JP7304649B2 - スイッチ性付着反応を用いた親和分離システム及び方法 - Google Patents

Description

発明の詳細な説明

［技術分野］
本発明は、スイッチ性付着反応を用いた親和分離システム及び方法に関し、より詳細には、サンプル内の所定の対象成分を亜集団に分離する技術に関する。

［背景技術］
最近、癌疾患及び退行性疾患などの特定疾患の検査の痛みを最小化し、早期診断を実現するための「液体生検（ｌｉｑｕｉｄ ｂｉｏｐｓｙ）」の概念が紹介された。液体生検は、非侵襲的な方法で比較的簡便に血液、唾液、尿などの体液を抽出して、特定疾患関連の細胞あるいはこれから流出された構成成分（ペプチド、タンパク質、核酸、小器官、特定の物質など）に対する分析を行う方法である。これを通じて、特定の疾患が発生したか否かを早期に確認できるので、既存の映像診断、組織検査、そして血液検査方法などのような検査方法の代案として注目を集めている。特に、人体内の細胞から微小小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）の形態で分泌されて、その由来細胞の特徴をそのまま反映しているエクソソームは、細胞の「アバター」と呼ばれ、血液、唾液、尿などの様々な体液から抽出可能である。エクソソームは、脂質二重層からなる小胞体であるので、体内で安定的であるだけでなく、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）、ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅなどの攻撃から自由である。したがって、エクソソームを癌疾患及び退行性疾患などの特定疾患の診断の新たなバイオマーカーとして利用しようとする研究が増加しており、実際にエクソソームを用いた癌の早期診断の目的の製品が開発されている。

しかし、体液にはあらゆる細胞から由来したエクソソームが混合された形態で存在するため、単純に体液から分離されたバルク母集団（ｂｕｌｋ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）形態のエクソソームサンプルでは癌などの特定の疾患を正確に診断するのに限界がある。さらに、疾患の発病初期には体液内の特定疾患関連細胞由来のエクソソームの濃度が相対的に非常に低いため、早期診断のためには、体液からターゲットエクソソームの分離及び濃縮が先行しなければならない。現存するエクソソーム分離技術の中で、密度差ベースの超遠心分離方法が再現性が高く、比較的安定した工程により、最上位標準（ｇｏｌｄ ｓｔａｎｄａｒｄ）分離過程として採択されている。しかし、高価な装備が必ず必要であり、分離時間が長くかかるという欠点がある。このような欠点を補完するために、エクソソームを沈殿させて分離する方法、及びサイズ排除クロマトグラフィ（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いるか、または特許文献（韓国登録特許第１０－１８０７２５６号）に開示されたようにマイクロフルイディクス（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を用いてサイズによって分離する方法が開発された。

しかし、このような既存のエクソソーム分離技術は、体液に存在する全てのエクソソームを一つの母集団の形態で提供するため、癌のような特定細胞由来の極微量のエクソソームを選択的に探知するのに限界がある。

そこで、従来の細胞や細胞由来の構成成分を分離する技術の問題点を解決するための方案が切実に求められている状況である。

［発明の概要］
［発明が解決しようとする課題］
本発明は、上述した従来技術の問題点を解決するためのもので、結合タンパク質などのようなバインダーがリガンドと結合して引き起こされるバインダーの構造変化（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｈａｎｇｅ）を特異的に認識する認識素材を用いて、溶液内のリガンドの有無に応じて迅速にバインダー－認識素材の結合あるいは各個の成分に解離されるスイッチ性付着反応（ｓｗｉｔｃｈ－ｌｉｋｅ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）に基づいて、分離対象の亜集団を高収率及び元の状態で親和分離する技術を提供することにある。

［課題を解決するための手段］
本発明の実施例に係る親和分離システムは、リガンドと；前記リガンドが着脱可能に結合され、前記リガンドと結合反応して構造が変わるバインダーと；構造が変わった前記バインダーと特異的に結合する認識素材と；前記バインダー及び前記認識素材のいずれか一方が表面に固定される固定部材と；前記バインダー及び前記認識素材の他方と重合されて重合体を形成し、サンプル溶液内の目標亜集団対象物質と特異的に結合する捕捉素材と；を含む。

また、本発明の実施例に係る親和分離システムにおいて、前記リガンドは、糖分子、イオン、基質、及び抗原からなる群から選択されるいずれか１つ以上を含むことができる。

また、本発明の実施例に係る親和分離システムにおいて、前記バインダーは、糖結合タンパク質、イオン結合タンパク質、酵素、抗体、アプタマー、細胞受容体、及びナノ構造体からなる群から選択されるいずれか１つ以上を含むことができる。

また、本発明の実施例に係る親和分離システムにおいて、前記認識素材は、抗体、タンパク質受容体、細胞受容体、アプタマー、酵素、ナノ粒子、ナノ構造体、及び重金属キレート剤（ｃｈｅｌａｔｏｒ）からなる群から選択されるいずれか１つ以上を含むことができる。

また、本発明の実施例に係る親和分離システムにおいて、前記固定部材は、ヒドロゲル、磁性ビーズ、ラテックスビーズ、ガラスビーズ、ナノ金属構造体、細孔性メンブレン、及び非細孔性メンブレンからなる群から選択されるいずれか１つ以上を含むことができる。

また、本発明の実施例に係る親和分離システムにおいて、内部に前記固定部材を収容する反応器；をさらに含むことができる。

また、本発明の実施例に係る親和分離システムにおいて、結合された前記リガンドが脱着されるときに、結合された前記バインダーと前記認識素材が互いに分離されてもよい。

また、本発明の実施例に係る親和分離システムにおいて、前記目標亜集団対象物質と結合した前記固定部材は、磁力、重力、及び遠心力のいずれか１つ以上によって濃縮されてもよい。

また、本発明の実施例に係る親和分離システムにおいて、前記サンプル溶液は体液を含み、前記目標亜集団対象物質は、前記体液内の異種のバルク集団から分離される物質であってもよい。

また、本発明の実施例に係る親和分離システムにおいて、前記異種のバルク集団は、所定の疾患の診断に使用される細胞、エクソソーム、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、糖、及び代謝成分からなる群から選択される少なくとも２つ以上を含むことができる。

一方、本発明の実施例に係る親和分離方法は、（ａ）リガンドが含有されたリガンド溶液、前記リガンドと着脱可能に結合反応して構造が変わるバインダー、構造が変わった前記バインダーと特異的に結合する認識素材、及び前記バインダー及び前記認識素材のいずれか一方と重合されて重合体を形成する捕捉素材を反応させて、前記バインダー及び前記認識素材の他方と、前記重合体とを結合させるステップと；（ｂ）前記捕捉素材が特異的に結合する目標亜集団対象物質を含むサンプル溶液を添加し、前記重合体の前記捕捉素材と前記目標亜集団対象物質とを結合させるステップと；（ｃ）前記バインダーに結合された前記リガンドが脱着されるように、前記リガンドが含まれていない回収溶液を添加して、前記認識素材及び前記バインダーの他方から、前記目標亜集団対象物質と結合された前記重合体を分離するステップと；を含む。

また、本発明の実施例に係る親和分離方法において、前記（ａ）ステップは、前記バインダー及び前記認識素材の他方を固定部材の表面に固定させるステップと；前記重合体が溶解された前記リガンド溶液を、前記固定部材に添加して、前記固定部材に固定された前記バインダー及び前記認識素材の他方と、前記重合体とを結合させるステップと；を含むことができる。

また、本発明の実施例に係る親和分離方法において、前記（ｂ）ステップと前記（ｃ）ステップとの間に、磁力、重力、及び遠心力のいずれか１つ以上を用いて、前記目標亜集団対象物質と結合された前記固定部材を、前記リガンド溶液及び前記サンプル溶液が混合された混合溶液内の所定の空間領域に捕捉するステップと；前記固定部材が含まれていない前記混合溶液の一部を除去して、前記目標亜集団対象物質を濃縮するステップと；をさらに含むことができる。

また、本発明の実施例に係る親和分離方法において、前記サンプル溶液は体液を含み、前記目標亜集団対象物質は、前記体液内の異種のバルク集団から分離される物質であってもよい。

また、本発明の実施例に係る親和分離方法において、前記異種のバルク集団は、所定の疾患の診断に使用される細胞、エクソソーム、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、糖、及び代謝成分からなる群から選択される少なくとも２つ以上を含むことができる。

本発明の特徴及び利点は、添付の図面に基づく次の詳細な説明によりさらに明らかになるであろう。

先ず、本明細書及び特許請求の範囲に使用された用語や単語は、通常の又は辞書的な意味に限定して解釈されてはならず、発明者が自分の発明を最良の方法で説明するために用語の概念を適宜定義できるという原則に基づき、本発明の技術的思想に符合する意味及び概念として解釈されなければならない。

［発明の効果］
本発明によれば、特定の疾患と関連する生体対象成分を苛酷でない条件下で亜集団に分離することができ、分離された対象成分の亜集団を液体生検サンプルとして用いて、癌疾患及び退行性疾患などの特定の疾患の診断を高感度で行うことができる。

［図面の簡単な説明］
［図１］本発明の実施例に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離システムの構成図である。

［図２］本発明の他の実施例に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離システムの構成図である。

［図３］本発明の実施例に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離方法の流れ図である。

［図４］本発明の他の実施例に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離方法の流れ図である。

［図５］本発明の実施例に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離方法を用いて黒色腫癌細胞と関連するエクソソーム亜集団を分離する工程を示した流れ図である。

［図６］本発明に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離システム及び方法を用いてサンプル内のＣＤ６３＋エクソソームを免疫親和クロマトグラフィー工程により分離した結果である。

［図７］図６の免疫親和クロマトグラフィー工程を繰り返して用いてエクソソームの分離時の再現性を示した結果である。

［図８］本発明に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離システム及び方法を用いてサンプル内のＣＤ６３＋エクソソームを免疫磁性分離工程により分離及び濃縮した結果である。

［図９］図８の免疫磁性分離工程を繰り返して行う場合のＣＤ６３＋エクソソームの分離時の再現性を示した結果である。

［図１０］本発明に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離システム及び方法を用いて分離されたＣＤ６３＋エクソソームに対する物理的特性化の結果である。

［図１１］本発明に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離システム及び方法を用いて分離されたＣＤ６３＋エクソソームサンプルのエクソソーム表面マーカーに対する特性化の結果である。

［図１２］エクソソーム標準サンプル間の濃度の変移を補償するために、ＣＤ９の濃度を基準としてＣａｖ１マーカーの濃度を補正した結果である。

［図１３］本発明に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離システム及び方法を用いて分離したＣＤ６３＋エクソソームを分析サンプルとして用いる際に、黒色腫癌の診断に対する潜在的な効果を示した結果である。

