JP2009150684A - ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】高精度にヘモグロビンＡ１ｃ値を測定することができるヘモグロビンＡ１ｃ値の測定方法である。
【解決手段】ヘモグロビンＡ類を含有する血液試料に、一定量の標識物質と結合した抗ヘモグロビンＡ抗体を添加して測定試料を作製する工程、前記測定試料において、前記ヘモグロビンＡ類及び前記標識物質と結合した抗ヘモグロビンＡ抗体からなる複合体と、前記複合体以外の成分とを分離し、前記複合体以外の成分を除去した後、前記複合体を、抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体が固定化された固相と反応させる工程、前記固相において、前記抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体と反応しなかった前記複合体を洗浄除去する工程、及び、前記固相において、前記標識物質の量を検出する工程を有するヘモグロビンＡ１ｃ値の測定方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、高精度にヘモグロビンＡ１ｃ値を測定することができるヘモグロビンＡ１ｃ値の測定方法に関する。

ヘモグロビン（Ｈｂ）類、特に糖化ヘモグロビン類の一種であるヘモグロビンＡ１ｃ（以下、ＨｂＡ１ｃという）は、過去１〜２カ月間の平均的な血糖値を反映しているため、糖尿病のスクリーニング検査や糖尿病患者の血糖管理状態を把握するための検査項目として広く利用されている。
従来、ＨｂＡ１ｃの測定方法としては、ＨＰＬＣ法、免疫法、電気泳動法等が用いられている。このうち、臨床検査分野で多く用いられている免疫法は、大量処理が可能で、特にスクリーニング検査において有用である。

現在用いられている免疫法によるＨｂＡ１ｃの測定方法では、ＨｂＡ１ｃのβ鎖Ｎ末端の数残基を認識部位とする抗ＨｂＡ１ｃ抗体を用いて反応するＨｂをＨｂＡ１ｃ量として測定する一方、総Ｈｂ量を測定し、総Ｈｂ量に対する比率からＨｂＡ１ｃ値を算出している（例えば、特許文献１参照）。しかしながら、本来ＨｂＡ１ｃは、ＨｂＡのβ鎖Ｎ末端にグルコースが結合したものであるから、ＨｂＡ量中のＨｂＡ１ｃ量の百分率で表す必要があるところ、従来の免疫法では、その原理上から、全てのＨｂのうちの上記ＨｂＡ１ｃとしたＨｂの比率を求めていることになり、正しくＨｂＡ１ｃ値を算出できていないという欠点があった。
特開２００２−３４０８９５号公報

本発明は、上記現状に鑑み、高精度に安定型ヘモグロビンＨｂＡ１ｃ値の測定を行うことができるヘモグロビンＡ１ｃ値の測定方法である。

本発明者らは、鋭意検討した結果、血液試料に、一定量の標識物質が結合した抗ＨｂＡ抗体（以下、標識抗ＨｂＡ抗体ともいう）を添加して、血液試料中のＨｂＡと標識抗ＨｂＡ抗体との複合体を生成させることによってＨｂＡ量を算出する一方、生成した複合体を抗ＨｂＡ１ｃ抗体が固定化された固相に接触させ、固相に捕捉された複合体が有する標識物質の量を検出することによってＨｂＡ１ｃ量を測定し、得られたＨｂＡ量及びＨｂＡ１ｃ量の比率から、高精度にＨｂＡ１ｃ値を求めることができることを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明は、ヘモグロビンＡ類を含有する血液試料に、一定量の標識物質と結合した抗ヘモグロビンＡ抗体を添加して測定試料を作製する工程、前記測定試料において、前記ヘモグロビンＡ類及び前記標識物質と結合した抗ヘモグロビンＡ抗体からなる複合体と、前記複合体以外の成分とを分離し、前記複合体以外の成分を除去した後、前記複合体を、抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体が固定化された固相と反応させる工程、前記固相において、前記抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体と反応しなかった前記複合体を洗浄除去する工程、及び、前記固相において、前記標識物質の量を検出する工程を有するヘモグロビンＡ１ｃ値の測定方法である。
以下、本発明を詳述する。

