JP4195492B1 - 急性虚血性疾患の診断薬 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】急性虚血性疾患が疑われる対象由来の血液と、ADAMTSを認識する抗体とを接触させ、形成された複合体を検出する。ADAMTSの血中濃度によって、急性虚血性疾患に罹患しているか否か、当該疾患を発症してからの時間、症状の重篤度などを判別することができる。
【選択図】なし
Description
Circ.J.2006 Apr;70(4):419−25. J.Biol.Chem.,1999 Aug 13;274(33):23349−23357. Connective Tissue,34,87(2002) J.Biochem.136,439−446(2004)
[1]下記の工程:
(1)急性虚血性疾患が疑われる対象由来の血液と、ADAMTSを認識する抗体とを接触させる工程;および
(2)上記工程(1)で形成された複合体を検出する工程;
を含むことを特徴とする、対象におけるADAMTSを検出する方法。
[2]ADAMTSがADAMTS−1である、[1]記載の方法。
[3]抗体がモノクローナル抗体である、[1]または[2]記載の方法。
[4]急性虚血性疾患が、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、虚血性肺疾患、腎梗塞、急性腸間膜動脈閉塞症、急性動脈閉塞症、網膜動脈閉塞症および網膜静脈閉塞症から選択される少なくとも一つの疾患である、[1]〜[3]のいずれか一に記載の方法。
[5]ADAMTSを認識する抗体を含む、急性虚血性疾患診断用キット。
[6]ADAMTSがADAMTS−1である、[5]記載のキット。
[7]ADAMTSを認識する抗体を有効成分とする、急性虚血性疾患診断薬。
[8]ADAMTSがADAMTS−1である、[7]記載の診断薬。
[9]抗体がモノクローナル抗体である、[5]〜[8]のいずれか一に記載のキットまたは診断薬。
[10]急性虚血性疾患が、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、虚血性肺疾患、腎梗塞、急性腸間膜動脈閉塞症、急性動脈閉塞症、網膜動脈閉塞症および網膜静脈閉塞症から選択される少なくとも一つの疾患である、[5]〜[9]のいずれか一に記載のキットまたは診断薬。
1.ADAMTSを検出する方法
本発明のADAMTSの検出方法は、下記の工程:
(1)急性虚血性疾患が疑われる対象由来の血液と、ADAMTSを認識する抗体とを接触させる工程;および
(2)上記工程(1)で形成された複合体を検出する工程;
を含むことを特徴とする。
工程(1)は、急性虚血性疾患が疑われる対象由来の血液と、ADAMTSを認識する抗体とを接触させ、複合体を形成させる工程である。
「急性虚血性疾患」としては、具体的には、虚血性心疾患(不安定狭心症、心筋梗塞、急性冠症候群など)、虚血性脳疾患(脳梗塞、TIAなど)、虚血性肺疾患(肺梗塞など)、腎梗塞、急性腸間膜動脈閉塞症、急性動脈閉塞症、網膜動脈閉塞症、網膜静脈閉塞症、虚血性腸疾患(虚血性大腸炎など)などが挙げられる。
本発明におけるADAMTSとしては特に限定されず、公知のADAMTSおよび将来発見されるADAMTSのいずれも対象とするが、なかでもADAMTS−1およびADAMTS−9が好ましく、ADAMTS−1がより好ましい。
また採取した血液はそのまま本工程に用いてもよいが、自体公知の方法、例えば遠心分離、濾過などを利用して細胞成分(赤血球、白血球、血小板など)を分離した液体成分(血漿)として本工程に用いることが好ましい。また血液を凝固させて血小板や凝固因子を分離した液体成分(血清)として本工程に用いることも好ましい。本明細書において、「血液」とは、上記操作で得られた血漿、血清なども含む概念である。
