WO2014073653A1 - 腎炎の病変部位の検査方法およびそのための試薬 - Google Patents

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WO2014073653A1
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fsp1
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antibody
multimeric
nephritis
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正之 岩野
宏幸 舟岡
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国立大学法人福井大学
Ｄｓファーマバイオメディカル株式会社
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    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy

Definitions

  • the present invention is for determining a lesion site of nephritis characterized by comparing monomer FSP1 concentration and multimeric FSP1 concentration contained in a biological sample derived from a subject with Fibroblast-specific protein 1 (hereinafter FSP1).
  • FSP1 Fibroblast-specific protein 1
  • the present invention relates to an inspection method and a reagent for performing the inspection.
  • FSP1 is a protein identified as a marker specific to fibroblasts (Non-patent Document 1), and encodes a filament-bound S100A4 protein having an anti-EF hand domain (Non-patent Document 2).
  • Non-patent Document 1 the active glomerular disease such as meniscal glomerulonephritis
  • the present inventors showed increased expression of FSP1 in podocytes and meniscus cells (Non-patent Document 3), and patients with meniscal glomerulonephritis
  • urinary FSP1 can be a biomarker of the disease (Non-patent Document 4).
  • urinary FSP1 is a positive indicator of disease activity because it shows a positive correlation with the frequency of glomeruli with cellular meniscus formation.
  • An object of the present invention is to provide a method for determining a lesion site of nephritis and a reagent for performing the determination.
  • FSP1 can be detected in biological samples of patients with interstitial kidney disease, and that the FSP1 is dominant in multimeric form.
  • FSP1 found in biological samples of patients with crescent-forming glomerulonephritis was also found to be dominant in monomeric form.
  • this invention consists of the following.
  • An inspection method for determining a lesion site of nephritis comprising the following steps: (1) a step of measuring any two or more of total FSP1, concentration of monomeric FSP1, and multimeric FSP1 in a biological sample derived from a subject; (2) A step of comparing the monomer FSP1 concentration and the multimeric FSP1 concentration in the biological sample derived from the subject.
  • the test method according to [1] or [2], wherein the measurement of the total FSP1 concentration, the monomeric FSP1 concentration, and the multimeric FSP1 concentration is measured by an immunochemical measurement method.
  • the reagent according to [5], wherein the lesion site of nephritis to be determined is glomerulus or stromal tissue.
  • test method of the present invention and the reagent therefor can quickly and easily determine the lesion site of a nephritic patient or a subject suspected of having nephritis.
  • Sequence corresponding to amino acid numbers 7 to 18 of the sequence 4: Sequence corresponding to amino acid numbers 10 to 21 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 5: Amino acid numbers 68 to 79 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 6: sequence corresponding to amino acid numbers 71 to 82 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 7: sequence corresponding to amino acid numbers 74 to 85 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, 8: sequence A sequence corresponding to amino acid numbers 77 to 88 of the amino acid sequence of No. 2; 9: a sequence corresponding to amino acid numbers 80 to 92 of the amino acid sequence of SEQ ID No.
  • F1 represents F1-2 monoclonal antibody.
  • I11 represents the I11-23 monoclonal antibody.
  • Each lane was electrophoresed with a human fibroblast extract, a mouse fibroblast extract, and a human epithelial cell extract.
  • the F1-2 antibody recognizes the N-terminus with low molecular homology between human FSP1 and mouse FSP1, and the I11 antibody recognizes the EF hand domain with high molecular homology between human FSP1 and mouse FSP1.
  • the recognition site of I13 antibody is considered to be the same as F1-2 antibody.
  • the present invention provides an inspection method for determining a lesion site of nephritis using a biological sample derived from a subject.
  • the subject to which the test method of the present invention can be applied is not particularly limited, and examples thereof include a patient who can be clinically determined as a nephritis patient but whose lesion site cannot be identified, or a subject suspected of developing nephritis. It is done.
  • the lesion sites of nephritis determined by the examination method of the present invention include glomeruli (ie, glomerular lesions) and stromal tissues (ie, stromal lesions).
  • the glomerular lesion determined in the present invention is a glomerular lesion having a characteristic that the monomer FSP1 is contained in the biological sample, and a highly active glomerular lesion is more suitable for the determination.
  • the activity of glomerular lesions is high means a state in which the formation of the meniscus in the glomeruli, the proliferation of mesangial cells, or the infiltration of T cells or macrophages into the glomeruli is observed.
  • glomerular lesions include meniscus glomerulonephritis, IgA nephropathy, lupus nephritis, purpura nephritis and the like.
  • the interstitial lesion determined in the present specification is an interstitial lesion having characteristics including multimeric FSP1 in a biological sample, and a highly active interstitial lesion is more suitable for determination.
  • high activity of stromal lesions refers to a state in which infiltration into the stroma of T cells or macrophages is observed.
  • interstitial lesions include interstitial nephritis and renal interstitial fibrosis.
  • the biological sample used in the test method of the present invention is not particularly limited as long as it is collected from the subject.
  • urine such as urine can be easily collected from the living body, or biological tissue can be used as the biological sample.
  • a kidney etc. are mentioned.
  • urine is used as the biological sample, for example, natural urine, catheter urine and the like can be mentioned.
  • urine samples suspected of urinary tract infection and gross hematuria are preferably excluded.
  • a urine sample may be used for a test
  • the sample may be collected from a subject immediately before the examination is performed, or may be collected in advance and stored frozen.
  • the inspection method for determining a lesion site of nephritis includes the following steps.
  • the total FSP1 concentration refers to the concentration of FSP1 protein containing monomeric FSP1 and multimeric FSP1 in a biological sample.
  • the method for measuring the total FSP1 concentration, monomeric FSP1 concentration and multimeric FSP1 concentration of the present invention is not particularly limited, and the amount of antigen in a biological sample, antibody corresponding to the amount of antigen, and antibody-antigen complex Any measurement method may be used as long as it is a measurement method that detects the amount of the substance by chemical or physical means.
  • gel electrophoresis eg, SDS-PAGE, NATIVE-PAGE, two-dimensional gel electrophoresis, etc.
  • various separation and purification methods eg, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, Gel filtration chromatography, affinity chromatography, reverse phase chromatography, isoelectric focusing, capillary electrophoresis, etc.
  • ionization methods eg, electron impact ionization, field desorption, secondary ionization, fast atom collisions
  • MALDI matrix-assisted laser desorption ionization
  • electrospray ionization method etc.
  • mass spectrometer eg, double-focusing mass spectrometer, quadrupole analyzer, time-of-flight mass spectrometer, Fourier transform mass
  • an analyzer or an ion cyclotron mass spectrometer it is also preferably performed by an immunochemical measurement method.
  • FSP1 detected in a sample takes a monomeric form or a multimeric form (may include a dimer or higher multimeric form).