図１は、本発明のヘモグロビンＡ１ｃ値の測定方法の原理を説明するための模式図である。図１（ａ）に示すように、容器１には、ＨｂＡ、ＨｂＡ１ｃ、並びに、ＨｂＡ及びＨｂＡ１ｃ以外の成分からなる血液試料が入っている。図１（ａ）中、１は容器、２は標識抗ＨｂＡ抗体、２１は抗ＨｂＡ抗体、□はＨｂＡ、■はＨｂＡ１ｃ、△はＨｂＡ及びＨｂＡ１ｃ以外の成分を示す。なお、図１において「ＨｂＡ」とは、ＨｂＡ１ｃ以外のＨｂＡ成分をいう。

血液試料が入った容器１中に、まず一定量の標識抗ＨｂＡ抗体２を添加する。標識抗ＨｂＡ抗体は、ＨｂＡ１ｃを含むＨｂＡ全て（以下、ＨｂＡ類ともいう）と同等に反応する抗体である。
図１（ｂ）に示すように、容器１内において、添加された標識抗ＨｂＡ抗体２は、ＨｂＡ類と反応し複合体３を形成する。このとき、添加された標識抗ＨｂＡ抗体の量は、血液中に存在するＨｂＡ類全量よりも少ないため、余剰のＨｂＡ類、すなわち、標識抗ＨｂＡ抗体と反応できないＨｂＡ類が存在する。
また、標識抗ＨｂＡ抗体と結合したＨｂＡ類に占める、標識抗ＨｂＡ抗体と結合したＨｂＡ１ｃの割合は、血液中におけるＨｂＡ類に占めるＨｂＡ１ｃの割合と同一とみなすことができる。すなわち、ＨｂＡ１ｃ値について下記式（１）が成立する。

本発明のヘモグロビンＡ１ｃ値の測定方法では、上記式（１）のうち、右式、すなわち下記式（２）を用いてＨｂＡ１ｃ値を算出する。

上記式（２）において、分母である「標識抗ＨｂＡ抗体と結合したＨｂＡ類の量」は、添加された標識抗ＨｂＡ抗体の量と等しい。従って、標識抗ＨｂＡ抗体は、後述するように、一定量、すなわち、既知量を用いる必要がある。
次に、図１（ｃ）に示すように、標識抗ＨｂＡ抗体と反応しなかったＨｂＡ類及び他の成分（以下、未反応成分ともいう）を、複合体３と分離する。図１（ｃ）中、４は未反応成分を示す。
次いで、図１（ｄ）に示すように、複合体３を、固相に固定化された抗ＨｂＡ１ｃ抗体（以下、固定化抗ＨｂＡ１ｃ抗体ともいう）と反応させる。図１（ｄ）中、５は固定化抗ＨｂＡ１ｃ抗体を示す。
そうすると、図１（ｅ）に示すように、複合体３のうち、ＨｂＡ１ｃと反応した標識抗ＨｂＡ抗体の複合体のみが、固相に固定化された抗ＨｂＡ１ｃ抗体５と反応する。図１（ｅ）中、６はＨｂＡ１ｃと反応した標識抗ＨｂＡ抗体の複合体を示す。

本発明のヘモグロビンＡ１ｃ値の測定方法において、抗ＨｂＡ１ｃ抗体５の抗体量は、試料中に存在する、ＨｂＡ１ｃと反応した標識抗ＨｂＡ抗体の複合体６量よりも多い。そのため、図１（ｆ）に示すように、全ての複合体６が固定化抗ＨｂＡ１ｃ抗体５に結合する。ＨｂＡ１ｃ以外のＨｂＡと結合した複合体は洗浄されることによって、測定系より除外される。図１（ｆ）中、７はＨｂＡ１ｃ以外のＨｂＡと結合した複合体を示す。

