WO2006112445A1

WO2006112445A1 - チトクロムｃの免疫化学的測定方法及び測定キット

Info

Publication number: WO2006112445A1
Application number: PCT/JP2006/308079
Authority: WO
Inventors: Muneo Aoyama
Original assignee: Eisai R & D Management Co., Ltd.
Priority date: 2005-04-15
Filing date: 2006-04-17
Publication date: 2006-10-26
Also published as: JP4896022B2; EP1873523A4; EP1873523A1; JPWO2006112445A1; EP1873523B1; US7892757B2; US20090075290A1

Abstract

体液、特に血中のチトクロムｃ量を正確に測定する免疫化学的方法、並びに測定キットを提供する。抗体とチトクロムｃの反応を酸性領域の緩衝液中で行うことにより、妨害物質の影響を排除でき、正確なチトクロムｃ量の測定が可能となる。

Description

明細書

チトクロム Cの免疫化学的測定方法及び測定キット

技術分野

[0001] 本発明は、体液、特に血中のチトクロム cを正確に測定する免疫化学的方法、及び測定キットに関する。

背景技術

[0002] チトクロム cは古くは電子伝達系の蛋白質として、また、近年ではアポトーシス関連蛋白質として研究され、細胞内のチトクロム C濃度や血中のチトクロム C濃度を免疫化学的に測定する方法が知られている（非特許文献 1)。また、血中のチトクロム c濃度が体内で起こっているアポトーシスの指標となることが知られ (非特許文献 2、特許文献 1、 2)、多くの疾患の診断薬としての用途が期待されている。

[0003] 従来のチトクロム c測定法や測定キットを用いて体液、特に血中のチトクロム cを測定する場合、その測定値がチトクロム c量を反映し、体内で起こっているアポトーシスを検査する上で支障が無いことは確認されていた。し力しこれまで、測定値が正確に体液中のチトクロム c量を反映しているか否かは検証されておらず、体液中のチトクロム cの測定値を正確に求められる測定方法及び測定キットが求められていた。

特許文献 l :WO 01/35093

特許文献 2：特開 2003-028860

非特許文献 1： Andrea Renz, et al. Rapid extracellular release of cytochrome c is spe cific for apoptosis and markers cell death in vivo, BLOOD, 98(5)1542-1548,2001 特許文献 2 : Z.BEN—ARI, et al.し lrculating soluble cytochromec in liver disease as marker of apoptosis, Journal of Internal Medicine, 254, 168—175,2003

発明の開示

[0004] 本発明の課題は、体液、特に血中のチトクロム cを正確に測定する免疫化学的方法

、及び測定キットを提供することにある。

[0005] 本発明者らは従来のサンドイッチ法で、血清に既知量のチトクロム cを添加し、その測定値を測定する添加回収試験を行ったところ、添加量の多寡を反映した測定値が得られることが判明したものの、添加量を正確に反映した測定値を得ることができなかった。

[0006] 種々の測定条件にっ、て検討した結果、チトクロム cと抗チトクロム c抗体を反応させる際の緩衝液の pHを酸性領域にすることにより、血清中チトクロム cの正確な測定値を得ることができることを見出して、発明を完成するに至った。

[0007] すなわち本発明は、以下に関する。

[1]体液中のチトクロム cを免疫化学的に測定する方法であって、抗体とチトクロム c の反応を酸性領域の緩衝液中で行うことを特徴とする方法。

[2]酸性領域が pH 3.5力ら pH 5.0である [1]に記載の方法。

[3]体液が血液である [ 1]又は [2]に記載の方法。

[4]体液中のチトクロム cを免疫化学的に測定するキットであって、抗体とチトクロム c の反応を酸性領域の緩衝液中で行うための測定キット。

[5]酸性領域が pH 3.5力ら pH 5.0である [4]に記載の測定キット。

[6]少なくとも、

(1)チトクロム cと反応する抗体及び

(2)酸性領域で反応させる緩衝液

を含む、 [4]又は [5]に記載の測定キット。

[7]チトクロム cと反応する抗体が、固相化した抗体及び Z又は標識した抗体である、 [6]に記載の測定キット。

[8]体液が血液である [4]〜 [7]の、ずれか一項に記載の測定キット。

[0008] 更に本発明者らは、質量解析を用いたプロテオーム技術により、正確なチトクロム c の定量を妨げるヒト血清中の妨害物質が、 a 1酸性糖蛋白質 ( a 1-acid glycoprotein) 、 a 1アンチトリプシン等の酸性度の高い蛋白質であることを明らかにした。

[0009] 本発明は、血清中の酸性度の高い蛋白質がチトクロム cと抗体との結合に影響を与えること、その影響が酸性領域でチトクロム cと抗体を反応させることで無くなることを明らかにしたものであり、酸性度の高い蛋白質が、チトクロム cと抗体との反応に影響を与えることを抑制するその他の方法、例えば反応液の塩濃度を調整する等の方法も、本発明に含まれるものである。 [0010] 本発明により、体液中、特に血中のチトクロム cを正確に測定する免疫化学的測定法が確立され、チトクロム c測定値の信頼性が高まる。

図面の簡単な説明

[0011] [図 1]ヒト血清をゲルろ過に付して得られた各フラクションのチトクロム c測定に対する妨害活性を示す。

[図 2]妨害物質が含まれるフラクションの二次元電気泳動の結果を示す (電気泳動写真)。スポットには、同定された蛋白質の名称を付記している。

発明を実施するための最良の形態

[0012] 本発明の主題は、体液中、特に血中のチトクロム cの量を測定する免疫化学的測定方法において、酸性領域で抗チトクロム c抗体とチトクロム cを反応させ、抗チトクロム c 抗体とチトクロム cの結合に影響を与える体液中の妨害物質の影響を減弱させて、正確なチトクロム cの測定値が得られるようにする方法にある。

