DE60013243T2

DE60013243T2 - Immunochromatographisches teststück und chromatographische analysenmethode

Info

Publication number: DE60013243T2
Application number: DE60013243T
Authority: DE
Inventors: Mie Takahashi; Masataka Nadaoka; Hirotaka Tanaka; Hiroshi Hirakata-shi Nakayama; Nobuyuki Kyotanabe-shi SHIGETO; Fumihisa Kadoma-shi Kitawaki
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 1999-10-25
Filing date: 2000-10-25
Publication date: 2005-11-17
Anticipated expiration: 2020-10-26
Also published as: EP1143247A1; JP2001124772A; DE60013243D1; JP4223163B2; WO2001031340A1; EP1143247B1; CN1327538A; EP1143247A4; CN100430726C; KR20010093217A; TW494238B

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein immunchromatographisches Probestück und ein chromatographisches Analysenverfahren zur Durchführung der qualitativen oder quantitativen Analyse einer flüssigen Probe durch Antigen-Antikörper-Reaktion und insbesondere solche, bei denen eine Analyse ohne Vorbehandlung einer gefärbten Probe wie Blut durchgeführt werden kann.
Hintergrund der Erfindung
Herkömmlich wird ein Untersuchungsverfahren mittels Immunchromatographie, das eine Antigen-Antikörper-Reaktion verwendet, allgemein als Verfahren zur Durchführung einer chemischen oder klinischen Untersuchung einer flüssigen Probe, wie etwa Wasser- oder Urinuntersuchung, gewählt. Im Allgemeinen wird auf ein Verfahren zum Trennen und Identifizieren von Gemischen durch Chromatographie entsprechend ihren Komponenten zurückgegriffen. Ein immunchromatographischen Probestück weist Folgendes auf: einen Teil zum Zugeben einer flüssigen Probe; einen Teil zum Halten eines Markierungsreagens, das durch Infiltration der flüssigen Probe migrieren kann und eine Substanz aufweist, die speziell an einen herabfließenden Analyten gebunden ist, der in der flüssigen Probe enthalten ist; einen Teil, der eine Bindungsreaktion des Markierungsreagens und des Analyten durchführt; und einen Teil zum Absorbieren einer herabfließenden Probe. Wenn die flüssige Probe in das chromatographischen Probestück gegeben wird und so belassen wird, kommt es nach Ablauf einer bestimmten Zeit zu einer Färbungsreaktion, die mit einer Färbung oder Entfärbung einhergeht, sodass eine qualitative Beurteilung aufgrund visueller Beobachtung möglich wird.
Ein immunchromatographisches Analysenverfahren ist ein Analysenverfahren, das ein Antigen oder einen Antikörper anhand der Besonderheit der Antigen-Antikörper-Reaktion identifiziert und nachweist. Das immunchromatographische Probestück weist weiterhin einen Teil auf, der ein fixiertes Antigen oder einen fixierten Antikörper hat, der eine Antigen-Antikörper-Reaktion mit einem Komplex aus dem in der flüssigen Probe enthaltenen Analyten und dem Markierungsreagens bewirkt, der mit dem vorgenannten typischen chromatographischen Probestück verglichen wird. Wenn eine flüssige Probe, die einen Analyten enthält, in ein immunchromatographischen Probestück gegeben wird, wird ein Markierungsreagens von der flüssigen Probe gelöst und wird in der Infiltrationsrichtung entwickelt, wodurch eine vorgegebene Färbung in einem Messbereich erzeugt wird, wo das Antigen oder der Antikörper fixiert ist. Daher kann aufgrund des Vorliegens der Färbung in dem Messbereich beurteilt werden, ob der vorgegebene Analyt in der flüssigen Probe enthalten ist oder nicht. Da das Analysenergebnis mittels der Färbungsreaktion bestimmt wird, wird es durch visuelle Beobachtung registriert. Auf diese Weise ist die Bestimmung des Analysenergebnisses bei einem immunchromatographischen Analysenverfahren extrem leicht, und das Verfahren kann für Analysen verschiedener Analyten verwendet werden.
Obwohl die Analyse durch Immunchromatographie im Großen und Ganzen qualitativ ist, sind aber auch quantitative Analysenverfahren entwickelt worden. In der veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Hei.8-240591 ist ein Verfahren zur Quantisierung eines Färbungsgrads beschrieben, bei dem eine Probe in das immunchromatographische Probestück gegeben wird, sodass es zu einer Reaktion kommt, und danach die Signale der Absorption und Reflexion an dem farblich reagierten Teil an dem Probestück unter Verwendung eines Nachweisgeräts gemessen werden. In der veröffentlichten japanischen Patentanmeldung Hei.8-334511 ist ein Verfahren beschrieben, das ein farblich reagiertes immunchromatographisches Probestück mit einem Bildsensor abbildet und die analytische Verarbeitung eines abgestuften Bilds des Probestücks, das einer Bildumwandlung unterzogen worden ist, durchführt, um dadurch den Färbungsgrad quantitativ zu messen.
Bei einem normalen immunchromatographischen Probestück gibt es kein Mittel zum mechanischen Steuern der Infiltrationsgeschwindigkeit einer flüssigen Pro be. Da die Infiltrationsgeschwindigkeit auf diese Weise nicht künstlich gesteuert werden kann, wird die Infiltrationsgeschwindigkeit von der Permeabilität des Probestücks beherrscht. Wenn unter Verwendung dieses Probestücks eine Zellteile enthaltende flüssige Probe wie Blut analysiert wird, führen die Viskosität der flüssigen Probe und das Vorhandensein der Zellteile zur Verstopfung eines Reaktionsschichtträgers, sodass die Infiltration der flüssigen Probe verhindert wird. Das hat eine sehr viel längere Messzeit zur Folge, während der es zur Trocknung der flüssigen Probe kommt, was zu mangelnder Reaktionsgenauigkeit und mangelnder Leistungsfähigkeit der quantitativen Bestimmung führt.
Außerdem wird bei einem immunchromatographischen Analysenverfahren zum Messen des Färbungsgrads, das eine visuelle Beobachtung oder ein Nachweisgerät verwendet, das Ablesen der durch die Antigen-Antikörper-Reaktion bewirkten Färbungsreaktion durch in einer gefärbten Probe enthaltene Farbstoffe, beispielsweise Blutfarbstoffe (rot) der Blutteile verhindert, wodurch die Empfindlichkeit bei der quantitativen Messung herabgesetzt wird oder Fehler beim Messen entstehen.
Um die vorgenannten Probleme beim Messen einer gefärbten Probe, insbesondere solcher Proben wie Vollblut, zu lösen, ist herkömmlich eine Vorbehandlung durch Zentrifugierung o.ä. notwendig gewesen, um in der Probe enthaltene Farbstoffe, das heißt, Blutkörperchenteile, die Blutfarbstoffe enthalten, vorher zu entfernen. Diese Vorbehandlung macht jedoch das immunchromatographische Analysenverfahren kompliziert und führt außerdem zu einer Erhöhung der Kosten und zu einer Verringerung der Brauchbarkeit.
Die vorliegende Erfindung wird in Anbetracht der vorstehenden Probleme gemacht und hat zum Ziel, ein immunchromatographisches Probestück und ein chromatographisches Analysenverfahren zur Verfügung zu stellen, die vermeiden können, dass die Infiltration der flüssigen Probe in das Probestück verhindert wird, die einen Färbungsgrad als Ergebnis der Antigen-Antikörper-Reaktion quantitativ ablesen können, ohne dabei durch den Hintergrund, der von in der Probe enthaltenen gefärbten Bestandteilen, insbesondere den Blutfarbstoffen, stammt, beeinträchtigt zu werden, und die außerdem keine Vorbehandlung durch Zentrifugierung o.ä. der zuzuführenden flüssigen Probe, insbesondere solcher Proben wie Blut, erfordern.
