JPH0972904A - 微量なヘモグロビン▲Ａ１ｃ▼測定用乾式試験片 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【解決手段】（ｉ）溶血剤を塗布した溶血層４、（ｉ
ｉ）ヘモグロビンＡを捕捉する機能を有する測定層５、
（ｉｉｉ）展開残液を吸収する吸収層６、をこの順序で
有する一個の連続した展開層２と、（ｉｖ）溶血剤，変
性剤，微粒子を塗布した溶血層７、（ｖ）微粒子一個に
つき複数個の抗ヘモグロビンＡ_１ｃ抗体が固定化されて
いる微粒子を含む凝集層８、（ｖｉ）凝集微粒子のみを
捕捉する測定層９、（ｖｉｉ）展開残液を吸収する吸収
層１０、をこの順序で有する一個の連続した展開層３と
が、一個の支持体１上に並べて設置してあり、ｉからｉ
ｉｉまでの間並びにｉｖからｖｉｉまでの間を液体が移
動しうることを特徴とする、血液検体用乾式測定用具。 【効果】大型の分析装置を用いず、前処理を要せずに患
者自身が在宅でも簡単な操作でヘモグロビンＡ_１ｃを測
定できる。さらに、目的物質を標識しないので、標識化
による抗体の変性の危険性もない。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、検体となる血中のヘモ
グロビンＡ（ＨｂＡと略する）と、そのグリコヘモグロ
ビンであるヘモグロビンＡ_１ｃ（ＨｂＡ_１ｃと略する）
とを同時に簡易測定するための乾式の試験片に関する。
特に、検体中にＨｂＡ_１ｃが非常に少ない場合に有用な
試験片に関する。

【０００２】

【従来の技術】血中のヘモグロビンに糖が結合（グリコ
シル化）したグリコヘモグロビンは、その濃度が過去１
〜２ケ月間の平均的な血中糖濃度を反映するため、糖尿
病の診断あるいは糖尿病の経過観察に適した指標として
広く利用されている。

【０００３】グリコヘモグロビンを測定する場合には、
全体のヘモグロビン量を対照とした際のグリコヘモグロ
ビン量の比率で示される。ヘモグロビンの種類（ヘモグ
ロビンＡ，Ｓ，ＣおよびＥ）のうち、ヘモグロビンＡ
（ＨｂＡ）中の特定のグリコシル化ヘモグロビンであ
る、ヘモグロビンＡ_１ｃ（ＨｂＡ_１ｃ）の割合を指標と
して用いることが臨床的に一般化されており、ＨｂＡ全
体に対するＨｂＡ_１ｃの比率で示すと、通常約４〜６％
がその目安とされている。

【０００４】このグリコヘモグロビンの測定法として
は、電気泳動法，イオン交換クロマトグラフィー法，ボ
ロン酸アフィニティクロマトグラフィー法，イムノアッ
セイ法などが知られているが、中でも所要時間や分離性
などの点からイオン交換クロマトグラフィー法が主流と
なっている。しかし、最近では特異性の高い『抗体』を
用いたイムノアッセイ法でも測定されるようになってき
た。

【０００５】従来のグリコヘモグロビンのイオン交換ク
ロマトグラフィー法およびイムノアッセイ法では、比較
的大型の分析装置を必要とし、大きな病院の検査室や検
査センターで測定が行なわれている。

【０００６】イムノアッセイ法は、使用する抗体の特異
性が高いため、イオン交換クロマトグラフィー法におい
て問題とされる不安定型グリコヘモグロビン，カルバミ
ル化ヘモグロビン，アセトアルデヒド化ヘモグロビン，
およびアセチル化ヘモグロビンなどの影響を受けず、迅
速かつ検体処理能力が高い長所がある。

