DE60116689T2

DE60116689T2 - Vollblut-Immunoassay

Info

Publication number: DE60116689T2
Application number: DE60116689T
Authority: DE
Inventors: Shinya Kobe-shi Uchida; Aya Kobe-shi Konishi; Tsuneyoshi Kobe-shi Torii; Kazuhiro Nakashima
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 2000-07-27
Filing date: 2001-07-19
Publication date: 2006-08-31
Anticipated expiration: 2021-07-20
Also published as: ATE316244T1; DE60116689D1; EP1176424A2; US20020031791A1; US6878558B2; EP1176424A3; EP1176424B1

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Vollblut-Immunassay, genauer gesagt einen Vollblut-Immunassay unter Verwendung von Teilchenagglutination.
2. Beschreibung des Standes der Technik
Für Immunassays zu Testgegenständen betreffend Infektionskrankheiten ist Serum als zu testende Probe verwendet worden. Jedoch bedarf es mindestens 30 Minuten, um Serum von Vollblut zur trennen, umfassend Zeit für die Blutgerinnung und Zeit für die anschließende Zentrifugation.
Typische Beispiele von Immunassays umfassen einen radioaktiven Immunassay (RIA), einen Enzymimmunassay (EIA), einen Teilchenagglutinationsassay und einen Zählimmunassay. Jedoch benötigen RIA und EIA B(gebundene Form)/F(freie Form)-Trennung nach der Antigen-Antikörper-Reaktion und daher Zeit und Aufwand, bevor die Ergebnisse des Assays erhalten werden.
Der Teilchenagglutinationsimmunassay ist insofern vorteilhaft, als er nur das Mischen einer zu testenden Probe mit einer Suspension von unlöslichen Trägerpartikeln (z.B. Latex), sensitiviert mit einem Antigen oder Antikörper, benötigt. Er benötigt nicht die B/F-Trennung und kann einfach ausgeführt werden.
In den vergangenen Jahren werden jedoch hochgenaue einfache Immunassaytechniken benötigt. Insbesondere ist es notwendig geworden, schnell zu beurteilen, ob ein Patient mit Hepatitis-Virus, HIV oder dergleichen infiziert ist, z.B. im Fall einer Notoperation. Dementsprechend wird gefordert, dass die Assayzeit vom Blutabnehmen bis zum Erhalten der Assayergebnisse verkürzt wird.
Unter Berücksichtigung der Verkürzung der Assaydauer ist es bevorzugt, von einem Patienten abgenommenes Vollblut an Stelle von Serum als Probe für den Immunassay zu verwenden. Wenn jedoch Vollblut verwendet wird, stört die Gegenwart von Blutzellen den Nachweis des Grads der Agglutination der Partikel.
Im Hinblick darauf offenbart z.B. die japanische, nicht geprüfte Patentveröffentlichung Nr. Hei 10(1998)-48214 einen Vollblutassay unter Verwendung einer herkömmlichen Latexagglutinationsmethode. Gemäß dieser Offenbarung wird eine Vollblutprobe unter Verwendung eines Tensids hämolysiert und die resultierende Probe wird durch einen Latex-turbidimetrischen Immunassay getestet.
Jedoch hat dieser Assay insofern ein Problem, als das Tensid, welches in einer ausreichenden Konzentration für die Hämolyse verwendet werden muss, die Antigen-Antikörper-Reaktion beeinträchtigt und eine ausreichende Antwort nicht erhalten werden kann.
JP 60047962 offenbart einen Immunagglutinationsassay, durchgeführt an einer Vollblutprobe, worin Hämolyse gleichzeitig oder vor der Agglutinatiosnreaktion durchgeführt wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, einen Vollblutimmunassay zur Verfügung zu stellen, durch welchen das Interferieren von Blutzellen vermieden wird, ohne jegliche Beeinträchtigung der Antigen-/Antikörper-Reaktion.
Die vorliegende Erfindung stellt einen Vollblutimmunassay zur Verfügung, umfassend die Schritte: Mischen einer Vollblutprobe mit sensitivierten unlöslichen Trägerpartikeln, um Immunagglutination zu bewirken, Verdünnen der resultierenden Agglutinationsmischung mit einer wässrigen Lösung enthaltend ein Erythrozyten-lysierendes Mittel, um Erythrozyten zu lysieren, wodurch eine Assayprobe hergestellt wird, und Bestimmen des Grads der Agglutination der Assayprobe.
