CN115004031A - 辅助诊断转移性雄激素阻断疗法抗性前列腺癌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的课题在于，提供一种新的前列腺癌标记，其能够简便且特异性地诊断转移性雄激素阻断疗法抗性前列腺癌，并且监测转移性雄激素阻断疗法抗性前列腺癌的病势。本发明涉及一种辅助诊断转移性雄激素阻断疗法抗性前列腺癌的方法，其包括：测定源自受检者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及前列腺特异性膜抗原的细胞外囊泡的量的步骤；及以所述具有磷脂酰丝氨酸及前列腺特异性膜抗原的细胞外囊泡的量为指标，判定受检者为转移性雄激素阻断疗法抗性前列腺癌的步骤。

Description

辅助诊断转移性雄激素阻断疗法抗性前列腺癌的方法

技术领域

本发明涉及一种辅助诊断转移性雄激素阻断疗法抗性前列腺癌的方法。

背景技术

激素疗法是前列腺癌的治疗法之一，但由于不是根治疗法，因此前列腺癌患者的一部分成为早晩激素疗法耐性前列腺癌(雄激素阻断疗法抗性前列腺癌，castrationresistant prostate cancer，以下，简称为“CRPC”)。通常，CRPC根据作为以往的前列腺癌标记的前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen，以下，简称为“PSA”。)的上升来诊断，但最近也指出与PSA的上升无关的病势的进展。

因此，在CRPC的治疗过程中，推荐不仅使用PSA测定，还同时使用图像诊断来监测包括转移的病势的进展。

已知前列腺特异性膜抗原(Prostate Specific Membrane Antigen，以下，简称为“PSMA”。)是在前列腺的细胞膜上发现，在前列腺癌患者的组织中，越是恶性程度高的受检体，则PSMA的染色性变得越强。

然而，已知细胞外囊泡在其粒子内部存在蛋白质或microRNA等核酸，且负责细胞之间的物质传递。细胞外囊泡也分泌在血液等体液中，细胞外囊泡中的蛋白质或microRNA等作为疾病的诊断标记而受到关注。Mizutani等人使用抗PSMA抗体固定化珠从源自健康人、无转移的前列腺癌患者、进展性前列腺癌患者及CRPC患者的血浆分离外泌体，进行使用抗CD9抗体的蛋白质印迹法。其结果，据报告，与健康人相比，在前列腺癌患者及CRPC患者中，外泌体的量增加(非专利文献1)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Kosuke Mizutani et al.,Anticancer Research,2014,34(7),p.3419-3423

非专利文献2：Zhen Xiao et al.,Cancer Res.,2001,61(16),p:6029-6033

非专利文献3：Vaclav Navratil et al.,Nucleic Acids Res.,2017,45(2):e10.doi:10.1093/nar/gkw853

发明内容

发明要解决的技术课题

然而，对CRPC特异性的癌标记及诊断CRPC的转移的生物标记尚不清楚。

并且，虽然有尝试测定血中的PSMA浓度的文献(非专利文献2、非专利文献3等)，但由于血中PSMA的量非常少，因此难以用以往技术进行测定，在血中PSMA浓度与前列腺癌的关系中未获得统一的见解。非专利文献1中也未特别对转移性CRPC患者进行试验。并且，非专利文献1的外泌体量的确认方法在要求迅速的诊断的临床检查领域中使用时，存在步骤繁杂的问题。

因此，本发明的课题在于，开发一种新的前列腺癌标记，其能够简便且特异性地诊断转移性CRPC，并且监测转移性CRPC的病势。

用于解决技术课题的手段

本发明是为了解决所述课题而完成的，由以下结构构成。

[1]一种辅助诊断转移性CRPC的方法，其包括：测定源自受检者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及PSMA的细胞外囊泡的量的步骤；及以所述具有磷脂酰丝氨酸及PSMA的细胞外囊泡的量为指标，判定受检者为转移性CRPC的步骤。

[2]根据所述[1]所述的方法，其中，所述判定是在所述具有磷脂酰丝氨酸及PSMA的细胞外囊泡的量为基准值以上的情况下，判定受检者为转移性CRPC的步骤。

[3]根据所述[1]或[2]所述的方法，其中，所述测定是使用对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质及对PSMA具有亲和性的抗体的测定。

[4]根据所述[1]至[3]中任一项所述的方法，其中，所述测定包括下述工序(i)～(iii)：

(i)从源自受检者的生物试样中获取细胞外囊泡的工序；

(ii)使所述工序(i)中获得的细胞外囊泡、对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质及对PSMA具有亲和性的抗体接触，形成所述对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质、具有磷脂酰丝氨酸及PSMA的细胞外囊泡以及对PSMA具有亲和性的抗体的复合体2的工序；及

(iii)通过测定所述工序(ii)中获得的复合体2的量来测定具有磷脂酰丝氨酸及PSMA的细胞外囊泡的量的工序。

[5]根据所述[1]至[4]中任一项所述的方法，其中，所述测定包括下述工序(i)～(iii)：

(i)使源自受检者的生物试样与对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质接触，形成所述生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡和所述对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质的复合体1之后，从所述复合体1分离所述具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡，获取所述具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡的工序；

(ii)使所述工序(i)中获得的具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡、对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质及对PSMA具有亲和性的抗体接触，形成所述对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质、具有磷脂酰丝氨酸及PSMA的细胞外囊泡以及所述对前列腺特异性膜抗原具有亲和性的抗体的复合体2的工序；及

(iii)通过测定所述工序(ii)中获得的复合体2的量来测定所述具有磷脂酰丝氨酸及PSMA的细胞外囊泡的量的工序。

[6]根据所述[5]所述的方法，其中，在所述工序(i)中，对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质与不溶性载体键合。

[7]根据所述[5]或[6]所述的方法，其中，所述工序(i)包括以下工序：

(i-1)使所述生物试样与对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质接触，形成所述生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡和所述对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质的复合体1的工序；

(i-2)从所述生物试样分离并获取所述工序(i-1)中获得的复合体1的工序；及

(i-3)从所述工序(i-2)中获取的所述复合体1分离所述具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡，获取所述具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡的工序。

[8]根据所述[3]至[7]中任一项所述的方法，其中，所述对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质是含T细胞免疫球蛋白/粘蛋白的蛋白质。

[9]根据所述[8]所述的方法，其中，所述含T细胞免疫球蛋白/粘蛋白的蛋白质是含T细胞免疫球蛋白/粘蛋白的蛋白质1或含T细胞免疫球蛋白/粘蛋白的蛋白质4。

[10]根据所述[1]至[9]中任一项所述的方法，其中，所述生物试样是血液试样。

[11]一种转移性CRPC的诊断辅助用检查试剂盒，其含有：用于测定具有磷脂酰丝氨酸及PSMA的细胞外囊泡的对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质、及对PSMA具有亲和性的抗体。

[12]根据所述[11]所述的试剂盒，其还含有固定有用于获取具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡的对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质的不溶性载体。

[13]一种转移性CRPC的诊断用生物标记，其含有具有磷脂酰丝氨酸及PSMA的细胞外囊泡。

[14]一种转移性CRPC诊断辅助用装置，其具有测定部，所述测定部测定源自受检者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及PSMA的细胞外囊泡的量。

[15]根据所述[14]所述的装置，其还具有判定部，所述判定部判定通过测定部中的测定获得的测定值是否为基准值以上。

鉴于所述状况，本发明人等发现存在于血中的具有磷脂酰丝氨酸及PSMA的细胞外囊泡(以下，有时简称为“PS-PSMA细胞外囊泡”。)能够成为用于诊断转移性CRPC的生物标记，从而完成了本发明。

发明效果

根据本发明，能够与非转移性CRPC、CRPC以外的前列腺癌、前列腺肥大及健康人区分，特异性地诊断转移性CRPC。

附图说明

图1表示将实施例1中获得的使用源自CRPC患者5受检体的生物试样而获得的测定值的平均值设为1时的，相对于该值的使用源自各疾病患者或健康人的生物试样而获得的测定值的相对值。

图2表示比较例1中获得的使用源自各疾病患者或健康人的生物试样而获得的测定值。图2(1)表示用固定化抗PSMA抗体-标记抗CD9抗体的测定系统进行测定的结果。图2(2)表示用固定化抗CD9抗体-标记抗PSMA抗体的测定系统进行测定的结果。

图3表示使用实施例2中获得的、使用Tim4珠从血清分离而获得的含有PS细胞外囊泡的试样或使用含有细胞外囊泡的血清作为试样，进行PS-PSMA细胞外囊泡的测定的结果。

具体实施方式

＜1.转移性雄激素阻断疗法抗性前列腺癌＞

癌的“转移”通常是指癌细胞从原发部位向身体的其他器官移动，然后再次增殖。

在本发明中，转移性雄激素阻断疗法抗性前列腺癌是雄激素阻断疗法抗性前列腺癌(CRPC)，是指有转移的情况。包括已经有转移的CRPC患者的状态及去势抵抗前列腺癌获得转移性的状态。

＜2.具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡＞

作为本发明所涉及的具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡，可举出源自细胞的由脂质二重膜构成且在其膜表面具有磷脂酰丝氨酸的小膜泡。作为该囊泡的直径，可举出通常为20nm～1000nm，优选为50～800nM，更优选为50nm～500nm，尤其优选为50nm～200nm。作为所述细胞外囊泡，可举出如Nature Reviews Immunology 9，581-593(August 2009)、“肥胖研究”Vol.13No.22007话题青木直人等中所记载，根据其产生起源及小膜泡的大小等进行各种分类的细胞外囊泡。具体而言，可举出外泌体、微泡、核外粒体、膜粒子、外泌体状囊泡、凋亡小体、脂肪体等。

外泌体是源自后期核内体的由脂质二重膜构成且在其膜表面具有磷脂酰丝氨酸的小膜泡。外泌体的直径通常为50nm～200nm，优选为50nm～150nm，更优选为50nm～100nm。已知外泌体在其膜表面含有CD63或CD9等四跨膜蛋白(tetraspanins)、Alix、TSG101、Lamp-1、Flotillin等蛋白质。

微泡是源自细胞膜的由脂质二重膜构成且在其膜表面具有磷脂酰丝氨酸的小膜泡。微泡的直径通常为100nm～1000nm，优选为100nm～800nm，更优选为100nm～500nm。已知微泡在其膜表面含有整合素、选择素、CD40配体等蛋白质。

核外粒体是源自细胞膜的由脂质二重膜构成且在其膜表面具有磷脂酰丝氨酸的小膜泡。核外粒体的直径通常为50nm～200nm，优选为50nm～150nm，更优选为50nm～100nm。已知核外粒体在其膜表面含有CR1、蛋白水解酶(proteolytic enzyme)，但不含有CD63。

膜粒子是源自细胞膜的由脂质二重膜构成且在其膜表面具有磷脂酰丝氨酸的小膜泡。膜粒子的直径通常为50nm～80nm。已知膜粒子在其膜表面含有CD133，但不含有CD63。

外泌体状囊泡是源自初期核内体的由脂质二重膜构成且在其膜表面具有磷脂酰丝氨酸的小膜泡。外泌体状囊泡的直径通常为20nm～50nm。已知外泌体状囊泡在其膜表面含有肿瘤坏死因子受体1(TNFRI)。

凋亡小体是源自凋亡细胞的由脂质二重膜构成且在其膜表面具有磷脂酰丝氨酸的小膜泡。凋亡小体的直径通常为50nm～500nm，优选为50nm～300nm，更优选为50nm～200nm。已知凋亡小体在其膜表面含有组蛋白。

