WO2006112445A1 - チトクロムcの免疫化学的測定方法及び測定キット - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to an immunochemical method and a measurement kit for accurately measuring cytochrome c in a body fluid, particularly blood.
- Cytochrome c has long been studied as a protein of the electron transport system, and recently as an apoptosis-related protein, and a method for immunochemically measuring intracellular cytochrome C concentration and blood cytochrome C concentration is known.
- Non-Patent Document 1 cytochrome c concentration in blood is an index of apoptosis occurring in the body (Non-patent Document 2, Patent Documents 1 and 2), and is expected to be used as a diagnostic agent for many diseases. Yes.
- the measured value reflects the amount of cytochrome c and is used to examine apoptosis occurring in the body. It was confirmed that there was no hindrance. Until now, it has not been verified whether or not the measured value accurately reflects the amount of cytochrome c in body fluid, and the measurement method and measurement kit can accurately determine the measured value of cytochrome c in body fluid. Was demanded.
- Patent Literature l WO 01/35093
- Patent Document 2 JP 2003-028860
- Non-patent document 1 Andrea Renz, et al. Rapid extracellular release of cytochrome c is spe cific for apoptosis and markers cell death in vivo, BLOOD, 98 (5) 1542-1548,2001
- Patent document 2 Z.BEN—ARI, et al. and lrculating soluble cytochromec in liver disease as marker of apoptosis, Journal of Internal Medicine, 254, 168-175,2003
- An object of the present invention is to provide an immunochemical method for accurately measuring cytochrome c in body fluids, particularly blood.
- the present inventors conducted an addition recovery test in which a known amount of cytochrome c was added to serum by the conventional sandwich method and the measured value was measured. As a result, the measured value reflecting the amount of the added amount was found. Although it was found that it could be obtained, it was not possible to obtain a measurement value that accurately reflected the added amount.
- the pH of the buffer solution in the reaction between cytochrome c and anti-cytochrome c antibody is set to an acidic region, so that an accurate measurement value of serum cytochrome c can be obtained. It was found that it could be obtained, and the present invention was completed.
- the present invention relates to the following.
- a method for immunochemically measuring cytochrome c in a body fluid wherein the reaction between an antibody and cytochrome c is carried out in an acidic buffer solution.
- a kit for immunochemically measuring cytochrome c in a body fluid wherein the reaction between an antibody and cytochrome c is carried out in an acidic buffer solution.
- the inventors of the present invention have proposed that the interfering substance in human serum that prevents accurate cytochrome c quantification by a proteomic technique using mass spectrometry is a 1-acid glycoprotein (a 1-acid glycoprotein), a 1 It was clarified that it is a highly acidic protein such as antitrypsin.
- the present invention reveals that a highly acidic protein in serum affects the binding between cytochrome c and an antibody, and that the effect is eliminated by reacting cytochrome c with the antibody in the acidic region.
- Other methods for inhibiting the highly acidic protein from affecting the reaction between cytochrome c and the antibody, such as adjusting the salt concentration of the reaction solution, are also included in the present invention. Is.
- an immunochemical measurement method for accurately measuring cytochrome c in a body fluid, particularly blood is established, and the reliability of the measured value of cytochrome c is increased.
- FIG. 1 shows the interfering activity for cytochrome c measurement of each fraction obtained by subjecting human serum to gel filtration.
- Figure 2 Shows the results of two-dimensional electrophoresis of fractions containing interfering substances (electrophoresis photo). The name of the identified protein is appended to the spot.
- the subject of the present invention is an immunochemical measurement method for measuring the amount of cytochrome c in a body fluid, particularly blood, wherein an anti-cytochrome c antibody and cytochrome c are reacted in an acidic region, and the anti-cytochrome c antibody and cytochrome are reacted.
- the method is to reduce the influence of interfering substances in body fluids that affect the binding of c, and to obtain an accurate measurement of cytochrome c.
- the acidic region as used herein is a pH region in which the influence of interfering substances in body fluids that affect the binding between an antibody and cytochrome c is attenuated.
- the binding between the antibody and cytochrome c also weakens. Therefore, the pH in the immunochemical measurement of the present invention is determined to be a pH satisfying the following 1 and 2. It is done.
- a measurement sensitivity capable of quantifying 10 ng / mL, preferably 1 ng / mL of cytochrome c in a buffer solution is obtained.
- a recovery rate of 70% or more, preferably 80% or more, and more preferably 90% or more can be obtained in the addition recovery test in the presence of body fluid.
- the pH used in the immunochemical measurement method can determine the optimum pH for each antibody.
- the pH is preferably 7 or less, more preferably pH 3 to pH 6, more preferably pH 3.5 to pH 5, and still more preferably pH 3.5 to pH 4.5.
- the method for determining the pH is not limited to this.
- appropriate protein such as BSA, appropriate salt such as NaCl, and appropriate interface if necessary Dilute cytochrome c to 1-1000 ng / mL in pH 3 to pH 7.5 buffer containing activator, etc.
- the immunochemical measurement method is a two-step sandwich method
- the diluted cytochrome c reacts with the immobilized anti-cytochrome c antibody, and after washing, the labeled anti-cytochrome c antibody is collected and used as a labeling substance.
- the labeling substance is detected by the corresponding activity, radioactivity if it is a radioactive label, or enzyme activity if it is an enzyme label.
- the immunochemical measurement method is a one-step sandwich method
- the diluted cytochrome c and the immobilized anti-cytochrome c antibody and the labeled anti-cytochrome c antibody are mixed and reacted to form a labeling substance.
- the labeling substance is detected by radioactivity, if it is a radioactive label, or if it is an enzyme label, the enzyme activity.
- the signal obtained from a sample containing 10 ng / mL, preferably 1 ng / mL of cytochrome c is sufficiently strong compared to the signal of a buffer-only sample without cytochrome c
- the pH is listed as a candidate pH for a buffer used in an immunochemical assay.
- cytochrome c is measured in a body fluid corresponding to the specimen used for the immunochemical measurement method, for example, serum, a known amount of cytochrome c is added to the serum. Measure the amount of cytochrome c in the serum supplemented with cytochrome c and the serum with no added force by the immunochemical method, and the ratio of the measured value to the theoretical value is the recovery rate.
- the recovery rate is expressed as follows: the amount of cytochrome c added is A, the measured value of cytochrome c in serum not containing cytochrome c is B, and the measured value of cytochrome c in serum added with cytochrome c is C.
- the pH is listed as a candidate pH of a buffer used in an immunochemical measurement method.
- the pH of the buffer used in the immunochemical method is determined in consideration of 1. the effect of pH on measurement sensitivity and 2. the effect of pH on additional recovery.
- cytochrome c In the immunochemical measurement of cytochrome c according to the present invention, an acidic buffer solution is used. In this method, not only the first reaction in which the immobilized antibody reacts with cytochrome c in the sample, but also the second reaction (cytochrome c and labeled antibody) when the interfering substance cannot be completely removed in the first reaction. It is also effective to use in the step of reacting.
- the method of the present invention is not limited to the method using a buffer solution in the acidic region in the first reaction.
- the buffer solution for reacting cytochrome c and cytochrome c antibodies in blood in the acidic region is determined in consideration of the above 1. Effect of pH on measurement sensitivity, 2. Effect of pH on recovery of supplement It is done.
- the type of buffer solution is not particularly limited as long as it is a buffer solution that can be adjusted to acidic conditions, and examples thereof include succinic acid buffer solution and citrate phosphate buffer solution.
- the method of the present invention is the same as the usual immunological method for measuring the amount of cytochrome c in a body fluid except that an anti-cytochrome c antibody and cytochrome c are reacted in an acidic region. Good.
- the immunochemical method is a method for quantifying cytochrome c using an antibody against cytochrome c.
