DE2204684A1 - Verfahren zum Nachweis von Antikörpern bzw. Antigenen in einer Körperflüssigkeit - Google Patents

Verfahren zum Nachweis von Antikörpern bzw. Antigenen in einer Körperflüssigkeit

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Roy Short Hills; Grunberg Emanuel North Caldwell; N.J.; Hager Hans Jacob New York N.Y.; Cleeland jun. (V.StA.)
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Description

Verfahren zum Nachweis von Antikörpern bzw. Antipenen in einer Körperflüssigkeit.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern bzw. Antigenen in einer Körperflüssigkeit und eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.
Die Diagnose von pathologischen oder anderen Zuständen in Menschen und Tieren wird oft unter Ausnützung von immunologischen Reaktionen durchgeführt, mit denen sich Antikörper bzw. Antigenen in den Körperflüssigkeiten des Lebewesens nachweisen lassen. Ein Antigen ist eine fremde Substanz, welche, wenn sie dem Lebewesen appliziert wird, die Bildung von gewissen löslichen und als Antikörper bezeichnete Substanzen bewirkt. Irgendeine fremde Substanz, wie z.B. ein Protein, welche normal nicht in einem bestimmten Lebewesen vorhanden ist, kann die Bildung von Antikörpern verursachen, wenn sie dem Lebewesen unter geeigneten Bedingungen appliziert wird.
Nach ihrer Bildung reagieren die Antikörper mit den, Antigenen und schützen auf diese Weise im Fall eines Bakterienoder Virus'-Fremdkörpers gegen Infektionen.
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Immunologische Testverfahren beruhen auf der Antigen-Antikörper-Reaktion,welche sich gewöhnlich durch Unlöslichkeit oder Agglutination der gebildeten Komplexe manifestiert.
Im allgemeinen wird die Anwesenheit eines Antigens bzw. eines Antikörpers dadurch nachgewiesen, dass man den entsprechenden Antikörper bzw. das entsprechende Antigen einer Körperflüssigkeit des Lebewesens, meistens Urin, Blutserum oder einen speziell behandelten Blutextrakt zugibt. Es können jedoch auch andere Körperflüssigkeiten verwendet werden. Man stellt die Anwesenheit des Antikörpers bzw. des Antigens dadurch fest, ob sich in der Körperflüssigkeit des Lebewesens ein unlöslicher Antigen-Antikörperkomplex gebildet hat oder nicht.
Weil einige Komplexe sich nur sehr langsam bilden und sehr geringe Teilchengrössen besitzen, müssen sie an einen Träger gebunden werden, um sie erkennen zu können. Als Träger wurden unter anderem Latexteilchen, wie z.B. Polystyrol, anionische phenolische Harze, fein verteilte diazotierte Aminocellulose und reaktive Latexteilchen verwendet. Bisher wurden die Agglutinationstests,in welchen die bereits vorstehend beschriebenen Trägerarten benützt wurden, ausschliesslich visuell ausgewertet, d.h. dass der Nachweis, ob tatsächlich eine oder keine Agglutination in dem Testsystem bzw. Testgemisch stattgefunden hatte, mittels des blossen Auges oder dem Mikroskop erfolgte. Jedoch ist in vielen Fällen eine visuelle Beobachtung des Auftretens des Agglutinationsphänomens schwierig und kann ohne oder auch selbst mit Hilfe eines Inkubators nur nach längerer Zeit erfolgen. Veiter verursacht in manchen Fällen eine unvollständige Beschichtung der Trägerteilchen falsche Reaktionen. Aus diesem Grund ist die optische Auswertung der Testmethode zeitraubend und führt leicht zu Fehlern.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, dieses bekannte Verfahren dahin fortzuentwickeln, dass ein schneller und sicherer Nachweis möglich wird, ob sich tatsächlich spezifische Agglutinationskomplexe mit den Latexträgerteilchen gebildet haben
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oder nicht. Ausserdem soll eine einfache und sichere quantitative Messung der gebildeten Antikörper- bzw. Antigenmengen ermöglicht werden.
Diese Aufgabe ist gemäss der Erfindung für ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern bzw. Antigenen in einer Körperflüssigkeit, bei dem in einem Testgemisch,das neben anderen Stoffen die Körperflüssigkeit, einen Träger und serologisch bestimmende Materialien enthält, Agglutinationskomplexe beobachtet werden, dadurch gelöst, dass als serologisch bestimmende Materialien, Antikörper bzw. Antigene verwendet werden, welche an einen serologisch inerten Latexträger mit einer Teilchengrösse von 0,05 bis 0,9/Umgebunden sind und dass die L:J.chtabsorption des Testgemisches nach dessen Aufteilung durch Lufteinschlüsse in Teilströme automatisch gemessen wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird in einem automatischen Analysator, in welchem Lichtabsorptionsmessungen in optischen Zellen, wie z.B. Kolorimeter, Spectralphotometer, Fluoreszenzmesser, Trübungsmesser und dgl. erfolgen, welcher dem für automatische diagnostische Verfahren üblicherweise benützten Technikon-Autoanalysator gleicht, durchgeführt. Obwohl jeder ähnliche Apparat, welcher die Reaktion der Antikörper mit den Antigenen und die Bildung einer Agglutination verursacht, sich für die Zwecke der Erfindung eignet, sind Apparate, welche eine Vorrichtung für die Trennung der Proben besitzen wie beispielsweise diejenigen, worin die Probenflüssigkeit durch Lufteinschlüsse aufgeteilt wird, bevorzugt. So ist z.B. aus der US-PS 2 797 149 ein System für die Trennung von Proben der Testmaterialien bekannt, worin an einem gewissen Punkt die flüssigen Testmaterialien, welche in den Apparat eintreten, durch Lufteinschlüsse getrennt werden. Die erzeugten aufeinanderfolgenden Flüssigkeitssegmente v/erden durch zwischenliegende Gassegmente getrennt, wodurch das durchflossene Röhrchen gereinigt und eine Vermischung der Proben verhindert wird.
