WO2020241999A1 - 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 시스템 및 방법 - Google Patents

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WO2020241999A1
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affinity separation
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백세환
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고려대학교 세종산학협력단
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to an affinity separation system and method using a switchable adhesion reaction, and more particularly, to a technology for separating a predetermined target component in a sample into subgroups.
  • Liquid biopsy is a non-invasive method that extracts body fluids such as blood, saliva, and urine relatively easily and analyzes specific disease-related cells or components (peptides, proteins, nucleic acids, organelles, specific substances, etc.) That's the way.
  • body fluids such as blood, saliva, and urine
  • specific disease-related cells or components peptides, proteins, nucleic acids, organelles, specific substances, etc.
  • exosomes which are secreted in the form of microvesicles from cells in the human body and reflect the characteristics of the derived cells as they are, are called'avatars' of cells, and can be extracted from various body fluids such as blood, saliva, and urine. Because exosomes are endoplasmic reticulums with a double layer of lipids, they are stable in the body and are free from attacks such as protease, RNase, and DNase. Accordingly, researches to use exosomes as a new biomarker for diagnosing specific diseases such as cancer and degenerative diseases are increasing, and products for early diagnosis of cancer using exosomes are being developed.
  • exosomes derived from all cells are present in a mixed form, there is a limitation in accurately diagnosing specific diseases such as cancer with a simple bulk population type exosome sample isolated from body fluid. .
  • concentration of exosomes derived from specific disease-related cells in body fluids is relatively very low, so for early diagnosis, separation and concentration of target exosomes from body fluids must be preceded.
  • the ultracentrifugation method based on the difference in density is adopted as the gold standard separation process due to its high reproducibility and relatively stable process.
  • methods of separating exosomes by sedimentation, using size exclusion chromatography, or using microfluidics as disclosed in Korean Patent Document No. 10-1807256 have been developed. .
  • the present invention is to solve the problems of the prior art described above, by using a recognition material that specifically recognizes the conformation change of the binder caused by binding of a binder such as a binding protein to the ligand, the presence or absence of a ligand in the solution Based on the binder-recognition material binding or switch-like reversible binding, which is rapidly dissociated into individual components, it is to provide a technology for affinity separation with high yield and in its original state. .
  • the affinity separation system includes a ligand; A binder in which the ligand is detachably bonded and the structure is changed by bonding reaction with the ligand; A recognition material specifically bonded to the binder whose structure is changed; A fixing member on which one of the binder and the recognition material is fixed to a surface; And a capture material that is polymerized with the other one of the binder and the recognition material to form a polymer, and specifically binds to a target subgroup target material in the sample solution.
  • the ligand may include any one or more selected from the group consisting of sugar molecules, ions, substrates, and antigens.
  • the binder any one or more selected from the group consisting of a sugar-binding protein, an ion-binding protein, an enzyme, an antibody, an aptamer, a cell receptor, and a nanostructure.
  • a sugar-binding protein any one or more selected from the group consisting of a sugar-binding protein, an ion-binding protein, an enzyme, an antibody, an aptamer, a cell receptor, and a nanostructure.
  • the recognition material is from the group consisting of antibodies, protein receptors, cell receptors, aptamers, enzymes, nanoparticles, nanostructures, and heavy metal chelators. Any one or more selected may be included.
  • the fixing member is selected from the group consisting of hydrogel, magnetic beads, latex beads, glass beads, nanometal structures, porous membranes, and non-porous membranes. It may include any one or more.
  • a reactor for accommodating the fixing member therein may further include.
  • the bound binder and the recognition material may be separated from each other.
  • the fixing member combined with the target subgroup target material may be concentrated by one or more of magnetic force, gravity, and centrifugal force.
  • the sample solution may contain a body fluid
  • the target subgroup target material may be a material separated from a heterogeneous bulk group in the body fluid
  • the heterogeneous bulk group is from the group consisting of cells, exosomes, DNA, RNA, proteins, lipids, sugars, and metabolic components used for diagnosis of predetermined diseases. It may include at least two or more selected.
  • the affinity separation method includes (a) a ligand solution containing a ligand, a binder whose structure is changed by detachably binding reaction with the ligand, and a recognition material that specifically binds to the binder whose structure is changed.
  • the step (a) comprises: fixing the other one of the binder and the recognition material to the surface of the fixing member; And combining the polymer with the other of the binder and the recognition material fixed to the fixing member by adding the ligand solution in which the polymer is dissolved, to the fixing member.
  • the affinity separation method in the affinity separation method according to an embodiment of the present invention, between the step (b) and the step (c), by using at least one of magnetic force, gravity, and centrifugal force, binding with the target subgroup target material Capturing the fixed member in a predetermined space in a mixed solution in which the ligand solution and the sample solution are mixed; And concentrating the target subgroup target material by removing a part of the mixed solution in which the fixing member is not contained.
  • the sample solution may include a body fluid
  • the target subgroup target material may be a material separated from a heterogeneous bulk group in the body fluid
  • the heterogeneous bulk group is from the group consisting of cells, exosomes, DNA, RNA, proteins, lipids, sugars, and metabolic components used for diagnosis of predetermined diseases. It may include at least two or more selected.
  • a biological target component related to a specific disease can be separated into subgroups under non-harsh conditions, and the separated target component subgroup is used as a liquid biopsy sample to diagnose specific diseases such as cancer and degenerative diseases with high sensitivity. Can be done with.
  • FIG. 1 is a block diagram of an affinity separation system using a switchable adhesion reaction according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a block diagram of an affinity separation system using a switchable adhesion reaction according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a flow chart of an affinity separation method using a switchable adhesion reaction according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a flow chart of an affinity separation method using a switchable adhesion reaction according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a flow chart illustrating a process of separating an exosome subpopulation associated with melanoma cancer cells using an affinity separation method using a switchable adhesion reaction according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a result of separating CD63+ exosomes in a sample by an immunoaffinity chromatography process using an affinity separation system and method using a switchable attachment reaction according to the present invention.
  • 11 is a result of characterization of exosome surface markers of CD63+ exosome samples isolated using an affinity separation system and method using a switchable attachment reaction according to the present invention.
  • FIG. 13 is a result showing the potential effect on the diagnosis of melanoma cancer when the CD63+ exosomes isolated using the affinity separation system and method using the switchable attachment reaction according to the present invention are used as an analysis sample.
  • FIG. 1 is a block diagram of an affinity separation system using a switchable attachment reaction according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is a block diagram of an affinity separation system using a switchable attachment reaction according to another embodiment of the present invention.
  • the ligand 10 and the ligand 10 are detachably bonded, and the structure is changed by binding reaction with the ligand 10.
  • a recognition material 30 specifically bonded to the binder 20 having a changed structure a fixing member 40 to which any one of the binder 20 and the recognition material 30 is fixed to the surface, and a binder ( 20) and the recognition material 30 to form a polymer (C) by polymerization with the other one, and a capture material 50 that specifically binds to the target subgroup target material (1) in the sample solution.
  • the present invention relates to a technique for separating a predetermined target component in a sample into subgroups.
  • body fluids such as blood, saliva, and urine are extracted and analyzed for specific disease-related cells or components (peptides, proteins, nucleic acids, organelles, specific substances, etc.)
  • disease-related cells or components peptides, proteins, nucleic acids, organelles, specific substances, etc.
  • a'liquid biopsy' that performs the procedure.
  • a technology using exosomes extracted from body fluids as a new biomarker for diagnosing specific diseases such as cancer and degenerative diseases has been recently studied.
  • exosomes derived from all cells exist in a mixed form in body fluid, there is a limitation in accurately diagnosing specific diseases such as cancer with a simple bulk population type exosome sample isolated from body fluid.
  • a technology for separation and concentration of target exosomes is required.
  • Conventional exosome separation techniques include ultracentrifugation, sedimentation separation, size exclusion chromatography, or separation using microfluidics, but these conventional techniques are all exosomes present in body fluids. Since it provides in the form of a single population, there is a limit to selectively detecting a trace amount of exosomes derived from specific cells such as cancer.
  • protein markers having a high correlation with cancer are present on the surface of exosomes, such as Caveolin 1 (Cav1) in melanoma cancer, HER-2/neu in gastric cancer, and L1CAM in ovarian cancer. Focusing on, it is intended to isolate specific exosome subgroups by employing an immunological affinity separation method for a specific marker. However, it is very difficult in terms of overcoming detection limits and maintaining reproducibility to separate and detect very trace amounts of exosomes in body fluids by conventional general processes.
  • the present invention was devised to implement an affinity separation technique that does not use harsh conditions so that a target subgroup can be recovered from a sample in a high yield and in its original state.
  • the sample is a body fluid required for a liquid biopsy
  • the target subgroup target substance 1 may be an exosome, but is not limited thereto. Therefore, it is not limited only when the bodily fluid is necessarily used for a liquid biopsy, and the sample may be any type of sample containing the target subgroup target substance 1.