  • SEQ ID NO: 2 As a monomeric form of FSP1, SEQ ID NO: 2 And a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by The amino acid sequence substantially identical to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90%, with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the amino acid sequences having homology of about 95% or more, most preferably about 98% or more are particularly preferable.
  • the FSP1 of the present invention is preferably a protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, that is, human FSP1.
  • an FSP1-specific antibody is used when an immunochemical assay is used.
  • FSP1-specific antibodies used in the present invention include antibodies that recognize both monomeric FSP1 and multimeric FSP1 from biological samples, antibodies that recognize only multimeric FSP1, and antibodies that recognize only monomeric FSP1. Can be mentioned.
  • antibodies that recognize both monomeric FSP1 and multimeric FSP1 are two types of combinations that recognize different epitopes, as described in the immunochemical assay method described below. Can be used. Therefore, it is preferable that the epitope recognized by each antibody is at a position distant from FSP1.
  • an antibody that recognizes the EF hand calcium binding domain of FSP1 as an epitope preferably an antibody that recognizes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 as an epitope, and the N-terminal amino acid sequence of FSP1 as an epitope
  • An antibody that recognizes preferably an antibody that recognizes the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 3 as an epitope.
  • the FSP1-specific antibody of the present invention can be produced by a known method using an appropriate immunogen.
  • the immunogen include FSP1 full-length protein or a partial peptide thereof.
  • the full-length protein of FSP1 used as an immunogen is a protein as described above.
  • the FSP1 partial peptide used as an immunogen is a peptide comprising a partial amino acid sequence of the same or substantially the same amino acid sequence as SEQ ID NO: 2.
  • the FSP1 partial peptide used as an immunogen may be a peptide containing the N-terminal amino acid sequence of FSP1 or the EF hand calcium binding domain of FSP1.
  • An example of the N-terminal amino acid sequence of FSP1 is the same or substantially the same amino acid sequence as the sequence corresponding to amino acid numbers 1 to 12 (SEQ ID NO: 3) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • the same or substantially the same as the sequence corresponding to amino acid numbers 80 to 92 (SEQ ID NO: 4) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Is a peptide sequence comprising the amino acid sequence of
  • FSP1 used as an immunogen can be produced from mammalian cells or tissues by a known protein purification method. Specifically, by homogenizing mammalian tissues or cells, and separating and purifying soluble fraction and / or nuclear fraction by chromatography such as reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. FSP1 can be manufactured.
  • FSP1 or a partial peptide thereof used as an immunogen can also be produced according to a known peptide synthesis method.
  • the peptide synthesis method may be, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method.
  • the target protein can be produced by removing the protecting group.
  • the FSP1-specific antibody used in the present invention includes those produced in animal blood, those produced in hybridomas, and produced in hosts transformed with expression vectors containing antibody genes by genetic engineering techniques. And those produced in cells containing antibody genes to be screened by the phage display method, human antibodies obtained directly from transgenic mice producing human antibodies, and the like. FSP1-specific antibodies can be produced by methods known to those skilled in the art.
  • FSP1 is administered to a mammal at a site where antibody production is possible by administration, or together with a carrier and a diluent.
  • the FSP1 used as an immunogen should be a complex that is cross-linked to a carrier protein such as partial peptide (if necessary, bovine serum albumin, KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) even if it is the full-length protein of FSP1 described above. May also be possible.
  • Complete Freund's adjuvant or incomplete Freund's adjuvant may be administered in order to enhance antibody production ability upon administration. Examples of mammals to be used include monkeys, rabbits, dogs, guinea pigs, mice, rats, sheep and goats, and mice and rats are preferably used.
  • Monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared by fusing the cells with myeloma cells.
  • hybridoma culture supernatant is added to a solid phase (eg, microplate) on which FSP1 is adsorbed directly or with a carrier, and then radioactive substances and enzymes are added.
  • a solid phase eg, microplate
  • Anti-immunoglobulin antibodies labeled with the above (anti-mouse immunoglobulin antibodies are used when cells used for cell fusion are mice) or protein A, and a method for detecting monoclonal antibodies bound to a solid phase, anti-immunoglobulin Examples include a method in which a hybridoma culture supernatant is added to a solid phase on which an antibody or protein A is adsorbed, FSP1 labeled with a radioactive substance or an enzyme is added, and a monoclonal antibody bound to the solid phase is detected.
  • Separation and purification of monoclonal antibodies can be carried out in the same way as in the separation and purification of ordinary polyclonal antibodies (eg, salting out, alcohol precipitation, isoelectric precipitation, electrophoresis, ion exchanger (eg, DEAE) adsorption / desorption method, ultracentrifugation, gel filtration, antigen-binding solid phase or specific purification method to obtain antibody by dissociating the binding using active adsorbent such as protein A or protein G]
  • active adsorbent such as protein A or protein G
  • the total FSP1 concentration, monomeric FSP1 concentration and multimeric FSP1 concentration in a biological sample derived from a subject can be measured by an immunochemical measurement method, respectively. . Specifically, for example, it can be carried out as follows.
  • Sandwich ELISA method, immunochromatography method, agglutination method The test solution containing a biological sample is reacted with the immobilized FSP1-specific antibody (primary reaction), and the same or different from the immobilized FSP1-specific antibody. After quantifying the labeled FSP1-specific antibody (secondary reaction), the amount of total FSP1, multimeric FSP1 or monomeric FSP1 in the test solution is measured by measuring the activity of the label. Can do.
  • the immobilized FSP1-specific antibody may be an antibody that recognizes both monomeric FSP1 and multimeric FSP1, an antibody that recognizes only multimeric FSP1, or an antibody that recognizes only monomeric FSP1.
  • a microplate well, a nitrocellulose membrane, latex beads, magnetic beads, or the like can be used as the solid phase carrier.
  • the solid phase method may be physically adsorbed, or may be oriented by chemical bonding or the like. Further, the solid phase may be preliminarily performed before the primary reaction, or may be performed after the formation of the sandwich complex.
  • the labeled FSP1-specific antibody is used by binding a label capable of detecting the antigen-antibody reaction product.
  • the labeled antibody may be the same or different from the immobilized FSP1-specific antibody.
  • a radioisotope, a gold colloid, an enzyme, a fluorescent substance, a luminescent substance, an enzyme substrate, or the like can be used.
  • the FSP1-specific antibody used for the secondary reaction is also immobilized on latex beads or magnetic beads.
  • the sandwich complex may be aggregated and the turbidity of the aggregate itself may be used for detection.
  • a sandwich complex composed of multimeric FSP1 and / or monomeric FSP1 and FSP1-specific antibodies in a biological sample is selected by a step of removing non-specifically reacted substances and unreacted antibodies.
  • the removal method may be a washing step using a buffer containing a surfactant, a separation step using magnets or electrochemical properties, or a separation step based on a difference in mobility such as molecular sieve or chromatography. Any method may be used as long as only the body remains specifically.
  • the immune complex can be measured by using any of the above detection means.