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Eine Vorrichtung zur Durchführung der Erfindung kennzeichnet sich durch ein an sich bekanntes automatisch arbeitendes Lichtabsorptionsmessgerät, bei welchem die Probenflüssigkeit durch Lufteinschlüsse in Teilströme aufgeteilt wird und dass in dessen Messkuvette ein Testgemisch enthalten ist, das aus einem wässrigen Verdünnungsmittel einem mit einem serologisch bestimmenden Material gebundenen serologisch inerten Latexträger mit einer Teilchengrösse von 0,05 bis 0,9/um, und einem ladungsneutralisierenden Polymeren neben der Körperbzw. Probenflüssigkeit besteht.
Das System und das -Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglichen nicht nur die quantitative Messung des Agglutinationsgrades, sondern auch die Messung der Hemmung der Agglutination durch geeignete ungebundene Antigene oder Antikörper. Die Zeit, welche für die Agglutination einer gewissen Probe benötigt wird, hängt von der Komplexität des Systems ab, liegt jedoch in der Regel zwischen ungefähr 20 Sekunden und 3 oder 4 Minuten. Der Nachweis der Agglutination erfolgt in der Regel in ungefähr 3 bis 15 Minuten.
Die in der Vorrichtung durchgeführte Reaktion bezieht sich nur auf Antigene oder Antikörper, die mit serologisch inerten Trägern physikalisch und/oder chemisch gebunden werden können. Der Ausdruck "serologisch inerte Träger" umfasst wasserunlösliche feine Latexteilchen, welche serologisch inert sind, und an die ein Antigen oder ein Antikörper gebunden v/erden kann. Latexteilchen mit einer Teilchengrösse zwischen ungefähr 0,05 und 0,9 /um sind für die Zwecke der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt.
Besonders geeignete Träger sind Latexsuspensionen von z.B. polymerisierten Styrolharzen mit einer Teilchengrösse zwischen 0,05 und 0,9/um; Polymethacrylharze mit Teilchengrössen zwischen 0,07 und 0,9/um; Polystyrole, Kopolymere aus Butadien und Styrol, carboxylierte Kopolymere aus Styrol und Butadiene, carboxylierte Polystyrole, carboxylierte Polystyrole mit Amino-
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gruppen, Acrylsäurepolymere, Methcrylsäurepolymere, Mischpolymere aus Acrylonitril, Butadien und Styrol, Polyvinylacetatacrylate, Pölyvinylpyridine, Vinylchloridacrylate und dgl. mit Teilchengrössen zwischen 0,05 und 0,9/U.
Die TrägerteiJLchen können auf verschiedene Weise mit den serologisch bestimmenden Materialien beschichtet werden. Es können z.B. Polymerteilchen eines polymerisieren Styrollatex wie "Lytron 615" (Monsanto Chemical Company) benutzt werden. Die Polymerteilchen in der dispersen.Phase des Polystyrollatex und das geeignete serologisch bestimmende Material werden in einer auf einen pH Wert von 8,2 gepufferten, wässrigen Lösung vereinigt. Eine bevorzugte Pufferlösung enthält Glycin und Kochsalz. Schliessl'ich wird die Reaktionsmischung auf eine geeignete Verdünnung gebracht.
Der Ausdruck "serologisch bestimmende Materialien" bezieht sich auf solche Materialien, die für eine serologische Bestimmung von entscheidender Bedeutung sind, d.h. die Anwesenheit dieser Materialien ist der bestimmende Paktor im serologischen Testverfahren» Diese Materialien können in Körperfltissigkeiten von Mensch und Tier unter Verwendung von immunologischen Prinzipien nachgewiesen werden. Die vorliegende Erfindung umfasst alle serologisch bestimmende Materialien welche physikalisch und/oder chemisch an serologisch inerte Latexträgerteilchen gebunden werden können.
Besonders geeignete serologisch bestimmende Materialien sind isolierte Antikörper von Mensch und Tier, Seruinbestandteile, Toxine, Bakterien und Virus-Komponenten, Hormone, Enzyme, Alkaloide, Zoll und Gewebeextrakte, Substanzen mit kleinem Molekulargewicht wie z.B. Insulin, Angiotensin,
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Urollcinase usw. Ganz besonders "bevorzugte Materialien für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind menschliches Choriongonadotropin, menschliches Gammaglobulin, menschliches Albumin und Oammaglobulin vom Hind.
Die Menge von dem an den serologisch inerten Träger gebundenen serologisch bestimmenden Material beträgt in der Regel 0,01 bis 15»0 Gew.?£. Jedoch wird jedes einzelne serologisch bestimmende Material in einer Menge benützt, welche sich am zweckmässigsten erweist. Aue diesem Grund wird jedes Material mit dem Träger in einem Verhältnis kombiniert, welches sich für die spezifischen Anforderungen am besten eignet.