- immunochemical methods such as a competitive method for labeling cytochrome c, a sandwich method for labeling antibodies, and a latex bead method for observing the aggregation of antibody-coated beads, but an antibody against cytochrome c is used.
- the method of the invention is included in the method of the present invention.
- Anti-cytochrome c antibodies are not particularly limited as long as they can detect cytochrome c.
- a polyclonal antibody may be used.
- the antibody may be solid-phased or labeled.
- labeling such as radioisotope labeling, electrochemiluminescent compound labeling, fluorescent labeling, enzyme labeling, and piotin labeling, but the present invention is not limited to these examples.
- Antibody production and labeling methods are described in, for example, Secondary Biochemistry Experiment Course 5 Immunobiochemistry Research Method (published by Tokyo Chemical Dojin Co., Ltd., Japan Biochemical Society) or New Chemistry Experiment Course 12 Molecular Immunology III (Japan Biochemistry Corporation) Published by Tokyo Chemical Co., Ltd.).
- examples of the body fluid include blood / plasma / serum “cerebral spinal fluid” umbilical cord blood * urine * amniotic fluid / bronchial lung lavage fluid collected from a living body, among which blood is preferred.
- the anti-cytochrome c antibody and cytochrome in the sample are usually used in the acidic region.
- the reacted cytochrome C is detected.
- the detection is preferably performed by washing and then reacting a labeled secondary antibody and detecting by a detection method according to the label.
- a secondary antibody labeled with piotin it can be detected by luminescence or color development using a substrate of the enzyme after further reaction with an enzyme such as avidin-labeled peroxidase or alkaline phosphatase.
- an enzyme-labeled secondary antibody, a fluorescently-labeled secondary antibody, a ruthenium-labeled secondary antibody, or the like may be used.
- Examples of immunochemical methods for measuring cytochrome c include a method using a ruthenium complex-labeled anti-cytochrome c antibody prepared by the method described in the following Reference Example.
- the present invention relates to a kit for immunochemically measuring cytochrome c in a body fluid.
- the kit of the present invention is a measurement kit for performing a reaction between an anti-cytochrome c antibody and cytochrome c in an acidic buffer solution.
- the instruction manual attached to the kit describes that the reaction between cytochrome c and anti-cytochrome c antibody is performed under acidic conditions.
- It can also be a kit containing a reaction buffer adjusted to acidity.
- the kit of the present invention may contain a secondary antibody, a cytochrome c standard solution, a diluent, a washing solution, a detection substrate, and the like.
- the kit of the present invention contains a reagent (cytochrome c measurement reagent) for quantifying cytochrome c in a body fluid, particularly blood, using an antibody against cytochrome c.
- a measuring reagent for measuring cytochrome c by the sandwich method is, for example, 1) .anti-cytochrome c antibody-coated cup, or anti-cytochrome c antibody-coated bead, 2) including a labeled anti-cytochrome c antibody,
- it is a reagent containing 3). Cytochrome c standard solution of known concentration, 4). Diluting solution, 5). Washing solution.
- 6 Chromogenic substrate, 7). Reaction stop solution may be included.
- the measurement kit of the present invention preferably includes a buffer solution for reacting cytochrome c in blood with an antibody against cytochrome c in an acidic region.
- the buffer contained in the measurement kit of the present invention may be a buffer that can be used in the reaction as it is, or a buffer that is used after dilution. Also, an appropriate amount of acidity Alternatively, an alkaline solution may be added to adjust the pH to an acidic range suitable for the present invention, or may include such instructions!
- Rabbit cytochrome c (manufactured by Sigma) was immunized to a rabbit and an antiserum against cytochrome c was obtained. Ammonium sulfate was added to the antiserum to a final concentration of 2 M, and the mixture was stirred at room temperature (20-30 ° C) for 5 hours. The stirred solution was centrifuged at 10,000 rpm for 30 minutes, and the supernatant was discarded. The precipitate was dissolved by adding 0.1 M phosphate buffer pH 7.2, and dialyzed against 0.1 M phosphate buffer pH 7.2.
- the dialyzed solution was applied to a CNBr- Sepharose4B (GE Healthcare Bioscience) column coupled with ushicytochrome c (Sigma), and the column was washed with 0.01M Tris-HCl buffer pH 7.5 containing 0.15M NaCl.
- IgG was eluted with 0.1 M guanidine hydrochloride.
- the eluted IgG was dialyzed against 0.01 M Tris-HCl buffer pH 7.5 containing 0.15 M NaCl to obtain a purified anti-cytochrome clgG product.
- the purified anti-cytochrome clgG was dialyzed against 0.1 M acetate buffer pH 4.2, pepsin (Sigma) was added at a protein concentration ratio of 20: 1, and reacted at 37 ° C for 16 hours. Adjust the pH to 7.5 by adding 1 N NaOH, flow through a Sephacryl S-200 (GE Healthcare Biosciences) column equilibrated with 0.01 M Tris-HCl buffer pH 7.5 containing 0.15 M NaCl, and perform gel filtration. It was. The first peak of the fraction is collected, concentrated, and anti-cytochrome clgG F (ab ') polyclonal
- Human cytochrome c (R & D Systems) 110 ⁇ g / 100 ⁇ L and 2 mg / mL ovalbumin 55 ⁇ L dissolved in 65 mM phosphate buffer pH 7.5 were mixed, and then 65 mM phosphate buffer pH 42 L of 1 mM dartalaldehyde diluted with 7.5 was added and stirred at room temperature for 2 hours. Next, dialyzed against 0.15 M NaCl at 4 ° C. for 48 hours to prepare equal amounts of FCA and adjuvant, and 0.1 mL of BALB / C mouse abdominal cavity was immunized. Immunization was repeated three times every two weeks.
- mice were intravenously injected with human cytochrome c50 g / 100 / ⁇ L dissolved in physiological saline from the tail vein. Three days later, the spleen of the mouse was removed and the spleen lymphocytes were fused with myeloma cells P3X63 Ag8U.l by the polyethylene glycol method according to a conventional method. Screening was performed using human cytochrome c as an antigen, and monoclonal antibody-producing hybridomas (clone: 3G7 and 27G9) against human cytochrome c were established.
- Anti-cytochrome c monoclonal antibody (clone: 2B5F8 (R & D Systems) or clone: 6H2 • B4 (Becton Dickinson)) is dialyzed against 0.1 M acetate buffer (pH 4.2) containing 0.15M NaCl, and OD 280 nm is 0.56. The solution was diluted with 0.1 M acetate buffer (pH 4.2) containing 0.15 M NaCl.
- the anti-cytochrome c monoclonal antibody prepared in Reference Example 3 (3G7 antibody or 27G9 antibody) or the anti-cytochrome clgG F (ab ') polyclonal antibody prepared in Reference Example 2 was permeabilized with PBS.
- Cytochrome c standard antigen is 1000 ng / mL, 500 ng / mL, 10% human cytochrome c (R & D Systems) 0.15 M sodium phosphate buffer pH 7.4 containing 5% BSA, 0.15 M NaCl, 0.1% NaN
- a standard curve is drawn by plotting the human cytochrome c standard antigen concentration on the horizontal axis and the count value of human cytochrome c standard antigen on the vertical axis. Based on the standard curve, antigen antigen 2, antigen 3, antigen 4, The amount of cytochrome c contained in each of luminescence count values of serum 1, serum 2 and serum 3 was calculated.
- 2B5F8 monoclonal antibody was immobilized on the beads.
- Cytochrome c in human serum was measured using succinate buffer instead of citrate phosphate buffer.
- Human cytochrome c (antigen 1, 1, diluted with an impulse solution (0.05M Tris-HCl, pH7.8, 5% BSA, 0.15M NaCl, 0.1% NaN) to 5, 10, 100, 1000, 3000 ng / mL 20 L of antigen 2, antigen 3, antigen 4, antigen 5), serum 1, serum 2, serum 3 and serum 4 were added.
