JP7496975B2 - 転移性去勢抵抗性前立腺癌の診断を補助する方法 - Google Patents

Description

本発明は、転移性去勢抵抗性前立腺癌の診断を補助する方法に関する。

前立腺癌の治療法の１つにホルモン療法があるが、根治療法ではないため、前立腺癌患者の一部は早晩ホルモン療法耐性前立腺癌（去勢抵抗性前立腺癌、castration resistant prostate cancer、以下、「CRPC」と略記する）となる。通常CRPCは、従来の前立腺癌マーカーである前立腺特異抗原（prostate-specific antigen、以下、「PSA」と略記する。）の上昇をもって診断されるが、最近ではPSAの上昇と相関しない病勢の進行も指摘されている。

そのためCRPCの治療過程では、PSA測定のみではなく画像診断も併用して転移を含む病勢の進行をモニタリングすることが推奨されている。

前立腺特異的膜抗原（Prostate Specific Membrane Antigen、以下、「PSMA」と略記する。）は前立腺の細胞膜上に発現しており、前立腺癌患者の組織では悪性度が高い検体ほどPSMAの染色性が強くなることが知られていた。

ところで、細胞外小胞は、その粒子内部にタンパク質やmicroRNA等の核酸が存在し、細胞間の物質伝達を担っていることが知られている。細胞外小胞は、血液等の体液中にも分泌されており、細胞外小胞中のタンパク質やmicroRNA等が疾患の診断マーカーとして注目されている。Mizutaniらは、健常者、転移のない前立腺癌患者、進行性前立腺癌患者及びCRPC患者由来の血漿から抗PSMA抗体固定化ビーズを用いてエクソソームを分離し、抗CD9抗体を用いたウエスタンブロット法を行っている。その結果、健常者と比較して前立腺癌患者及びCRPC患者において、エクソソームの量が増加したことを報告している（非特許文献１）。

Kosuke Mizutani et al., Anticancer Research, 2014, 34(7), p.3419-3423 Zhen Xiao et al., Cancer Res., 2001, 61(16), p:6029-6033 Vaclav Navratil et al., Nucleic Acids Res., 2017, 45(2):e10. doi: 10.1093/nar/gkw853

しかしながらCRPCに特異的な癌マーカー、及びCRPCの転移を診断するバイオマーカーは知られていない。
また、血中でのPSMA濃度を測定しようと試みた文献はある（非特許文献２、非特許文献３等）が、血中PSMAは非常に微量であるため従来技術での測定は困難であり、血中PSMA濃度と前立腺癌の関係には統一した見解は得られていない。非特許文献１でも、特に転移性CRPC患者についての試験は行われていない。また、非特許文献１のエクソソーム量の確認方法は、迅速な診断が求められる臨床検査の分野で用いるには、手順が煩雑であるという問題がある。
従って、本発明の課題は、転移性CRPCを簡便にかつ特異的に診断でき、また転移性CRPCの病勢をモニタリングする新たな前立腺癌マーカーを開発することである。

本発明は、前記課題を解決する目的でなされたものであり、以下の構成よりなる。
[1] 被験者に由来する生体試料中のホスファチジルセリン及びPSMAを有する細胞外小胞の量を測定すること、及び前記ホスファチジルセリン及びPSMAを有する細胞外小胞の量を指標として、被験者が転移性CRPCであると判定することを含む、転移性CRPCの診断を補助する方法。
[2] 前記判定が、前記ホスファチジルセリン及びPSMAを有する細胞外小胞の量が基準値以上の場合に、被験者が転移性CRPCであると判定することである、前記[1]に記載の方法。
[3] 前記測定が、ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質、及びPSMAに対して親和性を有する抗体を用いる測定である、前記[1]又は[2]に記載の方法
[4] 前記測定が、下記工程(i)～(iii)を含む、前記[1]～[3]の何れか一つに記載の方法：
(i) 被検者に由来する生体試料から細胞外小胞を取得する工程、
(ii)前記工程(i)で得られた細胞外小胞とホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質とPSMAに対して親和性を有する抗体とを接触させて、前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質とホスファチジルセリン及びPSMAを有する細胞外小胞とPSMAに対して親和性を有する抗体の複合体２を形成させる工程、
(iii)前記工程(ii)で得られた複合体２の量を測定することにより、ホスファチジルセリン及びPSMAを有する細胞外小胞の量を測定する工程。
[5] 前記測定が、下記工程(i)～(iii)を含む、前記[1]～[4]の何れか一つに記載の方法：
(i)被験者に由来する生体試料と、ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質とを接触させて、前記生体試料中のホスファチジルセリンを有する細胞外小胞と前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質との複合体１を形成させた後、前記複合体１から前記ホスファチジルセリンを有する細胞外小胞を分離し、前記ホスファチジルセリンを有する細胞外小胞を取得する工程、
(ii)前記工程(i)で得られたホスファチジルセリンを有する細胞外小胞とホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質とPSMAに対して親和性を有する抗体とを接触させて、前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質とホスファチジルセリン及びPSMAを有する細胞外小胞と前記前立腺特異的膜抗原に対して親和性を有する抗体との複合体２を形成させる工程、
(iii)前記工程(ii)で得られた複合体２の量を測定することにより、前記ホスファチジルセリン及びPSMAを有する細胞外小胞の量を測定する工程。
[6] 前記工程(i)において、ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質が不溶性担体に結合している、前記[5]に記載の方法。
[7] 前記工程(i)が以下の工程を含む、前記[5]又は[6]に記載の方法：
(i-1) 前記生体試料と、ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質とを接触させて、前記生体試料中のホスファチジルセリンを有する細胞外小胞と前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質との複合体１を形成させる工程。
(i-2) 前記生体試料から、前記工程(i-1)で得られた複合体１を分離し、取得する工程
(i-3) 前記工程(i-2)で取得した前記複合体１から前記ホスファチジルセリンを有する細胞外小胞を分離し、前記ホスファチジルセリンを有する細胞外小胞を取得する工程。
[8] 前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質が、Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチン含有タンパク質である、前記[3]～[7]の何れか一つに記載の方法。
[9] 前記Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチン含有タンパク質が、Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチン含有タンパク質１又はＴ細胞免疫グロブリン・ムチン含有タンパク質４である、前記[8]に記載の方法
[10] 前記生体試料が血液試料である、前記[1]～[9]の何れか一つに記載の方法。
[11] ホスファチジルセリン及びPSMAを有する細胞外小胞の測定のために使用されるホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質、及びPSMAに対して親和性を有する抗体を含む、転移性CRPCの診断補助用検査キット。
[12] 更にホスファチジルセリンを有する細胞外小胞の取得のために使用されるホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質を固定化した不溶性担体を含む、前記[11]に記載のキット。
[13] ホスファチジルセリン及びPSMAを有する細胞外小胞を含む、転移性CRPCの診断用バイオマーカー。
[14] 被験者に由来する生体試料中のホスファチジルセリン及びPSMAを有する細胞外小胞の量を測定する測定部を有する、転移性CRPC診断補助用装置。
[15] 更に測定部における測定で得られた測定値が基準値以上か否かを判定する判定部を有する、前記[14]に記載の装置。

前記状況に鑑み、本発明者らは、血中に存在するホスファチジルセリン及びPSMAを有する細胞外小胞（以下、「PS-PSMA細胞外小胞」と略記する場合がある。）が、転移性CRPCを診断するためのバイオマーカーとなり得ることを見出し、本発明を完成した。

本発明によれば、非転移性CRPC、CRPC以外の前立腺癌、前立腺肥大、及び健常者と区別して、転移性CRPCを特異的に診断することを可能とする。

実施例１で得られた、CRPC患者５検体由来生体試料を用いて得られた測定値の平均値を１とした場合の、この値に対する各疾患患者、又は健常者由来の生体試料を用いて得られた測定値の相対値を示す。 比較例１で得られた、各疾患患者、又は健常者由来の生体試料を用いて得られた測定値を示す。図２(１)は、固定化抗PSMA抗体-標識抗CD9抗体による測定系で測定を行った結果を示す。図２(２)は、固定化抗CD9抗体-標識抗PSMA抗体による測定系で測定を行った結果を示す。 実施例２で得られた、Tim4ビーズを用いて血清から分離して得られたPS細胞外小胞を含有する試料、又は細胞外小胞を含有する血清を試料として用い、PS-PSMA細胞外小胞の測定を行った結果を示す。

＜1. 転移性去勢抵抗性前立腺癌＞
癌の「転移」とは、一般に、癌細胞が原発部位から、身体の別の臓器に移動し、そこで再び増殖することをいう。
本発明において転移性去勢抵抗性前立腺癌とは、去勢抵抗性前立腺癌(CRPC)であって、転移を有する場合をいう。既に転移を有するCRPC患者の状態、及び去勢抵抗前立腺癌が転移性を獲得した状態を含む。

＜2.ホスファチジルセリンを有する細胞外小胞＞
本発明に係るホスファチジルセリンを有する細胞外小胞としては、細胞に由来する、脂質二重膜で構成される小型膜小胞であって、その膜表面にホスファチジルセリンを有するものが挙げられる。当該小胞の直径としては、通常20 nm～1000 nm、好ましくは50～800nM、より好ましくは50 nm～500 nm、特に好ましくは50 nm～200 nmのものが挙げられる。前記細胞外小胞としては、Nature Reviews Immunology 9， 581-593 (August 2009)、「肥満研究」Vol.13 No.2 2007 トピックス 青木直人等に記載のように、その発生起源及び小型膜小胞の大きさ等により様々に分類されるものも挙げられる。具体的には、エクソソーム、微小胞、エクトソーム、膜粒子、エクソソーム様小胞、アポトーシス小体、アディボソーム等が挙げられる。

エクソソームは、後期エンドソームに由来する、脂質二重膜で構成され、その膜表面にホスファチジルセリンを有する小型膜小胞である。エクソソームの直径は、通常50 nm～200 nm、好ましくは50 nm～150 nm、より好ましくは50 nm～100 nmである。エクソソームは、その膜表面にCD63やCD9等のテトラスパニン（tetraspanins）、Alix、TSG101、Lamp－1、Flotillin等のタンパク質を含むことが知られている。

微小胞は、細胞膜に由来する、脂質二重膜で構成され、その膜表面にホスファチジルセリンを有する小型膜小胞である。微小胞の直径は、通常100 nm～1000 nm、好ましくは100 nm～800 nm、より好ましくは100 nm～500 nmである。微小胞は、その膜表面にインテグリン、セレクチン、CD40リガンド等のタンパク質を含むことが知られている。

エクトソームは、細胞膜に由来する、脂質二重膜で構成され、その膜表面にホスファチジルセリンを有する小型膜小胞である。エクトソームの直径は、通常50 nm～200 nm、好ましくは50 nm～150 nm、より好ましくは50 nm～100 nmである。エクトソームは、その膜表面にCR1、タンパク質分解酵素 (proteolytic enzyme)を含むが、CD63は含まないことが知られている。

膜粒子は、細胞膜に由来する、脂質二重膜で構成され、その膜表面にホスファチジルセリンを有する小型膜小胞である。膜粒子の直径は、通常50 nm～80 nmである。膜粒子は、その膜表面にCD133を含むが、CD63は含まないことが知られている。

エクソソーム様小胞は、初期エンドソームに由来する、脂質二重膜で構成され、その膜表面にホスファチジルセリンを有する小型膜小胞である。エクソソーム様小胞の直径は、通常20 nm～50 nmである。エクソソーム様小胞は、その膜表面に腫瘍壊死因子受容体1（TNFRI）を含むことが知られている。

アポトーシス小体は、アポトーシス細胞に由来する、脂質二重膜で構成され、その膜表面にホスファチジルセリンを有する小型膜小胞である。アポトーシス小体の直径は、通常50 nm～500 nm、好ましくは50 nm～300 nm、より好ましくは50 nm～200 nmである。アポトーシス小体は、その膜表面にヒストンを含むことが知られている。

アディボソームは、脂肪細胞に由来する、脂質二重膜で構成され、その膜表面にホスファチジルセリンを有する小型膜小胞である。アディボソームの直径は、通常100 nm～1000 nm、好ましくは100 nm～800 nm、より好ましくは100 nm～500 nmである。アディボソームは、MFG-E8（milk fat globule－EGF factor 8）を含むことが知られている。