Die mit der erfindungsgemässen automatischen Vorrichtung verbundenen Messungen beruhen auf dem Auftreten von Agglutinationen die bei der Reaktion eines mit Antigen oder Antikörper beschichteten serologisch inerten Trägers mit dem entsprechenden Antikörper oder Antigen erzeugt werden.
Gemäss der vorliegenden Erfindung besteht das Reaktionsgemiach aus einem wässrigen Verdünnungsmittel, einem beschichteten Träger, der Test- bzw. Proben- bzw. Körperflüssigkeit und einem ladungsneutralisierenden Polymeren.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete wässrige Verdünnungsmittel kann V/asser, eine wässrige Kochsalzlösung oder eine wässrige Kochsalzlösung mit einem oberflächenaktiven Mittel sein. Die Mengen an Verdünnungsmittel beträgt 90 bis 99 Gew.# dee Systems.
Bes'onders bevorzugt ist ein Verdünnungsraittelsystera welcheo eine gleichaässige Agglutination verursacht.
Die tür die Zwecke der Erfindung besonders ge-
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eigneten Kochsalzlösungen enthalten 0,85 "bis 0,9 Gew.# Natriumchlorid und erwiinschtenfalls 0,3 ml/1 eines oberflächenaktiven Mittels.
Die erfindungsgemäss verwendeten oberflächenaktiven Mittel sind nicht-ionisch (neutral). Die von einem brauchbaren oberflächenaktiven Mittel geforderte Eigenschaft ist die Fähigkeit, die Reibung des Systems herabzusetzen und eine bessere Durchströmung zu bewirken.
Es hat sich herausgestellt, dass von den nicht-ionischen oberflächenaktiven Mitteln die als "Tweens" bezeichneten Polyoxyäthylensorbitan-Fettsäureester (Atlas Powder Company) am besten geeignet sind. Besonders bevorzugt ist PoIyoxyäthylensorbitanuionolaurat (Tween 20).
Es wurde weiter festgestellt, das z.B. bei der Diagnose von rheumaähnlicher Arthritis ein Verdünnungsmittel, welches aus einer Kochsalzlösung mit einem oberflächenaktiven Mittel besteht, dem Wasser vorzuziehen ist. In solch einem System betragen die bevorzugte Mengen an Kochsalz 0,85 Gew.% und die bevorzugte Menge an oberflächenaktivem Mittel 0,3 ml/l. Wenn Antikörper zu menschlichem Albuminserum gemessen werden, wird im Gegensatz hierzu Wasser als Verdünnungsmittel bevorzugt.
Die bereits beschriebenen beschichteten Träger können in verschiedenen Mengen vorhanden sein und zwar in Abhängigkeit von den Erfordernissen in den diagnostischen Tests, in welchen sie verwendet werden. Die<3 wird durch die Einheiten der optischen Dichte, die der geeigneten Grundlinie der optischen Dichte entsprechen, festgelegt. Im allgemeinen wird mit Vorteil eine Lösung mit einem Gewichtsverhältnis von einem Teil beschichtetem Latex bis 2,5?o Feststoffe) zu 3 bis 10 Teilen eines wässrigen
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Verdünnungsmittel verwendet, wodurch die erwünschte Grundlinie der optischen Dichte zwischen 0,9 und 0,7 optischen Dichteeinheiten (gemessen bei der verwendeten Wellenlänge) erreicht wird.
Die Testflüssigkeit wird in solchen Mengen benützt, die bei einer positiven Reaktion eine genügende Umsetzung des beschichteten Trägers mit dem Antigen oder dem Antikörper ergeben und eine optisch feststellbare Agglutination verursachen.
Man benützt in dem System einen polymeren Ladungsneutralisator um die abstossenden elektrischen Ladungen zwischen den beschichteten Teilchen teilweise zu neutralisieren. Dies ist notwendig, um eine maximale Agglutination zu gewährleisten. Das verwendete Polymere muss wasserlöslich sein, die Fähigkeit haben die Ladungen an den Reagenzien teilweise zu neutralisieren und darf nicht so viskos sein, dass es in seinen anwendbaren Konzentrationen eine unregelmässige Strömung oder eine Verstopfung des Systems verursacht.
Besonders geeignete wasserlösliche Polymere sind Polyvinylpyrrolidon M.G. 360 000, Carboxymethylcellulose, HydroxyäthyIcellulose und dgl.
Polyvinylpyrrolidon ist für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bevorzugt und kann in einer Menge von 1 bis 8 Qtev.fo benützt werden. Diese Menge kann für andere wasserlösliche Polymere variieren. Jedoch ist jede Menge anwendbar, solange sie nicht eine Viskosität des Systems die grosser ist als 107 Centipoise (gemessen in einem LVT Brookfield-Viscosimeter bei 250C unter Verwendung einer Drehspindel NO. 1 bei 30 üpm.) verursacht. Im Falle der Verwendung eines unvollständig beschichteten
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Trägers, was zu der Möglichkeit von störenden Nebenreaktionen führt, kann das System so eingestellt werden, dass nur die Hauptreaktion stattfindet und/oder gemessen wird. Dies kann z.B. dadurch erreicht werden, dass man die Konzentration des elektrisch neutralisierend wirkenden Polymeren herabsetzt, wodurch die schwächeren Nebenreaktionen unterdrückt werden und· nur die Hauptreaktion stattfindet.