  • the target subgroup target material (1) is a material that can be separated according to the present invention, such as cells or cell-derived components.
  • the affinity separation system includes a ligand 10, a binder 20, a recognition material 30, a fixing member 40, and a capture material 50.
  • the ligand 10 is a material that is detachably bonded to the binder 20 and may include any one or more selected from the group consisting of sugar molecules, ions, substrates, and antigens.
  • the binder 20 is a material that causes a conformation change through a binding reaction with the ligand 10.
  • the binder 20 may include any one or more selected from the group consisting of a sugar-binding protein, an ion-binding protein, an enzyme, an antibody, an aptamer, a cell receptor, and a nanostructure.
  • the binder 20 and the ligand 10 are sugar-binding protein-sugar molecule pair, ion-binding protein-ion pair, enzyme-substrate pair, antigen-antibody pair, aptamer-ligand pair, cell receptor-ligand
  • a binder-ligand pair such as a pair, a nanostructure-ligand pair, etc., can be formed, and examples of the most representative binder 20 and ligand 10 include calcium binding protein (CBP) and calcium ions.
  • CBP calcium binding protein
  • the binder 20 and the ligand 10 are not necessarily limited to the above material, and any material may be used as long as it is a material that causes structural change by detachably bonding to each other.
  • the recognition material 30 is a material that specifically binds to the binder 20 whose structure is changed by binding with the ligand 10, and is an antibody, protein receptor, cell receptor, aptamer, enzyme, nanoparticle, nanostructure, and heavy metal. It may include any one or more selected from the group consisting of chelators. However, since the material is only an example of the recognition material 30, the scope of the present invention is not necessarily limited thereto.
  • the binder 20, and the recognition material 30 when describing the binding reaction between the ligand 10, the binder 20, and the recognition material 30, calcium ions (ligand) first bind to the calcium binding protein (binder), and the structure of the calcium binding protein A change is caused, and an antigen-antibody reaction occurs between the calcium-binding protein and the antibody (recognition material) whose structure has changed, and binds to each other.
  • one of the binder 20 and the recognition material 30 is fixed to the fixing member 40, and the other is polymerized with the capture material 50 to form a polymer (C). That is, as shown in FIG. 1, when the recognition material 30 is fixed on the fixing member 40, the binder 20 and the capture material 50 are polymerized to form the binder-capturing material polymer (C) (first Example, see Example 2 and Example 3 to be described later), as shown in Figure 2, the binder 20 is fixed on the fixing member 40, the recognition material 30 and the capture material 50 are polymerized to recognize the material -It can be classified into the case of forming the capture material polymer (C) (second embodiment).
  • the fixing member 40 is a member that binds and fixes the binder 20 or the recognition material 30 to the surface, and includes a hydrogel (see Example 2), and a magnetic bead (see Example 3).
  • Latex beads, glass beads, nanometal structures, porous membranes and may include any one or more selected from the group consisting of a non-porous membrane.
  • the fixing member 40 is not necessarily limited to the above, and there is no particular limitation as long as it is a material that can be combined with the binder 20 or the recognition material 30.
  • the capture material 50 is a material such as an antibody that is polymerized with the binder 20 or the recognition material 30, and specifically binds to the target subgroup target material 1 in the sample solution.
  • the capture material 50 such as such an antibody may be specifically combined with a target marker P such as a surface protein of the target subgroup target material 1 through an antigen-antibody reaction.
  • the recognition material 30 is fixed on the fixing member 40, and the binder 20 whose structure is changed by combining the ligand 10 is combined with the recognition material 30,
  • the binder 20 and the polymerized capture material 50 are specifically combined with the target sub-group target material 1 to capture the target sub-group target material 1 in the sample solution.
  • the binder 20 is combined with the ligand 10 as a binder-capturing material polymer (C)
  • the binder 20 is a ligand ( 10) and the binder 20 and the capture material 50 may be polymerized with each other afterwards.
  • the binder 20 is fixed on the fixing member 40, the ligand 10 is combined, and the binder 20 and the recognition material 30 whose structure is changed are combined with each other, and the recognition material ( 30) and the polymerized capture material 50 are specifically combined with the target subgroup target material 1 to capture the target subgroup target material 1 in the sample solution.
  • the recognition material 30 and the capture material 50 are polymerized and the recognition material-capturing material polymer (C) is combined with the binder 20, or the recognition material 30 is first combined with the binder 20 and then captured. It can be polymerized with the material 50.
  • each of the coupling reactions may be performed in a reactor (not shown) accommodating the fixing member 40 therein.
  • the fixing member 40 and the target subgroup target material 1 are combined with each other through the recognition material 30, the binder 20, and the capture material 50.
  • the target subgroup target material 1 may be concentrated using one or more of magnetic force, gravity, and centrifugal force.
  • the supernatant is removed and the magnetic beads are removed while the fixing member 40 combined with the target subgroup target material 1 is captured using a magnet. By doing so, concentration is possible.
  • the binder 20 whose structure is changed by desorbing the ligand 10 bound to the binder 20 ) Can be restored to its original state, thereby separating the combined binder 20 and the recognition material 30 from each other.
  • the ligand 10 may be desorbed by injecting a recovery solution containing no ligand 10.
  • the affinity separation system of the present invention implemented as described above may be used to separate and recover cells or cell-derived components related to specific diseases such as cancer diseases or degenerative diseases from body fluids.
  • a sample solution containing a bodily fluid is used, and since heterogeneous bulk groups exist in the bodily fluid, the required target subgroup target material 1 is separated and recovered from the heterogeneous bulk group by using the affinity separation system.
  • the heterogeneous bulk group may include at least two or more selected from the group consisting of cells, exosomes, DNA, RNA, proteins, lipids, sugars, and metabolic components used for diagnosis of a predetermined disease.
  • the present invention uses a recognition material 30 such as an antibody that specifically recognizes a structural change caused by binding of a binder 20 such as a calcium binding protein to a ligand 10 such as calcium ions reacting specifically thereto. Is based on.
  • This antigen-antibody reaction such as the binder 20-recognition material 30 reaction is similar to the principle of rapidly binding or dissociating according to the presence or absence of a ligand 10 such as calcium ions, and turning on and off the light by operating a switch. It is described as'switch-like reversible binding'.
  • a target subgroup including a target marker can be isolated and concentrated with high efficiency under non-harsh conditions by using an adhesion reaction such as a novel reversible antigen-antibody reaction. That is, compared to the method of using harsh conditions such as acidic pH to recover the target substance of the target subgroup, such as exosomes bound by the antigen-antibody reaction, from the surface of the solid bead, the structural prototype of exosomes can be maintained. In addition, high yield recovery is possible.
  • FIG. 3 is a flow chart of an affinity separation method using a switchable attachment reaction according to an embodiment of the present invention
  • FIG. 4 is a flow chart of an affinity separation method using a switchable attachment reaction according to another embodiment of the present invention.
  • the affinity separation method according to the present invention, (a) a ligand solution containing the ligand 10, a binder (20) whose structure is changed by a detachably binding reaction with the ligand (10). ), a recognition material 30 that specifically binds to the binder 20 having a changed structure, and a capture material 50 that is polymerized with any one of the binder 20 and the recognition material 30 to form a polymer (C)
  • a ligand solution containing the ligand 10 a binder (20) whose structure is changed by a detachably binding reaction with the ligand (10).
  • a recognition material 30 that specifically binds to the binder 20 having a changed structure
  • a capture material 50 that is polymerized with any one of the binder 20 and the recognition material 30 to form a polymer (C)
  • the ligand solution, the binder 20, the recognition material 30, and the capture material 50 are first reacted (S100).
  • one of the binder 20 and the recognition material 30 is polymerized with the capture material 50 to form a polymer (C), and the other is combined with the polymer (C).
  • the ligand 10 contained in the ligand solution is bound to the binder 20, causing a structural change of the binder 20, and the recognition material 30 specifically recognizes and binds the binder 20 with a changed structure. do.
  • the binder 20 and the capture material 50 are polymerized to form a binder-capturing material polymer (C), and the binder 20 is added with a ligand solution.
  • the recognition material 30 may be combined with the binder 20.
  • the binder 20 and the capture material 50 may be added in a state in which the polymer (C) is formed, or may be added individually to form the polymer (C).
  • the recognition material 30 And polymer (C) can be combined.
  • the recognition material-capturing material polymer (C) is formed, and the binder 20 whose structure is changed by the ligand solution is used as the recognition material of the polymer (C). 30) can be combined. Even at this time, the recognition material 30 and the capture material 50 may be added in a polymer (C) state, but may be added individually to form the polymer (C). As an example, by fixing the binder 20 on the surface of the fixing member 40 and adding a ligand solution in which the recognition material-capturing material polymer (C) is dissolved to the fixing member 40, the binder 20 and the polymer ( C) can be combined.