【０００７】しかし、グリコヘモグロビンに対する特異
抗体は、ヘモグロビンとの化学構造の相違する部位（つ
まりヘモグロビンに糖の結合した部分）をエピトープと
している上に、ＨｂＡ_１ｃの場合は特にそのその部位が
十分に露出していないため、イムノアッセイ法を行う
際、多くの場合その部位を露出させるための溶血および
／又は変性操作が必要である。

【０００８】イムノアッセイ法を応用したもので、血中
ヘモグロビン（ヘモグロビンＡ、Ｓ、ＣおよびＥ）を目
視により判定する使い捨てタイプの乾式検査具（Ｓｃｒ
ｅｅｎｉｎｇ３，６７〜７６，１９９４）も知られてい
る。この乾式検査具は患者自身でも測定することが可能
であるが、前処理として溶血操作を必要とし、ＨｂＡ
_１ｃ等のグリコヘモグロビンの測定用ではない。前処理
を患者自身が行う場合、操作の煩雑さの他に汚染も問題
である。

【０００９】ＨｂＡ_１ｃ等を測ることができ、かつ検体
を前処理せずに測定可能な乾式試験片が開発されればそ
のメリットは極めて大きいわけであるが、現在まだ知ら
れていない。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、溶血
および／又は変性の前処理操作を必要とせず、大型の分
析装置を使わずに小型機器を用いて、検体数の少ない中
小の病院や開業医、又は患者自身でも簡単な操作でＨｂ
ＡとＨｂＡ_１ｃとを同時に直接測定できる乾式試験片を
提供することを目的とする。また、検体中にＨｂＡ_１ｃ
が特に少ない場合でも良好に測定できる乾式試験片を提
供することも目的とする。

【００１１】上記目的は、以下の構成すなわち ｉ）溶血剤，変性剤，微粒子を塗布した溶血層 ｉｉ）微粒子一個につき複数個の抗ＨｂＡ_１ｃ抗体が固
定化されている微粒子を含む凝集層 ｉｉｉ）凝集した微粒子を捕捉する機能を有する測定層 ｉｖ）展開残液を吸収する吸収層 をこの順序で有する一個の連続した展開層と、以下のｖ
からｖｉｉの構成すなわちｖ）溶血剤を塗布した溶血層 ｖｉ）ヘモグロビンＡを捕捉する測定層 ｖｉｉ）展開残液を吸収する吸収層 をこの順序で有する一個の連続した展開層とが、一個の
支持体上に並べて設置してあり、ｉからｉｖまでの間お
よびｖからｖｉｉまでの間を液体が移動しうる試験片で
解決できる。

【００１２】また、上記目的は、以下の構成すなわち ｉ）溶血剤，変性剤，微粒子を塗布した溶血層 ｉｉ）微粒子一個につき複数個の抗ＨｂＡ_１ｃ抗体が固
定化されている微粒子を含む凝集層 ｉｉｉ）凝集した微粒子を捕捉する機能を有する第一の
測定層 ｉｖ）凝集しない微粒子を捕捉する機能を有する第二の
測定層 ｖ）展開残液を吸収する吸収層 をこの順序で有する一個の連続した展開層からなり、ｉ
からｖまでの間を液体が移動しうる乾式試験片でもまた
解決できる。

【００１３】血液検体を溶血層へ点着し、展開液等で展
開させた後、測定層において光学的に測定してＨｂＡと
ＨｂＡ_１ｃの量を同時に求め、それぞれの値を用いてＨ
ｂＡに対するＨｂＡ_１ｃの比率を算出することができ
る。本発明の試験片で測定する際の血液検体としては、
全血は勿論のこと、分離された赤血球も使用できる。

【００１４】検体中にＨｂＡ_１ｃが微量しか含まれずと
も、凝集層中の抗ＨｂＡ_１ｃ抗体を、一個の微粒子につ
き複数の抗ＨｂＡ_１ｃ抗体が固定化されている状態でそ
の微粒子を凝集層中に含ませることにより感度を上げる
ことができる。詳細は後述する。