- an impulse solution 0.05M Tris-HCl, pH7.8, 5% BSA, 0.15M NaCl, 0.1% NaN
- the human cytochrome c standard antigen concentration is plotted on the horizontal axis and the count value of human cytochrome c standard antigen is plotted on the vertical axis, and a standard curve is drawn. Based on the standard curve, antigen antigen 2, antigen 3, antigen 4, The amount of cytochrome c contained in each of antigen 5, serum 1, serum 2, serum 3 and serum 4 was calculated.
- Table 3 shows the results obtained by immobilizing the anti-cytochrome c monoclonal antibody 2B5F8 antibody on the beads and using the anti-cytochrome 27G9 monoclonal antibody or the 6-2.4 monoclonal antibody as the ruthenium complex-labeled antibody. Even when this reagent was used, the recovery rate was 100%, and it was confirmed that the measurement sensitivity was 1 ng / mL or more, and that this condition also satisfies both sensitivity and recovery rate. It was done.
- Ki I Kiyo Kiyo Ki Y Kiyo Kiyo _n-n
- fraction No. 41 contains an interfering substance that inhibits the reaction between cytochrome c and anti-cytochrome c antibody (Fig. 1).
- the tildarcoside solution 1: 1 was added in an amount of 8 ⁇ L and left at 37 ° C for 16 hours. Thereto, 40 L of 50% acetonitrile containing 0.1% TFA was added and placed in an ultrasonic water bath for 10 minutes. The liquid was transferred to another tube, and 40 ⁇ L of 75% acetonitrile containing 0.1% TFA was added to the remaining gel and treated in an ultrasonic water bath for 10 minutes. The liquid was taken out and combined with the liquid previously transferred to another tube. Next, the liquid was dried with a freeze vacuum dryer.
- Human transthyretin (prealbumin) (Sigma) 1 mg was dissolved in 50 mM phosphate buffer pH 7.5 containing 0.3 mL of 0.15 M NaCl to prepare a transthyretin solution.
- reaction solution (0.15M PBS, 15 mM EDTA, 1% BSA, 0.1% NaN, pH 7.5)
- reaction conditions were measured according to the measurement method under the following acidic conditions or neutral conditions.
- the substances having interfering activities are both highly acidic proteins, and these highly acidic proteins interacted with strongly basic cytochrome c, which probably affected the measurement of cytochrome c. It is done. Since the interaction between cytochrome c and interfering substances is weakened by measurement in the acidic region, it is considered that accurate quantification is possible in the acidic region. Therefore, with respect to antibodies other than those tested in the examples, it is considered that the cytochrome c can be accurately measured by using the acidic region.
- Cytochrome C in body fluids is known to be an indicator of apoptosis occurring in the body, and has been shown to be effective as a diagnostic agent for many diseases.
- the immunochemical assay for cytochrome c using the buffer solution in the acidic region of the present application enables more accurate measurement of cytochrome C, and the application of this method to diagnostic agents is expected.
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Abstract
体液、特に血中のチトクロムc量を正確に測定する免疫化学的方法、並びに測定キットを提供する。抗体とチトクロムcの反応を酸性領域の緩衝液中で行うことにより、妨害物質の影響を排除でき、正確なチトクロムc量の測定が可能となる。
Description
明 細 書
チトクロム Cの免疫化学的測定方法及び測定キット
技術分野
[0001] 本発明は、体液、特に血中のチトクロム cを正確に測定する免疫化学的方法、及び 測定キットに関する。
背景技術
[0002] チトクロム cは古くは電子伝達系の蛋白質として、また、近年ではアポトーシス関連 蛋白質として研究され、細胞内のチトクロム C濃度や血中のチトクロム C濃度を免疫化 学的に測定する方法が知られている(非特許文献 1)。また、血中のチトクロム c濃度 が体内で起こっているアポトーシスの指標となることが知られ (非特許文献 2、特許文 献 1、 2)、多くの疾患の診断薬としての用途が期待されている。
[0003] 従来のチトクロム c測定法や測定キットを用いて体液、特に血中のチトクロム cを測定 する場合、その測定値がチトクロム c量を反映し、体内で起こっているアポトーシスを 検査する上で支障が無いことは確認されていた。し力しこれまで、測定値が正確に体 液中のチトクロム c量を反映しているか否かは検証されておらず、体液中のチトクロム cの測定値を正確に求められる測定方法及び測定キットが求められていた。