  • the sample solution may contain a bodily fluid, in which case the target subgroup target material 1 is separated from the heterogeneous bulk group in the bodily fluid.
  • the heterogeneous bulk group may include at least two or more selected from the group consisting of cells, exosomes, DNA, RNA, proteins, lipids, sugars, and metabolic components used for diagnosing diseases of the composition. In the heterogeneous bulk group containing moths, exosomes can be separated into a target subgroup target material (1).
  • the recovery solution is added (S300).
  • the recovery solution is a solution containing no ligand 10 that does not contain the ligand 10, and when the recovery solution is added, the ligand 10 bound to the binder 20 is eliminated, and the structure of the binder 20 is changed. As is restored to its original state, the bonding between the binder 20 and the recognition material 30 is released. Therefore, since the polymer (C) combined with the target subgroup target material (1) is separated from the recognition material 30 (see the first embodiment and Fig. 3) or separated from the binder 20 (the second implementation Example and see FIG. 4), finally, the target substance 1 of the target subgroup may be recovered.
  • the target sub-group target material 1 is recovered together with the polymer C, and the recognition material 30 is fixed on the fixing member 40 in the same form as the initial one (see the first embodiment and FIG. 3), Since the binder 20 is fixed (refer to the second embodiment and FIG. 4), a new sample solution may be separated using the recognition material 30 or the fixing member 40 to which the binder 20 is fixed.
  • the target subgroup target material 1 may be concentrated. Specifically, by using one or more of magnetic force, gravity, and centrifugal force, the fixing member 40 combined with the target subgroup target material 1 is placed in a predetermined spatial region in the mixed solution in which the ligand solution and the sample solution are mixed. To capture. Next, by removing a part of the mixed solution in which the fixing member 40 is not contained (for example, the supernatant), the target subgroup target material 1 can be concentrated.
  • the above process can be performed in a reactor, and the recognition material 30 or the fixing member 40 to which the binder 20 is fixed is filled in the reactor, and a ligand solution, a polymer (C), a sample solution, etc. are added thereto. do.
  • the reactor may perform a bonding and desorption reaction in a chromatography method as a chromatography column, or a process for performing a reaction in a batch method as a batch container, and separating using magnetic force, gravity, or centrifugal force. have.
  • the present invention can be used as a technique for separating and concentrating exosome subgroups in body fluids during a liquid biopsy for diagnosing specific diseases.
  • the exosome subgroups are The separating process will be described. 5 is a flowchart illustrating a process of separating an exosome subpopulation associated with melanoma cancer cells using an affinity separation method using a switchable adhesion reaction according to an embodiment of the present invention.
  • melanoma cancer a skin cancer arising from melanocytes, was selected as a target.
  • melanoma cancer is a disease that requires rapid and accurate diagnosis in order to increase the survival rate because it has the highest malignancy and a high metastasis rate.
  • Caveolin 1 the surface protein of exosomes
  • the diagnostic sensitivity based on Cav1-positive (Cav1+) exosomes was 68%. It is relatively higher than that of 43%, a diagnostic sensitivity based on CD63, a cancer marker.
  • the present invention is intended to be utilized as a method of selectively separating exosomes in body fluids to obtain a subpopulation containing Cav1+ exosomes, and using this as a test sample to increase the accuracy and sensitivity of melanoma cancer diagnosis.
  • Cav1+ exosomes were not targeted as the separation target, but the higher exosome group, which is associated with cancer occurrence, was selected as the separation target.
  • CD63 protein a house-keeping protein present in general exosomes, is increased and expressed on the surface of exosomes when several cancers including melanoma cancer occur, so this surface protein is separated.
  • exosome surface protein CD63+ as a diagnostic marker for melanoma cancer
  • its sensitivity is 43%, which is reported to be lower than when using exosome surface protein Cav1+, but Cav1+ exo in isolated CD63+ exosome subgroup If moth is included, it can be assumed that the sensitivity of melanoma cancer diagnosis using it as a test sample will be much higher than that of using a bulk population sample (see the upper part of FIG. 5).
  • an immunoisolation method using an antibody specific to a target marker may be applied.
  • the target exosome can be separated by reacting an exosome sample with an antibody immobilized on a solid surface such as magnetic beads or gel beads and then dissociating.
  • a solid surface such as magnetic beads or gel beads
  • dissociating Because the antigen-antibody reaction is highly selective, it is more suitable to separate exosomes associated with surface proteins compared to other existing separation methods (eg, ultracentrifugation, accelerated sedimentation, separation by size, etc.).
  • harsh conditions such as acidic pH should be used.
  • a subgroup of exosomes including a target marker can be isolated and concentrated with high efficiency under non-harsh conditions using an adhesion reaction such as a novel reversible antigen-antibody reaction.
  • a reversible recognition material is immobilized on a solid surface (I in FIG. 5), and calcium binding protein (CBP) is an exosome surface protein (eg: CD63) and polymerized through biotin-streptavidin linkage (CBP-capturing antibody polymer).
  • CBP-capturing antibody polymer dissolved in a solution containing calcium ions (eg >10 mM Ca 2+ ) is added to the fixed reversible recognition material, the polymer is fixed on the solid surface by a'switch on' recognition reaction (Fig. 5). Of II).
  • the exosomes containing the CD63 marker react with the capture antibody on the solid surface and are captured (III in FIG. 5).
  • the exosome recovery solution from which calcium has been removed is added, calcium ions that have been bound to CBP are desorbed and become'switch off', so that the captured exosomes can be recovered into the solution in the state of being bound to the capture antibody. It can be (IV in Fig. 5).
  • a subgroup of exosomes including the CD63 marker is separated and recovered, and concentration of exosomes is also possible depending on the volume ratio of the sample solution and the recovery solution used.
  • the solid surface can be regenerated and recycled for separation of other samples.
  • CBP calcium adhesion protein
  • Sodium chloride, Trizma, casein (sodium salt form, extract from bovine milk), 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), sodium dodecyl sulfate (SDS), bovine serum albumin (BSA), and CNBr-activated Sepharose 4B gel (4% agarose) was purchased from Sigma (St. Louis, MO, USA). Calcium chloride dehydrate and potassium chloride were supplied by Daejung (Siheung, Korea).
  • Sulfosuccinimidyl-6-[biotinamido]-6-hexanamido hexanoate (NHS-LC-LC-biotin), succinimidyl 4-(N-maleinidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)- propionate (SPDP), dithiotheritol (DTT), maleimide, streptavidin (SA), and horseradish peroxidase (HRP) were purchased from Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL, USA).
  • Anti-CD63 antibody (Cat. No.
  • Magnetic beads (Dynabeads M-280 Tosylactivated, diameter 2.8 mm) and streptavidin-poly-HRP20 were supplied from Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) and Fitzgerald (Acton, MA, USA), respectively.
  • exosome isolation kits namely ExoQuickTM kit (System Biosciences; Mountain View, CA, USA), MagCaptureTM kit (Wako; Osaka, Japan), and exoEasy MaxiTM kit (Qiagen; Hilden, Germany), are purchased from different sources. I did. Other reagents were also used for analysis.
  • Example 1 Preparation of components for isolation and characterization of exosomes
  • Biotinylation of anti-CD63 antibodies A biotinylated antibody was prepared by reacting the succinimidyl-ester portion of NHS-LC-LC-biotin with an amine group on an antibody molecule. Briefly, the process was mixed with anti-CD63 antibody dissolved in PB solution (PBS) containing 140 mM NaCl with 20 moles of NHS-LC-LC-biotin dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO), and 2 hours at room temperature. Reacted for a while. Unreacted reagents in the mixture were removed through size-exclusion chromatography using a Sephadex G-15 column in equilibrium with PBS. The purified polymer was dialyzed twice with PBS, concentrated to a concentration of 1 mg/ml using Vivaspin 500, and then stored at 4°C until use.
  • PBS PB solution
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Anti-CD63 antibody was labeled with HRP using a general procedure. Briefly, the antibody was first reduced with 10 mM DTT at 37° C. for 1 hour, and excess reagent was removed using a gel filtration column. HRP was also activated with 30 mole-fold SMCC, and unreacted reagents were removed through size-exclusion chromatography as before. After mixing the reduced antibody with 10 mole times of activated HRP, polymerization was carried out at 4° C. for 24 hours or longer. The resulting polymer was mixed with the same volume of glycerol and stored at -20°C.
  • an immune affinity gel To perform immunoaffinity chromatography, a monoclonal antibody specific for CBP was immobilized on the surface of CNBr-activated Sepharose 4B gel. According to the instructions provided by the manufacturer, in order to chemically bind the antibody (2 mg per ml of hydrated gel volume) on the agarose gel, the lysine residue on the antibody molecule was reacted with the functional group on the gel in alkaline conditions. After binding of the antibodies, the remaining reactive groups on the gel were hydrolyzed using Tris-HCl buffer.