ホスファチジルセリンを有する細胞外小胞としては、エクソソーム又は微小胞が好ましく、エクソソームがより好ましい。
本発明に係る「ホスファチジルセリンを有する細胞外小胞」を、以下「PS細胞外小胞」と略記する場合がある。
本発明に係る「ホスファチジルセリン及びPSMAを有する細胞外小胞」(以下、「PS-PSMA細胞外小胞」と略記する場合がある。)は、上記した本発明に係るPS細胞外小胞であって、且つその膜表面にPSMAを有する細胞外小胞である。

＜3. ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質＞
本発明に係る「ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質」としては、カルシウムイオンの存在下でホスファチジルセリンに対して親和性を有し、且つ上記した本発明に係るPS細胞外小胞の膜表面に存在（露出）しているホスファチジルセリンに結合するものであればよい。例えばアネキシンV（Annexin V）、MFG-E8（Milk Fat Globulin Protein E8）、T細胞免疫グロブリン・ムチン（T-cell immunoglobulin-mucin-domain）含有タンパク質等が挙げられる。T細胞免疫グロブリン・ムチン含有タンパク質（以下、「Timタンパク質」と略記する場合がある。）が好ましい。
本発明に係る「ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質」を、以下「PS親和性物質」と略記する場合がある。

[Timタンパク質]
本発明に係るTimタンパク質は、カルシウムイオンの存在下でホスファチジルセリンに対して親和性を有し、本発明に係るPS細胞外小胞に結合し得るものであればよく、動物に由来するTimタンパク質が好ましい。なかでも、ヒトが有するTimタンパク質が好ましい。
より具体的には、少なくとも、ホスファチジルセリンに対する結合ドメイン（IgVドメイン）のアミノ酸配列を有しているものであればよく、Timタンパク質の全長のアミノ酸配列を有するものであっても、Timタンパク質の一部でもよい。

そのような本発明に係るTimタンパク質としては、T細胞免疫グロブリン・ムチン含有タンパク質1（以下、「Tim1」と略記する。）、T細胞免疫グロブリン・ムチン含有タンパク質3（以下、「Tim3」と略記する。）、及びT細胞免疫グロブリン・ムチン含有タンパク質4（以下、「Tim4」と略記する。）等が挙げられる。Tim1及びTim4が好ましく、Tim4がより好ましい。

本発明に係るTimタンパク質のアミノ酸配列は、例えばWO2016-088689号に記載されている。

本発明に係るTimタンパク質は、市販品を用いることが出来る。また、一般的な化学合成方法や、WO2016-088689号に記載されたような、遺伝子組み換え技術によっても得ることが出来る。

＜4. 本発明の転移性CRPCの診断を補助する方法＞
本発明の転移性CRPCの診断を補助する方法（以下、「本発明の補助方法」と略記する場合がある）は、
(A) 被験者に由来する生体試料中のPS-PSMA細胞外小胞の量を測定すること、及び
(B) 前記PS-PSMA細胞外小胞の量を指標として、被験者が転移性CRPCであると判定すること、
を含む。

本発明の補助方法は、医師等による転移性CRPCの診断を補助する方法として用いることが出来る。また、本発明の補助方法は、in vitroで実施される。

本発明の補助方法におけるPS-PSMA細胞外小胞の「量」及び複合体２の「量」とは、容量，質量等の値又は濃度が挙げられる。また、PS-PSMA細胞外小胞の「量」及び複合体２の「量」と相関関係を有する発光量、吸光度、蛍光強度、濁度、透過光量、ピーク面積、反射率、屈折率、これらの値の変化量等の実測値、更にこれらの値から算出された値等の相対値の何れであってもよい。

本発明の補助方法において、上記(A)の「被験者に由来する生体試料中のPS-PSMA細胞外小胞の量を測定する」工程を、以下、「本発明に係る測定工程」と略記する場合がある。
また、上記(B)の「PS-PSMA細胞外小胞の量を指標として、被験者が転移性CRPCであると判定する」工程を、以下、「本発明に係る判定工程」と略記する場合がある。

［生体試料］
本発明に係る生体試料としては、ヒト由来のものであればよく、例えば、血清、血漿、全血、尿、精液、膀胱洗浄物、組織抽出液、前立腺組織切片、前立腺組織生検試料等、あるいはこれらから調製されたもの等が挙げられる。血漿、血清、全血等の血液由来試料が好ましく、血漿又は血清がより好ましい。血清が特に好ましい。
本発明に係る生体試料は、例えば、ヒトから直接採取されたものであっても、回収、濃縮、精製、単離、緩衝液等による希釈、ろ過滅菌等の前処理を行ったものであってもよい。これら前処理は、この分野で用いられる常法に従い、適宜行えばよい。
本発明に係る生体試料を被検者から得る（採取する）方法は、特に限定されず、例えば、自体公知の方法に基づいて、当該被検者から当該試料を得る（採取する）ことによりなされればよい。

＜(A) 本発明に係る測定工程について＞
本発明に係る測定工程は、具体的には例えば下記の工程を含む。
(A-1) 被検者に由来する生体試料から細胞外小胞を取得する工程、
(A-2) 前記工程(A-1)で得られた細胞外小胞とPS親和性物質とPSMAに対して親和性を有する抗体とを接触させて、前記PS親和性物質とPS-PSMA細胞外小胞とPSMAに対して親和性を有する抗体の複合体２を形成させる工程（以下、「複合体２形成工程」と略記する場合がある。）、
(A-3) 前記工程(A-2)で得られた複合体２の量を測定することにより、PS-PSMA細胞外小胞の量を測定する工程（以下、「測定工程」と略記する場合がある。）。

●(A-1) 被検者に由来する生体試料から細胞外小胞を取得する工程について
工程(A-1)に係る、生体試料から細胞外小胞を取得する方法としては、常法に従って細胞外小胞を単離すればよく、特に限定されない。
例えば、アフィニティー法（ホスファチジルセリン結合分子を用いるPSアフィニティー法等）、分画遠心分離法（ペレットダウン法、スクロースクッション法、密度勾配遠心法等の超遠心法等）、免疫沈降法、クロマトグラフィー法（イオン交換クロマトグラフィー法、ゲル浸透クロマトグラフィー法等）、密度勾配法（ショ糖密度勾配法等）、電気泳動法（オルガネラ電気泳動法等）、磁気分離法（磁気活性化細胞選別（MACS）法）、限外濾過濃縮法（ナノ膜限外濾過濃縮法等）、パーコール勾配単離法、マイクロ流体デバイスを利用した方法、PEG沈殿法等が挙げられる。
高い精製度の細胞外小胞を得られるアフィニティー法、又は理論的に偏りの無い回収が可能である分画遠心分離法が好ましく、アフィニティー法又は超遠心法がより好ましく、アフィニティー法が特に好ましい。アフィニティー法の中でも、PSアフィニティー法が好ましい。アフィニティー法及び分画遠心分離法は、例えば、WO2016-088689号に記載の方法に準じて行えばよい。
これらの単離方法は、１種のみを用いても、２種以上を組み合わせてもよい。また、１種の単離方法による単離を２回以上繰り返してもよい。

PSアフィニティー法により本発明に係るPS親和性物質を用いて細胞外小胞を取得する方法としては、前記生体試料とPS親和性物質とを接触させて、前記生体試料中のPS細胞外小胞と前記PS親和性物質との複合体１を形成させた後、前記複合体１から前記PS細胞外小胞を分離し、前記PS細胞外小胞を取得することによりなされる。

PSアフィニティー法による工程(A-1)の好ましい方法は、具体的には下記(A-1-1)～(A-1-3)の工程を含む。
（A-1-1）生体試料と、PS親和性物質とを接触させて、前記生体試料中のPS細胞外小胞と前記PS親和性物質との複合体1を形成させる工程（以下、「複合体１形成工程」と略記する場合がある。）、
（A-1-2）前記生体試料から、前記工程(A-1-1)で得られた複合体1を分離し、取得する工程（以下、「複合体１分離工程」と略記する場合がある。）、
（A-1-3）前記工程（A-1-2）で取得した前記複合体1から前記PS細胞外小胞を分離し、前記PS細胞外小胞を取得する工程（以下、「取得工程」と略記する場合がある。）。

尚、PSアフィニティー法により取得される細胞外小胞は、PS細胞外小胞である。

―（A-1-1）複合体１形成工程について―

(A-1-1)の複合体１形成工程は、「生体試料と、PS親和性物質とを接触させて、前記生体試料中のPS細胞外小胞と前記PS親和性物質との複合体1を形成させる工程。」である。

この工程で用いられる生体試料は、前記した通りである。具体例、好ましい例等も同じである。
また、本工程に用いられるPS親和性物質の具体例は上記「＜3. ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質＞」の項に記載した通りである。具体例、好ましい例等も同じである。

・PS親和性物質を不溶性担体に固定化させる方法
複合体１形成工程で用いられるPS親和性物質は、不溶性担体に結合されたものであることが好ましい。この場合、PS細胞外小胞と前記PS親和性物質との複合体1は、後記する(A-1-2)の複合体１分離工程で、公知のB/F分離法により、反応液から分離することができる。

PS親和性物質を不溶性担体に固定化する方法の例を以下に説明するが、例えばWO2016-088689号に記載された方法に準じて行えばよい。

PS親和性物質を固定化する不溶性担体としては、通常の免疫学的測定法で用いられる不溶性の担体であれば何れも使用可能である。例えば、ポリスチレン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリルアミド、ポリグリシジルメタクリレート、ポリプロピレン、ポリオレフィン、ポリイミド、ポリウレタン、ポリエステル、ポリ塩化ビニール、ポリエチレン、ポリクロロカーボネート、シリコーン樹脂、シリコーンラバー、アガロース、デキストラン、エチレン－無水マレイン酸共重合物等の有機物；ガラス、酸化ケイ素、ケイソウ、多孔性ガラス、スリガラス、アルミナ、シリカゲル、金属酸化物等の無機物質；鉄、コバルト、ニッケル、マグネタイト、クロマイト等の磁性体等；及びこれらの磁性体の合金を材料として調製されたものが挙げられる。また、これら担体は、マイクロプレート、チューブ、ディスク状片、粒子（ビーズ）等多種多様の形態で使用し得る。

尚、工程(A-1-1)の複合体１形成工程に用いる不溶性担体は、粒子（ビーズ）であることが好ましく、粒子の大きさは特に限定されないが、通常10nm～100μm、好ましくは100 nm～10 μmのものが挙げられる。

PS親和性物質と不溶性担体との結合方法としては、タンパク質を担体に結合させる自体公知の方法が挙げられる。例えば、アフィニティー結合により結合させる方法、化学結合により結合させる方法（例えば、特許3269554号公報、WO2012／039395公報に記載の方法）、物理的吸着により結合させる方法（例えば、特公平5－41946号公報に記載の方法）等が挙げられるが、物理的吸着により結合させる方法及びアフィニティー結合により結合させる方法が好ましい。物理的吸着により結合させる方法が、簡便であり、より好ましい。

本発明に係るPS親和性物質と不溶性とを物理的吸着により結合させる方法としては、自体公知の方法に従い、PS親和性物質と不溶性担体とが結合する条件下で、PS親和性物質と不溶性担体とを接触させればよい。

不溶性担体に結合させる、本発明に係るPS親和性物質の量は、例えば不溶性担体が粒子（ビーズ）の場合、不溶性担体1mgに対して、通常0.1μg～50 μg、好ましくは0.1 μg～30 μg、より好ましくは0.1μg～20μgである。また、不溶性担体がマイクロプレートの場合、マイクロプレートの1ウェルに対して、通常0.1μg～10 μg、好ましくは0.1 μg～5 μg、より好ましくは0.1 μg～2 μgである。

PS親和性物質と不溶性担体との物理的吸着は、PS親和性物質を含有する溶液と不溶性担体とを接触させることにより行われる。

PS親和性物質を含有する溶液において、当該物質を溶解させる溶液としては、PS親和性物質を安定な状態で溶解させるものであればよく、例えば精製水、例えばpH 6.0～9.8、好ましくは7.0～9.6に緩衝作用を有する緩衝液（例えばMOPSなどのグッド緩衝液、炭酸緩衝液、PBS、TBS、TBS-T、HBS等）が挙げられる。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常5～100 mM、好ましくは10～100 mMの範囲から適宜選択され、NaClを添加する場合の濃度は通常100～200 mM、好ましくは140～160 mMの範囲から適宜選択される。また、このPS親和性物質を溶解させる溶液中には、PS親和性物質と不溶性担体との結合を妨げない量であれば、例えば糖類、NaCl等の塩類、Tween20等の界面活性剤、防腐剤、タンパク質等が含まれていてもよい。