［図１４］本発明に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離システムと、現在商業的に販売されている様々なエクソソーム分離システムとの間に、分離されたサンプルの免疫分析によって決定されたＣａｖ１／ＣＤ９の濃度比率を基準として、黒色腫癌サンプルを正常サンプルから区分する性能に対する比較結果である。

［発明を実施するための最良の形態］
本発明の目的、特定の利点及び新規な特徴は、添付の図面と関連する以下の詳細な説明及び好ましい実施例からさらに明らかになるだろう。本明細書において各図面の構成要素に参照番号を付加するにおいて、同一の構成要素に限っては、たとえ他の図面上に表示されても、可能な限り同一の番号を有するようにしていることに留意しなければならない。また、「第１」、「第２」などの用語は、一つの構成要素を他の構成要素から区別するために使用されるもので、構成要素が前記用語によって制限されるものではない。以下、本発明を説明するにおいて、本発明の要旨を不要に曖昧にする可能性がある係る公知技術についての詳細な説明は省略する。

以下、添付の図面を参照して本発明の好ましい実施形態を詳細に説明する。

図１は、本発明の実施例に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離システムの構成図であり、図２は、本発明の他の実施例に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離システムの構成図である。

図１及び図２に示したように、本発明に係る親和分離システムは、リガンド１０と、前記リガンド１０が着脱可能に結合され、前記リガンド１０と結合反応して構造が変わるバインダー２０と、構造が変わったバインダー２０と特異的に結合する認識素材３０と、バインダー２０及び認識素材３０のいずれか一方が表面に固定される固定部材４０と、バインダー２０及び認識素材３０の他方と重合されて重合体Ｃを形成し、サンプル溶液内の目標亜集団対象物質１と特異的に結合する捕捉素材５０とを含む。

本発明は、サンプル内の所定の対象成分を亜集団に分離する技術に関する。特定の疾患が発生したか否かを早期に確認する診断方法として、血液、唾液、尿などの体液を抽出して、特定疾患関連の細胞あるいはこれから流出された構成成分（ペプチド、タンパク質、核酸、小器官、特定の物質など）に対する分析を行う「液体生検（ｌｉｑｕｉｄ ｂｉｏｐｓｙ）」がある。特に、体液から抽出されるエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を、癌疾患及び退行性疾患などの特定疾患の診断の新たなバイオマーカーとして用いる技術が最近研究されている。但し、体液にはあらゆる細胞に由来したエクソソームが混合された形態で存在するため、単純に体液から分離されたバルク母集団（ｂｕｌｋ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の形態のエクソソームサンプルでは癌のような特定の疾患を正確に診断するのに限界があるので、ターゲットエクソソームの分離及び濃縮技術が求められる。従来のエクソソーム分離技術としては、超遠心分離、沈殿分離、サイズ排除クロマトグラフィ（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）またはマイクロフルイディクス（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を用いて分離する方法があるが、このような従来技術は、体液に存在する全てのエクソソームを一つの母集団の形態で提供するため、癌のような特定の細胞に由来した極微量のエクソソームを選択的に探知するのに限界がある。

そこで、本発明は、エクソソームの表面に癌との相関性が高いタンパク質マーカー、例えば、黒色腫癌の場合にＣａｖｅｏｌｉｎ１（Ｃａｖ１）、胃癌の場合にＨＥＲ－２／ｎｅｕ、そして、卵巣癌の場合にＬ１ＣＡＭが存在する点に着目して、特定のマーカーに対する免疫親和分離方法を採用することによって、特定のエクソソーム亜集団を分離しようとする。但し、体液内の極微量のエクソソームを既存の一般の工程により分離し、探知するには、探知の限界の克服及び再現性の維持の観点で非常に難しい。実際に、固相の母体に捕捉された特定のエクソソームを解離させるためには、酸性ｐＨあるいは界面活性剤の包含のような苛酷条件を用いなければならないので、エクソソームの損傷及び収率の減少がもたらされるという問題が依然として存在するためである。そこで、本発明は、サンプルから目標亜集団を高収率及び元の状態で回収できるように、苛酷条件を用いない親和分離技術を実現するために案出された。

ここで、サンプルは、液体生検に必要な体液であって、目標亜集団対象物質１はエクソソームであってもよいが、必ずしもこれに限定されるものではない。したがって、体液が必ずしも液体生検に活用される場合のみに限定されるものではなく、サンプルは、目標亜集団対象物質１を含むいかなる種類のサンプルであっても構わない。また、目標亜集団対象物質１は、細胞や細胞由来の構成成分などのように、本発明によって分離可能な物質であれば、特に制限はない。

具体的には、本発明に係る親和分離システムは、リガンド１０、バインダー２０、認識素材３０、固定部材４０、及び捕捉素材５０を含む。

ここで、リガンド１０は、バインダー２０に着脱可能に結合される物質であって、糖分子、イオン、基質、及び抗原からなる群から選択されるいずれか１つ以上を含むことができる。

バインダー２０は、リガンド１０との結合反応を通じて構造変化（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｈａｎｇｅ）が引き起こされる物質である。このようなバインダー２０は、糖結合タンパク質、イオン結合タンパク質、酵素、抗体、アプタマー、細胞受容体、及びナノ構造体からなる群から選択されるいずれか１つ以上を含むことができる。したがって、バインダー２０及びリガンド１０は、糖結合タンパク質－糖分子ペア、イオン結合タンパク質－イオンペア、酵素－基質ペア、抗原－抗体ペア、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）－リガンドペア、細胞受容体－リガンドペア、ナノ構造体－リガンドペアなどのようなバインダー－リガンドペアをなすことができ、最も代表的なバインダー２０とリガンド１０の例としては、カルシウム結合タンパク質（ｃａｌｃｉｕｍ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＣＢＰ）とカルシウムイオンが挙げられる。但し、バインダー２０及びリガンド１０が必ずしも前記物質に限定されるものではなく、互いに着脱可能に結合して構造変化を起こす物質であれば、いかなるものでも構わない。

認識素材３０は、リガンド１０と結合して構造が変わったバインダー２０と特異的に結合する物質であって、抗体、タンパク質受容体、細胞受容体、アプタマー、酵素、ナノ粒子、ナノ構造体、及び重金属キレート剤（ｃｈｅｌａｔｏｒ）からなる群から選択されるいずれか１つ以上を含むことができる。但し、前記物質は、認識素材３０の一例に過ぎず、必ずしもこれに限定して本発明の権利範囲が定められてはならない。具体的な実施例として、リガンド１０とバインダー２０と認識素材３０との間の結合反応を説明すると、カルシウムイオン（リガンド）がカルシウム結合タンパク質（バインダー）と１次結合してカルシウム結合タンパク質の構造変化が引き起こされ、構造が変わったカルシウム結合タンパク質と抗体（認識素材）との間に抗原－抗体反応が起こって互いに結合される。

ここで、バインダー２０及び認識素材３０のいずれか一方は、固定部材４０に固定され、他方は、捕捉素材５０と重合されて重合体Ｃを形成する。すなわち、図１のように、固定部材４０上に認識素材３０が固定され、バインダー２０と捕捉素材５０が重合されてバインダー－捕捉素材重合体Ｃを形成する場合（第１実施例、後述する実施例２及び実施例３参照）と、図２のように、固定部材４０上にバインダー２０が固定され、認識素材３０と捕捉素材５０が重合されて認識素材－捕捉素材重合体Ｃを形成する場合（第２実施例）とに区分することができる。

それぞれの前記実施例において、固定部材４０は、表面にバインダー２０又は認識素材３０を結合固定する部材であって、ヒドロゲル（実施例２参照）、磁性ビーズ（実施例３参照）、ラテックスビーズ、ガラスビーズ、ナノ金属構造体、細孔性メンブレン、及び非細孔性メンブレンからなる群から選択されるいずれか１つ以上を含むことができる。但し、固定部材４０が必ずしも前記に限定されるものではなく、バインダー２０又は認識素材３０と結合可能な素材であれば、特に制限されない。捕捉素材５０は、バインダー２０又は認識素材３０と重合され、サンプル溶液内の目標亜集団対象物質１と特異的に結合される抗体のような物質である。このような抗体などの捕捉素材５０は、目標亜集団対象物質１の表面タンパク質のようなターゲットマーカーＰと抗原－抗体反応などを通じて特異的に結合され得る。

したがって、前記第１実施例の場合には、固定部材４０上に認識素材３０が固定され、リガンド１０が結合されて構造が変わったバインダー２０が認識素材３０と結合し、バインダー２０と重合された捕捉素材５０が目標亜集団対象物質１と特異的に結合して、サンプル溶液内の目標亜集団対象物質１を捕捉する。このとき、バインダー２０と捕捉素材５０が互いに重合された状態で、すなわち、バインダー－捕捉素材重合体Ｃとしてバインダー２０がリガンド１０と結合されるか、またはバインダー２０がリガンド１０と先に結合し、以降にバインダー２０と捕捉素材５０が互いに重合されてもよい。

第２実施例の場合には、固定部材４０上にバインダー２０が固定され、リガンド１０が結合されて構造が変わったバインダー２０と認識素材３０が互いに結合し、認識素材３０と重合された捕捉素材５０が目標亜集団対象物質１と特異的に結合して、サンプル溶液内の目標亜集団対象物質１を捕捉する。このとき、認識素材３０と捕捉素材５０が重合された認識素材－捕捉素材重合体Ｃがバインダー２０と結合するか、または認識素材３０が先にバインダー２０と結合した後に捕捉素材５０と重合されてもよい。

一方、前記第１及び第２実施例において、それぞれの結合反応は、内部に固定部材４０を収容する反応器（図示せず）内で行われ得る。このとき、反応器の内部では、認識素材３０、バインダー２０、及び捕捉素材５０を媒介として、固定部材４０と目標亜集団対象物質１が互いに結合するようになる。ここで、磁力、重力、及び遠心力のいずれか１つ以上を用いて目標亜集団対象物質１を濃縮することができる。例えば、磁性ビーズを固定部材４０として使用する場合、磁石を用いて目標亜集団対象物質１と結合された固定部材４０を捕捉した状態で上層液を除去し、磁性ビーズを除去することによって濃縮が可能である。

一方、前述したように、サンプル溶液内の目標亜集団対象物質１を捕捉した後は、これを回収しなければならないが、ここで、バインダー２０に結合されたリガンド１０を脱着させることによって、構造が変わったバインダー２０を元の状態に回復させ、結合されたバインダー２０と認識素材３０を互いに分離する方法を取ることができる。このとき、リガンド１０が含まれていない回収溶液を注入してリガンド１０を脱着させることができる。