Beschreibung der Erfindung
Um die Ziele zu erreichen, hat entsprechend einem immunchromatographischen Probestück von Anspruch 1 bei einem immunchromatographisches Probestück, das bei der qualitativen oder quantitativen Analyse eines in einer gefärbten Probe enthaltenen Analyten verwendet wird, eine Markierungssubstanz selbst oder eine Substanz, die mit der Markierungssubstanz hergestellt wird, oder eine Markierungssubstanz nach Abschluss der Reaktion oder ein Reaktionspartner mit der Markierungssubstanz einen Wellenlängenbereich, der eine Absorptionswellenlänge, die sich von der Absorptionswellenlänge der den Analyten enthaltenden Probe unterscheidet, aufweist oder der die gleiche Absorptionswellenlänge mit einem Absorptionskoeffizienten hat, der ausreichend höher als der Absorptionskoeffizient der Probe ist.
Entsprechend dem immunchromatographischen Probestück von Anspruch 2 beträgt bei dem in Anspruch 1 definierten immunchromatographischen Probestück in dem Fall, dass die Probe Blut ist, die Absorptionswellenlänge, die für die an dem Probestück entstehende Färbung spezifisch ist, 580 nm oder mehr.
Entsprechend dem immunchromatographischen Probestück von Anspruch 3 weist das in Anspruch 1 oder 2 definierte immunchromatographische Probestück einen Bereich zum Halten einer Substanz auf, die in der Probe enthaltene Zellteile zerstört.
Entsprechend dem immunchromatographischen Probestück von Anspruch 4 weist bei dem in Anspruch 3 definierten immunchromatographischen Probestück die Substanz, die Zellteile zerstört, einen anorganischen Stoff, einen grenzflächenaktiven Stoff oder Saponine auf.
Entsprechend dem immunchromatographischen Probestück von Anspruch 5 enthält bei dem in Anspruch 4 definierten immunchromatographischen Probestück der anorganische Stoff Chlorid.
Entsprechend dem immunchromatographischen Probestück von Anspruch 6 enthält bei dem in Anspruch 4 definierten immunchromatographischen Probestück der grenzflächenaktive Stoff einen nichtpolaren grenzflächenaktiven Stoff.
Entsprechend dem immunchromatographischen Probestück von Anspruch 7 wird bei dem in einem der Ansprüche 1 bis 6 definierten immunchromatographischen Probestück ein Färbungsgrad qualitativ oder quantitativ mit einem Spektralphotometer analysiert.
Entsprechend dem immunchromatographischen Probestück von Anspruch 8 weist bei dem in einem der Ansprüche 1 bis 7 definierten immunchromatographischen Probestück die Markierungssubstanz mindestens eine Komponente aus der Gruppe Metallsol, oxidiertes Metallteilchen, Nichtmetallsol, Farbstoffsol, gefärbtes Teilchen, Pigment oder Enzym auf.
Entsprechend dem immunchromatographischen Probestück von Anspruch 9 enthält bei dem in einem der Ansprüche 1 bis 8 definierten immunchromatographischen Probestück der Analyt mindestens Plasmaprotein, Bakterien oder Viren.
Entsprechend einem chromatographischen Analysenverfahren von Anspruch 10 wird bei einem chromatographischen Analysenverfahren, das das immunchromatographische Probestück verwendet, die den Analyten enthaltende gefärbte Probe in das immunchromatographische Probestück gegeben, ein Färbungsgrad an dem Probestück wird mit einer für die Färbung spezifischen Absorptionswellenlänge gemessen, und eine Markierungssubstanz selbst oder eine Substanz, die mit der Markierungssubstanz hergestellt wird, oder eine Markierungssubstanz nach Abschluss der Reaktion oder ein Reaktionspartner mit der Markierungssubstanz hat einen Wellenlängenbereich, der eine Absorptionswellenlänge, die sich von der Absorptionswellenlänge der den Analyten enthaltenden Probe unterscheidet, aufweist oder der die gleiche Absorptionswellenlänge mit einem Ab sorptionskoeffizienten hat, der ausreichend höher als der Absorptionskoeffizient der Probe ist.
Entsprechend einem chromatographischen Analysenverfahren von Anspruch 11 wird bei dem in Anspruch 10 definierten chromatographischen Analysenverfahren in dem Fall, dass die Probe Blut ist, ein Signal von der Markierungssubstanz in einem Färbungsbereich bei einer Wellenlänge von 580 nm oder mehr gemessen, wodurch der Analyt qualitativ oder quantitativ analysiert wird.
Entsprechend dem chromatographischen Analysenverfahren von Anspruch 12 weist bei dem in Anspruch 10 oder 11 definierten chromatographischen Analysenverfahren das immunchromatographische Probestück einen Bereich auf, wo eine Substanz, die Zellteile in der Probe zerstört, gehalten wird.
Entsprechend dem chromatographischen Analysenverfahren von Anspruch 13 weist bei dem in Anspruch 12 definierten chromatographischen Analysenverfahren die Substanz, die Zellteile zerstört, einen anorganischen Stoff, einen grenzflächenaktiven Stoff oder Saponine auf.
Entsprechend dem chromatographischen Analysenverfahren von Anspruch 14 enthält bei dem in Anspruch 13 definierten chromatographischen Analysenverfahren der anorganische Stoff Chlorid.
Entsprechend dem chromatographischen Analysenverfahren von Anspruch 15 enthält bei dem in Anspruch 13 definierten immunchromatographischen Probestück der grenzflächenaktive Stoff einen nichtpolaren grenzflächenaktiven Stoff.
Entsprechend dem chromatographischen Analysenverfahren von Anspruch 16 wird bei dem in einem der Ansprüche 10 bis 15 definierten chromatographischen Analysenverfahren ein Färbungsgrad qualitativ oder quantitativ mit einem Spektralphotometer analysiert.
Entsprechend dem chromatographischen Analysenverfahren von Anspruch 17 weist bei dem in einem der Ansprüche 10 bis 16 definierten chromatographischen Analysenverfahren die Markierungssubstanz mindestens eine Komponen te aus der Gruppe Metallsol, oxidiertes Metallteilchen, Nichtmetallsol, Farbstoffsol, gefärbtes Teilchen, Pigment oder Enzym auf.
Entsprechend dem chromatographischen Analysenverfahren von Anspruch 18 enthält bei dem in einem der Ansprüche 10 bis 17 definierten chromatographischen Analysenverfahren der Analyt mindestens Plasmaprotein, Bakterien oder Viren.
Entsprechend einem immunchromatographischen Probestück der Ansprüche 1, 2, 8 und 9 hat bei einem immunchromatographische Probestück, das bei der qualitativen oder quantitativen Analyse eines in einer gefärbten Probe enthaltenen Analyten verwendet wird, eine Markierungssubstanz selbst oder eine Substanz, die mit der Markierungssubstanz hergestellt wird, einen Wellenlängenbereich, der eine Absorptionswellenlänge, die sich von der Absorptionswellenlänge der den Analyten enthaltenden Probe unterscheidet, aufweist oder der die gleiche Absorptionswellenlänge mit einem Absorptionskoeffizienten hat, der ausreichend höher als der Absorptionskoeffizient der Probe ist. Dadurch kann bei der Analyse der Probe, die gefärbte Bestandteile enthält, die qualitative oder quantitative Analyse des Färbungsgrads durchgeführt werden, ohne durch den Hintergrund beeinträchtigt zu werden, der von den gefärbten Bestandteilen kommt, sodass eine chromatographische Analyse mit hoher Empfindlichkeit und hoher Leistungsfähigkeit realisiert wird.