特許文献 l :WO 01/35093
特許文献 2:特開 2003-028860
非特許文献 1: Andrea Renz, et al. Rapid extracellular release of cytochrome c is spe cific for apoptosis and markers cell death in vivo, BLOOD, 98(5)1542-1548,2001 特許文献 2 : Z.BEN—ARI, et al.し lrculating soluble cytochromec in liver disease as marker of apoptosis, Journal of Internal Medicine, 254, 168—175,2003
発明の開示
[0004] 本発明の課題は、体液、特に血中のチトクロム cを正確に測定する免疫化学的方法
、及び測定キットを提供することにある。
[0005] 本発明者らは従来のサンドイッチ法で、血清に既知量のチトクロム cを添加し、その 測定値を測定する添加回収試験を行ったところ、添加量の多寡を反映した測定値が
得られることが判明したものの、添加量を正確に反映した測定値を得ることができな かった。
[0006] 種々の測定条件にっ 、て検討した結果、チトクロム cと抗チトクロム c抗体を反応さ せる際の緩衝液の pHを酸性領域にすることにより、血清中チトクロム cの正確な測定 値を得ることができることを見出して、発明を完成するに至った。
[0007] すなわち本発明は、以下に関する。
[1]体液中のチトクロム cを免疫化学的に測定する方法であって、抗体とチトクロム c の反応を酸性領域の緩衝液中で行うことを特徴とする方法。
[2]酸性領域が pH 3.5力ら pH 5.0である [1]に記載の方法。
[3]体液が血液である [ 1]又は [2]に記載の方法。
[4]体液中のチトクロム cを免疫化学的に測定するキットであって、抗体とチトクロム c の反応を酸性領域の緩衝液中で行うための測定キット。
[5]酸性領域が pH 3.5力ら pH 5.0である [4]に記載の測定キット。
[6]少なくとも、
(1)チトクロム cと反応する抗体及び
(2)酸性領域で反応させる緩衝液
を含む、 [4]又は [5]に記載の測定キット。
[7]チトクロム cと反応する抗体が、固相化した抗体及び Z又は標識した抗体である 、 [6]に記載の測定キット。
[8]体液が血液である [4]〜 [7]の 、ずれか一項に記載の測定キット。
[0008] 更に本発明者らは、質量解析を用いたプロテオーム技術により、正確なチトクロム c の定量を妨げるヒト血清中の妨害物質が、 a 1酸性糖蛋白質 ( a 1-acid glycoprotein) 、 a 1アンチトリプシン等の酸性度の高い蛋白質であることを明らかにした。
[0009] 本発明は、血清中の酸性度の高い蛋白質がチトクロム cと抗体との結合に影響を与 えること、その影響が酸性領域でチトクロム cと抗体を反応させることで無くなることを 明らかにしたものであり、酸性度の高い蛋白質が、チトクロム cと抗体との反応に影響 を与えることを抑制するその他の方法、例えば反応液の塩濃度を調整する等の方法 も、本発明に含まれるものである。
[0010] 本発明により、体液中、特に血中のチトクロム cを正確に測定する免疫化学的測定 法が確立され、チトクロム c測定値の信頼性が高まる。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]ヒト血清をゲルろ過に付して得られた各フラクションのチトクロム c測定に対する 妨害活性を示す。
[図 2]妨害物質が含まれるフラクションの二次元電気泳動の結果を示す (電気泳動写 真)。スポットには、同定された蛋白質の名称を付記している。
発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明の主題は、体液中、特に血中のチトクロム cの量を測定する免疫化学的測定 方法において、酸性領域で抗チトクロム c抗体とチトクロム cを反応させ、抗チトクロム c 抗体とチトクロム cの結合に影響を与える体液中の妨害物質の影響を減弱させて、正 確なチトクロム cの測定値が得られるようにする方法にある。
[0013] 従って本明細書でいう酸性領域とは、抗体とチトクロム cの結合に影響を与える体液 中の妨害物質の影響が減弱する pH領域である。 pHを低下させることにより妨害物質 の影響を減弱させることができる力 同時に抗体とチトクロム cの結合も弱くなるため、 本発明の免疫化学的な測定における pHは、下記 1及び 2を満たす pHに決められる。
[0014] 1.緩衝液中で 10 ng/mL、好ましくは 1 ng/mLのチトクロム cが定量可能な測定感度が 得られる。
2.体液存在下での添加回収試験における回収率が 70%以上、好ましくは 80%以上、 更に好ましくは 90%以上得られる。
[0015] 抗体とチトクロム cの結合に及ぼす pHの効果は用いる抗体により異なるため、当該 免疫化学的測定方法に用いる pHは、抗体毎に最適な pHを決めることができる。好ま しくは pH 7以下、更に好ましくは pH 3〜pH 6、更に好ましくは pH 3.5〜pH 5、更に好 ましくは pH 3.5〜pH 4.5である。
[0016] 以下に、本発明の免疫化学的な測定における pHを決める方法を具体的に示すが
、 pHを決める方法は、これに限定されるものではない。
[0017] 1.測定感度への pHの影響
必要により BSA等の適当な蛋白質、 NaCl等の適当な塩類、必要により適当な界面
活性剤他を含む pH 3〜pH 7.5の緩衝液に、チトクロム cを 1〜1000 ng/mLに希釈する
[0018] 当該免疫化学的な測定法が 2ステップサンドイッチ法の場合、希釈したチトクロム c と固相化した抗チトクロム c抗体を反応させ、洗浄後、標識した抗チトクロム c抗体をカロ えて標識物質に対応した活性、放射性標識であれば放射活性、酵素標識であれば 酵素活性により標識物質を検出する。
[0019] また、当該免疫化学的な測定法が 1ステップサンドイッチ法の場合、希釈したチトク ロム cと固相化した抗チトクロム c抗体、標識した抗チトクロム c抗体をカ卩えて反応させ、 標識物質に対応した活性、放射性標識であれば放射活性、酵素標識であれば酵素 活性により標識物質を検出する。
[0020] 10 ng/mL,好ましくは 1 ng/mLのチトクロム cを含む検体から得られるシグナルが、 チトクロム cを含まな 、緩衝液のみの検体のシグナルと比較して充分に強ければ、当 該 pHは免疫化学的測定法に用いる緩衝液の pHの候補として挙げられる。
[0021] 2.添カ卩回収への pHの影響
免疫化学的測定法に用いる検体に対応した体液、例えば血清中のチトクロム cを測 定するのであれば血清に、既知量のチトクロム cを添加する。チトクロム cを添カ卩した血 清、及び添加しな力つた血清中のチトクロム c量を、当該免疫化学的な方法により測 定し、理論値に対する測定値の比率を回収率とする。
[0022] 回収率は、添カ卩したチトクロム c量を A、チトクロム c未添加血清中のチトクロム c測定 値を B、チトクロム c添加血清中のチトクロム c測定値を Cとして、
(1) .測定値 (C) Z理論値 (Aと Bの加重平均)、
(2) .チトクロム c添カ卩による測定値の上昇値 (C - B) Z添加量 (A)、
の何れでも計算できる。
[0023] 回収率が 70%以上、好ましくは 80%以上、更に好ましくは 90%以上の場合、当該 pHは 免疫化学的測定法に用いる緩衝液の pHの候補として挙げられる。
[0024] 当該免疫化学的な方法に用いる緩衝液の pHは 1.測定感度への pHの影響、 2.添 加回収への pHの影響を勘案して決定する。
[0025] また本発明の、免疫化学的なチトクロム cの測定に当たり、酸性領域の緩衝液を用
いる方法は、固相化した抗体と検体中のチトクロム cとを反応させる第 1反応のみなら ず、第 1反応で妨害物質が除去しきれなかった時に、第 2反応 (チトクロム cと標識抗 体を反応させる工程)に用いても有効である。
