierenden Latexreagens infolge des Unterschieds der vorwärts gestreuten Lichtintensität die nicht-agglutinierten einzelnen Teilchen, agglutinierten Doppelteilchen und agglutinierten Triplettteilchen segregiert, um Populationen zu ergeben, welche auf dem Scattergramm auftreten. Die Region G91 wird gesetzt, um die Populationen der einzelnen Teilchen, agglutinierten Doppelteilchen und agglutinierten Triplettteilchen in dem fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des HBs-Antigens zu enthalten, und die Teilchengrößenverteilung der Teilchen in der Region G91 wird erhalten. In ähnlicher Weise werden für die jeweiligen fluoreszierenden Latexreagenzien (z.B. des fluoreszierenden Latexreagens für die Detektion des Anti-TP-Antikörpers, des fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des AFP-Antigens und das fluoreszierende Latexreagens zur Detektion des CEA-Antigens), die Regionen G92, G93 bzw. G94 gesetzt, und ein Histogramm der Teilchen in jeder Region wurde erzeugt.
  • 18, 19, 20 und 21 sind Histogramme, korrespondierend zu den Regionen G91, 92, 93 bzw. 94. Die vertikalen Achsen zeigen die Frequenz (Anzahl der Teilchen) und die horizontalen Achsen zeigen vorwärts gestreute Lichtintensität (d.h. die Größe der Teilchen). Die Teilchengrößenverteilung in jeder Region wurde erhalten auf Basis dieser Histogramme. Aus dieser wurde die Anzahl der einzelnen Teilchen M und der agglutinierten Teilchen P und die Summe davon T erhalten. Die Agglutinationsrate P/T der Teilchen, welche in jeder dieser Regionen auftraten, wurde berechnet.
  • Die Agglutinationsraten (P/T) der Teilchen in den fluoreszierenden Latexreagenzien in den respektiven Messparametern, erhalten durch Messen der Proben, hergestellt aus den Proben HBs 1 bis HBs 7, werden in der folgenden Tabelle 5 gezeigt.
  • Tabelle 5
    Figure 00470001
  • Aus den obigen Messergebnissen wurde gefunden, dass die Agglutinationsraten der Teilchen des fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des HBs-Antigens erhöht sind in Abhängigkeit der Konzentrationen des HBs-Antigens, enthalten in den Proben, wohingegen die Agglutinationsraten der Teilchen der anderen Fluoreszenzlatexreagenzien unverändert sind, unabhängig von der Konzentrationen des in den Proben enthaltenen HBs-Antigens.
  • Die Agglutinationsraten (P/T) der Teilchen in den Fluoreszenzlatexreagenzien in den jeweiligen Messparametern, erhalten durch Messen der Proben TP 1 bis TP 7 werden in der folgenden Tabelle 6 gezeigt.
  • Tabelle 6
    Figure 00480001
  • Aus den obigen Messergebnissen wurde gefunden, dass die Agglutinationsraten der Teilchen des fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des Anti-TP-Antikörpers erhöht sind in Abhängigkeit der Konzentrationen des Anti-TP-Antikörpers, enthalten in den Proben, wohingegen die Agglutinationsraten der Teilchen der anderen Fluoreszenzlatexreagenzien unverändert sind, unabhängig von der Konzentrationen des in den Proben enthaltenen Anti-TP-Antikörpers.
  • Die Agglutinationsraten (P/T) der Teilchen in den Fluoreszenzlatexreagenzien in den jeweiligen Messparametern, erhalten durch Messen der Proben AFP 1 bis AFP 7 werden in der folgenden Tabelle 7 gezeigt.
  • Tabelle 7
    Figure 00490001
  • Aus den obigen Messergebnissen wurde gefunden, dass die Agglutinationsraten der Teilchen des fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des AFP-Antigens erhöht sind in Abhängigkeit der Konzentrationen des AFP-Antigens, enthalten in den Proben, wohingegen die Agglutinationsraten der Teilchen der anderen Fluoreszenzlatexreagenzien unverändert sind, unabhängig von der Konzentrationen des in den Proben enthaltenen AFP-Antigens.
  • Die Agglutinationsraten (P/T) der Teilchen in den Fluoreszenzlatexreagenzien in den jeweiligen Messparametern, erhalten durch Messen der Proben CEA 1 bis CEA 7 werden in der folgenden Tabelle 8 gezeigt.
  • Tabelle 8
    Figure 00500001
  • Aus den obigen Messergebnissen wurde gefunden, dass die Agglutinationsraten der Teilchen des fluoreszierenden Latexreagens zur Detektion des CEA-Antigens erhöht sind in Abhängigkeit der Konzentrationen des CEA-Antigens, enthalten in den Proben, wohingegen die Agglutinationsraten der Teilchen der anderen Fluoreszenzlatexreagenzien unverändert sind, unabhängig von der Konzentrationen des in den Proben enthaltenen CEA-Antigens.
  • Die Agglutinationsraten (P/T) der Teilchen in den Fluoreszenzlatexreagenzien in den jeweiligen Messparametern, erhalten durch Messen von S1 und S2 werden in der folgenden Tabelle 9 gezeigt.
  • Tabelle 9
    Figure 00510001
  • Wie durch die obigen Messergebnisse angezeigt, wurde die Agglutinationsrate jedes Parameters erhalten unter Verwendung von Vollblut als Probe durch gleichzeitiges Reagieren von vier Parametern in einem Reaktionssystem.