  • the prepared immuno-affinity gel was filled in a plasma column to prepare an immuno-affinity chromatography column, and the antibody non-specifically adsorbed on the solid (gel) surface was removed by washing with alternating acidic and alkaline conditions.
  • Preparation of pre-treatment immunoaffinity chromatography column and separation of CD63 positive (CD63+) exosomes through it was prepared.
  • a pre-treatment immuno-affinity chromatography column was prepared using the immuno-affinity gel prepared above.
  • a plastic column was filled with an immunoaffinity gel, and a carrier solution containing Ca 2+ (10 mM) ('Ca 2+ switch on' condition), CBP-SA polymer (5 ⁇ g/ml) was reacted with a monoclonal antibody and immobilized on an immunoaffinity gel, followed by biotinylated anti-CD63 antibody (3 ⁇ g/ml) with biotin-SA binding. Through the CBP-SA polymer was sequentially fixed.
  • the exosomes were separated using the thus prepared immune affinity column (9 mm ⁇ 3.2 mm; 1.5 ml bed volume).
  • An exosome sample normal exosome standard sample (25 ⁇ g/ml; 1 ml)
  • a carrier solution containing Ca 2+ was injected to wash the unbound components.
  • a carrier solution from which Ca 2+ was removed was injected to collect the CBP-antibody-exosome conjugates (including CD63+ exosomes) attached to the immune affinity gel for each fraction.
  • the pretreatment column was reused for analysis of other samples after regeneration.
  • the gel was added to 20 mM Tris-HCl (pH 7.4; attachment solution) containing 140 mM NaCl, 10 mM Ca 2+ and 2% BSA. And equilibrium was maintained.
  • CBP-SA (5 ⁇ g/ml, 1 ml) prepared in Example 1, biotinylated anti-CD63 antibody (3 ⁇ g/ml, 1 ml) and exosome standard sample (1 ml; normal human exosome standard reagent or melanoma cancer cells) Culture solution) was diluted with the attachment solution.
  • HRP enzyme (0.1 ⁇ g/ml) was added to each diluted solution for marking so that the addition position of each reagent could be confirmed.
  • Each of the prepared solutions was sequentially added to the gel column so as to flow out from a predetermined effluent volume.
  • the effluent from the column was transferred to a fraction collector (fractional volume: 1 ml) at an outflow rate of 120 ⁇ l/min using a peristaltic pump.
  • the gel column was washed with a BSA-free attachment solution.
  • a 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) buffer solution containing 500 mM NaCl was supplied to the column, and the exosomes attached to the column were drained and recovered. Thereafter, a 100 mM sodium acetate buffer (pH 4.5) containing 500 mM NaCl, 5% (v/v) Tween-20, and 0.02% (w/v) thimerosal was supplied to the gel column, and protein from the column. The column was regenerated by washing thoroughly until there was no spillage.
  • Immune magnetic enrichment of CD63+ exosomes is a method of separating a target substance under a magnetic field through an antigen-antibody reaction using an immunological magnetic bead to which an antibody is conjugated, and performing concentration simultaneously.
  • the separation process of CD63+ exosomes using this method is basically the same as the process of performing immunoaffinity chromatography in Example 2. After binding a monoclonal antibody that recognizes CBP structure change due to Ca 2+ binding to magnetic beads, CBP-SA polymer and biotinylated anti-CD63 antibody were sequentially reacted under the condition of'Ca 2+ switch on'.
  • an antibody specific to CD63 was chemically bonded to the amine group on the antibody to the activated tosyl portion on the solid surface of the magnetic bead and fixed. After washing 3 times with Tris-HCl buffer solution, the remaining surface was blocked with Casein-PBS. Beads (total 1 mg) were magnetically separated from the solution, and then CBP-SA polymer (5 ⁇ g/ml; 1 ml) diluted with the attachment solution was added and reacted on a shaker for 1 hour. After washing the beads with the BSA-free attachment solution, biotinylated anti-CD63 antibody (3 ⁇ g/ml; 1 ml) was sequentially reacted under the same conditions.
  • Example 2 in order to confirm the outlet position on the chromatogram of each added sample, a color development enzyme analysis for horseradish peroxidase (HRP) was first performed.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Enzyme substrate solution is 3% (v/v) aqueous hydrogen peroxide solution (10 ⁇ l), 10 mg/ml TMB (100 ⁇ l) dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO), and 0.05 M acetate buffer solution (pH 5.1; 10 ml). It was prepared by mixing. The reaction was terminated by adding 2 M sulfuric acid solution (50 ⁇ l) before the enzyme signal was saturated, and the optical density was measured with a microplate reader (Synergy H4, BioTek Inc; Winooski, VT, USA) at a maximum absorbance of 450 nm.
  • enzyme-linked immunosorbent assay was performed on the exosomes in each fraction in order to confirm the outlet location of the exosomes separated and recovered by immunoaffinity.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • a portion of each fraction was sampled and added to the microwell on which the anti-CD63 antibody was immobilized, and the SA-poly HRP 20 polymer was sequentially added to the residual biotin on the biotinylated antibody molecule predicted to react with exosomes in the column. Reacted with.
  • antibody immobilization was performed by adding 5 ⁇ g/ml antibody (100 ⁇ l) to each well and reacting at 37° C. for 1 hour.
  • the signal is weakly generated at the location of the exosome sample injection (Fig.6 (c) peak), and it is predicted that some exosome conjugates are leaked or that an excessive amount of exosomes having no affinity reacts non-specifically. However, since this peak size was less than 10% of the size of the (d) peak, it was no longer used as an analysis target.
  • the immunoassay signal for CD63+ exosomes contained in the 37th, 38th, and 39th fractions in the recovered exosome peaks on the chromatogram showed high reproducibility with an average coefficient of variation (CV) of less than 9.4% ( See Fig. 7B).
  • the test procedure of Evaluation Example 2 was first obtained as described above, and then the exosomes contained in each effluent fraction were recovered and analyzed 3 times according to the same separation protocol. .
  • immunoassay results for CD63+ exosomes included in the main fractions constituting each isolated exosome peak were obtained, and the coefficient of variation (CV) between the measured signals was reproducible for each isolation test. It was used as an evaluation index.
  • CV coefficient of variation
  • Example 3 In order to test the concentration performance of Example 3, the magnetic separation process was repeatedly applied to other exosome standard samples (1, 3, or 5 ⁇ g/ml), and then sandwich immunoassay was performed on the above-described CD63+ exosomes. , The results are shown in a black bar graph in FIG. 8A. The immunoassay results for CD63+ exosomes in the original standard sample before magnetic enrichment were indicated by white bars in FIG. 8A. When comparing both, the signal increased by about 3.7 times on average due to magnetic enrichment.
  • the concentration response of the immunoassay for the original standard sample was linearized through log-logit conversion, and the concentration of CD63+ exosomes concentrated therefrom was determined, as shown in FIG. 8B. .
  • the concentration response of the immunoassay for the original standard sample was linearized through log-logit conversion, and the concentration of CD63+ exosomes concentrated therefrom was determined, as shown in FIG. 8B. .
  • the concentration efficiency of about 7.9 times was confirmed from this.
  • the concentration of the exosome sample before and after separation was determined by comparing the result obtained with the standard reagent in the immunoassay.
  • the normal exosome standard reagent was diluted with Casein-Tris and the exosome standard sample (1 to 100 ⁇ g/ ml) was prepared, and anti-CD63 antibody (5 ⁇ g/ml; 100 ⁇ l) was added to the micro-well for immunoassay, and reacted at 37° C. for 1 hour, and fixed with a capture binder on the inner surface of the well. After washing, Casein-Tris was added to block the remaining surface under the same conditions as above. Each exosome sample (100 ⁇ l) was added to a different well, and reacted at 37° C. for 12 hours. The rest of the analysis process was performed according to the ELISA protocol described above.
  • the magnetic concentration technology based on the switch recognition material according to Example 3 captures the target exosomes under the condition of'Ca 2+ switch on', and sequentially recovers the exosomes under the condition of'Ca 2+ switch off', and then pre-processed. Magnetic beads are regenerated and provide reusable properties for separation and concentration of new samples.
  • the standard samples of exosomes of different concentrations (1, 3, 5 ⁇ g/ml; collected from normal human plasma) were magnetically separated and concentrated, and then reused before The same process was repeated two more times using the treated beads.
  • the concentration of the isolated exosome samples was analyzed using a sandwich immunoassay for CD63+ exosomes.
  • the concentration response pattern for CD63+ exosomes was very similar when the samples were separated and concentrated by reusing the pretreated beads.