本発明の方法は、第 1反応で酸性領域の緩衝液を用いる方法に限られるものでは ない。
[0026] 血液中のチトクロム cとチトクロム cに対する抗体を酸性領域で反応させる緩衝液は 、上記 1.測定感度への pHの影響、 2.添カ卩回収への pHの影響を勘案して決定され る。緩衝液の種類は、酸性条件に調整し得る緩衝液であれば特に制限されないが、 例えばこはく酸緩衝液、クェン酸リン酸緩衝液などが挙げられる。
[0027] 本発明の方法は、上述のように、酸性領域で抗チトクロム c抗体とチトクロム cを反応 させる他は、通常の、体液中のチトクロム cの量を測定する免疫学的方法と同様でよ い。
[0028] ここで免疫化学的方法とは、チトクロム cに対する抗体を用いて、チトクロム cを定量 する方法である。免疫化学的方法としては、チトクロム cを標識する競合法、抗体を標 識するサンドイッチ法、抗体コートしたビーズの凝集を観察するラテックスビーズ法等 、様々な方法があるが、チトクロム cに対する抗体を用いた方法であれば、本発明の 方法に含まれる。抗チトクロム c抗体は、チトクロム cを検出できるものであれば特に制 限はなぐ IgG、 IgG F(ab' )フラグメントや Fabフラグメントでもよぐモノクローナル抗体
2
でも、ポリクローナル抗体でも良い。また抗体は固相化されたものでも、標識されたも のでもよい。標識には、放射性同位元素による標識、電気化学発光する化合物によ る標識、蛍光標識、酵素標識、ピオチン標識等、様々な方法があるが、本発明はこれ らの例に限られるものではない。抗体の作製法及び標識法は、例えば続生化学実験 講座 5免疫生化学研究法 (社団法人日本生化学会編株式会社東京化学同人発行) または新生化学実験講座 12分子免疫学 III (社団法人日本生化学会編株式会社東 京化学同人発行)に記載されている。
[0029] 本明細書中において体液としては、生体より採取された血液 ·血漿 ·血清'脳脊髄 液'臍帯血 *尿*羊水 ·気管支肺洗浄液等が挙げられるが、このうち血液が好ましい。
[0030] 本発明の方法では、通常には、酸性領域で抗チトクロム c抗体と試料中のチトクロム
cを反応させた後に、反応したチトクロム Cの検出を行う。検出は、好ましくは洗浄を行 つた後、標識された 2次抗体を反応させ、標識に応じた検出法により、検出する方法 が挙げられる。例えば、ピオチン標識された 2次抗体を用いる場合は、さらに、ァビジ ン標識されたペルォキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素を反応させた 後、該酵素の基質を用いて発光又は発色により検出することができる。また、酵素標 識された 2次抗体、蛍光標識された 2次抗体、ルテニウム標識された 2次抗体などを 用いてもよい。
[0031] チトクロム cを測定する免疫化学的方法の例としては、例えば下記の参考例に記載 した方法で調製したルテニウム錯体標識抗チトクロム c抗体を用いる方法が挙げられ る。
[0032] さらに本発明は、体液中のチトクロム cを免疫化学的に測定するキットに関する。本 発明のキットは、抗チトクロム c抗体とチトクロム cの反応を酸性領域の緩衝液中で行う ための測定キットである。例えば、キット付属の使用説明書に、酸性条件でチトクロム cと抗チトクロム c抗体の反応を行う旨が記載されたキットが挙げられる。また、酸性に 調整した反応用緩衝液を含むキットでもよ 、。本発明のキットは抗チトクロム c抗体の 他に、 2次抗体、チトクロム c標準液、希釈液、洗浄液、検出用の基質などを含むもの でもよい。
[0033] 通常には、本発明のキットは、体液、特に血液中のチトクロム cをチトクロム cに対す る抗体を用いて定量するための試薬 (チトクロム c測定試薬)を含む。チトクロム c測定 試薬の一例として、サンドイッチ法によりチトクロム cを測定する測定試薬は、例えば 1) .抗チトクロム c抗体コートカップ、あるいは抗チトクロム c抗体コートビーズ、 2).標識抗 チトクロム c抗体を含み、好ましくは更に 3).既知濃度のチトクロム c標準液、 4).希釈液 、 5).洗浄液を含有する試薬である。更に酵素標識であれば、 6).発色基質、 7).反応 停止液が含まれてもよい。
[0034] 本発明の測定キットは、血液中のチトクロム cとチトクロム cに対する抗体を酸性領域 で反応させる緩衝液を含むことが好まし ヽ。
[0035] 本発明の測定キットに含まれる緩衝液は、そのままで反応に用いることができる緩 衝液であっても、希釈して用いる緩衝液であっても許される。また、適当な量の酸性
あるいはアルカリ性の溶液をカ卩えて本発明に適した酸性領域の pHとなるように調整さ れたもの、あるいはその様な指示書を含むものであっても良!、。
実施例
[0036] 以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではな い。
[0037] [参考例 1]抗チトクロム clgGの精製
ラットチトクロム c (シグマ社製)をゥサギに免疫し、チトクロム cに対する抗血清を得た 。その抗血清に最終濃度 2 Mになるように硫酸アンモ-ゥムを添加し、室温 (20-30°C )で 5時間撹拌した。撹拌した溶液を 10000回転で 30分遠心し上清を捨て、沈殿物に 0.1 Mリン酸緩衝液 pH 7.2を加え溶解後、 0.1 Mリン酸緩衝液 pH 7.2にて透析した。
[0038] 透析した溶液を、ゥシチトクロム c (シグマ社)を結合した CNBr- Sepharose4B (GEへ ルスケアバイオサイエンス社)カラムに流し、 0.15M NaClを含む 0.01Mトリス塩酸緩衝 液 pH 7.5でカラムを洗浄後、 0.1 M塩酸グァ-ジンで IgGを溶出した。溶出された IgG を 0.15 M NaClを含む 0.01 Mトリス塩酸緩衝液 pH 7.5で透析し抗チトクロム clgG精製 物とした。
[0039] [参考例 2]抗チトクロム cIgGF(a )ポリクローナル抗体の調製
2
精製した抗チトクロム clgGを 0.1 M酢酸緩衝液 pH 4.2で透析し、ペプシン(シグマ社 )を蛋白質濃度比で 20:1の割合になるように加え、 37°Cで 16時間反応させた。 1 N Na OHを加え pHを 7.5に調整し、 0.15 M NaClを含む 0.01 Mトリス塩酸緩衝液 pH 7.5で平 衡化した Sephacryl S-200 (GEヘルスケアバイオサイエンス社)カラムに流しゲル濾過 を行った。フラクションの第一ピークを集め、濃縮し、抗チトクロム clgG F(ab')ポリクロ
2 ーナル抗体とした。
[0040] [参考例 3]抗チトクロム cモノクローナル抗体の作製
ヒトチトクロム c (R&D Systems社) 110 μ g/100 μ Lと 65 mMリン酸緩衝液 pH 7.5に溶 解した 2 mg/mLォブアルブミン 55 μ Lを混合して、そこへ 65 mMリン酸緩衝液 pH 7.5 で希釈した 1 mMダルタルアルデヒド 42 Lを加え、室温で 2時間撹拌した。次に、 0.1 5 M NaClで 4°Cにおいて 48時間透析し、等量の FCAとアジュバントを作製し、 BALB/ Cマウス腹腔に 0.1 mL免疫した。 2週間おきに合計 3回同様に免疫した。 3回目の免
疫の 2週間後、マウスに生理食塩水に溶解したヒトチトクロム c50 g/100 /ζ Lを尾静 脈より静注した。 3日後マウス力も脾臓を摘出して、常法に従い、脾臓リンパ球をポリ エチレングリコール法によりミエローマ細胞 P3X63 Ag8U.lと細胞融合した。ヒトチトク ロム cを抗原としてスクリーニングを行い、ヒトチトクロム cに対するモノクローナル抗体 産生ハイブリドーマ(clone: 3G7および 27G9)を榭立した。
[0041] 榭立したノヽイブリドーマをエスクロン SF-B培地(三光純薬社)で培養して増殖させ、 BALB/Cマウス腹腔に接種した。 1週間後、腹水を採取した。採取した腹水からプロ ティン Aを用いて IgGを精製し、抗チトクロム c抗体 (3G7抗体および 27G9抗体)を得た
[0042] [参考例 4]抗チトクロム c抗体固相化ビーズの作製
