JP2007315776A - ヘモグロビンA1cの測定方法及びヘモグロビンA1c測定用測定キット - Google Patents
ヘモグロビンA1cの測定方法及びヘモグロビンA1c測定用測定キット Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】測定試料を吸着又は結合させた固定相に、捕捉物質が結合した標識物質を有する検出試薬を含む移動相を展開させることにより、測定試料中のヘモグロビンAに対するヘモグロビンA1cの比率を測定するヘモグロビンA1cの測定方法であって、前記標識物質として磁性体含有粒子を用い、前記磁性体含有粒子の磁性量を測定することにより、ヘモグロビンAに対するヘモグロビンA1cの比率を算出するヘモグロビンA1cの測定方法。
【選択図】なし
Description
また、従来の免疫アッセイ法においては、糖結合部位を露出させ、抗ヘモグロビンA1c抗体との抗原抗体反応をしやすくするためや、不安定型ヘモグロビンA1cを除去するために、測定試料を変性処理する必要があり、手間がかかるという問題があった。
以下に本発明を詳述する。
この場合、上記有機高分子物質は、磁性体含有粒子のマトリックスとしての役割を有する。
上記有機高分子物質としては特に限定されないが、スチレン系モノマーに由来するセグメントを有する共重合体であることが好ましい。スチレン系モノマーに由来するセグメントを有することにより、得られる磁性体含有粒子の水系媒体中における分散性が向上する。
その他のビニルモノマーとしては特に限定されず、例えば、塩化ビニル;酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル類;アクリロニトリル等の不飽和ニトリル類;(メタ)アクリル酸メチル、(メタ)アクリル酸エチル、(メタ)アクリル酸ブチル、(メタ)アクリル酸2−エチルヘキシル、(メタ)アクリル酸ステアリル、エチレングリコール(メタ)アクリレート、トリフルオロエチル(メタ)アクリレート、ペンタフルオロプロピル(メタ)アクリレート、シクロヘキシル(メタ)アクリレート、グリシジルメタクリレート、テトラヒドロフルフリル(メタ)アクリレート等の(メタ)アクリル酸エステル誘導体等が挙げられる。これら単量体は単独で用いられてもよいし、2種以上が併用されてもよい。
上記架橋性モノマーとしては特に限定されず、例えば、エチレングリコールジ(メタ)アクリレート、1,6−ヘキサンジオールジ(メタ)アクリレート、ネオペンチルグリコールジ(メタ)アクリレート、トリメチロールプロパントリ(メタ)アクリレート、テトラメチロールメタントリトリ(メタ)アクリレート、テトラメチロールプロパンテトラ(メタ)アクリレート、ジアリルフタレート及びその異性体、トリアリルイソシアヌレート及びその誘導体等が挙げられる。これら架橋性単量体は単独で用いられてもよいし、2種以上が併用されてもよい。
上記超常磁性を有する磁性体としては特に限定されず、例えば、四三酸化鉄(Fe3O4)、γ−重三二酸化鉄(γ−Fe2O3)等の各種フェライト類;鉄、マンガン、コバルト等の金属又はこれらの合金等が挙げられる。なかでもフェライト類が好適であり、なかでも四三酸化鉄(Fe3O4)が好適である。
このような磁性体としては、Fe2+とFe3+とを1:2の割合で含む混合液を塩基性の溶液に滴下することでFe3O4が得られる共沈反応法により調製したもの等を用いることができる。また、フェリコロイドHC−50(タイホー工業社製)、HX―20(シグマハイケミカル社製)等の市販品も用いることができる。