脂肪体是源自脂肪细胞的由脂质二重膜构成且在其膜表面具有磷脂酰丝氨酸的小膜泡。脂肪体的直径通常为100nm～1000nm，优选为100nm～800nm，更优选为100nm～500nm。已知脂肪体含有MFG-E8(milk fat globule-EGF factor 8)。

作为具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡，优选外泌体或微泡，更优选外泌体。

以下有时将本发明所涉及的“具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡”简称为“PS细胞外囊泡”。

本发明所涉及的“具有磷脂酰丝氨酸及PSMA的细胞外囊泡”(以下，有时简称为“PS-PSMA细胞外囊泡”。)是上述本发明所涉及的PS细胞外囊泡，且是在其膜表面具有PSMA的细胞外囊泡。

＜3.对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质＞

作为本发明所涉及的“对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质”，只要是在钙离子的存在下对磷脂酰丝氨酸具有亲和性，且与存在(露出)于上述本发明所涉及的PS细胞外囊泡的膜表面的磷脂酰丝氨酸键合的物质即可。例如，可举出含膜联蛋白V(Annexin V)、MFG-E8(Milk Fat Globulin Protein E8：乳脂肪球蛋白E8)、T细胞免疫球蛋白/粘蛋白(T-cellimmunoglobulin-mucin-domain)的蛋白质等。优选含T细胞免疫球蛋白/粘蛋白的蛋白质(以下，有时简称为“Tim蛋白质”。)。

以下，有时将本发明所涉及的“对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质”简称为“PS亲和性物质”。

[Tim蛋白质]

本发明所涉及的Tim蛋白质只要是在钙离子的存在下对磷脂酰丝氨酸具有亲和性，且能够与本发明所涉及的PS细胞外囊泡键合的物质即可，优选源自动物的Tim蛋白质。其中，优选人所具有的Tim蛋白质。

更具体而言，只要至少具有对磷脂酰丝氨酸的键合域(IgV域)的氨基酸序列即可，可以具有Tim蛋白质总长的氨基酸序列，也可以是Tim蛋白质的一部分。

作为这样的本发明所涉及的Tim蛋白质，可举出含T细胞免疫球蛋白/粘蛋白的蛋白质1(以下，简称为“Tim1”。)、含T细胞免疫球蛋白/粘蛋白的蛋白质3(以下，简称为“Tim3”。)及含T细胞免疫球蛋白/粘蛋白的蛋白质4(以下，简称为“Tim4”。)等。优选Tim1及Tim4，更优选Tim4。

本发明所涉及的Tim蛋白质的氨基酸序列例如记载在WO2016-088689号。

本发明所涉及的Tim蛋白质能够使用市售品。并且，也能够通过通常的化学合成方法或如WO2016-088689号中记载的基因重组技术获得。

＜4.本发明的辅助诊断转移性CRPC的方法＞

本发明的辅助诊断转移性CRPC的方法(以下，有时简称为“本发明的辅助方法”)包括：

(A)测定源自受检者的生物试样中的PS-PSMA细胞外囊泡的量；及

(B)以所述PS-PSMA细胞外囊泡的量为指标，判定受检者为转移性CRPC的步骤。

本发明的辅助方法能够用作辅助医师等诊断转移性CRPC的方法。并且，本发明的辅助方法在体外实施。

作为本发明的辅助方法中的PS-PSMA细胞外囊泡的“量”及复合体2的“量”，可举出容量，质量等值或浓度。并且，也可以是与PS-PSMA细胞外囊泡的“量”及复合体2的“量”具有相关关系的发光量、吸光度、荧光强度、浊度、透光量、峰面积、反射率、折射率、这些值的变化量等实测值、以及根据这些值计算出的值等相对值的中的任一个。

在本发明的辅助方法中，以下，有时将上述(A)的“测定源自受检者的生物试样中的PS-PSMA细胞外囊泡的量”的工序简称为“本发明所涉及的测定工序”。

并且，以下，有时将上述(B)的“以PS-PSMA细胞外囊泡的量为指标，判定受检者为转移性CRPC”的工序简称为“本发明所涉及的判定工序”。

[生物试样]

作为本发明所涉及的生物试样，只要是源自人的生物试样即可，例如可举出血清、血浆、全血、尿、精液、膀胱清洗物、组织提取液、前列腺组织切片、前列腺组织活检试样等，或者由它们制备而成的物质等。优选血浆、血清、全血等源自血液的试样，更优选血浆或血清。尤其优选为血清。

本发明所涉及的生物试样例如可以是直接从人采取的生物试样，也可以是进行通过回收、浓缩、提纯、分离、缓冲液等的稀释、过滤灭菌等预处理的生物试样。这些预处理只要按照在该领域中使用的常规方法适当进行即可。

从受检者获得(采取)本发明所涉及的生物试样的方法没有特别限定，例如，可以通过根据本身公知的方法从该受检者获得(采取)该试样来进行。

＜关于(A)本发明所涉及的测定工序＞

具体而言，本发明所涉及的测定工序例如包括下述工序。

(A-1)从源自受检者的生物试样中获取细胞外囊泡的工序；

(A-2)使所述工序(A-1)中获得的细胞外囊泡、PS亲和性物质及对PSMA具有亲和性的抗体接触，形成所述PS亲和性物质、PS-PSMA细胞外囊泡及对PSMA具有亲和性的抗体的复合体2的工序(以下，有时简称为“复合体2形成工序”。)；及

(A-3)通过测定所述工序(A-2)中获得的复合体2的量来测定PS-PSMA细胞外囊泡的量的工序(以下，有时简称为“测定工序”。)。

·关于(A-1)从源自受检者的生物试样中获取细胞外囊泡的工序

作为工序(A-1)所涉及的从生物试样中获取细胞外囊泡的方法，只要按照常规方法分离细胞外囊泡即可，没有特别限定。

例如，可举出亲和法(使用磷脂酰丝氨酸键合分子的PS亲和法等)、分级离心分离法(颗粒沉淀法、蔗糖缓冲法、密度梯度离心法等超离心法等)、免疫沉降法、色谱法(离子交换色谱法、凝胶渗透色谱法等)、密度梯度法(蔗糖密度梯度法等)、电泳法(细胞器电泳法等)、磁分离法(磁活性化细胞分选(MACS)法)、超滤浓缩法(纳米膜超滤浓缩法等)、珀科尔(Percoll)梯度分离法、利用微流体器件的方法、PEG沉淀法等。

优选获得高提纯度的细胞外囊泡的亲和法、或理论上能够无偏差地回收的分级离心分离法，更优选亲和法或超离心法，尤其优选亲和法。亲和法中，优选PS亲和法。亲和法及分级离心分离法例如可以按照WO2016-088689号中记载的方法进行。

这些分离方法可以仅使用一种，也可以组合两种以上。并且，也可以将利用一种分离方法的分离重复2次以上。

作为通过PS亲和法使用本发明所涉及的PS亲和性物质获取细胞外囊泡的方法，如下进行：使所述生物试样与PS亲和性物质接触，形成所述生物试样中的PS细胞外囊泡和所述PS亲和性物质的复合体1之后，从所述复合体1分离所述PS细胞外囊泡，获取所述PS细胞外囊泡。

具体而言，利用PS亲和法的工序(A-1)的优选方法包括下述(A-1-1)～(A-1-3)的工序。

(A-1-1)使生物试样与PS亲和性物质接触，形成所述生物试样中的PS细胞外囊泡和所述PS亲和性物质的复合体1的工序(以下，有时简称为“复合体1形成工序”。)；

(A-1-2)从所述生物试样分离并获取所述工序(A-1-1)中获得的复合体1的工序(以下，有时简称为“复合体1分离工序”。)；及

(A-1-3)从所述工序(A-1-2)中获取的所述复合体1分离所述PS细胞外囊泡，获取所述PS细胞外囊泡的工序(以下，有时简称为“获取工序”。)。

另外，通过PS亲和法获取的细胞外囊泡是PS细胞外囊泡。

-关于(A-1-1)复合体1形成工序-

(A-1-1)的复合体1形成工序是“使生物试样与PS亲和性物质接触，形成所述生物试样中的PS细胞外囊泡和所述PS亲和性物质的复合体1的工序。”。

该工序中使用的生物试样如上所述。具体例、优选例等也相同。

并且，本工序中使用的PS亲和性物质的具体例如上述“＜3.对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质＞”项中所记载。具体例、优选例等也相同。

·将PS亲和性物质固定在不溶性载体上的方法

复合体1形成工序中使用的PS亲和性物质优选为与不溶性载体键合的物质。在该情况下，PS细胞外囊泡和所述PS亲和性物质的复合体1能够在后述的(A-1-2)的复合体1分离工序中，通过公知的B/F分离法从反应液分离。

以下说明将PS亲和性物质固定在不溶性载体上的方法的例子，例如可以按照WO2016-088689号中记载的方法进行。

作为固定PS亲和性物质的不溶性载体，只要是在通常的免疫学测定法中使用的不溶性载体，则能够使用任何载体。例如，可举出聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯、

聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯、聚丙烯、聚烯烃、聚酰亚胺、聚氨酯、聚酯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚氯碳酸酯、硅酮树脂、硅酮橡胶、琼脂糖、葡聚糖、乙烯-马来酸酐共聚物等有机物；玻璃、氧化硅、硅藻、多孔玻璃、毛玻璃、氧化铝、硅胶、金属氧化物等无机物质；铁、钴、镍、磁铁矿、铬铁矿等磁性体等；及将这些磁性体的合金制备成材料的物质。并且，这些载体能够以微孔板、软管、盘状片、粒子(珠)等多种多样的形态使用。

另外，工序(A-1-1)的复合体1形成工序中使用的不溶性载体优选为粒子(珠)，粒子的大小没有特别限定，通常为10nm～100μm，优选可举出100nm～10μm。

作为PS亲和性物质与不溶性载体的键合方法，可举出使蛋白质与载体键合的本身公知的方法。例如，可举出通过亲和键合进行键合的方法、通过化学键合进行键合的方法(例如，日本专利3269554号公报、WO2012/039395公报中记载的方法)、通过物理吸附进行键合的方法(例如，日本特公平5-41946号公报中记载的方法)等，优选通过物理吸附进行键合的方法及通过亲和键合进行键合的方法。通过物理吸附进行键合的方法简便且更优选。

作为通过物理吸附将本发明所涉及的PS亲和性物质与不溶性载体进行键合的方法，只要按照本身公知的方法，在PS亲和性物质与不溶性载体键合的条件下，使PS亲和性物质与不溶性载体接触即可。

例如在不溶性载体为粒子(珠)的情况下，相对于不溶性载体1mg，与不溶性载体键合的本发明所涉及的PS亲和性物质的量通常为0.1μg～50μg，优选为0.1μg～30μg，更优选为0.1μg～20μg。并且，在不溶性载体为微孔板的情况下，相对于微孔板1孔，通常为0.1μg～10μg，优选为0.1μg～5μg，更优选为0.1μg～2μg。