不溶性担体に固定化させるPS親和性物質としては、Timタンパク質が好ましい。Tim4がより好ましい。Timタンパク質を固定化した不溶性担体を、以下「Tim担体」と略記する場合がある。Tim4タンパク質を固定化した不溶性担体を、以下「Tim4担体」と略記する場合がある。

PS親和性物質と不溶性担体を物理的吸着により結合させる方法の具体例としては、例えば以下の方法が挙げられる。

まず、不溶性担体が粒子（ビーズ）の場合、ビーズ担体1 mgに、PS親和性物質を通常0.1 μg～50 μg、好ましくは1 μg～50 μg含有する溶液を通常50 μL～300 μL、好ましくは50μL～200 μL、より好ましくは50 μL～100 μL接触させ、通常2℃～37℃、好ましくは4℃～11℃で通常0.5～48時間、好ましくは0.5～24時間反応させる。

不溶性担体がマイクロプレートの場合、マイクロプレートの1ウェルに、PS親和性物質を通常0.1 μg～10 μg、好ましくは0.2 μg～5 μg、より好ましくは0.5 μg～2 μg含有する溶液を通常50 μL～300 μL、好ましくは50 μL～200 μL、より好ましくは50 μL～100 μL接触させ、通常2℃～37℃、好ましくは4℃～11℃で通常4～48時間、好ましくは12～24時間反応させる。

前記のようにして得られたPS親和性物質を固定化した不溶性担体は、通常この分野で行われるブロッキング処理に付してもよい。

また、前記のようにして得られた本発明に係るPS親和性物質を固定化した不溶性担体を、要すれば、通常この分野で行われる精製処理に付してもよい。精製処理としては、担体表面に付着している不純物を除去することが出来ればよく、例えば、当該不溶性担体を洗浄溶液により洗浄する方法（以下、「洗浄操作」と略記する場合がある）が挙げられる。洗浄操作は、必要に応じて数回繰り返し行ってもよい。

・複合体１形成工程
(A-1-1)の複合体１形成工程は、PS親和性物質としてTim蛋白質を用いる場合、カルシウムイオンの存在下で行う。即ち、カルシウムイオンは、PS親和性物質と生体試料中の細胞外小胞とを接触させる際に、存在させる。

PS親和性物質と生体試料中の細胞外小胞とを接触させる際のカルシウムイオン濃度は、通常0.5 mM～100 mM、好ましくは1.0 mM～10 mM、より好ましくは2.0 mM～5.0 mMである。尚、PS親和性物質と生体試料中のPS細胞外小胞との複合体１が形成され、後記する(A-1-3)取得工程を実施するまで、即ち、当該複合体１を分離する工程に付すまでの当該複合体１を含有する溶液中には、前記した如き濃度のカルシウムイオンが必要であることは言うまでもない。

カルシウムイオンの由来は特に限定されず、例えば塩化カルシウム、水酸化カルシウム、炭酸水素カルシウム、ヨウ化カルシウム、臭化カルシウム、酢酸カルシウム等が挙げられ、好ましくは塩化カルシウム、炭酸水素カルシウム、ヨウ化カルシウムであり、より好ましくは塩化カルシウム、炭酸水素カルシウムである。

PS親和性物質と生体試料中の細胞外小胞とを接触させる際にカルシウムイオンを存在させる方法としては、PS親和性物質と生体試料中の細胞外小胞とを接触させる際のカルシウムイオン濃度が上記した範囲となるように、生体試料、又は／及びPS親和性物質を含有する溶液に、前記した如きカルシウムイオンを含有させればよい。また、PS親和性物質と生体試料中の細胞外小胞とを接触させる際のカルシウムイオン濃度が上記した範囲となるように、カルシウムイオンを含有させた溶液（以下、「カルシウムイオンを含有する溶液」と略記する場合がある。）と、生体試料と、PS親和性物質を含有する溶液とを混合させてもよい。

本発明に係るカルシウムイオンを含有する溶液において、カルシウムイオンを溶解させる溶液としては、PS細胞外小胞とPS親和性物質との結合を妨げないものであればよく、例えば水、pH 7.0～pH 8.0、好ましくはpH 7.2～pH 7.6に緩衝作用を有する緩衝液（例えばTBS、HBS等）等が挙げられる。尚、リン酸バッファーはカルシウムと結合して沈殿が生じるので好ましくない。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常5 mM～50 mM、好ましくは10 mM～30 mMの範囲から適宜選択される。NaCl濃度は通常100 mM～200 mM、好ましくは140 mM～160 mMの範囲から適宜選択される。

本発明に係るカルシウムイオンを含有する溶液中には、PS細胞外小胞とPS親和性物質との結合を妨げない量であれば、例えば糖類、NaCl等の塩類、界面活性剤、防腐剤、BSA等のタンパク質等が含まれていても良い。界面活性剤としては、例えばTween 20等が挙げられ、当該本発明に係るカルシウムイオンを含有する溶液における界面活性剤の濃度は、通常0.00001%～0.2%、好ましくは通常0.0005%～0.1%である。

複合体１形成工程において、PS親和性物質（不溶性担体に固定化されていてもよい）１μgと接触させる生体試料の量は、通常0.1 ml～100 ml、好ましくは0.1 ml～10 ml、より好ましくは0.1 ml～1.0 mlである。生体試料とPS親和性物質（不溶性担体に固定化されていてもよい）とを接触させる際の温度は、通常2～37℃、好ましくは4～37℃、より好ましくは4～30℃である。生体試料とPS親和性物質との接触時間は、通常0.5～24時間、好ましくは0.5～8時間、より好ましくは0.5～4時間である。

複合体１形成工程において、不溶性担体に結合したPS親和性物質を用いる場合の当該担体の量としては、複合体１を形成させる際の溶液1 mL当たり通常0.1 mg～20 mg、好ましくは0.3 mg～10 mg、より好ましくは0.5 mg～6.0 mgである。

複合体１形成工程は、例えば以下の方法で行えばよい。
即ち、混合後の溶液1 mL当たり通常0.1 mg～20 mg、好ましくは0.3 mg～10 mg、より好ましくは0.5 mg～6.0 mgとなる量のPS親和性物質を固定化した不溶性担体と、混合後の溶液中のカルシウムイオン濃度が通常0.5 mM～100 mM、好ましくは1.0 mM～10 mM、より好ましくは2.0 mM～5.0 mMとなる量の本発明に係るカルシウムイオンを含有する溶液と、PS親和性物質を固定化した不溶性担体1 mg当たり通常0.1 ml～100 ml、好ましくは0.1 ml～10 ml、より好ましくは0.1 ml～1.0 mlの生体試料とを、通常4.0～37℃、好ましくは4.0～25℃、より好ましくは4.0℃～11℃、通常0.5～24時間、好ましくは0.5～8.0時間、より好ましくは0.5～4.0時間接触混合させて、担体に結合したPS親和性物質と生体試料中のPS細胞外小胞との複合体（複合体１）を形成させる。

―(A-1-2)複合体１分離工程について―
(A-1-2)の複合体１分離工程は、生体試料から、前記工程(A-1-1)で得られた複合体１を分離し、取得する工程である。
尚、当該生体試料は、生体試料そのものであっても、本発明に係るカルシウムイオンを含有する溶液等を含む溶液であってもよい。

複合体１分離工程は、複合体１と生体試料とを分離して複合体１を取得することができるのであればどのような方法であってもよく、例えば公知のB/F分離を用いてもよく、具体的には以下のような方法が挙げられる。

(i) PS親和性物質を固定化した不溶性担体の当該担体が磁気担体の場合：複合体１形成工程により得られた複合体１を含む容器を、要すればマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁に複合体１を集合させ、上清を除くことによりこれらを分離する方法。
(ii) PS親和性物質を固定化した不溶性担体の当該担体がビーズ状である場合：複合体１形成工程により得られた複合体１を含む容器を遠心分離処理し、複合体１を沈殿として集合させた後、上清を除くことによりこれらを分離する方法。
(iii) PS親和性物質を固定化した不溶性担体の当該担体がプレートなどの場合：生体試料を含有する溶液のみを除くことによりこれらを分離する方法。
(iv) ろ過により複合体１と生体試料を含有する溶液とを分離する方法。

このようにして複合体１と生体試料を含有する溶液とを分離した後、分離された複合体１を自体公知の方法により取得（回収）すればよい。

複合体１分離工程の具体例としては、例えば以下の方法が挙げられる。
磁気担体を不溶性担体として用いる場合、複合体１形成工程をおこなった容器を要すればマグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁に得られた複合体１を集合させ、上清の試料を除く。

(A-1-1)の複合体形成工程、(A-1-2)の複合体分離工程を行った後、要すれば得られた複合体１をカルシウムイオン含有洗浄溶液を用いて洗浄してもよい（以下、「洗浄操作」と略記する場合がある）。洗浄操作により、PS親和性物質を固定化した不溶性担体表面に付着した細胞由来成分等の生体試料中の夾雑物を除去することができる。洗浄方法としては、カルシウムイオン含有洗浄溶液を使用する以外は、通常この分野で行われている洗浄方法が使用できる。

当該洗浄操作において用いられるカルシウムイオン含有洗浄溶液としては、カルシウムイオンを通常0.5～100mM、好ましくは通常1～10mM、より好ましくは通常2 mM～5 mM含有し、PS細胞外小胞と不溶性担体に固定化されたPS親和性物質との結合に影響を与えない溶液であればいずれでもよく、例えば、カルシウムイオンを通常0.5 mM～100 mM、好ましくは通常1 mM～10 mM、より好ましくは通常2 mM～5 mM含有する、pH 7.0～pH 8.0、好ましくはpH 7.2～pH 7.6に緩衝作用を有するカルシウムを沈殿させない緩衝液（例えばTBS、TBS-T、HBS）が挙げられる。尚、リン酸バッファーはカルシウムと結合して沈殿が生じるので好ましくない。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常5 mM～50 mM、好ましくは10 mM～30 mMの範囲から適宜選択され、NaCl濃度は通常100 mM～200 mM、好ましくは140 mM～160 mMの範囲から適宜選択される。この溶液中には、PS細胞外小胞と不溶性担体に固定化されたPS親和性物質との結合を妨げない量であれば、例えば糖類、NaCl等の塩類、界面活性剤、防腐剤、タンパク質等が含まれていても良い。界面活性剤としては、例えばtween 20（富士フイルム和光純薬(株)製）等が挙げられ、当該洗浄溶液における界面活性剤の濃度は、通常0.00001%～0.2%、好ましくは通常0.0005%～0.1%である。

PS親和性物質を固定化する不溶性担体として磁性粒子を用いた洗浄操作を例に取り、洗浄操作の具体例を説明する。
すなわち、複合体１分離工程により得られた複合体１を含む容器内に本発明に係るカルシウムイオン含有洗浄溶液を加え、攪拌する。その後、前記容器を、マグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁に当該複合体１を集合させ、前記容器内の溶液を捨てる。これらの洗浄操作は、必要に応じて数回繰り返し行ってもよい。

―（A-1-3）取得工程について―
（A-1-3）の取得工程は、(A-1-1)の複合体１形成工程、及び(A-1-2)の複合体１分離工程を行い、要すれば洗浄操作を行った後、取得した前記複合体１から前記PS細胞外小胞を分離し、前記本発明に係るPS細胞外小胞を取得する工程である。

取得工程としては、例えば、タンパク質変性剤を用いる方法、カルシウムイオン濃度を低下させる方法が挙げられ、インタクトなPS細胞外小胞を取得できるため、カルシウムイオン濃度を低下させる方法が好ましい。

タンパク質変性剤を用いる方法としては、複合体１形成工程、及び複合体１分離工程を行った後、要すれば洗浄操作を行った後、得られた本発明に係る複合体１に、タンパク質変性剤を作用させて、複合体１中の本発明に係るPS親和性物質を変性させ、複合体１から、PS細胞外小胞を分離することによりなされる。これにより、本発明に係るPS細胞外小胞を取得することができる。タンパク質変性剤を用いる方法における、タンパク質変性剤の使用濃度、使用条件等は通常この分野でなされる方法に準じて設定される。