[0013] 従って本明細書でいう酸性領域とは、抗体とチトクロム cの結合に影響を与える体液中の妨害物質の影響が減弱する pH領域である。 pHを低下させることにより妨害物質の影響を減弱させることができる力同時に抗体とチトクロム cの結合も弱くなるため、本発明の免疫化学的な測定における pHは、下記 1及び 2を満たす pHに決められる。

[0014] 1.緩衝液中で 10 ng/mL、好ましくは 1 ng/mLのチトクロム cが定量可能な測定感度が得られる。

2.体液存在下での添加回収試験における回収率が 70%以上、好ましくは 80%以上、更に好ましくは 90%以上得られる。

[0015] 抗体とチトクロム cの結合に及ぼす pHの効果は用いる抗体により異なるため、当該免疫化学的測定方法に用いる pHは、抗体毎に最適な pHを決めることができる。好ましくは pH 7以下、更に好ましくは pH 3〜pH 6、更に好ましくは pH 3.5〜pH 5、更に好ましくは pH 3.5〜pH 4.5である。

[0016] 以下に、本発明の免疫化学的な測定における pHを決める方法を具体的に示すが

、 pHを決める方法は、これに限定されるものではない。

[0017] 1.測定感度への pHの影響

必要により BSA等の適当な蛋白質、 NaCl等の適当な塩類、必要により適当な界面活性剤他を含む pH 3〜pH 7.5の緩衝液に、チトクロム cを 1〜1000 ng/mLに希釈する

[0018] 当該免疫化学的な測定法が 2ステップサンドイッチ法の場合、希釈したチトクロム c と固相化した抗チトクロム c抗体を反応させ、洗浄後、標識した抗チトクロム c抗体をカロえて標識物質に対応した活性、放射性標識であれば放射活性、酵素標識であれば酵素活性により標識物質を検出する。

[0019] また、当該免疫化学的な測定法が 1ステップサンドイッチ法の場合、希釈したチトクロム cと固相化した抗チトクロム c抗体、標識した抗チトクロム c抗体をカ卩えて反応させ、標識物質に対応した活性、放射性標識であれば放射活性、酵素標識であれば酵素活性により標識物質を検出する。

[0020] 10 ng/mL,好ましくは 1 ng/mLのチトクロム cを含む検体から得られるシグナルが、チトクロム cを含まな、緩衝液のみの検体のシグナルと比較して充分に強ければ、当該 pHは免疫化学的測定法に用いる緩衝液の pHの候補として挙げられる。

[0021] 2.添カ卩回収への pHの影響

免疫化学的測定法に用いる検体に対応した体液、例えば血清中のチトクロム cを測定するのであれば血清に、既知量のチトクロム cを添加する。チトクロム cを添カ卩した血清、及び添加しな力つた血清中のチトクロム c量を、当該免疫化学的な方法により測定し、理論値に対する測定値の比率を回収率とする。

[0022] 回収率は、添カ卩したチトクロム c量を A、チトクロム c未添加血清中のチトクロム c測定値を B、チトクロム c添加血清中のチトクロム c測定値を Cとして、

(1) .測定値 (C) Z理論値 (Aと Bの加重平均)、

(2) .チトクロム c添カ卩による測定値の上昇値 (C - B) Z添加量 (A)、

の何れでも計算できる。

[0023] 回収率が 70%以上、好ましくは 80%以上、更に好ましくは 90%以上の場合、当該 pHは免疫化学的測定法に用いる緩衝液の pHの候補として挙げられる。

[0024] 当該免疫化学的な方法に用いる緩衝液の pHは 1.測定感度への pHの影響、 2.添加回収への pHの影響を勘案して決定する。

[0025] また本発明の、免疫化学的なチトクロム cの測定に当たり、酸性領域の緩衝液を用いる方法は、固相化した抗体と検体中のチトクロム cとを反応させる第 1反応のみならず、第 1反応で妨害物質が除去しきれなかった時に、第 2反応 (チトクロム cと標識抗体を反応させる工程）に用いても有効である。

本発明の方法は、第 1反応で酸性領域の緩衝液を用いる方法に限られるものではない。

[0026] 血液中のチトクロム cとチトクロム cに対する抗体を酸性領域で反応させる緩衝液は、上記 1.測定感度への pHの影響、 2.添カ卩回収への pHの影響を勘案して決定される。緩衝液の種類は、酸性条件に調整し得る緩衝液であれば特に制限されないが、例えばこはく酸緩衝液、クェン酸リン酸緩衝液などが挙げられる。

[0027] 本発明の方法は、上述のように、酸性領域で抗チトクロム c抗体とチトクロム cを反応させる他は、通常の、体液中のチトクロム cの量を測定する免疫学的方法と同様でよい。

[0028] ここで免疫化学的方法とは、チトクロム cに対する抗体を用いて、チトクロム cを定量する方法である。免疫化学的方法としては、チトクロム cを標識する競合法、抗体を標識するサンドイッチ法、抗体コートしたビーズの凝集を観察するラテックスビーズ法等、様々な方法があるが、チトクロム cに対する抗体を用いた方法であれば、本発明の方法に含まれる。抗チトクロム c抗体は、チトクロム cを検出できるものであれば特に制限はなぐ IgG、 IgG F(ab' )フラグメントや Fabフラグメントでもよぐモノクローナル抗体