PS亲和性物质与不溶性载体的物理吸附通过使含有PS亲和性物质的溶液与不溶性载体接触来进行。

在含有PS亲和性物质的溶液中，作为使该物质溶解的溶液，只要是使PS亲和性物质以稳定的状态溶解的溶液即可，例如可举出纯净水、例如对pH6.0～9.8、优选7.0～9.6具有缓冲作用的缓冲液(例如MOPS等良好的缓冲液、碳酸缓冲液、PBS、TBS、TBS-T、HBS等)。并且，作为这些缓冲液中的缓冲剂浓度，通常从5～100mM，优选从10～100mM的范围适当选择，添加NaCl时的浓度通常从100～200mM，优选从140～160mM的范围适当选择。并且，在使该PS亲和性物质溶解的溶液中，只要是不妨碍PS亲和性物质与不溶性载体的键合的量，也可以含有例如糖类、NaCl等盐类、Tween20等表面活性剂、防腐剂、蛋白质等。

作为固定在不溶性载体上的PS亲和性物质，优选Tim蛋白质。更优选Tim4。以下，有时将固定有Tim蛋白质的不溶性载体简称为“Tim载体”。以下，有时将固定有Tim4蛋白质的不溶性载体简称为“Tim4载体”。

作为通过物理吸附使PS亲和性物质与不溶性载体键合的方法的具体例，例如可举出以下方法。

首先，在不溶性载体为粒子(珠)的情况下，使通常含有0.1μg～50μg，优选含有1μg～50μg的PS亲和性物质的溶液(通常为50μL～300μL，优选为50μL～200μL，更优选为50μL～100μL)与珠载体1mg接触，使其通常在2℃～37℃，优选在4℃～11℃下通常反应0.5～48小时，优选反应0.5～24小时。

在不溶性载体为微孔板的情况下，使通常含有0.1μg～10μg，优选含有0.2μg～5μg，更优选含有0.5μg～2μg的PS亲和性物质的溶液(通常为50μL～300μL，优选为50μL～200μL，更优选为50μL～100μL)与微孔板的1孔接触，使其通常在2℃～37℃，优选在4℃～11℃下通常反应4～48小时，优选反应12～24小时。

如上所述获得的固定有PS亲和性物质的不溶性载体也可以用于通常在该领域中进行的封闭处理。

并且，根据需要，也可以将如上所述获得的本发明所涉及的固定有PS亲和性物质的不溶性载体用于通常在该领域中进行的提纯处理。作为提纯处理，只要能够去除附着在载体表面上的杂质即可，例如，可举出通过清洗溶液清洗该不溶性载体的方法(以下，有时简称为“清洗操作”)。清洗操作可以根据需要重复进行多次。

·复合体1形成工序

在使用Tim蛋白质作为PS亲和性物质的情况下，(A-1-1)的复合体1形成工序在钙离子的存在下进行。即，钙离子在使PS亲和性物质与生物试样中的细胞外囊泡接触时存在。

使PS亲和性物质与生物试样中的细胞外囊泡接触时的钙离子浓度通常为0.5mM～100mM，优选为1.0mM～10mM，更优选为2.0mM～5.0mM。另外，在形成PS亲和性物质和生物试样中的PS细胞外囊泡的复合体1，直至实施后述的(A-1-3)获取工序，即直至用于将该复合体1分离的工序的含有该复合体1的溶液中，当然需要如上所述浓度的钙离子。

钙离子的来源没有特别限定，例如可举出氯化钙、氢氧化钙、碳酸氢钙、碘化钙、溴化钙、乙酸钙等，优选为氯化钙、碳酸氢钙、碘化钙，更优选为氯化钙、碳酸氢钙。

作为在使PS亲和性物质与生物试样中的细胞外囊泡接触时存在钙离子的方法，只要使生物试样或/及含有PS亲和性物质的溶液中含有如上所述钙离子，以使PS亲和性物质与生物试样中的细胞外囊泡接触时的钙离子浓度在上述范围内即可。并且，为了使PS亲和性物质与生物试样中的细胞外囊泡接触时的钙离子浓度在上述范围内，也可以将含有钙离子的溶液(以下，有时简称为“含有钙离子的溶液”。)、生物试样及含有PS亲和性物质的溶液混合。

在本发明所涉及的含有钙离子的溶液中，作为使钙离子溶解的溶液，只要是不妨碍PS细胞外囊泡与PS亲和性物质的键合的溶液即可，例如可举出水、对pH7.0～pH8.0优选对pH7.2～pH7.6具有缓冲作用的缓冲液(例如TBS、HBS等)等。另外，磷酸缓冲液与钙键合而产生沉淀，因此不优选。并且，作为这些缓冲液中的缓冲剂浓度，通常从5mM～50mM，优选从10mM～30mM的范围适当选择。NaCl浓度通常从100mM～200mM，优选从140mM～160mM的范围适当选择。

在本发明所涉及的含有钙离子的溶液中，只要是不妨碍PS细胞外囊泡与PS亲和性物质的键合的量，则也可以含有例如糖类、NaCl等盐类、表面活性剂、防腐剂、BSA等蛋白质等。作为表面活性剂，例如可举出Tween20等，该本发明所涉及的含有钙离子的溶液中的表面活性剂的浓度通常为0.00001％～0.2％，优选为通常0.0005％～0.1％。

在复合体1形成工序中，使与PS亲和性物质(也可以固定在不溶性载体上)1μg接触的生物试样的量通常为0.1ml～100ml，优选为0.1ml～10ml，更优选为0.1ml～1.0ml。使生物试样与PS亲和性物质(也可以固定在不溶性载体上)接触时的温度通常为2～37℃，优选为4～37℃，更优选为4～30℃。生物试样与PS亲和性物质的接触时间通常为0.5～24小时，优选为0.5～8小时，更优选为0.5～4小时。

在复合体1形成工序中，作为使用与不溶性载体键合的PS亲和性物质时的该载体的量，形成复合体1时的每1mL溶液通常为0.1mg～20mg，优选为0.3mg～10mg，更优选为0.5mg～6.0mg。

复合体1形成工序例如可以通过以下方法进行。

即，使混合后的每1mL溶液成为通常0.1mg～20mg，优选为0.3mg～10mg，更优选为0.5mg～6.0mg的量的固定有PS亲和性物质的不溶性载体、混合后的溶液中的钙离子浓度成为通常0.5mM～100mM，优选为1.0mM～10mM，更优选为2.0mM～5.0mM的量的本发明所涉及的含有钙离子的溶液、及每1mg固定有PS亲和性物质的不溶性载体成为通常0.1ml～100ml，优选为0.1ml～10ml，更优选为0.1ml～1.0ml的生物试样在通常4.0～37℃，优选在4.0～25℃，更优选在4.0℃～11℃下，接触混合通常0.5～24小时，优选为0.5～8.0小时，更优选为0.5～4.0小时，形成与载体键合的PS亲和性物质和生物试样中的PS细胞外囊泡的复合体(复合体1)。

-关于(A-1-2)复合体1分离工序-

(A-1-2)的复合体1分离工序是从生物试样分离并获取所述工序(A-1-1)中获得的复合体1的工序。

另外，该生物试样可以是生物试样本身，也可以是包含本发明所涉及的含有钙离子的溶液等的溶液。

只要能够分离复合体1与生物试样而获取复合体1，则复合体1分离工序可以是任何方法，例如可以使用公知的B/F分离，具体而言，可举出如下方法。

(i)固定有PS亲和性物质的不溶性载体的该载体为磁载体的情况：将含有通过复合体1形成工序获得的复合体1的容器根据需要设置在磁铁支架上，使用磁力使复合体1集合到管壁上，去除上清液，由此将它们分离的方法。

(ii)固定有PS亲和性物质的不溶性载体的该载体为珠状的情况：将含有通过复合体1形成工序获得的复合体1的容器进行离心分离处理，将复合体1作为沉淀集合之后，去除上清液，由此将它们分离的方法。

(iii)固定有PS亲和性物质的不溶性载体的该载体为板等的情况：仅去除含有生物试样的溶液，由此将它们分离的方法。

(iv)通过过滤将复合体1与含有生物试样的溶液分离的方法。

这样分离复合体1与含有生物试样的溶液之后，可以通过本身公知的方法获取(回收)所分离的复合体1。

作为复合体1分离工序的具体例，例如可举出以下方法。

在使用磁载体用作不溶性载体的情况下，将进行复合体1形成工序的容器根据需要设置在磁铁支架上，使用磁力使所获得的复合体1集合到管壁上，去除上清液的试样。

在进行(A-1-1)的复合体形成工序、(A-1-2)的复合体分离工序之后，也可以根据需要使用含钙离子的清洗溶液清洗所获得的复合体1(以下，有时简称为“清洗操作”)。通过清洗操作，能够去除附着在固定有PS亲和性物质的不溶性载体表面上的源自细胞的成分等生物试样中的混杂物。作为清洗方法，除了使用含钙离子的清洗溶液以外，能够使用通常在该领域中进行的清洗方法。

作为在该清洗操作中使用的含钙离子的清洗溶液，只要是含有通常0.5～100mM，优选为通常1～10mM，更优选为通常2mM～5mM的钙离子，且不影响PS细胞外囊泡与固定在不溶性载体上的PS亲和性物质的键合的溶液，则可以是任何溶液，例如可举出不使钙沉淀的缓冲液(例如TBS、TBS-T、HBS)，该钙含有通常0.5mM～100mM，优选为通常1mM～10mM，更优选为通常2mM～5mM的钙离子，且对pH7.0～pH8.0，优选对pH7.2～pH7.6具有缓冲作用。另外，磷酸缓冲液与钙键合而产生沉淀，因此不优选。并且，作为这些缓冲液中的缓冲剂浓度，通常从5mM～50mM，优选从10mM～30mM的范围适当选择，NaCl浓度通常从100mM～200mM，优选从140mM～160mM的范围适当选择。在该溶液中，只要是不妨碍PS细胞外囊泡与固定在不溶性载体上的PS亲和性物质的键合的量，则也可以含有例如糖类、NaCl等盐类、表面活性剂、防腐剂、蛋白质等。作为表面活性剂，例如可举出Tween20(FUJIFILM Wako Pure ChemicalCorporation制造)等，该清洗溶液中的表面活性剂的浓度通常为0.00001％～0.2％，优选为通常0.0005％～0.1％。

以使用磁性粒子作为固定PS亲和性物质的不溶性载体的清洗操作为例，对清洗操作的具体例进行说明。

即，在含有通过复合体1分离工序获得的复合体1的容器内添加本发明所涉及的含钙离子的清洗溶液，进行搅拌。然后，将所述容器设置在磁铁支架上，使用磁力使该复合体1集合到管壁上，丢弃所述容器内的溶液。这些清洗操作可以根据需要重复进行多次。

-关于(A-1-3)获取工序-

(A-1-3)的获取工序是进行(A-1-1)的复合体1形成工序及(A-1-2)的复合体1分离工序，根据需要进行清洗操作之后，从所获取的所述复合体1分离所述PS细胞外囊泡，获取所述本发明所涉及的PS细胞外囊泡的工序。

作为获取工序，例如可举出使用蛋白质改性剂的方法、降低钙离子浓度的方法，由于能够获取完整的PS细胞外囊泡，因此优选降低钙离子浓度的方法。

作为使用蛋白质改性剂的方法，如下进行：进行复合体1形成工序及复合体1分离工序之后，根据需要进行清洗操作之后，使蛋白质改性剂作用于所获得的本发明所涉及的复合体1，使复合体1中的本发明所涉及的PS亲和性物质改性，从复合体1分离PS细胞外囊泡。由此，能够获取本发明所涉及的PS细胞外囊泡。使用蛋白质改性剂的方法中的蛋白质改性剂的使用浓度、使用条件等通常按照在该领域中进行的方法来设定。