【００１５】免疫凝集反応は、市販の着色ビーズを使用
するので、色素等で抗体を標識する必要がない。目的物
質を標識しないので、標識化による抗体の変性の危険性
もない。このとき、溶血層における微粒子は、ヘモグロ
ビンと光学的に区別して検出しうる色に着色されている
ものだと、検出時に都合がよい。

【００１６】測定層での凝集微粒子の捕捉の方法は、濾
過することで捕捉することが一般的であるが、抗体やイ
オン交換樹脂を使用する方法も使用できる。

【００１７】

【発明の実施の形態】図１は、本発明による試験片の一
つの態様の平面図と側面図である。これを試験具Ａとす
る。

【００１８】支持体１の上に、展開可能な材質からなる
２つの展開膜２および３が装着されている。本発明で
は、液を通すことの出来る材質を「展開膜」と呼び、そ
の展開膜へ溶血層や凝集層などの構成層を設けたものを
「展開層」と呼ぶことにする。一方の展開膜２には順
次、展開開始点Ｐと，溶血剤を塗布した溶血層４と，抗
ＨｂＡ抗体またはイオン交換物質を固定化した測定層５
と，展開残液を吸収させる吸収剤からなる吸収層６とが
設けられている。他方の展開膜３には順次，展開開始点
Ｐ’と，溶血剤と変性剤と微粒子を塗布した溶血層７
と，微粒子一個につき複数個の抗ＨｂＡ_１ｃ抗体が固定
化されている微粒子を塗布した凝集層８と，凝集微粒子
のみを捕捉しうる測定層９と，展開残液を吸収させる吸
収剤からなる吸収層１０とが設けられている。図中の側
面図は、展開膜３を長方向に横切る断面図である。

【００１９】使用する際には、まず試験具Ａの溶血層４
と溶血層７へ血液検体を同量づつ点着することにより始
まる。溶血層４において血液が溶血され、次いで展開液
を展開開始点Ｐに加えてＨｂＡを展開させる。展開され
たＨｂＡは測定層５に固定化されている抗Ｈｂ抗体又は
イオン交換物質に捕捉され、展開残液は吸収層６に吸収
される。一方、溶血層７において血液は溶血と同時に変
性され、ＨｂＡ_１ｃを含むＨｂＡは微粒子に吸着され
る。引き続き展開液を展開開始点Ｐ’に加えると、その
微粒子は展開され、微粒子は凝集層８に塗布されている
抗ＨｂＡ_１ｃ抗体と反応して凝集し、凝集した微粒子は
測定層９に捕捉され、凝集していない微粒子を含む展開
残液は吸収層１０に吸収される。測定層５に捕捉された
ＨｂＡの着色度と、測定層９に捕捉された微粒子自身
（ＨｂＡ_１ｃに相当）の着色度とを光学的方法によって
測定する。その結果からそれぞれＨｂＡおよびＨｂＡ
_１ｃ量を求めた後、ＨｂＡに対するＨｂＡ_１ｃの比率を
算出する。

【００２０】ここで、もしも検体中にＨｂＡ_１ｃが非常
に少ない場合、微粒子一個に吸着するＨｂＡ_１ｃがたっ
たの一個という状況になる。これでは、普通に抗ＨｂＡ
_１ｃ抗体を単品で塗布している凝集層においては、抗Ｈ
ｂＡ_１ｃ抗体を介して微粒子どうしが繋がらず、結果と
して凝集反応が起こらない。そういった場合でも、本発
明の試験具Ａは、複数の抗ＨｂＡ_１ｃ抗体を固定化した
微粒子を中心に、ＨｂＡ_１ｃが一個吸着している微粒子
が集まり、凝集が起こる。抗ＨｂＡ_１ｃ抗体を固定化し
た微粒子は、溶血層に含まれる微粒子と同質のものに抗
ＨｂＡ_１ｃ抗体を公知の方法（「酵素免疫測定法」医学
書院，１９８７年）等により固定化したものが使用でき
る。