2

でも、ポリクローナル抗体でも良い。また抗体は固相化されたものでも、標識されたものでもよい。標識には、放射性同位元素による標識、電気化学発光する化合物による標識、蛍光標識、酵素標識、ピオチン標識等、様々な方法があるが、本発明はこれらの例に限られるものではない。抗体の作製法及び標識法は、例えば続生化学実験講座 5免疫生化学研究法 (社団法人日本生化学会編株式会社東京化学同人発行) または新生化学実験講座 12分子免疫学 III (社団法人日本生化学会編株式会社東京化学同人発行）に記載されている。

[0029] 本明細書中において体液としては、生体より採取された血液 ·血漿 ·血清'脳脊髄液'臍帯血 *尿*羊水 ·気管支肺洗浄液等が挙げられるが、このうち血液が好ましい。

[0030] 本発明の方法では、通常には、酸性領域で抗チトクロム c抗体と試料中のチトクロム cを反応させた後に、反応したチトクロム Cの検出を行う。検出は、好ましくは洗浄を行つた後、標識された 2次抗体を反応させ、標識に応じた検出法により、検出する方法が挙げられる。例えば、ピオチン標識された 2次抗体を用いる場合は、さらに、ァビジン標識されたペルォキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素を反応させた後、該酵素の基質を用いて発光又は発色により検出することができる。また、酵素標識された 2次抗体、蛍光標識された 2次抗体、ルテニウム標識された 2次抗体などを用いてもよい。

[0031] チトクロム cを測定する免疫化学的方法の例としては、例えば下記の参考例に記載した方法で調製したルテニウム錯体標識抗チトクロム c抗体を用いる方法が挙げられる。

[0032] さらに本発明は、体液中のチトクロム cを免疫化学的に測定するキットに関する。本発明のキットは、抗チトクロム c抗体とチトクロム cの反応を酸性領域の緩衝液中で行うための測定キットである。例えば、キット付属の使用説明書に、酸性条件でチトクロム cと抗チトクロム c抗体の反応を行う旨が記載されたキットが挙げられる。また、酸性に調整した反応用緩衝液を含むキットでもよ、。本発明のキットは抗チトクロム c抗体の他に、 2次抗体、チトクロム c標準液、希釈液、洗浄液、検出用の基質などを含むものでもよい。

[0033] 通常には、本発明のキットは、体液、特に血液中のチトクロム cをチトクロム cに対する抗体を用いて定量するための試薬 (チトクロム c測定試薬)を含む。チトクロム c測定試薬の一例として、サンドイッチ法によりチトクロム cを測定する測定試薬は、例えば 1) .抗チトクロム c抗体コートカップ、あるいは抗チトクロム c抗体コートビーズ、 2).標識抗チトクロム c抗体を含み、好ましくは更に 3).既知濃度のチトクロム c標準液、 4).希釈液、 5).洗浄液を含有する試薬である。更に酵素標識であれば、 6).発色基質、 7).反応停止液が含まれてもよい。

[0034] 本発明の測定キットは、血液中のチトクロム cとチトクロム cに対する抗体を酸性領域で反応させる緩衝液を含むことが好ましヽ。

[0035] 本発明の測定キットに含まれる緩衝液は、そのままで反応に用いることができる緩衝液であっても、希釈して用いる緩衝液であっても許される。また、適当な量の酸性あるいはアルカリ性の溶液をカ卩えて本発明に適した酸性領域の pHとなるように調整されたもの、あるいはその様な指示書を含むものであっても良!、。

実施例

[0036] 以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではない。

[0037] [参考例 1]抗チトクロム clgGの精製

ラットチトクロム c (シグマ社製)をゥサギに免疫し、チトクロム cに対する抗血清を得た。その抗血清に最終濃度 2 Mになるように硫酸アンモ-ゥムを添加し、室温 (20-30°C )で 5時間撹拌した。撹拌した溶液を 10000回転で 30分遠心し上清を捨て、沈殿物に 0.1 Mリン酸緩衝液 pH 7.2を加え溶解後、 0.1 Mリン酸緩衝液 pH 7.2にて透析した。

[0038] 透析した溶液を、ゥシチトクロム c (シグマ社）を結合した CNBr- Sepharose4B (GEへルスケアバイオサイエンス社)カラムに流し、 0.15M NaClを含む 0.01Mトリス塩酸緩衝液 pH 7.5でカラムを洗浄後、 0.1 M塩酸グァ-ジンで IgGを溶出した。溶出された IgG を 0.15 M NaClを含む 0.01 Mトリス塩酸緩衝液 pH 7.5で透析し抗チトクロム clgG精製物とした。

[0039] [参考例 2]抗チトクロム cIgGF(a ）ポリクローナル抗体の調製

2

精製した抗チトクロム clgGを 0.1 M酢酸緩衝液 pH 4.2で透析し、ペプシン（シグマ社 )を蛋白質濃度比で 20:1の割合になるように加え、 37°Cで 16時間反応させた。 1 N Na OHを加え pHを 7.5に調整し、 0.15 M NaClを含む 0.01 Mトリス塩酸緩衝液 pH 7.5で平衡化した Sephacryl S-200 (GEヘルスケアバイオサイエンス社)カラムに流しゲル濾過を行った。フラクションの第一ピークを集め、濃縮し、抗チトクロム clgG F(ab')ポリクロ