  • 5. Gleichzeitige Messung von vier Parametern von Infektionsmarkern
  • Unter Verwendung der automatischen Immunassayvorrichtung 100 wurden Immunassays für vier Parameter (Anti-TP-Antikörper, HBs-Antigen, Anti-HCV-Antikörper und Anti-HIV-Antikörper), welche Infektionsmarker sind, durchgeführt. Die Proben wurden vorbereitet wie folgt.
  • Proben
  • Unter Verwendung von Standards (einer Probenverdünnungsflüssigkeit und Probenverdünnungsflüssigkeiten, worin der Anti-TP-Antikörper bei sechs verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt wurde) zum Herstellen einer Standardkurve, enthalten in einem Ranream-Reagenzienkit zur TP-Messung (Sysmex Corporation), wurde eine Probenserie hergestellt, enthaltend Anti-TP-Antikörper (TP 1 bis TP 7). Die Konzentration des Anti-TP-Antikörpers jeder Probe in der Probenserie, enthaltend den Anti-TP-Antikörper, ist wie folgt:
    TP 1: 0 mIU, TP 2: 16,5 mIU, TP 3: 41,2 mIU, TP 4: 103,1 mIU, TP 5: 257,6 mIU, TP 6: 644 mIU und TP 7: 1610 mIU.
  • Unter Verwendung von Standards (einer Probenverdünnungsflüssigkeit und Probenverdünnungsflüssigkeiten, worin das HBs-Antigen bei sechs verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt wurde) zum Herstellen einer Standardkurve, enthalten in einem Ranream-Reagenzienkit zur HBsAg-Messung (Sysmex Corporation), wurde eine Probenserie hergestellt, enthaltend HBs-Antigen (HBs 1 bis HBs 7). Die Konzentration des HBs-Antigens jeder Probe in der Probenserie, enthaltend das HBs-Antigen, ist wie folgt:
    HBs 1: 0 U/ml, HBs 2: 1 U/ml, HBs 3: 3 U/ml, HBs 4: 9 U/ml, HBs 5: 27 U/ml, HBs 6: 81 U/ml und HBs 7: 243 U/ml.
  • Unter Verwendung von Standards (hergestellt aus einer negativen Kontrolle, Cut-off-Kontrolle und positiver Kontrolle, insgesamt 3 Proben) zur Herstellung der Standardkurve, enthalten in einem Ranream-Reagenzienkit für HCV IIex-Messung (Sysmex Corporation), wurde eine Probenserie hergestellt, enthaltend Anti-HCV-Antikörper (HCV 1 bis HCV 3). In dieser Probenserie, enthaltend Anti-HCV-Antikörper (HCV 1 bis HCV 3), enthielt HCV 3 die höchste Konzentration von Anti-HCV-Antikörper. In HCV 1 war die Konzentration von Anti-HCV-Antikörper 0 U/ml.
  • Als Probenserie, enthaltend Anti-HIV-Antikörper bei 3 Konzentrationen, wurde HIV 1 bis HIV 3 hergestellt wie folgt. Zunächst wurde PBS-Puffer (pH 7,2), enthaltend 5,0% (G/V), Rinderserumalbumin hergestellt. Dies wurde als HIV 1 bezeichnet. Als Nächstes wurde Hasen-Anti-HIV-Antiserum, verdünnt mit PBS-Puffer (= HIV 1), oben hergestellt, und dies wurde als HIV 3 bezeichnet. Zusätzlich wurde HIV 3 mit HIV 1 100-fach verdünnt, um HIV 2 zu ergeben. In dieser Probenserie, enthaltend Anti-HIV-Antikörper (HIV 1 bis HIV 3), enthielt HIV 3 die höchste Konzentration von Anti-HIV- Antikörper. In HIV 1 betrug die Konzentration von Anti-HCV-Antikörper 0 U/ml.
  • Messung
  • Das Reagensgefäß 227, in welchem die fluoreszierenden Latexreagenzien zur gleichzeitigen Messung von vier Parametern Infektionsmarkern platziert wurden und das Reagensgefäß 231, in welchem der Reaktionspuffer platziert ist, wurden in dem Reagenzieneinsetzbereich 222, lokalisiert im Probenvorbereitungsteil 200 der automatischen Immunassayvorrichtung 100, eingesetzt. Das Probengefäß 225, in welchem die Probe 225 platziert wurde, wurde in dem Probeneinsetzbereich 221 platziert und die automatische Immunassayvorrichtung 100 wurde wie oben beschrieben, betrieben, um jede Probe zu messen.
  • Analyseergebnisse
  • 22 und 23 sind zweidimensionale Scattergramme, erhalten durch Messen von HBs 7, welches die Probe ist, enthaltend das HBs-Antigen. Die horizontale Achse bezeichnet Fsc, und die vertikale Achse bezeichnet Fl. Die Scattergramme in 22 und 23 sind jene, worin die Ergebnisse, gemessen von der gleichen Probe ausgegeben wurden durch Ändern des Anzeigeverfahrens der vertikalen Achse. Infolge des Unterschieds an Fluoreszenzintensität sind vier Arten von fluoreszierenden Latexteilchen (d.h. die fluoreszierenden Latexteilchen zum Detektieren des Anti-TP-Antikörpers, die fluoreszierenden Latexteilchen zum Detektieren des HBs-Antigens, die fluoreszierenden Latexteilchen zum Detektieren des Anti-HCV-Antikörpers und die fluoreszierenden Latexteilchen zum Detektieren des Anti-HIV-Antikörpers) in Richtung der vertikalen Achse aufgetrennt und treten in den jeweils vorher bestimmten Regionen auf. Die fluoreszierenden Latexteilchen zum Detektieren des Anti-TP-Antikörpers, die fluoreszierenden Latexteilchen zum Detektieren des HBs- Antigens, die fluoreszierenden Latexteilchen zum Detektieren des Anti-HCV-Antikörpers und die fluoreszierenden Latexteilchen zum Detektieren des Anti-HIV-Antikörpers treten in den Regionen G101, G102, G103 bzw. G104 auf.