作为上述蛋白质改性剂，只要是在该领域中通常用作使蛋白质改性的化合物的改性剂，则可以是任何改性剂，例如可举出SDS(十二烷基硫酸钠)、N-月桂酰肌氨酸等阴离子性表面活性剂；CHAPS(3-(3-胆酰胺丙基)二甲基铵-1-丙磺酸盐)、Zwittergent 3-12(N-十二烷基-N,N-二甲基-3-铵基-1-丙磺酸盐)等双离子性表面活性剂；Brij 35(Takara BioInc.制造)、Dodecyl-β-D-maltoside(n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷)、Nonidet P-40、Octyl-β-D-glucoside(辛基-β-D-葡萄糖苷)、Triton X-100(聚氧乙烯(10)辛基苯基醚)、Tween20(聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单月桂酸酯)等非离子性表面活性剂；尿素、甲酰胺、胍等离液剂等，优选阴离子性表面活性剂，尤其优选SDS。

作为降低钙离子的浓度的方法，例如可举出使用钙离子螯合剂的方法。

即，是如下方法：在进行复合体1形成工序及复合体1分离工序之后，使钙离子螯合剂作用于与复合体1键合的钙离子及从含有复合体1的溶液中带入的钙离子之后，降低(使钙离子螯合)与复合体1键合的钙离子及从含有复合体1的溶液中带入的钙离子的(有效)浓度，由此从复合体1分离PS细胞外囊泡。

作为该方法中使用的钙离子螯合剂，只要是能够螯合钙离子的化合物，则可以是任何螯合剂，例如可举出EDTA(乙二胺四乙酸)、NTA(次氮基三乙酸)、DTPA(二乙烯三胺五乙酸)、GLDA(L-谷氨酸二乙酸)、HEDTA(羟乙基乙二胺三乙酸)、GEDTA(乙二醇双(β-氨基乙基醚)-N,N,N,N,-四乙酸)、TTHA(三乙烯四胺-N,N,N’,N”,N”’,N”’-六乙酸)、HIDA(2-羟乙基氨基二乙酸)、DHEG(N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸)、CyDTA(trans-1,2-Diaminocyclohexane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid,monohydrate)等，优选EDTA、GEDTA、CyDTA。

钙离子螯合剂通常以溶液形式使用。作为使钙离子螯合剂溶解的溶液，只要是使钙离子螯合剂溶解的溶液即可，例如可举出纯净水、缓冲液等。作为缓冲液，优选通常对pH7.0～pH8.0，优选对pH7.2～pH7.6具有缓冲作用的缓冲液(例如PBS、TBS、HBS等)。并且，作为这些缓冲液中的缓冲剂浓度，通常从5Mm～50Mm，优选从10Mm～30Mm的范围适当选择，NaCl浓度通常从100Mm～200Mm，优选从140Mm～160Mm的范围适当选择。含钙离子螯合剂的溶液也可以含有例如糖类、NaCl等盐类、防腐剂、蛋白质等。

作为含钙离子螯合剂的溶液中的钙离子螯合剂的浓度，通常为0.5mM～500mM，优选为0.5mM～100mM，更优选为0.5mM～50mM。并且，含钙离子螯合剂的溶液的pH通常为pH6.0～pH9.0，优选为pH7.0～pH8.0，更优选为pH7.2～pH7.6。

为了使钙离子螯合剂作用于与复合体1键合的钙离子，通过使含钙离子螯合剂的溶液与颗粒状的复合体1接触，使与复合体1键合的钙离子与含钙离子螯合剂的溶液中的钙离子螯合剂反应来进行。

例如，含钙离子螯合剂的溶液与复合体1的接触能够通过例如使该复合体1悬浮在该溶液中的方法(固定有PS亲和性物质的不溶性载体的不溶性载体为珠的情况等)、使该复合体1浸渍在该溶液中的方法(固定有PS亲和性物质的不溶性载体的不溶性载体为盘状片、软管的情况等)、将该溶液添加到该复合体1中的方法(固定有PS亲和性物质的不溶性载体的不溶性载体为微孔板、软管的情况等)等进行。

作为与复合体1接触的含钙离子螯合剂的溶液的量，只要是与复合体1接触后的溶液中的钙离子的浓度低于有效浓度，使细胞外囊泡从复合体1分离的量即可。

作为使钙离子螯合剂作用(接触)于复合体1的温度或时间，通常为4.0℃～37℃，优选为10℃～30℃，更优选为20℃～30℃，且通常为1～0分钟，优选为5～15分钟。

若以使用Tim载体的方法为例说明本发明所涉及的获取工序，则如下所述。

即，进行复合体1形成工序及复合体1分离工序，根据需要进行清洗操作之后，在所获得的复合体1中，将通常0.5mM～500mM，优选为0.5mM～100mM，更优选为0.5mM～50mM的含有钙离子螯合剂的溶液，每1mgTim载体添加通常10μL～500μL，优选为20μL～200μLμL，更优选为50μL～100μLμL，一边使用涡流混合器等搅拌，一边通常在4.0℃～37℃，优选在10℃～30℃，更优选在20℃～30℃下通常反应1～30分钟，优选为5～15分钟，从复合体1分离细胞外囊泡(PS细胞外囊泡)。

通过实施(A-1-3)的获取工序，与复合体1接触/作用的含钙离子螯合剂的溶液含有固定有PS亲和性物质的不溶性载体和从固定有PS亲和性物质的不溶性载体(复合体1)分离(游离)的细胞外囊泡。因此，若从该溶液去除载体，仅回收溶液，则能够获得含有PS细胞外囊泡的溶液。

另外，在以上的(A-1)中通过PS亲和法获取细胞外囊泡的情况下，所获取的细胞外囊泡实质上是PS细胞外囊泡。

·关于(A-2)复合体2形成工序

工序(A-2)如下进行：使所述工序(A-1)中获得的细胞外囊泡、PS亲和性物质及对PSMA具有亲和性的抗体接触，形成PS亲和性物质、PS-PSMA细胞外囊泡及对PSMA具有亲和性的抗体的复合体复合体2。

(1)对PSMA具有亲和性的抗体

本发明所涉及的对PSMA具有亲和性的抗体(以下，有时简称为“抗PSMA抗体”。)只要是对PSMA具有亲和性，且具有与PSMA键合的性质的抗体即可，优选与PSMA特异性地键合的抗体。并且，抗PSMA抗体可以是单克隆抗体，也可以是多克隆抗体。优选单克隆抗体。可以是市售品，也可以是通过常规方法制备的物质。

并且，抗PSMA抗体也可以是抗体的Fab、Fab’、F(ab')2、Fv、Fd、单链Fv(scFv)、二硫键合的Fv(sdFv)、VL、VH、双体((VL-VH)2或者(VH-VL)2)、三体(三价抗体)、四体(四价抗体)、微型体((scFV-CH3)2)、IgG-delta-CH2、scFv-Fc、(scFv)2-Fc片段等。

并且，在制备这些抗体的情况下，可以按照例如“免疫测定法”(免疫化学测定研究会编，Kodansha Ltd.，2014年)等中记载的方法来进行。

抗PSMA抗体的来源没有特别限定，例如可举出源自兔、大鼠、小鼠、绵羊、山羊、马等的具有上述性质的抗体。

复合体2形成工序中使用的抗PSMA抗体可以是固定在不溶性载体上的抗体，也可以是用标记物质等标记的抗体，优选用标记物质等标记的抗体。例如在使用用标记物质标记的抗PSMA抗体(标记抗PSMA抗体)的情况下，可以测定标记抗PSMA抗体的标记物质量，根据其量决定复合体2的量。

作为将抗PSMA抗体固定在不溶性载体上的方法及使用的不溶性载体的例子，可以使用在该领域中通常使用的不溶性载体，按照将抗体固定在该不溶性载体上的常规方法进行固定。

作为用于标记抗PSMA抗体的标记物质，可举出例如在通常的免疫测定法等中使用的碱性磷酸酶、过氧化物酶(POD)、微过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、乙酰胆碱酯酶、苹果酸脱氢酶、荧光素酶等酶类；例如放射免疫测定法(Radioimmunoassay，RIA)中使用的99mTc、131I、125I、14C、3H、32P、35S等放射性同位素；例如荧光免疫测定法(Fluoroimmunoassay，FIA)中使用的荧光素、丹磺酰、荧光胺、香豆素、萘胺、异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、罗丹明X异硫氰酸酯、磺胺101、荧光黄、吖啶、吖啶异硫氰酸酯、核黄素或者它们的衍生物等荧光性物质；例如荧光素(luciferin)、异鲁米诺、鲁米诺、双(2,4,6-三氟苯基)草酸盐等发光性物质；例如苯酚、萘酚、蒽或者它们的衍生物等在紫外部具有吸收的物质；例如4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基、3-氨基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷-1-氧基、2,6-二叔丁基-α-(3,5-二叔丁基-4-氧代-2,5-环己二烯-1-亚基)-对甲苯氧基等以具有氧基的化合物为代表的具有作为自旋标记剂的性质的物质等标记物质；例如HiLyte Fluor 647、HiLyte Fluor 488、HiLyte Fluor 555、HiLyte Fluor 680、HiLyteFluor 750等HiLyte系色素〔均为HiLyte Bioscience,Inc.商品名〕；例如Alexa Fluor Dye350、Alexa Fluor Dye 430、Alexa Fluor Dye 488、Alexa Fluor Dye 532、Alexa FluorDye 546、Alexa Fluor Dye 555、Alexa Fluor Dye 568、Alexa Fluor Dye 594、AlexaFluor Dye 633、Alexa Fluor Dye 647、Alexa Fluor Dye 660、Alexa Fluor Dye 680、Alexa Fluor Dye 700、Alexa Fluor Dye 750等Alexa系色素〔均为Molecular Probes,Inc.商品名〕；例如Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7等CyDye系色素〔均为Amersham BiosciencesK.K.商品名〕；例如考马斯亮蓝R250、甲基橙等色素等通常在该领域中使用的所有标记物质。其中，优选过氧化物酶，微过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，乙酰胆碱酯酶，苹果酸脱氢酶，荧光素酶等酶类，更优选碱性磷酸酶或过氧化物酶。

为了使如上所述的标记物质与抗PSMA抗体键合(进行标记)，可以适当利用例如本身公知的EIA、RIA、FIA等免疫测定法等中通常进行的本身公知的标记方法。

例如，可以适当利用以下进行：酶标记法，p.62，石川荣治著，学会出版中心，1991年；医化学实验讲座，第8卷，山村雄一主编，第1版，中山书店，1971；图解说明荧光抗体，川生明著，第1版，SoftScience公司，1983年；酶免疫测定法，石川荣治，河合忠，室井洁编，第2版，医学书院，1982年等；分子克隆实验指南第二版，J.萨姆布鲁克，E.F.弗里奇，T.曼尼阿蒂斯著，冷泉港实验室出版社等中记载的方法或利用亲和素(或链霉亲和素)与生物素的反应的常规方法等。

也可以使用使如上所述的标记物质与蛋白质键合(进行标记)的市售的试剂盒，按照试剂盒附带的使用说明书进行抗PSMA抗体的标记。

并且，在进行高效液相色谱、毛细管电泳法、毛细管芯片电泳法的情况下，为了更明确地将抗原抗体复合物与游离的标记抗PSMA抗体分离，可以键合例如DNA、RNA等核酸等的分离提高物质(日本专利第3070418号、日本专利第3531372号等)。

