DE3033869C2

DE3033869C2 - Verfahren zum Nachweis einer immunologischen Agglutinationsreaktion

Info

Publication number: DE3033869C2
Application number: DE3033869A
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Kunitachi Tokyo Takekawa
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1979-09-10
Filing date: 1980-09-09
Publication date: 1982-11-25
Also published as: DE3033869A1; JPS6222428B2; US4457893A; JPS5639465A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis einer immunologischen Agglutinationsreaktion gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Als Beispiel für ein bekanntes Verfahren zum Nachweis einer immunologischen Agglutinationsreaktion wird im folgenden kurz auf die US-PS 38 83 3C8 eingegangen. Dieses Verfahren besteht darin, daß man bestimmte Mengen einer zentrifugierten Suspension einer zu untersuchenden Blutprobe, enthaltend 2 bis 5% Blutkörperchen und ein spezifisches Antiserum in ein Reaktionsgefäß mit einem runden Boden gibt, die Suspension und das Antiserum bewegt, das Reaktionsgefäß stehen läßt, eine Zentrifugal-Präzipitation durchführt, das Reaktionsgefäß in bestimmte schneie Schüttelbewegungen versetzt, um die präzipierten bzw. ausgefällten Blutkörperchen wieder zu dispergieren, das Reaktionsgefäß verhältnismäßig langsam bewegt, um die Agglutinate im Mittelteil des Bodens des Reaktionsgefäßes zu sammeln, um ein Agglutinationsmuster am Boden des Reaktionsgefäßes zu erhalten, und das Agglutinationsmuster fotometrisch nachweist. Das Verfahren beruht auf dem Phänomen, daß nach dem oben erwähnten Aufschütteln und verhältnismäßig langsamen Bewegen Teilchen, die durch Agglutination miteinander verbunden sind, sich schnell im Mittelteil des Reaktionsgefäßes ansammeln, während nicht agglutinierte Teilchen wieder in Form einer Suspension dispergiert werden und sich nicht im Mittelteil des Reaktionsgefäßes ansammeln. Um das Agglutinationsmuster im Mittelteil des Bodens des Reaktiongefäßes nachzuweisen, werden Nephelometrie oder Opazitätsbzw. Transmissionsmessungen angewandt. Wenn der Lichtstrahl nämlich durch die Suspension hindurchgeht, variiert der Grad der Lichtabsorption in Abhängigkeit von der Dichte der Blulkötperchen, die zwischen der Oberfläche der Suspension und dem Boden des Reaktiongefäßes suspendiert sind, wobei diese Änderung der Lichtabsorption fotoelektrisch gemessen wird als unterschiedlicher Trübungsgrad. Insbesondere ist nach dem Beispiel der Fig. 33 der US-PS 38 83 308 der Lichtstrahl von oben auf das Reaklionsgefäß gerichtet, to das einen durchsichtigen bzw. transparenten runden Boden besitzt, und eine Maske oder Bodenplatte mit einer mittleren öffnung und einer ringförmigen öffnung um die mittlere Öffnung herum ist so unterhalb des Reaktionsgefässes angeordnet, daß Licht, das durch die mittlere öffnung hindurchtritt auf ein erstes lichtaufnehmendes (lichtempfindliches) Element auftrifft, während Licht, das durch die kreisförmige öffnung kommt, durch eine Linse auf ein zweites lichtaufnehmendes Element auftritt So gibt die Lichtmenge, die auf das erste lichtaufnehmende Element auftrifft nach Durchgang durch den Mittelteil des Reaktionsgefäßes, die Trübung im Mittelteil der zu analysierenden Suspension an, während die Lichtmenge, die auf das zweite lichtaufnehmende Element nach Durchgang durch den peripheren Teil des Reaktionsgefäßes auftrifft, die Trübung im peripheren bzw. Randteil der zu untersuchenden Suspension angibt. Wenn infolgedessen die Lichtmenge, die durch den Mittelteil der zu untersuchenden Suspension hindurchgeht, abnimmt gegenüber dem Vergleichswert und gleichzeitig die Lichtmenge, die durch den peripheren Teil der Suspension hindurchgeht, zunimmt gegenüber dem Vergleichswert, stellt man ein »Vorliegen von Agglutination« fest. Wenn andererseits die Lichtmengen, die durch den Mittelteil und den Randteil der zu untersuchenden Suspension hindurchgehen, gegenüber dem Verglcichswert unverändert bleiben wird »Abwesenheit von Agglutination« festgestellt.