前記のように具現された本発明の親和分離システムは、体液から癌疾患や退行性疾患などのような特定の疾患と関連する細胞や細胞由来の構成成分を分離して回収するのに用いることができる。この場合、体液を含むサンプル溶液を使用するが、その体液内には異種のバルク集団が存在するので、その異種のバルク集団から必要な目標亜集団対象物質１を前記親和分離システムを用いて分離回収する。このとき、異種のバルク集団は、所定の疾患の診断に使用される細胞、エクソソーム、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、糖、及び代謝成分からなる群から選択される少なくとも２つ以上を含むことができる。

総合的に、本発明は、カルシウム結合タンパク質のようなバインダー２０がこれと特異的に反応するカルシウムイオンのようなリガンド１０と結合して引き起こされる構造変化を特異的に認識する抗体などの認識素材３０の利用に基づく。このような抗原－抗体反応のようなバインダー２０－認識素材３０反応は、カルシウムイオンのようなリガンド１０の有無に応じて迅速に結合あるいは解離され、まるでスイッチを操作してオン／オフする原理と類似するので、‘スイッチ性可逆付着反応（ｓｗｉｔｃｈ－ｌｉｋｅ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）’として描写される。このような本発明によれば、新たな可逆性の抗原－抗体反応のような付着反応を用いて、ターゲットマーカーを含む対象亜集団を、苛酷でない条件で高効率で分離及び濃縮することができる。すなわち、抗原－抗体反応によって結合されたエクソソームのような目標亜集団対象物質を固相のビーズの表面から回収するために、酸性ｐＨのような苛酷な条件を用いる方式と比較するとき、エクソソームなどの構造的原形を維持することができ、また、高収率の回収が可能である。

以下では、本発明に係る親和分離システムを用いた親和分離方法について説明する。親和分離システムについては上述したので、重複する事項については説明を省略又は簡単に記述する。

図３は、本発明の実施例に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離方法の流れ図であり、図４は、本発明の他の実施例に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離方法の流れ図である。

図３及び図４に示したように、本発明に係る親和分離方法は、（ａ）リガンド１０が含有されたリガンド溶液、リガンド１０と着脱可能に結合反応して構造が変わるバインダー２０、構造が変わったバインダー２０と特異的に結合する認識素材３０、及びバインダー２０及び認識素材３０のいずれか一方と重合されて重合体Ｃを形成する捕捉素材５０を反応させて、バインダー２０及び認識素材３０の他方と、重合体Ｃとを結合させるステップ（Ｓ１００）と、（ｂ）捕捉素材５０が特異的に結合する目標亜集団対象物質１を含むサンプル溶液を添加し、重合体Ｃと目標亜集団対象物質１とを結合させるステップ（Ｓ２００）と、（ｃ）バインダー２０に結合されたリガンド１０が脱着されるように、リガンド１０が含まれていない回収溶液を添加して、認識素材３０及びバインダー２０の他方から、目標亜集団対象物質１と結合された重合体Ｃを分離するステップ（Ｓ３００）とを含む。

サンプル溶液内で目標亜集団対象物質１を分離し、回収するために、まず、リガンド溶液、バインダー２０、認識素材３０、及び捕捉素材５０を反応させる（Ｓ１００）。このとき、バインダー２０及び認識素材３０のいずれか一方は、捕捉素材５０と重合されて重合体Ｃを形成し、他方は、その重合体Ｃと結合する。ここで、リガンド溶液内に含有されたリガンド１０がバインダー２０に結合されてバインダー２０の構造変化が引き起こされ、構造が変わったバインダー２０を認識素材３０が特異的に認識して結合する。

すなわち、図３を参照すると、前述した第１実施例のように、バインダー２０と捕捉素材５０が重合されてバインダー－捕捉素材重合体Ｃが形成され、バインダー２０は、リガンド溶液の添加により構造変化が引き起こされるので、認識素材３０がバインダー２０と結合できる。このとき、バインダー２０及び捕捉素材５０は、重合体Ｃが形成された状態で添加されるか、または個別に添加されて重合体Ｃを形成してもよい。一実施例として、認識素材３０を固定部材４０の表面に固定させ、バインダー－捕捉素材重合体Ｃが溶解されたリガンド溶液を固定部材４０に添加することによって、認識素材３０と重合体Ｃを結合させることができる。

また、図４を参照すると、前述した第２実施例のように、認識素材－捕捉素材重合体Ｃが形成され、リガンド溶液により構造が変わったバインダー２０が重合体Ｃの認識素材３０と結合できる。このときにも、認識素材３０及び捕捉素材５０は、重合体Ｃの状態で添加されてもよいが、個別に添加されて重合体Ｃを形成してもよい。一例として、バインダー２０を固定部材４０の表面に固定させ、認識素材－捕捉素材重合体Ｃが溶解されたリガンド溶液を固定部材４０に添加することによって、バインダー２０と重合体Ｃを結合させることができる。

次に、目標亜集団対象物質１を含むサンプル溶液を添加する（Ｓ２００）。このとき、重合体Ｃの捕捉素材５０が目標亜集団対象物質１と特異的に結合するようになる。ここで、サンプル溶液は体液を含むことができ、このとき、目標亜集団対象物質１は、前記体液内の異種のバルク集団から分離される。ここで、異種のバルク集団は、所定の疾患の診断に使用される細胞、エクソソーム、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質、糖、及び代謝成分からなる群から選択される少なくとも２つ以上を含むことができるので、一例として、エクソソームを含む異種のバルク集団から、エクソソームを目標亜集団対象物質１として分離することができる。

以降に、回収溶液を添加する（Ｓ３００）。回収溶液は、リガンド１０を含有していないリガンド１０非含有の溶液であって、回収溶液が添加されると、バインダー２０に結合されたリガンド１０が脱落するようになり、これにより、バインダー２０の変化した構造が元の状態に回復されながら、バインダー２０と認識素材３０との結合が解除される。したがって、目標亜集団対象物質１と結合された重合体Ｃが、認識素材３０から分離されるか（第１実施例及び図３参照）、またはバインダー２０から分離されるので（第２実施例及び図４参照）、最終的に目標亜集団対象物質１を回収することができる。このとき、目標亜集団対象物質１は、重合体Ｃと共に回収され、固定部材４０上には、初期のような形態で認識素材３０が固定されるか（第１実施例及び図３参照）、またはバインダー２０が固定されるので（第２実施例及び図４参照）、認識素材３０又はバインダー２０が固定された固定部材４０を活用して新たなサンプル溶液を分離することもできる。

一方、サンプル溶液を添加した後、回収溶液を添加する前に、目標亜集団対象物質１を濃縮することができる。具体的には、磁力、重力、及び遠心力のいずれか１つ以上を用いて、目標亜集団対象物質１と結合された固定部材４０を、リガンド溶液及びサンプル溶液が混合された混合溶液内の所定の空間領域に捕捉する。次に、固定部材４０が含まれていない混合溶液の一部（例えば、上層液）を除去することによって、目標亜集団対象物質１を濃縮することができる。

前記の工程は反応器で行うことができ、反応器の内部に認識素材３０又はバインダー２０が固定された固定部材４０を充填し、これに、リガンド溶液、重合体Ｃ、サンプル溶液などを添加する。ここで、反応器は、クロマトグラフィーカラムであって、クロマトグラフィー方式で結合及び脱着反応を行うか、またはバッチ容器であって、バッチ（ｂａｔｃｈ）方式で反応を行い、磁力、重力、または遠心力を用いて分離する工程を行うことができる。

一例として、本発明は、特定疾患の診断のための液体生検時に体液内のエクソソーム亜集団を分離・濃縮する技術として活用できるところ、以下では、図５を参照して、本発明を用いてエクソソーム亜集団を分離する工程について説明する。図５は、本発明の実施例に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離方法を用いて黒色腫癌細胞と関連するエクソソーム亜集団を分離する工程を示した流れ図である。

体液内のエクソソームを用いた液体生検時に、単純に濃縮したバルク母集団の形態のサンプルから、検査対象の疾病に選択的に分離されたエクソソーム（ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｅｘｏｓｏｍｅ）サンプルの使用は診断の正確度を向上させることができる。このような接近法を実験的に例示するために、メラニン産生細胞から発生する皮膚癌である黒色腫癌を対象として選択した。参考に、黒色腫癌は、悪性度が最も高く、転移率が高いため、生存率を高めるために、迅速かつ正確な診断が必要な疾病である。過去のある研究によれば、エクソソームの表面タンパク質であるＣａｖｅｏｌｉｎ１（Ｃａｖ１）は、健常者に比べて黒色腫癌患者の血液で著しく増加するので、Ｃａｖ１陽性（Ｃａｖ１＋）エクソソームベースの診断敏感度は６８％で、他の黒色腫癌マーカーであるＣＤ６３ベースの診断敏感度である４３％よりも相対的に高い。このような液体生検の性能の向上を通じて臨床に用いるためには、ターゲットエクソソームの選択的な分離及び濃縮が必要であるが、体液内の全エクソソーム中のその割合が非常に低いため、公知の一般的な工程によっては実現しにくい。

したがって、本発明は、体液内のエクソソームを選択的に分離してＣａｖ１＋エクソソームを含有した亜集団を取得し、これを検査サンプルとして用いることで、黒色腫癌の診断の正確度及び敏感度を増加させる方法として活用しようとする。エクソソームの分離時に、その収率及び再現性を考慮して、Ｃａｖ１＋エクソソームを分離対象としてターゲッティングせず、癌の発生と連関性があるその上位のエクソソーム集団を分離対象とした。例えば、他の表面タンパク質と比較して一般的なエクソソームに多く存在するｈｏｕｓｅ－ｋｅｅｐｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎであるＣＤ６３タンパク質は、黒色腫癌を含むいくつかの癌の発生時にエクソソームの表面に増加して発現するので、この表面タンパク質を分離媒介体として用いる技術である。実際に、エクソソーム表面タンパク質ＣＤ６３＋エクソソームを黒色腫癌に対する診断マーカーとして用いる際に、その敏感度が４３％であって、エクソソーム表面タンパク質Ｃａｖ１＋の利用時よりも低いと報告されているが、分離されたＣＤ６３＋エクソソーム亜集団にＣａｖ１＋エクソソームが含まれれば、これを検査サンプルとして用いた黒色腫癌の診断の敏感度は、バルク母集団サンプルの利用時よりも遥かに増加すると仮定することができる（図５の上段参照）。