さらに、非特異的吸着や非特異的反応を抑制するために牛血清アルブミン(BSA)や牛ミルク蛋白等のリン酸緩衝溶液を固相と接触させ、抗体によってコートされなかった固相表面部分を前記BSAや牛ミルク蛋白等でブロッキングすることが一般に行われる。
工程(2)は、上記工程(1)で形成された複合体を検出することで、上記血液中にADAMTSが存在するか否かを判定する工程である。
この検出には、酵素免疫測定法(EIA法)、イムノクロマト法、ラテックス凝集法、放射免疫測定法(RIA法)、蛍光免疫測定法(FIA法)、ルミネッセンス免疫測定法、表面プラズモン共鳴測定法(SPR法)などを利用することができる。これらの中でも、EIA法、イムノクロマト法、FIA法およびSPR法が操作の容易性および迅速性の観点からして好適である。
上記したビオチン標識「ADAMTSを認識する抗体」は、ビオチンと、「ADAMTSを認識する抗体」とを自体公知の方法により結合させることにより製造することができる。例えば、市販のビオチン標識化キットを使用して、ビオチンと「ADAMTSを認識する抗体」とを結合させることができる。酵素標識ストレプトアビジンは、市販のものを好ましく使用することができる。
酵素標識抗体は、酵素と「ADAMTSを認識する抗体」とを自体公知の方法、例えば、グルタルアルデヒド法、マレイミド法などにより結合(標識)させることにより製造することができる。
蛍光物質としては、APC、PE、Cy2、Cy3、Cy5、ECD、FITC、PerCP、Alexa(登録商標)Fluor、フルオレセイン、ローダミンなどの化学物質を好ましく利用することができる。当該化学物質は、自体公知の方法で抗体に標識することができる。
本発明は、ADAMTSを認識する抗体を含む、急性虚血性疾患診断用キットを提供する。本発明における「ADAMTSを認識する抗体」は、前記「1.ADAMTSの検出方法」における「ADAMTSを認識する抗体」と同様の方法で調製することができる。
該キット中には、ADAMTSを認識する抗体以外に試薬等が含まれていてもよく、これらの試薬等は、予めADAMTSを認識する抗体と一緒になっていてもよいし、別々の容器に格納されていてもよい。試薬等としては、処理液や抗体を希釈するための緩衝液、2次抗体、標識物質(例、蛍光色素、酵素)、反応容器、陽性対照(例、組換えADAMTS)、陰性対照、固相、検査プロトコールを記載した指示書などが挙げられる。これらの要素は、必要に応じて予め混合しておくこともできる。該キットを使用することにより、急性虚血性疾患の診断が簡便、迅速かつ高精度となる。
本発明は、ADAMTSを認識する抗体を含む、急性虚血性疾患診断薬を提供する。上記「ADAMTSを認識する抗体」は本発明の診断薬における有効成分であり、前記「1.ADAMTSの検出方法」における「ADAMTSを認識する抗体」と同様の方法で調製することができる。
(1)細胞培養
ヒト冠動脈内皮細胞株(HCAEC)は、10%FCSを含むEBM−2培地(タカラバイオ社製)で、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)は、10%FCSを含むEBM−2培地(ケンブレックス社製)で、サル腎臓細胞株(COS7)は、10%FCSを含むDMEM培地(シグマ社製)で、心筋細胞株(H9C2)は、10%FCSを含むDMEM培地(シグマ社製)で、ブタ大動脈平滑筋細胞株(SMC)は、10%FCSを含むDMEM培地(シグマ社製)で培養した。
3×105個の上記細胞を、サブコンフルエントな状態で炭酸ガス培養器の中で培養し、窒素ガスを充てんすることで低酸素状態(1%O2)を作りだした。1時間、3時間、6時間および24時間ずつそれぞれ培養し、各細胞のRNAをAGPC法にて抽出した。