2 ーナル抗体とした。

[0040] [参考例 3]抗チトクロム cモノクローナル抗体の作製

ヒトチトクロム c (R&D Systems社） 110 μ g/100 μ Lと 65 mMリン酸緩衝液 pH 7.5に溶解した 2 mg/mLォブアルブミン 55 μ Lを混合して、そこへ 65 mMリン酸緩衝液 pH 7.5 で希釈した 1 mMダルタルアルデヒド 42 Lを加え、室温で 2時間撹拌した。次に、 0.1 5 M NaClで 4°Cにおいて 48時間透析し、等量の FCAとアジュバントを作製し、 BALB/ Cマウス腹腔に 0.1 mL免疫した。 2週間おきに合計 3回同様に免疫した。 3回目の免疫の 2週間後、マウスに生理食塩水に溶解したヒトチトクロム c50 g/100 /ζ Lを尾静脈より静注した。 3日後マウス力も脾臓を摘出して、常法に従い、脾臓リンパ球をポリエチレングリコール法によりミエローマ細胞 P3X63 Ag8U.lと細胞融合した。ヒトチトクロム cを抗原としてスクリーニングを行い、ヒトチトクロム cに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（clone： 3G7および 27G9)を榭立した。

[0041] 榭立したノヽイブリドーマをエスクロン SF-B培地（三光純薬社)で培養して増殖させ、 BALB/Cマウス腹腔に接種した。 1週間後、腹水を採取した。採取した腹水からプロティン Aを用いて IgGを精製し、抗チトクロム c抗体 (3G7抗体および 27G9抗体)を得た

[0042] [参考例 4]抗チトクロム c抗体固相化ビーズの作製

抗チトクロム cモノクローナル抗体（clone： 2B5F8 (R&D Systems社）または clone： 6H2 •B4 (BectonDickinson社））を、 0.15M NaClを含む 0.1 M酢酸緩衝液（pH 4.2)で透析し、 OD 280 nmが 0.56になるよう 0.15M NaClを含む 0.1 M酢酸緩衝液（pH 4.2)で希釈した。希釈した抗体 1.67 mLを、あらかじめ磁石を用いて 0.15M NaClを含む 0.1 M 酢酸緩衝液（pH 4.2) 3 mLで 3回洗浄したビーズ（Dynabeads^R M- 450 Epoxy, Dynal 社) 3.36 mL分と混合し、室温で 17時間撹拌した。次にビーズをブロッキングバッファ一（50 mM Tris-HCl, 1% BSA, 0.15 M NaCl, 0.1% NaN , pH7.5) 3 mLで懸濁し、室温

3

で 7時間撹拌してビーズをブロッキングした。ブロッキングされたビーズを使用時に濃度を調整して測定に用いた。

[0043] [参考例 5]ルテニウム錯体標識抗チトクロム c抗体の作製

参考例 3で作製した抗チトクロム cモノクローナル抗体 (3G7抗体または 27G9抗体）あるいは参考例 2で作製した抗チトクロム clgG F(ab')ポリクローナル抗体を PBSで透

2

祈し、抗体濃度を 0.5 mg/mLから 2 mg/mLの範囲に調製する。抗体 1 mLに、ジメチルスルホキシドに 10mg/mL濃度で溶解したルテニウム錯体（ruthenium(II) tris(bipyridyl) - N-hydroxysuccinimide, IGEN Corp. USA)を 12.2 μ L加え室温で 30分撹拌した。次に 2 Mグリシンを 50 L加え、室温で 10分撹拌した。それを、 PBS-3 (10 mMリン酸カリウム， 0.15M NaCl, 0.05% NaN , pH 6.0)であらかじめ平衡化した Sephadex G- 25 (

3

GEヘルスケアバイオサイエンス社)カラム（1.5 cm φ X 30 cm)にアプライして PBS- 3で溶出し、 1 mLでフラクション分取した。各フラクションの OD 280 nmを測定し、第 1ピークのフラクションを集めルテニウム錯体標識抗チトクロム c抗体とした。抗体濃度を Micr 0 BCA protein Assay kit (PIERCE社）を用いて測定した。

[0044] [参考例 6]ヒトチトクロム c標準抗原の調製

チトクロム c標準抗原は、ヒトチトクロム c (R&D Systems社）を 5% BSA、 0.15 M NaCl, 0.1% NaNを含む 0.15 Mリン酸ナトリウム緩衝液 pH 7.4で 1000 ng/mL, 500 ng/mL, 10

3

0 ng/mL, 50 ng/mL, 10 ng/mLに希釈して作製した。

[0045] [実施例 1]ヒト血清中のチトクロム c測定値に対する pHの影響

緩衝液に 30、 100、 500、 1000 ng/mLとなるように希釈したヒトチトクロム c (抗原 1、抗原 2、抗原 3、抗原 4)、血清 1、血清 2及び血清 3の 20 Lを、酸性検体希釈液 (0.15 M NaCl, 15mM EDTA, 5% N102 (日本油脂社製）， 0.1% NaNを含む 0.1 Mタエン酸リ

3

ン酸緩衝液 pH 4.0)、または中性検体希釈液（0.15M NaCl, 15mM EDTA, 5% N102 ( 日本油脂社製）， 0.1% NaNを含む 0.1Mクェン酸リン酸緩衝液 pH 7.5) 200 Lにカロえ