Eine weitere Methode, um das System einzustellen, besteht in der Aenderung der Grosse der T-förmigen Abscheider wodurch die Grosse der für die Messung zur Verfügung stehenden Agglutinate kontrolliert wird.
Bei dem erfindungsgemässen Nachweis der Reaktion zwischen Antikörper und Antigenen wird der Agglutinationsgrad unter Verwendung einer Druchflussküvette und einer geeigneten photoelektrischen Zelle optisch gemessen.
Die Absorption der vor der Reaktion in dem System anwesenden unagglutinierten Teilchen wird mit derjenigen der agglutinierten Suspension verglichen und der Absorptionsunterschied mit einem geeigneten Registriergerät registriert. Die Wellenlänge, bei der die Lichtdurchlässigkeit (Absorption) gemessen wird, hängt von dem System ab, welches jeweils zur Untersuchung gelangt. In den automatischen Systemen, welche sich für die Messung der Agglutinate eignen, kann die Messung nach Entfernung der Agglutinate oder direkt ohne Entfernung der Agglutinate erfolgen* Die Erfindung wird anhand der folgenden Zeichnungen veranschaulicht.
Figur 1 ist eine schematische Zeichnung eines Apparates, wie er in einer Ausführungsform des Verfahrens verwendet· wird, in welchem bei der Messung der Lichtabsorption die Agglutinate in der Testflüssigkeit entfernt werden.
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Figur IA zeigt die optischen Dichten von verschiedenen Verdünnungen eines anti-menschlichen Albuminserums von der Ziege, die in dem durch Figur 1 veranschaulichten Apparat gemessen sind.
Figur IB beinhaltet eine graphische Darstellung der Mengen an anti-menschlichem Albuminserum von der Ziege.
Figur 2 1st eine schematische Zeichnung eines Apparates wie er in einer AusfUhrungsform des Verfahrens verwendet wird, in welcher bei der Messung der Lichtabsorption die Agglutinate in der Testflüssigkeit nicht entfernt werden.
Figur 2A zeigt die optischen Dichten von verschiedenen Verdünnungen eines anti-menschlichen Albuminserums von der Ziege, die in dem durch Figur 2 veranschaulichten Apparat gemessen 3ind.
Figur 2B beinhaltet eine graphische Darstellung der Mengen an anti-menschlichem Albuminserum der Ziege.
Figur 3 ist eine schematische Darstellung eines Apparates wie er in einer Ausführungsform des Verfahrens verwendet wird, in welcher die Lichtabsorption von Testflüssigkeiten, welche einer Hemmung der Agglutinationsreaktion unterworfen wurden, gemessen wird.
Figur 3A zeigt die in den Apparaten gemäsa Figur 3 und Figur 1 gemessenen optischen Dichten von verschiedenen Harnproben einscfclieeslich solcher, welche von schwangeren Frauen stammen und menschliches Choriongonadotropin enthalten.
In der durch Figur 1 veranschaulichten Ausfuiirungsform des Verfahrens wird die Latexsuspension kontinuierlich durch eine Dosierpumpe in eine T-förmige Abzweigstelle gefördert,
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zu der gleichzeitig die zu analysierenden Proben von einer Probenplatte gepumpt werden. Die Latex-Probe-Mischung wird dann mit einem wasserlöslichen ladungsneutralisierenden Polymeren an einer zweiten T-förmigen Abzweigstelle vermischt, wobei das Polymere ebenfalls kontinuierlich in das System gepumpt wird. Die entstandene Mischung wird dann an einer dritten T-förmigen Abzweigstelle durch Lufteinschliisse in Segmente aufgetrennt. Die auf diese Weise getrennten Proben werden dann in einer kleinen Mischspule vermengt. Beim Austreten aus der Mischspule wird den durch Lufteinschlüsse getrennten Proben Verdünnungsmittel zugegeben. Nach Durchfliessen einer weiteren Mischspule strömt die erhaltene Mischung in eine Absitzspule mit 2,5 Windungen. Beim Durchfliessen der Mischung durch die Spulen findet eine Abtrennung des entstandenen agglutinierten Latex statt. Fach Austreten aus der Absitzspule wird ein grosser Teil des Latexagglutinates im ersten T-förmigen Abscheider entfernt. Die restlichen Agglutinate durchfliessen dann eine Absitzspule mit 1,5 Windungen und weitere Agglutinate werden in einem zweiten T-förmigen Abscheider entfernt. Die übrigbleibenden Reagenzien werden mit zusätzlichem Verdünnungsmittel vermischt und durch eine Mischspule gefördert. Die Suspension wird dann entlüftet, durch eine zweite Dosierpumpe gefördert, durch Lufteinschlüsse in Segmente aufgetrennt, durch eine Mischspule gepumpt und entlüftet. Schliesslich strömt die erhaltene Suspension durch eine Durchflussküvette, worin die Absorption mittels einer photoelektrischen Zelle gemessen wird, und die Ergebnisse werden in Einheiten optischer Dichte oder Prozenten Lichttransmission in einem geeigneten Registriergerät registriert. Eine positive Reaktion der Probe wird durch die wegen der Entfernung dor Agglutinate in den T^förmigen Abscheidern verursachte Erniedrigung der Latexkonzentration veranschaulicht
