JP2003028860A

JP2003028860A - チトクロムｃ測定によるｓｉｒｓにおける多臓器不全の検査試薬

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Publication number: JP2003028860A
Application number: JP2002129478A
Authority: JP
Inventors: Fumio Endo; 文夫遠藤; Naoto Adachi; 尚登足立; Hiroyuki Nunoi; 博幸布井; Keisuke Watanabe; 啓祐渡辺
Original assignee: Eisai Co Ltd
Current assignee: Eisai Co Ltd
Priority date: 2001-05-09
Filing date: 2002-05-01
Publication date: 2003-01-29
Anticipated expiration: 2022-05-01
Also published as: JP3896303B2

Abstract

(57)【要約】【課題】 SIRSにおける多臓器不全を検査する、簡便で
感度・定量性に優れた検査試薬および検査方法を提供す
る。【解決手段】血清などの体液中のチトクロムＣ量を、
SIRSに伴う多臓器不全の指標として用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、全身性炎症反応症
候群（systemic inflammatory response syndrome; SIR
S）における多臓器不全の検査方法及び検査試薬に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】SIRSは、全身性エリテマトーデス (SLE)
や移植片対宿主反応疾患（GVHD）のように、特定の抗原
（SLEの場合の二本鎖DNA等自己抗原、GVHDの場合の同種
抗原）に反応して、サイトカイン量が上昇し炎症反応を
起こすのでなく、具体的なターゲット無しに、生体に対
する侵襲に反応して非特異的に免疫反応が活性化し、サ
イトカイン産生が制御不能になって、重篤な多臓器不全
（MOF）を起こす疾患群である（Bone RC, Crit Care Me
d 24: 1125-1128, 1996、Davies MG. Et al., Br J Sur
gery 84: 920-935, 1997）。

【０００３】SIRSには、血球貪食症候群（hemophagocyt
ic syndrome; HPS）、敗血症、急性膵炎などの重症膵
炎、外科手術後に起こる臓器障害などが含まれ、殆どが
ICU患者で見られ、予後の予測が難しい疾患群である。

【０００４】多臓器不全（MOF）の指標としては、体
温、呼吸数、血液ガス、心拍数などの身体徴候をスコア
ー化（APACHE II、MOF score、PRISM III score）して
判断しているが、客観性に乏しいと言われている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、SIRS
における多臓器不全を検査する、簡便で感度・定量性に
優れた検査試薬及び検査方法を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】チトクロムＣは、ミトコ
ンドリアにおける電子伝達系の重要な蛋白質として知ら
れているが、細胞がアポトーシスの引き金となる刺激に
曝され、アポトーシスの状態になると、ミトコンドリア
にあったチトクロムＣが急速にサイトゾルへと放出され
ることが報告されている（Dinsdale D. et al., Americ
an J. Pathol.155:607-18, 1999）。そしてサイトゾル
のチトクロムＣは、アポトーシスのキーファクターであ
るカスパーゼ(caspase)-3の活性化に関与し、チトクロ
ムＣの増加が、アポトーシス進行と関係することが報告
されている（Medina V. et al.,Cancer Research 57:36
97-707, 1999）。

【０００７】本発明者らは、非特異的に免疫反応が活性
化しサイトカイン産生能が制御不能になって、多臓器不
全に陥れば、各臓器でアポトーシスが起こり、臓器のミ
トコンドリアより放出されたチトクロムＣが、血液など
の体液中でも測定できるのではないかと考えた。そし
て、チトクロムＣを測定するELISAを確立し、血中のチ
トクロムＣの量が多臓器不全のスコアと強く相関するこ
とを見出して、本発明を完成するに到った。

【０００８】すなわち本発明は、チトクロムＣを定量す
ることにより、SIRSにおける多臓器不全を検査する方法
及びその方法に使用できる試薬に関する。より具体的に
は、以下のものに関する。

【０００９】１．体液中のチトクロムＣを定量し、定量
結果を多臓器不全の指標として用いることを特徴とす
る、SIRSにおける多臓器不全を検査する方法。２．チトクロムＣを免疫化学的方法により定量する、１
に記載の方法。３．体液中のチトクロムＣを定量するための試薬を含
む、SIRSにおける多臓器不全の検査試薬。４．チトクロムＣを免疫化学的方法により定量する、３
に記載の試薬。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下に本発明の実施の形態につい
て詳細に説明する。

【００１１】本発明の検査方法は、SIRSにおける多臓器
不全を検査する方法であって、体液中のチトクロムＣを
定量し、定量結果を多臓器不全の指標として用いること
を特徴とする。