3

た。

[0046] 以下の測定は、電気化学発光酵素免疫測定機ピコルミ ¾220 (三光純薬社)を用いて行った。

[0047] 1% BSA, 0.3%スクロース， 0.01容量％ Tween 20, 0.1% NaNを含む 0.15 M PBS, pH

3

7.5でビーズ濃度 lmg/mLに調整した抗チトクロム c抗体固相化ビーズ 25 μ Lを加えて 9分反応させ、ピコルミ ^R BF洗浄液（三光純薬社) 350 Lで 2回洗浄後、 1% BSA, 0.3% スクロース， 0.01容量％ Tween 20, 0.1% NaNを含む 0.15 M PBS, pH 7.5で 0.5— 1

3

g/mL濃度に調整したルテニウム錯体標識抗チトクロム c抗体 200 μ Lを加えて 9分反応させた。ピコルミ ^R BF洗浄液 350 Lで 2回洗浄後、ピコルミ ^R発光電解液 (三光純薬社)を 300 μ Lカ卩えて発光カウント値を計測した。

[0048] 横軸にヒトチトクロム c標準抗原濃度、縦軸にヒトチトクロム c標準抗原のカウント値をプロットして標準曲線を描き、その標準曲線を基に、抗原抗原 2、抗原 3、抗原 4、血清 1、血清 2及び血清 3の発光カウント値力それぞれに含まれるチトクロム c量を算出した。

[0049] 次ヽで、抗原と抗原、ある！/ヽは抗原と血清をそれぞれ 10 μ Lずつ混合し、同様に酸性検体希釈液あるいは中性検体希釈液 200 Lを加えて、電気化学発光酵素免疫測定法にてチトクロム c量を算出して、その実測値と理論値を比較して回収率を求めた。ビーズに抗チトクロム cモノクローナル抗体 6H2.B4抗体を固相化し、ルテニウム錯体標識抗体として抗チトクロム clgG F(ab')ポリクローナル抗体を用いた結果を表 1に

2

、ビーズに 2B5F8モノクローナル抗体を固相化し、ルテニウム錯体標識抗体として 27

G9モノクローナル抗体を用いた結果を表 2に示す。

[0050] どちらの抗体系を用いた場合においても、抗原のみの場合は pHにかかわらず 100% に近い回収率を示すのに対し、血清が加わると pH 7.5では回収率が 2-20%近くまで低下し、 pH 4にすることで回収率が 100%に回復することが明ら力となった。

[0051] また、どちらの組合せの抗体を用いた場合でも、 pH 4の緩衝液中での測定感度が

、 1 ng/mL以上であることが確認され、この条が感度'回収率の両方を満たすものであることが示された。

[0052] [表 1]

表 1

6Η¾β4- Poly抗体

[表 2] 表 2

2B5F8- 27G9抗体

[0053] [実施例 2]こはく酸緩衝液を用いたヒト血清中のチトクロム c測定

クェン酸リン酸緩衝液に代えてこはく酸緩衝液を用いてヒト血清中のチトクロム cの測定を行った。

[0054] 検体希釈液 (0.1Mこはく酸， 0.15M NaCl, 2%リピジユア BL802 (日本油脂社）， 2%リビジユア BL405 (日本油脂社）, 15mM EDTA-2Na, 0.1% NaN , ρΗ4.0) 200 Lに、緩

3

衝液（0.05M Tris-HCl, pH7.8, 5% BSA, 0.15M NaCl, 0.1% NaN )で 5、 10、 100、 1000 、 3000 ng/mLとなるように希釈したヒトチトクロム c (抗原 1、抗原 2、抗原 3、抗原 4、抗原 5)、血清 1、血清 2、血清 3及び血清 4の 20 Lを加えた。

[0055] 以下の測定は、電気化学発光酵素免疫測定機ピコルミ ¾220 (三光純薬社)を用いて行った。

[0056] 1% BSA, 0.15M NaCl, 0.3% トレハロース， 0.01 v/v % Tween20, 10-mM EDTA-2N a, 25 μ g/mLマウス IgG, 0.1% NaNを含む 0.05 M Tris -HCl, pH7.5,でビーズ濃度 lmg

3

/mLに調整した抗チトクロム c抗体固相化ビーズ 25 μ Lをカ卩えて 9分反応させ、ピコル 5^R BF洗浄液（三光純薬社) 350 μ Lで 2回洗浄後、 1% BSA, 0.15M NaCl, 0.3%トレハロース， 0.01 v/v % Tween20, 0.3% NaNを含む 0.05M Tris -HCl, pH7.5で濃度 1 μ g/ mLに調整したルテニウム錯体標識抗チトクロム c抗体 200 μ Lを加えて 9分反応させた。ピコルミ ^R BF洗浄液 350 Lで 2回洗浄後、ピコルミ ^R発光電解液 (三光純薬社)を 300 μ L加えて発光カウント値を計測した。

[0057] 横軸にヒトチトクロム c標準抗原濃度、縦軸にヒトチトクロム c標準抗原のカウント値をプロットして標準曲線を描き、その標準曲線を基に、抗原抗原 2、抗原 3、抗原 4、抗原 5、血清 1、血清 2、血清 3及び血清 4の発光カウント値からそれぞれに含まれるチトクロム c量を算出した。

[0058] ビーズに抗チトクロム cモノクローナル抗体 2B5F8抗体を固相化し、ルテニウム錯体標識抗体として抗チトクロム 27G9モノクローナル抗体あるいは 6Η2.Β4モノクローナル抗体を用いた結果を表 3に示す。この試薬を用いた場合においても、回収率が 100% を示し、測定感度が、 1 ng/mL以上であることが確認され、この条件も感度'回収率の両方を満たすものであることが示された。