  • the concentration of CD63+ exosomes in the isolated sample according to the exosome concentration was found to have very high reproducibility as an average CV of 8.3% based on the signal value from the immunoassay (see FIG. 9B).
  • the standard samples (1, 3 and 5 ⁇ g / ml) were prepared by diluting the standard reagent for exosomes of normal people with an attachment solution, and when not using magnetic beads, immersed in Casein-Tris and stored at 4 °C.
  • FIG. 10 is a physical characterization result of the CD63+ exosomes isolated using the affinity separation system and method using the switchable attachment reaction according to the present invention
  • FIG. 11 is an affinity separation system using the switchable attachment reaction according to the present invention and This is the result of characterization of the exosome surface markers of CD63+ exosome samples isolated using the method.
  • DLS analysis In order to more accurately measure the size distribution of the isolated CD63+ samples, DLS analysis of exosomes was performed with a particle size analyzer (ELSZ-1000, Otsuka Electronics; Osaka, Japan) at room temperature. The exosome sample (0.5 ml) was transferred to a disposable cuvette (BI-SCP, Brookhaven Instruments Corporation; NY, USA) and analyzed according to the analyzer manufacturer's performance instructions. After determining the size of exosomes according to the Stokes-Einstein equation, the size distribution of extracellular vesicles was characterized. As a result, the particle diameter in each sample was found to be about 186.2 nm or 193.8 nm on average (see FIG. 10B). From the size and distribution of the particles thus measured, immunoaffinity chromatography and immunomagnetic separation processes The particles included in the sample separated through are determined to be exosomes.
  • Western blotting In order to confirm the distribution of heterogeneous surface proteins, which is one of the general characteristics of exosomes, Western blotting analysis was performed on tetraspanin protein markers in CD63+ exosome samples isolated in Examples 2 and 3, respectively. After performing SDS-PAGE analysis on the exosome samples under optimized conditions, the separated proteins were transferred to a nitrocellulose membrane to obtain specific antibody-HRP polymers for CD9, CD63, and CD81, which are generally widely distributed on the exosome surface. Reacted.
  • each exosome sample was first treated with 50 mM Tris buffer (pH 8.0) containing 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% sodium deoxycholate, and 0.1% sodium dodecyl sulfate (SDS). I did.
  • the denatured proteins were separated using 8% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and then transferred onto a nitrocellulose membrane through an electrophoretic method. After blocking the residual surface with Casein-PBS, the blotting analysis was performed using anti-CD63, CD9, and CD81 antibodies in which the membrane was previously chemically polymerized with HRP.
  • a HRP substrate solution containing 3,3'-diaminobenzidine (DAB) was added as a color developing reagent to generate a color signal on the membrane.
  • the substrate solution was prepared by adding 0.05% DAB (10 ⁇ l) and 3% H2O2 (1 ⁇ l) to 50 mM sodium acetate buffer (pH 5.0; 1 ml).
  • the total amount of exosomes in the exosome sample before and after immuno-affinity chromatography and immunomagnetic separation was calculated to determine the recovery yield of each separation process (Fig. 11B; right).
  • the yields of were 78.3% and 68.5%, respectively, and these results were very high compared to the conventional separation process (e.g., yield ⁇ 50%) in which the separation product was recovered using harsh conditions such as acidic pH.
  • the affinity of the recognition material for CBP is lowered to the background level when calcium ions in the solution are removed, so that the recovery yield of the separated exosomes is relatively very high, and structural deformation is minimized. Because it became.
  • Evaluation Example 6 Evaluation of analysis performance when using a CD63+ exosome subgroup as a diagnostic sample
  • FIG. 12 is a result of correcting the Cav1 marker concentration based on the CD9 concentration in order to compensate for the concentration variation between exosome standard samples
  • FIG. 13 is the affinity separation system and method using the switchable attachment reaction according to the present invention. This is a result showing the potential effect on the diagnosis of melanoma cancer when the isolated CD63+ exosome is used as an analysis sample.
  • melanoma cancer-related markers Cav1 protein-specific antibody and CD9 protein-specific antibody were fixed in different microtiter plate wells, and the same samples were added to react, and then ELISA was performed using CD63 antibody as a detection antibody. From this, a signal proportional to the cancer marker and the normal marker was obtained (Fig. 12; bar graph), and the two signal ratios, that is, the Cav1/CD9 signal ratio, were calculated (Fig. 12; line graph). At this time, when the plasma sample provided by a normal person was diluted and analyzed (FIG. 12A), the Cav1/CD9 signal ratio was maintained at an average of 0.147, approximately constant according to the dilution ratio. In addition, in the case of melanoma cancer cell samples (FIG.
  • the signal for each marker was measured relatively high, and the Cav1/CD9 ratio was an average of 0.206, which was 40% higher than the standard sample, which is the normal expression level of Cav1.
  • the Cav1+ exosomes in the CD63+ exosome subpopulation could be normalized by correcting them with CD9+ exosomes, which are normal markers.
  • an exosome standard sample (5 to 100 ⁇ g/ml) was prepared by diluting exosomes obtained from normal human plasma or melanoma cancer cell lines with Casein-Tris.
  • a specific capture antibody (5 ⁇ g/ml; 100 ⁇ l) for each marker was added into each microwell and then reacted at 37° C. for 1 hour to fix.
  • the rest of the experimental process was carried out in the same manner as the ELISA process for CD63 already introduced above. Signals generated after analysis for CD9 and Cav1 were measured, and the Cav1/CD9 signal ratio was calculated for each sample.
  • the expression levels of Cav1 and CD9 proteins were measured as signals through ELISA as described above, and the Cav1/CD9 signal ratio, a correction parameter, was calculated and compared.
  • the Cav1/CD9 signal ratio was compared with that of the normal person. It was found that the Cav1/CD9 signal ratio did not differ from before separation, or rather decreased in cancer samples, regardless of the kit used when using samples obtained from commercially available separation kits, respectively.
  • kits are either a precipitation method using a polymer such as polyethylene glycol (ExoQuickTM, SBI), or a friendly method using a protein that reacts in the presence of a metal ion with phosphatidylserine (PS) on the surface of exosomes (MagCaprueTM, Wako), or Exosomes are separated by using a rotating column to shorten the separation time (exoEasy MaxiTM, Qiagen).
  • a precipitation method using a polymer such as polyethylene glycol (ExoQuickTM, SBI)
  • PS metal ion with phosphatidylserine
  • MagnCaprueTM phosphatidylserine
  • Exosomes are separated by using a rotating column to shorten the separation time (exoEasy MaxiTM, Qiagen).
  • kits sold in this way are limited to remarkably improving diagnostic sensitivity as only a degree of separating or concentrating a bulk exosome population, and therefore, it is difficult to apply to cancer cell screening.
  • immunoisolation methods for specific exosome surface markers may be applied to increase diagnostic sensitivity, but competition in exosome recovery yield and originality maintenance without the introduction of innovative methods through the use of switch recognition materials as in the present invention Difficult to do.
  • ExoQuick kit Isolation of exosomes using the ExoQuick kit. It was separated according to the instructions provided by the manufacturer of the kit using the standard exosome sample. Briefly, the purchased exosome samples (25 ⁇ g/ml; 1 ml each) were transferred into separate microwells, and then a predetermined amount of ExoQuick exosome precipitation solution was added. After mixing, it was refrigerated at 4° C. and then centrifuged. After removing the supernatant, the exosomes precipitated in the form of granules were recovered, re-dissolved in a buffer solution (500 ⁇ l), and then immunoassays were performed as previously described to determine the Cav1/CD9 ratio.
  • the beads were washed three times with a washing solution (150 mM NaCl, 0.05% Tween20, and 20 mM Tris-HCl (pH 7.4; 1 mL) containing 2 mM CaCl2), and the eluate solution (150 mM NaCl and 2 mM EDTA) Was eluted with 20 mM Tris-HCl (pH 7.4)), and an immunoassay was performed to determine the Cav1/CD9 ratio for the recovered exosome samples.
  • a washing solution 150 mM NaCl, 0.05% Tween20, and 20 mM Tris-HCl (pH 7.4; 1 mL) containing 2 mM CaCl2
  • the eluate solution 150 mM NaCl and 2 mM EDTA
  • Exosomal samples were also isolated using other commercially available kits. Briefly, the XBP buffer (1 ml) provided with the kit was added to the same volume of sample. After mixing gently, the mixture was allowed to stand at room temperature and preheated to room temperature. The mixture was transferred into an exoEasy spin column and centrifuged for 1 minute. XWP buffer solution (10 ml) was sequentially added to the column, followed by centrifugation for 5 minutes to remove the buffer solution. After transferring the spin column to a new recovery tube, an XE buffer solution (500 ⁇ l) was added to the column and reacted for 1 minute.