Das übliche Verfahren zum s^achweis und zur Bestimmung eines Agglutinationsmusters, wie es beispielhaft in der US-PS 38 83 308 angegeben ist, besitzt verschiedene Nachteile: Die Vergleichsv/erte für die Lichtmengen die auf das erste und zweite lichtempfindliche Element auftreffen, müssen geeicht und eingestellt werden mit Hilfe geeigneter Vergleichs-Agglutinationsmuster. Durch diese Eichung und Einstellung wird das Bestimmungsverfahren mühsam. Außerdem ist das Vergleichs-Agglutinationsmuster nicht notwendigerweise identisch mit den tatsächlichen Agglutinationsmustern der zu untersuchenden Suspensionen, so daß die Abweichung der Vergleichs-Agglutinationsmuster von den tatsächlichen Agglutinationsmustern zu Fehlern bei der Bestimmung des Auftretens oder nicht-Auftretens von Agglutination führen können. Darüber hinaus muß nach dem bekannten Verfahren vermieden werden, daß ein Teil des Lichtes, das auf den Randteil der Suspension auftrifft und das durch darin enthaltene Teilchen gestreut wird, das erste lichtempfindliche Element durch die mittlere Öffnung der Maske oder der Bodenplatte erreicht und außerdem muß vermieden werden, daß ein Teil des Lichtes, das auf den Mittelteil der Suspension auftifft und von darin enthaltenen Teilchen gestreut wird, das zweite lichtempfindliche Element durch die kreisförmige Öffnung der Maske oder der Bodenplatte erreicht. Folglich müssen die Maske oder Bodenplatte und das erste und zweite lichtempfindliche Element so konstruiert und angeordnet sein, daß die oben erwähnten Anforderungen erfüllt sind. Dadurch wird

die Konstruktion und Anordnung des optische Systems zum Nachweis der Lichtabsorption kompliziert und schwierig herzustellen.

Ein weiteres Verfahren zum Nachweis einer immunologischen Agglutinationsreaktion ist in der DE-AS 15 23 058 beschrieben. Bei diesem Verfahren, bei der" rote Blutkörperchen mit einem Antiseram agglutiniert werden, wird nach Hämolyse der nicht agglutinierten roten Blutkörperchen eine Lichtabsorptionsmessung an der überstehenden Flüssigkeit durchgeführt.

Es isi Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Nachweis einer immunologischen Agglutinationsreaktion zur Verfügung zu stellen, daß den leichten und genauen Nachweis einer immunologischen Agglutinationsreaktion mit Hilfe einer auf einfache Weise arbeitenden Vorrichtung mit einfacher Konstruktion ermöglicht.

Diese Aufgabe wird durch das im Anspruch 1 gekennzeichnete Verfahren gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen dieser Lösung ergeben sich aus den Ansprüchen 2—5.

Bei immunologischen, insbesondere serologischen Agglutinationsreaktionen sind Antikörper, die an den Reaktionen teilnehmen, im allgemeinen Immungiobuline wie I_gG, I_gM und I_gA, die Proteine sind. Es ist bekannt, daß Proteine eine starke Lichtabsorptionsfähigkeit für Licht mit Wellenlängen von 190 und 280 nm besitzen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Lichtabsorptionen sowohl von dem flüssigen Medium, das den zu messenden Antikörper enthält, als auch der überstehenden Flüssigkeit, nach dem die Antigen-Antikörperreaktion stattgefunden hat, gemessen mit Hilfe von Licht, das aufgrund seiner Wellenlänge von dem Antikörper selektiv absorbiert wird, so daß die Agglutinationsreaktion nachgewiesen wird aufgrund des Unterschieds zwischen den beiden Absorptionen. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird nicht direkt das Agglutinationsmuster nachgewiesen, wie bei dem bekannten Verfahren nach der US 38 83 308, so daß das optische System für die Fotometriemessung vereinfacht wird und kein Vergleichs-Agglutinationsmuster erforderlich ist.

Ferner kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Antigen-Antikörper-Reaktion einfach mit Hilfe einer üblichen Zentrifuge durchgeführt werden oder sogar in einem stillstehenden Reaktion!;s;efäß. Dadurch wird das Verfahren zum Nachweis einer immunologischen Agglutinationsreaktion wesentlich vereinfacht.