Entsprechend dem immunchromatographischen Probestück der Ansprüche 3 bis 6 weist das in Anspruch 1 oder 2 definierte immunchromatographische Probestück einen Bereich zum Halten einer Substanz auf, die Zellteile zerstört, die in der Probe enthalten sind. Daher werden neben den vorgenannten Effekten des Anspruchs 1 oder 2 die Zellteile zerstört, sodass die Infiltration der Probe in das Probestück bei der Analyse der die Zellteile enthaltenden Probe gleichmäßig wird, die Messdauer verringert wird und die quantitative Analyse genauer durchgeführt werden kann. Außerdem wird die Vorbehandlung der Probe mit den Zellteilen, wie etwa Blut, durch Zentrifugierung o.ä. unnötig, sodass eine Kostensenkung und eine Verbesserung der Brauchbarkeit realisiert werden.
Entsprechend dem immunchromatographischen Probestück von Anspruch 7 wird bei dem in einem der Ansprüche 1 bis 6 definierten immunchromatographischen Probestück ein Färbungsgrad qualitativ oder quantitativ mit einem Spektralphotometer analysiert. Daher kann neben den vorgenannten Effekten der Ansprüche 1 bis 6 bei Verwendung eines Reflexionsspektralphotometers ein opakes Material als Träger, der eine Reaktionsschicht trägt, verwendet werden, und außerdem kann die Messung durchgeführt werden, ohne auf den Zustand der Rückseite der Reaktionsschicht Rücksicht nehmen zu müssen. Wenn ein Permeabilitätsspektrophotometer verwendet wird, kann der Färbungsgrad eines tiefen Teils in der Reaktionsschicht ebenfalls gemessen werden, sodass die qualitative oder quantitative Analyse mit hoher Empfindlichkeit und hoher Leistungsfähigkeit durchgeführt wird.
Entsprechend einem chromatographischen Analysenverfahren der Ansprüche 10, 11, 17 und 18 wird bei einem chromatographischen Analysenverfahren, das das immunchromatographische Probestück verwendet, die den Analyten enthaltende gefärbte Probe in das immunchromatographische Probestück gegeben, ein Färbungsgrad an dem Probestück wird mit einer für die Färbung spezifischen Absorptionswellenlänge gemessen, und eine Markierungssubstanz selbst oder eine Substanz, die mit der Markierungssubstanz hergestellt wird, hat einen Wellenlängenbereich, der eine Absorptionswellenlänge, die sich von der Absorptionswellenlänge der den Analyten enthaltenden Probe unterscheidet, aufweist oder der die gleiche Absorptionswellenlänge mit einem Absorptionskoeffizienten hat, der ausreichend höher als der Absorptionskoeffizient der Probe ist. Dadurch kann bei der Analyse der Probe, die gefärbte Bestandteile enthält, die qualitative oder quantitative Analyse des Färbungsgrads durchgeführt werden, ohne durch den Hintergrund beeinträchtigt zu werden, der von den gefärbten Bestandteilen kommt, sodass eine chromatographische Analyse mit hoher Empfindlichkeit und hoher Leistungsfähigkeit realisiert wird.
Entsprechend dem chromatographischen Analysenverfahren der Ansprüche 12 bis 15 weist das in Anspruch 10 oder 11 definierte chromatographische Analysenverfahren einen Bereich zum Halten einer Substanz auf, die in der Probe enthaltene Zellteile zerstört. Daher werden neben den vorgenannten Effekten des Anspruchs 10 oder 11 die Zellteile zerstört, sodass die Infiltration der Probe in das Probestück bei der Analyse der die Zellteile enthaltenden Probe gleichmäßig wird, die Messdauer verringert wird und die quantitative Analyse genauer durchgeführt werden kann. Außerdem wird die Vorbehandlung der Probe mit den Zellteilen, wie etwa Blut, durch Zentrifugierung o.ä. unnötig, sodass eine Kostensenkung und eine Verbesserung der Brauchbarkeit realisiert werden.
Entsprechend dem chromatographischen Analysenverfahren von Anspruch 16 wird bei dem in einem der Ansprüche 10 bis 15 definierten chromatographischen Analysenverfahren ein Färbungsgrad qualitativ oder quantitativ mit einem Spektralphotometer analysiert. Daher kann neben den vorgenannten Effekten der Ansprüche 10 bis 15 bei Verwendung eines Reflexionsspektralphotometers ein opakes Material als Träger, der eine Reaktionsschicht trägt, verwendet werden, und außerdem kann die Messung durchgeführt werden, ohne auf den Zustand der Rückseite der Reaktionsschicht Rücksicht nehmen zu müssen. Wenn ein Permeabilitätsspektrophotometer verwendet wird, kann der Färbungsgrad eines tiefen Teils in der Reaktionsschicht ebenfalls gemessen werden, sodass die qualitative oder quantitative Analyse mit hoher Empfindlichkeit und hoher Leistungsfähigkeit durchgeführt wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Zeichnung, die ein immunchromatographisches Probestück nach einer ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt.
2 ist eine schematische Zeichnung, die ein immunchromatographisches Probestück nach einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt.
3(a) und (b) sind Diagramme, die die quantitativen Leistungsfähigkeiten nach einem Beispiel der vorliegenden Erfindung in dem Fall (a), dass ein Färbungsbereich bei einer Wellenlänge von 520 nm gemessen wird, und (b), dass der gleiche Färbungsbereich bei einer Wellenlänge von 610 nm gemessen wird, darstellen.
Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
Ausführungsform 1
Nachstehend werden ein immunchromatographisches Probestück und ein chromatographisches Analysenverfahren nach der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben.
1 ist eine schematische Zeichnung, die ein immunchromatographisches Probestück 10 nach der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt.
In 1 weist das immunchromatographische Probestück 10 einen Reaktionsschichtträger 1, einen Probenzugabeteil 2, einen Markierungssubstanz-Halteteil 3, eine Reaktionsschicht 4, einen Fixierteil 5 für spezifisches Protein und einen Absorptionsteil 6 auf.
Der Reaktionsschichtträger 1 besteht aus flüssigkeitsundurchlässigem Kunststoff o.ä. und trägt chromatographische Materialien. Der Probenzugabeteil 2 besteht aus einem absorbierenden Material, wie etwa Vliesstoff, und führt eine flüssige Probe zu oder trägt sie auf. Der Markierungssubstanz-Halteteil 3 hält ein Markierungsreagens, um es in dem Vliesstoff o.ä. aufzulösen. Die Reaktionsschicht 4 besteht aus Cellulosenitrat o.ä. Der Fixierteil 5 für spezifisches Protein fixiert das spezifische Protein, das eine Bindungsreaktion, die für einen Analyten, wie etwa ein Antigen oder einen Antikörper, spezifisch ist, entsprechend dem Reaktionsmodus in dem Bereich der Reaktionsschicht 4 durchführt. Der Absorptionsteil 6 absorbiert schließlich die flüssige Probe. Der Probenzugabeteil 2, der Markierungssubstanz-Halteteil 3, die Reaktionsschicht 4, der Fixierteil 5 für spezifisches Protein und der Absorptionsteil 6 sind, wie vorstehend dargelegt, jeweils auf dem Reaktionsschichtträger 1 ausgebildet. Ein geeignetes Markierungsreagens und ein geeignetes spezifisches Protein müssen entsprechend der analysierten Probe und dem Analyten gewählt werden.
