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Gebiet der
Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft die Spektrophotometrie und die spektrophotometrische
Analyse von Serum oder Plasma, das für Bluttests verwendet wird.
Sie betrifft auch die Auswirkungen von Blutersatzstoffen und anderen
Interferenten auf Bluttestergebnisse. Insbesondere betrifft diese
Erfindung ein Verfahren zur Messung von Blutersatzstoffen in Serum
oder Plasma, zur Bestimmung der Auswirkungen von Blutersatzstoffen
auf Bluttestergebnisse und zur Kombination der beiden, um Bluttestergebnisse
bezüglich
der Anwesenheit von Blutersatzstoffen anzupassen oder zu korrigieren.
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Hintergrund
der Erfindung
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Klinische
Labortests werden bei Serum oder Plasma von Vollblut routinemäßig durchgeführt. In
einem Routine-Assay werden die roten Blutzellen durch Zentrifugation
vom Plasma abgetrennt oder rote Blutzellen und verschiedene Plasmaproteine
werden durch Gerinnung vor der Zentrifugation vom Serum abgetrennt.
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Hämoglobin
(Hb), Bilirubin (BR), Biliverdin (BV) und lichtstreuende Substanzen
wie Lipid-Partikel sind typische Substanzen, die mit spektrophotometrischen
und anderen blutanalytischen Messungen wechselwirken und diese beeinflussen.
Derartige Substanzen werden als Interferenten bezeichnet. Erhöhtes Hb
in dem Blut, Hämoglobinämie, kann
auf Krankheitszuständen
und als Ergebnis der Probenhandhabung beruhen. Erhöhte Gallenpigmente,
nämlich
BR und BV, können
auf Krankheitszuständen
beruhen. Erhöhte
Lipid-Partikel im Blut, auch als Hyperlipidämie oder Lipämie bekannt,
können
auf Krankheitszuständen
und Nahrungsbedingungen beruhen. Lipämie ist die Hauptursache einer
Trübung
im Serum und Plasma, und deshalb werden die Ausdrücke Lipämie und
Trübung
häufig
austauschbar verwendet.
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Viele
Tests, die an Plasma- oder Serumproben durchgeführt werden, verwenden eine
Reihe von Reaktionen, die nach der Erzeugung von Chromophoren beendet
sind, welche den Nachweis durch spektrophotometrische Messungen
bei einer oder zwei Wellenlängen
erleichtern. Die Messung von wechselwirkenden Substanzen vor der
Durchführung
derartiger Tests ist wichtig, um für sinnvolle und genaue Testergebnisse
zu sorgen. In der Tat werden Tests, wenn eine Probe ausreichend
mit Interferenten verunreinigt ist, normalerweise nicht durchgeführt, da
die Ergebnisse nicht zuverlässig
wären.
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Eine
weitere Gruppe von potentiellen Interferenten sind Blutersatzstoffe.
Blutersatzstoffe sind neue Produkte, die sich in der Entwicklung
befinden, zur Verwendung anstelle von Vollblut oder roten Blutzellen
für die
Transfusion. Die Bluttransfusion ist ein lebensrettendes Verfahren,
das nach schwerem Blutverlust bei einem Trauma oder einer Operation
durchgeführt
wird. Einige Vorteile der Verwendung von Blutersatz anstelle von
Blut oder roten Blutzellen sind wie folgt: 1. Es wird erwartet,
dass Blutersatzstoffe universell mit allen Bluttypen kompatibel
sind, deshalb ist eine Durchführung
einer Kreuzprobe nicht erforderlich; 2. die maximale Lagerzeit von
Blut beträgt
42 Tage, wohingegen Blutersatzstoffe eine viel längere Haltbarkeit aufweisen
könnten;
3. die Reinigung von Blutersatz kann eine Wärmebehandlung einschließen, welche
die Bedrohung durch gefährliche
Viren, wie HIV, beseitigt. Jedoch ist eine Herausforderung, die
Blutersatzstoffe klinischen Labors auferlegt, die Handhabung der
Auswirkungen von Blutersatzstoffen auf Bluttests. Einige Blutersatzstoffe
bewirken, dass Serum- oder
Plasmaproben als Vollblut oder schwer hämolysiertes Serum oder Plasma
erscheinen, daher kann der Ausdruck Pseudohämolyse verwendet werden, um
derartige Proben zu beschreiben. Hämolyse, die Freisetzung von
Hb aus roten Blutzellen in Serum oder Plasma, kann etwa 2 g/l betragen,
aber Blutersatzstoffe können
soviel wie 30 g/l vernetztes Hb (CLHb) bei einem Patienten ausmachen, der
bezgüglich
eines schweren Blutverlustes behandelt wird. Jedoch läßt eine
wahre Hämolyse
nicht nur Serum- oder Plasmaproben rot erscheinen, sondern hohe
Konzentrationen gewisser Analyten innerhalb roter Zellen, zum Beispiel
Kalium, erhöhen
auch die Konzentration von Analyten in einer Serum- oder Plasmaprobe.