Diese und weitere Ziele der vorliegenden Erfindung werden aus der nachfolgenden weiteren detaillierten Beschreibung leichter offensichtlich. Jedoch sind die folgende detaillierte Beschreibung und die spezifischen Beispiele, welche bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung anzeigen, nur illustrativ zu verstehen.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Im Vollblutimmunassay der vorliegenden Erfindung bedeutet Vollblutprobe von einem Menschen oder anderem Tier abgenommenes Blut, welches nicht der Serum- oder Plasmatrennung unterworfen wurde. Die Vollblutprobe kann jedoch vor dem Durchführen des Immunassays der vorliegenden Erfindung mit einem gerinnungshemmenden Mittel gerinnungsgehemmt werden und/oder mit einem Reaktionspuffer verdünnt werden.
Als gerinnungshemmende Mittel, die zum Gerinnungshemmen der Probe verwendet werden, sind jene, welche üblicherweise für Bluttests verwendet werden, wie EDTA-Salze, Zitrate und dergleichen verwendbar. Der Reaktionspuffer ist nicht besonders limitiert und z.B. ein Phosphatpuffer, ein Tris-HCl-Puffer und dergleichen sind verwendbar. Der pH des Reaktionspuffers kann geeigneter Weise etwa pH 6 bis 8,5 sein. Zum Reaktionspuffer kann eine Substanz, welche nicht spezifische Reaktionen unterdrückt, ein Sensitizer und dergleichen hinzugefügt werden, wie benötigt. Die Mischung des Vollbluts mit dem Reaktionspuffer kann zur Vorbereitung der nachfolgenden Immunagglutination sein. Wenn das Vollblut mit dem Reaktionspuffer verdünnt wird, kann das Verdünnungsverhältnis geeigneter Weise etwa 5 bis 10 (pro Volumen) und vorzugsweise 10 bis 50 sein. Die Temperatur und Zeit, bei welcher und während welcher das Vollblut mit dem Reaktionspuffer gemischt wird, kann geeigneter Weise etwa 20 bis 50°C und etwa 1 bis 5 Minuten sein.
Die unlöslichen Trägerpartikel sind immunisierte Partikel, d.h. sensitiviert mit einem Antigen oder Antikörper. Als Material für die Partikel können z.B. synthetische Polymere, typischerweise Polystyrollatex oder dergleichen erwähnt werden.
Die Größe der unlöslichen Trägerpartikel ist nicht besonders limitiert und alle bekannten unlöslichen Trägerpartikel können verwendet werden. Z.B. kann die Größe etwa 0,1 bis 20 μm im Durchmesser, vorzugsweise etwa 0,1 bis 1,0 μm im Durchmesser betragen. Die Partikel haben vorzugsweise einen einheitlichen Durchmesser.
Die unlöslichen Trägerpartikel können durch eine dem Fachmann bekannte Methode sensitiviert werden, z.B. durch physikalische Adsorption, chemische Bindung etc.. Das Antigen oder der Antikörper, der für die Sensitivierung der Partikel verwendet wird, ist nicht besonders limitiert, solange er unter Verwendung einer Antigen-/Antikörperreaktion nachgewiesen werden kann. Die unlöslichen Trägerpartikel werden üblicherweise in der Form einer Suspension in einem Lösungsmittel verwendet. Das Lösungsmittel kann geeigneter Weise Wasser, der oben erwähnte Puffer oder dergleichen sein. Das Mischungsverhältnis der unlöslichen Trägerpartikel zu dem Lösungsmittel ist geeigneter Weise etwa 0,1 bis 1 Gewicht pro Volumenprozent.
Betreffend die Immunagglutination wird eine Latexsuspension, enthaltend die sensitivierten unlöslichen Trägerpartikel, zu der Vollblutprobe, wahlweise verdünnt mit dem Reaktionspuffer, hinzugefügt, so dass die Antigen-/Antikörperreaktion stattfindet. Hier kann das Mischungsverhältnis der Probe zu den unlöslichen Trägerpartikeln (oder das Mischungsverhältnis der verdünnten Vollblutprobe zu der Latexsuspension) z.B. etwa 5:1 bis 20:1 sein. Die Reaktionstemperatur ist geeigneter Weise 20 bis 50°C und die Reaktionszeit ist geeigneter Weise 15 Sekunden bis 20 Minuten.