なお、本明細書において絶対偏差とは、上記有機高分子物質を構成する炭素元素と、磁性体を構成する金属元素の同期発光を測定し、粒子毎の炭素元素と金属元素との混在比率のバラツキから算出したその測定データの分散状態を示す偏差値であって、磁性体含有粒子の磁性体含有量のバラツキを示すパラメータである。上記絶対偏差の数値が小さいほど磁性体含有量のバラツキが小さく、すなわち、磁性体含有粒子の均一性が高く、大きいほど磁性体含有量のバラツキが大きい、すなわち、磁性体含有粒子の均一性が低いことを示す。
上記絶対偏差が0.3を超えると、免疫測定法に利用した場合に、測定再現性や定量性が低くなり測定精度が悪化することがあり、得られる測定データの信頼性が低くなる。より好ましい上限は0.27、更に好ましい上限は0.25、特に好ましい上限は0.20である。
固定相を有する試験片等に測定試料を展開させることにより、測定試料が吸着変性を起こすため、従来のようにHbA1cを変性させてHbAと化学構造が異なる部位、すなわち、糖結合部位を露出させる変性処理等を行う必要がない。これにより、簡易かつ迅速に、HbAに対するHbA1cの比率を高い精度で測定することが可能となる。
なお、複数の測定試料の測定を行う際や、1つの測定試料に対して複数回測定を行う際には、上記固定相における上記測定試料を吸着又は結合させる面積を一定にすることが好ましい。
上記メンブレンフィルターの具体的な例示としては、例えば、ニトロセルロースメンブレン、フッ化ビニリデン樹脂製メンブレン、ナイロン製メンブレン、ポリプロピレンフィルター等が挙げられる。なかでも、測定試料が吸着し、変性しやすいことから、フッ化ビニリデン樹脂製メンブレン、ナイロン製メンブレン等が好適に用いられる。
上記吸水材料は、過剰の試料を迅速に吸収することを目的として用いられるものであり、毛細管現象により、多孔質の担体を展開した測定試料液を吸収するものであれば特に限定されず、例えば、セルロースやコットン等の吸水性材料が挙げられる。
なお、(I)は、HbAに対するHbA1cの比率が比較的低い場合であり、(II)は、HbAに対するHbA1cの比率が比較的高い場合である。
その後、捕捉物質が結合した標識物質を有する検出試薬を含む移動相を展開させると、固定相に吸着したHbA1cを捕捉物質が捕捉する。
そして、固定相の磁性量を測定することにより、所定濃度での磁性量を求める。
次いで、図1(II)に示すように、HbAに対するHbA1cの比率が比較的高い場合についても、同様の操作を行い、固定相の磁性量を測定する。そして、これらの測定結果に基づき、検量線を作成する。このようにして作成した検量線を用いることで、磁性量の測定値から測定試料中のHbAに対するHbA1cの比率を求めることが可能となる。
このようなヘモグロビンA1c測定用キットを用いることで、簡易かつ迅速に、ヘモグロビンAに対するヘモグロビンA1cの比率を高い精度で測定することが可能となる。
(1)試験片の作製
フッ化ビニリデン樹脂製メンブレン(POREX TECHNOLOGIES社製)を幅5cm×長さ5cmに裁断し、メンブレン下部に吸収体を接触させた。メンブレン、吸収体を密着させるため、フロースルー用のデバイスで固定した。
磁性体含有粒子(ポリスチレン系、磁性体量60%、平均粒子径0.3μm、積水化学工業社製)10mgに、20mMリン酸緩衝液(pH7.5)10mLを加え、15000RPMにて20分間遠心分離を行った。得られた沈渣に、20mMリン酸緩衝液(pH7.5)に抗HbA1cモノクローナル抗体を0.2mg/mLの濃度になるように溶解した溶液を2mL加え、充分に混和して、室温にて1時間撹拌した。
検体として、グリコHbコントロールレベルI(HbA1c=5.4±0.3%)、又は、レベルII(HbA1c=10.6±0.5%)(国際試薬社製)を用い、牛血清アルブミン1%(w/v)、トリトン−100 0.01%(w/v)、及び、ヘモグロビン濃度が5μg/mLになるように50mMPBSを用いて調整することにより、レベルI試験液及びレベルII試験液を調製した。また、レベルI試験液及びレベルII試験液の等量混合液(HbA1c=8.0±0.4%)を調製した。