最後に、図１（ｇ）に示すように、固定化抗ＨｂＡ１ｃ抗体５に結合した、標識抗ＨｂＡ抗体とＨｂＡ１ｃとの複合体６を検出手段により検出する。図１（ｇ）中、８は検出手段を示す。
検出は、標識抗ＨｂＡ抗体における標識物質を利用して行なう。検出された標識物質の量は、標識抗ＨｂＡ抗体に結合したＨｂＡ１ｃ量とみなすことができるため、上記式（２）における分子の数値として用いることができる。そして、この分子の値と、上述の標識抗ＨｂＡ抗体の添加量から算出される分母の数値とを用いることによって、上記式（２）に基づいてＨｂＡ１ｃ値を算出することが可能となる。

本発明のヘモグロビンＡ１ｃ値の測定方法は、ヘモグロビンＡ類を含有する血液試料に、一定量の標識物質と結合した抗ヘモグロビンＡ抗体を添加して測定試料を作製する工程を有する（図１（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）参照）。

上記血液試料としては特に限定されず、例えば、ＥＤＴＡ、フッ化ナトリウム、ヘパリン等の抗凝固剤存在下での採血等の方法によって人から採血した血液を用いることができる。
上記血液試料は、ヘモグロビンＡ１ａ、ヘモグロビンＡ１ｂ、ヘモグロビンＡ１ｃからなるヘモグロビンＡ類等のヘモグロビン類を含有する。

上記標識物質としては、後述する抗原抗体反応を阻害しない物質であって、後述する検出工程において容易に、かつ、高精度に検出できる物質であれば特に限定されず、例えば、酵素等の発色反応を誘導する物質、蛍光物質、発光物質、磁性物質等、従来公知の標識物質が挙げられる。なかでも、磁性物質は、磁力による複合体の分離をも行なうことができるため好ましい。

上記抗ＨｂＡ抗体としては、血液試料中のＨｂＡ類を認識し、他のＨｂ成分とは反応しない抗体であれば特に限定されず、従来公知の抗ＨｂＡ抗体を用いることができる。
本明細書において、「ＨｂＡ類を認識する」とは、ＨｂＡ１ｃ及び他のＨｂＡを同等に認識することである。また、本明細書において、「他のＨｂ成分とは反応しない」とは、Ｈｂの１次構造の異なるＨｂ、例えば、胎児性Ｈｂ（ＨｂＦ）、ＨｂＳ、ＨｂＣ等の異常Ｈｂ類とも反応しないことを意味する。

上記抗ＨｂＡ抗体としては、高分子材料等の担体に固定化されたものを用いてもよい。また、上記抗ＨｂＡ抗体は、全分子又はＦａｂ画分等の断片を用いることもでき、ポリクローナル抗体であっても、モノクローナル抗体であってもよい。

上記標識物質と、上記抗ＨｂＡ抗体と結合させることによって、標識物質と結合した抗ヘモグロビンＡ抗体（以下、標識抗ＨｂＡ抗体ともいう）とすることができる。
上記標識物質と抗ＨｂＡ抗体とを結合させる方法としては、上記標識物質の標識能、及び、後述する抗ＨｂＡ抗体の抗原認識能が損なわれない方法であれば特に制限がなく、両者を直接結合させてもよいし、他の物質、例えば、粒子等の担体類を介して結合させてもよい。

上記標識抗ＨｂＡ抗体の添加量は、血液試料に対して、一定量、すなわち、既知量である。
これは、上述の通り、標識抗ＨｂＡ抗体の添加量を、上記式（２）の分母の値として用いるため、上記標識抗ＨｂＡ抗体量を正確に把握しておく必要があるためである。

上記標識抗ＨｂＡ抗体の添加量は、血液試料中のＨｂＡ類全量よりも少ないことが必要である。すなわち、本発明のヘモグロビンＡ１ｃ値の測定方法において、「一定量」とは、上述のように既知量であって、かつ、血液試料中のＨｂＡ類全量よりも少ない量をいう。
上記標識抗ＨｂＡ抗体の添加量が血液試料中のＨｂＡ類全量よりも多いと、反応系に非結合性の標識抗ＨｂＡ抗体が存在することになり、上記式（２）の分母の値が不正確になる。