[0059] [表 3]

表 3

2B5F8- 27G9抗体チ血血血抗抗抗抗血抗血血血抗血抗抗抗抗トクロム c定量値抗原の組み合わせ実測値理論値回収率

清原原清原凊 _¾原原原原 1¾京青 ϊ青青=

4423235 11 (ng/mL) (A) (B) (C) (D) = ( (A) + (B) ) /2 (C)/(D)

5.0 14.7 13.5 109.3% 10.2 16.5 16.1 102.8% 97.1 46.3 43.4 106.8% 1033.2 86.6 86.8 99.8% 2927.1 331.6 304.5 108.9% 21.9 740.5 772.6 95.9%

，抗抗抗抗抗抗抗抗

76.5 抗抗抗抗抗抗抗抗

1205.4 1243.1 97.0% 原原原原原原原原京京

511.9 2195.7 2190.0 100.3% 1452.9

血血血血血血血血血血血血血血血血

清 I滑嘴清清清清 Y清清清清_n-n=

2B5F8-6H2. B4抗体 442233 11 チトクロム c定量値抗原の組み合わせ実測値理論値回収率

(ng/mL) (A) (B) (C) (D) = ( (A) + (B) ) /2 (C)/(D)

4.6 12.1 12.4 98.0% 9.2 14.3 14.7 97.6% 108.3 44.9 42.8 104.9% 1090.0 91.8 92.4 99.4% 2859.8 370.3 324.7 114.1%

20.1 794.4 815.5 97.4% 76.4 1339.8 1276.7 104.9% 541.0 2072.1 2161.6 95.9% 1463.4 [実施例 3]チトクロム cの正確な測定を妨げるヒト血清中の妨害物質の同定

(1)ヒト血清のゲルろ過

ヒト血清 2mLを、 PBSを溶出液として Sephacryl S- 200 (GEヘルスケアバイオサイェンス社)カラムゲルクロマトグラフィー（サイズ φ 2.5cm X 120cm)によりゲルろ過し、 1フラタシヨン約 7 mLで分取した。各フラクション 0.5 mLに、ヒトチトクロム c (R&D Systems 社)を 10 μ g/mLの濃度に精製水で溶解したものを 50 μ Lカ卩えて混合し、その 50 μ L を反応用溶液（0.15 M PBS, 15 mMEDTA, 1% BSA, 0.1% NaN , ρΗ 7.5)50 Lで希

3

釈した。これを、電気化学発光免疫自動測定機ピコルミ ^R8220(三光純薬社)を用い、参考例で作製した抗チトクロム c抗体 (2B5F8)結合ビーズ、 1% BSA, 0.3%スクロース， 0 .01容量％ Tween20, 0.1% NaNを含む 0.15M PBS, pH7.5で 2 μ g/mLに希釈した参考例で作製したルテニウム錯体標識抗チトクロム c抗体 (3G7)、ピコルミ ^κ発光電解液 (三光純薬社)、ピコルミ ^R BF洗浄液 (三光純薬社)、ピコルミ ^Rセルクリーナー液 (三光純薬社)、ピコルミ ^Rノズルリンス液 (三光純薬社)をセットし、抗チトクロム c抗体結合ビーズ分注量 25 L、ルテニウム標識抗チトクロム c抗体分注量 100 L、ピコルミ ^R 光電解液分注量 300 L、 1ステップ、反応時間 26分の条件で測定した。

[0061] その結果、フラクション No.41付近で発光カウント値が減少した。したがって、フラクシヨン No.41にチトクロム cと抗チトクロム c抗体との反応を阻害する妨害物質が含まれていることがわかった（図 1)。

[0062] (2)妨害物質が含まれるフラクションの 2次元電気泳動と質量分析による同定

Hiroyuki Katayama et al" Optimization of in— gel protein digestion system in combi nation with thin-gel separation and negative staining in 96— well plate format： Rapid Commun. in Mass Spectrom. 2003; 17： 1071- 1078に記載されている方法を参考にして、妨害物質が含まれるフラクションを 2次元電気泳動で分離し、各スポットを質量分析により同定した (プロテオーム技術)。

[0063] ゲルろ過フラクション No.41の 0.5 mLを Swell Ge Blue Albumin Removal kit (PIERC E社)を用いて、アルブミン除去処理した。次に、二次元電気泳動を行うため、膨潤バッファー（8 M尿素， 2%CHAPS, 0.5% IPG Buffer,ブロモフエノールブルー， 0.6%ジチオスレィトール） 0.44 mLとアルブミン除去したゲルろ過フラクション 0.11 mLを混合し、そこへ等電点電気泳動用ゲル Immobilize Dry Strip pH3-10, 18cm (GEヘルスケアバィォサイエンス社)を浸し、室温でー晚放置し、ゲルを膨潤させた。ゲルを CoolPhoreS tarlPG-IEF Type- P (アナテック社）にセットし、 PowerPhoreStar Pro (アナテック社）で 500V2h, 700Vlh, lOOOVlh, 1500Vlh, 2000Vlh, 2500Vlh, 3000Vlh, 3500V101！〜の電圧をかけて、電気泳動を行った。泳動したゲルを SDS処理バッファー（50 mM Tri s -HCl, pH 6.8, 6 M尿素， 0.25%ジチオスレィトール， 2% SDS, 0.0025%ブロモフエノールブルー， 30容量％グリセロール）に浸して室温で lOmin撹拌し、次に、還元アルキル化処理バッファー（50 mMTris -HCl, pH 6.8, 6 M尿素， 2%SDS, 0.0025%ブロモフエノールブルー， 30容量％グリセロール， 4.5%ョードアセトアミド）に浸して室温で 10 min 撹拌した後、 2Dクイックゲル (アナテック社）にセットし、電気泳動した。泳動したゲルを Coomasie Briliant blueで染色して、スポットをカッターで切り出した。