Deshalb ist die Auswirkung von Blutersatzstoffen auf Hb-Basis auf
Bluttestergebnisse vorhersagbarer als die Auswirkung einer wahren
Hämolyse.
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Derzeitige
Verfahren, die zum Nachweis von Hämoglobinämie, Bilirubinämie oder
Lipämie
oder Trübung
verwendet werden, verwenden eine visuelle Überprüfung der Probe mit oder ohne
Vergleich mit einem gefärbten
Schaubild.
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Die
meisten Blutersatzstoffe, die sich in der Entwicklung befinden,
werden aus humanem Hb hergestellt, aber ein weiterer Typ von Blutersatz
ist mitgeteilt worden, bei dem es sich um eine milchig-weiße Emulsion
handelt, die winzige Perlen aus Perfluorkohlenstoffen enthält, die
in einem Tensid eingehüllt
sind. Zum Beispiel sind derartige Perfluorkohlenstoffe in R. G.
Pratt et al. "Quantitation
of perfluorocarbon blood substitutes in tissues using F-19 magnetic
resonance spectroscopy" Biomaterials,
Artificial Cells and Immobilization Technology, Bd. 20, Nr. 2-4,
1992, Seiten 921-924, XP002057067, beschrieben. Die Erstgenannten
schaffen eine Pseudohämolyse,
während
die letztgenannten eine Pseudolipämie in Serum- und Plasmaproben
schaffen. Untereinheiten von Blutersatz auf Hb-Basis sind zur Stabilität chemisch
vernetzt (CLHb) und erzeugen Absorptionsspektren, die den Absorptionsspektren
von normalem Hämoglobin
(Hb) sehr ähnlich
sind. Ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung eines Analyten,
wie Bilirubin oder Hämoglobin,
in Humanserum durch Absorptionsspektrophotometrie in Anwesenheit
von unbekannten Interferenten ist in der europäischen Patentanmeldung 0 158
506 beschrieben. Jedurch beruht das Verfahren aus Naßchemie-
und Trockenchemie-Assays, um die Analytenbestimmungen zu machen.
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Derzeit
gibt es kein Verfahren als solches für eine rasche Anpassung von
Bluttestergebnissen, die durch Blutersatzstoffe beeinflußt werden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein derartiges Verfahren, das Verfahren
und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung zur Messung der Konzentration
von Blutersatzstoffen in Anwesenheit von Hb, BR, BV und Trübung. Die
erhaltenen Ergebnisse von Messungen von Blutersatzstoffen werden
verwendet, um die Bluttestergebnisse zu korrigieren, die durch die
Blutersatzstoffe beeinflußt werden.
Weitere Mengen von anderen Interferenten können in Anwesenheit der Blutersatzstoffe
gemessen werden. Demgemäß kann eine
wahre Hämolyse
in Anwesenheit von Blutersatzstoffen gemessen werden, welche eine "Pseudohämolyse" verursachen.
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Zusammenfassung, der Erfindung
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Gemäß einem
Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren gemäß Anspruch
1 bereitgestellt, das die Konzentration eines Blutersatz-Interferenten
berücksichtigt.
Die Konzentration eines Blutersatzes in einer Serum- oder Plasmaprobe
wird rasch und genau gemessen, und die gemessene Konzentration wird
verwendet, um ihre Auswirkung, falls vorhanden, auf eine gemessene
Analytenkonzentration, zum Beispiel Gesamt-Serum/Plasmaprotein,
zu korrigieren. Es gibt keinen bekannten Stand der Technik, der
diesem Interferenten in einem ersten oder zweiten etikettierten
Rohr oder einer Pipettenspitze, die verwendet wird, um Serum oder
Plasma in ein Blutanalysiergerät
einzuführen,
messen kann.
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Spektraldaten
können
auf neue Weise verwendet werden, um in Anwesenheit oder Anwesenheit
von anderen Interferenten zu bestimmen, ob eine Probe einen Blutersatz
enthält
und, falls dies der Fall ist, in welchem Ausmaß.
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Weitere
Interferenten, zum Beispiel Hb, BR, BV und Trübung, können in Anwesenheit von Blutersatzstoffen
genau gemessen werden.
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Es
können
linearere Regressionsgleichungen für verschiedene Analyten in
verschiedenen Blutanalysiergerätenen
entwickelt werden, durch welche es möglich ist, die gemessene Konzentration
eines Analyten mit der Menge an vorhandenem Blutersatz in Beziehung
zu bringen. Die überprüften Analysiergeräte sind
Kodak Ektachem 700 von Johnson und Johnson und Hitachi 717 von Boehringer
Mannheim; das Erstgenannte repräsentiert
eine Objektträgertechnik
oder die sogenannte Trockenchemie (d.h. die einzige beteiligte Flüssigkeit
im Test ist die zu testende Probe), und das Letztgenannte repräsentiert
die sogenannte Naßchemie.
Der getestete Blutersatz war CLHb von Hemosol Inc.