  • the amount of immune complex is determined by, for example, absorbance, fluorescence intensity, luminescence intensity, etc., but may be separately quantified by comparison with the amount of immune complex indicated by FSP1 of known concentration, or simply the intensity You may compare qualitatively only.
  • the FSP1 detected by the above assay is an antibody in which the immobilized FSP1-specific antibody and the labeled FSP1-specific antibody recognize both different monomeric FSP1 and multimeric FSP1.
  • one antibody is an antibody that recognizes the EF hand calcium-binding domain of FSP1 as an epitope and the other antibody is an antibody that recognizes the N-terminal amino acid sequence of FSP1 as an epitope
  • multimers in biological samples Both FSP1 and monomeric FSP1 can be detected.
  • only the multimeric FSP1 can be obtained by using the same antibody as the immobilized FSP1-specific antibody and the labeled FSP1-specific antibody (for example, an antibody that recognizes the EF hand calcium binding domain of FSP1 as an epitope). Detection and monomer FSP1 can be calculated. Alternatively, multimeric FSP1 or monomeric FSP1 can be directly detected by using an antibody that recognizes only multimeric FSP1 or an antibody that recognizes only monomeric FSP1 as a solid-phased FSP1-specific antibody.
  • the measurement method based on the above sandwich ELISA method is a competition in which only one or both FSP1-specific antibodies recognize only one type of multimeric FSP1 or monomeric FSP1.
  • a measurement method based on the measurement principle may be used.
  • FSP1 or its equivalent antigenic substance (partial peptide of FSP1) is labeled with a radioisotope, colloidal gold, enzyme, fluorescent substance, luminescent substance or enzyme substrate, etc. as an antigen, microplate well, nitrocellulose
  • a measurement system for FSP1 may be constructed by adding ordinary technical considerations to those skilled in the art to the normal conditions and operation methods in each method. For details of these general technical means, it is possible to refer to reviews, books and the like. For example, Hiroshi Irie “Radioimmunoassay” (Kodansha, published in 1974), Hiroshi Irie “Continue Radioimmunoassay” (published in Kodansha, 1974), “Enzyme Immunoassay” edited by Eiji Ishikawa et al. 53)), edited by Eiji Ishikawa et al.
  • urinary FSP1 is dominant in monomeric form in patients with crescent-forming glomerulonephritis. Moreover, urinary FSP1 shows a positive correlation with the frequency of appearance of glomeruli in which cellular meniscus formation is observed. On the other hand, in patients with interstitial nephritis or renal interstitial fibrosis, urinary FSP1 is dominant in the multimeric form. Therefore, the testing method for determining the lesion site of nephritis is such a positive between monomeric FSP1 concentration and glomerular lesion prevalence, or multimeric FSP1 concentration and interstitial lesion prevalence. Based on correlation.
  • a correlation diagram between the monomeric FSP1 concentration and multimeric FSP1 concentration and the presence or absence of glomerular and interstitial lesions should be prepared in advance, and the concentrations of monomeric FSP1 and multimeric FSP1 in subjects You may compare with a correlation diagram.
  • the concentration comparison is preferably performed based on the presence or absence of a significant difference.
  • the lesion site of nephritis is glomerular
  • the multimeric FSP1 concentration is higher than the monomeric FSP1 concentration (more than 51% of the sum of the monomeric FSP1 concentration and the multimeric FSP1 concentration)
  • the lesion site of nephritis approximates the concentration in a biological sample of a patient with glomerular or interstitial tissue, it is judged that the lesion site of nephritis is likely to be glomerular or interstitial tissue Can do.
  • the present invention extends to a test reagent for determining a lesion site of nephritis.
  • the reagent of the present invention is not particularly limited as long as it is a reagent for simply carrying out the above-described inspection method of the present invention.
  • the reagent for testing contains an FSP1-specific antibody.
  • the FSP1 antibody include an antibody that recognizes both monomer FSP1 and multimeric FSP1, an antibody that recognizes only multimeric FSP1, and an antibody that recognizes only monomer FSP1. It is preferable to have.
  • Examples of the FSP1-specific antibody in the present invention include the same antibodies as those described in the above test method.
  • the FSP1-specific antibody of the present invention can be provided in a state dissolved in water or a suitable buffer.
  • the FSP1-specific antibody of the present invention can be provided in a state immobilized on an appropriate solid phase.
  • the solid phase include, but are not limited to, a microplate well, a nitrocellulose membrane, latex beads, and magnetic beads.
  • the FSP1-specific antibody of the present invention can be provided in a state of being previously labeled with the above-mentioned labeling substance, or can be provided separately from the labeling substance, and can be used after labeling.
  • the reagent of the present invention is another substance necessary for the reaction for measuring the monomeric FSP1 concentration or the multimeric FSP1 concentration in addition to the antibody, and the reaction is adversely affected by storing in the coexisting state. It may further contain non-substances. Alternatively, the reagent may be provided with a separate reagent containing other substances necessary in the reaction to detect FSP1.
  • the other substance for detecting FSP1 includes a reaction buffer, a blocking solution, an enzyme substrate, a nonspecific reaction inhibitor, a preservative, or a surfactant.
  • FSP1 expression vector was prepared by inserting the full-length human FSP1 gene into a pET-49b (+) vector (Novagen) having a GST tag sequence and a His tag sequence.
  • BL21DE3 competent cells were transformed with the vector, and the protein was inducibly expressed using isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside (Takara Bio Inc.).
  • the expressed fusion protein was purified by column chromatography using HisTrap HP column (GE Healthcare), then GST tag and His tag were cleaved using human rhinovirus 3C protease (Novagen), and purified recombinant human FSP1 (rFSP1 ).
  • rFSP1 50 ⁇ g / 250 ⁇ l was emulsified in an equal volume of CFA (Difco Laboratories) and used as the antigen.
  • CFA Cosmetic Food and Drugs
  • antigens were administered intraperitoneally to BALB / c mice (female, 7 weeks old) (CLEA Japan Inc.), and similar immunizations were carried out 2 weeks, 4 weeks and 6 weeks later.
  • the antigen was boosted in the tail vein without adjuvant.
  • the spleen was removed from the mouse and dissociated through a 100-mesh steel net.
  • Dissociated splenocytes (2 ⁇ 10 8 ) were fused with the same number of myeloma cells in the presence of 50% polyethylene glycol (Roche Applied Science).
  • the fused cells were suspended in a selective growth medium containing 5% Briclone (Archport), seeded in a 96-well culture plate (2 ⁇ 10 5 cells / well), and cultured while periodically changing the medium.
  • the supernatant of the well containing hybridoma colonies was screened for the presence of specific antibodies using direct ELISA, and hybridoma cells derived from positive wells were cloned twice by limited dilution.