抗チトクロム cモノクローナル抗体(clone: 2B5F8 (R&D Systems社)または clone: 6H2 •B4 (BectonDickinson社))を、 0.15M NaClを含む 0.1 M酢酸緩衝液(pH 4.2)で透析 し、 OD 280 nmが 0.56になるよう 0.15M NaClを含む 0.1 M酢酸緩衝液(pH 4.2)で希 釈した。希釈した抗体 1.67 mLを、あらかじめ磁石を用いて 0.15M NaClを含む 0.1 M 酢酸緩衝液(pH 4.2) 3 mLで 3回洗浄したビーズ(DynabeadsR M- 450 Epoxy, Dynal 社) 3.36 mL分と混合し、室温で 17時間撹拌した。次にビーズをブロッキングバッファ 一(50 mM Tris-HCl, 1% BSA, 0.15 M NaCl, 0.1% NaN , pH7.5) 3 mLで懸濁し、室温
3
で 7時間撹拌してビーズをブロッキングした。ブロッキングされたビーズを使用時に濃 度を調整して測定に用いた。
[0043] [参考例 5]ルテニウム錯体標識抗チトクロム c抗体の作製
参考例 3で作製した抗チトクロム cモノクローナル抗体 (3G7抗体または 27G9抗体) あるいは参考例 2で作製した抗チトクロム clgG F(ab')ポリクローナル抗体を PBSで透
2
祈し、抗体濃度を 0.5 mg/mLから 2 mg/mLの範囲に調製する。抗体 1 mLに、ジメチル スルホキシドに 10mg/mL濃度で溶解したルテニウム錯体(ruthenium(II) tris(bipyridyl) - N-hydroxysuccinimide, IGEN Corp. USA)を 12.2 μ L加え室温で 30分撹拌した。 次に 2 Mグリシンを 50 L加え、室温で 10分撹拌した。それを、 PBS-3 (10 mMリン酸 カリウム, 0.15M NaCl, 0.05% NaN , pH 6.0)であらかじめ平衡化した Sephadex G- 25 (
3
GEヘルスケアバイオサイエンス社)カラム(1.5 cm φ X 30 cm)にアプライして PBS- 3で
溶出し、 1 mLでフラクション分取した。各フラクションの OD 280 nmを測定し、第 1ピー クのフラクションを集めルテニウム錯体標識抗チトクロム c抗体とした。抗体濃度を Micr 0 BCA protein Assay kit (PIERCE社)を用いて測定した。
[0044] [参考例 6]ヒトチトクロム c標準抗原の調製
チトクロム c標準抗原は、ヒトチトクロム c (R&D Systems社)を 5% BSA、 0.15 M NaCl, 0.1% NaNを含む 0.15 Mリン酸ナトリウム緩衝液 pH 7.4で 1000 ng/mL, 500 ng/mL, 10
3
0 ng/mL, 50 ng/mL, 10 ng/mLに希釈して作製した。
[0045] [実施例 1]ヒト血清中のチトクロム c測定値に対する pHの影響
緩衝液に 30、 100、 500、 1000 ng/mLとなるように希釈したヒトチトクロム c (抗原 1、抗 原 2、抗原 3、抗原 4)、血清 1、血清 2及び血清 3の 20 Lを、酸性検体希釈液 (0.15 M NaCl, 15mM EDTA, 5% N102 (日本油脂社製), 0.1% NaNを含む 0.1 Mタエン酸リ
3
ン酸緩衝液 pH 4.0)、または中性検体希釈液(0.15M NaCl, 15mM EDTA, 5% N102 ( 日本油脂社製), 0.1% NaNを含む 0.1Mクェン酸リン酸緩衝液 pH 7.5) 200 Lにカロえ
3
た。
[0046] 以下の測定は、電気化学発光酵素免疫測定機ピコルミ ¾220 (三光純薬社)を用 いて行った。
[0047] 1% BSA, 0.3%スクロース, 0.01容量% Tween 20, 0.1% NaNを含む 0.15 M PBS, pH
3
7.5でビーズ濃度 lmg/mLに調整した抗チトクロム c抗体固相化ビーズ 25 μ Lを加えて 9分反応させ、ピコルミ R BF洗浄液(三光純薬社) 350 Lで 2回洗浄後、 1% BSA, 0.3% スクロース, 0.01容量% Tween 20, 0.1% NaNを含む 0.15 M PBS, pH 7.5で 0.5— 1
3
g/mL濃度に調整したルテニウム錯体標識抗チトクロム c抗体 200 μ Lを加えて 9分反 応させた。ピコルミ R BF洗浄液 350 Lで 2回洗浄後、ピコルミ R発光電解液 (三光純薬 社)を 300 μ Lカ卩えて発光カウント値を計測した。
[0048] 横軸にヒトチトクロム c標準抗原濃度、縦軸にヒトチトクロム c標準抗原のカウント値を プロットして標準曲線を描き、その標準曲線を基に、抗原 抗原 2、抗原 3、抗原 4、 血清 1、血清 2及び血清 3の発光カウント値力 それぞれに含まれるチトクロム c量を 算出した。
[0049] 次 ヽで、抗原と抗原、ある!/ヽは抗原と血清をそれぞれ 10 μ Lずつ混合し、同様に酸
性検体希釈液あるいは中性検体希釈液 200 Lを加えて、電気化学発光酵素免疫 測定法にてチトクロム c量を算出して、その実測値と理論値を比較して回収率を求め た。ビーズに抗チトクロム cモノクローナル抗体 6H2.B4抗体を固相化し、ルテニウム錯 体標識抗体として抗チトクロム clgG F(ab')ポリクローナル抗体を用いた結果を表 1に
2
、ビーズに 2B5F8モノクローナル抗体を固相化し、ルテニウム錯体標識抗体として 27
G9モノクローナル抗体を用いた結果を表 2に示す。
[0050] どちらの抗体系を用いた場合においても、抗原のみの場合は pHにかかわらず 100% に近い回収率を示すのに対し、血清が加わると pH 7.5では回収率が 2-20%近くまで 低下し、 pH 4にすることで回収率が 100%に回復することが明ら力となった。
[0051] また、どちらの組合せの抗体を用いた場合でも、 pH 4の緩衝液中での測定感度が
、 1 ng/mL以上であることが確認され、この条 が感度'回収率の両方を満たすもの であることが示された。
[0052] [表 1]
表 1
6Η¾β4- Poly抗体
[表 2]
表 2
2B5F8- 27G9抗体
[0053] [実施例 2]こはく酸緩衝液を用いたヒト血清中のチトクロム c測定
クェン酸リン酸緩衝液に代えてこはく酸緩衝液を用いてヒト血清中のチトクロム cの 測定を行った。
[0054] 検体希釈液 (0.1Mこはく酸, 0.15M NaCl, 2%リピジユア BL802 (日本油脂社), 2%リ ビジユア BL405 (日本油脂社), 15mM EDTA-2Na, 0.1% NaN , ρΗ4.0) 200 Lに、緩
3
衝液(0.05M Tris-HCl, pH7.8, 5% BSA, 0.15M NaCl, 0.1% NaN )で 5、 10、 100、 1000 、 3000 ng/mLとなるように希釈したヒトチトクロム c (抗原 1、抗原 2、抗原 3、抗原 4、抗 原 5)、血清 1、血清 2、血清 3及び血清 4の 20 Lを加えた。
[0055] 以下の測定は、電気化学発光酵素免疫測定機ピコルミ ¾220 (三光純薬社)を用 いて行った。
[0056] 1% BSA, 0.15M NaCl, 0.3% トレハロース, 0.01 v/v % Tween20, 10-mM EDTA-2N a, 25 μ g/mLマウス IgG, 0.1% NaNを含む 0.05 M Tris -HCl, pH7.5,でビーズ濃度 lmg
3
/mLに調整した抗チトクロム c抗体固相化ビーズ 25 μ Lをカ卩えて 9分反応させ、ピコル 5R BF洗浄液(三光純薬社) 350 μ Lで 2回洗浄後、 1% BSA, 0.15M NaCl, 0.3%トレハ ロース, 0.01 v/v % Tween20, 0.3% NaNを含む 0.05M Tris -HCl, pH7.5で濃度 1 μ g/
mLに調整したルテニウム錯体標識抗チトクロム c抗体 200 μ Lを加えて 9分反応させた 。ピコルミ R BF洗浄液 350 Lで 2回洗浄後、ピコルミ R発光電解液 (三光純薬社)を 300 μ L加えて発光カウント値を計測した。
[0057] 横軸にヒトチトクロム c標準抗原濃度、縦軸にヒトチトクロム c標準抗原のカウント値を プロットして標準曲線を描き、その標準曲線を基に、抗原 抗原 2、抗原 3、抗原 4、 抗原 5、血清 1、血清 2、血清 3及び血清 4の発光カウント値からそれぞれに含まれる チトクロム c量を算出した。