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Es
werden Algorithmen entwickelt, die Analyten-spezifisch und Analysiergerät-spezifisch sind,
die die Menge an Blutersatz messen können, der in der Serum- und der Plasmaprobe
vorliegt, und die erforderliche Anpassung an die oder Korrektur
der gemessene(n) Analytenkonzentration machen können, wodurch die Auswirkung
des Blutersatzes entfernt wird.
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Andere
Vorteile und neuen Merkmale der Erfindung werden aus der folgenden
detaillierten Beschreibung ersichtlicher, wenn sie in Verbindung
mit den begleitenden Zeichnungen betrachtet wird.
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Beschreibung
der Zeichnungen
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1 ist
eine graphische Darstellung einer liniearen Regressionanpassung
der Daten, die aus der CLHb-Kalibrierung erzeugt wurden.
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2 stellt
eine graphische Darstellung der Ergebnisse einer linearen Regressionsanpassung
für eine vorhergesagte
CLHb-Konzentration bei Proben dar, die in den Kalibrierungsverfahren
nicht verwendet wurden.
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3 stellt
eine Darstellung der Ergebnisse einer linearen Regressionsanpassung
von Daten dar, die aus einer Kalibrierung von wahrem Hb in Anwesenheit
von vernetztem Hb und anderen Interferenten (IL, BR, BV) erzeugt
wurden.
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4 ist
eine graphische Darstellung einer linearen Regressionsanpassung
von Daten bezüglich
Gesamtprotein.
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5 ist
eine graphische Darstellung einer linearen Regressionsanpassung
von Daten bezgüglich
Aspartat-Amino-Transferase.
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6 ist
eine graphische Darstellung einer linearen Regressionsanpassung
von Daten bezüglich
alkalischer Phosphatase.
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7 ist
eine graphische Darstellung der linearen Regressionsanpassung von
Daten bezüglich
Gesamt-Bilirubin.
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Definitionen
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Die
hierin verwendeten Abkürzungen
weisen die folgende Bedeutung auf:
- Na
- = Natrium
- K
- = Kalium
- Cl
- = Chlor
- HCO3
- = Bicarbonat
- Ca
- = Calcium
- Mg
- = Magnesium
- GGT
- = Gamma-Glutamyl-Transferase
- AST
- = Aspartat-Amino-Transferase
- LDH
- = Lactat-Dehydrogenase
- CK
- = Creatin-Kinase
- ALP
- = Alkalische Phosphatase
- Tbili
- = Gesamt-Bilirubin
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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Die
in der vorliegenden Erfindung verwendete Vorrichtung umfaßt allgemein
ein zeitlich abgestimmtes Zweistrahl-Spektrophotometer, das optisch
durch optische Fasern an einen Probenhalter gekoppelt ist oder mit diesem
kommuniziert. Bei der Probe kann es sich um eine Serum- oder Plasmaprobe
in einem etikettierten Rohr aus Glas oder Kunststoffmaterial oder
um eine Kunststoff-Pipettenspitze handeln, die für die Einführung der Probe in das Blutanalysiergerät verwendet
wird. Ein Roboterarm kann verwendet werden, um die Probe in den
Probenhalter einzuführen.
Es versteht sich, dass andere Überführungstransportmechanismen
verwendet werden könnten.
Weiter legt jedes Mittel, durch welches die optischen Eingangs-
und Ausgangs-Faserbündel in
Ausrichtung zur Messung von Absorption oder Reflexion in einem Probenbehälter gebracht
werden, innerhalb des Bereichs der vorliegenden Erfindung. Entlang
der Seite des Probenhalters befindet sich eine getrennte Faser zur Übertragung
des Bezugslichts, wenn der Verschluß am Probenkanal geschlossen
ist und der Verschluß am
Bezugskanal geöffnet
ist. Proben- und Bezugs-Dunkelscans können durchgeführt werden,
während die
Probe sich bei geschlossenem Probenhalter an ihrem Platz befindet
und beide Verschlüsse
geschlossen sind, wobei die Integrationszeiten verwendet werden,
die für
die jeweiligen Proben- und Bezugslicht-Scans verwendet werden. Es
gibt keine andere Verschlüsse
in der Vorrichtung außer
dem Probenweg- und Bezugsweg-Verschluß. Das Spektrophotometer verwendet
eine festgelegte Integrationszeit für den Bezugsstrahl und eine
Wahl der Integrationszeit für
den Probenstrahl.