  • Each clone was cultured in medium and the antibody-rich supernatant was concentrated by ammonium sulfate precipitation, dialyzed against PBS and stored at -80 ° C. Supernatants were collected from 484 wells having hybridoma cells, and antibody detection was attempted. Using direct ELISA and native PAGE, five antibodies were found to bind to rFSP1. Among these five clones, two antibodies (F1-2 and I11-23) having high titer and binding to rFSP1 were selected. Isotype analysis (AbD Serotec) revealed that F1-2 belongs to the IgG2a ( ⁇ ) subclass and I11-23 belongs to the IgG1 ( ⁇ ) subclass.
  • F1-2 is N-terminal of FSP1 (amino acid number 1 of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2).
  • -11 recognizes the sequence corresponding to the twelfth position; SEQ ID NO: 3
  • I11-23 corresponds to the EF hand calcium binding domain (sequence corresponding to amino acid numbers 80 to 92 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2). It was found to recognize SEQ ID NO: 4) (FIG. 1).
  • F1-2 recognized the N-terminus of FSP1
  • I11-23 recognized the EF hand calcium binding domain (FIG. 2).
  • Example 2 Measurement of urinary FSP1 using a sandwich ELISA method on a sample derived from a patient with renal disease 2 menstrual glomerulonephritis patients, 1 patient with interstitial nephritis, 1 patient with renal interstitial fibrosis Urine samples were collected from the urine. Urine samples were collected three times independently from one of the two meniscal glomerulonephritis patients and the interstitial nephritis patient. Urine samples were also collected from membranous nephropathy and nephrosclerosis, where glomerular lesions are less active. The amount of FSP1 in the urine sample was measured using a sandwich ELISA method.
  • the I11-23 antibody purified from the ascites antibody was immobilized on each well of a 96-well microplate at a solid phase concentration (1.25 ⁇ g / mL), and 100 ⁇ L of a sample obtained by diluting the collected urine specimen 4 times was brought into contact with the well. It was. After a primary reaction at room temperature for 1 hour, the wells were washed three times. Next, F1-2 antibody and I11-23 antibody purified from ascites antibody were labeled with HRP, and 100 ⁇ L of labeled F1-2 antibody diluted 2000 times and 100 ⁇ L of labeled I11-23 antibody diluted 4000 times were contacted with the wells, respectively. I let you.
  • test method of the present invention and the reagent therefor can quickly and easily determine the lesion site of a nephritic patient or a subject suspected of having nephritis.

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Abstract

　FSP1特異的抗体を用いて、多量体FSP1および単量体FSP1を測定・比較する方法など。

Description

腎炎の病変部位の検査方法およびそのための試薬
　本発明は、Fibroblast-specific protein 1(以下、FSP1)を被験者由来の生体試料に含まれる単量体FSP1濃度と多量体FSP1濃度を比較することを特徴とする腎炎の病変部位を判定するための検査方法および該検査を実施するための試薬などに関する。
　FSP1は、線維芽細胞に特異的なマーカーとして同定されたタンパク質であり（非特許文献１）、対EF handドメインを有するフィラメント結合S100A4タンパク質をコードしている（非特許文献２）。本発明者らは、半月体形成性糸球体腎炎などの活動性糸球体疾患では、ポドサイトや半月体細胞にFSP1の発現亢進が見られ（非特許文献３）、半月体形成性糸球体腎炎患者の尿中FSP1が該疾患のバイオマーカーとなりうることを見出した（非特許文献４）。さらに、尿中FSP1は細胞性半月体形成を認める糸球体の出現頻度と正相関を示すことから、疾患活動性の指標になることも見出した。
　しかし、生体試料中FSP1と腎疾患の関連性が実証されているのは半月体形成性糸球体腎炎に留まり、腎間質性疾患と生体試料中FSP1との関わりは未だ報告がない。また、腎炎患者における病変部位を簡便に判定する方法も臨床現場において依然として希求されている。
Struts et al., The Journal of Cell Biology, Vol.130, 393-405, 1995 Okada et al., The American Physiological Society, Vol.273, F563-574, 1997 Yamaguchi et al., American Journal of Kidney Diseases, Vol.54, 653-664, 2009 Iwano et al., Journal of the American Society of Nephrology, Vol.23, 209-214, 2012
　本発明は、腎炎の病変部位を判定するための方法および該判定を実施するための試薬を提供することを課題とする。
　本発明者らは、研究の結果、間質性腎疾患患者の生体試料中においてFSP1が検出でき、さらに該FSP1は多量体型がドミナントであることを見出した。一方、半月体形成性糸球体腎炎患者の生体試料中において見出されるFSP1は単量体型がドミナントであることを併せて見出した。