上記標識抗ＨｂＡ抗体の添加量としては、使用する上記抗ＨｂＡ抗体の結合能にもよるが、好ましい上限が血液中のＨｂ量換算で５ｇ／ｄＬ、すなわち、Ｈｂ５ｇ／ｄＬと結合できる抗ＨｂＡ抗体の量以下である。

上記血液試料に、一定量の上記標識抗ＨｂＡ抗体を添加することによって、該血液試料中において、該血液試料中のＨｂＡ類と、該標識抗ＨｂＡ抗体とからなる複合体（以下、単に複合体ともいう）が形成される。
このようにして、上記血液試料中のヘモグロビンＡ類と、上記標識物質と結合した抗ヘモグロビンＡ抗体とからなる複合体を含有する測定試料を調整することができる。

上記複合体は、血液試料中のＨｂＡ類と、該血液試料に添加された標識抗ＨｂＡ抗体との抗原抗体反応によって形成される。
上記抗原抗体反応としては特に限定されず、従来公知の方法、すなわち、上記標識抗ＨｂＡ抗体を含む緩衝液等の溶液に血液試料を添加し、所定の反応温度及び反応時間の条件下で反応させる方法等が挙げられる。
上記反応温度としては適宜調節すればよいが、０〜４０℃とすることが好ましい。
上記反応時間としては適宜調節すればよいが、１２０分以下程度とすることが好ましい。

本発明のヘモグロビンＡ１ｃ値の測定方法は、前記測定試料において、前記ヘモグロビンＡ類及び前記標識物質と結合した抗ヘモグロビンＡ抗体からなる複合体と、前記複合体以外の成分とを分離し、前記複合体以外の成分を除去した後、前記複合体を、抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体が固定化された固相と反応させる工程を有する（図１（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）参照）。

本発明のヘモグロビンＡ１ｃ値の測定方法において、「複合体以外の成分」とは、上記測定試料において、上記標識抗ＨｂＡ抗体と反応しなかったＨｂＡを含むＨｂ類、脂質その他の血液成分をいう。

上記測定試料から、上記複合体以外の成分を分離し、除去する方法としては、使用する標識抗ＨｂＡ抗体にもよるが、遠心分離、磁力による分離等、従来公知の分離方法が挙げられる。
なお、本明細書において、「上記複合体以外の成分を分離し、除去する」とは、上記複合体以外の成分を完全に分離し、除去することを意味するものではない。すなわち、上記複合体以外の成分を分離し、除去した後、夾雑物として残っているものがあっても、測定系に障害とならなければよく、上記複合体を「単離」することを意味するわけではない。

上記複合体以外の成分を分離し、除去した後、必要に応じて、上記複合体以外の成分を分離除去された測定試料、すなわち、上記複合体の洗浄操作等を行なってもよい。
上記洗浄操作は、他の成分を分離除去した後、緩衝液等の溶液、すなわち、洗浄液を添加して複合体を分散させ、再度遠心分離、磁力分離により、複合体と洗浄液を分離する方法等、従来公知の方法が挙げられる。

本発明のヘモグロビンＡ１ｃ値の測定方法において、上記抗ＨｂＡ１ｃ抗体とは、ＨｂＡ１ｃと特異的に反応する抗体であり、ＨｂＡ１ｃ以外のＨｂＡ成分とは反応しない抗体をいう。
上記抗ＨｂＡ１ｃ抗体のＨｂＡ１ｃ分子中における認識部位は、上記標識抗ＨｂＡ抗体の認識部位とは異なることが必要であり、上記標識抗ＨｂＡ抗体及び抗ＨｂＡ１ｃ抗体は相互にそれぞれの抗原抗体反応を妨げない必要がある。

上記抗ＨｂＡ１ｃ抗体を調整する方法としては特に限定されず、例えば、特許２５４０３６２号公報等に開示されているように従来公知の方法によって調製することができる。
上記抗ＨｂＡ１ｃ抗体としては、例えば、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の何れも用いることが可能である。また、上記抗ＨｂＡ１ｃ抗体としては、全分子又はＦａｂ画分等の断片を用いることもできる。