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Vorzugsweise
ist die Lichtquelle eine 10 Watt-Quarz-Wolfram-Halogenlampe, aber
Lampen mit anderen Wattzahlen können
verwendet werden. Die Zufuhrstromversorgung ist Wechselstrom, aber
die Ausgabe an die Lichtquelle ist stabilisierter Gleichstrom. Der
spektrale Ausstoß aus
der Lichtquelle ist Breitband, das den sichtbaren und NIR-Bereich
abdeckt. Der Strahlungsstrahl aus der Lichtquelle wird durch ein
Bandpass-Filter in die Lampenanordnung und ein Formungsfilter in
das Spektrophotometer geleitet. Das Bandpass-Filter ist erforderlich,
um unerwünschte
Strahlung außerhalb
von 475-910 nm zu verringern, und das Formungsfilter ist erforderlich,
um die optische Antwort des Nachweissystems "abzuflachen". Der Wellenbereich von 475-910 nm wird
verwendet, da dieser Bereich verwendet werden kann, um sowohl die
Blutersatzstoffe als auch andere Interferenten, d.h. Hb, BR, BV
und Trübung,
zu messen. Ein gegabeltes Bündel
tritt aus einer Hauptfaser aus, die an die Ausstoß-Lichtquelle
angeschlossen ist und eine statistische Probeentnahme der Lampenstrahlung
bereitstellt, um den Proben- und Bezugsstrahl über zwei Zweige zuzuführen. Der
Proben- und Bezugsstrahl konvergieren wieder am Spektrophotometer über zwei
Zweige eines weiteren gegabelten Faserbündels. Um für eine ausgeglichen, zum linearen
Photodiodenarray (PDA)-Detektor austretende Strahlung sowohl aus
dem Proben- als auch aus dem Bezugsweg zu sorgen, müssen 99%
und 1 % der Strahlung aus der Hauptfaser durch den Proben- bzw.
Bezugsweg geleitet werden.
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Wenn
der Probenhalter nicht lichtundurchlässig ist, d.h. in der Lage
ist, äußeres Licht
auszuschließen, müssen Proben-
und Bezugs-Dunkelscans vom Proben- bzw. Bezugs-Lichtscan abgezogen werden.
Wenn der Probenhalter ausreichend lichtundurchlässig ist, was empirisch bestimmt
wird, können
die Dunkelscans weggelassen werden. Auch können mehrere Scans gemittelt
werden, um das Rauschen zu minimieren, aber für den Zweck der Geschwindigkeit
können
einzelne Scans verwendet werden.
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Bei
der Verwendung wird jedes Pixel oder jeder Wellenlängenabschnitt
etwa gleichzeitig während
eines speziellen Scans am Photodiodenarray gemessen. Die optische
Strahlung, die auf jedes Sensorelement einfällt, wird über eine festgelegte Zeit integriert,
und die einzelnen Pixel oder Wellenlängen werden aufeinanderfolgend
durch eine 16 Bit-Analog-Digital-Wandler oder ADC abgetastet.
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Obwohl
die vorliegende Ausführungsform
detailliert die Verwendung eines PDA beschreibt, versteht es sich,
dass jedes alternative Mittel, das für ein ähnliches Ergebnis sorgt, innerhalb
des Bereichs der vorliegenden Erfindung liegt. Zum Beispiel kann
ein Filterrad-System verwendet werden. Bei der Durchführung der Messungen
verwendet jeder Analyt ein bis vier Wellenlängen oder Pixel. Im Hinblick
auf die Tatsache, dass die erste Ableitung der Extinktion bezüglich der
Messung mit dem PDA der Unterschied zwischen der Extinktion bei
zwei benachbarten Pixeln ist, wird die erste Ableitung der Extinkion
bei einer Wellenlänge
mit einem Filterrad-System erfordern, dass die Extinktion mit zwei
verschiedenen engen Bandpass-Filtern gemessen wird. Der Fachmann
versteht leicht, dass die Filter nicht auf einem rotierenden Rad
angeordnet sein müssen,
sondern dass jede Struktur, welche das Ergebnis einer engen Bandpass-Filtration
absorbierter Strahlung erzielt, im Bereich der vorliegenden Erfindung
liegt.
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Eine
weitere Ausführungsform
verwendet die Reflexion, bei der einfallendes Licht von irgendeiner
reflektierenden Oberfläche
reflektiert wird, welche hinter der Probe angeordnet ist.
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Transmission
wird gegenüber
der Reflexion bevorzugt, da die Auswirkung der Schwankung bei der
Extinktion aufgrund des Behälters,
in dem sich die Serum- oder
Plasmaprobe befindet, bei den gewählten Wellenlängen unbedeutend
ist. Die Schwankung bei der scheinbaren Extinktion aufgrund von
Markierungen auf den Etiketten kann wirksam durch Verwendung der
ersten Ableitung der scheinbaren Extinktion gehandhabt werden. Der
Ausdruck "scheinbare" Extinktion wird
verwendet, da, wenn die durch die Probe übertragene Lichtmenge gemessen
wird und das übertragene
Licht in Extinktioneinheiten umgewandelt wird, wie es im nächsten Abschnitt
erörtert
wird, die Lichtabschwächung
durch jedes Mittel außer
jenem, das durch die Probe absorbiert wird, als Extinktion interpretiert
wird. Zum Beispiel streuen Lipid-Partikel Licht vom Detektor weg, und
das gestreute Licht wird als Extinktion interpretiert. Es versteht
sich, dass die Bestimmung der Konzentration von Interferenten unter
Verwendung von Reflexion im Bereich dieser Erfindung liegt.