　本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下よりなる。
［１］以下の工程を含むことを特徴とする、腎炎の病変部位を判定するための検査方法：
（１）被験者由来の生体試料における総FSP1濃度、単量体FSP1濃度および多量体FSP1濃度のうちいずれか２つ以上を測定する工程、
（２）被験者由来の生体試料における単量体FSP1濃度および多量体FSP1濃度を比較する工程。
［２］生体試料が尿試料であることを特徴とする、［１］に記載の検査方法。
［３］総FSP1濃度、単量体FSP1濃度および多量体FSP1濃度の測定が、免疫化学的測定法によって測定されることを特徴とする、［１］または［２］に記載の検査方法。
［４］判定される腎炎の病変部位が、糸球体または間質組織である［１］～［３］のいずれか１つに記載の検査方法。
［５］FSP1特異的抗体を、少なくとも１種類含む、腎炎の病変部位を判定するための試薬。
［６］判定される腎炎の病変部位が、糸球体または間質組織である［５］に記載の試薬。
　本発明の検査方法およびそのための試薬は、腎炎患者または腎炎であることが疑われる被験者の病変部位の判定を迅速かつ簡便ならしめることができる。
F1-2抗体およびI11-23抗体のエピトープマッピングを示す図である。１：配列番号：２のアミノ酸配列のアミノ酸番号１～１２番目に該当する配列、２：配列番号：２のアミノ酸配列のアミノ酸番号４～１５番目に該当する配列、３：配列番号：２のアミノ酸配列のアミノ酸番号７～１８番目に該当する配列、４：配列番号：２のアミノ酸配列のアミノ酸番号１０～２１番目に該当する配列、５：配列番号：２のアミノ酸配列のアミノ酸番号６８～７９番目に該当する配列、６：配列番号：２のアミノ酸配列のアミノ酸番号７１～８２番目に該当する配列、７：配列番号：２のアミノ酸配列のアミノ酸番号７４～８５番目に該当する配列、８：配列番号：２のアミノ酸配列のアミノ酸番号７７～８８番目に該当する配列、９：配列番号：２のアミノ酸配列のアミノ酸番号８０～９２番目に該当する配列。 F1-2抗体とI11-23抗体が認識するヒトFSP1に対するエピトープ部分が異なることを示す図である。F1はF1-2モノクローナル抗体を示す。I11はI11-23モノクローナル抗体を示す。各レーンにはそれぞれ、ヒト線維芽細胞抽出物、マウス線維芽細胞抽出物、ヒト上皮細胞抽出物を電気泳動した。F1-2抗体はヒトFSP1とマウスFSP1の分子相同性が低いN末端を認識し、I11抗体はヒトFSP1とマウスFSP1の分子相同性が高いEF handドメインを認識する。I13抗体の認識部位はF1-2抗体と同じと考えられる。 半月体形成性糸球体腎炎（A1-3、D）および間質性腎炎（B1-3、C）の多量体FSP1濃度と単量体FSP1濃度の総FSP1濃度に対する割合(%)を示すグラフである。
　本発明は、被験者由来の生体試料を用いて腎炎の病変部位を判定するための検査方法を提供する。
　本発明の検査方法が適用できる被験者は特に制限されないが、例えば、腎炎患者と臨床的に判断できるが、その病変部位が特定できない患者、または腎炎を発症していることが疑われる被験者などが挙げられる。本発明の検査方法によって判定される腎炎の病変部位は、糸球体（即ち、糸球体病変）および間質組織（即ち、間質性病変）を含む。本発明で判定される糸球体病変は、生体試料中に単量体FSP1を含む特徴を有する糸球体病変であり、活動性の高い糸球体病変が判定により適する。ここで糸球体病変の活動性が高いとは、糸球体における半月体の形成、メサンギウム細胞の増殖、あるいはＴ細胞やマクロファージの糸球体内への浸潤が観察される状態をいう。そのような糸球体病変としては、半月体形成性糸球体腎炎、IgA腎症、ループス腎炎、紫斑病性腎炎等が挙げられる。また、本明細書において判定される間質性病変は、生体試料中に多量体FSP1を含む特徴を有する間質性病変であり、活動性の高い間質性病変が判定により適する。ここで間質性病変の活動性が高いとは、Ｔ細胞やマクロファージの間質への浸潤が観察される状態をいう。そのような間質性病変としては、間質性腎炎、腎間質線維化等が挙げられる。
　本発明の検査方法に用いられる生体試料としては、上記被験者から採取されるものであれば特に制限はないが、例えば、尿など生体から容易に採取できるものや、生体組織も生体試料として用いることができ、例えば、腎臓などが挙げられる。生体試料として尿を用いる場合、例えば自然尿、カテーテル尿などが挙げられる。但し、尿路感染が疑われる尿試料や肉眼的血尿は除外されることが好ましい。また、尿試料はそのまま検査に用いてもよいが、デブリスを除去すべく遠心分離などの前処理を行ってもよい。さらに、試料は検査を実施する直前に被験者から採取されたものでも、予め採取され冷凍保存されたものでもよい。
　本発明者らは、後述する実施例において示すように、半月体形成性糸球体腎炎患者においては、尿中FSP1が単量体型としてドミナントに存在することを見出した。また同時に、間質性腎炎患者・腎間質線維化患者においては、尿中FSP1濃度が多量体型としてドミナントに存在することを見出した。
　従って、本発明の腎炎の病変部位を判定するための検査方法は、以下の工程を含むことを特徴とする。
（１）被験者由来の生体試料における総FSP1濃度、単量体FSP1濃度および多量体FSP1濃度のうちいずれか２つ以上を測定する工程、
（２）被験者由来の生体試料における単量体FSP1濃度および多量体FSP1濃度を比較する工程。
　本発明において総FSP1濃度とは、生体試料における単量体FSP1および多量体FSP1を含むFSP1タンパク質の濃度をいう。
　本発明の総FSP1濃度、単量体FSP1濃度および多量体FSP1濃度の測定方法は、特に制限されるべきものではなく、生体試料中の抗原量、抗原量に対応した抗体、抗体－抗原複合体の量を化学的または物理的手段により検出する測定法であれば、いずれの測定法を用いてもよい。そのような方法としては、例えば、ゲル電気泳動（例：SDS-PAGE、NATIVE-PAGE、二次元ゲル電気泳動など）や、各種の分離精製法（例：イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動など）、イオン化法（例：電子衝撃イオン化法、フィールドディソープション法、二次イオン化法、高速原子衝突法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（MALDI）法、エレクトロスプレーイオン化法など）、質量分析計（例：二重収束質量分析計、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計など）等に供することにより行うことができる。本発明においては、免疫化学的測定方法によって行うこともまた好ましい。
　本発明において、試料中において検出されるFSP1は、単量体型または多量体型（２量体またはそれ以上の多量体型を含んでよい）をとるが、単量体型のFSP1としては、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有するタンパク質が挙げられる。配列番号：２で表されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列としては、配列番号：２で表されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列などが挙げられる。本発明のFSP1は、好ましくは、配列番号：２で表されるアミノ酸配列を有するタンパク質、すなわちヒトFSP1である。
　本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、例えば、相同性計算アルゴリズムNCBI BLAST（National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool）を用い、以下の条件（期待値=10；ギャップを許す；マトリクス=BLOSUM62；フィルタリング=OFF）にて計算することができる。
　本発明の総FSP1濃度、単量体FSP1濃度および多量体FSP1濃度のうちいずれか２つ以上を測定する工程において、免疫化学的測定法を用いる場合、FSP1特異的抗体を用いることを特徴とする。本発明において用いられるFSP1特異的抗体としては、生体試料中から単量体FSP1および多量体FSP1の両方を認識する抗体、多量体FSP1だけを認識する抗体、単量体FSP1だけを認識する抗体が挙げられる。