  • 24, 25, 26 und 27 sind Histogramme, die zu den Bereichen G101, G102, G103 bzw. G104 in den zweidimensionalen Scattergrammen in 22 bzw. 23 korrespondieren. Die vertikalen Achsen zeigen Frequenz (d.h. Teilchenanzahl), und die horizontalen Achsen zeigen vorwärts gestreute Lichtintensität (d.h. Größe der Teilchen).
  • Die Agglutinationsraten (P/T) der fluoreszierenden Latexteilchen in den jeweiligen Messparametern, erhalten durch Messen der Proben, hergestellt aus den Proben TP 1 bis TP 7 werden in der folgenden Tabelle 10 gezeigt.
  • Tabelle 10
    Figure 00540001
  • Aus den obigen Messergebnissen ergibt sich, dass die Agglutinationsraten der fluoreszierenden Latexteilchen zur Detektion des Anti-TP-Antikörpers erhöht sind in Abhängigkeit der Konzentrationen von Anti-TP-Antikörpern, enthalten in den Proben, wohingegen die Agglutinationsraten der anderen fluoreszierenden Latexteilchen nicht verändert waren, unabhängig von den Konzentrationen der Anti-TP-Antikörper, enthalten in den Proben.
  • Die Agglutinationsraten (P/T) der fluoreszierenden Latexteilchen in den jeweiligen Messparametern, erhalten durch Messung der Proben, hergestellt aus den Proben HBs 1 bis HBs 7 werden in der folgenden Tabelle 11 gezeigt.
  • Tabelle 11
    Figure 00550001
  • Aus den obigen Messergebnissen ergibt sich, dass die Agglutinationsraten der fluoreszierenden Latexteilchen zur Detektion des HBs-Antigens erhöht sind in Abhängigkeit der Konzentrationen des HBs-Antigens, enthalten in den Proben, wohingegen die Agglutinationsraten der anderen fluoreszierenden Latexteilchen nicht verändert waren, unabhängig von den Konzentrationen des HBs-Antigens, enthalten in den Proben.
  • Die Agglutinationsraten (P/T) der fluoreszierenden Latexteilchen in den jeweiligen Messparametern, erhalten durch Messung der Proben, hergestellt aus den Proben HCV 1 bis HCV 3 werden in der folgenden Tabelle 12 gezeigt.
  • Tabelle 12
    Figure 00560001
  • Aus den obigen Messergebnissen ergibt sich, dass die Agglutinationsraten der fluoreszierenden Latexteilchen zur Detektion des Anti-HCV-Antikörpers erhöht sind in Abhängigkeit der Konzentrationen des Anti-HCV-Antikörpers, enthalten in den Proben, wohingegen die Agglutinationsraten der anderen fluoreszierenden Latexteilchen nicht verändert waren, unabhängig von den Konzentrationen des Anti-HCV-Antikörpers, enthalten in den Proben.
  • Die Agglutinationsraten (P/T) der fluoreszierenden Latexteilchen in den jeweiligen Messparametern, erhalten durch Messung der Proben, hergestellt aus den Proben HIV 1 bis HIV 3 werden in der folgenden Tabelle 13 gezeigt.
  • Figure 00560002
  • Aus den obigen Messergebnissen ergibt sich, dass die Agglutinationsraten der fluoreszierenden Latexteilchen zur Detektion des Anti-HIV-Antikörpers erhöht sind in Abhängigkeit der Konzentrationen des Anti-HIV-Antikörpers, enthalten in den Proben, wohingegen die Agglutinationsraten der anderen fluoreszierenden Latexteilchen nicht verändert waren, unabhängig von den Konzentrationen des Anti-HIV-Antikörpers, enthalten in den Proben.
  • 6. Gleichzeitige Messung von vier Parametern an Tumormarkern
  • Unter Verwendung der automatischen Immunassayvorrichtung 100 wurden Immunassays der vier Parameter, welche Tumormarker sind (FRN-Antigen, CEA-Antigen, AFP-Antigen und PSA-Antigen) durchgeführt. Die Proben wurden wie folgt hergestellt.
  • Proben
  • Unter Verwendung von Standards (einer Probenverdünnungsflüssigkeit und Probenverdünnungsflüssigkeiten, worin das FRN-Antigen bei sechs verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt wurde) zum Herstellen einer Standardkurve, enthalten in einem Ranream-Reagenzienkit zur FRN-Messung (Sysmex Corporation), wurde eine Probenserie hergestellt, enthaltend FRN-Antigen (FRN 1 bis FRN 7). Die Konzentration des FRN-Antigens jeder Probe in der Probenserie, enthaltend das FRN-Antigen, ist wie folgt:
    FRN 1: 0 ng/ml, FRN 2: 1,25 ng/ml, FRN 3: 5 ng/ml, FRN 4: 20 ng/ml, FRN 5: 80 ng/ml, FRN 6: 320 ng/ml, FRN 7: 1280 ng/ml.