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Der
PDA integriert die optische Strahlung über eine festgelegte Zeit und
wandelt das optische Signal in ein elektronisches Zeit-Multiplex-Analogsignal
um, das als Scan bezeichnet wird, wobei die Extinktion berechnet
wird als: Extinktion = log{(Bezug Lichti – Bezug
dunkeli)/(Probe Lichti – Probe
dunkeli)} + log(IST/ITR)worin
Extinktion;
= Extinktion Pixel i
Bezug Lichti =
Bezugspixel i-Messwerte, wobei der Bezugsweg geöffnet ist und der Probenweg
durch einen Verschluß geschlossen
ist;
Bezug dunkeli = Bezugspixel i-Messwerte,
wobei sowohl der Bezugs- als auch der Probenweg durch Verschlüsse geschlossen
sind;
Probe Lichti = Probenpixel i-Messwerte,
wobei der Probenweg offen ist und der Bezugsweg durch einen Verschluß geschlossen
ist;
Probe dunkeli = Probenpixel i-Messwerte,
wobei sowohl der
Proben- als auch der Bezugsweg durch Verschlüsse geschlossen
sind;
ITS = Integrationszeit für Probenmessung;
ITR =Integrationszeit
für Bezugsmessung;
und
i
= spezielles Pixel (Wellenlänge)
im PDA.
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Abhängig vom
erforderlichen Analysegeräte-Durchsatz,
und falls der Probenhalter ausreichend lichtundurchlässig ist,
sind Dunkelscans nicht erforderlich. Das elektronische Signal ist
proportional zur Zeit, über welche
der Detektor das optische Signal integriert. Das elektronische Signal
wird durch elektronische Analogverstärker verstärkt und von einem Analog-Digital-Wandler
oder ADC in ein digitales Signal überführt. Die digitale Information
aus dem Wandler wird bezüglich
einer Datenanalyse von einem Mikroprozessor interpretiert, welcher
wiederum über
ein RS232-Anschlußstück mit einem
Computer verbunden ist. Die Ergebnisse der Datenanalyse können auf
dem Computer oder auf einem mit dem Computer verbundenen Drucker
angezeigt werden. Ein Benutzer kann die Vorrichtung durch den Computer
starten, um einen speziellen zu analysierenden Interferenten zu
spezifizieren und die Zahl und den Zeitverlauf der Messungen zu
bestimmen.
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Obwohl
eine schnelle Vordurchmusterung-Vorrichtung soviel Zeit wie ein
bis zwei Minuten pro Probenmessung in Anspruch nehmen und auf diesem
Gebiet immer noch als rasch angesehen werden könnte, ermöglicht die vorliegende Erfindung
eine rasche Vordurchmusterung von Proben, indem sie aufeinanderfolgende
Probenmessungen in Zeitabständen
von 5 Sekunden bei 4 Interferenten und dem Blutersatz vornehmen kann;
bei Pipettenspitzen und wenn keine Dunkelscan-Messungen mit denselben Spitzen vorgenommen
werden, können
die spektralen Messungen in bis zu einer Sekunde durchgeführt werden.
Nachdem der Probenhalter geöffnet
worden ist, wird die Probe gemäß dem Steuerungsverfahren
platziert, und ein Sensor im Probenhalter kann die Sammlung von
Spektraldaten aktivieren.
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Die
Integrationszeit für
den Probenstrahl ist bei klaren Proben gering, da es weniger gestreutes
Licht gibt und deshalb mehr Licht zum Detektor durchgelassen wird.
Wenn das Licht zum Beispiel durch eine trübe Probe ausreichend gestreut
wird, schaltet das Spektrophotometer automatisch zu einer höheren Integrationszeit
um. Aufgrund der linearen Beziehung zwischen der Detektorantwort
und der IZ kann die zweite IZ aus der Detektorantwort der niedrigen
IZ (oder ersten IZ) bestimmt werden. Die gewählte höhere Integrationszeit liegt in
einem auf solche Weise vorausgewählten
Bereich, dass die Antwort des Detektors optimal und im linearen Antwortbereich
liegt. Dieses Merkmal ermöglicht,
dass alle Proben, von der klarsten bis zur trübsten, wirksam ohne Überschreitung
des linearen Antwortbereichs des Detektors durchmustert werden.
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Wie
bei jedem quantitativen Verfahren ist eine Kalibrierung des Spektrophotometers
erforderlich. Jedoch ist das Verfahren für die NIR-Kalibrierung viel
komplexer als das der meisten, die mit einem Minimum eines einzigen
Standardmaterials bekannter Konzentration kalibriert werden können. Mit
Bezug auf die NIR-Kalibrierung müssen
die Proben alle Interferenten enthalten, die bei der Analyse einer
unbekannten Probe erwartet werden; die Probe muß eine gleichmäßige Verteilung
des interessierenden Interferenten enthalten, und die Konzentrationen
von irgend zwei Interferenten sollten nicht signifikant korrelieren.