(2)细胞外囊泡

复合体2形成工序所涉及的工序(A-1)中获得的细胞外囊泡具有实质上仅含有PS细胞外囊泡的情况及含有PS细胞外囊泡和不具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡这两者的情况。在工序(A-1)中，通过PS亲和法获得的细胞外囊泡实质上仅为PS细胞外囊泡，因此优选。

在以下与复合体2形成工序有关的说明中，只要没有特别记载，则在记载为“(A-1)中获得的细胞外囊泡”或“细胞外囊泡”的情况下，包括上述两种细胞外囊泡的情况。

(3)PS亲和性物质

复合体2形成工序中使用的PS亲和性物质如前述＜3.对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质＞项中所记载。具体例、优选例等也相同，优选Tim蛋白质。更优选Tim4。

另外，本发明所涉及的PS亲和性物质可以是固定在不溶性载体上的物质，也可以是用标记物质标记的物质，在使用复合体2形成工序中标记的抗PSMA抗体的情况下，需要将游离的标记抗PSMA抗体与复合体2分离。在该情况下，上述PS亲和性物质优选固定在不溶性载体上。这样一来，在形成复合体2之后，游离的标记抗PSMA抗体与复合体2能够通过公知的B/F分离法分离。

标记PS亲和性物质的方法及其中使用的标记物质等的具体例基于标记上述抗PSMA抗体的方法及标记物质的具体例等。

“(A-2)复合体2形成工序”中使用的不溶性载体优选粒子(珠)或微孔板，在粒子的情况下，其大小没有特别限定，通常为10nm～100μm，优选可举出100nm～10μm。并且，在微孔板的情况下，其孔的数量、大小没有特别限定，通常可举出12孔～1536孔，优选96孔～384孔。

将PS亲和性物质固定在不溶性载体上的方法及其优选的具体例如前述(A-1-1)的复合体1形成工序的“将PS亲和性物质固定在不溶性载体上的方法”项中所记载。具体例、优选例等也相同，优选将Tim蛋白质固定在不溶性载体上的Tim载体。更优选将Tim4固定在不溶性载体上的Tim4载体。

(4)复合体2形成工序

在复合体2形成工序中，在使工序(A-1)中获得的细胞外囊泡与Tim蛋白质接触的情况下，在钙离子的存在下进行。其溶液中的钙离子浓度通常为0.5mM～100mM，优选为1mM～50mM，更优选为2mM～50mM。另外，在形成本发明所涉及的复合体2，直至用于测定复合体2的量的工序的含有该复合体2的溶液中，需要所述浓度的钙离子。

并且，钙离子的来源没有特别限定，可举出与所述工序(A-1-1)中的钙离子的来源相同的具体例。

作为在钙离子的存在下使工序(A-1)中获得的细胞外囊泡与PS亲和性物质接触的方法的例子，可举出以使该细胞外囊泡与PS亲和性物质接触时的钙离子浓度在上述范围内的方式，将含有钙离子的溶液、含有该细胞外囊泡的溶液及含有PS亲和性物质的溶液混合的方法。

在所述含有钙离子的溶液中，使钙离子溶解的溶液及其添加剂的例子如所述工序(A-1)的“(2)复合体1形成工序”项中所记载，具体例、优选例等也相同。

使工序(A-1)中获得的细胞外囊泡、PS亲和性物质及抗PSMA抗体接触的顺序可以同时，也可以不同，但优选使该细胞外囊泡与PS亲和性物质接触之后，与抗PSMA抗体接触。

(4-1)细胞外囊泡与PS亲和性物质的反应

关于与PS亲和性物质反应的，工序(A-1)中获得的含有细胞外囊泡的溶液的量，在PS亲和性物质固定在珠上的情况下，相对于该载体1mg通常为0.1mL～1000mL，优选为0.1mL～500mL，更优选为0.1mL～100mL，在PS亲和性物质固定在微孔板上的情况下，相对于1孔，通常为50μL～300μL，优选为50μL～200μL，更优选为50μL～150μL。

使细胞外囊泡与PS亲和性物质接触时的温度通常为2～37℃，优选为2～30℃。并且，作为细胞外囊泡与PS亲和性物质的接触时间，通常为0.5～24小时，优选为0.5～20小时，更优选为0.5～12小时。

作为使细胞外囊泡与PS亲和性物质接触的方法的例子，以下以使用固定在不溶性载体上的Tim蛋白质(Tim载体)作为PS亲和性物质的情况为例进行说明。

在使用珠作为Tim载体的不溶性载体的情况下，使每1mgTim载体通常0.1～1000ml，优选为0.1～500ml，更优选为0.1～100ml的量的工序(A-1)中获得的含有细胞外囊泡的溶液、将工序(A-1)中获得的含有细胞外囊泡的溶液、Tim载体及本发明所涉及的含有钙离子的溶液混合后的每1mL溶液成为通常0.001～20mg，优选为0.005～10mg，更优选为0.01～6.0mg的量的Tim载体、及将含有该细胞外囊泡的溶液、Tim载体及本发明所涉及的含有钙离子的溶液混合后的溶液中的钙离子浓度成为通常0.5～100mM，优选为1.0～10mM，更优选为2.0～5.0mM的量的含有钙离子的溶液接触。通常在2～37℃，优选在2～30℃下通常接触0.5～24小时，优选为1～20小时，更优选为1～12小时，形成PS细胞外囊泡和固定在珠载体上的Tim蛋白质的复合体。

在使用微孔板作为Tim载体的不溶性载体的情况下，向固定有Tim蛋白质的微孔板的各孔中添加每1孔通常50μL～300μL，优选为100μL～200μL的，使Tim载体与工序(A-1)中获得的含有细胞外囊泡的溶液接触时的溶液中的钙离子浓度成为通常0.5～100mM，优选为1.0～50mM，更优选为2.0～50mM的量的本发明所涉及的含有钙离子的溶液和工序(A-1)中获得的含有该细胞外囊泡的溶液，通常在2℃～37℃，优选在2℃～30℃下通常反应0.5～24小时，优选为0.5～20小时，更优选为0.5～12小时，由此形成PS细胞外囊泡和固定在微孔板载体上的Tim蛋白质的复合体。

(4-2)复合体2形成：PS细胞外囊泡和PS亲和性物质的复合体与抗PSMA抗体的反应

在获得PS细胞外囊泡和PS亲和性物质的复合体之后，使所获得的该复合体与抗PSMA抗体接触并反应，由此获得复合体2。

在复合体2形成工序中使用的抗PSMA抗体的使用浓度可以从通常免疫学测定中的该领域中使用的浓度范围适当选择。

与PS细胞外囊泡和PS亲和性物质的复合体反应的抗PSMA抗体的稀释倍率根据抗体的活性或浓度而不同，通常为10倍～1000000倍，优选为1000倍～100000倍。

作为抗PSMA抗体的稀释液，除了含有钙离子的以外，只要是不妨碍PS亲和性物质和PS细胞外囊泡的复合体与抗PSMA抗体的键合的物质即可，例如可举出水、对pH7.0～8.0，优选对7.2～7.6具有缓冲作用的缓冲液(例如TBS、HBS等)等。另外，磷酸缓冲液与钙键合而产生沉淀，因此不优选。并且，作为这些缓冲液中的缓冲剂浓度，通常从5～50mM，优选从10～30mM的范围适当选择，NaCl浓度通常从100～200mM，优选从140～160mM的范围适当选择。只要是不妨碍PS亲和性物质和PS细胞外囊泡的复合体与抗PSMA抗体的键合的量，则该溶液中也可以含有例如糖类、NaCl等盐类、表面活性剂、防腐剂、BSA等蛋白质等。作为表面活性剂，例如可举出Tween20等，该溶液中的表面活性剂的浓度通常为0.00001～0.2％，优选为通常0.0005～0.1％。并且，该稀释液的含钙离子的浓度通常为0.5～100mM，优选为通常1～10mM，更优选为通常2～5mM。

关于与PS细胞外囊泡和PS亲和性物质的复合体反应的抗PSMA抗体溶液的量，在PS亲和性物质固定在珠上的情况下，相对于该载体1mg通常为0.1mL～1000mL，优选为0.1mL～500mL，更优选为0.1mL～100mL，在PS亲和性物质固定在微孔板上的情况下，相对于1孔，通常为50μL～300μL，优选为50μL～200μL，更优选为50μL～150μL。

使PS细胞外囊泡和PS亲和性物质的复合体与抗PSMA抗体接触时的温度通常为2～37℃，优选为10～37℃，更优选为20～30℃。并且，抗PSMA抗体与该复合体的反应时间通常为0.5～12小时，优选为1～4小时，更优选为1～2小时。

也可以在复合体2形成工序之后，进行(A-3)的测定工序之前，进行从反应液分离作为复合体2形成工序中获得的[固定在不溶性载体上的PS亲和性物质、PS-PSMA细胞外囊泡及标记抗PSMA抗体的复合体]的复合体2的工序。

该复合体2分离工序只要能够将复合体2与反应液分离，换言之，能够进行所谓的B/F分离，则可以是任何方法，能够使用在该领域中使用的B/F分离法。具体而言，可以是与工序(A-1-3)的获取方法中的复合体1分离工序相同的方法。

(5)清洗操作

在本发明所涉及的(A-2)的各工序之间适当进行清洗操作是任意的。但是，该清洗操作在钙离子的存在下进行。例如，可以使用所述(A-1-2)的复合体1分离工序项中记载的“含钙离子的清洗溶液”进行通常的清洗操作。

·关于(A-3)测定工序

(A-3)的测定工序是“通过测定工序(A-2)中获得的复合体2的量来测定PS-PSMA细胞外囊泡的量的工序”。

作为测定本发明所涉及的复合体2的量的方法，例如可举出酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)、酶键合免疫吸附测定法(ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、利用简易免疫色谱的测定法、高效液相色谱(HPLC)、电泳法、毛细管电泳法、毛细管芯片电泳法、质量分析法、免疫比瘘法、免疫比浊法等。其中，优选酶免疫测定法(EIA)或酶键合免疫吸附测定法(ELISA)，更优选酶键合免疫吸附测定法(ELISA)。

作为这些测定原理，例如可举出夹心法、竞争法、二抗体法等，优选夹心法。并且，能够通过使用不溶性载体等进行B/F分离的异质方法进行测定，也能够通过不进行B/F分离的同质方法进行测定。

在工序(A-2)中使用标记抗PSMA抗体，测定所生成的[PS亲和性物质、PS-PSMA细胞外囊泡及标记抗PSMA抗体的复合体2]的量的情况下，只要测定该复合体2中的源自标记抗PSMA抗体的标记量即可。该方法根据标记物质的种类而不同，可以根据标记物质所具有的性质，分别按照规定的方法实施。

例如，在标记物质为酶的情况下，可以按照免疫测定法的常规方法，例如“酶免疫测定法”(蛋白质核酸酶附册No.31，北川常广·南原利夫·辻章夫·石川荣治编辑，51～63,KYORITSU SHUPPAN CO.,LTD.、1987)等中记载的方法进行测定。

在标记物质为放射性物质的情况下，例如可以按照RIA中进行的常规方法，根据该放射性物质发出的放射线的种类及强度，适当选择并使用液浸型GM计数器、液体闪烁计数器、井型闪烁计数器、HPLC用计数器等测定设备，进行测定(例如参考医化学实验讲座，第8卷，山村雄一主编，第1版，中山书店，1971等)。

在标记物质为荧光性物质的情况下，可以按照例如使用荧光光度计等测定设备的FIA中进行的常规方法，例如“图解说明荧光抗体，川生明著，第1版，SoftScience公司，1983”等中记载的方法进行测定。