上記タンパク質変性剤としては、この分野において一般にタンパク質を変性させる化合物として用いられるものであればいずれでもよく、例えば、SDS（ドデシル硫酸ナトリウム）、Ｎ－ラウロイルサルコシン等の陰イオン性界面活性剤；CHAPS（3-（3-コラミドプロピル）シエツルアミノ-1-プロパンスルホン酸塩）、Zwittergent 3-12（N-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホナート）等の両イオン性界面活性剤；Brij 35（タカラバイオ（株）製）、Dodecyl-β-D-maltoside（n-ドデシル-β-D-マルトシド）、ノニデット P-40、Octyl-β-D-glucoside（オクチル-β-D-グルコシド）、Triton X-100（ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル）、Tween 20（ポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート）等の非イオン性界面活性剤；尿素、ホルムアミド、グアニジン等のカオトロピック剤等が挙げられ、陰イオン性界面活性剤が好ましく、SDSが特に好ましい。

カルシウムイオンの濃度を低下させる方法としては、例えばカルシウムイオンキレート剤を使用する方法が挙げられる。
すなわち、複合体１形成工程、及び複合体１分離工程を行った後、複合体１と結合しているカルシウムイオン及び複合体１を含有する溶液から持ち込まれたカルシウムイオンにカルシウムイオンキレート剤を作用させた後、複合体１と結合しているカルシウムイオン及び複合体１を含有する溶液から持ち込まれたカルシウムイオンの（有効）濃度を低下させる（カルシウムイオンをキレートさせる）ことによって、複合体１からPS細胞外小胞を分離させる方法である。

この方法に用いられるカルシウムイオンキレート剤としては、カルシウムイオンをキレートし得る化合物であればいずれでもよく、例えば、EDTA (エチレンジアミン四酢酸)、NTA (ニトリロ三酢酸）、DTPA (ジエチレントリアミン五酢酸）、GLDA (L-グルタミン酸二酢酸）、HEDTA (ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸）、GEDTA (エチレングリコールビス(β-アミノエチルエーテル）-N,N,N,N,-四酢酸)、TTHA (トリエチレンテトラミン-N,N,N’,N’’,N’’’,N’’’-六酢酸）、HIDA (2-ヒドロキシエチルイミノ二(酢酸）)、DHEG(N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル）グリシン)、CyDTA (trans-1,2-Diaminocyclohexane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid, monohydrate）等が挙げられ、EDTA、GEDTA、CyDTAが好ましい。

カルシウムイオンキレート剤は、通常溶液として用いる。カルシウムイオンキレート剤を溶解させる溶液としては、カルシウムイオンキレート剤を溶解させるものであればよく、例えば、精製水、緩衝液等が挙げられる。緩衝液としては、通常pH 7.0～pH 8.0、好ましくはpH 7.2～pH 7.6に緩衝作用を有する緩衝液（例えばPBS、TBS、HBS等）が好ましい。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常5 Mm～50 Mm、好ましくは10 Mm～30 Mmの範囲から適宜選択され、NaCl濃度は通常100 Mm～200 Mm、好ましくは140 Mm～160Mmの範囲から適宜選択される。カルシウムイオンキレート剤含有溶液は、例えば糖類、NaCl等の塩類、防腐剤、タンパク質等が含まれていても良い。

カルシウムイオンキレート剤含有溶液中のカルシウムイオンキレート剤の濃度としては、通常0.5 mM～500 mM、好ましくは0.5 mM～100 mM、より好ましくは0.5 mM～50 mMである。また、カルシウムイオンキレート剤含有溶液のpHは、通常pH 6.0～pH 9.0、好ましくはpH 7.0～pH 8.0、より好ましくはpH 7.2～pH 7.6である。

カルシウムイオンキレート剤を複合体１と結合しているカルシウムイオンに作用させるには、カルシウムイオンキレート剤含有溶液をペレット状の複合体１と接触させ、複合体１と結合しているカルシウムイオンとカルシウムイオンキレート剤含有溶液中のカルシウムイオンキレート剤とを反応させることにより行われる。

例えば、カルシウムイオンキレート剤含有溶液と複合体１との接触は、例えば当該溶液に当該複合体１を懸濁させる方法（PS親和性物質を固定化した不溶性担体の不溶性担体がビーズである場合等）、当該溶液に当該複合体１を浸漬させる方法（PS親和性物質を固定化した不溶性担体の不溶性担体がディスク状片、チューブである場合等）、当該溶液を当該複合体１に添加する方法（PS親和性物質を固定化した不溶性担体の不溶性担体がマイクロプレート、チューブである場合等）等により行うことができる。

複合体１と接触させるカルシウムイオンキレート剤含有溶液の量としては、複合体１と接触後の溶液中のカルシウムイオンの濃度が有効濃度未満となり、複合体１から細胞外小胞が分離される量であればよい。

複合体１にカルシウムイオンキレート剤を作用（接触）させる温度や時間としては、通常4.0℃～37℃、好ましくは10℃～30℃、より好ましくは20℃～30℃で通常1～0分間、好ましくは5～15分間である。

本発明に係る取得工程を、Tim担体を用いる方法を例にとり説明すれば、以下の通りである。
即ち、複合体１形成工程、及び複合体１分離工程を行い、要すれば洗浄操作を行った後、得られた複合体１に、通常0.5 mM～500 mM、好ましくは0.5 mM～100 mM、より好ましくは0.5 mM～50 mMのカルシウムイオンキレート剤を含有する溶液をTim担体1 mg当たり通常10 μL～500 μL、好ましくは20 μL～200 μLμＬ、より好ましくは50 μL～100 μLμＬ添加し、ボルテックスミキサー等を用いて撹拌しながら通常4.0℃～37℃、好ましくは10℃～30℃、より好ましくは20℃～30℃で通常1～30分間、好ましくは5～15分間反応させ、複合体１から、細胞外小胞（PS細胞外小胞）を分離させる。

(A-1-3)の取得工程を実施することにより、複合体１と接触・作用させたカルシウムイオンキレート剤含有溶液は、PS親和性物質を固定化した不溶性担体と、PS親和性物質を固定化した不溶性担体（複合体１）から分離（遊離）した細胞外小胞が含有していることとなる。従って、当該溶液から担体を除去し、溶液だけを回収すれば、PS細胞外小胞を含有する溶液を得ることが出来る。

尚、以上の(A-1)でPSアフィニティー法で細胞外小胞を取得した場合、取得される細胞外小胞は、実質的にPS細胞外小胞である。

●(A-2)複合体２形成工程について
工程(A-2)は、前記工程(A-1)で得られた細胞外小胞とPS親和性物質とPSMAに対して親和性を有する抗体とを接触させて、PS親和性物質とPS-PSMA細胞外小胞とPSMAに対して親和性を有する抗体との複合体複合体２を形成させることによりなされる。

(1) PSMAに対して親和性を有する抗体
本発明に係るPSMAに対して親和性を有する抗体（以下、「抗PSMA抗体」と略記する場合がある。）は、PSMAに親和性を有し、PSMAに結合する性質を持っているものであればよく、PSMAに特異的に結合する抗体が好ましい。また、抗PSMA抗体は、モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよい。モノクローナル抗体が好ましい。市販品でも常法により調製されたものでもよい。

また、抗PSMA抗体は、抗体のFab、Fab’、F(ab')2、Fv、Fd、一本鎖Fv（scFv）、ジスルフィド結合したFv（sdFv）、VL、VH、ダイアボディー（(VL-VH)2もしくは(VH-VL)2）、トリアボディー（三価抗体）、テトラボディー（四価抗体）、ミニボディー（(scFV-CH3)2）、IgG-delta-CH2、scFv-Fc、（scFv）2-Fcフラグメント等であってもよい。
また、これらの抗体を調製する場合は、例えば「免疫測定法」（免疫化学的測定研究会編、講談社、2014年）等に記載の方法に従って行えばよい。

抗PSMA抗体の由来は特に限定されないが、例えばウサギ、ラット、マウス、羊、山羊、馬等に由来する、上記した性質を有するものが挙げられる。

複合体２形成工程に用いられる抗PSMA抗体は、不溶性担体に固定化されたものであっても標識物質等で標識されているものであってもよいが、標識物質等で標識されているものが好ましい。例えば標識物質で標識された抗PSMA抗体（標識抗PSMA抗体）を用いる場合、標識抗PSMA抗体の標識物質量を測定し、その量に基づいて、複合体２の量を決定すればよい。

抗PSMA抗体を不溶性担体に固定化させる方法及び使用される不溶性担体の例としては、この分野で通常用いられる不溶性担体を用い、抗体を当該不溶性担体に固定化させる常法に従って固定化させればよい。

抗PSMA抗体を標識するために用いられる標識物質としては、例えば通常の免疫測定法等において用いられるアルカリホスファターゼ，ペルオキシダーゼ(POD)，マイクロペルオキシダーゼ，β-ガラクトシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコース-6-リン酸脱水素酵素，アセチルコリンエステラーゼ，リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類；例えば放射免疫測定法（Radioimmunoassay、RIA）で用いられる99mTc，131I，125I，14C，3H、32P，35S等の放射性同位元素；例えば蛍光免疫測定法（Fluoroimmunoassay、FIA）で用いられるフルオレセイン，ダンシル，フルオレスカミン，クマリン，ナフチルアミン、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミン、ローダミンＸイソチオシアネート、スルフォローダミン101、ルシファーイエロー、アクリジン、アクリジンイソチオシアネート、リボフラビンあるいはこれらの誘導体等の蛍光性物質；例えばルシフェリン，イソルミノール，ルミノール，ビス(2,4,6-トリフロロフェニル)オキザレート等の発光性物質；例えばフェノール，ナフトール，アントラセンあるいはこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質；例えば4-アミノ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル，3-アミノ-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-1-オキシル，2,6-ジ-t-ブチル-α-（3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソ-2,5-シクロヘキサジエン-1-イリデン）-p-トリルオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等の標識物質；例えばHiLyte Fluor 647、HiLyte Fluor 488、HiLyte Fluor 555、HiLyte Fluor 680、HiLyte Fluor 750等のHiLyte系色素〔いずれもハイライトバイオサイエンス社（HiLyte Bioscience, Inc.）商品名〕；例えばAlexa Fluor Dye 350、Alexa Fluor Dye 430、Alexa Fluor Dye 488、Alexa Fluor Dye 532、Alexa Fluor Dye 546、Alexa Fluor Dye 555、Alexa Fluor Dye 568、Alexa Fluor Dye 594、Alexa Fluor Dye 633、Alexa Fluor Dye 647、Alexa Fluor Dye 660、Alexa Fluor Dye 680、Alexa Fluor Dye 700、Alexa Fluor Dye 750等のAlexa系色素〔いずれもモレキュラープローブス社（Molecular Probes）商品名〕；例えばCy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7等のCyDye系色素〔いずれもアマシャムバイオサイエンス社（Amersham Biosciences）商品名〕；例えばクーマシーブリリアントブルーR250，メチルオレンジ等の色素等、通常この分野で用いられている標識物質が全て挙げられる。中でも、ペルオキシダーゼ，マイクロペルオキシダーゼ，アルカリホスファターゼ，β-ガラクトシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコース-6-リン酸脱水素酵素，アセチルコリンエステラーゼ，リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類が好ましく、アルカリホスファターゼ又はペルオキシダーゼがより好ましい。

上記した如き標識物質を抗PSMA抗体に結合させる（標識する）には、例えば自体公知のEIA、RIA、FIA等の免疫測定法等において一般に行われている自体公知の標識方法を適宜利用して行えばよい。

例えば、酵素標識法、p.62、石川栄治著、学会出版センター,1991年；医化学実験講座、第8巻、山村雄一監修、第1版、中山書店、1971；図説 蛍光抗体、川生明著、第1版、（株）ソフトサイエンス社、1983年；酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、室井潔編、第2版、医学書院、1982年等;モレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル セカンド エディション、Ｊ．サムブルック，Ｅ．Ｆ．フリッシュ，Ｔ．マニアティス、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス等に記載の方法）や、アビジン（又はストレプトアビジン）とビオチンの反応を利用した常法等を適宜利用して行えばよい。

上記した如き標識物質をタンパク質に結合させる（標識する）市販のキットを用い、キットに添付の取扱説明書に従って、抗PSMA抗体の標識を行ってもよい。

また、高速液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動法、キャピラリーチップ電気泳動法を実施する場合、抗原抗体複合物と遊離の標識抗PSMA抗体とをより明確に分離するために、例えばDNA、RNA等の核酸等の分離向上物質を結合させてもよい（特許第3070418号、特許第3531372号等）。