上記抗ＨｂＡ１ｃ抗体が固定化された固相としては特に限定されず、例えば、通常の免疫測定法で用いられる従来公知の固相を使用することができる。
上記固相としては、具体的には例えば、マイクロタイタープレート、チューブ、ビーズ、あるいは粒子等を使用することができる。
なかでも、後述する検出工程において、検出操作の行ないやすい固相を用いることが好ましい。

上記抗ＨｂＡ１ｃ抗体を上記固相に固定化する方法としては特に限定されず、従来公知の方法を用いることができる。
上記抗ＨｂＡ１ｃ抗体を上記固相に固定化する方法としては、具体的には例えば、物理吸着又は化学結合が知られている。すなわち、１μｇ／ｍｌ程度の濃度の抗体溶液を固相に接触させ、４℃で１２時間程度静置する等の方法により行なうことができる。上記抗ＨｂＡ１ｃ抗体を上記固相に固定化した後、タンパク質の非特異的吸着部位をブロックするために、常法に基づき、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）のようなタンパク質でブロッキング処理を行ってもよい。

上記複合体を、抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体が固定化された固相に接触させる方法としては特に限定されず、従来公知の方法、すなわち、上記複合体を緩衝液等の溶液に分散させ、該溶液を抗ＨｂＡ１ｃ抗体が固定化された固相に接触させる方法等が挙げられる。このとき、必要に応じて加温等を行なってもよい。

本発明のヘモグロビンＡ１ｃ値の測定方法は、前記固相において、前記抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体と反応しなかった前記複合体を洗浄除去する工程を有する（図１（ｆ）参照）。
上記複合体を上記固相に固定化された抗ＨｂＡ１ｃ抗体（以下、固定化抗ＨｂＡ１ｃ抗体ともいう）に接触させ反応させた後、洗浄操作を行うことによって、固定化抗ＨｂＡ１ｃ抗体と反応しなかった複合体、すなわち、標識ＨｂＡ抗体がＨｂＡ１ｃ以外のＨｂＡ成分と結合してなる複合体を洗浄除去する。

上記洗浄操作としては特に限定されず、従来公知の方法を用いることができ、例えば、緩衝液等を繰り返し固相に接触させて上清を除去する方法等が挙げられる。

本発明のヘモグロビンＡ１ｃ値の測定方法は、前記固相において、前記標識物質の量を検出する工程を有する（図１（ｇ）参照）。
上記固定化抗ＨｂＡ１ｃ抗体と反応した複合体は標識物質を有することから、該標識物質を検出することにより、複合体の量、すなわち、標識抗ＨｂＡ抗体と反応したＨｂＡ１ｃの量を測定できる。

上記固相の上記標識物質の量を検出する方法としては、上記標識物質の種類によって異なる。
上記標識物質として、酵素標識を用いる場合には、酵素反応を行い、発色反応を誘導して検出する方法が挙げられる。上記標識物質として、蛍光標識を用いる場合には、蛍光量を検出する方法が挙げられる。上記標識物質として、磁性標識を用いる場合には、磁性量を検出する方法が挙げられる。このようにして検出された標識物質の量から、ＨｂＡ１ｃの量を測定することができる。

このようにして得られたＨｂＡ１ｃの量と、添加した標識抗ＨｂＡ抗体の量とを用いることによって、下記式（２）に基づいて、ＨｂＡ１ｃ値（％）を算出することができる。

本発明によれば、血液試料中のＨｂＡ１ｃの量と、ＨｂＡの量とに基づいて、これらの比率からＨｂＡ１ｃ値（％）を算出することができることから、従来と異なり、異常Ｈｂ等の影響を受けることなく高精度にＨｂＡ１ｃ値（％）を測定することが可能なヘモグロビンＡ１ｃ値の測定方法を提供することができる。