Es versteht sich, dass bei jeder erfindungsmäßen Vordurchmusterung einer
typischen Probe für
eine anschließenden
Analyse jede Kombination von Interferenten anwesend sein kann. Die
Vordurchmusterung ermöglicht
die Bestimmung der Konzentration irgendeines derselben in Anwesenheit
oder Abwesenheit der anderen. Obwohl die präsentierten Daten auf einem
speziellen Blutersatz beruhen, der durch die chemische Vernetzung
der Hb-Untereinheiten hergestellt ist, versteht es sich, dass ähnliche
Kalibrierungsalgorithmen zur Messung anderer Blutersatzstoffe und
zum Korrigieren ihrer Auswirkungen auf Bluttestergebnisse innerhalb
des Bereichs dieser Erfindung liegen. Es versteht sich auch, dass "andere Blutersatzstoffe" nicht nur jene einschließen, die
auf Hb-Basis beruhen,
sondern jeden anderen Blutersatzstoff, z.B. jene, die als milchigweiße Emulsion
erscheinen.
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Der
erste Teil des Verfahrens zur Erzeugung einer Kalibrierungskurve
besteht darin, Spektraldaten für den
Kalibrierungssatz zu speichern. Der Kalibrierungsalgorithmus jedes
Interferenten muß so
in einem Mikroprozessor installiert werden, dass, wenn eine unbekannte
Probe bezüglich
eines speziellen Interferenten getestet wird, das Ergebnis schnell
erzeugt wird. Um die Menge irgendeines vorhandenen Interferenten
zu berechnen, kann irgendeines von mehreren Verfahren, die alle
innerhalb des Bereichs dieser Erfindung liegen, verwendet werden.
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Eine
Vorgehensweise wäre
es, die rohe Extinktion durch mehrfache lineare Regression zu verarbeiten und
unter Verwendung von Standardverfahren und Statistik Wellenlängen zu
wählen,
um optimale Wellenlängen
zu finden, bei denen die Konzentrationen der Interferenten beschrieben
werden können.
Jedoch beeinflussen signifikante Änderungen des Spektrums, die
durch Lipämie
herbeigeführt
werden, das Ergebnis der Berechnungen für Hämoglobin oder Bilirubin oder
Biliverdin oder Blutersatzstoffe, und demgemäß ist es erforderlich, zusätzliche
Wellenlängen
zu wählen,
um diese Wechselwirkungen zu kompensieren. Jedoch ist dies keine
bevorzugte Vorgehensweise.
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Ein
weiteres Verfahren, das angewandt werden kann, besteht darin, das
ganze Extinktionsspektrum zu verwenden und entweder eine Hauptkomponentenanalyse
oder eine partielle Analyse der kleinsten Quadrate durchzuführen und
aus den Komponenten, die optimiert sind, wirksam die Konzentration
dieser verschiedenen Elemente zu bestimmen. Jedoch ist ein Nachteil
der Verwendung dieser beiden Verfahren, dass sie bezüglich der
Berechnung anspruchsvoll sind und demgemäß mehr Zeit zum Rechnen erfordern
und die Zeitspanne erhöhen,
die erforderlich ist, um jede Probe zu bestimmen.
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Ein
bevorzugtes Verfahren besteht darin, die erste Ableitung gewisser
Abschnitte des Extinktionsspektrums bezüglich des speziellen gemessenen
Interferenten zu berechnen. Es ist auch möglich, die zweite oder dritte
Ableitung der Extinktion zu berechnen, und derartige Berechnungen
liegen im Bereich dieser Erfindung. Jedoch ist jeder Schritt des
Heranziehens von Differenzen, um diese Ableitungen zu berechnen,
zeitaufwendiger und führt
mehr Rauschen ein.
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Vor
der Verarbeitung der Daten kann ein Glätten der Extinktionsdaten durchgeführt werden,
falls erforderlich.
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In
der Praxis wird eine optimale Kombination der ersten Ableitungen
von mindestens zwei Abschnitten eines Extinktionsspektrums, das
aus einem Scan einer einen speziellen Interferenten enthaltenden
Plasmaproben erzeugt wurde, verwendet, um die Interferentenkonzentration
zu berechnen. Die genaue verwendete Vorgehensweise hängt von
dem gemessenen Interferenten ab.
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Die
vorliegenden Erfindung weist drei Teile auf. Der erste Teil der
vorliegenden Erfindung besteht darin, die Menge des Blutersatzes
zu messen, der in der Serum/Plasmaprobe vorliegt. Mit Bezug auf
Hemosol-CLHb können
optimale Ergebnisse erhalten werden, indem man die erste Ableitung
der Extinktionsmessungen bei Wellenlängen von etwa 541 nm, 558 nm,
600 nm und 616 nm berechnet.
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Die
nachstehend angeführten
Kalibrierungsgleichungen decken den breiten Bereich von Variabilität ab, der
für die
Interferenzen erwartet wird. Wenn die Genauigkeit am unteren Ende
ein Problem bereitet, können
getrennte Kalibrierungen entwickelt werden; eine für das obere
Ende und eine zweite, wenn das Ergebnis, das durch die vorangehende
Kalibrierung vorhergesagt wird, kleiner ist als ein vorbestimmtes
Niveau.