【００１２】ここで、体液とは、生体より採取された血
液、血漿、血清、脳脊髄液等を意味する。

【００１３】体液中のチトクロムＣを測定する方法とし
ては、免疫化学的方法、電気泳動による方法、クロマト
グラフィーによる方法等が考えられる。電気泳動による
方法としては、ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行っ
てチトクロムＣをバンドとして検出する方法、キャピラ
リー電気泳動でピークとして検出する方法等がある。ま
た、クロマトグラフィーによる方法としては、高速液体
クロマトグラフィーでピークとして検出する方法等があ
る。場合によっては感度を上げるために、蛍光標識する
ことも許されるが、本発明はこれらの例に限定されるも
のではない。

【００１４】チトクロムＣを測定する方法としては、感
度及び簡便性から免疫化学的方法が好ましい。ここで免
疫化学的方法とは、チトクロムＣに対する抗体を用い
て、チトクロムＣを定量する方法である。免疫化学的方
法としては、チトクロムＣを標識する競合法、抗体を標
識するサンドイッチ法、抗体コートしたビーズの凝集を
観察するラテックスビーズ法等、様々な方法があるが、
チトクロムＣに対する抗体を用いた方法であれば、本発
明の好ましい態様に含まれる。抗体はモノクローナル抗
体でも、ポリクローナル抗体でも良い。また標識する方
法にも、放射性同位元素による標識、電気化学発光する
化合物による標識、蛍光標識、酵素標識、ビオチン標識
等、様々な方法があるが、本発明はこれらの例に限られ
るものではない。

【００１５】チトクロムＣを測定する免疫化学的方法の
例として、以下にサンドイッチ法についてステップを追
って説明する。

【００１６】1).チトクロムＣに対する抗体をビーズま
たはカップ上に固相化する。ビーズはマイクロビーズで
もよく、その場合は磁性体のマイクロビーズが好まし
い。固相化は、共有結合により結合させても非共有結合
により結合させても構わない。通常、ビーズまたはカッ
プ上の非特異的な結合部位をふさぐため、ウシ血清アル
ブミン（BSA)、カゼイン等の蛋白質、Tween 20等の界面
活性剤でブロッキング操作を行う。

【００１７】2).検体を、必要であればBSA、カゼイン等
の蛋白質、または、Tween 20等の界面活性剤を含むバッ
ファーで希釈し、ビーズまたはカップに加える。また、
既知の量のチトクロムＣも同様に希釈して加える。

【００１８】3).ビーズまたはカップを、できればTween
20等の界面活性剤を含むバッファーで洗浄後、できれ
ばBSA、カゼイン等の蛋白質、または、Tween 20等の界
面活性剤を含むバッファーで希釈された標識抗体を加え
る。

【００１９】4).ビーズまたはカップを、できればTween
20等の界面活性剤を含むバッファーで洗浄後、標識に
応じた方法で測定する。例えば、放射性標識であれば放
射活性を、酵素標識であれば酵素活性を測定する。ま
た、ビオチン化標識であれば更に標識アビジンを加え
て、標識に応じた方法で測定する。

【００２０】5).既知量のチトクロムＣから検量線を作
成し、検体中に含まれるチトクロムＣ量を計算する。

【００２１】以上のステップにより、検体中のチトクロ
ムＣが定量される。

【００２２】チトクロムＣの定量結果を指標として用い
ることにより、SIRSにおける多臓器不全が検査される。
例えばチトクロムＣの定量値が正常値よりも高い場合
に、SIRSにおける多臓器不全が検出されたとすることが
できる。

【００２３】また本発明は、チトクロムＣを測定するこ
とによりSIRSにおける多臓器不全を検査する検査試薬に
も関し、この試薬は体液中のチトクロムＣを定量するた
めの試薬を含む。チトクロムＣを定量するための試薬
は、好ましくは、免疫化学的方法により定量するための
試薬である。このような試薬としては、チトクロムＣに
対する抗体が挙げられる。

【００２４】免疫化学的方法としては、サンドイッチ法
が好ましい。サンドイッチ法は、固定化抗体と標識抗体
により抗原がサンドイッチされた状態を利用する、ELIS
Aなど免疫化学的方法である。サンドイッチ法は、蛋白
質濃度の高い体液中のチトクロムＣを高感度で定量する
のに適した方法である。

【００２５】本発明の検査試薬は、好ましくは、チトク
ロムＣに対する抗体を構成成分とする、体液中のチトク
ロムＣをサンドイッチ法により定量する検査試薬であ
る。この態様の検査試薬は、抗体として抗チトクロムＣ
抗体を用いる以外は、通常のサンドイッチ法に用いられ
る試薬（キット）と同様の構成でよい。その一例として
サンドイッチ法によりチトクロムＣを測定する検査試薬
は、例えば1).抗チトクロムＣ抗体コートカップ、抗チ
トクロムＣ抗体コートビーズなどの抗チトクロムＣ抗体
コート固相、2).標識抗チトクロムＣ抗体、3).既知濃度
のチトクロムＣ標準溶液、4).希釈液、5).洗浄液、を含
有する試薬である。更に酵素標識であれば、6).発色基
質、7).反応停止液が含まれてもよい。