　本発明において用いられるFSP1特異的抗体のうち、単量体FSP1および多量体FSP1の両方を認識する抗体は、後述する免疫化学的測定方法において記載する通り、異なるエピトープを認識する２種類の組合せで用いられうる。従って、それぞれの抗体が認識するエピトープはFSP1上で離れた位置にあることが好ましい。そのような抗体としては、FSP1のEF handカルシウム結合ドメインをエピトープとして認識する抗体、好ましくは配列番号：４に表されるアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗体、およびFSP1のN末端アミノ酸配列をエピトープとして認識する抗体、好ましくは配列番号：３に表されるアミノ酸配列をエピトープとして認識する抗体が挙げられる。
　本発明のFSP1特異的抗体は適切な免疫原を用いて、公知の方法で製造することができる。免疫原としては、例えば、FSP1の全長タンパク質またはその部分ペプチドが挙げられる。本発明において、免疫原として用いられるFSP1の全長タンパク質とは前記した通りのタンパク質である。また、本発明において、免疫原として用いられるFSP1部分ペプチドとは、配列番号：２と同一または実質的に同一のアミノ酸配列の部分アミノ酸配列を含むペプチドである。
　または、免疫原として用いられるFSP1部分ペプチドとしては、FSP1のN末端アミノ酸配列またはFSP1のEF hand カルシウム結合ドメインを含むペプチドであってもよい。FSP1のN末端アミノ酸配列の一例としては、配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１～１２番目に該当する配列（配列番号：３）と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチド配列である。また、FSP1のEF hand カルシウム結合ドメインの一例としては、配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号８０～９２番目に該当する配列（配列番号：４）と同一または実質的に同一のアミノ酸配列を含むペプチド配列である。
　免疫原として用いられるFSP1は、哺乳動物の細胞または組織から自体公知のタンパク質の精製方法によって製造することができる。具体的には、哺乳動物の組織または細胞をホモジナイズし、可溶性画分および／または核画分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等で分離精製することによって、FSP1を製造することができる。
　免疫原として用いられるFSP1もしくはその部分ペプチドは、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
　ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。免疫原として用いられるFSP1を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とするタンパク質を製造することができる。
　本発明で使用されるFSP1特異的抗体としては、動物の血中に産生されるもの、ハイブリドーマに産生されるもの、遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるもの、ファージディスプレイ法によりスクリーニングされる抗体遺伝子を含む細胞に産生されるもの、もしくは、ヒトの抗体を生産するトランスジェニックマウスから直接得られるヒト抗体などが挙げられる。
　FSP1特異的抗体は当業者に公知の方法によって作製することができる。
　FSP1は、哺乳動物に対して、投与により抗体産生が可能な部位にそれ自体あるいは担体、希釈剤とともに投与される。免疫原として使用するFSP1は、前記のFSP1の全長タンパク質であっても、その部分ペプチド（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、KLH（Keyhole Limpet Hemocyanin）等のキャリアータンパク質に架橋した複合体とすることもできる）であってもよい。投与に際して抗体産生能を高めるため、完全フロイントアジュバントや不完全フロイントアジュバントを投与してもよい。用いられる哺乳動物としては、例えば、サル、ウサギ、イヌ、モルモット、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギが挙げられるが、マウス及びラットが好ましく用いられる。
　ハイブリドーマの作製に際しては、抗原を免疫された哺乳動物、例えば、マウスから抗体価の認められた個体を選択し最終免疫の2～5日後に脾臓又はリンパ節を採取し、それらに含まれる抗体産生細胞を骨髄腫細胞と融合させることにより、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを調製することができる。
　モノクローナル抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングには種々の方法が使用できるが、例えば、FSP1を直接あるいは担体とともに吸着させた固相（例、マイクロプレート）にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体（細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる）又はプロテインAを加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法、抗免疫グロブリン抗体又はプロテインAを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したFSP1を加え、固相に結合したモノクローナル抗体を検出する方法などが挙げられる。
　モノクローナル抗体の分離精製は、通常のポリクローナル抗体の分離精製と同様に免疫グロブリンの分離精製法〔例、塩析法、アルコール沈殿法、等電点沈殿法、電気泳動法、イオン交換体（例、DEAE）による吸脱着法、超遠心法、ゲルろ過法、抗原結合固相又はプロテインAあるいはプロテインＧなどの活性吸着剤により抗体のみを採取し、結合を解離させて抗体を得る特異的精製法〕に従って行なうことができる。
　以上のようにして、得られたFSP1特異的抗体を用いて、免疫化学的測定法によって被験者由来の生体試料における総FSP1濃度、単量体FSP1濃度および多量体FSP1濃度をそれぞれ測定することができる。具体的には例えば、以下のようにして実施することできる。
（１）サンドイッチELISA法、イムノクロマト法、凝集法
　固相化したFSP1特異的抗体に生体試料を含む被験液を反応させ（１次反応）、さらに固相化したFSP1特異的抗体と同一または別異の標識化したFSP1特異的抗体を反応させ（２次反応）た後、標識体の活性を測定することにより被験液中の総FSP1量、多量体FSP1量または単量体FSP1量を定量することができる。
　固相化したFSP1特異的抗体は、単量体FSP1および多量体FSP1の両方を認識する抗体、多量体FSP1だけを認識する抗体、単量体FSP1だけを認識する抗体のいずれであってもよい。固相化の担体としては、マイクロプレートウェル、ニトロセルロース膜、ラテックスビーズ、磁気ビーズなどを用いることができる。固相化方法は物理的に吸着させてもよいし、化学結合等で配向性を持たせてもよい。また、固相化は１次反応前に予め行ってもよいし、サンドイッチ複合体を形成した後でもよい。
　標識化したFSP1特異的抗体は、抗原抗体反応物を検出しうる標識体を結合させて用いる。標識化した抗体は、固相化したFSP1特異的抗体と同一の抗体でも別異の抗体であってもよい。標識体はラジオアイソトープ、金コロイド、酵素、蛍光物質、発光物質または酵素基質等を用いることができる。また、標識体は間接的に検出を可能にする物質であっても構わない。間接的に検出を可能にする方法としては例えば、ストレプトアビジン＝ビオチン反応、糖鎖＝レクチン反応、核磁気共鳴反応等が挙げられる。あるいは、固相化したFSP1特異的抗体に用いられた固相が、ラテックスビーズ、磁気ビーズである場合は、２次反応に用いるFSP1特異的抗体もラテックスビーズ、磁気ビーズに固相化することによって、サンドイッチ複合体を凝集化させて、凝集物そのものの濁度を検出に利用してもよい。