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Um
das Spektrophotometer bezüglich
CLHb zu kalibrieren, wurden Serumproben mit normalem Aussehen mit
0 bis 16,6 g/l CLHb, 0 bis 3,2 g/l Hb, 0 bis 4,0 g/l IL, 0 bis 48,4
mg/dl BR und 0 bis 4,0 mg/dl BV versetzt, wie in Tabelle 1 gezeigt.
Es wurde keine signifikante Korrelation zwischen den Analyten zugelassen. Die
Proben wurden einmal unmittelbar nach der Präparation gescannt, und dann
wurde dies unter Verwendung verschiedener Einweg-Polypropylen-Pipettenspitzen wiederholt.
Das Hb wurde präpariert,
indem man das normale Plasma (bezüglich Aussehen) durch Wasser
ersetzte und die Erythrozyten durch Frost/Tau-Wechsel lysierte.
Der Hb-Gehalt des Überstands
des Lysats wurde mit einem Abbott Cell DynTM gemessen.
Die Spektren wurden auf Disketten gespeichert. Die Analysen bei
einem Probensatz wurden durch ein statistisches Computerprogramm
durchgeführt,
und es wurde ein Algorithmus für
CLHb entwickelt. Unabhängige
Probensätze
wurde für
eine Validierung (auf die in den graphischen Darstellungen als Voraussage
Bezug genommen wird) der Kalibrierungsgleichung beiseite gestellt,
wie es in Tabelle 2 gezeigt ist.
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1 ist
eine graphische Darstellung einer linearen Regressionsanpassung
der Daten, die aus der CLHb-Kalibrierung erzeugt wurden. Der Algorithmus,
der auf der Grundlage dieser Daten für Hb entwickelt wurde, ist
wie folgt: g/l CLHb = 23,97 (541 nm) – 76,01
(558 nm) + 130,84 (600 nm) – 113,61
(616 nm) + 0,30worin (Xnm) die erste Ableitung der bei der
angegebenen Wellenlänge
gemessenen Extinktion ist.
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2 stellt
eine graphische Darstellung der Ergebnisse einer linearen Regressionsanpassung
für eine vorgesagte
CLHb-Konzentration bei Proben dar, die nicht in den Kalibrierungsverfahren
verwendet wurden.
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3 stellt
eine graphische Darstellung der Ergebnisse einer linearen Regressionsanpassung
der Daten dar, die aus der Kalibrierung von wahrem Hb in Anwesenheit
von vernetztem Hb und anderen Interferenten (IL, BR, BV) erzeugt
wurden. Tabelle 3 liefert die einzelnen Datenpunkte, die erhalten
werden, wenn diese Kalibrierung durchgeführt wird. Der Algorithmus,
der als Ergebnis dieser Kalibrierung entwickelt wurde, ist wie folgt: g/l Hb = –0,72
+ 30,72 (558) – 17,40
(570) + 171,14 (730)wobei die Zahlen in den Klammern die erste
Ableitung der Extinktion bei den gezeigten Wellenlängen (nm) sind.
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Der
zweite Teil der vorliegenden Erfindung besteht darin, die Beziehung
zwischen gemessenen Mengen jedes Analyten bezüglich der Menge an in der Serum-
und der Plasmaprobe vorliegendem Blutersatz für ein spezielles Blutanalysiergerät quantitativ
zu bestimmen; diese Gleichungen, welche ermöglichen, die Analytenkonzentration
bei null g/l Blutersatz zu extrapolieren, müssen bei verschiedenen Konzentrationen
des Analyten validiert werden, und falls die Steigungen der Regressionsgerade
bei verschiedenen Analytenkonzentrationen mit der Analytenkonzentration
variieren, kann ein durchschnittlicher Steigungswert verwendet werden.
In dieser Anmeldung bezeichnet Analyt Substanzen, die routinemäßig in einem
Blutanalysiergerät
gemessen werden. Die Tabelle 4 und 5 geben die gemessenen Konzentrationen
(alle in S.I.-Einheiten) von verschiedenen Analyten bei zwei verschiedenen
Analysegeräten
in Anwesenheit von verschiedenen CLHb-Konzentrationen wieder. Die
Analyten, die stark durch das CLHb beeinflußt werden, sind in den schattierten
Abschnitten von Tabelle 5 gezeigt.