【００２１】ここで、各構成の材質としてはいずれも公
知の物質でよいが、具体的には次のようなものである。

【００２２】支持体は、光透過性でも光非透過性でも良
いが、展開終了後の測定を支持体下部から行うのである
ならば、透明なポリエチレンテレフタレートなどが望ま
しい。その他の例；ポリスチレン、ポリエステル、酢酸
セルロースなど

【００２３】液をクロマトさせる、展開層全体を形成し
ている展開膜の材質は、液を通しやすい物質が望まし
い。例えば、濾紙といったセルロース、酢酸セルロー
ス、ニトロセルロース、ガラスファイバーなどがある。

【００２４】吸収剤の条件としては、展開残液を吸収す
るのに十分な細孔容積を有するマトリクッス的な物質
か、乾燥ゲルといった吸水性に優れた物質が好ましい。 その他の例：セルロース、酢酸セルロース、ポリアクリ
ル酸、ポリビニールアルコールなど

【００２５】凝集した微粒子を捕捉するための測定層
は、濾過材を用いて濾過することで捕捉することが一般
的であるが、抗体やイオン交換樹脂を使用する方法もあ
る。濾過材を用いる際の材質の例としては、ポリテトラ
フルオロエチレン、ポリスルオン、ポリプロピレン、ポ
リビニリデンジフロライド、セルロース混合エステルな
どがある。

【００２６】目的物質を吸着させるための微粒子と、複
数の抗ＨｂＡ_１ｃ抗体を固定化した微粒子は、一般の免
疫凝集反応で使用される市販の着色ラテックスや、着色
または無着色金属コロイド（金、銀、銅）など（着色
は、ヘモグロビンの色と光学的に区別して測定できるも
の）が使用できる。

【００２７】支持体上へ展開膜を配置する方法として
は、細長くテープ状に加工した展開膜を両面テープや接
着剤やホットメルトを用いて物理的に固定する。テープ
状に加工する際の幅・長さは、クロマトグラフィー技術
に準ずる。

【００２８】溶血剤としてはサポニンが有力であるが、
さらに界面活性剤も使用でき、その種類としては、ポリ
ソルベート、ポリエチレングリコール−ｐ−イソオクチ
ルエーテルなどが挙げられる。その中でも溶血能の点か
ら、トリトンＸ−１００が市販品として特に望ましい。

【００２９】溶血層に塗布される変性剤は、ＨｂＡ_１ｃ
を変性させてＨｂＡとの化学構造の相違する部位（つま
り糖結合部分）を露出させ、抗ＨｂＡ_１ｃ抗体が免疫的
に認識し易くする役割を有する。チオシアン酸塩のよう
な酸や、プロテアーゼのような加水分解酵素が好ましい
が、環境を単に酸性にするのみでも良い。

【００３０】展開に用いる展開液としては、通常のイム
ノアッセイ法に使用されるような、少量の蛋白質、塩、
界面活性剤などを含む緩衝液が望ましく、一例として
は、０．１％ウシ血清アルブミンと、０．０１％トリト
ンＸ−１００と、０．９％塩化ナトリウムとを含む０．
１Ｍリン酸緩衝液が挙げられる。展開層に各層を設ける
ために、展開膜へ各種試薬を含浸・塗布または結合させ
る。手法としては当業者間で公知の方法で良く、施すべ
き物質を１種以上の溶液に溶かし込み、塗り付けること
で含浸したり、インクジェットプリンターで噴霧した
り、化学的に結合する（「酵素免疫測定法」医学書院、
１９８７）ことがされる。いずれにしても、最終的には
乾燥させる。