表面タンパク質マーカーによるエクソソームの分離のために、ターゲットマーカーに特異な抗体を用いた免疫分離方法を適用することができる。この方法によれば、エクソソームサンプルを磁性ビーズやゲルビーズのような固体表面に固定された抗体と反応させた後、解離させてターゲットエクソソームを分離することができる。抗原－抗体反応は選択性が非常に高いため、現存する他の分離方法（例えば、超遠心分離、加速沈降、サイズによる分離など）に比べて、表面タンパク質に関連するエクソソームを分離するにはさらに適している。しかし、抗原－抗体反応により結合されたエクソソームを固体表面から回収するためには、酸性ｐＨのような苛酷な条件を用いなければならないが、この場合、エクソソームに損傷を与えることがあり、また、高収率の回収が難しいという問題がある。しかし、本発明によれば、新たな可逆性の抗原－抗体反応のような付着反応を用いて、ターゲットマーカーを含むエクソソーム亜集団を、苛酷でない条件で高効率で分離及び濃縮することができる。

本発明に係る一実施例によって、エクソソームを分離するためには、可逆的認識素材を固体表面（Ｂｅａｄ ｓｕｒｆａｃｅ）に固定させ（図５のＩ）、カルシウム結合タンパク質（ＣＢＰ）は、エクソソーム表面タンパク質（例：ＣＤ６３）に対する特異抗体とビオチン―ストレプトアビジンリンケージ（ｂｉｏｔｉｎ－ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｌｉｎｋａｇｅ）を介して重合する（ＣＢＰ－捕捉抗体重合体）。固定された可逆的認識素材にカルシウムイオン（例＞１０ｍＭ Ｃａ^２＋）が含まれた溶液に溶解されたＣＢＰ－捕捉抗体重合体を添加すると、‘スイッチオン’認識反応によって、重合体は固体表面に固定される（図５のＩＩ）。同じ溶液に、準備されたバルクエクソソーム試料を順次添加すると、ＣＤ６３マーカーを含むエクソソームが固体表面の捕捉抗体と反応して捕捉される（図５のＩＩＩ）。同じ溶液で洗浄した後、カルシウムが除去されたエクソソーム回収溶液を添加すると、ＣＢＰと結合されていたカルシウムイオンが脱着されて‘スイッチオフ’の状態になるので、捕捉されていたエクソソームを捕捉抗体と結合された状態で溶液内に回収することができる（図５のＩＶ）。その結果、ＣＤ６３マーカーを含むエクソソーム亜集団が分離回収され、使用された試料溶液と回収溶液の体積の比率に応じてエクソソームの濃縮も可能である。追加的に、固体表面は再生されて他の試料の分離に再利用できる。

以下では、具体的な実施例及び評価例を通じて、本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものではない。

＜材料＞
カルシウムイオンがカルシウム付着タンパク質（ＣＢＰ）に付着反応時に変化したＣＢＰの独特の構造を特異に認識する単一クローン抗体は、本発明者らによって生産された（Ｐａｅｋ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌｙｓｔ １３９，３７８１－３７８９，２０１４））。また、ＣＢＰとして、突然変異されたグルコース／ガラクトース結合タンパク質（ｇｌｕｃｏｓｅ－ｇａｌａｃｔｏｓｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＧＧＢＰ）を選択し、このタンパク質を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；Ｅ．ｃｏｌｉ）から産生した後、精製した。塩化ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、Ｔｒｉｚｍａ、カゼイン（ｃａｓｅｉｎ）（ｓｏｄｉｕｍ ｓａｌｔ ｆｏｒｍ、ｅｘｔｒａｃｔ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ｍｉｌｋ）、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（３，３’，５，５’－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ＴＭＢ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ；ＳＤＳ）、ウシ血清アルブミン（ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ；ＢＳＡ）、及びＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂゲル（ＣＮＢｒ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ ｇｅｌ）（４％アガロース）は、Ｓｉｇｍａ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）から購入した。塩化カルシウム二水和物（Ｃａｌｃｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｄｉｈｙｄｒａｔｅ）及び塩化カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ）は、Ｄａｅｊｕｎｇ（始興、韓国）で供給した。スルホスクシンイミジル－６－［ビオチンアミド］－６－ヘキサンアミドヘキサノエート（Ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－６－［ｂｉｏｔｉｎａｍｉｄｏ］－６－ｈｅｘａｎａｍｉｄｏ ｈｅｘａｎｏａｔｅ）（ＮＨＳ－ＬＣ－ＬＣ－ｂｉｏｔｉｎ）、スクシンイミジル ４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ４－（Ｎ－ｍａｌｅｉｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ）ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅ－１－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ；ＳＭＣＣ）、Ｎ－スクシンイミジル ３－（２－ピリジルジチオ）－プロピオナート（Ｎ－ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ３－（２－ｐｙｒｉｄｙｌｄｉｔｈｉｏ）－ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ；ＳＰＤＰ）、ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ；ＤＴＴ）、マレイミド（ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ；ＳＡ）、及びホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）は、サーモフィッシャーサイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，米国）から購入した。抗ＣＤ６３抗体（Ｃａｔ．Ｎｏ．３５３０１４）は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，米国）で供給し、ＣＤ９（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＡＢ１８８０）、ＣＤ８１（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＡＢ４６１５）、あるいはＣａｖｅｏｌｉｎ－１（Ｃａｖ１；Ｃａｔ．Ｎｏ．ＭＡＢ５７３６）に特異な単一クローン抗体は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，米国）で供給した。冷凍乾燥された健常者のエクソソーム標準試薬（ヒト血漿由来）及び黒色腫癌細胞培養液はＨａｎｓａＢｉｏＭｅｄ（Ｔａｌｌｉｎｎ、エストニア）から購入した。磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ－２８０ Ｔｏｓｙｌａｃｔｉｖａｔｅｄ、直径２．８ｍｍ）及びｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－ｐｏｌｙ－ＨＲＰ２０は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，米国）及びＦｉｔｚｇｅｒａｌｄ（Ａｃｔｏｎ，ＭＡ，米国）でそれぞれ供給した。種々の他のエクソソーム分離キット、すなわち、ＥｘｏＱｕｉｃｋ^ＴＭ ｋｉｔ（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，米国）、ＭａｇＣａｐｔｕｒｅ^ＴＭ ｋｉｔ（Ｗａｋｏ；Ｏｓａｋａ、日本）、及びｅｘｏＥａｓｙ Ｍａｘｉ^ＴＭ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ；Ｈｉｌｄｅｎ、ドイツ）は、それぞれ異なる供給源から購入した。それ以外の他の試薬も分析用製品を使用した。

＜実施例１：エクソソームの分離及び特性化用構成成分の製造＞
〔ＳＡとＣＢＰとの重合。〕１０ｍＭのリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４；ＰＢ）に溶解されたＣＢＰ（４００μｇ）を、２０モル倍のＳＭＣＣと混合した後、室温で１時間反応させて活性化した。ＰＢに溶解されたＳＡ（２ｍｇ）を、５モル倍のＳＰＤＰと１時間反応させた後、５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＥＤＴＡ）を含む１０ｍＭのＤＴＴ溶液で３７℃で１時間、化学的に還元させて、スルフヒドリル基（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ ｇｒｏｕｐｓ）を表出させた。各活性化された成分は、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１５ゲル濾過カラム（１０ｍｌの体積）を介して過剰に使用された試薬を除去することによって分離した。２つの活性化されたタンパク質、すなわち、ｍａｌｅｉｍｉｄｅ－ＣＢＰ及びｔｈｉｏｌａｔｅｄ－ＳＡを１：５のモル比で混合し、室温で４時間反応させた。その後、ＳＡとＣＢＰとの重合体（ＣＢＰ－ＳＡ）が含まれた最終溶液を、使用時まで、よくシールされた容器内で４℃で保管した。

〔抗ＣＤ６３抗体のビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ）。〕ＮＨＳ－ＬＣ－ＬＣ－ビオチンのスクシンイミジル－エステル（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ－ｅｓｔｅｒ）部分を抗体分子上のアミン基と反応させて、ビオチン化された抗体を製造した。簡略に過程を記述すると、１４０ｍＭのＮａＣｌを含むＰＢ溶液（ＰＢＳ）に溶解された抗ＣＤ６３抗体を、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；ＤＭＳＯ）に溶解された２０モル倍のＮＨＳ－ＬＣ－ＬＣ－ビオチンと混合し、室温で２時間反応させた。混合物内の未反応試薬は、ＰＢＳで平衡状態にあるＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１５カラムを用いたサイズ排除クロマトグラフィ（ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を介して除去した。精製された重合体は、ＰＢＳで２回透析し、Ｖｉｖａｓｐｉｎ５００を用いて１ｍｇ／ｍｌの濃度に濃縮した後、使用時まで４℃で保管した。

〔ＨＲＰを用いた抗ＣＤ６３抗体の標識。〕抗ＣＤ６３抗体を一般的な過程を用いてＨＲＰで標識した。簡略に説明すると、抗体を、まず、１０ｍＭのＤＴＴで３７℃で１時間還元させ、過量の試薬はゲル濾過カラムを用いて除去した。ＨＲＰも３０モル倍のＳＭＣＣで活性化させ、未反応試薬は、先と同様にサイズ排除クロマトグラフィを介して除去した。還元された抗体を、１０モル倍の活性化されたＨＲＰと混合した後、重合反応を４℃で２４時間以上行った。生成された重合体は、同じ体積のグリセロール（ｇｌｙｃｅｒｏｌ）と混合した後、－２０℃で保管した。

＜実施例２：免疫親和クロマトグラフィー＞
〔免疫親和ゲルの製造。〕免疫親和クロマトグラフィーを行うために、ＣＢＰに特異な単一クローン抗体をＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂゲルの表面に固定させた。製造社で提供した説明書に従って、抗体（水和されたゲルの体積ｍｌ当たり２ｍｇ）をアガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ）上に化学的に結合させるために、抗体分子上のリジン（ｌｙｓｉｎｅ）残基をゲル上の機能性基とアルカリ条件で反応させた。抗体を結合させた後、ゲル上の残りの反応基は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝溶液を用いて加水分解させた。

製造された免疫親和ゲルをプラスチックカラムに充填させて免疫親和クロマトグラフィーカラムを製造し、酸性条件とアルカリ性条件を交互に用いて洗浄することによって、固体（ゲル）表面に非特異的に吸着された抗体を除去した。