[0064] 切り出したゲルをカッターで細力べ砕き、チューブに入れ 50 mM NH HCO：ァセトニ

4 3 トリル =1:1を 100 L注入し、室温で 60分撹拌した。 50 mM NH HCO：ァセトニトリル =1

4 3

:1を入れ替え、さらに室温で 40分撹拌し Coomasie Briliantblueを脱色した。

[0065] 洗浄液（50%メタノール、 10%酢酸、 40%精製水） 100 μ Lで置換し、 4°Cで保存一時保存した。洗浄液を除去し、 50 mM NH HCO：ァセトニトリル =1:1を用いて 100 L/tu

4 3

beで 3回洗浄した。次に、 100 mM NH HCOを 100 L/tube入れて、室温で 5分間撹

4 3

拌した。液を除去し、 DTT 2.5 mg/mLを含む 100 mM NH HCOを 100 μ L/tube入れ

4 3

て、 15分間撹拌した。液を除去し、アクリルアミド 45 mg/mLを含む 100 mM NH HCO

4 3 を 100 L/tube入れ 15分間撹拌した。液を除去し、メタノール:酢酸:精製水 =5 : 1 :4 を 500 L/tube入れ、室温で 16時間撹拌した。液を入れ替えてさらに室温で 30分間撹拌した。液を除去し、 50 mM NH HCOを 500 μ L/tube入れ、室温で 10分間撹拌し

4 3

た。液を除去し、ァセトニトリル 500 L/tube入れ、室温で 5分間撹拌した。

[0066] チューブのふたを開け、減圧遠心乾燥機（トミー精工社、 Speed vac)にセットし、乾固するまで減圧乾燥させた。次に、 0.2% n-ォクチルダルコシド（シグマ社)液： 50 mM NH HCO = 1： 1液 45 μ Lに 200 μ g/mLトリプシンを 5 μ L加えた液を 2.5 μ Lとり、乾燥

4 3

させたゲルに加え、室温で 5分間反応させた。そこへ 50 mM NH HCO :0.2% n—オタ

4 3

チルダルコシド液 = 1： 1を 8 μ L加え、 37°Cで 16時間放置した。そこへ、 0.1% TFAを含む 50%ァセトニトリルを 40 Lカ卩え、 10分間超音波水槽にかけた。液を別なチューブに移し、残ったゲルに、 0.1% TFAを含む 75%ァセトニトリルを 40 μ L入れ、超音波水槽で 10分間処理した。液を取り出し、先に別チューブに移しておいた液と合わせた。次に、凍結真空乾燥機で液を乾燥させた。

[0067] 乾燥させたサンプルに 0.1% TFAを含む 5%ァセトニトリルを 50 μ L入れ、撹拌してサンプルを溶解した。 C18逆相クロマトグラフィー用ゲルを詰め、あらかじめメタノール 200 μ Lと 50 μ Lで 2回洗浄したカラムに、溶解したサンプルを全量アプライした。 2000 rp m、 5分遠心し、アプライしたサンプルを完全に流した。次に、カラムに 0.1% TFAを含む 5%ァセトニトリルを 50 μ L入れ、 2000 rpm、 5分遠心し洗浄した。この洗浄を 3回行つた。次に、 0.1% TFAを含む 95%ァセトニトリルを 25 μ L入れ、 2000 rpm、 5分遠心しサンプルを溶出した。溶出された液を 37°Cに放置し、液を乾燥させた。

[0068] 0.1% TFAを含む 5%ァセトニトリルをチューブに入れてサンプルを溶解し、 LC- MASS 分析装置 (サーモエレクトロン社、 LCQ)を用いて、質量解析を行い、二次元電気泳動において得られたスポットを同定した。結果を図 2に示した。

[0069] (3)同定された蛋白質のチトクロム c測定に対する影響

同定された蛋白質のうち、アルブミンを除く市販されていて入手可能なものについて、蛋白質をチトクロム cの測定系に添加して、チトクロム c測定を行い、妨害活性があるか調べた。

[0070] 1).ヒトトランスフェリン (Biogenesis社) 6.5 mgを精製水 0.65 mLで溶解し 10 mg/mLのトランスフェリン溶液を調製した。

2) .ヒト α 1酸性糖蛋白質（Athens Research&Technology社） 1 mgを 0.5 mLの PBS- 1で溶解し、ひ 1酸性糖蛋白質溶液とした。

3) .ヒト α ΐアンチトリプシン（CALBIOCHEM社） 1 mgを 0.33 mLの精製水で溶解し、 a 1アンチトリプシン溶液とした。

4) .ヒトトランスチレチン (プレアルブミン）（Sigma社） 1 mgを 0.3 mLの 0.15 M NaClを含む 50mMリン酸緩衝液 pH 7.5で溶解しトランスチレチン溶液とした。

5) .ヒトビタミン D結合蛋白質 (Gc-グロブリン) (CALBIOCHEM社) 1 mgを 0.5 mLの精製水で溶解し、ビタミン D結合蛋白質溶液とした。