（実施例１）
（標識物質の調製）
標識物質として磁性物質を選択し、磁性物質を含む粒子（磁性粒子）を調製した。
スチレン（キシダ化学社製、３．０ｇ）、グリシジルメタクリレート（和光純薬社製）３．０ｇ、ポリエチレングリコールメタクリレート（新中村化学社製）０．３ｇ及びエチレングリコールジメタクリレート（新中村化学社製）０．０３ｇの混合物をイオン交換水２００ｇ中に分散させ、攪拌しながら、窒素雰囲気下にて７０℃に昇温した。３０分間、０．５重量％の過硫酸カリウム水溶液（重合開始剤：和光純薬社製）２０ｍＬを反応系に添加し、更に、重合開始剤添加２分後に、１．０重量％の塩化鉄（ＩＩ）・４水和物（和光純薬社製）水溶液２０ｍＬを反応系に添加した。重合反応は７０℃で２０時間行なった。
重合反応後、遠心分離・再分散を蒸留水で４回繰り返し行うことで洗浄し、標識物質である磁性体を内包した粒子（以下、標識物質を磁性粒子ともいう）を得た。

（標識抗ＨｂＡ抗体の調製）
標識物質（磁性粒子）に、抗ＨｂＡ抗体を固定化し、標識抗ＨｂＡ抗体を調製した。
上記磁性粒子１２ｍｇに、１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ６．５）１．０ｍＬを加え、１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行ない、上清を除去した。得られた沈渣に、１００ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ６．５）を３８０μＬ、５．０ｍｇ／ｍＬの抗ＨｂＡ抗体溶液を２０μＬ加え、充分混和して室温にて２０時間攪拌した。反応後、１５０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離を行ない、未反応の抗ＨｂＡ抗体を除去した。なお、磁性粒子への抗ＨｂＡ抗体の結合量は、上清の抗体（非結合の抗体）濃度測定から、仕込み量の５５％であることを確認した。
得られた沈渣は、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬに懸濁させ、遠心分離を行った。その沈渣を、５．０重量％の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）９００μＬに懸濁させ、３７℃で１時間攪拌してブロッキング処理を行った。
その後、１５０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離を行ない、沈渣に１００ｍＭホウ酸緩衝液１．０ｍＬ（ｐＨ７．５）を添加し、超音波で分散させた。続いて、５．０重量％のＢＳＡ、５．０重量％のグリセロール、及び０．０１重量％のアジ化ナトリウムを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）１ｍＬ中に懸濁させ、標識抗ＨｂＡ抗体溶液を得た。

（抗ＨｂＡ１ｃ抗体固定化試験片の調製）
ニトロセルロースメンブレン（ＳＲＨＦ Ｐ７０、日本ミリポア社製）を幅２０ｃｍ×長
さ６ｃｍに裁断し、その長さ方向上端より３ｃｍの部位（以下、反応部位ともいう）に、２．０ｍｇ／ｍｌの抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体を含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を幅０．７ｍｍの直線状に塗布した。メンブレンを３７℃で２時間乾燥した後、１．０重量％の牛血清アルブミンを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に１時間浸漬し、ブロッキング処理を行った。更に、その後、０．１重量％のラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウムを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で洗浄後、シリカゲルデシケーター内で室温下にて乾燥し、抗ＨｂＡ１ｃモノクローナル抗体を固定化したメンブレンを得た。
得られた試験片を幅５ｍｍに裁断し、長さ方向の一方の端に幅５ｍｍ×長さ２０ｍｍの吸水パッド（日本ミリポア社製ＡＰ２２）を、他方の端に幅５ｍｍ×長さ１５ｍｍのグラスファイバー製コンジュゲートパッド（日本ミリポア社製）を重ね、透明なテープで固定して試験片とした。

（コントロール血液試料の調製）
グリコＨｂコントロール（シスメックス社製）レベルＩ（ＨｂＡ１ｃ値が５．０％）及びレベルＩＩ（同１１．０％）を蒸留水２００μＬで溶解した後、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８）にて２００倍に希釈した。レベルＩ及びレベルＩＩを混合して、ＨｂＡ１ｃ値が５．０〜１１．０％の試料（コントロール試料）を調製した。