在标记物质为发光性物质的情况下，可以使用EnVision(PerkinElmer Co.,Ltd.制造)等酶标仪、光计数器等测定设备，通过与各测定设备对应的测定方法进行测定。

在标记物质为在紫外部具有吸收的物质的情况下，可以通过使用分光光度计等测定设备的常规方法进行测定。在标记物质具有自旋性质的情况下，可以按照使用电子自旋共振装置的常规方法，例如“酶免疫测定法”(蛋白质核酸酶附册No.31，北川常广·南原利夫·辻章夫·石川荣治编辑，264～271，KYORITSU SHUPPAN CO.,LTD.，1987)等中记载的方法分别进行测定。

在标记物质为酶的情况下，可举出使其与显色试剂反应而导入显色反应，并通过分光光度计等测定其结果生成的色素量的方法等本身公知的方法。另外，为了使显色反应停止，也可以利用例如在反应液中添加1～6N的硫酸等酶活性抑制剂或试剂盒附带的反应停止剂等通常在该领域中进行的反应停止方法。

作为上述显色试剂，例如在使用碱性磷酸酶作为标记物的情况下，可举出CDP-Star^TM(Tropix,Inc.商品名、2-氯-5-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2’-(5-氯三环[3.3.1.1^3.7]癸烷])-4-基]-1-苯基磷酸二钠)、AMPPD、CSPD等碱性磷酸酶的二氧杂环丁烷系化学发光基质等。在使用过氧化物酶作为标记物质的情况下，可举出四甲基联苯胺(TMB)溶液或邻苯二胺(OPD)溶液，优选可举出TMB溶液。此外，可举出3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMBZ)、邻苯二胺、邻硝基苯基-β-D-半乳糖苷、2,2’-联氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、N-乙基-N-磺丙基间茴香胺(ADPS)、磷酸对硝基苯酯等通常在该领域中使用的显色试剂。

本发明所涉及的PS-PSMA细胞外囊泡的量的测定方法中使用的试剂及其测定时的浓度、实施测定时的测定条件等(反应温度、反应时间、反应时的pH、测定波长、测定装置等)可以全部按照本身公知的如上所述的免疫学测定法的测定操作法选择。

工序(A-3)的测定工序并不限于手工法，也可以通过使用自动分析装置的测定系统进行。另外，对于使用手工法或自动分析装置进行测定时的试剂类等的组合等，没有特别限制，可以根据适用的自动分析装置的环境、机种，或者考虑其他要因，适当选择使用认为最好的试剂类等的组合。

作为本发明所涉及的PS-PSMA细胞外囊泡的量的测定方法的具体例，以下记载使用固定在不溶性载体上的PS亲和性物质和用碱性磷酸酶(ALP)标记的抗PSMA抗体测定试样中的PS-PSMA细胞外囊泡的量时的方法。

例如，在使用固定在微孔板上的PS亲和性物质通过ELISA法进行的情况下，在形成PS细胞外囊泡和固定在微孔板上的PS亲和性物质的复合体之后，根据需要进一步进行清洗操作之后，向对该微孔板的各孔中添加每1孔通常50μL～300μL，优选为50μL～200μL，更优选为50μL～100μL的，将ALP标记抗PSMA抗体用通常0.5～100mM，优选为通常1～50mM，更优选为通常2～50mM的含有钙离子的抗PSMA抗体的稀释液稀释通常10倍～1000000倍，优选为1000倍～100000倍的稀释溶液，使其通常在2～37℃，优选在10～37℃下反应0.5～12小时，优选为1～4小时。

接着，使用含钙离子的清洗用溶液清洗各孔。

而且，向各孔添加每1孔通常50μL～300μL，优选为50μL～200μL，更优选为50μL～100μL的CDP-Star Substance with Emerald II Enhancer(Thermo Fisher ScientificK.K.制造)等ALP酶反应基质溶液，通常在2℃～37℃，优选在20℃～30℃下反应5分钟～60分钟，优选为10分钟～40分钟。然后，使用EnVision(PerkinElmer Co.,Ltd.制造)等酶标仪等测定设备测定化学发光信号即可。

使用所获得的测定值，接着进行转移性PSMA的判定工序即可。

＜关于(B)本发明所涉及的判定工序＞

本发明所涉及的判定工序是通过本发明所涉及的测定工序测定PS-PSMA细胞外囊泡的量，根据所获得的测定结果判定受检者是否罹患转移性CRPC的工序。

即，通过上述“关于(A)本发明所涉及的测定工序”项中记载的方法测定源自受检者的生物试样中的PS-PSMA细胞外囊泡的量，根据其结果，获得用于判定转移性CRPC的与PS-PSMA细胞外囊泡有关的数据(例如PS-PSMA细胞外囊泡的存在与否、浓度、量的增加程度等信息)。使用所获得的数据，例如通过下述方法进行转移性CRPC的判定(诊断/检查)。

例如在预先设定基准值(截止值)，PS-PSMA细胞外囊泡的测定结果(测定值)为该基准值以上的情况下，提供试样的受检者能够做出有可能罹患转移性CRPC、罹患转移性CRPC的可能性高、有可能转移到转移性CRPC、转移到转移性CRPC的可能性高等。

可以使用源自转移性CRPC患者、转移性CRPC以外的前列腺疾病(非转移性CRPC、CRPC以外的前列腺癌或前列腺肥大症)患者或健康人的试样，通过上述测定方法测定试样中的PS-PSMA细胞外囊泡的量，基于该值的边界值等设定所述基准值(截止值)。也可以将转移性CRPC疾病以外的前列腺疾病(非转移性CRPC、CRPC以外的前列腺癌或前列腺肥大症)患者或健康人的PS-PSMA细胞外囊泡的量的平均值设定为基准值。

并且，能够利用使用源自罹患转移性CRPC的受检者的试样通过本发明所涉及的测定工序获得的测定值和使用源自转移性CRPC以外的前列腺疾病(非转移性CRPC、CRPC以外的前列腺癌或前列腺肥大症)患者或健康人的试样通过本发明所涉及的测定工序获得的值(以下，有时简称为源自健康人的值)根据ROC(Receiver Operating Characteristic：接收器操作特征)曲线分析等统计分析来决定上述基准值(截止值)。

并且，上述基准值(截止值等)的灵敏度或特异性例如为60％以上，优选为70％以上，更优选为80％以上，进一步优选为90％以上。

作为另一方式，可举出与该受检体中的PS-PSMA细胞外囊泡的量或其量的范围(测定值或测定值的范围)对应地设定多个判定区分来进行判定的方法。例如，设定[(1)不存在非转移性CRPC的可能性，(2)非转移性CRPC的可能性低，(3)存在非转移性CRPC的征兆，(4)非转移性CRPC的可能性高等]的判定区分。并且，通过判定源自受检者的生物试样中的PS-PSMA细胞外囊泡的量的测定结果进入哪个判定区分，能够做出非转移性CRPC的判定。

作为又一方式，在相同受检者中，将在某一时刻测定的源自受检者的生物试样中的PS-PSMA细胞外囊泡的测定结果与在不同的时刻测定的源自受检者的生物试样中的PS-PSMA细胞外囊泡的测定结果进行比较，评价测定结果(测定值)的增减和/或增减的程度，由此也能够进行判定。例如，在确认到测定结果(测定值)的增加的情况下，能够判定提供试样的受检者的病情有可能已经进展为转移性CRPC等。

在通过本发明的辅助转移性CRPC的判定的方法判定作为受检者的患者有可能罹患转移性CRPC或其可能性高的情况下，能够进一步选择进行病理组织检查等侵袭性检查或包括使用造影剂、核种、小分子化合物、抗体等中的任一个或其组合的各种图像检查等。并且，能够选择进行治疗法的变更。

另一方面，在通过本发明的辅助方法判定作为受检者的患者有可能没有罹患转移性CRPC或罹患的可能性低的情况下，能够选择相同的治疗的继续或局部治疗的追加或治疗的停止这样的治疗方针。

＜5.本发明的转移性CRPC的诊断辅助用检查试剂盒＞

本发明的转移性CRPC的诊断辅助用检查试剂盒(以下，有时简称为“本发明的试剂盒”。)是含有用于测定PS-PSMA细胞外囊泡的PS亲和性物质及抗PSMA抗体作为构成要件。PS亲和性物质及抗PSMA抗体也可以分别为溶液状态、冻结状态、干燥状态或冻结干燥状态。

上述“PS亲和性物质”也可以是与不溶性载体键合的物质。关于PS亲和性物质及与不溶性载体键合的PS亲和性物质，如上述＜3.对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质＞项中所说明，具体例、不溶性载体及与不溶性载体的键合方法、及这些优选例等也相同。

并且，“抗PSMA抗体”也可以是“标记抗PSA抗体”。关于抗PSMA抗体及标记抗PSMA抗体，如上述＜4.辅助诊断转移性CRPC的方法＞的“(A-2),(2)对PSMA具有亲和性的抗体〕项中所记载，具体例、标记物质及标记方法、及这些优选例等也相同。

本发明的试剂盒还可以含有固定有用于获取PS细胞外囊泡的PS亲和性物质的不溶性载体作为构成要件。关于PS亲和性物质及与不溶性载体键合的PS亲和性物质，如上述＜3.对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质＞项中所说明，具体例、不溶性载体及与不溶性载体的键合方法、及这些优选例等也相同。

而且，本发明的试剂盒中也可以含有选自所述含有钙离子的溶液、含钙离子的清洗溶液及含钙离子螯合剂的溶液中的至少一种。关于各构成要件的具体例、优选的方式等，如上所述。

作为本发明的试剂盒的具体例，可举出用于测定PS-PSMA细胞外囊泡的含有下述任意构成要件的试剂盒(称为试剂盒A。)。

·固定有PS亲和性物质的固相板及用标记物质标记的抗PSMA抗体

·用标记物质标记的PS亲和性物质及固定有抗PSMA抗体的固相板

作为本发明的试剂盒的另一具体例，可举出含有用于获取PS-PSMA细胞外囊泡的选自下述的构成要件的试剂盒(称为试剂盒B。)。

·固定有PS亲和性物质的珠载体(用于从生物试样中获取PS细胞外囊泡的试剂)

·含有钙离子的溶液

·含钙离子的清洗溶液

·钙离子螯合剂

作为本发明的试剂盒的又一具体例，可举出包含上述试剂盒A和上述试剂盒B的试剂盒。

作为本发明的试剂盒的优选的具体例，例如可举出包含下述(1)或(2)的构成要件的试剂盒。

(1)固定有PS亲和性物质的固相板及用标记物质标记的抗PSMA抗体、或用标记物质标记的PS亲和性物质及固定有抗PSMA抗体的固相板；

(2)·固定有PS亲和性物质的固相板及用标记物质标记的抗PSMA抗体、或用标记物质标记的PS亲和性物质及固定有抗PSMA抗体的固相板；

·固定有用于获取PS-PSMA细胞外囊泡的PS亲和性物质的珠载体。

对于上述各试剂盒的构成要件，如上所述，其具体例及优选例等也相同。

并且，这些试剂盒中所含的试剂中也可以具有通常在该领域中使用的试剂类，例如缓冲剂、敏化剂、表面活性剂、防腐剂(例如叠氮化钠、水杨酸、苯甲酸等)、稳定化剂(例如白蛋白、球蛋白、水溶性明胶、表面活性剂、糖类等)、活化剂、避免共存物质影响的试剂、标记物质检测用试剂等其他在该领域中使用的试剂，且不阻碍与共存的试剂之间的稳定性，或不阻碍PS亲和性物质与细胞外囊泡的反应或键合、及抗PSMA抗体与细胞外囊泡的反应或键合的试剂。并且，这些试剂类等的浓度范围、pH等也可以适当选择为了发挥各试剂类所具有的效果而通常使用的浓度范围及pH等来使用。