【００３１】凝集層に塗布された抗ＨｂＡ_１ｃ抗体と、
測定層に固定化された抗ＨｂＡ抗体は、ポリクローナル
抗体かモノクローナル抗体のいずれも使用できる。

【００３２】ＨｂＡを測定する方の展開膜の測定層に固
定化されたイオン交換物質は、ジエチルアミノエチルセ
ルロースやカルボキシメチルセルロースなどが使用でき
る。

【００３３】図２は、本発明による試験片のもう一つの
態様の平面図である。これを試験片Ｂとする。

【００３４】支持体２１の上に、液を展開可能な材質で
できた展開膜２２を装着し、展開膜２２に順次、溶血剤
・微粒子および変性剤を塗布した溶血層２３と、微粒子
一個につき複数個の抗ＨｂＡ_１ｃ抗体が固定化されてい
る微粒子を塗布した凝集層２４と、凝集微粒子を捕捉で
きる孔径を有する濾過剤でできた測定層２５と、凝集し
ない微粒子を捕捉する濾過剤でできた測定層２６と、展
開残液を吸収する吸収剤からなる吸収層２７とが設けて
ある。

【００３５】試験片Ｂの溶血層２３に血液検体を点着す
ると、検体は溶血および変性され、ＨｂＡ_１ｃを含むＨ
ｂＡは微粒子に吸着される。次いで展開液を展開開始点
Ｐに加えると、その微粒子は凝集層２４に塗布されてい
る抗ＨｂＡ_１ｃ抗体と免疫反応して凝集する。つまりそ
の凝集塊は、ＨｂＡのうち、ＨｂＡ_１ｃのみが原因で凝
集している。続いて凝集した微粒子（ＨｂＡ_１ｃ由来）
は孔径の大きい濾過膜である測定層２５に捕捉され、一
方凝集していない微粒子（ＨｂＡ由来）は孔径の小さい
濾過膜である測定層２６に捕捉され、その他の展開残液
は吸収層２７に吸収される。測定層２５および２６中の
ＨｂＡの着色度と、測定層２５に捕捉された微粒子自身
の着色度（ＨｂＡ_１ｃ量に相当）とを光学的に測定し、
その結果からそれぞれＨｂＡおよびＨｂＡ_１ｃを求めた
後、ＨｂＡに対するＨｂＡ_１ｃの比率を算出する。抗Ｈ
ｂＡ_１ｃ抗体固定化微粒子の働きで、検体中にＨｂＡ
_１ｃが非常に少なくとも凝集反応を起こすために、測定
が可能である。

【００３６】図３は、本発明による試験片のもう一つの
態様の平面図である。これを試験片Ｃとする。

【００３７】支持体３１の上に液を展開可能な材質でで
きた展開層３２を装着し、展開層３２に順次、溶血剤・
微粒子および変性剤を塗布した溶血層３３と、微粒子一
個につき複数個の抗ＨｂＡ_１ｃ抗体が固定化されている
微粒子を塗布した凝集層３４と、凝集微粒子のみを捕捉
しうる濾過膜でできた測定層３５と、展開残液を吸収さ
せる吸収剤からなる吸収層３６とを設けてある。これは
第２図の試験片Ｂのうち、凝集しない微粒子を捕捉する
濾過材でできた測定層２６と、展開残液を吸収する吸収
剤からなる吸収層２７とを一つにまとめた、図２の試験
片Ｂの別態様というべきものである。使用方法は試験片
Ｂと同じで、測定対象物質ＨｂＡ_１ｃが関与する微粒子
は凝集して測定層３５に捕捉され、凝集していない微粒
子を含む展開残液は吸収層３６に吸収される。このと
き、測定層３５と吸収層３６中のＨｂＡの着色度と、測
定層３５に捕捉された微粒子の着色度を光学的方法によ
り分別測定して、その結果からＨｂＡおよびＨｂＡ_１ｃ
を求めた後、ＨｂＡに対するＨｂＡ_１ｃの比率を算出す
る。抗ＨｂＡ_１ｃ抗体固定化微粒子の働きで、検体中に
ＨｂＡ_１ｃが非常に少なくとも凝集反応を起こすため
に、測定が可能である。