Als Erythrozyten-lysierendes Mittel, enthalten in der wässrigen, zum Verdünnen der resultierenden Agglutinationsmischung verwendeten Lösung, werden geeigneter Weise Mittel verwendet, die in der Lage sind, nicht nur die Membranen von Erythrozyten zu zerstören, sondern auch die Membranen aufzulösen oder zusammenzuziehen. Z.B. sind Tenside, welche üblicherweise im Bereich der Blutzellzählung zum Lysieren von Erythrozyten verwendet werden, verwendbar. Insbesondere können wasserlösliche Tenside erwähnt werden. Die wasserlöslichen Tenside können kationisch, anionisch, nicht-ionisch oder ampholytisch sein. Unter diesen sind jene mit einer stärkeren hydrophoben Natur im hydrophoben Teil (einer großen Zahl Kohlenstoffatome) bevorzugter, da sie eine größere Fähigkeit zum Lysieren von Erythrozyten besitzen.
Beispiele von kationischen Tensiden umfassen Alkyltrimethylammoniumsalze und Alkylpyridinsalze.
Beispiele von anionischen Tensiden umfassen Alkylsulfate (z.B. Natriumdodekylsulfat).
Beispiele von ampholytischen Tensiden umfassen Alkylbeatinacetate.
Beispiele von nicht-ionischen Tensiden umfassen Polyoxyethylenalkylether, Polyoxyethylenalkenylether und Polyoxyethylenalkylphenylether.
Das Erythrozyten-lysierende Mittel wird geeigneter Weise in 2 bis weniger als 10.000 ppm in der wässrigen Lösung zum Verdünnen der Agglutinationsmischung verwendet.
Die wässrige Lösung kann auch ein Salz wie Natriumchlorid und/oder einen Puffer zusätzlich zu dem Erythrozyten-lysierenden Mittel enthalten. In solchen Fällen kann die Menge der enthaltenen Substanz wie nötig adjustiert werden gemäß dem oben genannten pH und dergleichen.
In der vorliegenden Erfindung werden Erythrozyten nach der Immunagglutination und vor der Messung lysiert, um ihre Interferenz mit der Bestimmung zu verhindern. In einem in der japanischen ungeprüften Patentveröffentlichung Nr. Hei 10(1998)-48214 offenbarten Assay, in welchem die Antigen-/Antikörper-Reaktion nach der Lyse der Erythrozyten durchgeführt wird, wird eine große Menge eines Tensids zum Lysieren der Erythrozyten benötigt. In der Gegenwart des Tensids in einer großen Menge wird die Antigen-/Antikörper-Reaktion beeinflusst. Um die Konzentration des verwendeten Tensids zu verringern, und muss die Vollblutprobe reduziert oder verdünnt werden, was in Folge die Konzentration des Antigens oder Antikörpers verringert, welches an der Antigen-/Antikörper-Reaktion teilnehmen soll, und resultiert in einer schlechten Antwort. Wenn jedoch die Antigen-/Antikörper-Reaktion zuerst unter den oben genannten Bedingungen durchgeführt wird, wird die Antigen-/Antikörper-Reaktion selbst nicht durch das Tensid beeinflusst, sondern schreitet auch wie nötig und ausreichend voran. Desweiteren ist es möglich, Partikel ohne Zerstören eines Antigen-/Antikörper-Reaktionskomplexes (Agglutinationsmischung) zu detektieren.
Das Verfahren zur Bestimmung des Grads der Agglutination der Assayprobe, nachdem die Erythrozyten lysiert worden sind, kann jedes bekannte Verfahren ohne besondere Einschränkung sein. Verwendbar ist eine bekannte Vorrichtung zum Bestimmen des Grades des Agglutination. Z.B. kann im Fall eines turbidimetrischen Immunassays ein Spektrophotometer verwendet werden. Im Fall eines Zählungs-Immunassays kann ein Messapparat, der das Prinzip der Durchflusszytometrie verwendet, verwendet werden und ein kommerziell erhältliches Durchflusszytometer kann verwendet werden.
Die PAMIA-Serie, hergestellt von Sysmex Corp., stellt Vorrichtungen für Zähl-Immunassays zur Verfügung. Diese Serie ist geeignet, da ein einziger Apparat eine Gruppe von Vorgängen vom Mischen einer Probe mit einem Puffer bis zum Berechnen des Grads der Agglutination automatisch durchführen kann.
Die Bestimmung des Grads der Agglutination unter Verwendung eines Durchflusszytometers kann wie folgt durchgeführt werden:
Agglutinierte Partikel und nicht-agglutinierte Partikel, die in der vorbereiteten Assayprobe enthalten sind, werden nach und nach in einen laminaren Fluss einer Hüllflüssigkeit, gebildet in einer Durchflusszelle, extrudiert. Die Partikel treten einer nach dem anderen in einer Reihe durch das Zentrum der Durchflusszelle hindurch.