(2) 細胞外小胞
複合体２形成工程に係る工程(A-1)で得られた細胞外小胞は、実質的にPS細胞外小胞のみを含有する場合と、PS細胞外小胞とホスファチジルセリンを有さない細胞外小胞の両方を含有する場合がある。工程(A-1)において、PSアフィニティー法で得られた細胞外小胞は、実質的にPS細胞外小胞のみであるため、好ましい。
以下の複合体２形成工程に関する説明では、特に記載しない限り、「(A-1)で得られた細胞外小胞」、又は「細胞外小胞」と記載した場合、上記の両方の細胞外小胞の場合を含む。

(3) PS親和性物質
複合体２形成工程に用いられるPS親和性物質は、前記した＜3. ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質＞の項に記載した通りである。具体例、好ましい例等も同じであり、Timタンパク質が好ましい。Tim4がより好ましい。

尚、本発明に係るPS親和性物質は、不溶性担体に固定化されたものであっても、標識物質で標識されたものであってもよいが、複合体２形成工程で標識された抗PSMA抗体を用いる場合、遊離の標識抗PSMA抗体と複合体２とを分離する必要がある。この場合は、上記したPS親和性物質は不溶性担体に固定化されたものであることが好ましい。そうすれば、複合体２を形成した後、遊離の標識抗PSMA抗体と複合体２は、公知のB/F分離法により分離することができる。

PS親和性物質を標識する方法及びそれに用いられる標識物質等の具体例は、上記した抗PSMA抗体を標識する記載された方法及び標識物質の具体例等に準する。

「(A-2)複合体２形成工程」に用いる不溶性担体は、粒子（ビーズ）又はマイクロプレートが好ましく、粒子の場合、その大きさは特に限定されないが、通常10 nm～100 μm、好ましくは100 nm～10μmのものが挙げられる。またマイクロプレートの場合、そのウェルの数、大きさは特に限定されないが、通常12穴～1536穴、好ましくは96穴～384穴のものが挙げられる。

PS親和性物質を不溶性担体に固定化させる方法及びその好ましい具体例は、前記した(A-1-1)の複合体１形成工程の「PS親和性物質を不溶性担体に固定化させる方法］の項に記載した通りである。具体例、好ましい例等も同じであり、Timタンパク質を不溶性担体に固定化したTim担体が好ましい。Tim4を不溶性担体に固定化したTim4担体がより好ましい。

(4) 複合体２形成工程
複合体２形成工程において、工程(A-1)で得られた細胞外小胞とTimタンパク質とを接触させる場合、カルシウムイオンの存在下で行う。その溶液中のカルシウムイオン濃度は、通常0.5 mM～100 mM、好ましくは1 mM～50 mM、より好ましくは2 mM～50 mMである。尚、本発明に係る複合体２が形成され、複合体２の量を測定する工程に付すまでの当該複合体２を含有する溶液中には、前記の濃度のカルシウムイオンが必要である。

また、カルシウムイオンの由来は特に限定されず、前記工程(A-1-1)におけるカルシウムイオンの由来と同様の具体例が挙げられる。

カルシウムイオンの存在下に工程(A-1)で得られた細胞外小胞とPS親和性物質とを接触させる方法の例としては、該細胞外小胞とPS親和性物質とを接触させる際のカルシウムイオン濃度が、上記した範囲となるように、カルシウムイオンを含有する溶液と、該細胞外小胞を含有する溶液と、PS親和性物質を含有する溶液を混合させる方法が挙げられる。

前記カルシウムイオンを含有する溶液において、カルシウムイオンを溶解させる溶液およびその添加剤の例は、前記工程(A-1)の「(2)複合体１形成工程」の項に記載された通りであり、具体例、好ましい例等も同じである。

工程(A-1)で得られた細胞外小胞と、PS親和性物質と、抗PSMA抗体とを接触させる順序は同時であっても、また異なっていてもよいが、該細胞外小胞をPS親和性物質と接触させた後、抗PSMA抗体と接触させるのが望ましい。

(4-1) 細胞外小胞とPS親和性物質との反応
PS親和性物質と反応させる、工程(A-1)で得られた細胞外小胞を含有する溶液の量は、PS親和性物質がビーズに固定化されている場合、当該担体1 mｇに対し通常0.1 mL～1000 mL、好ましくは0.1 mL～500 mL、より好ましくは0.1 mL～100 mLで、PS親和性物質がマイクロプレートに固定化されている場合、1ウェルに、通常50 μL～300 μL、好ましくは50 μL～200 μL、より好ましくは50 μL～150 μLである。

細胞外小胞とPS親和性物質とを接触させる際の温度は、通常2～37℃、好ましくは2～30℃である。また、細胞外小胞とPS親和性物質との接触時間としては、通常0.5～24時間、好ましくは0.5～20時間、より好ましくは0.5～12時間である。

細胞外小胞とPS親和性物質とを接触させる方法の例として、PS親和性物質として不溶性担体に固定化されたTimタンパク質（Tim担体）を用いる場合を例にとり、以下に説明する。

Tim担体の不溶性担体としてビーズを用いる場合、Tim担体1mg当たり通常0.1～1000ml、好ましくは0.1～500ml、より好ましくは0.1～100mlの量の工程(A-1)で得られた細胞外小胞を含有する溶液と、工程(A-1)で得られた細胞外小胞を含有する溶液とTim担体と本発明に係るカルシウムイオンを含有する溶液とを混合後の溶液1mL当たり通常0.001～20mg、好ましくは0.005～10mg、より好ましくは0.01～6.0mgとなる量のTim担体と、該細胞外小胞を含有する溶液とTim担体と本発明に係るカルシウムイオンを含有する溶液とを混合後の溶液中のカルシウムイオン濃度が通常0.5～100mM、好ましくは1.0～10mM、より好ましくは2.0～5.0mMとなる量のカルシウムイオンを含有する溶液とを接触させる。通常2～37℃、好ましくは2～30℃で通常0.5～24時間、好ましくは1～20時間、より好ましくは1～12時間接触させて、PS細胞外小胞とビーズ担体に固定化されたTimタンパク質との複合体を形成させる。

Tim担体の不溶性担体としてマイクロプレートを用いる場合、Timタンパク質を固定化したマイクロプレートの各ウェルに、Tim担体と工程(A-1)で得られた細胞外小胞を含有する溶液とを接触させる際の溶液中のカルシウムイオン濃度が通常0.5～100mM、好ましくは1.0～50mM、より好ましくは2.0～50mMとなる量の本発明に係るカルシウムイオンを含有する溶液と、工程(A-1)で得られた該細胞外小胞を含有する溶液を1ウェルあたり通常50μL～300μL、好ましくは100μL～200μL添加し、通常2℃～37℃、好ましくは2℃～30℃で通常0.5～24時間、好ましくは0.5～20時間、より好ましくは0.5～12時間反応させることにより、PS細胞外小胞とマイクロプレート担体に固定化されたTimタンパク質との複合体を形成させる。

(4-2) 複合体２形成：PS細胞外小胞とPS親和性物質との複合体と、抗PSMA抗体との反応

PS細胞外小胞とPS親和性物質との複合体を得た後、得られた該複合体と、抗PSMA抗体を接触させて、反応させることにより、複合体２を得る。

複合体２形成工程において使用する抗PSMA抗体の使用濃度は、通常免疫学的測定におけるこの分野で用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。

PS細胞外小胞とPS親和性物質の複合体と反応させる抗PSMA抗体の希釈倍率は、抗体の活性や濃度によって異なるが、通常10倍～1000000倍、好ましくは1000倍～100000倍である。

抗PSMA抗体の希釈液としては、カルシウムイオンを含有する以外は、PS親和性物質とPS細胞外小胞との複合体と抗PSMA抗体との結合を妨げないものであればよく、例えば水、pH7.0～8.0、好ましくは7.2～7.6に緩衝作用を有する緩衝液（例えばTBS、HBS等）等が挙げられる。尚、リン酸バッファーはカルシウムと結合して沈殿が生じるので好ましくない。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常5～50mM、好ましくは10～30mMの範囲から適宜選択され、NaCl濃度は通常100～200mM、好ましくは140～160mMの範囲から適宜選択される。この溶液中には、PS親和性物質とPS細胞外小胞との複合体と抗PSMA抗体との結合を妨げない量であれば、例えば糖類、NaCl等の塩類、界面活性剤、防腐剤、BSA等のタンパク質等が含まれていても良い。界面活性剤としては、例えばTween20等が挙げられ、当該溶液における界面活性剤の濃度は、通常0.00001～0.2％、好ましくは通常0.0005～0.1％である。また当該希釈液のカルシウムイオン含有濃度は通常0.5～100mM、好ましくは通常1～10mM、より好ましくは通常2～5mMである。

PS細胞外小胞とPS親和性物質の複合体と反応させる抗PSMA抗体溶液の量は、PS親和性物質がビーズに固定化されている場合、当該担体1 mｇに対し通常0.1 mL～1000 mL、好ましくは0.1 mL～500 mL、より好ましくは0.1 mL～100 mLで、PS親和性物質がマイクロプレートに固定化されている場合、1ウェルに、通常50 μL～300 μL、好ましくは50 μL～200 μL、より好ましくは50 μL～150 μLである。

PS細胞外小胞とPS親和性物質の複合体と、抗PSMA抗体とを接触させる際の温度は、通常2～37℃、好ましくは10～37℃、より好ましくは20～30℃である。また、抗PSMA抗体と当該複合体との反応時間は、通常0.5～12時間、好ましくは1～4時間、より好ましくは1～2時間である。

複合体２形成工程の後、(A-3)の測定工程を行う前に、複合体２形成工程で得られた[不溶性担体に固定化されたPS親和性物質とPS-PSMA細胞外小胞と標識抗PSMA抗体との複合体]である複合体２を、反応液から分離する工程を行ってもよい。

この複合体２分離工程は、複合体２と反応液とを分離する、言い換えればいわゆるB／F分離することができればどのような方法であってもよく、この分野で用いられるB／F分離法が使用できる。具体的には、工程(A-1-3)の取得方法における複合体１分離工程と同じ方法でよい。

(5) 洗浄操作

本発明に係る(A-2)の各工程の間に適宜洗浄操作を行うのは任意である。但し、当該洗浄操作は、カルシウムイオンの存在下に行われる。例えば、前記した(A-1-2)の複合体１分離工程の項に記載された「カルシウムイオン含有洗浄溶液」を用いて、通常の洗浄操作を行えばよい。

●(A-3) 測定工程について
(A-3)の測定工程は、「工程(A-2)で得られた複合体２の量を測定することにより、PS-PSMA細胞外小胞の量を測定する工程」である。

本発明に係る複合体２の量を測定する方法としては、例えば、酵素免疫測定法（EIA）、ラジオイムノアッセイ法（RIA）、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）、蛍光免疫測定法（FIA）、簡易イムノクロマトグラフィーによる測定法、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、キャピラリーチップ電気泳動法、質量分析法、免疫比ろう法、免疫比濁法、等が挙げられる。中でも酵素免疫測定法（EIA）、又は酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）が好ましく、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）がより好ましい。

これらの測定原理としては、例えばサンドイッチ法、競合法、二抗体法等が挙げられ、サンドイッチ法が好ましい。また、不溶性担体等を用い、B/F分離を行うヘテロジニアスな方法で測定することも、B/F分離を行わないホモジニアスな方法で測定することも可能である。

工程(A-2)で標識抗PSMA抗体を用い、生成した[PS親和性物質とPS-PSMA細胞外小胞と標識抗PSMA抗体との複合体２]の量を測定する場合には、当該複合体２中の標識抗PSMA抗体に由来する標識量を測定すればよい。その方法は、標識物質の種類により異なり、標識物質が有している性質に応じて、それぞれ所定の方法に従い実施すればよい。

例えば、標識物質が酵素の場合には、免疫測定法の常法、例えば「酵素免疫測定法」（蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、51～63,共立出版（株）、1987）等に記載された方法に準じて測定を行えばよい。