Eine Substanz, die mit der Markierungssubstanz hergestellt wird, ist eine Substanz, die beispielsweise mit der Markierungssubstanz in dem Fixierteil 5 für spezifisches Protein hergestellt wird, und sie kann leuchtend sein. Eine Markie rungssubstanz nach Abschluss der Reaktion ist eine Markierungssubstanz nach dem Färben beispielsweise durch Färbungsreaktion. Ein Reaktionspartner mit der Markierungssubstanz ist beispielsweise eine Substanz, die nach dem Färben durch Zugeben eines Substrats zu dem Fixierteil 5 für spezifisches Protein, wo die Markierungssubstanz fixiert wird, beispielsweise in dem Fall erhalten wird, dass die Markierungssubstanz ein Enzym ist. Ein Farbstoffsol, ein wasserlösliches Pigment, ein Metallsol wie ein Goldkolloid, ein Nichtmetallsol wie Selen oder Kohlenstoff, ein oxidiertes Metallteilchen wie Ferrit, ein gefärbtes Teilchen wie Latex, ein Enzym o.ä. oder ein Komplex aus diesen Substanzen und einer Substanz, die spezifisch an den Analyten gebunden ist, wird als Markierungsreagens verwendet, das von dem Markierungssubstanz-Halteteil 3 gehalten wird.
Ein Beispiel für die Struktur des immunchromatographischen Probestücks 10 ist in 1 gezeigt. Es kann jede Struktur, in der die Chromatographie durchgeführt wird, gewählt werden, und die verwendeten Teile können aus einem beliebigen Träger und Reagens bestehen.
Ein Probestück mit einem chromatographischen Material, das aus einem beliebigen porösen Träger, wie etwa Cellulosenitrat und Glasfaserfilter, besteht, wird als immunchromatographisches Probestück 10 verwendet.
Nachstehend werden das immunchromatographische Probestück 10 und ein chromatographisches Analysenverfahren nach der ersten Ausführungsform beschrieben.
Wenn in 1 die flüssige Probe in den Probenzugabeteil 2 gegeben wird, dringt die flüssige Probe in den Probenzugabeteil 2 ein und erreicht den Markierungssubstanz-Halteteil 3. Dann wird das Markierungsreagens, das in dem Bereich des Markierungssubstanz-Halteteils 3 gehalten wird, durch Infiltration der flüssigen Probe aufgelöst und dringt zusammen mit der flüssigen Probe in die Reaktionsschicht 4 ein. Vorgesehen ist der Fixierteil 5 für spezifisches Protein, an dem das spezifische Protein in dem Bereich der Reaktionsschicht 4 fixiert wird. Wenn die flüssige Probe den Analyten enthält, führt das spezifische Protein eine Antigen-Antikörper-Reaktion an dem Komplex aus dem Analyten und dem Markierungsreagens durch, und in dem Bereich des Fixierteils 5 für spezifisches Protein ist eine Art Färbungsreaktion zu beobachten. Wenn die flüssige Probe den Analyten nicht enthält, findet keine Antigen-Antikörper-Reaktion statt und es ist auch keine Färbungsreaktion zu beobachten. Schließlich wird die flüssige Probe am Absorptionsteil 6 absorbiert und dadurch wird die Reaktion beendet.
Nach Abschluss der vorgenannten Reaktion wird ein Signal von der Markierungssubstanz im Färbungsbereich unter Verwendung eines beliebigen Nachweisgeräts gemessen. Wenn die Probe Vollblut ist, wird die Messung vorzugsweise mit einer beliebigen Wellenlänge von 580 nm oder mehr durchgeführt. Dadurch können das Vorhandensein der Färbung und der Färbungsgrad qualitativ oder quantitativ analysiert werden. Mit der vorgenannten Analyse kann festgestellt werden, ob die flüssige Probe den Analyten enthält oder nicht, und wenn die flüssige Probe den Analyten enthält, kann seine Menge quantitativ gemessen werden. Das vorgenannte „Signal von der Markierungssubstanz" bedeutet konkret eine Farbe der Markierungssubstanz, die selbst ein gefärbter Gegenstand ist, Lichtemission durch UV-Strahlung oder Anliegen einer Spannung oder Färbung durch Färbungsreaktion.
Außer dem Fall, dass ein ganzzahliger Wert einer Extinktion oder Extinktionsverteilung mit einer beliebigen Wellenlänge gemessen wird, kann bei der Messung des Signals von der Markierungssubstanz im Färbungsbereich die Extinktion in einem Wellenlängenbereich mit einer beliebigen Breite gemessen werden. In diesem Fall kann die Extinktion in dem festgelegten Wellenlängenbereich integriert werden und quantitativ analysiert werden.
Wie vorstehend dargelegt, wird bei dem immunchromatographischen Probestück und dem chromatographischen Analysenverfahren der ersten Ausführungsform das Signal von der Markierungssubstanz in dem Färbungsbereich an dem immunchromatographischen Probestück 10 beispielsweise mit einer beliebigen Wellenlänge von 580 nm oder mehr gemessen, sodass bei der Analyse der Probe, die gefärbte Bestandteile, insbesondere Blutfarbstoffe im Blut, enthält, die Messung des Färbungsgrads bei einer anderen Wellenlänge als 200 – 580 nm, der Absorptionswellenlänge von Blut, durchgeführt wird. Daher kann die qualitative oder quantitative Messung des Färbungsgrads durchgeführt werden, ohne dass diese durch den Hintergrund beeinträchtigt wird, der von gefärbten Be standteilen, insbesondere Blutfarbstoffen, kommt, die in der flüssigen Probe enthalten sind, wodurch der Messfehler verringert wird und die qualitative oder quantitative Analyse mittels Immunchromatographie mit einer höheren Empfindlichkeit und höheren Leistungsfähigkeit realisiert wird. Außerdem kann eine qualitative chromatographische Analyse durch visuelle Beobachtung der gefärbten Probe entsprechend dem verwendeten Markierungsreagens realisiert werden.
Weiterhin werden bei dieser ersten Ausführungsform Sandwichreaktionen mit dem Messungsmodus der Bindungsreaktion zwischen dem Markierungssubstanzkomplex und dem Analyten und die Bindungsreaktion zwischen diesem Reaktionspartner und einer fixierten Substanz als Beispiel genannt. Die Messung kann jedoch auch als Konkurrenzreaktion durchgeführt werden, bei der der Analyt und der Markierungssubstanzkomplex konkurrierend mit der fixierten Substanz reagieren.
Bei dieser ersten Ausführungsform wird in dem Fall, dass die Probe Vollblut ist, das Signal von der Markierungssubstanz mit einer beliebigen Wellenlänge von 580 nm oder mehr gemessen. Die Messung kann jedoch vorzugsweise bei einer beliebigen Wellenlänge von 580 bis 700 nm durchgeführt werden.
Bei dem chromatographischen Analysenverfahren der ersten Ausführungsform kann beispielsweise ein Reflexionsspektralphotometer als Nachweisgerät zum Messen des Färbungsgrads des immunchromatographischen Probestücks 10 verwendet werden. Außer den ähnlichen Wirkungen wie bei der ersten Ausführungsform kann ein opakes Material als Reaktionsschichtträger 1, der die Reaktionsschicht 4 trägt, verwendet werden. Dadurch wird die Materialauswahl vergrößert, und außerdem kann die Messung durchgeführt werden, ohne auf den Zustand der Rückseite der Reaktionsschicht 4 Rücksicht nehmen zu müssen.