ADAMTS−1のmRNA発現量は、LightCycler rapid thermal cylcer system(Roche社製)を用いたリアルタイムPCR法で測定した。詳細には、mRNAをテンプレートにして、逆転写酵素(Reverse transcriptase,SS−IIインビトロジェン社)を用いてcDNAを合成した後に、ADAMTS−1特異的プライマーをデザインし、リアルタイムPCR反応を行った。内部標準としてαチューブリンを用いて、定量化した。
Upperプライマー:CACTCTGCGGAACTTTTGC(配列番号1)
Lowerプライマー:GCATCATCATGTGGCATGTTA(配列番号2)
(1)抗体固相化プレートの作製
96ウェルマイクロプレート(ヌンク社製)に、ウサギ抗ADAMTS−1抗体(1.0μg/mL,シグマ社製)を100μL/ウェルで加え、4℃で一晩静置してプレート表面に抗体を結合させた。0.01%Tween20含有リン酸緩衝液(PBST)でウェルを2回洗浄後、非特異的なプレートへの吸着や非特異的反応を抑制するために、2%BSA(シグマ社製)含有リン酸緩衝液を150μL/ウェルで加え、室温で2時間静置してプレートのブロッキングを行った。次いでPBSTでウェルを3回洗浄して、ADAMTS−1抗体固相化プレートを作製した。
組換えADAMTS−1は、市販の組換えADAMTS−1を購入(R&D社)し使用した。(1)で作製したプレートに、前記組換えADAMTS−1溶液(1%BSA−PBST中、pH7.4)を、濃度を変えて100μL/ウェルで加え、室温で2時間静置して抗ADAMTS−1抗体と組換えADAMTS−1とが結合した複合体を形成させた。PBSTでウェルを3回洗浄後、マウス抗ADAMTS−1抗体(2.0μg/mL,R&D社製)を100μL/ウェルで加え、室温で2時間静置して複合体中の組換えADAMTS−1にマウス抗ADAMTS−1抗体を結合させた。PBSTでウェルを3回洗浄後、POD標識した抗マウスIgG抗体(2000倍希釈,MBL社製)を100μL/ウェルで加え、室温で2.0時間静置した。PBSTでウェルを3回洗浄後、TMB溶液を100μL/ウェルで加え、室温で15分静置して残ったPODを発色させた。
100μL/ウェルの1N塩酸を加えて反応を停止させ、450nmにおける吸光度を測定した。組換えADAMTS−1濃度に対するそれぞれの吸光度をプロットし、検量線を作成した。結果を図2に示す。
組換えADAMTS−1溶液の代わりに種々の疾患に罹患している患者の血清を検体として用い、実施例1と同様の操作を行って吸光度を測定した。実施例1で作成した検量線に基づき、各患者の血清中のADAMTS−1濃度を算出した。結果を表1に示す。
Claims (7)
- 下記の工程:
(1)急性虚血性疾患が疑われる対象由来の血液と、ADAMTS−1を認識する抗体とを接触させる工程;および
(2)上記工程(1)で形成された複合体を検出する工程;
を含むことを特徴とする、対象におけるADAMTS−1を検出する方法。 - 抗体がモノクローナル抗体である、請求項1記載の方法。
- 急性虚血性疾患が、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、虚血性肺疾患、腎梗塞、急性腸間膜動脈閉塞症、急性動脈閉塞症、網膜動脈閉塞症および網膜静脈閉塞症から選択される少なくとも一つの疾患である、請求項1または2記載の方法。
- ADAMTS−1を認識する抗体を含む、急性虚血性疾患診断用キット。
- ADAMTS−1を認識する抗体を有効成分とする、急性虚血性疾患診断薬。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項4記載のキットまたは請求項5記載の診断薬。
- 急性虚血性疾患が、虚血性心疾患、虚血性脳疾患、虚血性肺疾患、腎梗塞、急性腸間膜動脈閉塞症、急性動脈閉塞症、網膜動脈閉塞症および網膜静脈閉塞症から選択される少なくとも一つの疾患である、請求項4〜6のいずれか一項に記載のキットまたは診断薬。
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