  • Unter Verwendung von Standards (einer Probenverdünnungsflüssigkeit und Probenverdünnungsflüssigkeiten, worin das CEA-Antigen bei sechs verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt wurde) zum Herstellen einer Standardkurve, enthalten in einem Ranream- Reagenzienkit zur CEA-Messung (Sysmex Corporation), wurde eine Probenserie hergestellt, enthaltend CEA-Antigen (CEA 1 bis CEA 7). Die Konzentration des CEA-Antigens jeder Probe in der Probenserie, enthaltend das CEA-Antigen, ist wie folgt:
    CEA 1: 0 ng/ml, CEA 2: 0,5 ng/ml, CEA 3: 2 ng/ml, CEA 4: 8 ng/ml, CEA 5: 32 ng/ml, CEA 6: 128 ng/ml, CEA 7: 512 ng/ml.
  • Unter Verwendung von Standards (einer Probenverdünnungsflüssigkeit und Probenverdünnungsflüssigkeiten, worin das AFP-Antigen bei sechs verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt wurde) zum Herstellen einer Standardkurve, enthalten in einem Ranream-Reagenzienkit zur AFP-Messung (Sysmex Corporation), wurde eine Probenserie hergestellt, enthaltend AFP-Antigen (AFP 1 bis AFP 7). Die Konzentration des AFP-Antigens jeder Probe in der Probenserie, enthaltend das AFP-Antigen, ist wie folgt:
    AFP 1: 0 ng/ml, AFP 2: 2 ng/ml, AFP 3: 8 ng/ml, AFP 4: 32 ng/ml, AFP 5: 128 ng/ml, AFP 6: 512 ng/ml, AFP 7: 2048 ng/ml.
  • Unter Verwendung von Standards (einer Probenverdünnungsflüssigkeit und Probenverdünnungsflüssigkeiten, worin das PSA-Antigen bei sechs verschiedenen Konzentrationen hinzugefügt wurde) zum Herstellen einer Standardkurve, enthalten in einem Ranream-Reagenzienkit zur PSA-Messung (Sysmex Corporation), wurde eine Probenserie hergestellt, enthaltend PSA-Antigen (PSA 1 bis PSA 7). Die Konzentration des PSA-Antigens jeder Probe in der Probenserie, enthaltend das PSA-Antigen, ist wie folgt:
    PSA 1: 0 ng/ml, PSA 2: 0,125 ng/ml, PSA 3: 0,5 ng/ml, PSA 4: 2 ng/ml, PSA 5: 8 ng/ml, PSA 6: 32 ng/ml, PSA 7: 128 ng/ml.
  • Messung
  • Das Reagensgefäß 227, in welchem das oben hergestellte fluoreszierende Latexreagens zur gleichzeitigen Messung von vier Tumormarker Parametern platziert wurde und das Reagensgefäß 231, in welchem der Reaktionspuffer platziert war, wurden in dem Reagenzieneinsetzbereich 222, lokalisiert im Probenvorbereitungsteil 200 der automatischen Immunassayvorrichtung 100 eingesetz. Das Probengefäß 225, in welchem die Probe platziert wurde, wurde in dem Probeneinsetzbereich 221 platziert und die automatische Immunassayvorrichtung 100 wurde wie oben beschrieben, betrieben, um jede Probe zu messen.
  • Analysenergebnisse
  • 28 und 29 sind zweidimensionale Scattergramme, erhalten durch Messen von AFP 7, welches die Probe ist, enthaltend AFP. Die horizontale Achse bezeichnet Fsc, und die vertikale Achse bezeichnet FL. Die zweidimensionalen Scattergramme in 28 und 29 korrespondieren zu jenen, in welchen die Ergebnisse, gemessen von derselben Probe, ausgegeben wurden durch Ändern des Anzeigeverfahrens der vertikalen Achse. Infolge des Unterschieds an Fluoreszenzintensität sind vier Arten von fluoreszierenden Latexteilchen (d.h. die fluoreszierenden Latexteilchen zur Detektion des FRN-Antigens, die fluoreszierenden Latexteilchen zur Detektion des CEA-Antigens, die fluoreszierenden Latexteilchen zur Detektion des AFP-Antigens und die fluoreszierenden Latexteilchen zur Detektion des PSA-Antigens) in Richtung der vertikalen Achse getrennt und treten jeweils in den vorher bestimmten Regionen auf. Die fluoreszierenden Latexteilchen zur Detektion des FRN-Antigens, die fluoreszierenden Latexteilchen zur Detektion des CEA-Antigens, die fluoreszierenden Latexteilchen zur Detektion des AFP-Antigens und die fluoreszierenden Latexteilchen zur Detektion des PSA- Antigens treten in den Regionen G201, G202, G203 bzw. G204 auf.
  • 30, 31, 32 und 33 sind die Histogramme, die zu den Regionen G201, G202, G203 bzw. G204 in den zweidimensionalen Scattergrammen in 26 bzw. 27 korrespondieren. Die vertikale Achse zeigt die Frequenz an (d.h. Teilchenanzahl), und die horizontale Achse zeigt die vorwärts gestreute Lichtintensität an (d.h. Größe der Teilchen).