Bei dem chromatographischen Analysenverfahren der ersten Ausführungsform kann beispielsweise ein Permeabilitätsspektrophotometer als Nachweisgerät zum Messen des Färbungsgrads des immunchromatographischen Probestücks 10 verwendet werden. Zusätzlich zu den ähnlichen Wirkungen wie bei der ersten Ausführungsform kann auch der Färbungsgrad eines tiefen Teils in der Reaktionsschicht 4 gemessen werden. Daher ist eine qualitative oder quantitative Ana lyse mit höherer Empfindlichkeit und höherer Leistungsfähigkeit möglich. Außerdem kann das Markierungsreagens mit niedriger Konzentration verwendet werden.
Bei dieser ersten Ausführungsform wird insbesondere Blut als die die gefärbten Bestandteile enthaltende Probe verwendet. Das ist jedoch nur ein Beispiel. Es können auch Proben analysiert werden, die andere gefärbte Bestandteile als Blut enthalten. Beispielsweise werden auch Urin, okkultes Blut im Stuhl, aus Lebensmitteln o.ä. ausgedrückte Flüssigkeiten usw. verwendet. In diesem Fall müssen das Markierungsreagens und das spezifische Protein entsprechend der analysierten Probe und dem Analyten gewählt werden. Das heißt, ein Absorptionskoeffizient bei der Wellenlänge, die für die Farbreaktion spezifisch ist, muss ausreichend höher als der Absorptionskoeffizient der Probe bei der gleichen Wellenlänge sein. Bei der Messung des Färbungsgrads mit dem Nachweisgerät kann die Messung bei der Wellenlänge erfolgen, die für die Färbungsreaktion spezifisch ist. Die vorgenannte „spezifische Wellenlänge" bedeutet eine beliebige Wellenlänge oder einen breiten Wellenlängenbereich mit einer beliebigen Breite, aber keinen maximalen Wellenlängenbereich der gefärbten Probe. Die vorgenannte Formulierung „ausreichend höher" heißt, dass das Signal von der Markierungssubstanz durch die Farbreaktion so stark ist, dass ein zuverlässiges Ergebnis der qualitativen oder quantitativen Analyse erhalten wird.
Ausführungsform 2
Nachstehend werden ein immunchromatographisches Probestück und ein chromatographisches Analysenverfahren nach einer zweiten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben.
2 ist eine Darstellung, die ein immunchromatographisches Probestück 10 nach der zweiten Ausführungsform zeigt.
In 2 weist das immunchromatographische Probestück 10 einen Reaktionsschichtträger 1, einen Probenzugabeteil 2, einen Markierungssubstanz-Halteteil 3, eine Reaktionsschicht 4, einen Fixierteil 5 für spezifisches Protein, einen Absorptionsteil 6 und einen Halteteil 7 für die Zellteile-zerstörende Substanz auf.
Der Reaktionsschichtträger 1 besteht aus Flüssigkeits-undurchlässigem Kunststoff o.ä. und trägt chromatographische Materialien. Der Probenzugabeteil 2 besteht aus einem absorbierenden Material, wie etwa Vliesstoff, und führt eine flüssige Probe zu oder trägt sie auf. Der Markierungssubstanz-Halteteil 3 hält ein Markierungsreagens, um es in dem Vliesstoff o.ä. aufzulösen. Die Reaktionsschicht 4 besteht aus Cellulosenitrat o.ä. Der Fixierteil für spezifisches Protein 5 fixiert das spezifische Protein, das eine Bindungsreaktion, die für einen Analyten, wie etwa ein Antigen oder einen Antikörper, spezifisch ist, entsprechend dem Reaktionsmodus in dem Bereich der Reaktionsschicht 4 durchführt. Der Absorptionsteil 6 absorbiert schließlich die flüssige Probe. Der Halteteil 7 für die Zellteile-zerstörende Substanz hält eine Substanz, die Zellteile zerstört. Der Probenzugabeteil 2, der Markierungssubstanz-Halteteil 3, die Reaktionsschicht 4, der Fixierteil 5 für spezifisches Protein, der Absorptionsteil 6 und der Halteteil 7 für die Zellteile-zerstörende Substanz sind, wie vorstehend dargelegt, jeweils auf dem Reaktionsschichtträger 1 vorgesehen. Das geeignete Markierungsreagens, das geeignete spezifische Protein und die geeignete zellteilezerstörende Substanz müssen entsprechend der analysierten Probe und dem Analyten gewählt werden.
Eine Substanz, die mit der Markierungssubstanz hergestellt wird, ist eine Substanz, die beispielsweise mit der Markierungssubstanz in dem Fixierteil für spezifisches Protein 5 hergestellt wird, und sie kann leuchtend sein. Eine Markierungssubstanz nach Abschluss der Reaktion ist eine Markierungssubstanz nach dem Färben beispielsweise durch Färbungsreaktion. Ein Reaktionspartner mit der Markierungssubstanz ist eine Substanz, die nach dem Färben durch Zugeben eines Substrats zu dem Fixierteil 5 für spezifisches Protein, wo die Markierungssubstanz fixiert wird, beispielsweise in dem Fall erhalten wird, dass die Markierungssubstanz ein Enzym ist. Ein Farbstoffsol, ein wasserlösliches Pigment und ein Metallsol wie ein Goldkolloid, ein Nichtmetallsol wie Selen oder Kohlenstoff, ein oxidiertes Metallteilchen wie Ferrit, ein gefärbtes Teilchen wie Latex, ein Enzym o.ä. oder ein Komplex aus diesen Substanzen und einer Substanz, die eine für den Analyten spezifische Bindungsreaktion durchführt, werden als Markierungsreagens verwendet, das von dem Markierungssubstanz-Halteteil 3 gehalten wird.
Chlorid wie Natriumchlorid oder Kaliumchlorid, nichtpolare grenzflächenaktive Stoffe wie ein „triton"-System (triton = Triton oder Trinitrotoluen) und ein Tween-System, polare grenzflächenaktive Stoffe oder Saponine werden als Zellteilezerstörende Substanz verwendet, die von dem Halteteil 7 für die Zellteilezerstörende Substanz gehalten wird.
Ein Beispiel für die Struktur des immunchromatographischen Probestücks 10 ist in 2 gezeigt. Es kann jede Struktur, in der die Chromatographie durchgeführt wird und die das Halteteil 7 für die Zellteile-zerstörende Substanz aufweist, gewählt werden, und die verwendeten Teile können aus einem beliebigen Träger und Reagens bestehen.
Ein Probestück mit einem chromatographischen Material, das aus einem beliebigen porösen Träger, wie etwa Cellulosenitrat und Glasfaserfilter, besteht, wird als immunchromatographisches Probestück 10 verwendet.
Nachstehend werden das immunchromatographische Probestück 10 und ein chromatographisches Analysenverfahren nach der zweiten Ausführungsform beschrieben.
Wenn in 2 die flüssige Probe in den Probenzugabeteil 2 gegeben wird, dringt die flüssige Probe in den Probenzugabeteil 2 ein und erreicht den Bereich des Halteteils 7 für die Zellteile-zerstörende Substanz. Die Zellteile der flüssigen Probe werden durch die Funktion der in diesem Bereich enthaltenen Zellteilezerstörenden Substanz zerstört. Die flüssige Probe, in der diese Zellteile zerstört sind, erreicht den Markierungssubstanz-Halteteil 3. Dann wird das Markierungsreagens, das in dem Bereich des Markierungssubstanz-Halteteils 3 gehalten wird, durch Infiltration der flüssigen Probe aufgelöst und dringt zusammen mit der flüssigen Probe in die Reaktionsschicht 4 ein. Vorgesehen ist der Fixierteil 5 für spezifisches Protein, an dem das spezifische Protein in dem Bereich der Reaktionsschicht 4 fixiert wird. Wenn die flüssige Probe den Analyten enthält, führt das spezifische Protein eine Antigen-Antikörper-Reaktion an dem Komplex aus dem Analyten und dem Markierungsreagens durch, und in dem Bereich des Fixierteils 5 für spezifisches Protein ist eine Art Färbungsreaktion zu beobachten. Wenn die flüssige Probe den Analyten nicht enthält, findet keine Antigen-Antikörper- Reaktion statt und es ist auch keine Färbungsreaktion zu beobachten. Schließlich wird die flüssige Probe am Absorptionsteil absorbiert, und dadurch wird die Reaktion beendet.