標識物質が放射性物質の場合には、例えばRIAで行われている常法に従い、該放射性物質の出す放射線の種類および強さに応じて液浸型GMカウンター、液体シンチレーションカウンター、井戸型シンチレーションカウンター、HPLC用カウンター等の測定機器を適宜選択して使用し、測定を行えばよい（例えば医化学実験講座、第8巻、山村雄一監修、第1版、中山書店、1971等参照）。

標識物質が蛍光性物質の場合には、例えば蛍光光度計等の測定機器を用いるFIAで行われている常法、例えば「図説 蛍光抗体、川生明著、第1版、（株）ソフトサイエンス社、1983」等に記載された方法に準じて測定を行えばよい。

標識物質が発光性物質の場合には、EnVision（パーキンエルマー社製)等のマイクロプレートリーダー、フォトカウンター等の測定機器を用い、各測定機器に応じた測定方法で測定を行えばよい。

標識物質が紫外部に吸収を有する物質の場合には、分光光度計等の測定機器を用いる常法によって測定を行えばよい。標識物質がスピンの性質を有する場合には、電子スピン共鳴装置を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法」（蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、264～271、共立出版（株）、1987）等に記載された方法に準じてそれぞれ測定を行えばよい。

標識物質が酵素である場合は、これを発色試薬と反応させて発色反応に導き、その結果生成する色素量を分光光度計等により測定する方法等の自体公知の方法が挙げられる。尚、発色反応を停止させるために、例えば反応液に1～6Nの硫酸等の酵素活性阻害剤や、キットに添付の反応停止剤を添加する等、通常この分野で行われている反応停止方法を利用してもよい。

上記発色試薬としては、例えば標識物としてアルカリホスファターゼを用いる場合、CDP-Star^TM（Tropix, Inc.商品名、2-クロロ-5-(4-メトキシスピロ[1,2-ジオキセタン-3,2’-(5-クロロトリシクロ[3.3.1.1^3.7]デカン])-4-イル]-1-フェニルリン酸二ナトリウム）、AMPPD、CSPD等のアルカリホスファターゼのジオキセタン系化学発光基質等が挙げられる。標識物質としてペルオキシダーゼを用いる場合、テトラメチルベンジジン（TMB）溶液又はオルトフェニレンジアミン(OPD)溶液が挙げられ、好ましくはTMB溶液が挙げられる。その他、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMBZ）、ｏ-フェニレンジアミン、ｏ-ニトロフェニル-β-D-ガラクトシド、2，2’-アジノ-ビス（3-エチルベンズチアゾリン-6-スルホン酸）（ABTS）、N-エチル-N-スルホプロピル-m-アニシジン（ADPS）、p-ニトロフェニルリン酸等、通常この分野で用いられる発色試薬が挙げられる。

本発明に係るPS-PSMA細胞外小胞の量の測定方法に用いられる、試薬及びその測定時の濃度、測定を実施するに際しての測定条件等（反応温度、反応時間、反応時のｐＨ，測定波長、測定装置等）は、すべて自体公知の上記した如き免疫学的測定法の測定操作法に準じて選択すればよい。

工程(A-3)の測定工程は、用手法に限らず、自動分析装置を用いた測定系で行ってもよい。尚、用手法又は自動分析装置を用いて測定を行う場合の試薬類等の組み合わせ等については、特に制約はなく、適用する自動分析装置の環境、機種に合わせて、或いは、他の要因を考慮にいれて最も良いと思われる試薬類等の組み合わせを適宜選択して用いればよい。

本発明に係るPS-PSMA細胞外小胞の量の測定方法の具体例として、不溶性担体に固定化したPS親和性物質と、アルカリホスファターゼ(ALP)で標識した抗PSMA抗体を用いて試料中のPS-PSMA細胞外小胞の量を測定する場合の方法を以下に記載する。

例えばマイクロプレートに固定化されたPS親和性物質を用いてELISA法によりおこなう場合、PS細胞外小胞とマイクロプレートに固定化されたPS親和性物質との複合体形成後、要すればさらに洗浄操作を行った後、該マイクロプレートの各ウェルに対して、ALP標識抗PSMA抗体を通常0.5～100mＭ、好ましくは通常1～50mＭ、より好ましくは通常2～50mＭのカルシウムイオンを含有する抗PSMA抗体の希釈液で通常10倍～1000000倍、好ましくは1000倍～100000倍希釈した希釈溶液を、1ウェルあたり通常50μL～300μL、好ましくは50μL～200μL、より好ましくは50μL～100μL添加し、通常2～37℃、好ましくは10～37℃で0.5～12時間、好ましくは1～4時間反応させる。
次いで、カルシウムイオン含有洗浄用溶液を用いて各ウェルを洗浄する。
更に、CDP-Star Substance with Emerald II Enhancer（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）等のALP酵素反応基質溶液を1ウェル当たり通常50 μL～300 μL、好ましくは50 μL～200 μL、より好ましくは50μL～100μL各ウェルに添加し、通常2℃～37℃、好ましくは20℃～30℃で5分間～60分間、好ましくは10分間～40分間反応させる。その後、EnVision（パーキンエルマー社製）等のマイクロプレートリーダー等の測定機器を用いて化学発光シグナルを測定すればよい。
得られた測定値を用い、続いて転移性PSMAの判定工程を行えばよい。

＜(B) 本発明に係る判定工程について＞
本発明に係る判定工程は、PS-PSMA細胞外小胞の量を本発明に係る測定工程により測定し、得られた測定結果に基づいて被検者が転移性CRPCに罹患しているか否かを判定する工程である。

すなわち、上記「(A)本発明に係る測定工程について」の項に記載の方法により被検者由来生体試料中のPS-PSMA細胞外小胞の量を測定し、その結果を基に、転移性CRPCを判定するための、PS-PSMA細胞外小胞に関するデータ（例えばPS-PSMA細胞外小胞の存在の有無、濃度、量の増加の程度等の情報）を得る。得られたデータを用いて、例えば下記の方法で、転移性CRPCの判定（診断・検査）を行う。

例えば予め基準値（カットオフ値）を設定しておき、PS-PSMA細胞外小胞の測定結果（測定値）がその基準値以上の場合には、試料を提供した被検者は、転移性CRPCに罹患している可能性がある、転移性CRPCに罹患している可能性が高い、転移性CRPCに移行する可能性がある、転移性CRPCに移行する可能性が高い、等の判定を下すことが出来る。

前記基準値（カットオフ値）は、転移性CRPC患者と転移性CRPC以外の前立腺疾患（非転移性CRPC、CRPC以外の前立腺癌、又は前立腺肥大症）患者又は健常者由来試料を用いて上記測定方法により試料中のPS-PSMA細胞外小胞の量を測定し、その値の境界値等を元に設定されればよい。転移性CRPC疾患以外の前立腺疾患（非転移性CRPC、CRPC以外の前立腺癌、又は前立腺肥大症）患者又は健常者のPS-PSMA細胞外小胞の量の平均値を基準値と設定してもよい。

また、上記基準値（カットオフ値）は、転移性CRPCに罹患している被検者由来の試料を用いて本発明に係る測定工程により得られた測定値と、転移性CRPC以外の前立腺疾患（非転移性CRPC、CRPC以外の前立腺癌、又は前立腺肥大症）患者又は健常者由来の試料を用いて本発明に係る測定工程により得られた値（以下、健常者由来の値と略記する場合がある）とを用いてＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線解析等の統計解析に基づいて決定することができる。
また、上記基準値（カットオフ値等）の感度又は／特異度は、例えば60％以上、好ましくは70％以上、より好ましくは80％以上、更に好ましくは90％以上である。

別の形態として、当該検体中のPS-PSMA細胞外小胞の量又はその量的範囲（測定値又は測定値の範囲）に対応させて複数の判定区分を設定して判定する方法が挙げられる。例えば、［（１）非転移性CRPCのおそれはない、（２）非転移性CRPCのおそれは低い、（３）非転移性CRPCの兆候がある、（４）非転移性CRPCのおそれが高い、等］の判定区分を設定する。そして、被検者由来生体試料中のPS-PSMA細胞外小胞の量の測定結果がどの判定区分に入るかを判定することにより非転移性CRPCの判定を下すことが出来る。

更に別の形態として、同一被検者において、ある時点で測定された被検者由来生体試料中のPS-PSMA細胞外小胞の測定結果と、異なる時点で測定された被検者由来生体試料中のPS-PSMA細胞外小胞の測定結果とを比較し、測定結果（測定値）の増減及び／又は増減の程度を評価することによっても判定が可能である。例えば、測定結果（測定値）の増加が認められた場合には、試料を提供した被検者が転移性CRPCへ病態が進行した可能性がある等の判定が可能である。

本発明の転移性CRPCの判定を補助する方法により被検者である患者が転移性CRPCに罹患している可能性がある、又はその可能性が高いと判定された場合には、更に病理組織検査等の侵襲的検査や、造影剤、核種、小分子化合物、抗体等うちのいずれかまたはこの組み合わせの使用を含む各種画像検査等をおこなうことを選択できる。また、治療法の変更を行うことを選択できる。
一方、本発明の補助方法により被検者である患者が転移性CRPCに罹患していない可能性がある又はその可能性が低いと判定された場合には、同様の治療の継続や局所治療の追加または治療の休止といった治療方針を選択することができる。

＜5. 本発明の転移性CRPCの診断補助用検査キット＞
本発明の転移性CRPCの診断補助用検査キット（以下、「本発明のキット」と略記する場合がある。）は、PS-PSMA細胞外小胞の測定のために使用される、PS親和性物質、及び抗PSMA抗体を構成要素として含むものである。PS親和性物質、及び抗PSMA抗体は、それぞれ溶液状態、凍結状態、乾燥状態、又は凍結乾燥状態であってもよい。

上記「PS親和性物質」は、不溶性担体に結合したものであってもよい。PS親和性物質及び不溶性担体に結合したPS親和性物質については、上記＜3.ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質＞の項で説明した通りであり、具体例、不溶性担体及び不溶性担体への結合方法、及びこれらの好ましい例等も同じである。
また、「抗PSMA抗体」は、「標識抗PSA抗体」であってもよい。抗PSMA抗体及び標識抗PSMA抗体については、上記＜4. 転移性CRPCの診断を補助する方法＞の「(A-2),(2)PSMAに対して親和性を有する抗体〕の項に記載した通りであり、具体例、標識物質及び標識方法、及びこれらの好ましい例等も同じである。

本発明のキットは、更にPS細胞外小胞の取得のために使用されるPS親和性物質を固定化した不溶性担体を構成要素として含んでいてもよい。PS親和性物質及び不溶性担体に結合したPS親和性物質については、上記＜3.ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質＞の項で説明した通りであり、具体例、不溶性担体及び不溶性担体への結合方法、及びこれらの好ましい例等も同じである。

更に、本発明のキットには、前記カルシウムイオンを含有する溶液、カルシウムイオン含有洗浄溶液、及びカルシウムイオンキレート剤含有溶液から選ばれる少なくとも1種を含んでいてもよい。各々の構成要素の具体例、好ましい態様等については、前記した通りである。

本発明のキットの具体例としては、PS-PSMA細胞外小胞を測定するために使用される下記の何れかの構成要素を含むキット（キットＡとする。）が挙げられる。
・PS親和性物質を固定化した固相プレート及び標識物質で標識された抗PSMA抗体
・標識物質で標識されたPS親和性物質及び抗PSMA抗体を固定化した固相プレート

本発明のキットの別の具体例としては、PS-PSMA細胞外小胞の取得のために使用される下記から選択される構成要素を含むキット（キットＢとする。）が挙げられる。
・PS親和性物質を固定化したビーズ担体（PS細胞外小胞を生体試料から取得するために用いられる試薬）
・カルシウムイオンを含有する溶液
・カルシウムイオン含有洗浄溶液
・カルシウムイオンキレート剤

本発明のキットの更に別の具体例としては、上記キットＡと上記キットＢを含むものが挙げられる。

本発明のキットの好ましい具体例としては、例えば下記（１）又は（２）の構成要素を含むキットが挙げられる。

（１）PS親和性物質を固定化した固相プレート及び標識物質で標識された抗PSMA抗体、又は標識物質で標識されたPS親和性物質及び抗PSMA抗体を固定化した固相プレート、
（２）・PS親和性物質を固定化した固相プレート及び標識物質で標識された抗PSMA抗体、又は標識物質で標識されたPS親和性物質及び抗PSMA抗体を固定化した固相プレート、
・PS-PSMA細胞外小胞の取得のために使用されるPS親和性物質を固定化したビーズ担体。