Die durch die Durchflusszelle hindurchtretenden Partikel werden mit Laserlicht bestrahlt. Nach dem Hindurchtreten durch die Durchflusszelle wird das Laserlicht durch einen Strahlstopper gestoppt. Nur vorwärts gestreutes Licht wird durch eine Photodiode aufgefangen. Als Laserlicht kann Licht mit einer Wellenlänge von 310 bis 1285 nm verwendet werden, z.B. 488 nm, 680 nm, 780 nm, 860 nm, 980 nm und dergleichen. Neben vorwärts gestreutem Licht kann seitwärts gestreutes Licht oder sowohl seitwärts gestreutes Licht als auch vorwärts gestreutes Licht als gestreutes Licht detektiert werden.
Wenn ein Partikel das Laserlicht kreuzt, wird ein gestreuter Lichtimpuls generiert, welcher eine Intensität entsprechend dem Volumen des Partikels hat. Der Impuls wird durch eine Lichtauffangeinheit aufgefangen. Üblicherweise wird der aufgefangene gestreute Lichtimpuls in einen elektrischen Impuls umgewandelt. Der elektrische Impuls stellt Informationen über die Teilchengrößenverteilung der Partikel zur Verfügung. D.h., der elektrische Impuls hat eine Intensität entsprechend dem Volumen des Partikels, welcher in das Laserlicht eintritt, welcher ein einzelner nicht-agglutinierter Partikel, zwei agglutinierte Partikel, drei oder mehr agglutinierte Partikel, eine Blutzelle selbst oder dergleichen sein kann.
Die elektrischen Impulse werden entsprechend ihrer Intensität unterschieden und nicht-agglutinierte Partikel und agglutinierte Partikel werden gezählt. Zum Zählen dieser Partikel wird ein Grenzwert zur Unterscheidung von nicht agglutinierten Partikeln und agglutinierten Partikeln auf Basis der Intensität des gestreuten Lichts bestimmt. Die nicht-agglutinierten Partikel und die agglutinierten Partikel ergeben gestreutes Licht von unterschiedlichen Intensitäten in Folge ihrer unterschiedlichen Größen und können voneinander unterschieden werden. Daher wird der Grenzwert zwischen den nicht-agglutinierten Partikeln und den agglutinierten Partikeln zur Unterscheidung der nicht-agglutinierten Partikel von den agglutinierten Partikeln gemäß der Intensität des gestreuten Lichts gesetzt.
Hier kann ein Grenzwert in situ zur selben Zeit, zu der das gestreute Licht der Assayprobe gemessen wird, gesetzt werden; kann nach Erhalt der Daten auf Basis der erhaltenen Daten gesetzt werden; oder kann im Vorhinein als geschätzter Grenzwert auf Basis bekannter Information, gesammelten früheren Daten oder dergleichen gesetzt werden. Insbesondere wird unter Berücksichtigung von Messfehlern und Reproduzierbarkeit der Grenzwert vorzugsweise in situ zur selben Zeit gesetzt, zu der das gestreute Licht der Assayprobe auf Basis der gemessenen gestreuten Lichtwerte gemessen wird.
Die nicht-agglutinierten Partikel und agglutinierten Partikel können voneinander unterschieden und in Bezug auf den Grenzwert gezählt werden, und der Grad der Agglutination kann berechnet werden.
Der Grad der Agglutination kann berechnet werden aus der oben erhaltenen Anzahl P der agglutinierten Partikel und der oben erhaltenen Anzahl M der nicht-agglutinierten Partikel unter allen gezählten Partikel, als Verhältnis der agglutinierten Partikel, welche an der Antigen-/Antikörper-Reaktion teilgenommen haben, d.h. P/(M + P), (M + P = T).
Wenn nicht zu zählende Partikel wie Chylomicrone in der Probe vorhanden sind, erscheint die Teilchengrößenverteilung dieser Partikel auch in jener der entsprechenden unlöslichen Trägerpartikel. In diesem Fall kann die Teilchengrößenverteilung der nicht zu zählenden Partikel durch Interpolation geschätzt werden unter Verwendung der Spline-Funktion, und kann von der Teilchengrößenverteilung umfassend sowohl die gewünschten Teilchen und die nicht zu zählenden Teilchen abgezogen werden. Dadurch kann ein ungefährer Korrekturwert nur der gewünschten Teilchen erhalten werden und für das Erhalten von genauen Zählungen der agglutinierten Partikel und der nicht-agglutinierten Partikel verwendet werden (siehe japanisches Patent Nr. 2912413).