牛血清アルブミン1%(w/v)、トリトン−100 0.01%(w/v)を含む50mMPBSを用いて調製した。
(1)試験片の作製
ニトロセルロースメンブレン(Schleicher&Schuell社製)を幅5cm×長さ5cmに裁断し、メンブレン下部に吸収体を接触させた。メンブレン、吸収体を密着させるため、フロースルー用のデバイスで固定した。
磁性体含有粒子(ポリスチレン系、磁性体量60%、平均粒子径0.3μm、積水化学社製)10mgに、20mMリン酸緩衝液(pH7.5)10mLを加え、15000RPMにて20分間遠心分離を行った。得られた沈渣に、20mMリン酸緩衝液(pH7.5)に抗HbA1cモノクローナル抗体を0.2mg/mLの濃度になるように溶解した溶液を2mL加え、充分に混和して、室温にて1時間撹拌した。
検体として、グリコHbコントロールレベルI(HbA1c=5.4±0.3%)、又は、レベルII(HbA1c=10.6±0.5%)(国際試薬社製)を用い、牛血清アルブミン1%(w/v)、トリトン−100 0.01%(w/v)、及び、ヘモグロビン濃度が5μg/mLになるように50mMPBSを用いて調整することにより、レベルI試験液及びレベルII試験液を作製した。また、レベルI試験液及びレベルII試験液の等量混合液(HbA1c=8.0±0.4%)を調製した。
牛血清アルブミン1%(w/v)、トリトン−100 0.01%(w/v)を含む50mMPBSを用いて調製した。
各試験液100μLを試験デバイスに添加し、10分後、洗浄液500μLで洗浄した。抗HbA1cモノクローナル抗体結合磁性体含有粒子懸濁液(固形分0.5%に調整)300μLをデバイスに添加した後、洗浄液500μLで洗浄した。メンブレン部を吸収体と分離し、メンブレン部の磁性量を、市販のGMRセンサ(差動磁界センサ、NVE社製)を用いて測定した。結果を表1に示した。
従って、実施例1、2のヘモグロビンA1cの測定方法は、簡便で、精度の高い有用な測定法であることがわかる。
2 ヘモグロビンA
3 ヘモグロビンA1c
4 検出試薬
Claims (7)
- 測定試料を吸着又は結合させた固定相に、捕捉物質が結合した標識物質を有する検出試薬を含む移動相を展開させることにより、測定試料中のヘモグロビンAに対するヘモグロビンA1cの比率を測定するヘモグロビンA1cの測定方法であって、
前記標識物質として磁性体含有粒子を用い、前記磁性体含有粒子の磁性量を測定することにより、ヘモグロビンAに対するヘモグロビンA1cの比率を算出する
ことを特徴とするヘモグロビンA1cの測定方法。 - 検出試薬としてヘモグロビンA1cと特異的に結合する抗ヘモグロビンA1c抗体が結合又は吸着した磁性体含有粒子を用いることを特徴とする請求項1記載のヘモグロビンA1cの測定方法。
- 磁性体含有粒子は、有機高分子物質と、前記有機高分子物質中に分散した磁性体とからなり、前記磁性体を50〜80重量%含有し、かつ、平均粒子径が0.03〜0.5μm、前記有機高分子物質中における前記磁性体の分散径が1〜30nmであることを特徴とする請求項1、2記載のヘモグロビンA1cの測定方法。
- 磁性体は、酸化鉄であることを特徴とする請求項3記載のヘモグロビンA1cの測定方法。
- 有機高分子物質は、スチレン系モノマーに由来するセグメントを60重量%以上含有することを特徴とする請求項3又は4記載のヘモグロビンA1cの測定方法。
- 検出試薬の展開方法がフロースルー方式を用いることを特徴とする請求項1、2、3、4又は5記載のヘモグロビンA1cの測定方法。
- 請求項1、2、3、4、5又は6記載のヘモグロビンA1cの測定方法を実施するために用いることを特徴とするヘモグロビンA1c測定用キット。
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