〔前処理された免疫親和クロマトグラフィーカラムの製造、及びこれを介したＣＤ６３陽性（ＣＤ６３＋）エクソソームの分離。〕前記で製造された免疫親和ゲルを活用して前処理された免疫親和クロマトグラフィーカラムを製造した。エクソソームマーカーの一種であるＣＤ６３陽性（ＣＤ６３＋）エクソソームに特異な免疫親和クロマトグラフィーカラムを作製するために、プラスチックカラムに免疫親和ゲルを充填し、Ｃａ^２＋（１０ｍＭ）が含まれた運搬溶液（‘Ｃａ^２＋スイッチオン’の条件）を用いて、ＣＢＰ－ＳＡ重合体（５μｇ／ｍｌ）を単一クローン抗体と反応させて免疫親和ゲルに固定させた後、ビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）抗ＣＤ６３抗体（３μｇ／ｍｌ）を、ｂｉｏｔｉｎ－ＳＡ結合を介してＣＢＰ－ＳＡ重合体に順次固定させた。

このように作製された免疫親和カラム（９ｍｍ×３．２ｍｍ；１．５ｍｌ ｂｅｄ ｖｏｌｕｍｅ）を用いてエクソソームを分離した。準備されたＣＤ６３免疫親和カラムにエクソソーム試料（健常者のエクソソーム標準サンプル（２５μｇ／ｍｌ；１ｍｌ））を添加し、Ｃａ^２＋を含む運搬溶液を注入して、結合されなかった成分を洗浄した。その後、Ｃａ^２＋が除去された運搬溶液（‘Ｃａ^２＋スイッチオフ’の条件）を注入して、免疫親和ゲルに付着していたＣＢＰ－抗体－エクソソーム結合体（ＣＤ６３＋エクソソームを含む）を分画別に回収した。ここで、前処理カラムは、再生した後、他のサンプルの分析に再利用した。

前記過程をより詳細に説明すると、エクソソームサンプルを免疫親和カラムに添加する前に、ゲルを、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａ^２＋及び２％ＢＳＡを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４；付着溶液）と平衡状態を維持させた。実施例１で製造したＣＢＰ－ＳＡ（５μｇ／ｍｌ、１ｍｌ）及びビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）抗ＣＤ６３抗体（３μｇ／ｍｌ、１ｍｌ）、そして、エクソソーム標準サンプル（１ｍｌ；健常者のエクソソーム標準試薬あるいは黒色腫癌細胞培養液）をそれぞれ付着溶液で希釈させた。また、各試薬の添加位置を確認できるように、マーキングのために、ＨＲＰ酵素（０．１μｇ／ｍｌ）を各希釈溶液に添加した。製造した各溶液を、予め指定された流出体積で流出されるように、ゲルカラムに順に添加した。カラムからの流出液は、連動ポンプを用いて１２０μl／ｍｉｎの流出速度で分画収集器（分画体積：１ｍｌ）に移送された。未反応のタンパク質をカラムから除去するために、ゲルカラムを、ＢＳＡが排除された付着溶液で洗浄した。最終的に、カラムに、５００ｍＭのＮａＣｌが含まれた２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝溶液を供給して、カラムに付着されていたエクソソームを流出させて回収した。その後、ゲルカラムに、５００ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０、及び０．０２％（ｗ／ｖ）チメロサールが含まれた１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）緩衝溶液（ｐＨ４．５）を供給し、カラムからタンパク質の流出がなくなるまで完全に洗浄してカラムを再生した。

＜実施例３．免疫磁性分離＞
〔ＣＤ６３＋エクソソームの免疫磁性濃縮。〕一般に、磁性濃縮技術は、抗体が結合された免疫磁性ビーズを用いて、抗原－抗体反応を介して磁場下で目標物質を分離し、濃縮を同時に行う方法である。この方法を用いたＣＤ６３＋エクソソームの分離過程は、基本的に実施例２の免疫親和クロマトグラフィーを行う工程と同一である。Ｃａ^２＋結合によるＣＢＰの構造変化を認知する単一クローン抗体を磁性ビーズに結合させた後、‘Ｃａ^２＋スイッチオン’の条件下で、ＣＢＰ－ＳＡ重合体、そして、ビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）抗ＣＤ６３抗体を順次反応させた。このように製造した免疫磁性ビーズをエクソソームサンプル（健常者のエクソソーム標準サンプル１ｍｌ）と反応させた後、磁石を用いて磁性ビーズを捕捉した状態で上層液を除去し、ビーズを洗浄した。その後、‘Ｃａ^２＋スイッチオフ’の条件下で、初期に比べて１／１０体積の緩衝溶液を添加して、ＣＤ６３＋エクソソームを回収及び濃縮した。

前記過程をより詳細に説明すると、磁性濃縮のために、ＣＤ６３に特異な抗体を、磁性ビーズの固体表面上に活性化されたトシル（ｔｏｓｙｌ）部分に抗体上のアミン基と化学的に結合させて固定した。Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝溶液で３回洗浄した後、残りの表面をＣａｓｅｉｎ－ＰＢＳでブロッキングした。ビーズ（総１ｍｇ）を溶液から磁性分離した後、付着溶液で希釈したＣＢＰ－ＳＡ重合体（５μｇ／ｍｌ；１ｍｌ）を添加し、振盪器上で１時間反応させた。ビーズをＢＳＡが除去された付着溶液で洗浄した後、ビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）抗ＣＤ６３抗体（３μｇ／ｍｌ；１ｍｌ）を同じ条件で順次反応させた。再び洗浄した後、付着溶液で希釈したエクソソームサンプル（２５μｇ／ｍｌ；１ｍｌ）を添加し、３時間反応させた。最後に、免疫親和クロマトグラフィーでのようなプロトコルに従ってＣＤ６３＋エクソソームの回収及びビーズの再生を行った。

＜評価例１：実施例１で回収された流出分画の分析＞
図６は、本発明に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離システム及び方法を用いてサンプル内のＣＤ６３＋エクソソームを免疫親和クロマトグラフィー工程により分離した結果である。

実施例２において、各添加試料のクロマトグラム上の流出位置を確認するために、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ；ＨＲＰ）に対する発色式酵素分析を先に行った。実施例２による分離過程を介してカラムから収集した溶出分画を分析してみると、各成分の添加位置、及び各分画別のＣＤ６３＋エクソソームに対する分布を確認することができる。前処理されたゲルカラムに各成分（即ち、ＣＢＰ－ＳＡ重合体、ビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）抗ＣＤ６３抗体及びエクソソームサンプル）を注入する際に、各溶液に総０．１μｇのＨＲＰを含ませることで、溶出後、添加された位置を確認できるようにした。したがって、各分画から一部をサンプリングしてマイクロウェルに分注し、ＨＲＰ基質溶液を添加して得た反応結果から、各成分の注入位置情報に対するクロマトグラムを得、図６に点線で（ａ）、（ｂ）、（ｃ）ピークを表示した。前記酵素分析過程についてより詳細に説明すると、各分画の一定量（５μｌ）をマイクロタイタープレート（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ）に分注した後、酵素基質溶液（２００μｌ）を添加して酵素から信号を発生させた。酵素基質溶液は、３％（ｖ／ｖ）過酸化水素水溶液（１０μｌ）、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；ＤＭＳＯ）に溶解された１０ｍｇ／ｍｌのＴＭＢ（１００μｌ）、そして、０．０５Ｍのアセテート（ａｃｅｔａｔｅ）緩衝溶液（ｐＨ５．１；１０ｍｌ）を混合して製造した。酵素の信号が飽和する前に２Ｍ硫酸溶液（５０μｌ）を添加して反応を終結させ、光学密度を最大吸光度４５０ｎｍでマイクロプレートリーダ（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ）（Ｓｙｎｅｒｇｙ Ｈ４，ＢｉｏＴｅｋ Ｉｎｃ．；Ｗｉｎｏｏｓｋｉ，ＶＴ，ＵＳＡ）で測定した。

さらに、免疫親和力によって分離されて回収されたエクソソームの流出位置を確認するために、各分画内のエクソソームに対する酵素免疫分析（ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）を行った。このために、抗ＣＤ６３抗体が固定されたマイクロウェルに、各分画から一部をサンプリングして添加して反応させ、カラム内でエクソソームと反応したと予測されるビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）抗体分子上の残りのビオチンにＳＡ－ｐｏｌｙ ＨＲＰ２０重合体を順次反応させた。より具体的には、抗体の固定化は、５μｇ／ｍｌの抗体（１００μｌ）を各ウェルに添加した後、３７℃で１時間反応させて行った。洗浄後、残りの表面を、０．５％カゼインが含まれたＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝溶液（Ｃａｓｅｉｎ－Ｔｒｉｓ）でブロッキングした。その後、各分画の一定部分（１００μl）を各ウェルに添加し、３７℃及び１００％湿度が維持される箱内で１２時間反応させた。ウェルを洗浄し、実施例１で製造したビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｅｄ）抗ＣＤ６３抗体（１μｇ／ｍｌ；１００μl）を添加した後、３７℃で１時間反応させた。再び洗浄した後、Ｃａｓｅｉｎ－Ｔｒｉｓで希釈したＳＡ－ｐｏｌｙ ＨＲＰ２０（６６ｎｇ／ｍｌ；ウェル当たり１００μl）を添加し、３７℃で１時間反応させた。最後に、ＨＲＰに対する基質溶液（２００μl）を添加し、発色が飽和する前に２Ｍ硫酸溶液（５０μl）を添加して反応を停止させ、光学密度を前記のように測定した。ＨＲＰ基質溶液を添加してエクソソーム特異クロマトグラムを得た結果は図６の実線で表示し、‘Ｃａ^２＋スイッチオフ’の条件下で意味のある信号は図６に（ｄ）ピークとして表示した。使用された免疫分析では、ＣＤ６３＋エクソソームを中心に形成された抗ＣＤ６３抗体サンドイッチ結合体のみが探知されるので（図６の挿入図参照）、カラムから流出された（ｄ）ピークには、免疫分離されて回収されたＣＤ６３＋エクソソームが含まれたと判断される。それに加えて、エクソソームサンプルの注入位置（図６の（ｃ）ピーク）でも信号が弱く発生したことからみて、一部のエクソソーム結合体が流出されるか、あるいは親和力がない過量のエクソソームが非特異反応した結果であると予測される。しかし、このピークの大きさが、（ｄ）ピークの大きさに比べて１０％以下であるので、これ以上分析対象としなかった。

＜評価例２：実施例２による免疫親和クロマトグラフィーの再現性の評価＞
図７は、図６の免疫親和クロマトグラフィー工程を繰り返して用いて、エクソソームの分離時の再現性を示した結果である。