（コントロール試料の測定）
１．０重量％のＢＳＡ及び０．０１重量％のアジ化ナトリウムを含む１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に、上記標識抗ＨｂＡ抗体を０．１重量％の濃度になるように溶解した。得られた溶液２０μＬを９６ウェルマイクロプレート（ナルジェヌンクインターナショナル社製）の各ウェルに添加した。
次に、上記コントロール試料１００μＬをウェルに添加して混合し、試料中のＨｂＡ類と標識抗ＨｂＡ抗体の複合体を形成させた。反応後、磁石をプレートに接触させて標識抗ＨｂＡ抗体複合体を集めた後、上清（標識抗ＨｂＡ抗体と反応しなかった余剰のＨｂ類を含む）を除去した。上記リン酸緩衝液を再度添加して分散させて、同様に磁石で標識抗ＨｂＡ抗体複合体を集めた後に上清を除去した（洗浄操作）。上記洗浄操作を３回繰り返した後、ウェル内の標識抗ＨｂＡ抗体を回収し、１．０重量％のＢＳＡ及び０．０３重量％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む生理食塩水に分散させた。
次に、上記で作製した、固定化抗ＨｂＡ１ｃ抗体を固定化した反応部位を有する試験片のコンジュゲートパッド内に、上記コントロール試料１００μＬを滴下した。滴下１０分後、試験片の反応部位における磁性量を、ＧＭＲセンサ（差動磁界センサ、ＮＶＥ社製）にて測定した。用いたコントロール試料のＨｂＡ１ｃ値と、検出された磁性量の関係を図２に示す。ＨｂＡ１ｃ値の増加に伴い磁性量が増大しており、両者は直線関係にあることがわかる。
また、上記磁性量から抗ＨｂＡ１ｃ抗体と反応した標識抗ＨｂＡ抗体の量；すなわちＨｂＡ１ｃ量（Ｘ）を算出し、ＨｂＡ量；すなわち用いた標識抗ＨｂＡ抗体量（Ｙ）とから、ＨｂＡ１ｃ値（％）を下記式（２）により求めた。

この結果と、同一のコントロール試料を市販のＨＰＬＣ法による測定装置（アークレイ社製、ＨＡ−８１７０）にて測定した際の結果との相関関係を図３に示す。良好な相関性を示し、測定値も一致した。

（健常人及び糖尿病患者血の測定）
健常人及び糖尿病患者より採血した血液試料を用いて、上述の測定と同様の測定を実施した。得られたＨｂＡ１ｃ値と、同一試料を市販のＨＰＬＣ法による測定装置（アークレイ社製、ＨＡ−８１７０）にて測定した際の結果の相関関係を図４に示す。図４に示すように、良好な相関性を示し、測定値も一致した。

本発明のヘモグロビンＡ１ｃ値の測定方法の原理を説明するための模式図である。 本発明のヘモグロビンＡ１ｃ値の測定方法により得られた磁性量とＨｂＡ１ｃ値の関係を示す模式図である。 本発明のヘモグロビンＡ１ｃ値の測定方法の測定値とＨＰＬＣ法の測定値との関係（コントロール試料）を示す模式図である。 本発明のヘモグロビンＡ１ｃ値の測定方法の測定値とＨＰＬＣ法の測定値との関係（実試料）を示す模式図である。

Claims (2)

1. ヘモグロビンＡ類を含有する血液試料に、一定量の標識物質と結合した抗ヘモグロビンＡ抗体を添加して測定試料を作製する工程、
   前記測定試料において、前記ヘモグロビンＡ類及び前記標識物質と結合した抗ヘモグロビンＡ抗体からなる複合体と、前記複合体以外の成分とを分離し、前記複合体以外の成分を除去した後、前記複合体を、抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体が固定化された固相と反応させる工程、
   前記固相において、前記抗ヘモグロビンＡ１ｃ抗体と反応しなかった前記複合体を洗浄除去する工程、及び、
   前記固相において、前記標識物質の量を検出する工程を有する
   ことを特徴とするヘモグロビンＡ１ｃ値の測定方法。
2. 標識物質は、磁性物質であることを特徴とする請求項１記載のヘモグロビンＡ１ｃ値の測定方法。

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