  • the exosomes were eluted by centrifugation for an additional 5 minutes and collected in a tube. Finally, the eluate was re-injected into the spin column, reacted for 1 minute, and centrifuged for 5 minutes to recover the eluate. The recovered solution was subjected to an immunoassay to determine the Cav1/CD9 ratio as mentioned above.

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Abstract

본 발명은 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 시스템 및 방법에 관한 것으로, 본 발명의 실시예에 따른 친화 분리 시스템은, 리간드(10), 상기 리간드(10)가 탈착 가능하게 결합되고, 상기 리간드(10)와 결합 반응하여 구조가 변하는 바인더(20), 구조가 변한 바인더(20)와 특이적으로 결합하는 인식소재(30), 바인더 (20) 및 인식소재(30) 중 어느 하나가 표면에 고정되는 고정 부재(40), 및 바인더 (20) 및 인식소재(30) 중 다른 하나와 중합되어 중합체(C)를 형성하고, 샘플 용액 내의 목표 아집단 대상물질(1)과 특이적으로 결합하는 포획소재(50)를 포함한다.

Description

스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 시스템 및 방법
본 발명은 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 시스템 및 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 샘플 내 소정의 대상성분을 아집단으로 분리하는 기술에 관한 것이다.
최근에, 암 질환 및 퇴행성 질환 등 특정 질환 검사의 고통을 최소화하고 조기진단을 구현하기 위한 '액체 생검(liquid biopsy)' 개념이 소개되었다. 액체 생검은 비침습적인 방법으로 비교적 간편하게 혈액, 타액, 소변 등 체액을 추출하여 특정 질환 관련 세포 혹은 이로부터 유출된 구성성분(펩타이드, 단백질, 핵산, 소기관, 특정물질 등)에 대한 분석을 실시하는 방법이다. 이를 통해 특정 질환 발생 여부를 조기에 확인할 수 있기 때문에, 기존의 영상진단과 조직검사 그리고 혈액검사 방법 등과 같은 검사방법의 대안으로 주목받고 있다. 특히, 인체 내 세포에서 미세소포(microvesicle) 형태로 분비되어 그 유래 세포의 특징을 그대로 반영하고 있는 엑소좀은 세포의 '아바타'라고 불리며, 혈액, 타액, 소변 등 다양한 체액에서 추출이 가능하다. 엑소좀은 지질 이중층으로 되어있는 소포체이기 때문에 체내에서 안정적일 뿐만 아니라, protease, RNase, DNase 등의 공격으로부터 자유롭다. 따라서, 엑소좀을 암 질환 및 퇴행성 질환 등 특정 질환 진단의 새로운 바이오마커로 이용하려는 연구가 증가하고 있으며, 실제로 엑소좀을 이용한 암의 조기진단 목적의 제품들이 개발되고 있다.
하지만, 체액에는 모든 세포에서 유래된 엑소좀이 혼합된 형태로 존재하기 때문에, 단순히 체액에서 분리된 벌크 모집단(bulk population) 형태의 엑소좀 샘플로는 암 등 특정 질환을 정확하게 진단하기에 한계가 있다. 더욱이 질환 발병 초기에는 체액 내 특정 질환 관련 세포 유래의 엑소좀 농도가 상대적으로 매우 낮아서, 조기진단을 위해서는 체액으로부터 타겟 엑소좀의 분리 및 농축이 선행되어야 한다. 현존하는 엑소좀 분리 기술 중, 밀도 차이 기반의 초원심분리 방법이 재현성이 높으며 비교적 안정된 공정으로 인해 최상위 표준(gold standard) 분리과정으로 채택되고 있다. 그러나 고가의 장비가 반드시 필요하고 분리 시간이 오래 걸린다는 단점이 있다. 이러한 단점을 보완하기 위해, 엑소좀을 침전시켜 분리하는 방법, size exclusion chromatography를 이용하거나, 특허문헌 한국등록특허 제10-1807256호에 개시된 바와 같이 microfluidics를 이용하여 크기에 따라 분리하는 방법들이 개발되었다.
그러나 이와 같은 기존의 엑소좀 분리 기술들은 체액에 존재하는 모든 엑소좀을 하나의 모집단 형태로 제공하기 때문에, 암과 같은 특정 세포에서 유래된 극미량의 엑소좀을 선택적으로 탐지하는데 한계가 있다.
이에 종래 세포나 세포 유래 구성성분을 분리하는 기술의 문제점을 해결하기 위한 방안이 절실히 요구되고 있는 상황이다.
본 발명은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 결합 단백질 등과 같은 바인더가 리간드와 결합하여 야기되는 바인더의 구조변화(conformation change)를 특이하게 인식하는 인식소재를 이용하여, 용액 내 리간드 유무에 따라 신속하게 바인더-인식소재 결합 혹은 각개 성분으로 해리되는 스위치 성 부착반응(switch-like reversible binding)에 기반하여 분리 대상 아집단을 고수율 및 본래의 상태로 친화 분리하는 기술을 제공하는 데 있다.
본 발명의 실시예에 따른 친화 분리 시스템은 리간드; 상기 리간드가 탈착 가능하게 결합되고, 상기 리간드와 결합 반응하여 구조가 변하는 바인더; 구조가 변한 상기 바인더와 특이적으로 결합하는 인식소재; 상기 바인더 및 상기 인식소재 중 어느 하나가 표면에 고정되는 고정 부재; 및 상기 바인더 및 상기 인식소재 중 다른 하나와 중합되어 중합체를 형성하고, 샘플 용액 내의 목표 아집단 대상물질과 특이적으로 결합하는 포획소재;를 포함한다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 친화 분리 시스템에 있어서, 상기 리간드는, 당 분자, 이온, 기질, 및 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 친화 분리 시스템에 있어서, 상기 바인더는, 당 결합단백질, 이온 결합단백질, 효소, 항체, 앱타머, 세포 수용체, 및 나노 구조체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 친화 분리 시스템에 있어서, 상기 인식 소재는, 항체, 단백질 수용체, 세포 수용체, 앱타머, 효소, 나노입자, 나노 구조체, 및 중금속 킬레이트제(chelator)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 친화 분리 시스템에 있어서, 상기 고정 부재는, 하이드로 젤, 자성비드, 라텍스 비드, 글라스 비드, 나노금속 구조체, 세공성 멤브레인, 및 비세공성 멤브레인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 친화 분리 시스템에 있어서, 내부에 상기 고정 부재를 수용하는 반응기;를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 친화 분리 시스템에 있어서, 결합된 상기 리간드가 탈착될 때에, 결합된 상기 바인더와 상기 인식소재가 서로 분리될 수 있다.
또한, 본 발명의 실시에에 따른 친화 분리 시스템에 있어서, 상기 목표 아집단 대상물질과 결합한 상기 고정 부재는, 자력, 중력, 및 원심력 중 어느 하나 이상에 의해 농축될 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 친화 분리 시스템에 있어서, 상기 샘플 용액은 체액을 포함하고, 상기 목표 아집단 대상물질은, 상기 체액 내의 이종 벌크집단으로부터 분리되는 물질일 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 친화 분리 시스템에 있어서, 상기 이종 벌크집단은, 소정의 질환 진단에 사용되는 세포, 엑소좀, DNA, RNA, 단백질, 지질, 당, 및 대사 성분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개 이상을 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 실시예에 따른 친화 분리 방법은 (a) 리간드가 함유된 리간드 용액, 상기 리간드와 탈착 가능하게 결합 반응하여 구조가 변하는 바인더, 구조가 변한 상기 바인더와 특이적으로 결합하는 인식소재, 및 상기 바인더 및 상기 인식소재 중 어느 하나와 중합되어 중합체를 형성하는 포획소재를 반응시켜, 상기 바인더 및 상기 인식소재 중 다른 하나와, 상기 중합체를 결합시키는 단계; (b) 상기 포획소재가 특이적으로 결합하는 목표 아집단 대상물질을 포함하는 샘플 용액을 첨가하여, 상기 중합체의 상기 포획소재와 상기 목표 아집단 대상물질을 결합시키는 단계; 및 (c) 상기 바인더에 결합된 상기 리간드가 탈착되도록, 상기 리간드가 비함유된 회수용액을 첨가하여, 상기 인식소재 및 상기 바인더 중 다른 하나로부터, 상기 목표 아집단 대상물질과 결합된 상기 중합체를 분리하는 단계;를 포함한다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 친화 분리 방법에 있어서, 상기 (a)단계는, 상기 바인더 및 상기 인식소재 중 다른 하나를 고정 부재의 표면에 고정시키는 단계; 및 상기 중합체가 용해된 상기 리간드 용액을, 상기 고정 부재에 첨가하여, 상기 고정 부재에 고정된 상기 바인더 및 상기 인식소재 중 다른 하나와, 상기 중합체를 결합시키는 단계;를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 친화 분리 방법에 있어서, 상기 (b) 단계와 상기 (c) 단계 사이에, 자력, 중력, 및 원심력 중 어느 하나 이상을 이용해, 상기 목표 아집단 대상물질과 결합된 상기 고정 부재를, 상기 리간드 용액 및 상기 샘플 용액이 혼합된 혼합용액 내의 소정의 공간 영역에 포획하는 단계; 및 상기 고정 부재가 미함유된 상기 혼합용액의 일부를 제거하여, 상기 목표 아집단 대상물질을 농축하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 친화 분리 방법에 있어서, 상기 샘플 용액은 체액을 포함하고, 상기 목표 아집단 대상물질은, 상기 체액 내의 이종 벌크집단으로부터 분리되는 물질일 수 있다.