Die in Figur 2 schematisch dargestellte Ausführungsform 209834/0804
dee Verfahrens unterscheidet sich von derjenigen gemäss Figur 1 nur durch die Messung des Absorptionsunterschieds zwischen den agglutinierten und den nicht-agglutinierten Teilchen, wobei die Messung direkt an der durch eine geeignete photoelektrische Zelle hindurchströmenden Suspension erfolgt. Die Latexsuspension wird kontinuierlich durch eine Dosierpumpe in eine T-förmige Abzweigstelle gefördert, zu der gleichzeitig die zu analysierende Probe von einer Probenplatte gepumpt wird. Die Latex-Probe-Mischung wird dann mit einem wasserlöslichen ladungsneutralisierenden Polymeren an einer zweiten T-förmigen Abzweigstelle vermischt, wobei das Polymere ebenfalls kontinuierlich in das System gepumpt wird. Die entstandene Mischung wird dann an einer dritten T-förmigen Abzweigstelle durch Lüfteinschlüsse in Segmente aufgetrennt. Die auf diese Weise getrennten Proben werden dann in einer kleinen Mischspule vermengt. Beim Austreten aus der Mischspule wird den durch Lufteinschlüsse getrennten Proben Verdünnungsmittel zugegeben. Die erhaltene Suspension strömt durch eine weitere kleine Mischspule. Die Suspension wird dann entlüftet und strömt durch eine Durchflussküvette, worin die Absorption mittels einer photoelektrischen Zelle gemessen wird, und die Ergebnisse werden in Einheiten optischer Dichte oder Prozenten Lichttransmission in einem geeigneten Registriergerät registriert. Eine positive Reaktion der Probe wird durch die Anwesenheit von Agglutinaten veranschaulicht.
Das in Figur 3 schematisch dargestellte automatische System, das auf der Hemmung der Agglutination beruht, kann in einem Apparat welcher denjenigen der vorher erwähnten Systemen gleicht, durchgeführt werden. Jedoch ist diese Pieaktion etwas verschieden, wie nachstehend beschrieben wird. In der Agglutination-Hemmungs-Reaktion wird ein bekanntes Antigen oder Antikörper kontinuierlich in das System gepumpt. Die Probe, deren Hemmungsfähigkeit für die Reaktion
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analysiert werden soll, wird aus einem Probennehmer gepumpt und an einer ersten I-förmigen Abzweigstelle mit dem Antigen oder dem Antikörper vermischt. Ein wasserlösliches ladungsneutralisierendes Polymeres wird kontinuierlich in das System gepumpt und mit der Probe-Antigen·" oder Probe-Antikörper-Mischung an einer zweiten T-förmigen Abzweigstelle vermengt. Die Latexteilchen-Suspension, welche mit dem entsprechenden Antikörper oder Antigen zu dem bekannten Antigen oder Antikörper beschichtete Latexteilchen enthält, wird kontinuierlich in das System gefördert und an einer dritten T-förmigen Abzweigstelle mit den anderen Reagenzien vermischt. Die Suspension wird an einer vierten T-förmigen Abzweigstelle durch Lufteinschlüsse in Segmente aufgetrennt und der weitere Vorgang verläuft wie in Figur 1 oder 2-beschrieben. Die Ergebnisse werden in Einheiten optischer Dichte oder Prozenten Lichttransmission in einem geeigneten Registriergerät registriert. In diesem System wird eine positive Reaktion der Probe dadurch veranschaulicht, dass keine oder eine geringere Agglutination auftritt als in der Kontrollreaktion, in welcher das bekannte Antigen oder der bekannte Antikörper die mit dem entsprechenden Antikörper oder Antigen beschichtete Latexteilchen-Suspension agglutiniert.
Die Erfindung wird an, Hand der nachstehenden Beispiele veranschaulicht.
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Beispiel 1
Menschliches Albuminserum wird wie folgt an Teilchen, welche aus einem carboxylierten Kopolymeren aus Butadiene und Styrol bestehen, gebunden,
2 ml einer 6$igen Suspension von menschlichem Albumin werden mit 50 ml destilliertem Wasser verdünnt und während 10 Minuten gerührt. Es werden 8 ml eines carboxylierten Kopolymeren aus Butadiene und Styrol, sowie 50$ Feststoffe (Dow 816) zugesetzt und weitere 37 ml eines 0,1 M Phosphatpuffers vom pH-Wert 5,5 zugegeben. Die Mischung wird während 10 Minuten gerührt und es werden 160 ml einer l^igen wässrigen Lösung von 1-Cyclohexyl-3-[2-morpholinyl-(4)äthyl]-carbodiimide-metho-p-toluolsulfonat zugefügt. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt; Das Produkt wird durch Zentrifugieren in Form einer tonartigen weissen Masse, welche aus Teilchen mit einer Teilchengrösse von ungefähr 0,2 μ besteht, ein spezifisches Gewicht von 1,01 besitzt und 10 Gew.% menschliches Albumin enthält, zurückgewonnen.