　生体試料中の多量体FSP1および/または単量体FSP1とFSP1特異的抗体からなるサンドイッチ複合体は、非特異的に抗体と反応した物質や未反応の抗体を除去する工程により選別される。除去方法は、界面活性剤等を含む緩衝液による洗浄工程、磁石あるいは電気化学的性質を用いた分離工程、あるいは分子篩やクロマトグラフィーのような移動度の違いによる分離工程が考えられるが、免疫複合体のみを特異的に残存させる方法であればどのような方法であっても構わない。
　上記の検出手段のいずれかを用いることで免疫複合体を測定することができる。免疫複合体量は、例えば吸光度、蛍光強度、発光強度等によりその多寡を決定するが、別途濃度既知のFSP1が示す免疫複合体量との比較による定量を行なってもよいし、単純にその強度のみを定性的に比較しても構わない。
　上記の測定法によって検出されるFSP1は、固相化したFSP1特異的抗体と標識化したFSP1特異的抗体がそれぞれ別異の単量体FSP1および多量体FSP1の両方を認識する抗体であった場合（例えば、一方の抗体がFSP1のEF handカルシウム結合ドメインをエピトープとして認識する抗体であり、他方の抗体がFSP1のN末端アミノ酸配列をエピトープとして認識する抗体である場合）、生体試料中の多量体FSP1と単量体FSP1の両者を検出することができる。かかる場合、固相化したFSP1特異的抗体と標識化したFSP1特異的抗体として同一の抗体（例えば、FSP1のEF handカルシウム結合ドメインをエピトープとして認識する抗体）を用いることによって、多量体FSP1のみを検出し、単量体FSP1を算出することができる。あるいは、固相化したFSP1特異的抗体として多量体FSP1のみを認識する抗体または単量体FSP1のみを認識する抗体を用いることによって直接、多量体FSP1または単量体FSP1を検出することもできる。
（２）競合法
　上記サンドイッチELISA法等を測定原理とする測定法は、FSP1特異的抗体の一方または両方が1種類の多量体FSP1または単量体FSP1のみを認識する抗体のみを用いることによる競合法を測定原理とする測定法であってもよい。この場合、抗原としてFSP1またはそれと同等の抗原性を有する物質（FSP1の部分ペプチド）を、ラジオアイソトープ、金コロイド、酵素、蛍光物質、発光物質あるいは酵素基質等により標識し、マイクロプレートウェル、ニトロセルロース膜、ラテックスビーズ、磁気ビーズなどに固相化された多量体FSP1のみを認識する抗体または単量体FSP1のみを認識する抗体に対して、生物試料中のFSP1と競合させることにより、生物試料中のFSP1を測定することができる。
（３）吸収法
　上記サンドイッチELISA法または競合法を用いた測定法において、多量体FSP1のみを認識する抗体または単量体FSP1のみを認識する抗体等を用い、予め生体試料中の多量体FSP1もしくは単量体FSP1のいずれか一方を該抗体等で吸収、除去する工程を経た後に、FSP1の測定を行なうことにより、除去されなかったFSP1のみを測定することもできる。
　本発明の検査方法に適用するにあたっては、特別の条件、操作等の設定は必要とされない。それぞれの方法における通常の条件、操作法に当業者の通常の技術的配慮を加えてFSP1の測定系を構築すればよい。これらの一般的な技術手段の詳細については、総説、成書などを参照することができる。例えば、入江寛編「ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和４９年発行）、入江寛編「続ラジオイムノアッセイ」（講談社、昭和５４年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（医学書院、昭和５３年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第２版）（医学書院、昭和５７年発行）、石川栄治ら編「酵素免疫測定法」（第３版）（医学書院、昭和６２年発行）、「Methods in ENZYMOLOGY」Vol.70(Immunochemical Techniques(PartA))、同書Vol.73(Immunochemical Techniques(PartB))、同書Vol.74(Immunochemical Techniques(PartC))、同書Vol.84(Immunochemical Techniques(PartD:Selected Immunoassays))、同書Vol.92(Immunochemical Techniques(PartE:Monoclonal Antibodies and General Immunoassay Methods))、同書Vol.121(Immunochemical Techniques(PartI:Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies))(以上、アカデミックプレス社発行)などを参照することができる。
　後述の実施例に示されるように、活動性の高い糸球体病変である半月体形成性糸球体腎炎患者と活動性の高い間質性病変である間質性腎炎または腎間質線維化患者とを比較して、半月体形成性糸球体腎炎患者では尿中FSP1は単量体型がドミナントである。また、尿中FSP1は細胞性半月体形成を認める糸球体の出現頻度と正の相関を示す。一方、間質性腎炎または腎間質線維化患者においては、尿中FSP1は多量体型がドミナントである。従って、腎炎の病変部位の判定のための検査方法は、単量体FSP1濃度と糸球体病変の罹患率、あるいは多量体FSP1濃度と間質性病変の罹患率との間のこのような正の相関に基づき行われる。
　例えば、被験者からの生体試料における単量体FSP1濃度および多量体FSP1濃度を比較する。あるいは、単量体FSP1濃度および多量体FSP1濃度と糸球体病変および間質性病変の罹患の有無との相関図をあらかじめ作成しておき、被験者における単量体FSP1および多量体FSP1の濃度をその相関図と比較してもよい。濃度の比較は、好ましくは、有意差の有無に基づいて行われる。
　そして、被験者において単量体FSP1濃度が多量体FSP1濃度よりも高い（単量体FSP1濃度および多量体FSP1濃度の総和の５１％以上）場合に、腎炎の病変部位が糸球体であり、逆に多量体FSP1濃度が単量体FSP1濃度よりも高い（単量体FSP1濃度および多量体FSP1濃度の総和の５１％以上）場合に、腎炎の病変部位が間質性組織である可能性が高いと判断することができる。あるいは腎炎の病変部位が糸球体または間質性組織である患者の生体試料における濃度に近似する場合には、腎炎の病変部位が糸球体または間質性組織である可能性が高いと判断することができる。
　さらに、本発明は、腎炎の病変部位の判定の検査用試薬にも及ぶ。本発明の試薬は、上述の本発明の検査方法を簡便に実施するための試薬であればよく、特に限定されない。該検査するための試薬は、FSP1特異的抗体を含有してなる。該FSP1抗体としては、単量体FSP1および多量体FSP1の両方を認識する抗体、多量体FSP1だけを認識する抗体、単量体FSP1だけを認識する抗体が挙げられ、それらの抗体を１種類以上有することが好ましい。本発明におけるFSP1特異的抗体としては、上記検査方法において記載したものと同一のものが挙げられる。
　本発明のFSP1特異的抗体は、水もしくは適当な緩衝液中に溶解した状態で提供することができる。あるいは、本発明のFSP1特異的抗体は、適当な固相に固定化された状態で提供することもできる。固相としては、例えば、マイクロプレートウェル、ニトロセルロース膜、ラテックスビーズ、磁気ビーズ等が挙げられるが、これらに限定されない。また、本発明のFSP1特異的抗体は、予め上記の標識物質で標識した状態で提供することもできるし、標識物質とそれぞれ別個に提供され、用時標識して用いることもできる。
　本発明の試薬は、前記抗体に加えて、単量体FSP1濃度または多量体FSP1濃度を測定するための反応において必要な他の物質であって、共存状態で保存することにより反応に悪影響を及ぼさない物質をさらに含有することができる。あるいは、該試薬は、FSP1を検出するための反応において必要な他の物質を含有する別個の試薬とともに提供されてもよい。例えば、FSP1を検出するための当該他の物質としては、反応緩衝液、ブロッキング液、酵素基質、非特異反応防止剤、防腐剤または界面活性剤等が挙げられる。
　以下に、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではないことは明らかである。
（実施例１）FSP1に対するモノクローナル抗体の取得とエピトープマッピング