Nach Abschluss der vorgenannten Reaktion wird ein Signal von der Markierungssubstanz im Färbungsbereich unter Verwendung eines beliebigen Nachweisgeräts gemessen. Wenn die Probe Vollblut ist, wird die Messung vorzugsweise mit einer beliebigen Wellenlänge von 580 nm oder mehr durchgeführt. Dadurch können das Vorhandensein der Färbung und der Färbungsgrad qualitativ oder quantitativ analysiert werden. Mit der vorgenannten Analyse kann festgestellt werden, ob die flüssige Probe den Analyten enthält oder nicht, und wenn die flüssige Probe den Analyten enthält, kann seine Menge quantitativ gemessen werden. Das vorgenannte „Signal von der Markierungssubstanz" bedeutet konkret eine Farbe der Markierungssubstanz, die selbst ein gefärbter Gegenstand ist, Lichtemission durch UV-Strahlung oder Anliegen einer Spannung oder Färbung durch Färbungsreaktion.
Außer dem Fall, dass ein ganzzahliger Wert einer Extinktion oder Extinktionsverteilung bei einer beliebigen Wellenlänge gemessen wird, kann bei der Messung des Signals von der Markierungssubstanz im Färbungsbereich die Extinktion in einem Wellenlängenbereich mit einer beliebigen Breite gemessen werden. In diesem Fall kann die Extinktion in dem festgelegten Wellenlängenbereich integriert werden und quantitativ analysiert werden.
Wie vorstehend dargelegt, wird bei dem immunchromatographischen Probestück und dem chromatographischen Analysenverfahren der zweiten Ausführungsform das Signal von der Markierungssubstanz in dem Färbungsbereich an dem immunchromatographischen Probestück 10 beispielsweise bei einer beliebigen Wellenlänge von 580 nm oder mehr gemessen, sodass bei der Analyse von gefärbten Bestandteilen, insbesondere einer Probe, die Blutfarbstoffe im Blut enthält, der Färbungsgrad bei einer anderen Wellenlänge als 200 – 580 nm, der Absorptionswellenlänge von Blut, gemessen wird. Daher kann die qualitative oder quantitative Messung des Färbungsgrads durchgeführt werden, ohne dass diese durch den Hintergrund beeinträchtigt wird, der von gefärbten Bestandteilen, insbesondere Blutfarbstoffen, kommt, die in der flüssigen Probe enthalten sind, wo durch der Messfehler verringert wird und die qualitative oder quantitative Analyse mittels Immunchromatographie mit einer höheren Empfindlichkeit und höheren Leistungsfähigkeit realisiert wird.
Da ein Teil zum Halten der die Zellteile zerstörenden Substanz vorgesehen ist, werden die Zellteile zerstört, sodass eine gleichmäßige Infiltration auf die Reaktionsschicht 4 beim Analysieren der die Zellteile enthaltenden flüssigen Probe möglich ist. Dadurch wird die Messdauer verkürzt und die quantitative Analyse genauer durchgeführt. Außerdem ist für die Probe mit den Zellteilen, wie etwa Blut, keine Vorbehandlung wie Zentrifugierung erforderlich, wodurch eine Kostensenkung und eine Verbesserung der Brauchbarkeit realisiert werden.
Außerdem kann eine chromatographische qualitative Analyse durch visuelle Beobachtung der gefärbten Probe entsprechend dem verwendeten Markierungsreagens realisiert werden.
Weiterhin werden bei dieser zweiten Ausführungsform Sandwichreaktionen, die den Messungsmodus der Bindungsreaktion zwischen dem Markierungssubstanzkomplex und dem Analyten haben, und die Bindungsreaktion zwischen diesem Reaktionspartner und einer fixierten Substanz als Beispiel beschrieben. Die Messung kann jedoch auch als Konkurrenzreaktion durchgeführt werden, bei der der Analyt und der Markierungssubstanzkomplex konkurrierend mit der fixierten Substanz reagieren.
Bei dieser zweiten Ausführungsform wird in dem Fall, dass die Probe Vollblut ist, das Signal von der Markierungssubstanz bei einer beliebigen Wellenlänge von 580 nm oder mehr gemessen. Die Messung kann jedoch vorzugsweise bei einer beliebigen Wellenlänge von 580 bis 700 nm durchgeführt werden.
Bei dem chromatographischen Analysenverfahren der zweiten Ausführungsform kann beispielsweise ein Reflexionsspektralphotometer als Nachweisgerät zum Messen des Färbungsgrads des immunchromatographischen Probestücks 10 verwendet werden. Außer den ähnlichen Wirkungen wie bei der zweiten Ausführungsform kann ein opakes Material als Reaktionsschichtträger 1, der die Reaktionsschicht 4 trägt, verwendet werden. Dadurch wird die Materialauswahl vergrö ßert, und außerdem kann die Messung durchgeführt werden, ohne auf den Zustand der Rückseite der Reaktionsschicht 4 Rücksicht nehmen zu müssen.
Bei dem chromatographischen Analysenverfahren der zweiten Ausführungsform kann beispielsweise ein Permeabilitätsspektrophotometer als Nachweisgerät zum Messen des Färbungsgrads des immunchromatographischen Probestücks 10 verwendet werden. Zusätzlich zu den ähnlichen Wirkungen wie bei der zweiten Ausführungsform kann auch der Färbungsgrad eines tiefen Teils in der Reaktionsschicht 4 gemessen werden. Daher ist eine qualitative oder quantitative Analyse mit höherer Empfindlichkeit und höherer Leistungsfähigkeit möglich. Außerdem kann das Markierungsreagens mit niedriger Konzentration verwendet werden.
Bei dieser zweiten Ausführungsform wird insbesondere Blut als die Probe verwendet, die die gefärbten Bestandteile und die Zellteile enthält. Das ist jedoch nur ein Beispiel, und es können auch Proben analysiert werden, die andere gefärbte Bestandteile als Blut enthalten. Beispielsweise werden auch Körperflüssigkeiten, bakterienhaltige Flüssigkeiten und aus Lebensmitteln o.ä. ausgedrückte Flüssigkeiten verwendet. In diesem Fall müssen das Markierungsreagens und der Antikörper entsprechend der analysierten Probe und dem Analyten gewählt werden. Das heißt, ein Absorptionskoeffizient bei der Wellenlänge, die für die Farbreaktion spezifisch ist, muss ausreichend höher als der Absorptionskoeffizient der Probe bei der gleichen Wellenlänge sein. Bei der Messung des Färbungsgrads mit dem Nachweisgerät kann die Messung bei der Wellenlänge erfolgen, die für die Farbreaktion spezifisch ist. Die vorgenannte „spezifische Wellenlänge" bedeutet eine beliebige Wellenlänge oder einen breiten Wellenlängenbereich mit einer beliebigen Breite, aber keinen maximalen Wellenlängenbereich der gefärbten Probe. Die vorgenannte Formulierung „ausreichend höher" heißt, dass das Signal von der Markierungssubstanz durch die Färbungsreaktion so stark ist, dass ein zuverlässiges Ergebnis der qualitativen oder quantitativen Analyse erhalten wird.