또한, 본 발명의 실시예에 따른 친화 분리 방법에 있어서, 상기 이종 벌크집단은, 소정의 질환 진단에 사용되는 세포, 엑소좀, DNA, RNA, 단백질, 지질, 당, 및 대사 성분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점들은 첨부도면에 의거한 다음의 상세한 설명으로 더욱 명백해질 것이다.
이에 앞서 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이고 사전적인 의미로 해석되어서는 아니되며, 발명자가 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
본 발명에 따르면, 특정 질환과 관련된 생체 대상성분을 가혹하지 않은 조건하에서 아집단으로 분리할 수 있고, 분리된 대상성분 아집단을 액체 생검샘플로 이용하여 암 질환 및 퇴행성 질환 등 특정 질환 진단을 고감도로 실시할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 시스템의 구성도이다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 시스템의 구성도이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 방법의 순서도이다.
도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 방법의 순서도이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 방법을 이용하여 흑색종 암세포와 관련된 엑소좀 아집단을 분리하는 공정을 도시한 순서도이다.
도 6은 본 발명에 따른 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 시스템 및 방법을 이용하여 샘플 내 CD63+ 엑소좀을 면역 친화 크로마토그래피 공정으로 분리한 결과이다.
도 7은 도 6의 면역 친화 크로마토그래피 공정을 반복적으로 이용하여 엑소좀 분리 시 재현성을 나타낸 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 시스템 및 방법을 이용하여 샘플 내 CD63+ 엑소좀을 면역 자성분리 공정으로 분리 및 농축한 결과이다.
도 9는 도 8의 면역 자성분리 공정을 반복적으로 실시하는 경우의 CD63+ 엑소좀 분리 시 재현성을 나타낸 결과이다.
도 10은 본 발명에 따른 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 시스템 및 방법을 이용하여 분리된 CD63+ 엑소좀에 대한 물리적 특성화 결과이다.
도 11은 본 발명에 따른 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 시스템 및 방법을 이용하여 분리된 CD63+ 엑소좀 샘플들의 엑소좀 표면마커에 대한 특성화 결과이다.
도 12는 엑소좀 표준샘플들 간 농도변이를 보상히기 위해 CD9 농도를 기준으로 Cav1 마커 농도를 보정한 결과이다.
도 13은 본 발명에 따른 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 시스템 및 방법을 이용하여 분리한 CD63+ 엑소좀을 분석샘플로 이용 시 흑색종 암 진단에 대한 잠재적 효과를 나타낸 결과이다.
도 14는 본 발명에 따른 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 시스템과 현재 상업적으로 판매되는 다양한 엑소좀 분리 시스템들 간에, 분리된 샘플의 면역 분석에 의해 결정된 Cav1/CD9 농도비율을 기준으로, 흑색종 암 샘플을 정상 샘플로부터 구분해내는 성능에 대한 비교 결과이다.
본 발명의 목적, 특정한 장점들 및 신규한 특징들은 첨부된 도면들과 연관되어지는 이하의 상세한 설명과 바람직한 실시예들로부터 더욱 명백해질 것이다. 본 명세서에서 각 도면의 구성요소들에 참조번호를 부가함에 있어서, 동일한 구성 요소들에 한해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 번호를 가지도록 하고 있음에 유의하여야 한다. 또한, "제1", "제2" 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위해 사용되는 것으로, 구성요소가 상기 용어들에 의해 제한되는 것은 아니다. 이하, 본 발명을 설명함에 있어서, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 관련된 공지 기술에 대한 상세한 설명은 생략한다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시형태를 상세히 설명하기로 한다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 스위치 성 부착반응을 이용한 친화분리 시스템의 구성도이고, 도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 시스템의 구성도이다.
도 1 내지 도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 친화 분리 시스템은, 리간드(10), 상기 리간드(10)가 탈착 가능하게 결합되고, 상기 리간드(10)와 결합 반응하여 구조가 변하는 바인더(20), 구조가 변한 바인더(20)와 특이적으로 결합하는 인식소재(30), 바인더(20) 및 인식소재(30) 중 어느 하나가 표면에 고정되는 고정 부재(40), 및 바인더(20) 및 인식소재(30) 중 다른 하나와 중합되어 중합체(C)를 형성하고, 샘플 용액 내의 목표 아집단 대상물질(1)과 특이적으로 결합하는 포획소재(50)를 포함한다.
본 발명은 샘플 내 소정의 대상성분을 아집단으로 분리하는 기술에 관한 것이다. 특정 질환 발생 여부를 조기에 확인하는 진단 방법으로서, 혈액, 타액, 소변 등 체액을 추출하여 특정 질환 관련 세포 혹은 이로부터 유출된 구성성분(펩타이드, 단백질, 핵산, 소기관, 특정물질 등)에 대한 분석을 실시하는 '액체 생검(liquid biopsy)'이 있다. 특히, 체액에서 추출되는 엑소좀(exosome)을 암 질환 및 퇴행성 질환 등 특정 질환 진단의 새로운 바이오마커로 이용하는 기술이 최근 연구되고 있다. 다만, 체액에는 모든 세포에서 유래된 엑소좀이 혼합된 형태로 존재하기 때문에, 단순히 체액에서 분리된 벌크 모집단(bulk population) 형태의 엑소좀 샘플로는 암과 같은 특정 질환을 정확하게 진단하는데 한계가 있으므로, 타겟 엑소좀의 분리 및 농축 기술이 요구된다. 종래 엑소좀 분리 기술로는 초원심분리, 침전 분리, 크기배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography) 또는 미세유체공학(microfluidics)를 이용하여 분리하는 방법이 있지만, 이러한 종래 기술들은 체액에 존재하는 모든 엑소좀을 하나의 모집단 형태로 제공하기 때문에, 암과 같은 특정 세포에서 유래된 극미량의 엑소좀을 선택적으로 탐지하는데 한계가 있다.
이에 본 발명은 엑소좀 표면에 암과 상관성이 높은 단백질 마커들, 예를 들면 흑색종 암의 경우 Caveolin 1 (Cav1), 위암의 경우 HER-2/neu, 그리고 난소암의 경우 L1CAM이 존재하는 점에 착안하여, 특정 마커에 대한 면역 친화 분리방법을 채용함으로써, 특정 엑소좀 아집단을 분리하고자 한다. 다만, 체액 내 극미량의 엑소좀을 기존의 일반적인 공정으로 분리하고 탐지하기에는 탐지한계의 극복 및 재현성 유지 측면에서 매우 어렵다. 실제로, 고상 모체에 포획된 특정 엑소좀을 해리시키기 위해서는 산성 pH 혹은 계면활성제의 포함과 같은 가혹 조건을 사용해야 하므로, 엑소좀의 손상 및 수율의 감소가 초래되는 문제점이 여전히 존재하기 때문이다. 이에 본 발명은 샘플로부터 목표 아집단을 고수율 및 원래의 상태로 회수할 수 있도록 가혹 조건을 사용하지 않는 친화 분리 기술을 구현하고자 안출되었다.
여기서, 샘플은 액체 생검에 필요한 체액으로서, 목표 아집단 대상 물질(1)은 엑소좀일 수 있지만, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 체액이 반드시 액체 생검에 활용되는 경우에만 한정될 것은 아니고, 샘플은 목표 아집단 대상물질(1)을 포함하는 어떠한 종류의 샘플이어도 무방하다. 또한, 목표 아집단 대상물질(1)은 세포나 세포 유래 구성성분 등과 같이 본 발명에 따라 분리 가능한 물질이기만 하면 특별한 제한은 없다.
구체적으로, 본 발명에 따른 친화 분리 시스템은, 리간드(10), 바인더(20), 인식소재(30), 고정 부재(40), 및 포획소재(50)를 포함한다.