  • Die Agglutinationsraten (P/T) der fluoreszierenden Latexteilchen in den jeweiligen Messparametern, erhalten durch Messen der Proben, hergestellt aus den Proben FRN 1 bis FRN 7, werden in der folgenden Tabelle 14 gezeigt.
  • Tabelle 14
    Figure 00600001
  • Aus den obigen Messergebnissen ergibt sich, dass die Agglutinationsraten der fluoreszierenden Latexteilchen zur Detektion des FRN-Antigens erhöht sind in Abhängigkeit der Konzentrationen des FRN-Antigens, enthalten in den Proben, wohingegen die Agglutinationsraten der anderen fluoreszierenden Latexteilchen nicht verändert waren, unabhängig von den Konzentrationen des FRN-Antigens, enthalten in den Proben.
  • Die Agglutinationsraten (P/T) der fluoreszierenden Latexteilchen in den jeweiligen Messparametern, erhalten durch Messung der Proben, hergestellt aus den Proben CEA 1 bis CEA 7 werden in der folgenden Tabelle 15 gezeigt.
  • Tabelle 15
    Figure 00610001
  • Aus den obigen Messergebnissen ergibt sich, dass die Agglutinationsraten der fluoreszierenden Latexteilchen zur Detektion des CEA-Antigens erhöht sind in Abhängigkeit der Konzentrationen des CEA-Antigens, enthalten in den Proben, wohingegen die Agglutinationsraten der anderen fluoreszierenden Latexteilchen nicht verändert waren, unabhängig von den Konzentrationen des CEA-Antigens, enthalten in den Proben.
  • Die Agglutinationsraten (P/T) der fluoreszierenden Latexteilchen in den jeweiligen Messparametern, erhalten durch Messung der Proben, hergestellt aus den Proben AFP 1 bis AFP 7 werden in der folgenden Tabelle 16 gezeigt.
  • Tabelle 16
    Figure 00620001
  • Aus den obigen Messergebnissen ergibt sich, dass die Agglutinationsraten der fluoreszierenden Latexteilchen zur Detektion des AFP-Antigens erhöht sind in Abhängigkeit der Konzentrationen des AFP-Antigens, enthalten in den Proben, wohingegen die Agglutinationsraten der anderen fluoreszierenden Latexteilchen nicht verändert waren, unabhängig von den Konzentrationen des AFP-Antigens, enthalten in den Proben.
  • Die Agglutinationsraten (P/T) der fluoreszierenden Latexteilchen in den jeweiligen Messparametern, erhalten durch Messung der Proben, hergestellt aus den Proben PSA 1 bis PSA 7 werden in der folgenden Tabelle 17 gezeigt.
  • Tabelle 17
    Figure 00630001
  • Aus den obigen Messergebnissen ergibt sich, dass die Agglutinationsraten der fluoreszierenden Latexteilchen zur Detektion des PSA-Antigens erhöht sind in Abhängigkeit der Konzentrationen des PSA-Antigens, enthalten in den Proben, wohingegen die Agglutinationsraten der anderen fluoreszierenden Latexteilchen nicht verändert waren, unabhängig von den Konzentrationen des PSA-Antigens, enthalten in den Proben.
  • Bei der oben beschriebenen simultanen Messung der vier Parameter von Infektionsmarkern wurden die Immunassays der multiplen Parameter, assoziiert mit den Infektionen (Anti-TP-Antikörper, HBs-Antigen, Anti-HCV-Antikörper und Anti-HIV-Antikörper) gleichzeitig durchgeführt für eine Probe unter Verwendung des fluoreszierenden Latexreagens, enthaltend die fluoreszierenden Latexteilchen, immobilisiert mit TP-Antigen, die fluoreszierenden Latexteilchen, immobilisiert mit Anti-HBs-Antikörper, die fluoreszierenden Latexteilchen, immobilisiert mit HCV-Antigen und die fluoreszierenden Latexteilchen, immobilisiert mit HIV-Antigen, als Trägerteilchen. So kann die Kombination von mehreren Arten von fluoreszierenden Latexteilchen, die auf mit Infektionen assoziierte Parameter reagieren, das Reagens zur gleichzeitigen Messung von multiplen Parametern von Infektionsmarkern zur Verfügung stellen.
  • Zusätzlich wurde in der oben beschriebenen gleichzeitigen Messung von vier Parametern von Tumormarkern die Immunassays von mehreren Parametern, assoziiert mit den Tumoren (FRN-Antigen, CEA-Antigen, AFP-Antigen und PSA-Antigen) gleichzeitig durchgeführt für eine Probe unter Verwendung des fluoreszierenden Latexreagens, enthaltend die fluoreszierenden Latexteilchen, immobilisiert mit Anti-FRN-Antikörper, die fluoreszierenden Latexteilchen, immobilisiert mit Anti-CEA-Antikörper, die fluoreszierenden Latexteilchen, immobilisiert mit Anti-AFP-Antikörper und die fluoreszierenden Latexteilchen, immobilisiert mit Anti-PSA-Antikörper, als Trägerteilchen. So kann die Kombination von mehreren Arten von fluoreszierenden Latexteilchen, die auf Parameter reagieren, die assoziiert sind mit Tumoren, das Reagens zur gleichzeitigen Messung von mehreren Parametern, assoziiert mit Tumormarkern, zur Verfügung stellen.