Das Produkt wird in einer 0,85#igen wässrigen Kochsalzlösung (Gewichtsverhältnis 1:10) suspendiert. Diese Latexsupsension wird durch eine Dosierpumpe mit einer Strömungs- · geschwindigkeit von 0,1 ml/min in eine T-fönaige Abzweigstelle gefördert, zu welcher gleichzeitig eine zu analysierende verdünnte Probe von anti-menschlichem Albumin-Serum von der Ziege von einer Probeplatte mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,1 ml/min gepumpt wird. Die Latex-Probe-Mischung wird dann mit einer 4 Gew.% Polyvinylpyrrolidon (M.G 360 000) enthaltenden wässrigen Lösung an einer zweiten T-fc5rmigen Abzweigstelle vermischt, wobei die Polyvinylpyrroliuon-Lösung kontinuierlich mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,1 ml/min in das System gepumpt wird. Die entstandene Mischung
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wird dann an einer dritten T-förmigen Abzweigstelle durch Lufteinschlüsse in Segmente aufgetrennt. Die auf diese Weise getrennten Proben werden dann in einer Mischspule mit 6 Windungen vermengt. Beim Austreten der Probe aus der Mischspule wird an einer vierten T-förmigen Abzweigstelle Wasser als Verdünnungsmittel zugegeben. Nach Durchfliessen einer Mischspule mit 14 Windungen strömt die erhaltene Mischung in eine Absitzspule mit 2,5 Windungen. Beim Durchfliessen der Mischung durch die Absitzspule findet eine Abtrennung des entstandenen mit Albumin beschichteten agglutinierten Latex statt. Nach Austreten aus der Absitzspule wird ein grosser Teil der Agglutinate in einem ersten anschliessenden T-förmigen Abscheider entfernt. Die restliche Agglutinate durchfliessen dann eine Absitzspule mit 1,5 Windungen und weitere Agglutinate werden in einem zweiten T-förmigen Abscheider entfernt. Die übrigbleibenden Reagenzien werden mit zusätzlichem Wasser vermischt und durch eine Mischspule mit 14 Windungen gefördert.. Die entstandene Suspension wird dann entlüftet, durch eine zweite Dosierpumpe gefördert, durch Lufteinschlüsse in Segmente aufgetrennt und durch eine Mischspule mit 14 Windungen gepumpt. Die Suspension wird dann entlüftet, strömt durch eine Durchflussküvette, worin die Absorption mittels einer photoelektrischen Zelle bei 420 nm gemessen wird und die Ergebnisse werden in eirem geeigneten Registriergerät registriert. Eine Erniedriegung der Latexkonzentration zeigt das Vorliegen einer positiven Reaktion an.
Beispiel 2
Menschliches Choriongonadotropin wird wie folgt an Teilchen, welche aus einem carboxyliertem Kopolymeren von Butadiene und Styrol bestehen, gebunden.
377 000 internationale Einheiten von menschlichem Choriongonadotropin-Pulver werden in 65 ml einer sterilen
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— JLo —
Salzlösung gelöst, während 1 Stunde auf 800C erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. 60 ml de? gekühlten, menschliches Choriongonadotropin enthaltenden Lösung werden schnell in einen Reaktionskolben, welcher 500 ml carboxyliertes Latex aus Styrol und Butadiene (Dow. No. 816) mit einem pH-Wert von 9,3, einem spezifischen Gewicht von 1,030 und einer Viskosität von 100 Cps(gemessen in einem Brookfield No. 1 bei 20 Upm.) enthält, gegossen. Die Latexkonzentration wird auf 78-82 mg/ml eingestellt. Sobald das menschliche Choriongonadotropin gleichmässig im Latex verteilt ist, wird eine Lösung von 1,8 g l«*Cyclohexyl-3-[2-morpholinyl (4)-äthyl]-carbodiimid~metho-p-toluolsulfonat in 180 ml Wasser zugegeben. Die Reagenzien werden während 2 Stunden bei Raumtemperatur gemischt und danach bei 25 000 g und bei 100C zentrifugiert.
Die überstehende Lösung wird abgegossen und die erhaltenen Latexkugeln während 10 Minuten in ungefähr 400 ml Wasser gemahlen und bei 100C während 1,5 Stunden bei 25 000 g zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird dann verworfen und die Kugeln in 400 ml eines Puffere, welcher 0,1 M Tris-HCl, 0,85$ NaCl und O,1Mf-Amino-n-capronsäure enthält und ein pH-Wert von 8,2 besitzt, erneut suspendiert. Die gepufferte Mischung wird gemahlen und bei 100C während 1,5 Stunden bei 25 000 g zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird abgegossen und die Latexkugeln zurückgewonnen* Die Kugeln besitzen eine durchschnittliche Grosse von ungefähr 0,20-0,25 μ, enthalten 0,75 Gew.$ menschliches Choriongonadotropin und haben ein spezifisches Gewicht von 1,01.
Das Produkt wird in einer 0,85$igen, 0,3 ml/l Tween (6 Tropfen/l) enthaltenden wässrigen Kochsalzlösung (Gewichtsverhältnis 1:2,5) suspendiert.