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Die 4 bis 7 sind
graphische Darstellungen von linearen Regressionsanpassungen, falls
geeignet, der gemessenen Analyten als Antwort auf verschiedene Mengen
von zugesetztem CLHb. 4 ist für Gesamtprotein (Tprot), wenn
es in dem Kodak Ektachem und dem Hitachi 717 gemessen wird; 5 ist
für Aspartat-Amino-Transferase
(AST), wenn sie in dem Kodak Ektachem und dem Hitachi 717 gemessen
wird; 6 ist für
alkalische Phosphatase (ALP), wenn sie in dem Kodak Ektachem und
dem Hitachi 717 gemessen wird; und 7 ist für Gesamt-Bilirubin
(Tbili), wenn es in dem Kodak Ektachem und dem Hitachi 717 gemessen
wird. Falls geeignet, sind die linearen Regressionsgleichungen neben
den entsprechenden Regressionsgeraden gezeigt. Um zu erläutern, wie
diese Erfindung funktioniert, verwende man eine Serum-Gesamtprotein-Messung
in dem Kodak Ektachem als Test, welche durch die Anwesenheit von
CLHb im Serum eines Patienten beeinflußt wird:
Aus 4,
y = 2,28x + c, worin
y = g/l Gesamtprotein (in Anwesenheit
von CLHb)
x = g/l vorhandenes CLHb
c = g/l Gesamtprotein
(in Anwesenheit von null CLHb)
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In
diesem Beispiel, c = 62 g/l.
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Der
dritte Teil der vorliegenden Erfindung besteht in der Kombination
der ersten zwei Teile der Erfindung, um die Konzentration des Analyten
zu extrapolieren, was eine Analytekonzentration ergibt, wenn kein Blutersatz
vorliegt. Für
erläuternde
Zwecke nehme man an, dass die gemessene CLHb-Menge in der Serumprobe
20 g/l beträgt
und die gemessene Menge an Gesamtprotein in derselben Probe 108
g/l beträgt.
Frage:
Was ist das tatsächliche
Gesamt-Serumprotein?
Antwort: Aus der scheinbaren oder gemessenen
Gesamtprotein-Konzentration (in diesem Fall ist sie 108 g/l), subtrahiere
man die gemessenen g/l CLHb mal der Steigung der Regressionsgeraden
(in diesem Fall ist sie 2,28) von dem gemessenen Wert.
Die
Antwort ist 62,4 g/l.
-
Dies
steht in guter Übereinstimmung
mit dem bekannten Wert von 62 g/l. Die Genauigkeit dieser Korrektur
hängt von
der Genauigkeit der Messung des Blutersatzes und von der Zuverlässigkeit
der verwendeten Steigung ab.
-
Es
versteht sich auch, dass als Teil dieser Erfindung andere Interferenten
in der Anwesenheit von Blutersatzstoffen genau gemessen werden können. Dies
kann erforderlich sein, um zu bestimmen, ob andere Interferenten
in ausreichenden Mengen vorliegen, welche die Korrektur bezüglich der
Blutersatzstoffe ungültig machen.
Wie vom Fachmann leicht verstanden wird, können unter Verwendung verschiedener
Gruppen von Wellenlängen
mehrere Algorithmen für
jeden Interferenten entwickelt werden, wobei die resultierende Vorhersageleistung
durch die verschiedenen Algorithmen für den gleichen Interferenten ähnlich ist.
Auch können
Algorithmen für
jeden Interferenten oder alle Kombinationen von Interferenten, einschließlich Blutersatzstoffen, entwickelt
werden, welche es ermöglichen,
gemessene Analytenkonzentrationen bezgülich der Anwesenheit eines
oder mehrerer Interferenten anzupassen.
-
Während die
Erfindung speziell durch gewissen Ausführunsformen gezeigt und mit
Bezug darauf beschrieben wurde, versteht der Fachmann, dass verschiedene
andere Änderungen
bezüglich
Form und Einzelheit vorgenommen werden können, ohne vom Bereich der
Erfindung abzuweichen. LEGENDE
DER FIGUREN
| Figure
1 | Figur
1 |
| Fitted
CLHb (g/L) | Angepasstes
CLHb (g/l) |
| Actual
CLHb (g/L) | Tatsächliches
CLHb (g/l) |
| | |
| Figure
2 | Figur
2 |
| Predicted
CLHb (g/L) | Vorgesagtes
CLHb (g/l) |
| Actual
CLHb (g/L) | Tatsächliches
CLHb (g/l) |
| | |
| Figure
3 | Figur
3 |
| Fitted
Hb (g/L) | Angepasstes
Hb (g/l) |
| Actual
Hb (g/L) | Tatsächliches
Hb (g/l) |
| | |
| Figure
4 | Figur
3 |
| Effect
of CLHb on TProt | Auswirkung
von CLHb auf TProt |
| Total
Protein (g/L) | Gesamtprotein
(g/l) |
| CLHb
(g/L) | CLHb
(g/l) |
| | |
| Figure
5 | Figur
5 |
| Effect
of CLHb on AST | Auswirkung
von CLHb auf AST |
| AST
(U/L) | AST
(E/l) |
| CLHb
(g/L) | CLHb
(g/l) |
| Figure
6 | Figur
6 |
| Effect
of CLHb on ALP | Auswirkung
von CLHb auf ALP |
| ALP
(U/L) | ALP
(E/l) |
| CLHb
(g/L) | CLHb
(g/l) |
| | |
| Figure
7 | Figur
7 |
| Effect
of CLHb on TBili | Auswirkung
von CLHb auf TBili |
| TBili
(umol/L) | TBili
(μMol/l) |
| CLHb
(g/L) | CLHb
(g/l) |