[0058] ビーズに抗チトクロム cモノクローナル抗体 2B5F8抗体を固相化し、ルテニウム錯体 標識抗体として抗チトクロム 27G9モノクローナル抗体あるいは 6Η2.Β4モノクローナル 抗体を用いた結果を表 3に示す。この試薬を用いた場合においても、回収率が 100% を示し、測定感度が、 1 ng/mL以上であることが確認され、この条件も感度'回収率の 両方を満たすものであることが示された。
[0059] [表 3]
表 3
2B5F8- 27G9抗体 チ血血血抗抗抗抗血抗血血血抗血抗抗抗抗トクロム c定量値 抗原の組み合わせ 実測値 理論値 回収率
清原原清原凊 _¾原原原原 1¾京青 ϊ青青=
4423235 11 (ng/mL) (A) (B) (C) (D) = ( (A) + (B) ) /2 (C)/(D)
5.0 14.7 13.5 109.3% 10.2 16.5 16.1 102.8% 97.1 46.3 43.4 106.8% 1033.2 86.6 86.8 99.8% 2927.1 331.6 304.5 108.9% 21.9 740.5 772.6 95.9%
,抗抗抗抗抗抗抗抗
76.5 抗抗抗抗抗抗抗抗
1205.4 1243.1 97.0% 原原原原原原原原京京
511.9 2195.7 2190.0 100.3% 1452.9
血血血血血血血血血血血血血血血血
清 I滑嘴清清清清 Y清清清清_n-n=
2B5F8-6H2. B4抗体 442233 11 チトクロム c定量値 抗原の組み合わせ 実測値 理論値 回収率
(ng/mL) (A) (B) (C) (D) = ( (A) + (B) ) /2 (C)/(D)
4.6 12.1 12.4 98.0% 9.2 14.3 14.7 97.6% 108.3 44.9 42.8 104.9% 1090.0 91.8 92.4 99.4% 2859.8 370.3 324.7 114.1%
20.1 794.4 815.5 97.4% 76.4 1339.8 1276.7 104.9% 541.0 2072.1 2161.6 95.9% 1463.4 [実施例 3]チトクロム cの正確な測定を妨げるヒト血清中の妨害物質の同定
(1)ヒト血清のゲルろ過
ヒト血清 2mLを、 PBSを溶出液として Sephacryl S- 200 (GEヘルスケアバイオサイェン ス社)カラムゲルクロマトグラフィー(サイズ φ 2.5cm X 120cm)によりゲルろ過し、 1フ ラタシヨン約 7 mLで分取した。各フラクション 0.5 mLに、ヒトチトクロム c (R&D Systems 社)を 10 μ g/mLの濃度に精製水で溶解したものを 50 μ Lカ卩えて混合し、その 50 μ L を反応用溶液(0.15 M PBS, 15 mMEDTA, 1% BSA, 0.1% NaN , ρΗ 7.5)50 Lで希
3
釈した。これを、電気化学発光免疫自動測定機ピコルミ R8220(三光純薬社)を用い、 参考例で作製した抗チトクロム c抗体 (2B5F8)結合ビーズ、 1% BSA, 0.3%スクロース, 0 .01容量% Tween20, 0.1% NaNを含む 0.15M PBS, pH7.5で 2 μ g/mLに希釈した参考
例で作製したルテニウム錯体標識抗チトクロム c抗体 (3G7)、ピコルミ κ発光電解液 (三 光純薬社)、ピコルミ R BF洗浄液 (三光純薬社)、ピコルミ Rセルクリーナー液 (三光純 薬社)、ピコルミ Rノズルリンス液 (三光純薬社)をセットし、抗チトクロム c抗体結合ビー ズ分注量 25 L、ルテニウム標識抗チトクロム c抗体分注量 100 L、ピコルミ R 光電 解液分注量 300 L、 1ステップ、反応時間 26分の条件で測定した。
[0061] その結果、フラクション No.41付近で発光カウント値が減少した。したがって、フラク シヨン No.41にチトクロム cと抗チトクロム c抗体との反応を阻害する妨害物質が含まれ ていることがわかった(図 1)。
[0062] (2)妨害物質が含まれるフラクションの 2次元電気泳動と質量分析による同定
Hiroyuki Katayama et al" Optimization of in— gel protein digestion system in combi nation with thin-gel separation and negative staining in 96— well plate format: Rapid Commun. in Mass Spectrom. 2003; 17: 1071- 1078に記載されている方法を参考に して、妨害物質が含まれるフラクションを 2次元電気泳動で分離し、各スポットを質量 分析により同定した (プロテオーム技術)。
[0063] ゲルろ過フラクション No.41の 0.5 mLを Swell Ge Blue Albumin Removal kit (PIERC E社)を用いて、アルブミン除去処理した。次に、二次元電気泳動を行うため、膨潤バ ッファー(8 M尿素, 2%CHAPS, 0.5% IPG Buffer,ブロモフエノールブルー, 0.6%ジチ オスレィトール) 0.44 mLとアルブミン除去したゲルろ過フラクション 0.11 mLを混合し、 そこへ等電点電気泳動用ゲル Immobilize Dry Strip pH3-10, 18cm (GEヘルスケアバ ィォサイエンス社)を浸し、室温でー晚放置し、ゲルを膨潤させた。ゲルを CoolPhoreS tarlPG-IEF Type- P (アナテック社)にセットし、 PowerPhoreStar Pro (アナテック社)で 500V2h, 700Vlh, lOOOVlh, 1500Vlh, 2000Vlh, 2500Vlh, 3000Vlh, 3500V101!〜 の電圧をかけて、電気泳動を行った。泳動したゲルを SDS処理バッファー(50 mM Tri s -HCl, pH 6.8, 6 M尿素, 0.25%ジチオスレィトール, 2% SDS, 0.0025%ブロモフエノ ールブルー, 30容量%グリセロール)に浸して室温で lOmin撹拌し、次に、還元アルキ ル化処理バッファー(50 mMTris -HCl, pH 6.8, 6 M尿素, 2%SDS, 0.0025%ブロモフエ ノールブルー, 30容量%グリセロール, 4.5%ョードアセトアミド)に浸して室温で 10 min 撹拌した後、 2Dクイックゲル (アナテック社)にセットし、電気泳動した。泳動したゲル
を Coomasie Briliant blueで染色して、スポットをカッターで切り出した。
[0064] 切り出したゲルをカッターで細力べ砕き、チューブに入れ 50 mM NH HCO:ァセトニ
4 3 トリル =1:1を 100 L注入し、室温で 60分撹拌した。 50 mM NH HCO:ァセトニトリル =1
4 3
:1を入れ替え、さらに室温で 40分撹拌し Coomasie Briliantblueを脱色した。
[0065] 洗浄液(50%メタノール、 10%酢酸、 40%精製水) 100 μ Lで置換し、 4°Cで保存一時 保存した。洗浄液を除去し、 50 mM NH HCO:ァセトニトリル =1:1を用いて 100 L/tu
4 3
beで 3回洗浄した。次に、 100 mM NH HCOを 100 L/tube入れて、室温で 5分間撹
4 3
拌した。液を除去し、 DTT 2.5 mg/mLを含む 100 mM NH HCOを 100 μ L/tube入れ
4 3
て、 15分間撹拌した。液を除去し、アクリルアミド 45 mg/mLを含む 100 mM NH HCO
4 3 を 100 L/tube入れ 15分間撹拌した。液を除去し、メタノール:酢酸:精製水 =5 : 1 :4 を 500 L/tube入れ、室温で 16時間撹拌した。液を入れ替えてさらに室温で 30分間 撹拌した。液を除去し、 50 mM NH HCOを 500 μ L/tube入れ、室温で 10分間撹拌し
4 3
た。液を除去し、ァセトニトリル 500 L/tube入れ、室温で 5分間撹拌した。
[0066] チューブのふたを開け、減圧遠心乾燥機(トミー精工社、 Speed vac)にセットし、乾 固するまで減圧乾燥させた。次に、 0.2% n-ォクチルダルコシド(シグマ社)液: 50 mM NH HCO = 1: 1液 45 μ Lに 200 μ g/mLトリプシンを 5 μ L加えた液を 2.5 μ Lとり、乾燥