In der vorliegenden Erfindung kann auch der Grad der Agglutination berechnet und dann die Konzentration des Antigens oder Antikörpers aus dem berechneten Grad der Agglutination erhalten werden.
Die Konzentration des Antigens oder Antikörpers kann unter Verwendung einer Standardkurve erhalten werden, welche im Vorhinein hergestellt wird durch Erhalt des Verhältnisses des Grads der Agglutination des Antigens oder Antikörpers zu einer bekannten Konzentration des Antigens oder Antikörpers (vorzugsweise werden eine Vielzahl von Graden der Agglutination mit unterschiedlichen Konzentrationen bestimmt).
In dem Fall, in dem ein Spektrophotometer für die Bestimmung verwendet wird, wird eine Vollblutprobe, ein Puffer und ein Latexreagenz gemischt, und unmittelbar danach wird die resultierende Mischung mit der wässrigen Lösung enthaltend das Erythrozyten-lysierende Mittel für die Hämolyse vermischt. Die hämolysierte Probe wird in eine Messzelle gegeben und mit Licht bestrahlt, um die Absorption zu messen. Die Wellenlänge des Lichts ist geeigneter Weise 600 bis 2000 nm. Die Absorption zu diesem Zeitpunkt wird als Absorption bei Zeit 0 angesehen (d.h. die Antigen-/Antikörper-Reaktion hat noch nicht stattgefunden).
Anschließend wird die Vollblutprobe, der Puffer und das Latexreagenz gemischt und für eine bestimmte Zeit reagieren gelassen. Die resultierende Mischung wird mit der wässrigen Lösung, enthaltend das Erythrozyten-lysierende Mittel, für die Hämolyse verdünnt. Die hämolysierte Probe wird in derselben Weise wie oben beschrieben gemessen. Der Grad der Agglutination kann aus dem Unterschied zwischen der erhaltenen Absorption und der Absorption bei Zeit 0 erhalten werden.
Beispiel
In diesem Beispiel wurde RANREAM HBsAg (hergestellt von Sysmex Corp.) zum Herstellen einer Probe verwendet, welche der Latexagglutination unterworfen und dann hämolysiert wurde. PAMIA-30 (hergestellt von Sysmex Corp.) wurde zur Bestimmung verwendet.
RANRIAM (registriert) HBsAg ist ein Reagenzkit zur Bestimmung von HBs-Antigen und umfasst ein Latexreagenz, einen Puffer, ein Probenverdünnungsmittel und einen Kalibrator, unter welchen das Latexreagenz und der Puffer in diesem Beispiel verwendet wurden. Das Latexreagenz ist eine 0,5% (Gewicht pro Volumen)-Suspension von 0,8 μm Polystyrollatex sensitiviert mit einem Anti-HBs-Antikörper.
10 μl Vollblut wurden mit 80 μl des Puffers (pH 6) gemischt und bei 45°C für eine Minute inkubiert. 10 μl des mit Anti-HBs-Antikörper sensitivierten Latexreagenz wurden hierzu hinzugefügt, um die Reaktion bei 45°C zu beginnen.
Etwa 20 Sekunden, nachdem die Reaktion gestartet wurde, wurden 19 μl der Reaktionsmischung mit 950 μl einer Hüllflüssigkeit (200 ppm Dodekylnatrimsulfat, 0,3 g/l wässrige Lösung von Natriumchlorid) in eine 51-fache Verdünnung gemischt, um Erythrozyten zu lysieren und eine Assayprobe vorzubereiten.
Die Assayprobe wurde in den optischen Detektor von PAMIA 30 eingeführt, um den Grad der Agglutination P/T (%) (T1) zu bestimmen.
Etwa 15 Minuten nachdem die Reaktion gestartet wurde, wurde der Grad der Agglutination P/T (%) (T2) in derselben Weise wie der Grad der Agglutination P/T (%) (T1) bestimmt, nachdem die Erythrozyten lysiert worden waren. T1 war der Grad der Agglutination in der Frühphase der Reaktion und wurde zur Bestimmung verwendet, ob die Probe innerhalb des Messbereichs war. Üblicherweise wird T2 als Grad der Agglutination (Agglutinationsverhältnis) der Probe verwendet.