Die Erfindung wird im folgenden durch Ausführungsbeispiele anhand der Zeichnungen näher erläutert, dabei ist

Fig. 1 eine schematische Darstellung der einzelnen Stufen, die bei einem Verfahren zum Nachweis einer immunologischen Agglutinationsreaktion durchgeführt werden,

Fig. 2 eine schematische Darstellung einer zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeigneten Vorrichtung und

Fig. 3 eine schematische Darstellung einer anderen geeigneten Vorrichtung.

In Fig. 1, die die einzelnen Stufen des Verfahrens zeigt, ist 1 eine Spritze, die mit einem Serumbehälter 2 verbunden ist und mit deren Hilfe eine bestimmte Menge Serum 3 aus dem Behälter 2 entnommen und in das Reaktionsgefäß 4 übergeführt werden kann. Bei dor im Bild gezeigten Vorrichtung ist das Reaktionsgefäß 4 ein durchsichtiges Reagenzglas. Die Lichtabsorption (OD\) dieses Serums 3 wird durch die Wand des Reaktionsgefäßes 4 gemessen z. B, bei einer Weiienlänge von 280 nm.

;~· s Reak;ionsgefäß 4 ist aus einem rvirftena!

hei jt-äteiii das für die angewandte Wellenlänge eine hohe Transparenz besitzt bei Anwendung von Licht mit eu,£i V.'ellen'Snge .On 280 nm, vorzugsweise aus Qu&n.

Nachdem die Lichtabsorption des Serums gemessen

worden ist, wird mit einer anderen Spritze 5 die Lösung 6, die Antigenteilchen wie Erythrozyten enthäit (im

ίο folgenden als »Antigenlösung« bezeichnet), aus dem Behälter >' entnommen und eine bestimmte Menge dieser Antigenlösung 6 in das Reaktionsgefäß 4, das das Serum 3 enthält, gegeben. Dabei tritt die Agglutinationsreaktion zwischen Antigen und Antikörper und

is eine Präzipitation bzw. Ausfällung von Antigenteilchen oder Agglutinaten ein. Die Agglutinationsreaktion kann entweder mit Hilfe einer Zentrifuge 8 durchgeführt werden oder indem man das Reaktionsgefäß 4 stillstehen läßt, wie oben angegeben. Nach voilständigern Ablauf der Antigen-Antikörper-Reaktion wird die Absorption (OD₂) der überstehenden < iüssigkeit des Serums nach der Reaktion mit Hilfe von Liciit mit einer Wellenlänge von 280 nm wie bei der Messung der Lichtabsorption OD\ gemessen. Dann wird der Unterschied zwischen den Werten für die Lichtabsorptionen ODi und erzürn Nachweis der Agglutinationsreaktion bestimmt.

In diesem Zusammenhang ist darauf hinzuweisen, daß sich die Antigenteilchen am Boden des Reaktionsgefäßes 4 absetzen, da die Antigenteilchen eine größere spezifische Dichte besitzen als die anderen Bestandteile des Serums unabhängig davon, ob die Antigen-Antikörper-Reaktionen eine Agglutinations- oder nicht-Agglutinationsreaktion ist. Im Falle einer Agglutinations-Reaktion werden die Immungiobuline ais Antikörper von den Antigenteilchen absorbiert und setzen sich zusammen mit den Antigenteilchen ab, so daß die Konzentration an Protein in dem Serum, das die überstehende Flüssigkeit bildet, entsprechend abnimmt. Dadurch tritt ein Unterschied zwischen den Lichtabsorptionen ODi und OD2 ein, der es erlaubt, das »Auftreten von Agglutination« zu bestimmen. Bei einer nicht-Agglutinationsreaktion werden die Immungiobuline nicht von den sedimentierenden bzw. sich absetzenden Artigenteilchen adsorbiert, so daß die Konzentration an Pro'ein in dem die überstehende Flüssigkeit bildenden Serum sich nicht ändert. Infolgedessen sind die Absorptionswerte für ODi und OD2 gleich und es kann festgestellt werden, daß keine Agglutination eingetreten ist.

Die Menge an Antikörpern, die von den Antigenteilchen adsorbiert werden, variiert je nach der Menge der Antigenteilchen und der Stärke des Antikörpers, so daß die Menge an Rest-Immungiobulinen im Serum, das die überstehende Flüssigkeit bildet, entsprechend variiert.