4 3
させたゲルに加え、室温で 5分間反応させた。そこへ 50 mM NH HCO :0.2% n—オタ
4 3
チルダルコシド液 = 1: 1を 8 μ L加え、 37°Cで 16時間放置した。そこへ、 0.1% TFAを含 む 50%ァセトニトリルを 40 Lカ卩え、 10分間超音波水槽にかけた。液を別なチューブ に移し、残ったゲルに、 0.1% TFAを含む 75%ァセトニトリルを 40 μ L入れ、超音波水槽 で 10分間処理した。液を取り出し、先に別チューブに移しておいた液と合わせた。次 に、凍結真空乾燥機で液を乾燥させた。
[0067] 乾燥させたサンプルに 0.1% TFAを含む 5%ァセトニトリルを 50 μ L入れ、撹拌してサン プルを溶解した。 C18逆相クロマトグラフィー用ゲルを詰め、あらかじめメタノール 200 μ Lと 50 μ Lで 2回洗浄したカラムに、溶解したサンプルを全量アプライした。 2000 rp m、 5分遠心し、アプライしたサンプルを完全に流した。次に、カラムに 0.1% TFAを含 む 5%ァセトニトリルを 50 μ L入れ、 2000 rpm、 5分遠心し洗浄した。この洗浄を 3回行 つた。次に、 0.1% TFAを含む 95%ァセトニトリルを 25 μ L入れ、 2000 rpm、 5分遠心し
サンプルを溶出した。溶出された液を 37°Cに放置し、液を乾燥させた。
[0068] 0.1% TFAを含む 5%ァセトニトリルをチューブに入れてサンプルを溶解し、 LC- MASS 分析装置 (サーモエレクトロン社、 LCQ)を用いて、質量解析を行い、二次元電気泳 動において得られたスポットを同定した。結果を図 2に示した。
[0069] (3)同定された蛋白質のチトクロム c測定に対する影響
同定された蛋白質のうち、アルブミンを除く市販されていて入手可能なものについ て、蛋白質をチトクロム cの測定系に添加して、チトクロム c測定を行い、妨害活性があ るか調べた。
[0070] 1).ヒトトランスフェリン (Biogenesis社) 6.5 mgを精製水 0.65 mLで溶解し 10 mg/mLのトラ ンスフェリン溶液を調製した。
2) .ヒト α 1酸性糖蛋白質(Athens Research&Technology社) 1 mgを 0.5 mLの PBS- 1で 溶解し、 ひ 1酸性糖蛋白質溶液とした。
3) .ヒト α ΐアンチトリプシン(CALBIOCHEM社) 1 mgを 0.33 mLの精製水で溶解し、 a 1アンチトリプシン溶液とした。
4) .ヒトトランスチレチン (プレアルブミン)(Sigma社) 1 mgを 0.3 mLの 0.15 M NaClを含む 50mMリン酸緩衝液 pH 7.5で溶解しトランスチレチン溶液とした。
5) .ヒトビタミン D結合蛋白質 (Gc-グロブリン) (CALBIOCHEM社) 1 mgを 0.5 mLの精製 水で溶解し、ビタミン D結合蛋白質溶液とした。
[0071] 反応用溶液(0.15M PBS, 15 mM EDTA, 1% BSA, 0.1% NaN , pH 7.5) 100 μ Lに、
3
同定された蛋白質の溶液を 0または 10 μ L、ヒトチトクロム c (10 μ g/mL)を 1 μ L添加し た。これを、電気化学発光免疫自動測定機ピコルミ ¾220 (三光純薬社)を用い、参考 例で作製した抗チトクロム c抗体 (2B5F8)結合ビーズ、ルテニウム錯体標識抗チトク口 ム c抗体 (27G9)、ピコルミ R発光電解液 (三光純薬社)、ピコルミ ¾F洗浄液 (三光純薬 社)、ピコルミ Rセルクリーナー液 (三光純薬社)、ピコルミ Rノズルリンス液 (三光純薬社 )をセットし、抗チトクロム c抗体結合ビーズ分注量 25 μ L、ルテニウム標識抗チトクロム c抗体分注量 100 L、ピコルミ R発光電解液分注量 300 L、 1ステップ、反応時間 26 分の条件で測定した。その結果、 a 1酸性糖蛋白質およびひ 1アンチトリプシンに添 加回収率の低下が認められ、妨害活性を有することがわ力つた (表 4)。
[0072] [表 4] 表 4
[0073] (4)同定された妨害物質の酸性領域でのチトクロム c測定に対する影響
反応条件を以下に示す酸性条件、または、中性条件で、測定方法に従って測定し た。
1)酸性条件
•酸性反応用溶液(0.05 Μクェン酸, 1% BSA, 0.15 M NaCl, 15 mM EDTA, pH 4.0) •ルテニウム希釈液(0.05 Mクェン酸, 1% BSA, 0.15M NaCl, 0.3%スクロース, 0.01% Tween20, pH 4.0)
2)中性条件
•中性反応用溶液(0.15 M PBS, 15 mM EDTA, 1% BSA, 0.1% NaN , pH7.5)
3
'ルテニウム希釈液(0.15 M PBS, 1% BSA, 0.3%スクロース, 0.01% Tween20, 0.1% Na N , pH 7.5)
3
[0074] 3)測定方法
反応用溶液 100 Lに、妨害活性の認められた蛋白質の溶液である ex 1酸性糖蛋 白質液(2mg/mL)または α 1アンチトリプシン液(3mg/mL) 10 レ及び、ヒトチトクロム c (R&D Systems社)を 10 μ g/mLの濃度に精製水で溶解したもの 1 μ Lを加えて混合し た。これを、電気化学発光免疫自動測定機ピコルミ R8220 (三光純薬社)を用い、参考 例で作製した抗チトクロム c抗体 (2B5F8)結合ビーズ、ルテニウム希釈液で希釈した参 考例で作製したルテニウム標識抗チトクロム c抗体 (3G7)、ピコルミ R発光電解液 (三光 純薬社)、ピコルミ R BF洗浄液 (三光純薬社)、ピコルミ Rセルクリーナー液 (三光純薬
社)、ピコルミ Kノズルリンス液 (三光純薬社)をセットし、抗チトクロム C抗体結合ビーズ 分注量 25 L、ルテニウム標識抗チトクロム c抗体分注量 100 L、ピコルミ R発光電解 液分注量 300 L、 1ステップ、反応時間 26分の条件で測定した。
[0075] その結果、表 5に示すとおり、ヒト血清中での測定と同様に抗原抗体反応時の pHを 下げることで妨害活性を回避できることが明らかとなった。
[0076] 妨害活性を有する物質は共に酸性度の高い蛋白質であり、これら酸性度の高い蛋 白質が塩基性の強いチトクロム cと相互作用することにより、チトクロム cの測定に影響 を与えていたと考えられる。酸性領域で測定することによりチトクロム cと妨害物質の 相互作用は弱くなることから、酸性領域では正確な定量が可能となったものと考えら れる。従って、実施例で試験した以外の抗体に関しても、酸性領域とすることでチトク ロム cの正確な測定が可能となるものと考えられる。
[0077] [表 5] 表 5
産業上の利用の可能性
体液中のチトクロム Cが体内で起こっているアポトーシスの指標となることが知られ、 多くの疾患の診断薬として有効であることが明らかとなっている。本願の酸性領域の 緩衝液を用いるチトクロム cの免疫化学的測定法により、より正確なチトクロム C量の測 定が可能となり、本方法の診断薬への応用が期待される。
Claims
[1] 体液中のチトクロム cを免疫化学的に測定する方法であって、抗体とチトクロム cの反 応を酸性領域の緩衝液中で行うことを特徴とする方法。
[2] 酸性領域が pH 3.5力 pH 5.0である請求項 1に記載の方法。
[3] 体液が血液である請求項 1又は 2に記載の方法。
[4] 体液中のチトクロム cを免疫化学的に測定するキットであって、抗体とチトクロム cの反 応を酸性領域の緩衝液中で行うための測定キット。
[5] 酸性領域が pH 3.5力 pH 5.0である請求項 4に記載の測定キット。
[6] 少なくとも、
(1)チトクロム cと反応する抗体及び
(2)酸性領域で反応させる緩衝液
を含む、請求項 4又は 5に記載の測定キット。
[7] チトクロム cと反応する抗体が、固相化した抗体及び Z又は標識した抗体である、請 求項 6に記載の測定キット。
[8] 体液が血液である請求項 4から 7の 、ずれか一項に記載の測定キット。
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