Auf der anderen Seite wurde zum Vergleich als Stand der Technik-Beispiel die Vollblutprobe zunächst unter Verwendung eines Puffers enthaltend 10.000 ppm Dodekylnatriumsulfat, hämolysiert, welches notwendig ist zum Lysieren von Erythrozyten, und dann der Latexagglutination ausgesetzt.
Etwa 20 Sekunden nachdem die Reaktion gestartet worden war, wurden 19 μl der Reaktionsmischung mit 950 μl einer Hüllflüssigkeit (0,3 g/l wässrige Lösung Natriumchlorid) in eine 51-fache Verdünnung gemischt, um eine Assayprobe vorzubereiten.
Desweiteren wurde als Vergleichspunkt das Agglutinationsverhältnis (P/T) der Serumprobe bestimmt, ohne dass Dodekylnatriumsulfat in dem Puffer und in der Hüllflüssigkeit enthalten war.
Die Ergebnisse werden unten gezeigt.
Tabelle 1
Wie oben gezeigt wurde bestätigt, dass die Antigen-/Antikörper-Reaktion durch Interferenz des Tensids in dem Stand der Technik-Beispiel inhibiert wurde, während die Reaktion in der vorliegenden Erfindung nicht inhibiert und eine genaue Bestimmung realisiert wurde.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann, durch Verdünnen der Probe mit der das Tensid enthaltenden wässrigen Lösung, um Erythrozyten unmittelbar vor der Messung zu lysieren, die Antigen-/Antikörper-Reaktion ohne Interferenz durch das Tensid durchgeführt werden und eine hochsensitive Messung durchgeführt werden.

Claims

Vollblut-Immunassay, umfassend die Schritte: Mischen einer Vollblutprobe mit sensitisierten unlöslichen Trägerpartikeln, um ein Immunagglutination zu bewirken, Verdünnen der resultierenden Agglutinationsmischung mit einer wäßrigen Lösung, die ein Erythrozyten-lysierendes Mittel enthält, um Erythrozyten zu lysieren, wodurch eine Assayprobe bereitet wird, und Bestimmen des Grads an Agglutination in der Assayprobe.
Vollblut-Immunassay gemäß Anspruch 1, worin das Erythrozyten-lysierende Mittel ein Tensid ist.
Vollblut-Immunassay gemäß Anspruch 2, worin das Tensid Natriumdodecylsulfat ist.
Vollblut-Immunassay gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, welcher unter Verwendung eines Apparats für einen Zählimmunassay, der das Prinzip der Durchflußzytometrie verwendet, durchgeführt wird.
Vollblut-Immunassay gemäß Anspruch 4, des weiteren umfassend die Schritte: Einführen der Assayprobe, umfassend nicht agglutinierte Partikel und agglutinierte Partikel, in eine Durchflußzelle, Bestrahlen der Partikel, welche durch die Durchflußzelle hindurchtreten, mit Laserlicht, und Detektieren des dadurch erzeugten gestreuten Lichts, Setzen eines Grenzwerts zur Unterscheidung von nicht agglutinierten Partikeln und agglutinierten Partikeln in Bezug auf die Intensität des gestreuten Lichts, und Unterscheiden und Zählen der nicht agglutinierten Partikel und der agglutinierten Partikel in Bezug auf den Grenzwert, und Berechnen des Grads der Agglutination aus der Anzahl der nicht agglutinierten Partikel und der Anzahl der agglutinierten Partikel.
Vollblut-Immunassay gemäß Anspruch 5, worin der Grad der Agglutination berechnet wird durch die Anzahl der agglutinierten Partikel P/(die Anzahl der agglutinierten Partikel P + die Anzahl der nicht agglutinierten Partikel M).
Vollblut-Immunassay gemäß einem der Ansprüche 5 bis 6, worin das gestreute Licht vorwärts gestreutes Licht ist.
Vollblut-Immunassay gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die Größe der unlöslichen Trägerpartikel 0,1 bis 20 μm ist.
Vollblut-Immunassay gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, worin ein Mischungsverhältnis der verdünnten Vollblutprobe zu der Suspension der unlöslichen Trägerpartikel 5:1 bis 20:1 ist.
Immunassay gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, worin in der Immunagglutination der Vollblutprobe mit den unlöslichen Trägerpartikeln die Reaktionstemperatur zwischen 20 bis 50°C und die Reaktionszeit von 15 Sekunden bis 20 Minuten ist.