Beispiele
Nachstehend wird ein Verfahren zur Implementierung der vorliegenden Erfindung anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben. Diese nachstehend beschriebenen Beispiele beschränken jedoch nicht den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung.
Quantitative Bestimmung von HCG im Blut
Es wird ein immunchromatographisches Probestück mit einer Anti-HCG-β-Antikörper-Fixierlinie und einem breiten Band eines Komplexes aus Anti-HCG-α-Antikörper und Goldkolloid in einer Cellulosenitratmembran hergestellt. Diese Probestück ist in 2 gezeigt. In der Figur weist das Probestück einen Antikörper-Fixierteil 5, einen den Komplex aus Anti-HCG-α-Antikörper und Goldkolloid enthaltenden Markierungssubstanz-Halteteil 3, der vor dem Antikörper-Fixierteil 5 angeordnet ist, und einen Probenzugabeteil 2 auf. Dieses Probestück wird nach folgendem Verfahren hergestellt.
BEISPIEL 1
Herstellung des chromatographischen Probestücks:
Es wird eine Anti-HCG-β-Antikörperlösung hergestellt, deren Konzentration durch Verdünnung mit Phosphorsäurepufferlösung eingestellt wird. Diese Antikörperlösung wird mit einer Lösungsaustragsvorrichtung auf eine Cellulosenitratmembran aufgebracht. Dadurch wird eine Antikörper-Fixierlinie für den Nachweis auf der Cellulosenitratmembran erhalten. Nach dem Entwässern wird diese Cellulosenitratmembran in Tris-HCl-Pufferlösung, die 1 % Magermilch enthält, eingeweicht und 30 Minuten vorsichtig geschüttelt. Nach Ablauf von 30 Minuten wird die Membran in ein Tris-HCl-Pufferlösungsbad gelegt und 10 Minuten vorsichtig geschüttelt, und anschließend wird sie in ein weiteres Tris-HCl-Pufferlösungsbad gelegt und weitere 10 Minuten vorsichtig geschüttelt. Anschließend wird die Cellulosenitratmembran gewaschen. Nach zweimaligem Waschen wird die Membran aus der Waschlösung genommen und bei Raumtemperatur entwässert.
Goldkolloid wird dadurch hergestellt, dass 1-%ige Zitronensäurelösung bei 100 °C unter Umwälzung zu einer 0,01-%igen Goldchloridsäurelösung gegeben wird. Nach 30-minütiger Umwälzung wird die Lösung abgekühlt. Zu der Goldkolloidlösung, die mit 0,2 M Kaliumcarbonatlösung mit einem pH von 9 hergestellt worden ist, wird Anti-HCG-α-Antikörper gegeben, und dann wird die Goldkolloidlösung einige Minuten gerührt. Anschließend wird 10-%ige BSA-Lösung (BSA: Rinderserumalbumin) mit pH 9 in einer solchen Menge zugegeben, dass die Endkonzentration der Goldkolloidlösung 1 % beträgt, und danach wird die Goldkolloidlösung gerührt, wodurch ein Antikörper-Goldkolloid-Komplex (Markierungssubstanz-Antikörper) hergestellt wird. Dann wird diese Markierungssubstanz-Antikörper-Lösung 50 Minuten bei 4 °C mit 20.000 G zentrifugiert, um den Markierungssubstanz-Antikörper zu isolieren, und der Markierungssubstanz-Antikörper wird in Waschpufferlösung (1 % BSA, Phosphorsäurepufferlösung) suspendiert und anschließend zentrifugiert, wodurch der Markierungssubstanz-Antikörper gereinigt und isoliert wird. Dieser Markierungssubstanz-Antikörper wird in Waschpufferlösung suspendiert und dann mit einem 0,8-μm-Filter filtriert. Anschließend wird der Markierungssubstanz-Antikörper so zubereitet, dass er 1/10 der ursprünglichen Goldkolloidlösung ausmacht, und wird dann bei 4 °C gelagert.
Die Markierungssubstanz-Antikörper-Lösung wird in eine Lösungsaustragsvorrichtung gegeben und auf einen Teil der entwässerten Anti-HCG-β-Antikörper-Fixiermembran aufgebracht, der von der Stelle entfernt ist, wo der Antikörper fixiert ist, und anschließend wird die Membran entwässert. Auf diese Weise wird der Markierungssubstanz-Antikörper-Halteteil auf der fixierten Membran hergestellt.
Die Antikörper-Fixiermembran mit dem Markierungssubstanz-Antikörper-Halteteil, der wie vorstehend hergestellt worden ist, wird an den Reaktionsschichtträger angeklebt, und Vliesstoff, der nach dem Imprägnieren mit grenzflächenaktivem Stoff als Hämolyse-Agens entwässert wird, und Glasfaserfilter werden als Probenzugabeteil bzw. Absorptionsteil hinzugefügt. Anschließend wird die Membran in Streifen mit einer Breite von 0,5 cm geschnitten, wodurch ein Probestück hergestellt wird.
BEISPIEL 2
Herstellung der Probe:
Humanblut, das mit Heparin als gerinnungshemmendes Mittel versetzt ist, wird so aufbereitet, dass es einen Hämatokrit-Wert von 45 % hat. Durch Zugeben von HCG-Lösungen mit bekannten Konzentrationen zu diesem Blut werden HCG-Lösungen mit verschiedenen bekannten Konzentrationen hergestellt.
BEISPIEL 3
Untersuchung der Wellenlänge, bei der die Extinktion gemessen werden soll:
Es werden 200 μl oder mehr Blut, das HCG enthält, in den Probenzugabeteil auf Probestücke gegeben, und dann wird es zu einem Absorptionsteil hin entwickelt, um dadurch eine Antigen-Antikörper-Reaktion und eine Färbungsreaktion im Antikörper-Fixierteil durchzuführen. Der Zustand der Färbung 5 Minuten nach der Zugabe der Probe zu den Probestücken wird mit einem Reflexionsspektralphotometer (CS9300; hergestellt von Shimadzu Corporation) gemessen. Anschließend erfolgt die arithmetische Verarbeitung des Färbungsgrads.
Das Blut (Hämatokritwert 45 %), das HCG in einer Menge von 0 E/l, 100 E/l, 1000 E/l bzw. 10.000 E/l enthält, wird zu den Probestücken gegeben und dann entwickelt. Die Färbungszustände an dem Antikörper-Fixierteil auf dem Probestück werden für das Blut mit der jeweiligen HCG-Konzentration mit dem Reflexionsspektralphotometer gemessen. Es werden die Extinktionen bei Wellenlängen von 520 und 620 nm gemessen, und sie werden durch eine zuvor erstellte Eichkurve ersetzt, die den Zusammenhang zwischen der HCG-Konzentration und der Extinktion zeigt. Das Ergebnis ist in 3 dargestellt. Wenn die Extinktion von Blut, das HCG in einer Menge von 1000 E/l enthält, gemessen wird und durch die Eichkurve ersetzt wird, müsste die HCG-Konzentration eigentlich 1000 E/l betragen. In der Praxis gibt es jedoch eine geringe Abweichung, und anhand des Ausmaßes dieser Abweichung kann die Genauigkeit der Messung ermittelt werden.
Die 3 sind Diagramme, die die quantitative Leistungsfähigkeit für den Fall (a), dass die Extinktion bei der quantitativen chromatographischen Messung bei einer Wellenlänge von 520 nm gemessen wird, und für den Fall (b) zeigen, dass diese bei einer Wellenlänge von 610 nm gemessen wird. Die Abszissenachse gibt die HCG-Konzentration der zu den Probestücken gegebenen Probe an. Die Ordinatenachse gibt den umgerechneten Wert der Antigen-Konzentration an, der durch Ersetzen des Signals von einer Markierungssubstanz in einem Färbungsbereich auf dem Probestück durch die Eichkurve erhalten wird.