  • Die oben beschriebenen Reagenzien für die gleichzeitige Messung von vier Parametern gleichzeitige Messung sind nützlich zur Messung von mehreren Parametern, die mit Infektionen oder Tumoren assoziiert sind in einer kurzen Zeitperiode. In dem Fall der gleichzeitigen Messung von mehreren Parametern muss jedoch die Kombination der Messparameter nicht auf die obigen limitiert sein. Zum Beispiel können multiple Parameter, ausgewählt aus den sogenannten immunologischen Serumtestparametern (CRP, RF, ASO, IgG, IgA, IgM, IgE, etc.), kombiniert werden, oder multiple Parameter, ausgewählt aus endokrinen Parametern (TSH, T4, T3, FT4, etc.), können kombiniert werden. Zusätzlich können multiple Parameter, ausgewählt aus Blutmedikamenten-Testparametern (PHT, PB, PRM, CBZ, VPA, etc.), kombiniert werden. Die Parameter, die gleichzeitig gemessen werden sollen, können natürlich in geeigneter Weise kombiniert werden, unabhängig von der Testkategorie.
  • Bei der oben beschriebenen gleichzeitigen Messung der vier mit Infektionsmarkern assozierten Parameter und den vier Tumormarker-Parametern wurde die Suspension, in welcher die multiplen Arten von fluoreszierenden Latexteilchen, reagierend mit den multiplen Parametern, zuvor in einer Flüssigkeit suspendiert worden waren, verwendet als das fluoreszierende Latexreagens. Konventionell werden, wenn vier Parameter gemessen werden, die Reagenzien für die Messung, welche mit den jeweiligen Parametern reagieren, benötigt. In den Beispielen gemäß der vorliegenden Erfindung jedoch besteht das fluoreszierende Latexreagens zur Messung der jeweiligen Parameter aus einer einzigen Flüssigkeit. Zusätzlich dient nur eine Art von Reaktionspuffer der gleichzeitigen Messung von vier Parametern. Da es nicht nötig ist, die fluoreszierenden Latexreagenzien und die Reaktionspuffer für die jeweiligen multiplen Messparameter herzustellen, kann der Raum zum Einsetzen der Reagenzien kompakter gestaltet werden in der automatischen Immunassayvorrichtung, was in Folge zu einer Verkleinerung des gesamten Apparats führt.
  • Als eine weitere Konfiguration der Reagenzien wird das fluoreszierende Latexreagens für jeden Messparameter hergestellt, die fluoreszierenden Latexreagenzien werden so konfiguriert, dass das fluoreszierende Latexreagens von der Testfolge abhängt, und die erwünschten Messparameter werden ausgewählt und kombiniert. 34 ist eine Zeichnung, die ein modifiziertes Beispiel der Probenvorbereitungseinheit der automatischen Immunassayvorrichtung 100, gezeigt in 7, darstellt. Die Probenvorbereitungseinheit 200 in 34 ist so konfiguriert, dass sie mehrere Arten von fluoreszierenden Latexreagenzien kombiniert, und die gleichzeitige Messung der multiplen Parameter durchführt. Der Reagenzieneinsetzteil 222 kann die Reagenziengefäße 27a, 27b, 27c und 27d, in welchen die ersten, zweiten, dritten und vierten fluoreszierenden Latexreagenzien platziert sind, jeweils einsetzen. Die ersten bis vierten fluoreszierenden Latexreagenzien reagieren jeweils auf unterschiedliche Messparameter, und die darin enthaltenen fluoreszierenden Latexteilchen umfassen Fluoreszenzfarbstoffe bei verschiedenen Konzentrationen. Die Konfigurationen außer dem Reagenzieneinsetzteil 222 sind die gleichen wie jene, die in 7 beschrieben werden.
  • In diesem modifizierten Beispiel kann die automatische Immunassayvorrichtung 100 zwei Operationsmodi auswählen: den Modus die vier Parameter gleichzeitig zu messen und den Modus der Einzelparametermessung. Der Benutzer wählt einen der Operationsmodi unter Verwendung des Flüssigkristall-Touchpanels 101 vor der Messung aus. Nach dem Auswählen des gleichzeitigen vier Parameter-Messmodus, funktioniert die Probenvorbereitungseinheit 200 in 34, nachdem der Startschalter 103 gedrückt wurde, wie in S1 (Kontrolle der Probenvorbereitungseinheit) in der Gesamtkontrolle der Vorrichtung folgt.
  • Zunächst saugt die Verteilungsvorrichtung 224 80 μl des Reaktionspuffers aus dem Reagensgefäß 231 in dem Reagenseinsetzteil 222. Als Nächstes saugt die Verteilungsvorrichtung 224 10 μl der Probe aus dem Probengefäß 225, welches in dem Probeneinsetzteil 221 eingesetzt ist, und stößt die oben aufgesaugten Reaktionspuffer und die Probe in das Reaktionsgefäß 226, eingesetzt in den Inkubator 223, aus. Als Nächstes saugt die Verteilungsvorrichtung 224 2,5 μl des ersten fluoreszierenden Latexreagens aus dem Reagenzgefäß 227a in dem Reagenzieneinsetzteil 222 auf und stößt sie in das Reaktionsgefäß 226 aus. Als Nächstes saugt die Verteilungsvorrichtung 224 2,5 μl des zweiten fluoreszierenden Latexreagens aus dem Reagenzgefäß 227b in dem Reagenzieneinsetzteil 222 auf und stößt es in das Reaktionsgefäß 226 aus. Die Verteilungsvorrichtung 224 saugt auch je 2,5 μl des dritten und vierten fluoreszierenden Latexreagens auf und stößt diese in ähnlicher Weise in das Reaktionsgefäß 226 aus. Anschließend inkubiert der Inkubator 223 durch Schütteln/Rühren das Reaktionsgefäß 226, in welchem die Probe, die fluoreszierenden Latexreagenzien und der Reaktionspuffer platziert wurden, während die Temperatur bei 45°C gehalten wird für 15 Minuten und reagiert die Probe mit den Reagenzien, um eine Probenflüssigkeit vorzubereiten. Die Verteilungsvorrichtung 224 saugt die Probenflüssigkeit nach der Inkubation auf und führt sie in das Probengefäß 233 über. Eine Verdünnungsflüssigkeit wird in dem Probengefäß 233 zuvor platziert, und die ausgestoßene Probenflüssigkeit wird 51-fach verdünnt. Anschließend werden die Kontrollen des Lichtdetektionsteils und des Analyseteils, wie in den obigen Beispielen beschrieben, ausgeführt.