Im Hinblick auf diese Variation der Adsorption de.' Antikörper erlaubt die Berechnung der Differenz zwischen den beiden Lichtabsorptionen ODi und OD2 die Bestimmung des Grads der Agglutination und damit eine qus^titativs Analvse, d h. eine quantitative Analyse

co des Antigens und von dem Antigen adsorbierten Antikörpers.

In F i g. 2 is: pine zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignete Vorrichtung dargestellt. Eine Vielzahl voi v. i'.ntersuchenden Serumproben

h) werde·.! /.1 enio!>iechen'^;e Probenbehälter !1 geg-.V.n die sich intermittierend nacheinander in Richtung d-.'f Pfeiles A dci Figur bewegen. Eine Reihe von RcaktionsrefKßcn 12 bewegen sich ebenfalls intermit-

tierend in Richtung des Pfeiles B der Figur mit der gleichen Geschwindigkeit bzw. Periode wie die Probenbehälter 11. Eine Spritze 13 zieht eine vorbestimmte Menge des zu untersuchenden Serums aus dem Probenbehälter It in der Einsaugstellung und entleert -, die aufgesaugten S.erumproben in die Reaktionsgefäße 12 in Einfüllstellung. So werden die Serumproben von den Probenbehältern 11 in die entsprechenden Reaktionsgefäße 12 nacheinander eingefüllt. Nach Aufnahme der Serumprobe kommt das Reaktionsgefäß 12 in eine m erste Meßstellung, wo die Lichtabsorption ODi der Serumprobe in dem Reaktionsgefäß 12 gemessen und in einen entsprechenden Speicher (nicht gezeigt) eingegeben wird. Bei der Vorrichtung der F i g. 2 umfaßt die fotometrische Vorrichtung zur Messung der ersten _r, Lichtabsorption OD\ eine mehrfarbige Lichtquelle 14, ein Interferenz-Filter 15, das Licht mit der Wellenlänge 280 nm aus dem von der Lichtquelle 14 emittierten Licht ausfiltert. Das Licht von dem Interferenz-Filter 15 wird auf die Serumprobe in dem Reaktionsgefäß 12 in der ersten Meßstellung; gerichtet, und ein Prisma 16 bricht das aus dem Reaktionsgefäß 12 austretende Licht und lenkt den Strahl auf ein lichtempfindliches Element 17. Die Lichtabsorption ODi der Se-umprobe wird aufgrund der von dem lichtempfindlichen Element 17 >> ablesbaren Werte bestimmt und in einen (nicht gezeigten) Speicher eingegeben.

Nach Messung der Lichtabsorption in der ersten Meßsteüung kommt das Reaktionsgefäß 12 in eine Reagenzaufnahmestellung, wo eine vorbestimmte Men- jo ge einer Antigenlösung 18 (z. B. einer Suspension von Blutkörperchen) aus einem Reagenzbehälter 19 mit Hilfe einer Spritze 20 in das Reaktionsgefäß 12 eingebracht wird. Die Antigenlösung ist ein Reagenz, um die Antigen-Antikörper-Reaktion herbeizuführen. Wenn sich das Reaktionsgefäß 12 eine vorbestimmte Anzahl von Einzelschritten von der Reagenzaufnahmestellung entfernt hat. wird ein Rührer 21 in das Reaktiongefäß 12 geführt, der die Serumprobe und das Reagenz in dem Reaktionsgefäß 12 bewegt und vermischt. Die Antigen-Antikörper-Reaktion findet während der Zeit si alt. bis das Reaktionsgefäß 12 eine zweite Meßstellung- erreicht, wo die Lichtabsorption OD₂ der überstehenden Flüssigkeit nach Ablauf der Antigen-Antikörper-Reak'ion gemessen wird. Bei der Vorrichtung der F i g. 2 ist die foiometrische Meßvorrichtung an der zweiten Meßstelle ähnlich bzw. gleich wie diejenige an der ersten Meßstelle und die mehrfarbige Lichtquelle 14 wird für die erste und die zweite Messung angewandt. In der zweiten Meßstellung trifft das von der Lichtquelle 14 kommende Licht auf ein Interferenz-Filter 22 und das ausgefilterte Licht mit einer Wellenlänge von 280 nm trifft durch die Wand des Reaktionsgefäßes 12 auf die überstehende Flüssigkeit und das lichtempfindliche Element 23 empfängt das Licht von dem Reaktionsgefäß 12 zur Bestimmung der Lichtabsorption OD₂ der überstehenden Flüssigkeit.