上述标记物质检测用试剂是指在用标记物质标记抗PSMA抗体时检测该标记的试剂，可根据标记物质的种类适当选择。例如，可举出四甲基联苯胺、邻苯二胺等吸光度测定用基质、羟苯基丙酸、羟苯基乙酸等荧光基质、CDP-Star^TM、鲁米诺等发光物质、磷酸4-硝基苯酯等吸光度测定用试剂、4-甲基伞形酮磷酸酯等荧光基质等。

并且，本发明的试剂盒中还可以包括用于进行本发明的辅助方法的说明书等。该“说明书”是指通过文章或/及图表实质上记载有本发明的辅助方法的特征、原理、操作步骤、判定步骤等的本发明的试剂盒中所包含的试剂类的使用说明书、添加文本、小册子(传单)等。具体而言，例如可举出(i)记载有本发明所涉及的测定工序的原理、操作步骤等的说明书、(ii)记载有本发明所涉及的测定工序及判定工序的原理、操作步骤等的说明书等。

使用本发明的试剂盒，能够简便、短时间且精确地进行本发明的辅助方法。

＜6.用于辅助诊断本发明的转移性CRPC的本发明的生物标记＞

用于辅助诊断转移性CRPC的本发明的生物标记是在其膜表面具有磷脂酰丝氨酸及PSMA的细胞外囊泡(PS-PSMA细胞外囊泡)。该细胞外囊泡的详细情况如所述“＜1.本发明所涉及的细胞外囊泡＞”栏中所记载。

＜7.本发明所涉及的转移性CRPC的诊断辅助用装置＞

本发明所涉及的转移性CRPC的诊断辅助用装置(以下，简称为“本发明所涉及的辅助用装置”。)至少具备(1)测定部。而且，还可以具备(2)判定部、(3)输出部及(4)输入部的一个以上。

本发明所涉及的辅助用装置中的测定部构成为测定源自受检者的生物试样中的上述本发明的生物标记即PS-PSMA细胞外囊泡的量。具体而言，例如可举出在按照免疫学测定法的方法中使用的装置等测定装置。

另外，根据需要，也可以构成为，在测定部中，根据所测定的测定值，计算上述本发明的生物标记的量。

本发明所涉及的辅助用装置中的判定部构成为判定通过测定部中的测定获得的测定值是否为基准值以上。

或，本发明所涉及的辅助用装置中的判定部构成为，以对由测定部获得的源自受检者的生物试样中的PS-PSMA细胞外囊泡的量进行测定的测定部及所述PS-PSMA细胞外囊泡的量为指标，判定受检者是否罹患转移性CRPC。

例如，也可以构成为，将由测定部测定的测定值与预先设定的基准值(截止值)进行比较，判定是否为该基准值以上，或是否小于该基准值。

本发明所涉及的辅助用装置中的输出部构成为输出由测定部获得的结果或/及由判定部获得的结果。

本发明所涉及的辅助用装置中的输入部构成为接受操作者的操作，向测定部发送用于使该测定部工作的信号。

构成本发明所涉及的辅助用装置的上述(1)～(4)的装置可以配置在相同的装置内，也可以分别配置。

在本发明所涉及的辅助用装置中，关于该辅助用装置所涉及的源自受检者、活体的试样、PS-PSMA细胞外囊泡如上所述，其具体例及优选例等也相同。

关于本发明所涉及的辅助用装置的测定部及由判定部进行的测定、判定等如＜4.辅助诊断转移性CRPC的方法＞中所说明，优选例、具体例等也相同。

使用上述本发明所涉及的辅助用装置，能够简便、短时间且精确地进行本发明的辅助方法。

＜8.本发明所涉及的治疗转移性CRPC的方法＞

本发明所涉及的治疗转移性CRPC的方法(以下，简称为“本发明所涉及的治疗方法”。)如下进行：测定源自受检者的生物试样中的本发明的生物标记的量，根据所获得的测定结果，判定受检者是否罹患转移性CRPC，根据其判定结果，对判定为存在转移性CRPC的可能性或转移性CRPC的可能性高的患者实施适当的治疗。

另外，对于本发明所涉及的治疗方法中的源自受检者的生物试样、标记、测定、判定等，如所述＜4.辅助诊断转移性CRPC的方法＞项中所说明，优选例、具体例等也相同。

作为本发明所涉及的治疗方法中的适当的治疗，具体而言，例如可举出外科治疗、放射线疗法(包括外照射、内照射、核种的体内给药)、抗癌化学疗法(多西他赛、卡巴他赛等)、雄激素去除疗法(亮丙瑞林、戈瑟瑞林、地加瑞克等)、抗雄激素疗法(雄激素受体抑制药：比卡鲁胺、氟他胺、阿帕他胺、恩杂鲁胺等；雄激素産生抑制药：阿比特龙、雌激素：雌莫司汀、乙炔雌二醇等)、利用其他药剂的治疗法(免疫检查点抑制药：派姆单抗等、分子靶向药等)等。

以下举出实施例及比较例对本发明进一步详细地进行说明，但本发明并不限定于这些实施例等。

实施例

实施例1.PSMA-细胞外囊泡的测定

(1)Tim4固定化珠的获取

向每1受检体分取75μg的Dynabeads MyOne Streptavidin C1(Thermo FisherScientific K.K.制造)的1.5mL软管中，添加每1受检体含有125ng的Tim4蛋白质(FUJIFILMWako Pure Chemical Corporation制造)的TBS-T溶液(Tris buffer，0.01％Tween20)，使其在室温下反应1小时之后，用含0.1％BSA的TBS-T溶液清洗5次，获得了键合有Tim4蛋白质的珠(Tim4珠)。

(2)试样的制备

使用Tim4珠，通过下述方法制备含有在膜表面具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡(PS细胞外囊泡)的试样。

向上述(1)中获得的Tim4珠中添加每1受检体50μL的以终浓度成为4mM的方式添加CaCl₂的含2％BSA的TBS(Tris buffer)，并使其悬浮。将所获得的Tim4珠悬浮液以每1孔50μL(每1孔Tim4珠75μg，作为Tim4为125ng)的方式分注到96孔的聚丙烯板中。

将源自确认有转移的CRPC患者(转移性CRPC患者，n＝12)、未确认到转移的CRPC患者(非转移性CRPC患者，n＝2)、确认不是CRPC的前列腺癌患者(n＝70)、前列腺肥大症患者(n＝24)或健康人(n＝10)的血清各50μL添加到分注Tim4珠悬浮液的96孔板的孔中，在室温下一边搅拌一边使其反应1小时。

反应后，将96孔板设置在96孔板用磁铁支架上，使用磁力使Tim4珠集合到管壁上，去除反应液。然后，用含2mM的CaCl₂的TBS-T200μL对各孔进行5次清洗操作。

向清洗后的Tim4珠中添加50μL的含2mM的EDTA的TBS作为溶出液之后，在室温下搅拌10分钟。然后，将96孔板设置在96孔板用磁铁支架上，使用磁力使Tim4珠集合到管壁上，回收上清液(溶出液)。

将所获得的上清液用作试样。该试样含有在膜表面具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡(PS细胞外囊泡)。

(3)利用ELISA的细胞外囊泡的测定

通过下述1)～3)的方法，测定了试样中的具有磷脂酰丝氨酸及PSMA的细胞外囊泡(PS-PSMA细胞外囊泡)的量。

1)Tim4板的获取

在白色MaxiSorp96孔板(Thermo Fisher Scientific K.K.制造)中，每1孔分注100μL的1.25μg/mL Tim4(50mM碳酸缓冲液pH9.6)。在4℃下静置一晚之后，用TBS-T(Trsbuffer)400μL清洗3次。

2)碱性磷酸酶(ALP)标记抗PSMA抗体的获取

使用ALP标记试剂盒-SH(Dojin Chemical Co.,Ltd.制造)，按照试剂盒附带的使用说明书，对PSMA抗体(Miltenyi Biotec K.K.制造)进行ALP标记。

3)ELISA

在上述1)中获得的Tim4板中，每1孔添加200μL含1％BSA的TBS，一边搅拌一边在室温下封闭1小时。然后，用TBS-T400μL将孔清洗3次之后，每1孔分注50μL以终浓度成为40mM的方式添加CaCl₂的含2％BSA的TBS。向其中添加上述(2)中制备的试样，一边搅拌一边在室温下使其反应1小时。反应后，用含2mM的CaCl₂的TBS-T400μL将各孔清洗5次。

清洗后，每1孔添加0.25μg/mL(含1％BSA的TBS、含2mM的CaCl₂)上述2)中获得的ALP标记抗PSMA抗体100μL，一边搅拌一边在室温下使其反应1小时。然后，用2mM的CaCl₂TBS-T400μL将各孔清洗5次。

清洗后，每1孔添加50μLCDP-Star Substance with Emerald-II Enhancer(Thermo Fisher Scientific K.K.制造)，一边搅拌一边反应30分钟后，使用EnVision(PerkinElmer Co.,Ltd.制造)测定了化学发光信号。

4)结果

将结果示于图1。在图1中，选择测定值在转移性CRPC患者的测定值的平均值附近的CRPC患者5受检体，将其平均值设为1，分别显示源自各疾病患者或健康人的试样的测定值相对于该值的相对值。

由图1可知，转移性CRPC患者的PS-PSMA细胞外囊泡的量(有CRPC转移)与非转移性CRPC患者(无CRPC转移)、确认不是CRPC的前列腺癌患者(PC)、前列腺肥大症患者(BPH)及健康人(正常)中的任一个相比，显著高。

由以上可知，PS-PSMA细胞外囊泡的量成为用于判定转移性CRPC的标记；及通过测定PS-PSMA细胞外囊泡的量，能够判定转移性CRPC。

比较例1.与以往技术的比较

将与实施例1中使用的相同受检体中前列腺肥大症患者(n＝8)、确认不是CRPC的前列腺癌患者(n＝8)、及CRPC患者(转移性RPC患者及非转移性CRPC患者)(n＝8)、及健康人(n＝10)的血清作为试样使用，通过与实施例1的“(2)试样的制备”相同的方法制备含有在膜表面具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡(PS细胞外囊泡)的试样，通过以下方法测定了试样中的PS-PSMA细胞外囊泡的量的浓度。

(1)试剂类的制备

1)抗PSMA抗体固定化板的获取

在白色MaxiSorp96孔板(Thermo Fisher Scientific K.K.制造)中，每1孔分注100μL的稀释成50mM碳酸缓冲液pH9.6的1.25μg/mL抗PSMA抗体(Miltenyi Biotec K.K.制造)。在4℃下静置一晚之后，用TBS-T400μL清洗3次。

2)抗CD9抗体固定化板的获取

在白色MaxiSorp96孔板(Thermo Fisher Scientific K.K.制造)中，每1孔分注100μL的稀释成50mM碳酸缓冲液pH9.6的1.25μg/mL抗CD9抗体(BioLegend,Inc.制造)。在4℃下静置一晚之后，用TBS-T400μL清洗3次。