Eine Harnprobe wild mit einer Strömungsgeschwindigkeit 209834/0804
von 0,1 ml/min von einer Probenplatte in eine T-förmige Abzweigstelle gefördert undmit einem mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,1 ml/min in die Abzweigstelle gepumpten, anti-menschlichen Choriongonadotropin-Serum (im Verhälnis von 1:100 in einer 0,85#igen wässrigen Kochsalzlösung) vermengt. Eine 4$ige wässrige Polyvinylpyrrolidonlösung mit 0,85$ Kochsalz wird kontinuierlich mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,1 ml/min in das System gepumpt· und mit der ProlDe-Antiserum-Mischung an einer zweiten T-förmigen Abzweigstelle vermischt. Die Suspension von menschlichem Choriongonadotropin-Latex wird kontinuierlich mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,1 ml/min in das System gepumpt und mit den anderen Reagenzien an einer dritten T-förmigen Abzweigstelle vermengt. Die entstandene Mischung wird dann in einer vierten T-förmigen Abzweigstelle durch Lufteinschliisse in Segmente aufgetrennt.
Die auf diese Weise getrennten Proben werden dann in einer Mischspule mit 6Windungen vermischt. Beim Austreten der Probe aus der Mischspule wird mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,60 ml/min eine wässrige 0,85#ige Kochsalzlösung, welche 6 Tropfen Tween 20/1 enthält, als Verdünnungsmittel zugegeben,
Nach Durchfliesaen einer Miechapule mit 14 Windungen strömt die erhaltene Mischung in eine Absitzspule mit 2,5 Windungen. Beim Durchfliessen der Misohung durch die Absitzspule findet eine Abtrennung der entstandenen mit menschlichem Choriongonadotropin beschichteten agglutinierten Latexsusponsion statt. Nach Austreten des Latex aus der Absitzspule wird ein grosser Teil der Agglutinate in einem ersten anschliessendcn T-förmigon Abscheider entfernt. Die restliche Agglutinate durchfliessen dann eine Absitzspule mit 1,5 Windungen und weitere Agglutinate werden in einem zweiten T-förmigen Abscheider entfernt. Die übrigbleibenden
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Reagenzien werden mit zusätzlicher Kochsalzlösung verdünnt und durch eine Mischspule mit 14 Windungen gefördert. Die entstandene Suspension wird dann entlüftet, durch eine zweite Dosierpumpe gefördert, durch Lufteinschlüsse in Segmente getrennt und durch eine Mischspule mit 14 Windungen gepumpt. Die Suspension wird dann entlüftet, strömt durch eine Durchflussküvette, worin die Absorption mittels einer photoelektrischen Zelle bei 505 nm gemessen wird, und die Ergebnisse werden in einem geeignetem Registriergerät registriert. Eine Erhöhung der Latexkonzentration veranschaulicht eine positive Reaktion.
Beispiel 5
Menschliches Albumin, welches wie in Beispiel 1 an ein carboxyliertes Kopolymeres aus Butadiene und Styrol gebunden ist, wird (Gewichtsverhälnis 1:10) in einer 0,85$igen, 0,3 ml/1 Tween 20 (6 Tropfen/l) enthaltenden wässrigen Kochsalzlösung suspendiert. Die Suspension wird durch eine Dosierpumpe kontinuierlich mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,1 ml/min an eine T-förmige Abzweigstelle gefördert, zu der gleichzeitig eine zu analysierende Probe von antimenschlichem Albumin-Serum von der Ziege von einer Probenplatte mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,1 al/rnin gepumpt wird. Die Latex-Probe-Misohung wird dann sit einer 0,85$ Kochsalz und 4 Gew,# Polyvinylpyrrolidon enthaltenden Lösung an einer zweiten Τ-förmigen Abzweigstelle vermischt, wobei die Polyvinylpyrrolidonlösung kontinuierlich mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,1 ml/min in das System gepumpt wird. Die entstandene Mischung wird dann an einer dritten T-förmigen Abzweigstelle durch Lüfteinschlüsse in Segmente aufgetrennt. Die auf diese Weise getrennten Proben werden dann in einer Mischspule mit 6 Windungen vermengt. Beim Austreten der Probe aus der Mischspule wird Wasser mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 1,6 ml/min zugegeben.
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Die entstandene Suspension wird dann durch eine andere Mischspule mit 6 Windungen gefördert. Schliesslich wird die Suspension entlüftet, strömt durch eine Durchflussküvette, worin die Absorption mittels einer photoelektrischen Zelle bei 420 mn gemessen wird, und die Ergebnisse werden in einem geeigneten Registriergerät registriert.
Beispiel 4
Menschliches Gammaglobulin wird wie folgt an Teilchen, welche aus einem carboxylierten Kopolymeren von Butadiene und Styrol bestehen, gebunden:
Gammaglobulin (Cohn Fraktion II) wird in einer Konzentration von Ufo in destilliertem Wasser suspendiert und über Nacht durch einen magnetischen Rührer gerührt. Die Mischung wird dann bei 10 000 Upm während 30 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird dann abgegossen und filtriert.
214 ml der filtrierten Gammaglobulin-Lösung werden mit 107 ml einer wässrigen Suspension, welche Polystyrol (40$ Peststoffe; Monsanto Lytron 612) in einem Verhältnis von 1:10 enthält, vermischt und in einem Wasserbad bei einer Temperatur von 560C während 60 Minuten gerührt. Das entstandene Produkt wird nach 20 minutigem Zentrifugieren bei 20 000 Upm., zurückgewonnen. Die überstehende Lösung wird abgegossen und die erhaltene Masse wird nochmals in destilliertem Wasser suspendiert, wobei das Volumen der Suspension 320 ml betrögt. Die Latexsuspension wird wieder bei 20 000 Upm« während 20 Minuten zentrifugiert. Die zentrifugierte Lösung wird abgegossen und die Latexteilchen nochmals in 320 ml wässrigem 0,1 M Txus-KCl-Puffer vom pK-V/ert 8,2, vielcher 0,855° Kochsalz enthält, suspendiert. Die Latexteilchen werden durch zwei zusätzliche Zentrifugierungen von 20 Minuten bei 20 000 Upm. gereinigt, wobei jedesmal 320 ml frisches
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Kochsalz enthaltender Tris-Puffer vom pH-Wert 8,2 verwendet werden.