上記の各キットの構成要素については前記の通りであり、その具体例及び好ましい例等も同じである。

また、これらキットに含まれる試薬中には、通常この分野で用いられる試薬類、例えば緩衝剤、増感剤、界面活性剤、防腐剤（例えばアジ化ナトリウム、サリチル酸、安息香酸等）、安定化剤（例えばアルブミン、グロブリン、水溶性ゼラチン、界面活性剤、糖類等）、賦活剤、共存物質の影響回避剤、標識物質検出用試薬等その他この分野で用いられているものであって、共存する試薬との安定性を阻害したり、PS親和性物質と細胞外小胞との反応又は結合、及び抗PSMA抗体と細胞外小胞との反応又は結合を阻害したりしないものを有していてもよい。またこれら試薬類等の濃度範囲、pH等も、各々の試薬類が有する効果を発揮するために通常用いられる濃度範囲及びpH等を適宜選択して用いればよい。

上記標識物質検出用試薬とは、抗PSMA抗体が標識物質で標識されている場合、その標識を検出するものであり、標識物質の種類により適宜選択される。例えば、テトラメチルベンジジン、オルトフェニレンジアミン等の吸光度測定用基質、ヒドロキシフェニルプロピオン酸、ヒドロキシフェニル酢酸等の蛍光基質、CDP-Star^TM、ルミノール等の発光物質、４－ニトロフェニルフォスフェート等の吸光度測定用試薬、４－メチルウンベリフェリルフォスフェート等の蛍光基質等が挙げられる。

更にまた、本発明のキットには、本発明の補助方法を行うための説明書等を含まれていてもよい。当該「説明書」とは、本発明の補助方法の特徴、原理、操作手順、判定手順等が文章又は／及び図表により実質的に記載されている本発明のキットに含まれる試薬類の取扱説明書、添付文書、パンフレット（リーフレット）等を意味する。具体的には、例えば、（ｉ）本発明に係る測定工程の原理、操作手順等が記載されたもの、（ｉｉ）本発明に係る測定工程及び判定工程の原理、操作手順等が記載されたもの等が挙げられる。

本発明のキットを用いれば、本発明の補助方法を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。

＜6. 本発明の転移性CRPCの診断を補助するための本発明のバイオマーカー＞
転移性CRPCの診断を補助するための本発明のバイオマーカーは、その膜表面にホスファチジルセリン及びPSMAを有する細胞外小胞（PS-PSMA細胞外小胞）である。当該細胞外小胞の詳細は、前記「＜1. 本発明に係る細胞外小胞＞」の欄に記載した通りである。

＜7. 本発明に係る転移性CRPCの診断補助用装置＞
本発明に係る転移性CRPCの診断補助用装置（以下、「本発明に係る補助用装置」と略記する。）は、少なくとも（１）測定部を備えている。更に、（２）判定部、（３）出力部及び（４）入力部の一つ以上を備えていてもよい。

本発明に係る補助用装置における測定部は、被検者由来の生体試料中の上記本発明のバイオマーカーであるPS-PSMA細胞外小胞の量を測定するように構成されている。具体的には、例えば、免疫学的測定法に準じた方法に用いられる装置等の測定装置が挙げられる。
尚、要すれば、測定部では、測定された測定値に基づいて、上記本発明のバイオマーカーの量を算出するように構成されていてもよい。

本発明に係る補助用装置における判定部は、測定部における測定で得られた測定値が基準値以上か否かを判定するように構成されている。
又は、本発明に係る補助用装置における判定部は、測定部にて得られた被験者に由来する生体試料中のPS-PSMA細胞外小胞の量を測定する測定部、及び前記PS-PSMA細胞外小胞の量を指標として、被検者が転移性CRPCに罹患しているかを判定するように構成されている。
例えば、測定部にて測定された測定値を、あらかじめ設定された基準値（カットオフ値）と比較して、該基準値以上であるか、又は該基準値未満であるかを判定するように構成されていてもよい。

本発明に係る補助用装置における出力部は、測定部にて得られた結果又は／及び判定部にて得られた結果を出力するよう構成されている。

本発明に係る補助用装置における入力部は、操作する者の操作を受けて、測定部へ、当該測定部を作動させるための信号を送るよう構成されている。

本発明に係る補助用装置を構成する上記（１）～（４）の装置は、同一の装置内に配置されていても、それぞれ別体となっていてもよい。

本発明に係る補助用装置において、当該補助用装置に係る被検者、生体由来試料、PS-PSMA細胞外小胞については前記した通りであり、その具体例及び好ましい例等も同じである。

本発明に係る補助用装置の測定部及び判定部によりなされる測定、判定等については、＜4. 転移性CRPCの診断を補助する方法＞にて説明した通りであり、好ましい例、具体例等も同じである。

上記本発明に係る補助用装置を用いれば、本発明の補助方法を簡便、短時間且つ精度よく行うことができる。

＜8. 本発明に係る転移性CRPCを治療する方法＞
本発明に係る転移性CRPCを治療する方法（以下、「本発明に係る治療方法」と略記する。）は、被検者由来生体試料中の本発明のバイオマーカーの量を測定し、得られた測定結果に基づいて被検者が転移性CRPCに罹患しているか否かを判定し、その判定結果に基づいて転移性CRPCのおそれがある又は転移性CRPCのおそれが高いと判定された患者に適切な治療を施すことによりなされる。
尚、本発明に係る治療方法における被検者由来生体試料、マーカー、測定、判定等については、前記の＜4. 転移性CRPCの診断を補助する方法＞の項で説明した通りであり、好ましい例、具体例等も同じである。

本発明に係る治療方法における適切な治療としては、具体的には、例えば、外科的治療、放射線療法（外照射、内照射、核種の体内投与を含む）、抗癌化学慮法（ドセタキセル、カバジタキセル等）、アンドロゲン除去療法（リュープロレリン、ゴセレリン、デガレリクス等）、抗アンドロゲン療法（アンドロゲンレセプター阻害薬：ビカルタミド、フルタミド、アパルタミド、エンザルタミド等、アンドロゲン産生抑制薬：アビラテロン、女性ホルモン：エストラムスチン、エチニルエストラジオール等）、その他の薬剤による治療法（免疫チェックポイント阻害薬：ペンブロリツマブ等、分子標的薬等）等が挙げられる。

以下に実施例及び比較例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例等により何等限定されるものではない。

実施例１．PSMA-細胞外小胞の測定
(1) Tim4固定化ビーズの取得
Dynabeads MyOne Streptavidin C1（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を 1検体当たり75 μg分取した1.5 mLチューブに、Tim4タンパク質(富士フイルム和光純薬(株)製)を1検体当たり125 ng含有するTBS-T溶液（Tris buffer, 0.01% Tween 20）を添加して、室温で1時間反応させた後、0.1% BSA含有TBS-T溶液で5回洗浄し、Tim4タンパク質が結合したビーズ(Tim4ビーズ)を得た。

(2) 試料の調製
Tim4ビーズを用い、下記の方法で膜表面にホスファチジルセリンを有する細胞外小胞（PS細胞外小胞）を含有する試料を調製した。
上記(1)で得られたTim4ビーズに、終濃度が4 mMとなるようにCaCl₂を添加した2% BSA含有TBS（Tris buffer）を1検体当たり50 μL加え懸濁した。得られたTim4ビーズ懸濁液を、96ウェルのポリプロピレンプレートに1ウェル当たり50 μL（１ウェル当たりTim4ビーズ75 μg、Tim4として125 ng）となるように分注した。
転移があることが確認されたCRPC患者（転移性CRPC患者、n=12）、転移が認められなかったCRPC患者（非転移性CRPC患者、n=2）、CRPCでないことが確認されている前立腺癌患者（n=70）、前立腺肥大症患者（n=24）、又は健常者（n=10）由来の血清を、Tim4ビーズ懸濁液を分注した96ウェルプレートのウェルに、50 μLずつ加え、室温で撹拌しながら1時間反応させた。
反応後、96ウェルプレートを、96ウェルプレート用マグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁にTim4ビーズを集合させ、反応液を除去した。その後、2 mM CaCl₂含有TBS-T 200 μLで、各ウェルを5回洗浄操作した。
洗浄後のTim4ビーズに、溶出液として2 mM EDTA含有TBS を50 μL添加した後、室温で10分間撹拌した。その後、96ウェルプレートを、96ウェルプレート用マグネットスタンドに設置し、磁力を用いて管壁にTim4ビーズを集合させ、上清(溶出液)を回収した。
得られた上清を、試料として用いた。この試料は、膜表面にホスファチジルセリンを有する細胞外小胞（PS細胞外小胞）を含有する。

(3) ELISAによる細胞外小胞の測定
下記1)～3)の方法で、試料中のホスファチジルセリン及びPSMAを有する細胞外小胞（PS-PSMA細胞外小胞）の量を測定した。

1) Tim4プレートの取得
白色のMaxiSorp96ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に、1.25 μg/mL Tim4 (50 mM炭酸バッファー pH9.6)を1ウェル当たり100 μLずつ分注した。4℃で一晩静置した後、TBS-T （Trs buffer）400 μLで3回洗浄した。

2) アルカリホスファターゼ(ALP)標識抗PSMA抗体の取得
PSMA抗体（ミルテニーバイオテク社製）を、ALP標識キット-SH（同仁化学(株)製）を用い、キットに添付の取扱説明書に従って、ALP標識を行った。

3) ELISA
上記1)で得られたTim4プレートに、1% BSA含有TBSを1ウェル当たり200 μL加え、撹拌しながら室温で1時間ブロッキングした。その後TBS-T 400 μLでウェルを3回洗浄した後、終濃度が40 mMとなるようにCaCl₂を添加した2% BSA含有TBSを1ウェル当たり50 μL分注した。そこに上記(2)で調製した試料を加え、撹拌しながら室温で1時間反応させた。反応後、2 mM CaCl₂含有TBS-T 400μLで、各ウェルを5回洗浄した。
洗浄後、上記2)で得られたALP標識抗PSMA抗体を0.25 μg/mL（1% BSA含有TBS、2 mM CaCl₂含有）を1ウェル当たり100 μL加え、撹拌しながら室温で1時間反応させた。その後、2 mM CaCl₂TBS-T 400 μLで、各ウェルを5回洗浄した。
洗浄後、CDP-Star Substance with Emerald-II Enhancer（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）を1ウェル当たり50 μL加え、撹拌しながら30分間反応後、EnVision（パーキンエルマー社製）を用いて化学発光シグナルを測定した。

4) 結果
結果を図１に示す。図１では、測定値が転移性CRPC患者の測定値の平均値近傍にあるCRPC患者5検体を選択し、その平均値を1とし、この値に対する各疾患患者、又は健常者由来試料の測定値の相対値をそれぞれ示す。
図１より明らかな通り、転移性CRPC患者のPS-PSMA細胞外小胞の量（CRPC転移あり）が、非転移性CRPC患者（CRPC転移なし）、CRPCでないことが確認されている前立腺癌患者（PC）、前立腺肥大症患者（BPH）及び健常者（Normal）のいずれよりも有意に高値であることがわかった。
以上のことから、PS-PSMA細胞外小胞の量が転移性CRPCを判定するためのマーカーとなること、及びPS-PSMA細胞外小胞の量を測定することにより、転移性CRPCを判定することが出来ることが示された。

比較例１．従来技術との比較
実施例1で用いたものと同じ検体のうち前立腺肥大症患者（n=8）、CRPCでないことが確認されている前立腺癌患者（n=8）、及びCRPC患者(転移性RPC患者及び非転移性CRPC患者)（n=8）、及び健常者（n=10）の血清を試料として用い、実施例１の「(2)試料の調製」と同様の方法で膜表面にホスファチジルセリンを有する細胞外小胞（PS細胞外小胞）を含有する試料を調製し、以下の方法で試料中のPS-PSMA細胞外小胞の量の濃度を測定した。

(1) 試薬類の調製
1) 抗PSMA抗体固定化プレートの取得
白色のMaxiSorp96ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に50 mM炭酸バッファー pH9.6に希釈した1.25 μg/mL 抗PSMA抗体（ミルテニーバイオテク社製）を1ウェル当たり100 μLずつ分注した。4℃で一晩静置した後、TBS-T 400 μLで3回洗浄した。