実施例２による免疫親和カラムを用いたエクソソームの分離再現性を確認するために、同じ免疫分離過程を繰り返し、各実験結果から得た流出分画を、既に言及したＣＤ６３＋エクソソームに対する免疫分析を行って各クロマトグラムを取得した（図７のＡ参照）。Ｃａ^２＋が除去された流出用運搬溶液に転換した後（３５番目の分画後）、繰り返し実験時にも、ＣＤ６３＋エクソソームが分離されて単一の独立したピークの形態で形成されることが確認できた。さらに、ＣＤ６３＋エクソソームピークを形成する分画番号、及びエクソソームに対する特異信号の強度も非常に類似していることを確認した。特に、クロマトグラム上の回収エクソソームピーク内の３７、３８及び３９番目の分画に含まれたＣＤ６３＋エクソソームに対する免疫分析信号は、平均変異係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ；ＣＶ）が９．４％以下程度であって、高い再現性を示した（図７のＢ参照）。

本評価例２の試験過程をより詳細に説明すると、前記のように免疫親和クロマトグラムを最初に得た後、同じ分離プロトコルに従って各流出分画に含まれたエクソソームを回収し、分析する過程を３回繰り返した。本評価実験では、各分離されたエクソソームピークを構成する主要分画内に含まれたＣＤ６３＋エクソソームに対する免疫分析結果を得、その測定された信号間の変異係数（ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ；ＣＶ）を、各分離試験に対する再現性の評価指標として使用した。分離用ゲルカラムを使用しない時には、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝溶液を充填して４℃で保管した。

＜評価例３：実施例３の濃縮性能の評価＞
図８は、本発明に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離システム及び方法を用いてサンプル内のＣＤ６３＋エクソソームを免疫磁性分離工程により分離及び濃縮した結果である。

実施例３の濃縮性能を試験するために、磁性分離工程を他のエクソソーム標準サンプル（１、３、あるいは５μｇ／ｍｌ）に対して繰り返して適用した後、前述したＣＤ６３＋エクソソームに対するサンドイッチ免疫分析を行い、その結果を、図８のＡに黒色の棒グラフで表示した。磁性濃縮前の元の標準サンプル内のＣＤ６３＋エクソソームに対する免疫分析の結果は、図８のＡに白色の棒で表示したが、両者を比較すると、磁性濃縮により、信号が平均的に約３．７倍程度増加したことが分かった。分離されたエクソソームの濃縮比率を決定するために、元の標準サンプルに対する免疫分析の濃度応答をｌｏｇ－ｌｏｇｉｔ変換を通じて線形化し、これから、濃縮されたＣＤ６３＋エクソソームの濃度を決定して、図８のＢに示した。その中で、ＣＤ６３＋エクソソームを基準として３μｇ／ｍｌのエクソソームサンプルに対して濃縮した結果、約２２μｇ／ｍｌを得ることができ、このことから、約７．９倍の濃縮効率が確認できた。

ここで、分離前後のエクソソームサンプルの濃度を、免疫分析において標準試薬で得た結果との比較を通じて決定したが、まず、健常者のエクソソーム標準試薬をＣａｓｅｉｎ－Ｔｒｉｓで希釈してエクソソーム標準サンプル（１～１００μｇ／ｍｌ）を準備し、免疫分析のために、抗ＣＤ６３抗体（５μｇ／ｍｌ；１００μl）をマイクロウェル内に添加し、３７℃で１時間反応させて、ウェル内部の表面に捕捉バインダーで固定した。洗浄後、Ｃａｓｅｉｎ－Ｔｒｉｓを添加して、残りの表面を前記と同じ条件下でブロッキングした。各エクソソームサンプル（１００μl）をそれぞれ異なるウェルに添加し、３７℃で１２時間反応させた。残りの分析過程は、前述したＥＬＩＳＡプロトコルに従って行われた。

＜評価例４：実施例３による免疫磁性分離の再現性の評価＞
図９は、図８の免疫磁性分離工程を繰り返して行う場合のＣＤ６３＋エクソソームの分離時の再現性を示した結果である。

実施例３によるスイッチ認識素材ベースの磁性濃縮技術は、‘Ｃａ^２＋スイッチオン’の条件下でターゲットエクソソームを捕捉し、順次に‘Ｃａ^２＋スイッチオフ’の条件下でエクソソームを回収した後、前処理された磁性ビーズは再生されて新しい試料の分離及び濃縮に再利用できる特性を提供する。実際に、前処理されたビーズの再利用時に、その濃縮性能の再現性を確認するために、異なる濃度のエクソソーム標準サンプル（１、３、５μｇ／ｍｌ；健常者の血漿から採取）に対して磁性分離及び濃縮した後、再利用された前処理されたビーズを用いて同じ過程を２回さらに繰り返した。分離されたエクソソームサンプルの濃度は、ＣＤ６３＋エクソソームに対するサンドイッチ免疫分析を用いて分析した。その結果を示す図９のＡを参照すると、サンプルの分離及び濃縮を、前処理されたビーズを再利用して行う際に、ＣＤ６３＋エクソソームに対する濃度応答パターンは非常に類似していた。実際に、エクソソームの濃度による分離サンプル内のＣＤ６３＋エクソソームの濃縮は、免疫分析からの信号値を基準として平均ＣＶ８．３％であって、再現性が非常に高いことが分かった（図９のＢ参照）。

ここで、標準サンプル（１、３及び５μｇ／ｍｌ）は、健常者のエクソソーム標準試薬を付着溶液で希釈して製造され、磁性ビーズを使用しない時には、Ｃａｓｅｉｎ－Ｔｒｉｓに浸して４℃で保管した。

＜評価例５：実施例２及び３によって分離されたＣＤ６３＋エクソソームに対する特性化＞
図１０は、本発明に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離システム及び方法を用いて分離されたＣＤ６３＋エクソソームに対する物理的特性化の結果であり、図１１は、本発明に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離システム及び方法を用いて分離されたＣＤ６３＋エクソソームサンプルのエクソソーム表面マーカーに対する特性化の結果である。

実施例２及び３で分離したＣＤ６３＋エクソソーム亜集団に対する形態学的な特性化、及び表面タンパク質に対する分析を介して、実際にエクソソームの２つの特徴、すなわち、微小小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）の形態及び異種の表面タンパク質の分布を確認した。形態学的な特性化のために、本発明で開発した方法で分離されたエクソソームの形態を測定するために、走査電子顕微鏡（ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＳＥＭ）を用いてイメージを観察し、また、動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ；ＤＬＳ）技術を用いて大きさの分布を測定した。

〔走査電子顕微鏡（Ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ；ＳＥＭ）イメージング。〕実施例２及び３で分離されたＣＤ６３＋エクソソームサンプルに対して、ＳＥＭイメージングを介して形態学的に観察した。高倍率イメージを得るために、前記の免疫親和クロマトグラフィーあるいは免疫磁性分離過程を通じてそれぞれ分離されたエクソソームサンプルを、標準プロトコルに従って試片を作製した。固体状態で微細構造及び形態を測定するために、各元のサンプルを顕微鏡ガラススライドに移した後、カバーガラスで覆い、対象物を液体窒素中に浸して急速冷凍させて冷却固定させた。カバーガラスを除去した後、冷凍標本を２．５％グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）溶液を添加して固定させ、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝溶液及び脱イオン水でそれぞれ１回洗浄し、アセトンを添加して脱水させた。次に、液体二酸化炭素を使用する臨界点乾燥法（ｃｒｉｔｉｃａｌ ｐｏｉｎｔ ｄｒｙｉｎｇ）によりアセトンを除去した。サンプルをｔｅｍｐｆｉｘ ｍｏｕｎｔｉｎｇ ａｄｈｅｓｉｖｅを用いてアルミニウムスタブ（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｓｔｕｂｓ）上に載せ、コロイド銀（ｃｏｌｌｏｉｄａｌ ｓｉｌｖｅｒ）を添加して表面と接触させた。白金を３～５ｎｍの厚さにスパッタコーティング（ｓｐｕｔｔｅｒ－ｃｏａｔｉｎｇ）した後、サンプルをＨｉｔａｃｈｉ Ｓ－４７００ ＳＥＭ（Ｈｉｔａｃｈｉ；東京、日本）で観察した。ＳＥＭ観察の結果、各サンプル試片から、同一に直径が約１００ｎｍである球状の粒子のイメージを得ることができた（図１０のＡ参照）。実際に、エクソソームは、様々な種類の細胞から分泌される膜構造の微小小胞（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）であって、直径がおよそ３０～２００ｎｍであるものと知られている。

〔動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ；ＤＬＳ）分析。〕分離されたＣＤ６３＋サンプルの大きさの分布をさらに正確に測定するために、エクソソームのＤＬＳ分析を、室温で粒度分析器（ＥＬＳＺ－１０００，Ｏｔｓｕｋａ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ；大阪、日本）を用いて行った。エクソソームサンプル（０．５ｍｌ）を使い捨てキュベット（ｃｕｖｅｔｔｅ）（ＢＩ－ＳＣＰ，Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ＮＹ，米国）に移した後、分析器製造者の実行案内に従って分析した。エクソソームの大きさをストークス－アインシュタイン（Ｓｔｏｋｅｓ－Ｅｉｎｓｔｅｉｎ）方程式によって決定した後、細胞外小胞（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ）の大きさの分布を特性化した。その結果、各サンプルでの粒子の直径は、平均約１８６．２ｎｍあるいは１９３．８ｎｍレベルであることが分かった（図１０のＢ参照）。このように測定された粒子の大きさ及びその分布から、免疫親和クロマトグラフィー及び免疫磁性分離過程を通じて分離されたサンプルに含まれた粒子はエクソソームであると判断される。

〔ウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）。〕エクソソームの一般的な特徴の一つである異種の表面タンパク質の分布を確認するために、実施例２及び３で分離したＣＤ６３＋エクソソームサンプル内のテトラスパニン（ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ）系列のタンパク質マーカーに対してウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）分析をそれぞれ行った。エクソソームサンプルを最適化された条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行った後、分離されたタンパク質をニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）に移送させ、エクソソームの表面に一般に多く分布するＣＤ９、ＣＤ６３、及びＣＤ８１に対してそれぞれ特異な抗体－ＨＲＰ重合体を反応させた。より詳細に説明すると、各エクソソームサンプルを、まず、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％トリトンＸ－１００、０．５％デオキシコール酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）、及び０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ；ＳＤＳ）を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝溶液（ｐＨ８．０）で処理した。このように変性されたタンパク質を８％ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を用いて分離した後、ニトロセルロース膜（ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ）上に電気泳動的方法を通じて移送した。Ｃａｓｅｉｎ－ＰＢＳで残りの表面をブロッキングした後、メンブレンを予めＨＲＰと化学重合させた抗ＣＤ６３、ＣＤ９、及びＣＤ８１抗体を用いてブロッティング分析を行った。最後に、発色試薬として３，３’－ジアミノベンジジン（３，３’－ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；ＤＡＢ）を含むＨＲＰ基質溶液を添加して、メンブレン上に発色信号を発生させた。基質溶液は、５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）緩衝溶液（ｐＨ５．０；１ｍｌ）に０．０５％ＤＡＢ（１０μl）及び３％Ｈ２Ｏ２（１μl）を添加して製造した。