Die so bestimmte Lichtabsorption OCh der überstehenden Flüssigkeit wird in einen (nicht gezeigten) Differentialverstärker eingegeben, in den an einer anderen Stelle die Lichtabsorption ODi der entsprechenden Serumprobe, wie sie an der ersten Meßstelle gemessen und in dem Speicher festgehalten wurde, eingegeben wird, so daß der DifferntialverstSrker ein Signal aussendet, daß die Differenz /wischen den beiden Lichtabsorptionen ODi und ODt angibt, wodurch die Bestimmung, ob Agglutination vorliegt oder nicht, möglich wird. Wenn Agglutination eingetreten ist, ist es auch möglich, den Grad der Agglutination zu bestimmen und dadurch eine quantitative Analyse für Antigen und Antikörper durchzuführen.

Nach der zweiten Meßstellung, in der die Lichtabsorption der überstehenden Flüssigkeit gemessen worden ist, kommt das Reaktionsgefäß 12 in eine Entleerungsstellung, wo die Flüssigkeit aus dem Reaktionsgefäß 12 mit Hilfe einer Absaugpumpe 24 abgezogen und verworfen wird. In der nächsten Stellung wird mit Hilfe einer Spülpumpe 25 Spülflüssigkeit 27 Iz. B. physiologische Kochsalzlösung) aus einem Behältei 26 in das Reaktionsgefäß gegeben, die in der nächsten Stellung des Reaktionsgefässes 12 durch eine weitere ,^A osaugpumpe 28 abgezogen wird. Dadurch wird das Reaktionsgefäß 12 gereinigt und für den nächsten ,--nalysezyklus vorbereitet.

In Fig. 3 ist eine andere zur Durchführung des erfindiingsgemäßen Verfahrens geei<?"rie Vorrii htung angegeben. Diese Vor/ichtiPv " :üi Falle geeignet, bei denen die Proben Antigenlösungen (z. B. Suspensionen von Blutkörperchen) sind. Bei dieser Vorrichtung wird eine bestimmte Menge Reagenz in Form eines Serums. das Antikörper enthält, 29 (Serumreagenz) in ein Reaktionsgefäß 12 aus einem Reagenzbehälter 19 mit Hilfe einer Reagenzspritze 20 gegeben. Wenn das Reaktionsgefäß 12 die erste Meßstellung erreicht, wird die Absorption OD\ des Serumreagenzes gemessen.

Anschließend, wcnr das Reaktionsgefäß 12 die Probenaufnahmesteilung erreichi hat, wird mit Hilfe einer Probenspritze 13 eine vorbestimmte Menge der Probe in das Reaktionsgefäß 12 gegeben. Die Teile der Vorrichtung »jet Fig,3, die der Probenaufnu'^iestellung folgen, sind ebenso ausgebildet und arbeiten auf die gleiche Weise wie die entsprechenden Teile der F^;g. 2, so daß die Einzelheiten hier nicht mehr näher erläutert werden.

Hierzu 3 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Nachweis einer immunologischen Agglutinationsreaktion, bei dem man ein Antikörperhaltiges flüssiges Medium mit einem Antigen zusammenbringt und eine Lichtabsorptionsessung an der überstehenden Flüssigkeit durchführt, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antikörperhaltige flüssige Medium in ein Reaktionsgefäß gibt, die Lichtabsorption dieses Mediums mit Licht einer solchen Wellenlänge, daß es von dem Antikörper selektiv absorbiert wird, mißt, das Antigen in das Reaktionsgefäß gibt, nach Ablauf der Antigen-Antikörper-Reaktion eine zweite Absorptionsmessung an der überstehenden Flüssigkeit mit Hilfe von Licht der gleichen Wellenlänge durchführt und den Unterschied zwischen der ersten und zweiten Absorption bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man aus dem Unterschied der Lichtabsorptionen das Vorhandensein oder nicht-Vorhandensein bzw. den Grad der Agglutinierung bestimmt

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Antikörper-haltiges Medium Serum verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch I bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Antigen eine Suspension von Blutkörperchen verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lichtabsorption bei 280 nm oder 190 nm mißt