  • Vor der Messung wird der Probenvorbereitungsteil 200 wie folgt kontrolliert, wenn der Einzelparametermessmodus ausgewählt ist. Die Verteilungsvorrichtung 224 saugt zunächst den Reaktionspuffer und die Probe auf und stößt diese in das Reaktionsgefäß 226 aus, wie oben, und saugt anschließend 10 μl des fluoreszierenden Latexreagens für den bestimmten Messparameter auf und stößt diese in das Reaktionsgefäß 226 aus. Die übrigen Funktionen werden wie oben kontrolliert.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Antigen (Antikörper) in der Proben mit exzellenter Genauigkeit detektiert werden, selbst wenn die Probe und die Vollblutprobe verwendet werden, die andere Teilchen als die Trägerteilchen enthalten (z.B. Erythrozyten, Plättchen, Chylomikrone und Bakterien). Gemäß der vorliegenden Erfindung können Trägerteilchen unterschieden und gezählt werden, um ein Agglutinationsniveau zu ergeben, selbst wenn Trägerteilchen verwendet werden, welche in der Größe mit den übrigen Teilchen überlappen. So ist die Beschränkung bezüglich der Teilchengrößen bei der Auswahl der Trägerteilchen verringert. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann die Art der Reagenzien verringert werden, da kein Markierungsantikörper verwendet wird, um die zu messende Zielsubstanz zu markieren, welche an die Trägerteilchen gebunden ist.
  • Zusätzlich kann die Teilchenagglutinationsreaktion für die multiplen Messzielsubstanzen durchgeführt werden in einem Reaktionssystem, und die jeweiligen zu messenden Zielsubstanzen können gleichzeitig mit einer hervorragenden Genauigkeit detektiert werden. So können im Notfall in einer kurzen Zeitdauer multiple Parameter von Immunassay durchgeführt werden.
  • Zusätzlich wird es gemäß der vorliegenden Erfindung möglich, den automatischen Immunassayapparat zu verkleinern durch Vereinigen der Reagenzien für multiple Parametermessungen wie Infektionsmarker und Tumormarker in einem Reagens. Sowohl die Einzelparametermessung als auch die gleichzeitige Messung multipler Parameter kann durchgeführt werden, so dass die Reagenzien für die jeweiligen Messparameter in Kombination verwendet werden.
  • Die voranstehende detaillierte Beschreibung und Beispiele sind zur Erklärung und Illustration zur Verfügung gestellt worden. Viele Variationen in den vorliegend erwünschten Ausführungsformen, welche hierin dargestellt wurden, werden für den Fachmann naheliegend sein.

Claims (6)

  1. Immunassayverfahren umfassend: (a) Herstellen einer Messprobe durch Mischen einer Probe mit Trägerpartikeln; wobei die Probe eine zu messende Zielsubstanz und co-existierende Partikel umfasst; wobei ein Antikörper oder ein Antigen gegen die zu messende Zielsubstanz auf den Trägerpartikeln immobilisiert ist; wobei die Trägerpartikel eine andere physikalische Eigenschaft haben als die co-existierenden Partikel; wobei diese andere physikalische Eigenschaft ausgewählt ist aus Fluoreszenz, Absorption, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder biologischer Lumineszenz, und wobei die Trägerpartikel agglutiniert sind, wenn die zu messende Zielsubstanz in der Probe vorhanden ist; (b) Nachweisen einer ersten und zweiten optischen Information der co-existierenden Partikel und der Trägerpartikel in der Messprobe, wobei die erste optische Information ausgewählt ist aus Fluoreszenz, Absorption, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder biologischer Lumineszenz, und die zweite optische Information Streulicht ist; (c) Unterscheiden der Trägerpartikel von den co-existierenden Partikeln auf Grundlage der ersten optischen Information; (d) Nachweisen eines Agglutinierungsniveaus der Trägerpartikel auf Grundlage der zweiten optischen Information; und (e) Analysieren auf Grundlage des Agglutinierungsniveaus der Trägerpartikel, ob die zu messende Zielsubstanz in der Probe vorhanden ist oder nicht.