Nachstehend werden die Wirkungen bei der quantitativen chromatographischen Messung für den Fall beschrieben, dass die Messung bei einer Wellenlänge von 580 nm oder weniger durchgeführt wird, und für den Fall, dass die Messung bei einer Wellenlänge von 580 nm oder mehr durchgeführt wird.
In 3 sind die umgerechneten Ergebnisse der Konzentration des Analyten auf der Grundlage der Messwerte des Färbungsgrads 5 Minuten nach Zugabe einer flüssigen Probe zu dem immunchromatographischen Probestück dargestellt. Als Markierungsreagens wird in beiden Fällen (a) und (b) der gleiche Antikörper-Goldkolloid-Komplex verwendet. Wenn die Messung zunächst bei 610 nm durchgeführt wird [3(b)], liegen die Werte des Variationskoeffizienten im Bereich von 0 bis 15 %. Wenn die Messung hingegen bei 520 nm durchgeführt wird [ 3(a)], variieren die Werte des Variationskoeffizienten von 35 bis 45 % dadurch, dass sie von den Farbstoffen der Blutkörperchen beeinflusst werden, und diese große Streuung zeigt, dass die quantitative Leistungsfähigkeit schlecht ist.
Bei dieser Ausführungsform ist das Ergebnis unter Verwendung des Goldkolloids als Markierungssubstanz beschrieben worden. Das Goldkolloid hat jedoch vorzugsweise einen Teilchendurchmesser mit einer Absorption bei einer Wellenlänge von 580 nm oder mehr. Wenn anstatt des Goldkolloids gefärbte Teilchen oder wasserlösliche Pigmente als Markierungssubstanz verwendet werden, wird die Messung zweckmäßigerweise bei der maximalen Absorptionswellenlänge der gefärbten Teilchen, beispielsweise bei einer Wellenlänge von etwa 650 nm für blaue Teilchen oder blaue Pigmente, oder bei einer beliebigen Wellenlänge von 580 nm oder mehr für Ruß durchgeführt. Die Wellenlänge der Messung beruht auf der Absorptionswellenlänge des gefärbten Reaktionspartners.
Anwendungsmöglichkeiten in der Industrie
Wenn bei der vorliegenden Erfindung die chromatographische Analyse durchgeführt wird, um die flüssige Probe unter Verwendung der Antigen-Antikörper-Reaktion qualitativ oder quantitativ zu analysieren, wird bewirkt, dass die Markierungssubstanz selbst oder eine Substanz, die mit der Markierungssubstanz hergestellt wird, den Wellenlängenbereich hat, der eine Absorptionswellenlänge, die sich von der Absorptionswellenlänge der den Analyten enthaltenden Probe unterscheidet, aufweist oder der die gleiche Absorptionswellenlänge mit einem Absorptionskoeffizienten hat, der ausreichend höher als der Absorptionskoeffizient der Probe ist, wodurch eine Analyse ohne Vorbehandlung der gefärbten Probe wie Blut durchgeführt wird.

Claims

Immunchromatographisches Probestück, das bei der qualitativen oder quantitativen Analyse eines in einer gefärbten Probe enthaltenen Analyten verwendet wird, dadurch gekennzeichnet, dass eine Markierungssubstanz selbst oder eine Substanz, die mit der Markierungssubstanz hergestellt wird, oder eine Markierungssubstanz nach Abschluss der Reaktion oder ein Reaktionspartner mit der Markierungssubstanz einen Wellenlängenbereich hat, der eine Absorptionswellenlänge, die sich von der Absorptionswellenlänge der den Analyten enthaltenden Probe unterscheidet, aufweist oder der die gleiche Absorptionswellenlänge mit einem Absorptionskoeffizienten hat, der ausreichend höher als der Absorptionskoeffizient der Probe ist.
Immunchromatographisches Probestück nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Fall, dass die Probe Blut ist, die Absorptionswellenlänge, die für die an dem Probestück entstehende Färbung spezifisch ist, 580 nm oder mehr ist.
Immunchromatographisches Probestück nach Anspruch 1 oder 2, das einen Bereich zum Halten einer Substanz, die in der Probe enthaltene Zellteile zerstört, aufweist.
Immunchromatographisches Probestück nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz, die Zellteile zerstört, einen anorganischen Stoff, einen grenzflächenaktiven Stoff oder Saponine aufweist.
Immunchromatographisches Probestück nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der anorganische Stoff Chlorid enthält.
Immunchromatographisches nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der grenzflächenaktive Stoff einen nichtpolaren grenzflächenaktiven Stoff enthält.
Immunchromatographisches Probestück nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass ein Färbungsgrad qualitativ oder quantitativ mit einem Spektralphotometer analysiert wird.
Immunchromatographisches Probestück nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungssubstanz mindestens eine Komponente aus der Gruppe Metallsol, oxidiertes Metallteilchen, Nichtmetallsol, Farbstoffsol, gefärbtes Teilchen, Pigment oder Enzym aufweist.
Immunchromatographisches Probestück nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt mindestens Plasmaprotein, Bakterien oder Viren enthält.
Chromatographisches Analysenverfahren, das das immunchromatographische Probestück verwendet, dadurch gekennzeichnet, dass die gefärbte Probe, die den Analyten enthält, in das immunchromatographische Probestück gegeben wird, ein Färbungsgrad an dem Probestück mit einer für die Färbung spezifischen Absorptionswellenlänge gemessen wird und eine Markierungssubstanz selbst oder eine Substanz, die mit der Markierungssubstanz hergestellt wird, oder eine Markierungssubstanz nach Abschluss der Reaktion oder ein Reaktionspartner mit der Markierungssubstanz einen Wellenlängenbereich hat, der eine Absorptionswellenlänge, die sich von der Absorptionswellenlänge der den Analyten enthaltenden Probe unterscheidet, aufweist oder der die gleiche Absorptionswellenlänge mit einem Absorptionskoeffizienten hat, der ausreichend höher als der Absorptionskoeffizient der Probe ist.
Chromatographisches Analysenverfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass in dem Fall, dass die Probe Blut ist, ein Signal von der Markierungssubstanz in einem Färbungsbereich bei einer Wellenlänge von 580 nm oder mehr gemessen wird, wodurch der Analyt qualitativ oder quantitativ analysiert wird.
Chromatographisches Analysenverfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass das immunchromatographische Probestück einen Bereich aufweist, wo eine Substanz, die Zellteile in der Probe zerstört, gehalten wird.
Chromatographisches Analysenverfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Substanz, die Zellteile zerstört, einen anorganischen Stoff, einen grenzflächenaktiven Stoff oder Saponine aufweist.
Chromatographisches Analysenverfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der anorganische Stoff Chlorid enthält.
Chromatographisches Analysenverfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass der grenzflächenaktive Stoff einen nichtpolaren grenzflächenaktiven Stoff enthält.
Chromatographisches Analysenverfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass ein Färbungsgrad qualitativ oder quantitativ mit einem Spektralphotometer analysiert wird.
Chromatographisches Analysenverfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungssubstanz mindestens eine Komponente aus der Gruppe Metallsol, oxidiertes Metallteilchen, Nichtmetallsol, Farbstoffsol, gefärbtes Teilchen, Pigment oder Enzym aufweist.
Chromatographisches Analysenverfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt mindestens Plasmaprotein, Bakterien oder Viren enthält.