染色された発色信号から、エクソソームのテトラスパニン（ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ）タンパク質マーカーが、いずれも、実施例２及び３の方法で分離したＣＤ６３＋エクソソームサンプル内に発現されていることが確認できた（図１１のＡ参照）。参考に、ＣＤ９とＣＤ８１に対するバンドの発色信号の鮮明度と比較して、ＣＤ６３に対するバンド信号が鮮明でないが、これは、ＣＤ６３マーカーが糖化タンパク質であるため、バンドが３０～６０ｋＤａと比較的広く存在するということも影響があるが、より根本的に、本評価実験で使用したエクソソーム標準試料（図１１のＡ、ｃｏｎｔｒｏｌ）自体において、ＣＤ６３マーカーの発現に対するバンド信号が低いためである（図１１のＡ参照）。前記で得た結果を総合すると、免疫親和クロマトグラフィー及び免疫磁性分離過程を通じて分離されたサンプルが、エクソソームの一般的な特徴をすべて示している点からみて、本発明によってＣＤ６３＋エクソソーム亜集団の分離が達成されたと判断される。

〔分離後のＣＤ６３＋エクソソームの回収率。〕エクソソーム分離システムの回収率を決定するために、分離前後のサンプル内のＣＤ６３＋エクソソームに対する定量分析を行ったが、エクソソーム標準試料に対するＣＤ６３マーカーの免疫分析を介して求めた標準曲線を用いて、ＣＤ６３＋エクソソーム亜集団の濃度を迂回的に測定した。免疫分析時にエクソソーム表面マーカーであるＣＤ６３特異抗体を捕捉及び探知バインダーとして使用した酵素免疫分析（ＥＬＩＳＡ）を介して標準曲線を求めた（図１１のＢ；左側）。同じ条件下で、分離前及び分離後のサンプルに対して免疫分析を行い、これから発生した信号を標準曲線に代入して各エクソソームの濃度に換算した。体積希釈比率を補正した後、免疫親和クロマトグラフィー及び免疫磁性分離前後のエクソソームサンプル内のエクソソームの総量を計算して、各分離工程の回収収率を決定した（図１１のＢ；右側）。これから、２つの工程の収率は、それぞれ７８．３％及び６８．５％程度であったが、このような結果は、既存の酸性ｐＨなどの苛酷条件を用いて分離産物を回収する分離工程（例：収率＜５０％）に比べて非常に高かった。これは、本発明によってスイッチ認識素材を使用する分離工程では、溶液内のカルシウムイオンの除去時に、ＣＢＰに対する認識素材の親和力が背景レベルに低くなることで、分離されたエクソソームの回収収率が相対的に非常に高く、また、構造的変形が最小化されたためである。

＜評価例６：ＣＤ６３＋エクソソーム亜集団を診断サンプルとして利用時の分析性能の評価＞
図１２は、エクソソーム標準サンプル間の濃度の変移を補償するために、ＣＤ９の濃度を基準としてＣａｖ１マーカーの濃度を補正した結果であり、図１３は、本発明に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離システム及び方法を用いて分離したＣＤ６３＋エクソソームを分析サンプルとして用いる際に、黒色腫癌の診断に対する潜在的な効果を示した結果である。

〔ターゲットマーカーの濃度の標準化。〕本発明によってＣＤ６３＋エクソソーム亜集団を分離して診断サンプルとして用いる際に、黒色腫癌関連マーカーであるＣａｖ１＋エクソソームの濃縮効果により、高感度診断が可能になると予測される。しかし、単純にＣａｖ１タンパク質の発現レベルを測定する場合、エクソソームの濃度がサンプルに応じて変化するため、分離効果を正確に判断するには制限的である。したがって、性能の比較時の不確実性を最小化するために、一般にエクソソームの表面に存在する正常マーカーであるＣＤ９タンパク質を測定し、補正を通じて標準化させる方法を導入した。このために、黒色腫癌関連マーカーであるＣａｖ１タンパク質特異抗体とＣＤ９タンパク質特異抗体をそれぞれ異なるマイクロタイタープレートウェル（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ ｗｅｌｌ）に固定させ、同じサンプルを添加して反応させた後、ＣＤ６３抗体を探知抗体として用いてＥＬＩＳＡを行った。これから、癌マーカー及び正常マーカーに比例した信号を得（図１２；棒グラフ）、その２つの信号の比率、すなわち、Ｃａｖ１／ＣＤ９の信号比率を計算した（図１２；線グラフ）。このとき、健常者供与の血漿サンプルを希釈して分析した場合（図１２のＡ）、そのＣａｖ１／ＣＤ９の信号比率が平均０．１４７であって、希釈比率に応じて概ね一定に維持された。また、黒色腫癌細胞サンプルの場合（図１２のＢ）は、各マーカーに対する信号は相対的に高く測定され、そのＣａｖ１／ＣＤ９の比率が平均０．２０６であって、Ｃａｖ１の発現レベルが、健常者の標準サンプルよりも平均４０％程度高いことが分かった。このように、総エクソソームの濃度の変化に対して、ＣＤ６３＋エクソソーム亜集団内のＣａｖ１＋エクソソームを、正常マーカーであるＣＤ９＋エクソソームで補正して標準化させることができた。

前記評価実験過程について敷衍すると、エクソソーム標準サンプル（５～１００μｇ／ｍｌ）を、健常者の血漿あるいは黒色腫癌細胞株から得たエクソソームをＣａｓｅｉｎ－Ｔｒｉｓで希釈して準備した。サンプル内の各マーカーの濃度を測定するために、各マーカーに対して特異な捕捉抗体（５μｇ／ｍl；１００μl）を各マイクロウェル内に添加した後、３７℃で１時間反応させて固定させた。残りの実験過程は、前記で既に紹介したＣＤ６３に対するＥＬＩＳＡ過程と同一に行われた。ＣＤ９とＣａｖ１に対して分析した後、発生した信号を測定し、Ｃａｖ１／ＣＤ９の信号比率を各サンプルに対して計算した。

〔診断サンプルとして分離されたエクソソームの潜在性。〕このような免疫分析を介したＣａｖ１／ＣＤ９の信号比率の測定方法を用いて、スイッチ認識素材をベースとして分離したＣＤ６３＋エクソソーム亜集団を診断サンプルとして用いる際に、黒色腫癌の診断に対する潜在的な効果を試験した。健常者のエクソソームと黒色腫癌エクソソームの各標準物質２５μｇ／ｍｌを分離してＣＤ６３＋エクソソーム亜集団を得、そのＣａｖ１タンパク質の発現レベルに対する分析結果を、分離前の結果と比較した。分離前のバルクエクソソームサンプルの利用時には、Ｃａｖ１／ＣＤ９の信号比率が、健常者サンプルの場合と比較して、癌サンプルで４０％程度増加した（図１３のＡ；左側）。免疫クロマトグラフィー方法で分離したＣＤ６３＋エクソソーム亜集団サンプルの利用時には、その信号が、健常者の場合と比較して、癌サンプルで約４倍（即ち、４００％）増加した（図１３のＡ；右側）。すなわち、分離されたＣＤ６３＋エクソソーム亜集団サンプルの利用時に、黒色腫癌細胞のスクリーニングに対する潜在的敏感度が約１０倍増加することが分かった。このような癌細胞のスクリーニングに対する効果は、免疫磁性分離方法で分離した亜集団サンプルの利用時にもほぼ同一に約７．７倍増加した（図１３のＡ参照）。このような効果は、ＣＤ６３＋エクソソーム亜集団をスクリーニングサンプルとして用いる際に、Ｃａｖ１＋エクソソームの増加だけでなく、ＣＤ９＋エクソソームの減少を招いたことに起因すると予測される。実際に、ＣＤ９＋エクソソームの濃度が癌サンプルにおいて減少するという報告がある。

＜評価例７：既存のエクソソーム分離システムとの性能の比較＞
図１４は、本発明に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離システムと、現在商業的に販売されている様々なエクソソーム分離システムとの間に、分離されたサンプルの免疫分析によって決定されたＣａｖ１／ＣＤ９の濃度比率を基準として、黒色腫癌サンプルを正常サンプルから区分する性能に対する比較結果である。

本発明の実施例２及び３によるスイッチ認識素材ベースの分離システムから得たＣＤ６３＋エクソソーム亜集団サンプルの黒色腫癌細胞のスクリーニングに対する効果を客観的に評価するために、現在商用化されているエクソソーム分離キットを用いて得たサンプルを用いた効果と比較した。商用化されたエクソソーム分離キットのうち、一般に販売される様々なＥｘｏＱｕｉｃｋ^ＴＭ、ＭａｇＣａｐｔｕｒｅ^ＴＭ、及びｅｘｏＥａｓｙ Ｍａｘｉ^ＴＭキットを購入して使用した。正常エクソソームと黒色腫癌エクソソームの標準物質２５μｇ／ｍｌ（１ｍｌ）を、各システムの定められたプロトコルに従って分離した。各分離されたエクソソームサンプルを、上述したようなＥＬＩＳＡを介してＣａｖ１及びＣＤ９タンパク質の発現レベルを信号として測定して、補正パラメータであるＣａｖ１／ＣＤ９の信号比率を計算して比較した。その結果を示す図１４を参照すると、本発明の免疫クロマトグラフィー及び免疫磁性分離システムから得たＣＤ６３＋エクソソーム亜集団サンプルの利用時に、上述したように、Ｃａｖ１／ＣＤ９の信号比率が、健常者の場合と比較して癌サンプルでそれぞれ５．５倍、４．１倍増加した反面、商用化された分離キットから求めたサンプルの利用時に、使用されたキットに関係なく、いずれも、Ｃａｖ１／ＣＤ９の信号比率が分離前と差がないか、またはむしろ癌サンプルにおいて減少することが分かった。

このような結果は、商用化されたエクソソーム分離キットの分離原理が、本発明で用いた原理と異なるためであると判断される。実際に、商用化キットは、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）のようなポリマーを使用した沈殿方法（ＥｘｏＱｕｉｃｋ^ＴＭ、ＳＢＩ社）や、エクソソームの表面のホスファチジルセリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ；ＰＳ）と金属イオンの存在下で反応するタンパク質を用いた親和的方法（ＭａｇＣａｐｒｕｅ^ＴＭ、Ｗａｋｏ社）、または回転カラムを用いて分離時間を短縮する方法（ｅｘｏＥａｓｙ Ｍａｘｉ^ＴＭ、Ｑｉａｇｅｎ社）などでエクソソームを分離する。