【００２６】体液中のチトクロムＣ濃度は、多臓器不全
の指標として用いられるPRISM IIIスコアと良く相関
し、チトクロムＣ濃度を測定することにより、SIRSで起
こっている多臓器不全を客観的に評価することが可能で
ある。

【００２７】特に、血清の場合にはチトクロムＣ濃度が
10 ng/mlを超えると予後が悪く、チトクロムＣ濃度を測
定することにより予後を予測することが可能である。

【００２８】

【実施例】以下に、具体的な例をもって本発明を示す
が、本発明はこれに限られるものではない。％は、特記
しない限り質量％である。

【００２９】

【参考例１】チトクロムＣのELISAによる測定チトクロムＣの測定法は、以下の手順で実施する。

【００３０】1).抗チトクロムＣ抗体の精製ラットのチトクロムＣ（シグマ社）をウサギに免疫し、
チトクロムＣに対する抗血清を得る。その抗血清に最終
濃度2 Mになるように硫安を添加し、室温（20〜30℃）
で５時間撹拌する。撹拌した溶液を10000回転で30分遠
心し上清を捨て、沈殿物を0.1 Mリン緩衝液pH 7.2で溶
解後、同一緩衝液に対して透析する。透析した溶液は、
CNBr-Sepharose 4B（ファルマシア社）にウシのチトク
ロムＣを結合させて得たカラムに流す。0.15 M NaClを
含む0.01 Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5でカラムを洗浄後、
0.1 M塩酸グアニジンで抗チトクロムＣ抗体を溶出し、
0.15M NaClを含む0.01 Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5に対し
て透析し抗体(IgG)精製物とする。

【００３１】2).チトクロムＣF(ab')₂の調製精製したIgGを0.1 M酢酸緩衝液pH 4.2に対して透析す
る。透析したIgG溶液にペプシン（シグマ社）を質量濃
度比で20:1の割合になるように加え、37℃で16時間反応
させる。反応後の溶液のpHを1 N NaOHで7.5に調整した
後、0.15 M NaClを含む0.01 Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5
で平衡化したSephacryl S-200（ファルマシア社）カラ
ムでゲル濾過を行う。ゲル濾過したフラクションの第一
ピークを集め、濃縮し抗チトクロムＣ抗体 F(ab')₂液と
する。

【００３２】3).西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識
抗チトクロムＣ F(ab')₂抗体の作製 4 mg/mlに調整したHRP（東洋紡）の1 mlに0.1 Mメタ過
ヨウ素酸ナトリウムを60μl加え、室温（20〜30℃）で2
0分撹拌後、0.001 M酢酸緩衝液pH 4.4に対して透析す
る。透析後、0.2 M炭酸ナトリウム液でpH 9.0〜9.5に調
整する。この溶液に0.1 M炭酸緩衝液pH 9.5に対して透
析したチトクロムＣ F(ab')₂溶液4 mg/mlを加え、室温
（20〜30℃）で２時間撹拌する。4 mg/mlに調整した水
素化ホウ素ナトリウム液を50μl加え、4℃で2時間撹拌
後、16時間静置保存する。この溶液を0.15 M NaClを含
むリン酸緩衝液 pH 7.2で透析後、Sephacryl S-200（フ
ァルマシア社）カラムでゲル濾過を行う。ゲル濾過した
フラクションの第一ピークを集め、25% ウサギ血清（日
本生物材料）を含む0.2 Mリン酸二ナトリウム緩衝液pH
5.4で希釈し、HRP標識抗チトクロムＣ抗体 F(ab')₂液
（標識抗体液）とする。

【００３３】4).抗チトクロムＣ抗体固相化カップの作
製上記1)で得られたIgG精製物を、0.01 Mトリス塩酸緩衝
液pH 7.5で吸光度0.1に調整する。この抗体溶液を、ポ
リスチレンカップに100μl注入し4℃で16時間反応後、E
IA法専用洗浄機によって0.15 M NaCl及び0.01% Tween 2
0を含む0.01 Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5で3回（各4秒
間）洗浄する。洗浄したカップに0.5% ウシアルブミン
を含む0.01 Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5を200μl加え、再
度4℃で16時間反応させ固相化カップとする。