2)抗CD9抗体固定化プレートの取得
白色のMaxiSorp96ウェルプレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社製）に50 mM炭酸バッファー pH9.6に希釈した1.25 μg/mL 抗CD9抗体（BioLegnd社製）を1ウェル当たり100 μLずつ分注した。4℃で一晩静置した後、TBS-T 400 μLで3回洗浄した。

3) ALP標識抗CD9抗体の取得
CD9抗体（BioLegend社製）をALP標識キット-SH（同仁化学社製）により取扱説明書に従って、ALP標識を行った。

4) ALP標識抗PSMA抗体の取得
PSMA抗体（ミルテニーバイオテク社製）をALP標識キット-SH（同仁化学社製）により取扱説明書に従って、ALP標識を行った。

(2) PS-PSMA細胞外小胞の測定
1) 固定化抗PSMA抗体―標識抗CD9抗体による測定系
上記(1)1)で得られた抗PSMA抗体固定化プレートに1% BSA含有TBSを1ウェル当たり200 μL 入れ、1時間室温で撹拌しながらブロッキングした。プレートをTBS-Tで3回洗浄した後、2% BSA含有TBSと試料（各50μL）を添加し、1時間室温で撹拌しながら反応させた。その後、プレートをTBS-Tで5回洗浄し、上記(1)3)のALP標識抗CD9抗体を0.25 μg/mLになるように希釈した1% BSA含有TBSを1ウェル当たり100 μL加え、1時間室温で撹拌しながら反応させた。反応後、TBS-Tで5回洗浄し、CDP-Star Substance with Emerald-II Enhancer (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)を1ウェル当たり50 μL加え、撹拌しながら30分間反応後、化学発光シグナルをEnVision(パーキンエルマー社製)を用いて測定した。

2) 固定化抗CD9抗体-標識抗PSMA抗体による測定系
上記(1)2)で得られた抗CD9抗体固定化プレートに1% BSA含有TBSを1ウェル当たり200 μL 入れ、1時間室温で撹拌しながらブロッキングした。プレートをTBS-Tで3回洗浄した後、2% BSA含有TBSと試料（各50μL）を添加し、1時間室温で撹拌しながら反応させた。その後、プレートをTBS-Tで5回洗浄し、上記(1)4)で得られたALP標識抗PSMA抗体を0.25 μg/mL含有した1% BSA含有TBSを1ウェル当たり100 μL加え、1時間室温で撹拌しながら反応させた。反応後、TBS-Tで5回洗浄した。次いでCDP-Star Substance with Emerald-II Enhancer (サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)をALP酵素反応基質溶液として1ウェル当たり50 μL加え、撹拌しながら30分間反応後、化学発光をEnVision (パーキンエルマー社製)を用いて測定した。

(3) 結果
結果を図２に示す。図２において、縦軸は発光強度（cps）を示す。
図２(1)は、上記(2)1)の「固定化抗PSMA抗体―標識抗CD9抗体による測定系」の結果である。また、図２(2)は、上記(2)2)の「固定化抗CD9抗体-標識抗PSMA抗体による測定系」の結果である。
上記(2)1)の方法は、非特許文献1のFigure 3のエクソソームの検出方法をELISAに転換した方法である。また、上記(2)2)の方法は、非特許文献1のFigure 3のエクソソームの検出方法をELISAに転換し、固相に固定化した抗体と標識抗体を逆にした方法である。
図２より、明らかな通り、「固定化抗PSMA抗体―標識抗CD9抗体による測定系」の場合も、「固定化抗CD9抗体-標識抗PSMA抗体による測定系」の場合も、CRPC患者（CRPC）、CRPCでないことが確認されている前立腺癌患者（PC）、及び前立腺肥大症患者（BPH）の間で、測定値に有意差はなかった。

以上のことより、従来の方法を単にELISAに転換してエクソソーム（細胞外小胞）を測定しても、CRPC患者を前立腺癌患者及び前立腺肥大症患者と区別することはできないことがわかる。

実施例２
(1) 細胞外小胞を含む試料の調製
PSMA陽性ヒト前立腺癌細胞株C4-2B細胞を培養後、培養上清を回収した。回収した培養上清90 mLをさらに2回遠心分離処理（１回目：2,000×g、10分間、2回目：12,000×g、30分間）して不純物を分離し、上清を得た。得られた培養上清サンプルをフィルターろ過（孔径0.22μm）して不純物を分離し、上清を得た。
次いで、得られた上清を超遠心分離処理（100,000×g、70分間、4℃）し、沈殿画分を得た。得られた沈殿画分をPBS(-)にて懸濁し、再度超遠心分離処理（100,000×g、70分間、4℃）し、沈殿の洗浄を行った。この洗浄操作をもう一度行った後、得られた沈殿画分をPBS(-) 100 μLに懸濁した。試料中のタンパク質量を常法により測定した。

(2) 測定用試料１の調製
TBSで50%に希釈したヒトプール血清に、上記(1)で得られた細胞外小胞を含む試料を、シグナル強度測定時のタンパク質量の終濃度が 0 ng/well, 0.39 ng/well, 0.78 ng/well, 1.56 ng/well, 3.12 ng/well, 6.25 ng/well, 12.5 ng/well,及び 25 ng/wellとなるようにそれぞれ添加し、測定用試料１として用いた。すなわち、測定用試料１は、細胞外小胞を含有するヒト血清試料である。

(3) 測定用試料２の調製
TBSで50%に希釈したヒトプール血清に上記(1)で得られた細胞外小胞を含む試料を、シグナル強度測定時のタンパク質量の終濃度が0 ng/well, 0.39 ng/well, 0.78 ng/well, 1.56 ng/well, 3.12 ng/well, 6.25 ng/well, 12.5 ng/well,及び 25 ng/wellとなるようにそれぞれ添加した。次いでCRPC患者等由来の血清の代わりに、この細胞外小胞を添加したヒトプール血清を用いる以外は、実施例１の「(2)試料の調製」と同様の方法を実施し、膜表面にホスファチジルセリンを有する細胞外小胞を含有する上清を得、測定用試料２として用いた。
すなわち、測定用試料２は、Tim4担体（Tim4ビーズ）を用い、細胞外小胞を含むヒト血清からPS細胞外小胞を分離して得られた、PS細胞外小胞を含有する試料である。

(4)ELISAによる細胞外小胞の測定
上記(2)で得られた測定用試料１、及び上記(3)で得られた測定用試料２を用い、それぞれ実施例１の「(3)ELISAによる細胞外小胞の測定」と同様の方法で、試料中のPS-PSMA細胞外小胞の量（シグナル強度）を測定した。

(5)結果
得られた結果を図３に示す。
図３において、―□―は、上記(2)で得られた測定用試料１を用いて測定を行った結果を示す。また、―×―は、上記(3)で得られた測定用試料２を用いて測定を行った結果を示す。
図３から明らかな通り、本発明に係るPS親和性物質であるTim4を用いて血清中のPS細胞外小胞を取得し、次いで本発明に係るPS-PSMA細胞外小胞の測定を行うことにより、血清中に含まれる夾雑物等に由来する測定のバックグラウンドをほぼ消すことが出来ることがわかる。

本発明によれば、非侵襲的な転移性CRPCの診断が可能となる。
また、ホルモン療法治療中に、血中PSAの測定と併せて、本発明によりPS-PSMA細胞外小胞を測定し、これらの値をモニタリングすることにより、転移を含むCRPCの進行の診断補助としての利用が可能となり、従来のPSA測定のみによる診断を行うことによる転移性CRPC診断の見逃しを減少することができる。
更にPSA上昇を伴わないCRPCの進行を診断するためのモニタリングでは、頻回の画像検査が必要であるが、本発明によれば、画像検査が不要な患者に対し頻回の画像検査を行うことが避けられ、結果として不要な放射線被爆を減らすことが出来る。
本邦ではPSMAに親和性の高い化合物を放射標識して用いるPSMA-PETの臨床試験が2019年9月に開始されたが、PSMA-PETを受ける前のコンパニオン診断として、本発明によるPS-PSMA細胞外小胞の量の測定を行い、その値が高い場合においてPSMA-PETを施行するようにすることで、医療費の抑制や患者の放射線被爆の減少に貢献することが可能となる。
更にまた、本発明を用いた「PSMA－PETのコンパニオン診断」への用途が期待される。

Claims (14)

1. 被験者に由来する生体試料中のホスファチジルセリン及び前立腺特異的膜抗原を膜表面に有する細胞外小胞の量を測定すること、並びに、前記ホスファチジルセリン及び前立腺特異的膜抗原を有する細胞外小胞の量が基準値以上の場合に、被験者が転移性去勢抵抗性前立腺癌であると判定することを含む、転移性去勢抵抗性前立腺癌の診断を補助する方法。
2. 前記測定が、ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質、及び前立腺特異的膜抗原に対して親和性を有する抗体を用いる測定である、請求項１に記載の方法。
3. 前記測定が、下記工程（１）～（３）を含む、請求項１に記載の方法：
   （１）被検者に由来する生体試料から細胞外小胞を取得する工程、
   （２）前記工程（１）で得られた細胞外小胞とホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質と前立腺特異的膜抗原に親和性を有する抗体とを接触させて、ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質とホスファチジルセリン及び前立腺特異的膜抗原を有する細胞外小胞と前立腺特異的膜抗原に対して親和性を有する抗体の複合体２を形成させる工程、
   （３）前記工程（２）で得られた複合体２の量を測定することにより、ホスファチジルセリン及び前立腺特異的膜抗原を有する細胞外小胞の量を測定する工程。
4. 前記測定が、下記工程（１）～（３）を含む、請求項１に記載の方法：
   （１）被検者に由来する生体試料と、ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質とを接触させて、前記生体試料中のホスファチジルセリンを有する細胞外小胞と前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質との複合体１を形成させた後、前記複合体１から前記ホスファチジルセリンを有する細胞外小胞を分離し、前記ホスファチジルセリンを有する細胞外小胞を取得する工程、
   （２）前記工程（１）で得られたホスファチジルセリンを有する細胞外小胞とホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質と前立腺特異的膜抗原に対して親和性を有する抗体とを接触させて、前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質と、ホスファチジルセリン及び前立腺特異的膜抗原を有する細胞外小胞と前記前立腺特異的膜抗原に対して親和性を有する抗体との複合体２を形成させる工程、
   （３）前記工程（２）で得られた複合体２の量を測定することにより、前記ホスファチジルセリン及び前立腺特異的膜抗原を有する細胞外小胞の量を測定する工程。
5. 前記工程（１）において、ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質が不溶性担体に結合している、請求項４に記載の方法。
6. 前記工程（１）が以下の工程を含む、請求項４に記載の方法：
   （１－１）前記生体試料と、ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質とを接触させて、前記生体試料中のホスファチジルセリンを有する細胞外小胞と前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質との複合体１を形成させる工程。
   （１－２）前記生体試料から、前記工程（１－１）で得られた複合体１を分離し、取得する工程
   （１－３）前記工程（１－２）で取得した前記複合体１から前記ホスファチジルセリンを有する細胞外小胞を分離し、前記ホスファチジルセリンを有する細胞外小胞を取得する工程。
7. 前記ホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質が、Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチン含有タンパク質である、請求項２に記載の方法。
8. 前記Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチン含有タンパク質が、Ｔ細胞免疫グロブリン・ムチン含有タンパク質１又はＴ細胞免疫グロブリン・ムチン含有タンパク質４である、請求項７に記載の方法。
9. 前記生体試料が血液試料である、請求項１に記載の方法。
10. ホスファチジルセリン及び前立腺特異的膜抗原を膜表面に有する細胞外小胞の測定のために使用されるホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質、及び前立腺特異的膜抗原に対して親和性を有する抗体を含む、転移性去勢抵抗性前立腺癌の診断補助用検査キット。
11. 更にホスファチジルセリンを有する細胞外小胞の取得のために使用されるホスファチジルセリンに対して親和性を有する物質を固定化した不溶性担体を含む、請求項１０に記載のキット。
12. ホスファチジルセリン及び前立腺特異的膜抗原を膜表面に有する細胞外小胞を含む、転移性去勢抵抗性前立腺癌の診断用バイオマーカー。
13. 被験者に由来する生体試料中のホスファチジルセリン及び前立腺特異的膜抗原を膜表面に有する細胞外小胞の量を測定する測定部を有する、転移性去勢抵抗性前立腺癌診断補助用装置。
14. 更に測定部における測定で得られた測定値が基準値以上か否かを判定する判定部を有する、請求項１３に記載の装置。

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