このように、販売されるほとんどのキットは、単にバルクエクソソーム集団を分離または濃縮する程度であって、診断敏感度を著しく向上させるには制限的であり、したがって、癌細胞のスクリーニングなどに適用しにくい。それに加えて、診断敏感度の増加のために特定のエクソソーム表面マーカーに対する免疫分離方法が適用されることはできるが、本発明のようにスイッチ認識素材の使用などを通じた画期的な方法の導入なしでは、エクソソームの回収収率及び原形の維持の面で競争することは難しい。

以下では、本評価実験で使用された商用キットを用いたエクソソームの分離過程を簡単に説明する。

〔ＥｘｏＱｕｉｃｋキットを用いたエクソソームの分離。〕エクソソーム標準サンプルを、使用したキットのメーカーが提供した案内に従って分離した。簡略に紹介すると、購入したエクソソームサンプル（各２５μｇ／ｍｌ；１ｍｌ）を別々のマイクロウェル内に移した後、予め定められた量のＥｘｏＱｕｉｃｋエクソソーム沈殿溶液を添加した。混合後、４℃で冷蔵した後、遠心分離した。上澄液を除去した後、粒状に沈殿したエクソソームを回収し、緩衝溶液（５００μl）に再溶解させた後、Ｃａｖ１／ＣＤ９の比率を決定するために、既に説明したように免疫分析を行った。

〔ＭａｇＣａｐｔｕｒｅキットを用いたエクソソームの分離。〕同じエクソソーム標準サンプルを、当該キットのメーカーが提供したプロトコルに従って分離した。簡略に紹介すると、エクソソームに対する特定の捕捉因子であるホスファチジルセリン（ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ；ＰＳ）－付着タンパク質でコーティングされた磁性ビーズ（６０μl）を、付着増進剤である金属イオンを含んでいる分析サンプル（１ｍｌ）に添加した。その混合物を３時間撹拌しながら反応させた。その後、ビーズを洗浄溶液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、及び２ｍＭのＣａＣｌ２を含む２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４；１ｍｌ）で３回洗浄した後、溶出溶液（１５０ｍＭのＮａＣｌ及び２ｍＭのＥＤＴＡを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．４））で溶出させた。回収されたエクソソームサンプルに対するＣａｖ１／ＣＤ９の比率を決定するために免疫分析を行った。

〔ｅｘｏＥａｓｙ Ｍａｘｉキットを用いたエクソソームの分離。〕エクソソームサンプルをまた、商業的に購入した他のキットを用いて分離した。簡略に説明すると、キットと共に提供されたＸＢＰ緩衝溶液（１ｍｌ）を、同じ体積のサンプルに添加した。軽く混合した後、混合物を室温に置いて室温まで予熱した。この混合物をｅｘｏＥａｓｙスピンカラム内に移した後、１分間遠心分離した。ＸＷＰ緩衝溶液（１０ｍｌ）を順次にカラム内に添加し、入れた緩衝溶液を除去するために、５分間さらに遠心分離した。スピンカラムを新しい回収チューブに移した後、ＸＥ緩衝溶液（５００μl）をカラムに添加し、その後、１分間反応させた。追加で５分間遠心分離してエクソソームを溶出させてチューブに回収した。最後に、溶出液をスピンカラムに再投入した後、１分間反応させ、５分間遠心分離して、溶出溶液を回収した。回収された溶液は、上述したようにＣａｖ１／ＣＤ９の比率を測定するために免疫分析を行った。

以上、本発明を具体的な実施例を通じて詳細に説明したが、これは本発明を具体的に説明するためのもので、本発明はこれに限定されず、本発明の技術的思想内で当分野における通常の知識を有する者によってその変形や改良が可能であることは自明である。

本発明の単純な変形及び変更はいずれも本発明の領域に属するものであって、本発明の具体的な保護範囲は、添付の特許請求の範囲によって明らかになるであろう。

［符号の説明］
１：目標亜集団対象物質
１０：リガンド
２０：バインダー
３０：認識素材
４０：固定部材
５０：捕捉素材
Ｃ：重合体
Ｐ：ターゲットマーカー

本発明の実施例に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離システムの構成図である。 本発明の他の実施例に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離システムの構成図である。 本発明の実施例に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離方法の流れ図である。 本発明の他の実施例に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離方法の流れ図である。 本発明の実施例に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離方法を用いて黒色腫癌細胞と関連するエクソソーム亜集団を分離する工程を示した流れ図である。 本発明に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離システム及び方法を用いてサンプル内のＣＤ６３＋エクソソームを免疫親和クロマトグラフィー工程により分離した結果である。 図６の免疫親和クロマトグラフィー工程を繰り返して用いてエクソソームの分離時の再現性を示した結果である。 本発明に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離システム及び方法を用いてサンプル内のＣＤ６３＋エクソソームを免疫磁性分離工程により分離及び濃縮した結果である。 図８の免疫磁性分離工程を繰り返して行う場合のＣＤ６３＋エクソソームの分離時の再現性を示した結果である。 本発明に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離システム及び方法を用いて分離されたＣＤ６３＋エクソソームに対する物理的特性化の結果である。 本発明に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離システム及び方法を用いて分離されたＣＤ６３＋エクソソームサンプルのエクソソーム表面マーカーに対する特性化の結果である。 エクソソーム標準サンプル間の濃度の変移を補償するために、ＣＤ９の濃度を基準としてＣａｖ１マーカーの濃度を補正した結果である。 本発明に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離システム及び方法を用いて分離したＣＤ６３＋エクソソームを分析サンプルとして用いる際に、黒色腫癌の診断に対する潜在的な効果を示した結果である。 本発明に係るスイッチ性付着反応を用いた親和分離システムと、現在商業的に販売されている様々なエクソソーム分離システムとの間に、分離されたサンプルの免疫分析によって決定されたＣａｖ１／ＣＤ９の濃度比率を基準として、黒色腫癌サンプルを正常サンプルから区分する性能に対する比較結果である。

Claims (11)

1. リガンドと、
   前記リガンドが解離可能に結合され、前記リガンドと結合反応して構造が変わるバインダーと、
   構造が変わった前記バインダーと特異的に結合する認識素材と、
   前記バインダー及び前記認識素材のいずれか一方が表面に固定される固定部材と、
   前記バインダー及び前記認識素材の他方と重合されて重合体を形成し、サンプル溶液内の目標亜集団対象物質と特異的に結合する捕捉素材とを含み、
   前記サンプル溶液は、異種のエクソソームバルク集団が含まれた体液を含み、
   前記目標亜集団対象物質は、前記異種のエクソソームバルク集団のうち、所定の疾患の診断に用いられる表面タンパク質を有する疾患の診断用のエクソソームであり、
   前記捕捉素材は、前記疾患の診断用のエクソソームの表面タンパク質と特異的に結合し、
   前記捕捉素材に結合された前記疾患の診断用のエクソソームは、液体生検（ｌｉｑｕｉｄ ｂｉｏｐｓｙ)に用いられる、親和分離システム。
2. 前記リガンドは、糖分子、イオン、基質、及び抗原からなる群から選択されるいずれか１つ以上を含む、請求項１に記載の親和分離システム。
3. 前記バインダーは、糖結合タンパク質、イオン結合タンパク質、酵素、抗体、アプタマー、細胞受容体、及びナノ構造体からなる群から選択されるいずれか１つ以上を含む、請求項１に記載の親和分離システム。
4. 前記認識素材は、抗体、タンパク質受容体、細胞受容体、アプタマー、酵素、ナノ粒子、ナノ構造体、及び重金属キレート剤（ｃｈｅｌａｔｏｒ）からなる群から選択されるいずれか１つ以上を含む、請求項１に記載の親和分離システム。
5. 前記固定部材は、ヒドロゲル、磁性ビーズ、ラテックスビーズ、ガラスビーズ、ナノ金属構造体、細孔性メンブレン、及び非細孔性メンブレンからなる群から選択されるいずれか１つ以上を含む、請求項１に記載の親和分離システム。
6. 内部に前記固定部材を収容する反応器をさらに含む、請求項１に記載の親和分離システム。
7. 結合された前記リガンドが解離されるときに、結合された前記バインダーと前記認識素材が互いに分離される、請求項１に記載の親和分離システム。
8. 前記目標亜集団対象物質と結合した前記固定部材は、磁力、重力、及び遠心力のいずれか１つ以上によって濃縮される、請求項１に記載の親和分離システム。
9. （ａ）リガンドが含有されたリガンド溶液、前記リガンドと解離可能に結合反応して構造が変わるバインダー、構造が変わった前記バインダーと特異的に結合する認識素材、及び前記バインダー及び前記認識素材のいずれか一方と重合されて重合体を形成する捕捉素材を反応させて、前記バインダー及び前記認識素材の他方と、前記重合体とを結合させるステップと、
   （ｂ）前記捕捉素材が特異的に結合する目標亜集団対象物質を含むサンプル溶液を添加し、前記重合体の前記捕捉素材と前記目標亜集団対象物質とを結合させるステップと、
   （ｃ）前記バインダーに結合された前記リガンドが解離されるように、前記リガンドが含まれていない回収溶液を添加して、前記認識素材及び前記バインダーの他方から、前記目標亜集団対象物質と結合された前記重合体を分離するステップとを含み、
   前記サンプル溶液は、異種のエクソソームバルク集団が含まれた体液を含み、
   前記目標亜集団対象物質は、前記異種のエクソソームバルク集団のうち、所定の疾患の診断に用いられる表面タンパク質を有する疾患の診断用のエクソソームであり、
   前記捕捉素材は、前記疾患の診断用のエクソソームの表面タンパク質と特異的に結合し、
   前記捕捉素材に結合された前記疾患の診断用のエクソソームは、液体生検（ｌｉｑｕｉｄ ｂｉｏｐｓｙ)に用いられる、親和分離方法。
10. 前記（ａ）ステップは、
    前記バインダー及び前記認識素材の他方を固定部材の表面に固定させるステップと、
    前記重合体が溶解された前記リガンド溶液を、前記固定部材に添加して、前記固定部材に固定された前記バインダー及び前記認識素材の他方と、前記重合体とを結合させるステップとを含む、請求項９に記載の親和分離方法。
11. 前記（ｂ）ステップと前記（ｃ）ステップとの間に、
    磁力、重力、及び遠心力のいずれか１つ以上を用いて、前記目標亜集団対象物質と結合された前記固定部材を、前記リガンド溶液及び前記サンプル溶液が混合された混合溶液内の所定の空間領域に捕捉するステップと、
    前記固定部材が含まれていない前記混合溶液の一部を除去して、前記目標亜集団対象物質を濃縮するステップとをさらに含む、請求項１０に記載の親和分離方法。

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