　GSTタグ配列およびHisタグ配列を有するpET-49b(+)ベクター(Novagen)に全長ヒトFSP1遺伝子を挿入することによってFSP1発現ベクターを調製した。BL21DE3コンピテント細胞を該ベクターで形質転換し、イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(Takara Bio Inc.)を用いてタンパク質を誘導発現させた。発現した融合タンパク質をHisTrap HP カラム(GE Healthcare)を用いて、カラムクロマトグラフィーによって精製後、ヒトライノウイルス3Cプロテアーゼ(Novagen)を用いてGSTタグおよびHisタグを切断し、精製組換えヒトFSP1(rFSP1)を取得した。rFSP1(50μg/250μl)を等量のCFA(Difco Laboratories)中で乳化し、抗原として用いた。
　モノクローナル抗体を生じさせるため、BALB/cマウス（雌、７週齢）(CLEA Japan Inc.)に抗原を腹腔内投与し、同様の免疫を２週間、４週間、６週間後に行った。４回目の免疫から１週間後、アジュバント無しで抗原を尾静脈中に追加接種した。追加接種から３日後、マウスから脾臓を摘出し、100-メッシュスチール網を通して、解離させた。解離した脾細胞(2x108)を、５０％ポリエチレングリコール(Roche Applied Science)の存在下、同数のミエローマ細胞と融合させた。融合細胞を５％Briclone(Archport)を含む選択増殖培地中に懸濁し、９６ウェル培養プレート(2x105細胞/ウェル)に播いて、定期的に培地を交換しながら培養した。ハイブリドーマコロニーを含むウェルの上清に対してダイレクトELISAを用いて特定の抗体が存在するかスクリーニングに供し、陽性ウェル由来のハイブリドーマ細胞を限定希釈によって２回クローニングした。各クローンを培地中で培養し、抗体豊富な上清を硫酸アンモニウム沈殿によって濃縮し、PBSで透析し、－８０℃で保存した。
　ハイブリドーマ細胞を持つ４８４ウェルから上清を回収し、抗体の検出を試みた。ダイレクトELISAとnative PAGEを用いて、５つの抗体が、rFSP1に結合することを見出した。これら５つのクローンのうち、高力価を有する、rFSP1に結合する２種類の抗体(F1-2およびI11-23)を選抜した。アイソタイプ解析(AbD Serotec)では、F1-2はIgG2a(κ)サブクラスに属し、I11-23 はIgG1(κ)サブクラスに属することが判った。PepSpots(JPT Peptide Technologies)を用いたエピトープマッピングでは、これら２つのモノクローナル抗体は異なるエピトープを認識し、F1-2はFSP1のＮ末端（配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号１～１２番目に該当する配列；配列番号：３）を認識し、I11-23 はEF handカルシウム結合ドメイン（配列番号：２で表されるアミノ酸配列のうち、アミノ酸番号８０～９２番目に該当する配列；配列番号：４）を認識することがわかった（図１）。また、ヒトFSP1とマウスFSP1を用いたエピトープ結合実験でも、F1-2はFSP1のＮ末端を認識し、I11-23 はEF handカルシウム結合ドメインを認識した（図２）。
（実施例２）腎疾患患者由来の試料に対するサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いた尿中FSP1の測定
　半月体形成性糸球体腎炎患者２名、間質性腎炎患者１名、腎間質線維化患者１名から尿検体を採取した。半月体形成性糸球体腎炎患者２名のうちの１名および間質性腎炎患者からは独立に３回ずつ尿検体を採取した。また、糸球体病変の活動性が低い膜性腎症と腎硬化症からも尿検体を採取した。尿検体中のFSP1の量をサンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。腹水抗体から精製したI11-23抗体を固相化濃度(1.25μg/mL)で９６穴マイクロプレートの各ウェルに固相化し、採取した尿検体を４倍希釈した試料100μLを該ウェルに接触させた。室温で１時間、１次反応させた後、ウェルを３回洗浄した。次に腹水抗体から精製したF1-2抗体およびI11-23抗体をそれぞれHRP標識し、2000倍希釈した標識化F1-2抗体100μLおよび4000倍希釈した標識化I11-23抗体100μLをウェルにそれぞれ接触させた。室温で１時間、２次反応させた後、ウェルを３回洗浄した。基質液100μLをウェルに接触させ、３７℃で３０分間反応させた。反応停止液100μLをウェルに接触させ、反応を停止させた後、反応液の吸光度を測定した。予め上記の方法によって各濃度FSP1(0,1,2,4,8,16,32,64ng/mL) 100μLを標準タンパク質溶液として吸光度とFSP1濃度の標準曲線を作成し、該標準曲線を基に得られた各検体の吸光度から各FSP1濃度(ng/mL)を推定し、併せてその差を算出した（表１）。また、活動性の高い糸球体腎炎である半月体形成性糸球体腎炎（A1-3、D）および活動性の高い間質性腎炎である間質性腎炎、腎間質線維化（B1-3、C）については、多量体FSP1濃度と単量体FSP1濃度の割合をグラフとして表示した（図３）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１または図３の通り、活動性の高い糸球体病変患者である半月体形成性糸球体腎炎患者においては、多量体FSP1濃度と単量体FSP1濃度の総和を１００％とした場合、単量体FSP1濃度の割合はそれぞれ、約８４．１％（Ａ１）、約７３．３％（Ａ２）、約８１．３％（Ａ３）、約８２．２％（Ｄ）であった。一方、活動性の高い間質性病変患者である、間質性腎炎または腎間質線維化患者においては、多量体FSP1濃度と単量体FSP1濃度の総和を１００％とした場合、多量体FSP1濃度の割合はそれぞれ、約８９．２％（Ｂ１）、約８９．７％（Ｂ２）、約９７．３％（Ｂ３）、約９２．８％（Ｃ）であった。また、活動性の低い糸球体病変患者（Ｅ，Ｆ，Ｇ，Ｈ，Ｉ）においては、単量体FSP1濃度、多量体FSP濃度共に小さく、FSP1の漏出が少なかった。
　同一のエピトープを認識する固相化I11-23抗体と標識化I11-23抗体によってFSP1が検出されるという結果は、間質性病変である間質性腎炎および腎間質線維化患者の尿中では多量体FSP1が存在し、また単量体FSP1よりも存在比が高いことから、それがドミナントであることを示唆している。一方、異なるエピトープを認識する固相化I11-23抗体と標識化F1-2抗体によってFSP1が検出されるという結果は、糸球体病変である半月体形成性糸球体腎炎患者の尿中では単量体FSP1が存在し、また多量体FSP1よりも存在比が高いことから、それがドミナントであることを示唆している。従って、尿検体中のFSP1が多量体としてドミナントであるか単量体としてドミナントであるかが、腎炎の病変部位と相関することを確認できた。
　本発明の検査方法およびそのための試薬は、腎炎患者または腎炎であることが疑われる被験者の病変部位の判定を迅速かつ簡便ならしめることができる。
　本願は日本で出願された特願2012-247896（出願日：2012年11月9日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (6)

  1. 　以下の工程を含むことを特徴とする、腎炎の病変部位を判定するための検査方法：
    （１）被験者由来の生体試料における総FSP1濃度、単量体FSP1濃度および多量体FSP1濃度のうちいずれか２つ以上を測定する工程、
    （２）被験者由来の生体試料における単量体FSP1濃度および多量体FSP1濃度を比較する工程。
  2. 　生体試料が尿試料であることを特徴とする、請求項１に記載の検査方法。
  3. 　総FSP1濃度、単量体FSP1濃度および多量体FSP1濃度の測定が、免疫化学的測定法によって測定されることを特徴とする、請求項１または２に記載の検査方法。
  4. 　判定される腎炎の病変部位が、糸球体または間質組織である請求項１～３のいずれか１項に記載の検査方法。
  5. 　FSP1特異的抗体を、少なくとも１種類含む、腎炎の病変部位を判定するための試薬。
  6. 　判定される腎炎の病変部位が、糸球体または間質組織である請求項５に記載の試薬。
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