【００３８】

【発明の効果】本発明による乾式試験片を用いると、大
型の分析装置を用いず、しかも前処理を要せずに患者自
身が在宅でも簡単な操作でＨｂＡとＨｂＡ_１ｃを同時に
測定できる。また、免疫凝集反応を利用し、市販の着色
ビーズを使用するので抗体を標識する必要もない。さら
に、目的物質を標識しないので、標識化による抗体の変
性の危険性もない。また、検体中にＨｂＡ_１ｃが非常に
少なくとも凝集反応を起こすために、測定が可能であ
る。

【００３９】

【図面の簡単な説明】

【図１】は、本発明の試験片Ａの平面図と側面図であ
る。

【図２】は、本発明の試験具Ｂの平面図である。側面図
は図１と同じなので省略した。

【図３】は、図２の試験具の別態様（試験具Ｃ）の平面
図である。側面図は図１と同じなので省略した。

【符号の説明】

１，２１，３１ ： 支持体 ２，３，２２，３２ ： 展開層 ４，７，２３，３３ ： 溶血層 ８，２４，３４ ： 凝集層 ５，９，２５，２６，３５ ： 測定層 ６，１０，２７，３６ ： 吸収層 Ｐ，Ｐ’： 展開開始点

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】血液検体中のヘモグロビンＡ_１ｃを測定す
   るための乾式試験片であって、以下のｉからｉｖの構成
   すなわち ｉ）溶血剤，変性剤，微粒子を塗布した溶血層 ｉｉ）微粒子一個につき複数個の抗ヘモグロビンＡ_１ｃ
   抗体が固定化されている微粒子を含む凝集層 ｉｉｉ）凝集した微粒子を捕捉する機能を有する測定層 ｉｖ）展開残液を吸収する吸収層 をこの順序で有する一個の連続した展開層と、以下のｖ
   からｖｉｉの構成すなわち ｖ）溶血剤を塗布した溶血層 ｖｉ）ヘモグロビンＡを捕捉する測定層 ｖｉｉ）展開残液を吸収する吸収層 をこの順序で有する一個の連続した展開層とが、一個の
   支持体上に並べて設置してあり、ｉからｉｖまでの間並
   びにｖからｖｉｉまでの間を液体が移動しうることを特
   徴とする、血液検体用試験片。
2. 【請求項２】溶血層における微粒子が、ヘモグロビンと
   光学的に区別して検出しうる色に着色されている、特許
   請求の範囲第１に記載の試験片。
3. 【請求項３】測定層での凝集微粒子の捕捉の方法が、濾
   過材による濾過によるものである、特許請求の範囲第１
   又は２項に記載の試験片。
4. 【請求項４】血液検体中のヘモグロビンＡ_１ｃを測定す
   るための試験片であって、以下のｉからｖの構成すなわ
   ち ｉ）溶血剤，変性剤，微粒子を塗布した溶血層 ｉｉ）微粒子一個につき複数個の抗ヘモグロビンＡ_１ｃ
   抗体が固定化されている微粒子を含む凝集層 ｉｉｉ）凝集した微粒子を捕捉する機能を有する第一の
   測定層 ｉｖ）凝集していない微粒子を捕捉する機能を有する第
   二の測定層 ｖ）展開残液を吸収する吸収層 をこの順序で有する一個の連続した展開層からなり、ｉ
   からｖまでの間を液体が移動しうることを特徴とする、
   血液検体用試験片。
5. 【請求項５】溶血層における微粒子が、特定物質と光学
   的に区別して検出しうる色に着色されている、特許請求
   の範囲第４に記載の試験片。
6. 【請求項６】測定層での凝集微粒子の捕捉の方法が、濾
   過材による濾過によるものである、特許請求の範囲第４
   又は５項に記載の試験片。
7. 【請求項７】ｉｖの第二の測定層がｖの吸収層を兼ねて
   いる、特許請求の範囲第５から９項のいずれかに記載の
   試験片。