3)ALP标记抗CD9抗体的获取

将CD9抗体(BioLegend,Inc.制造)通过ALP标记试剂盒-SH(Dojin Chemical Co.,Ltd.制造)按照使用说明书进行ALP标记。

4)ALP标记抗PSMA抗体的获取

将PSMA抗体(Miltenyi Biotec K.K.制造)通过ALP标记试剂盒-SH(DojinChemical Co.,Ltd.制造)按照使用说明书进行ALP标记。

(2)PS-PSMA细胞外囊泡的测定

1)固定化抗PSMA抗体-标记抗CD9抗体的测定系统

在上述(1)1)中获得的抗PSMA抗体固定化板中，每1孔添加200μL的含1％BSA的TBS，在室温下一边搅拌一边封闭1小时。用TBS-T将板清洗3次之后，添加含2％BSA的TBS和试样(各50μL)，在室温下一边搅拌一边使其反应1小时。然后，用TBS-T将板清洗5次，每1孔添加100μL将上述(1)3)的ALP标记抗CD9抗体稀释成0.25μg/mL的含1％BSA的TBS，在室温下一边搅拌一边使其反应1小时。反应后，用TBS-T清洗5次，每1孔添加50μL的CDP-StarSubstance with Emerald-II Enhancer(Thermo Fisher Scientific K.K.制造)，一边搅拌一边使其反应30分钟之后，使用EnVision(PerkinElmer Co.,Ltd.制造)测定了化学发光信号。

2)固定化抗CD9抗体-标记抗PSMA抗体的测定系统

在上述(1)2)中获得的抗CD9抗体固定化板中，每1孔添加200μL含1％BSA的TBS，在室温下一边搅拌一边封闭1小时。用TBS-T将板清洗3次之后，添加含2％BSA的TBS和试样(各50μL)，在室温下一边搅拌一边使其反应1小时。然后，用TBS-T将板清洗5次，每1孔添加100μL含有0.25μg/mL上述(1)4)中获得的ALP标记抗PSMA抗体的含1％BSA的TBS，在室温下一边搅拌一边使其反应1小时。反应后，用TBS-T清洗5次。接着，每1孔添加50μL的CDP-StarSubstance with Emerald-II Enhancer(Thermo Fisher Scientific K.K.制造)作为ALP酶反应基质溶液，一边搅拌一边使其反应30分钟之后，使用EnVision(PerkinElmer Co.,Ltd.制造)测定了化学发光。

(3)结果

将结果示于图2。在图2中，纵轴表示发光强度(cps)。

图2(1)是上述(2)1)的“固定化抗PSMA抗体-标记抗CD9抗体的测定系统”的结果。并且，图2(2)是上述(2)2)的“固定化抗CD9抗体-标记抗PSMA抗体的测定系统”的结果。

上述(2)1)的方法是将非专利文献1的图3的外泌体的检测方法转换为ELISA的方法。并且，上述(2)2)的方法是将非专利文献1的图3的外泌体的检测方法转换为ELISA，使固定在固相上的抗体与标记抗体相反的方法。

由图2可知，无论是“固定化抗PSMA抗体-标记抗CD9抗体的测定系统”的情况，还是“固定化抗CD9抗体-标记抗PSMA抗体的测定系统”的情况，在CRPC患者(CRPC)、确认不是CRPC的前列腺癌患者(PC)及前列腺肥大症患者(BPH)之间，测定值均没有显著差异。

由以上可知，即使将以往的方法简单地转换为ELISA来测定外泌体(细胞外囊泡)，也无法区分CRPC患者与前列腺癌患者及前列腺肥大症患者。

实施例2

(1)含有细胞外囊泡的试样的制备

培养PSMA阳性人前列腺癌细胞株C4-2B细胞之后，回收培养上清液。将所回收的培养上清液90mL进一步进行2次离心分离处理(第1次：2,000×g，10分钟，第2次：12,000×g，30分钟)以分离杂质，获得了上清液。将所获得的培养上清液样品用过滤器过滤(孔径0.22μm)以分离杂质，获得了上清液。

接着，对所获得的上清液进行超离心分离处理(100,000×g，70分钟，4℃)，获得了沉淀组分。将所获得的沉淀组分用PBS(-)悬浮，再次进行超离心分离处理(100,000×g，70分钟，4℃)，进行了沉淀的清洗。再一次进行该清洗操作之后，将所获得的沉淀组分悬浮在PBS(-)100μL中。通过常规方法测定了试样中的蛋白质量。

(2)测定用试样1的制备

在用TBS稀释至50％的人池血清中，以信号强度测定时的蛋白质量的终浓度成为0ng/well，0.39ng/well，0.78ng/well，1.56ng/well，3.12ng/well，6.25ng/well，12.5ng/well及25ng/well的方式分别添加上述(1)中获得的含有细胞外囊泡的试样，用作测定用试样1。即，测定用试样1是含有细胞外囊泡的人血清试样。

(3)测定用试样2的制备

在用TBS稀释至50％的人池血清中，以信号强度测定时的蛋白质量的终浓度成为0ng/well，0.39ng/well，0.78ng/well，1.56ng/well，3.12ng/well，6.25ng/well，12.5ng/well及25ng/well的方式分别添加了上述(1)中获得的含有细胞外囊泡的试样。接着，使用添加了该细胞外囊泡的人池血清来代替源自CRPC患者等的血清，除此以外，实施与实施例1的“(2)试样的制备”相同的方法，获得含有在膜表面具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡的上清液，用作测定用试样2。

即，测定用试样2是使用Tim4载体(Tim4珠)，从含有细胞外囊泡的人血清分离PS细胞外囊泡而获得的含有PS细胞外囊泡的试样。

(4)利用ELISA的细胞外囊泡的测定

使用上述(2)中获得的测定用试样1及上述(3)中获得的测定用试样2，分别通过与实施例1的“(3)利用ELISA的细胞外囊泡的测定”相同的方法，测定了试样中的PS-PSMA细胞外囊泡的量(信号强度)。

(5)结果

将所获得的结果示于图3。

在图3中，-□-表示使用上述(2)中获得的测定用试样1进行测定的结果。并且，-×-表示使用上述(3)中获得的测定用试样2进行测定的结果。

由图3可知，使用作为本发明所涉及的PS亲和性物质的Tim4获取血清中的PS细胞外囊泡，接着进行本发明所涉及的PS-PSMA细胞外囊泡的测定，由此能够大致消除源自血清中所含的混杂物等的测定的背景。

产业上的可利用性

根据本发明，能够进行非侵袭性的转移性CRPC的诊断。

并且，在激素疗法治疗中，在测定血中PSA的同时，根据本发明测定PS-PSMA细胞外囊泡，监测这些值，由此能够用作包括转移的CRPC的进展的诊断辅助，能够减少以往的仅通过PSA测定进行诊断而引起的转移性CRPC诊断的遗漏。

而且，在用于诊断不伴随PSA上升的CRPC的进展的监测中，需要频繁的图像检查，但根据本发明，能够避免对不需要图像检查的患者进行频繁的图像检查，作为结果，能够减少不需要的放射线暴露。

在日本，于2019年9月开始了放射标记使用对PSMA亲和性高的化合物的PSMA-PET的临床试验，但作为接受PSMA-PET之前的伴随诊断，通过进行根据本发明的PS-PSMA细胞外囊泡的量的测定，在其值高的情况下实施PSMA-PET，能够有助于抑制医疗费或减少患者的放射线暴露。

并且，期待在使用本发明的“PSMA-PET的伴随诊断”中的用途。

Claims (15)

1.一种辅助诊断转移性雄激素阻断疗法抗性前列腺癌的方法，其包括：

测定源自受检者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及前列腺特异性膜抗原的细胞外囊泡的量的步骤；及以所述具有磷脂酰丝氨酸及前列腺特异性膜抗原的细胞外囊泡的量为指标，判定受检者为转移性雄激素阻断疗法抗性前列腺癌的步骤。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，

所述判定是在所述具有磷脂酰丝氨酸及前列腺特异性膜抗原的细胞外囊泡的量为基准值以上的情况下，判定受检者为转移性雄激素阻断疗法抗性前列腺癌的步骤。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，

所述测定是使用对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质及对前列腺特异性膜抗原具有亲和性的抗体的测定。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，

所述测定包括下述工序(1)～(3)：

(1)从源自受检者的生物试样中获取细胞外囊泡的工序；

(2)使所述工序(1)中获得的细胞外囊泡、对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质及对前列腺特异性膜抗原具有亲和性的抗体接触，形成对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质、具有磷脂酰丝氨酸及前列腺特异性膜抗原的细胞外囊泡及对前列腺特异性膜抗原具有亲和性的抗体的复合体2的工序；及

(3)通过测定所述工序(2)中获得的复合体2的量来测定具有磷脂酰丝氨酸及前列腺特异性膜抗原的细胞外囊泡的量的工序。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，

所述测定包括下述工序(1)～(3)：

(1)使源自受检者的生物试样与对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质接触，形成所述生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡和所述对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质的复合体1之后，从所述复合体1分离所述具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡，获取所述具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡的工序；

(2)使所述工序(1)中获得的具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡、对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质及对前列腺特异性膜抗原具有亲和性的抗体接触，形成所述对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质、具有磷脂酰丝氨酸及前列腺特异性膜抗原的细胞外囊泡及所述对前列腺特异性膜抗原具有亲和性的抗体的复合体2的工序；及

(3)通过测定所述工序(2)中获得的复合体2的量来测定所述具有磷脂酰丝氨酸及前列腺特异性膜抗原的细胞外囊泡的量的工序。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，

在所述工序(1)中，对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质与不溶性载体键合。

7.根据权利要求5所述的方法，其中，

所述工序(1)包括以下工序：

(1-1)使所述生物试样与对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质接触，形成所述生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡和所述对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质的复合体1的工序；

(1-2)从所述生物试样分离并获取所述工序(1-1)中获得的复合体1的工序；及

(1-3)从所述工序(1-2)中获取的所述复合体1分离所述具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡，获取所述具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡的工序。

8.根据权利要求3所述的方法，其中，

所述对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质是含T细胞免疫球蛋白/粘蛋白的蛋白质。

9.根据权利要求8所述的方法，其中，

所述含T细胞免疫球蛋白/粘蛋白的蛋白质是含T细胞免疫球蛋白/粘蛋白的蛋白质1或含T细胞免疫球蛋白/粘蛋白的蛋白质4。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，

所述生物试样是血液试样。

11.一种转移性雄激素阻断疗法抗性前列腺癌的诊断辅助用检查试剂盒，其含有：用于测定具有磷脂酰丝氨酸及前列腺特异性膜抗原的细胞外囊泡的对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质、及对前列腺特异性膜抗原具有亲和性的抗体。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其还含有固定有用于获取具有磷脂酰丝氨酸的细胞外囊泡的对磷脂酰丝氨酸具有亲和性的物质的不溶性载体。

13.一种转移性雄激素阻断疗法抗性前列腺癌的诊断用生物标记，其含有具有磷脂酰丝氨酸及前列腺特异性膜抗原的细胞外囊泡。

14.一种转移性雄激素阻断疗法抗性前列腺癌诊断辅助用装置，其具有测定部，所述测定部测定源自受检者的生物试样中的具有磷脂酰丝氨酸及前列腺特异性膜抗原的细胞外囊泡的量。

15.根据权利要求14所述的装置，其还具有判定部，所述判定部判定通过测定部中的测定获得的测定值是否为基准值以上。

Images