  2. Immunassayverfahren umfassend: (a) Herstellen einer Messprobe durch Mischen einer Probe, die eine erste und zweite zu messende Zielsubstanz und co-existierende Partikel und erste und zweite Trägerpartikel umfasst; wobei ein Antikörper oder ein Antigen gegen die erste zu messende Zielsubstanz auf den ersten Trägerpartikeln immobilisiert ist und die ersten Trägerpartikel agglutinieren, wenn die erste zu messende Zielsubstanz vorhanden ist; wobei ein Antikörper oder ein Antigen gegen die zweite zu messende Zielsubstanz auf den zweiten Trägerpartikeln immobilisiert ist und die zweiten Trägerpartikel agglutinieren, wenn die zweite zu messende Zielsubstanz vorhanden ist; wobei die ersten und zweiten Trägerpartikel verschiedene optische Informationen als die co-existierenden Partikel umfassen; und wobei die ersten Trägerpartikel eine andere physikalische Eigenschaft haben als die zweiten Trägerpartikel, wobei die andere physikalische Eigenschaft ausgewählt ist aus Fluoreszenz, Absorption, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder biologischer Lumineszenz; (b) Nachweisen der ersten und zweiten optischen Information der ersten und zweiten Trägerpartikel und der co-existierenden Partikel in der Messprobe, wobei diese erste optische Information ausgewählt ist aus Fluoreszenz, Absorption, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder biologischer Lumineszenz und diese zweite optische Information Streulicht ist; (c) Unterscheiden der ersten Trägerpartikel, der zweiten Trägerpartikel und der co-existierenden Partikel auf Grundlage der ersten optischen Information; (d) Nachweisen der jeweiligen Agglutinierungsniveaus der ersten und zweiten Trägerpartikel auf Grundlage der zweiten optischen Information; und (e) Analysieren auf Grundlage der jeweiligen Agglutinierungsniveaus, ob mindestens eine der ersten und zweiten zu messenden Zielsubstanzen in der Probe vorhanden ist oder nicht.
  3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Probe Vollblut ist und die co-existierenden Partikel Erythrozyten oder Plättchen sind.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die erste optische Information ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Fluoreszenz, Chemilumineszenz und Absorption.
  5. Immunassay-Apparat umfassend: (a) eine Messprobenzufuhr zum Zuführen einer Messprobe, wobei die Messprobe eine Mischung einer Probe und Trägerpartikel ist; wobei die Probe eine zu messende Zielsubstanz und co-existierende Partikel umfasst; wobei ein Antikörper oder ein Antigen gegen die zu messende Zielsubstanz auf den Trägerpartikeln immobilisiert ist; wobei die Trägerpartikel eine andere physikalische Eigenschaft haben als die co-existierenden Partikel, wobei diese physikalische Eigenschaft ausgewählt ist aus Fluoreszenz, Absorption, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder biologischer Lumineszenz; und wobei die Trägerpartikel agglutiniert sind, wenn die zu messende Zielsubstanz in der Probe vorhanden ist; (b) einen Detektor optischer Informationen zum Nachweisen einer ersten und zweiten optischen Information der co-existierenden Partikel und der Trägerpartikel in der Messprobe, wobei die erste optische Information ausgewählt ist aus Fluoreszenz, Absorption, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder biologischer Lumineszenz und die zweite optische Information Streulicht ist; (c) eine Kontrolleinheit, welche die Trägerpartikel von den co-existierenden Partikeln auf Grundlage der ersten optischen Information unterscheidet, das Agglutinierungsniveau der Trägerpartikel auf Grundlage der zweiten optischen Information berechnet und auf Grundlage des Agglutinierungsniveaus der Trägerpartikel analysiert, ob die zu messende Zielsubstanz in der Probe vorhanden ist oder nicht.
  6. Immunassay-Apparat umfassend: (a) eine Messprobenzufuhr zum Zuführen einer Messprobe, wobei die Messprobe ein Gemisch einer Probe und erster und zweiter Trägerpartikel ist, wobei die Probe eine erste und zweite zu messende Zielsubstanz und co-existierende Partikel umfasst; wobei ein Antikörper oder ein Antigen gegen die erste zu messende Zielsubstanz auf den ersten Trägerpartikeln immobilisiert ist und die ersten Trägerpartikel agglutinieren, wenn die erste zu messende Zielsubstanz vorhanden ist; wobei ein Antikörper oder ein Antigen gegen die zweite zu messende Zielsubstanz auf den zweiten Trägerpartikeln immobilisiert ist und die zweiten Trägerpartikel agglutinieren, wenn die zweite zu messende Zielsubstanz vorhanden ist; und wobei die ersten Trägerpartikel eine andere physikalische Eigenschaft haben als die zweiten Trägerpartikel, wobei die andere physikalische Eigenschaft ausgewählt ist aus Fluoreszenz, Absorption, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder biologischer Lumineszenz; (b) einen Detektor optischer Informationen zum Nachweisen der ersten und zweiten optischen Information der ersten und zweiten Trägerpartikel, wobei die erste optische Information ausgewählt ist aus Fluoreszenz, Absorption, Phosphoreszenz, Chemilumineszenz oder biologischer Lumineszenz und die zweite optische Information Streulicht ist; (c) eine Kontrolleinheit, die die ersten Trägerpartikel, die zweiten Trägerpartikel und die co-existierenden Partikel auf Grundlage der ersten optischen Information unterscheidet, die entsprechenden Agglutinierungsniveaus der ersten und zweiten Trägerpartikel auf Grundlage der zweiten optischen Information berechnet; und auf Grundlage der entsprechenden Agglutinierungsniveaus analysiert, ob mindestens eine der ersten und zweiten zu messenden Zielsubstanzen in der Probe vorhanden ist.
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