Das Produkt wird nach 20 niinutigem zentrifugieren bei 20 000 Upm. zurückgewonnen, in einem kleinen Yolumen von Tris-Puffer gemahlen und in einem Gesamtvolumen von 320 ml Trispuffer vom pH-Wert 8,2, welcher Kochsalz und 0,01$ Thimerasol als Konservierungsmittel enthält»suspendiert.
Die Latexsuspension wird kontinuierlich durch eine Dosierpumpe mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,1 ml/min an eine T-förmige Abzweigstelle gefördert, zu der gleichzeitig eine auf den Rheumatoidfaktor zu analysierende menschliche Serumprobe mit einer Strömungsgeschwidigkeit von 0,1 ml/min von einer Probenplatte gepumpt wird.
Vor der Analyse werden die Serumproben auf das Zehnfache mit einer Kochsalzlösung verdünnt. Die Latex-Probe-Mischung wird dann mit einer 0,5 Gew.$ Hydroxyäthylcellulose enthaltenden wässrigen Lösung, welche mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 0,1 ml/min kontinuierlich an eine zweite T-förmige Abzweigstelle gepumpt wird, vermengt. Die entstandene Mischung wird dann an einer dritten T-förmigen Abzweigstelle durch Lufteinschlüsse in Segmente aufgetrennt. Die auf diese Weise getrennten Proben werden dann in einer Mischspule mit 6 Windungen vermischt und der weitere Vorgang verläuft wie in Beispiel 1 beschrieben, wobei die Lichtabsorption bei 505 nm gemessen wird. Eine Erniedrigung der Latexkonzentration veranschaulicht eine positive Reaktion
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Claims (15)

  1. Patentansprüche
    /i.) Verfahren zum Wachweis von Antikörpern bzw. Antigenen in einer Körperflüssigkeit, bei dem in einem Testgemisch,das neben anderen Stoffen die Körperflüssigkeit, einen Träger und serologisch bestimmende Materialien enthält, Agglutinationskomplexe beobachtet werden, dadurch gekennzeichnet , dass als serologisch bestimmende Materialien, Antikörper bzw. Antigene verwendet, werden, welche an einen serologisch inerten Latexträger mit einer Teilchengrösse von 0,05 bis 0,9/um gebunden sind und dass die Lichtabsorption des Testgemischs nach dessen Aufteilung durch Lufteinschlüsse in Teilströme automatisch gemessen wird.
  2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als serologisch bestimmendes Material menschliches Choriongonadotropin verwendet ist.
  3. 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als serologisch bestimmendes Material menschliches Albumin-Serum verwendet ist.
  4. 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als serologisch bestimmendes Material menschliches Gammaglobulin verwendet ist.
  5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , dass die Lichtabsorption von Probenflüssigkeiten nach Entfernung der Agglutinate gemessen wird.
  6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , dass die Lichtabsorption von Probenflüssigkeiten ohne Entfernung der Agglutinate gemessen wird.
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  7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet , dass die Lichtabsorption von Proben- 'flüssigkeiten, welche einer Hemmung der Agglutinationsreaktionen unterworfen wurden, gemessen wird.
  8. 8. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7, gekennzeichnet durch ein an sich bekanntes automatisch arbeitendes Lichtabsorptionsmessgerät, bei welchem die Probenflüssigkeit durch Lufteinschlüsse in Teilströme aufgeteilt wird, und dass in dessen Messkuvette ein Testgemisch enthalten ist, das aus einem wässrigen Verdünnungsmittel,· einem mit einem serologisch bestimmenden Material beschichteten inerten Latexträger mit einer Teilchengrösse von 0,05 bis 0,9/um gebunden ist, un'd einem laäungsneutralisierenden Polymeren neben der Körper- bzw. Probenflüssigkeit besteht.
  9. 9. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzei chn e t , dass das wässrige Verdünnungsmittel eine 0,85 bis 0,90 Gew9<> Natriumchlorid enthaltende wässrige Kochsalzlösung ist.
  10. 10. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzei chn e t , dass das wässrige Verdünnungsmittel eine 0,85 bis 0,90 Gev% Natriumchlorid und ungefähr 0,3 ml/1 eines oberflächenaktiven Mittels enthaltende wässrige Kochsalzlösung ist.
  11. 11. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzei chn e t , dass das wässrige Verdünnungsmittel reines V/asser ist.
  12. 12. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet , dass das ladungsneutralisierende Polymere Polyvinylpyrrolidon mit einem Molekulargewicht von 360 000 ist.
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  13. 13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet , dass das serologisch bestimmende Material menschliches Choriongonadotropin ist.
  14. 14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet , dass das serologisch bestimmende Material menschliches Gammaglobulin ist.
  15. 15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet , dass das serologisch bestimmende Material menschliches Albuminserum ist.
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    Lee rseite
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