【００３４】5).標準抗原の調製ラットのチトクロムＣ（シグマ社）を2% BSA、0.01 M E
DTA 2Na、0.1% NaN₃、0.01% Tween 20及び0.15 M NaCl
を含む0.05 Mトリス緩衝液pH 7.5で50 ng/ml〜0.05 ng/
mlの希釈液を作製する。

【００３５】6).測定抗チトクロムＣ抗体を固相化したカップ中のウシアルブ
ミン液を吸い取り、全カップに2% BSA、0.01 M EDTA 2N
a、0.1% NaN₃、0.01% Tween 20及び0.15 M NaClを含む
0.05 Mトリス緩衝液pH 7.5を50μl注入する。そのカッ
プに標準抗原希釈液及び検体を50μl加え、室温（20〜3
0℃）で1時間反応させる。反応後、EIA専用洗浄機を用
い0.01% Tween 20、0.0015 M NaCl、0.0015% パラオキ
シ安息香酸メチル及び0.005% ２-クロロアセトアミドを
含む0.005 Mトリス緩衝液pH 7.5で3回（各4秒間）洗浄
する。洗浄後、標識抗体を100μl加え室温（20〜30℃）
で1時間反応させる。反応後、EIA専用洗浄機を用い0.01
% Tween 20、0.15 M NaCl、0.0015% パラオキシ安息香
酸メチル及び0.005% ２-クロロアセトアミドを含む0.00
5 Mトリス緩衝液pH 7.5で3回（各4秒間）洗浄する。洗
浄後、1.5 mg/mlのABTS（2,2-アジノ-ビス-(3-エチルベ
ンゾチアゾリン-6-スルホン酸)を含む 0.1 M クエン酸
緩衝液pH 4.2を100μl加え室温（20〜30℃）で1時間反
応させ、0.013% NaN₃液を100μl加え反応を停止する。
発色した溶液の405nmの吸光度を分光光度計で測定す
る。

【００３６】7).標準抗原曲線の特性各濃度のチトクロムＣ及び検体の吸光度値からブランク
の吸光度値を引く。横軸に標準抗原濃度、縦軸に標準抗
原の吸光度をプロットし、標準曲線を描く。その標準抗
原曲線を基に、検体中に含まれるチトクロムＣ量を計算
する。

【００３７】

【実施例１】SIRSの患者血清中のチトクロムＣの定量参考例１に記載したチトクロームＣのELISA系を用い
て、SIRSのHPS、敗血症、熱傷、急性膵炎及び外科手術
後の患者ならびに健常人の血清中チトクロムＣ濃度を測
定した。

【００３８】その結果、表１に示す通り、健常人15人で
は全て陰性（< 0.05 ng/ml）であったが、HPSでは13例
中13例（100%）、敗血症では８例中８例（100%）、熱傷
では６例中４例（67%）、急性膵炎では９例中９例（100
%）、外科手術後では８例中６例（75%）が陽性であっ
た。

【００３９】

【表１】

【００４０】またHPSでは、血清中チトクロムＣ濃度が1
0 ng/ml以上であった５例中４例（80%）が死亡したのに
対し、10 ng/ml未満であった８例中に死亡例は無く（0
%）、血清中チトクロムＣ濃度が10 ng/ml以上の患者で
予後が悪いことが示された。

【００４１】

【実施例２】SIRS患者血清中のチトクロムＣ測定値と多
臓器不全スコアの相関SIRSの患者12人に関し、多臓器不
全のスコアPRISM IIIをPollack MMらの報告（Crit Care
Med 24: 743-752, 1996）に従って算定し、血清中チト
クロムＣ濃度との相関を調べた。

【００４２】その結果、図１に示す通りチトクロムＣ濃
度はPRISM IIIスコアと良く相関し、チトクロムＣ濃度
が多臓器不全の客観的な指標として有用であることが示
された。

【００４３】

【発明の効果】チトクロムＣの測定が、SIRSの多臓器不
全の検査、予後の予測に有用であることが明らかにされ
た。したがって、SIRSにおける多臓器不全を検査する、
簡便で感度・定量性に優れた検査試薬及び検査方法が提
供される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 SIRS患者血清中のチトクロムＣ測定値と多臓
器不全スコアの相関を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者渡辺啓祐茨城県つくば市吉沼3495−７

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】体液中のチトクロムＣを定量し、定量結
果を多臓器不全の指標として用いることを特徴とする、
SIRS（systemic inflammatory response syndrome）に
おける多臓器不全を検査する方法。
【請求項２】チトクロムＣを免疫化学的方法により定
量する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】体液中のチトクロムＣを定量するための
試薬を含む、SIRSにおける多臓器不全の検査試薬。
【請求項４】チトクロムＣを免疫化学的方法により定
量する、請求項３に記載の試薬。