[0071] 反応用溶液（0.15M PBS, 15 mM EDTA, 1% BSA, 0.1% NaN , pH 7.5) 100 μ Lに、

3

同定された蛋白質の溶液を 0または 10 μ L、ヒトチトクロム c (10 μ g/mL)を 1 μ L添加した。これを、電気化学発光免疫自動測定機ピコルミ ¾220 (三光純薬社)を用い、参考例で作製した抗チトクロム c抗体 (2B5F8)結合ビーズ、ルテニウム錯体標識抗チトク口ム c抗体 (27G9)、ピコルミ ^R発光電解液 (三光純薬社)、ピコルミ ¾F洗浄液 (三光純薬社)、ピコルミ ^Rセルクリーナー液 (三光純薬社)、ピコルミ ^Rノズルリンス液 (三光純薬社 )をセットし、抗チトクロム c抗体結合ビーズ分注量 25 μ L、ルテニウム標識抗チトクロム c抗体分注量 100 L、ピコルミ ^R発光電解液分注量 300 L、 1ステップ、反応時間 26 分の条件で測定した。その結果、 a 1酸性糖蛋白質およびひ 1アンチトリプシンに添加回収率の低下が認められ、妨害活性を有することがわ力つた (表 4)。 [0072] [表 4] 表 4

[0073] (4)同定された妨害物質の酸性領域でのチトクロム c測定に対する影響

反応条件を以下に示す酸性条件、または、中性条件で、測定方法に従って測定した。

1)酸性条件

•酸性反応用溶液（0.05 Μクェン酸， 1% BSA, 0.15 M NaCl, 15 mM EDTA, pH 4.0) •ルテニウム希釈液（0.05 Mクェン酸， 1% BSA, 0.15M NaCl, 0.3%スクロース， 0.01% Tween20, pH 4.0)

2)中性条件

•中性反応用溶液（0.15 M PBS, 15 mM EDTA, 1% BSA, 0.1% NaN , pH7.5)

3

'ルテニウム希釈液（0.15 M PBS, 1% BSA, 0.3%スクロース， 0.01% Tween20, 0.1% Na N , pH 7.5)

3

[0074] 3)測定方法

反応用溶液 100 Lに、妨害活性の認められた蛋白質の溶液である ex 1酸性糖蛋白質液（2mg/mL)または α 1アンチトリプシン液（3mg/mL) 10 レ及び、ヒトチトクロム c (R&D Systems社）を 10 μ g/mLの濃度に精製水で溶解したもの 1 μ Lを加えて混合した。これを、電気化学発光免疫自動測定機ピコルミ ^R8220 (三光純薬社)を用い、参考例で作製した抗チトクロム c抗体 (2B5F8)結合ビーズ、ルテニウム希釈液で希釈した参考例で作製したルテニウム標識抗チトクロム c抗体 (3G7)、ピコルミ ^R発光電解液 (三光純薬社)、ピコルミ ^R BF洗浄液 (三光純薬社)、ピコルミ ^Rセルクリーナー液 (三光純薬社)、ピコルミ ^Kノズルリンス液 (三光純薬社)をセットし、抗チトクロム C抗体結合ビーズ分注量 25 L、ルテニウム標識抗チトクロム c抗体分注量 100 L、ピコルミ ^R発光電解液分注量 300 L、 1ステップ、反応時間 26分の条件で測定した。

[0075] その結果、表 5に示すとおり、ヒト血清中での測定と同様に抗原抗体反応時の pHを下げることで妨害活性を回避できることが明らかとなった。

[0076] 妨害活性を有する物質は共に酸性度の高い蛋白質であり、これら酸性度の高い蛋白質が塩基性の強いチトクロム cと相互作用することにより、チトクロム cの測定に影響を与えていたと考えられる。酸性領域で測定することによりチトクロム cと妨害物質の相互作用は弱くなることから、酸性領域では正確な定量が可能となったものと考えられる。従って、実施例で試験した以外の抗体に関しても、酸性領域とすることでチトクロム cの正確な測定が可能となるものと考えられる。

[0077] [表 5] 表 5

産業上の利用の可能性

体液中のチトクロム Cが体内で起こっているアポトーシスの指標となることが知られ、多くの疾患の診断薬として有効であることが明らかとなっている。本願の酸性領域の緩衝液を用いるチトクロム cの免疫化学的測定法により、より正確なチトクロム C量の測定が可能となり、本方法の診断薬への応用が期待される。

Claims

請求の範囲

[1] 体液中のチトクロム cを免疫化学的に測定する方法であって、抗体とチトクロム cの反応を酸性領域の緩衝液中で行うことを特徴とする方法。

[2] 酸性領域が pH 3.5力 pH 5.0である請求項 1に記載の方法。

[3] 体液が血液である請求項 1又は 2に記載の方法。

[4] 体液中のチトクロム cを免疫化学的に測定するキットであって、抗体とチトクロム cの反応を酸性領域の緩衝液中で行うための測定キット。

[5] 酸性領域が pH 3.5力 pH 5.0である請求項 4に記載の測定キット。

[6] 少なくとも、

(1)チトクロム cと反応する抗体及び

(2)酸性領域で反応させる緩衝液

を含む、請求項 4又は 5に記載の測定キット。

[7] チトクロム cと反応する抗体が、固相化した抗体及び Z又は標識した抗体である、請求項 6に記載の測定キット。

[8] 体液が血液である請求項 4から 7の、ずれか一項に記載の測定キット。