여기서, 리간드(10)는 바인더(20)에 탈착 가능하게 결합되는 물질로서, 당 분자, 이온, 기질, 및 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
바인더(20)는 리간드(10)와의 결합 반응을 통해 구조변화(conformation change)가 야기되는 물질이다. 이러한 바인더(20)는 당 결합단백질, 이온 결합단백질, 효소, 항체, 앱타머, 세포 수용체, 및 나노 구조체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 따라서, 바인더(20) 및 리간드(10)는 당 결합단백질-당 분자 쌍, 이온 결합단백질-이온 쌍, 효소-기질 쌍, 항원-항체 쌍, 앱타머(aptamer)-리간드 쌍, 세포 수용체-리간드 쌍, 나노 구조체-리간드 쌍 등과 같은 바인더-리간드 쌍을 이룰 수 있고, 가장 대표적인 바인더(20)와 리간드(10)의 예로는, 칼슘 결합단백질(calcium binding protein, CBP)과 칼슘 이온을 들 수 있다. 다만, 바인더(20) 및 리간드(10)가 반드시 상기 물질에 한정되는 것은 아니고, 서로 탈착 가능하게 결합하여 구조변화를 일으키는 물질이기만 하면 어떠한 것이라도 무방하다.
인식소재(30)는 리간드(10)와 결합하여 구조가 변한 바인더(20)와 특이적으로 결합하는 물질로서, 항체, 단백질 수용체, 세포 수용체, 앱타머, 효소, 나노입자, 나노 구조체, 및 중금속 킬레이트제(chelator)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 다만, 상기 물질은 인식소재(30)의 일례에 불과하므로 반드시 이에 한정하여 본 발명의 권리범위가 정해져서는 안된다. 구체적 실시예로, 리간드(10), 바인더(20) 및 인식소재(30) 사이의 결합 반응을 설명하면, 칼슘 이온(리간드)이 칼슘 결합단백질(바인더)과 1차 결합하여 칼슘 결합단백질의 구조변화가 야기되고, 구조가 변한 칼슘 결합단백질과 항체(인식소재) 사이에 항원-항체 반응이 일어나 서로 결합된다.
여기서, 바인더(20) 및 인식소재(30) 중 어느 하나는 고정 부재(40)에 고정되고, 그 중 다른 하나는 포획소재(50)와 중합되어 중합체(C)를 형성한다. 즉, 도 1과 같이 고정 부재(40)상에 인식소재(30)가 고정되고, 바인더(20)와 포획소재(50)가 중합되어 바인더-포획소재 중합체(C)를 형성하는 경우(제1 실시예, 후술하는 실시예 2 및 실시예 3 참조), 도 2와 같이 고정 부재(40) 상에 바인더(20)가 고정되고, 인식소재(30)와 포획소재(50)가 중합되어 인식소재-포획소재 중합체(C)를 형성하는 경우(제2 실시예)로 구분할 수 있다.
각각의 상기 실시예에 있어서, 고정 부재(40)는 표면에 바인더(20) 또는 인식소재(30)를 결합 고정하는 부재로서, 하이드로 젤(실시예 2 참조), 자성비드(실시예 3 참조), 라텍스 비드, 글라스 비드, 나노금속 구조체, 세공성 멤브레인, 및 비세공성 멤브레인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 다만, 고정 부재(40)가 반드시 상기에 한정되는 것은 아니고, 바인더(20) 또는 인식소재(30)와 결합될 수 있는 소재이면 특별한 제한이 없다. 포획소재(50)는 바인더(20) 또는 인식소재(30)와 중합되고, 샘플 용액 내의 목표 아집단 대상물질(1)과 특이적으로 결합되는 항체와 같은 물질이다. 이러한 항체 등의 포획소재(50)는 목표 아집단 대상물질(1)의 표면 단백질과 같은 타겟 마커(P)와 항원-항체 반응 등을 통해 특이적으르 결합될 수 있다.
따라서, 상기 제1 실시예의 경우에는, 고정 부재(40) 상에 인식소재(30)가 고정되고, 리간드(10)가 결합되어 구조가 변한 바인더(20)가 인식소재(30)와 결합하며, 바인더(20)와 중합된 포획소재(50)가 목표 아집단 대상물질(1)과 특이적으로 결합하여, 샘플 용액 내의 목표 아집단 대상물질(1)을 포획한다. 이때, 바인더(20)와 포획소재(50)가 서로 중합된 상태에서, 즉 바인더-포획소재 중합체(C)로서 바인더(20)가 리간드(10)와 결합되거나, 또는 바인더(20)가 리간드(10)와 먼저 결합하고 이후에 바인더(20)와 포획소재(50)가 서로 중합될 수 있다.
제2 실시예의 경우에는, 고정 부재(40) 상에 바인더(20)가 고정되고, 리간드(10)가 결합되어 구조가 변한 바인더(20)와 인식소재(30)가 서로 결합하며, 인식소재(30)와 중합된 포획소재(50)가 목표 아집단 대상물질(1)과 특이적으로 결합하여, 샘플 용액 내의 목표 아집단 대상물질(1)을 포획한다. 이때, 인식소재(30)와 포획소재(50)가 중합된 인식소재-포획소재 중합체(C)가 바인더(20)와 결합하거나, 또는 인식소재(30)가 먼저 바인더(20)와 결합한 후에 포획소재(50)와 중합될 수 있다.
한편, 상기 제1 및 제2 실시예에서, 각각의 결합 반응은 내부에 고정 부재(40)를 수용하는 반응기(도시되지 않음) 내에서 이루어질 수 있다. 이때, 반응기 내부에서는 인식소재(30), 바인더(20), 및 포획소재(50)를 매개로, 고정 부재(40)와 목표 아집단 대상물질(1)이 서로 결합하게 된다. 여기서, 자력, 중력, 및 원심력 중 어느 하나 이상을 이용해 목표 아집단 대상물질(1)을 농축할 수 있다. 예를 들어, 자성비드를 고정 부재(40)로 사용하는 경우, 자석을 이용해 목표 아집단 대상물질(1)과 결합된 고정 부재(40)를 포획한 상태에서 상층액을 제거하고 자성비드를 제거함으로써 농축이 가능하다.
한편, 전술한 바와 같이, 샘플 용액 내의 목표 아집단 대상물질(1)을 포획한 다음에는, 이를 회수해야 하는데, 여기서 바인더(20)에 결합된 리간드(10)를 탈착시킴으로써 구조가 변한 바인더(20)를 원상태로 회복시켜, 결합된 바인더(20)와 인식소재(30)를 서로 분리하는 방식을 취할 수 있다. 이때, 리간드(10)가 함유되지 않은 회수용액을 주입하여 리간드(10)를 탈착시킬 수 있다.
상기와 같이 구현된 본 발명의 친화 분리 시스템은 체액으로부터 암질환이나 퇴행성 질환 등과 같은 특정 질환과 관련된 세포나 세포 유래 구성성분을 분리하고 회수하는데 이용될 수 있다. 이 경우, 체액을 포함하는 샘플 용액을 사용하는데, 그 체액 내에는 이종 벌크집단이 존재하므로, 그 이종 벌크집단으로부터 필요한 목표 아집단 대상물질(1)을 상기 친화 분리 시스템을 이용하여 분리 회수한다. 이때, 이종 벌크집단은 소정의 질환 진단에 사용되는 세포, 엑소좀, DNA, RNA, 단백질, 지질, 당, 및 대사 성분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개 이상을 포함할 수 있다.
종합적으로, 본 발명은 칼슘 결합단백질과 같은 바인더(20)가 이와 특이하게 반응하는 칼슘이온과 같은 리간드(10)와 결합하여 야기되는 구조변화를 특이하게 인식하는 항체 등 인식소재(30)의 이용에 기반한다. 이러한 항원-항체 반응과 같은 바인더(20)-인식소재(30) 반응은 칼슘이온과 같은 리간드(10) 유무에 따라 신속하게 결합 혹은 해리되어 마치 스위치를 조작하여 불을 켜고 끄는 원리와 유사하기 때문에 '스위치 성 가역 부착반응 (switch-like reversible binding)'으로 묘사된다. 이러한 본 발명에 따르면, 새로운 가역성 항원-항체 반응과 같은 부착반응을 이용하여 타겟 마커를 포함한 대상 아집단을 가혹하지 않은 조건에서 고효율로 분리 및 농축할 수 있다. 즉, 항원-항체 반응에 의해 결합된 엑소좀과 같은 목표 아집단 대상물질을 고상 비드의 표면으로부터 회수하기 위해서 산성 pH와 같은 가혹한 조건을 사용하는 방식과 비교할 때에 엑소좀 등의 구조적 원형을 유지할 수 있고 또한 고수율의 회수가 가능하다.
이하에서는 본 발명에 따른 친화 분리 시스템을 이용한 친화 분리방법에 대해 설명한다. 친화 분리 시스템에 대해서는 상술하였는바, 중복되는 사항에 대해서는 설명을 생략하거나 간단하게만 기술한다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 스위치 성 부착반응을 이용한 친화분리 방법의 순서도이고, 도 4는 본 발명의 다른 실시예에 따른 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 방법의 순서도이다.
도 3 내지 도 4에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 친화 분리 방법은, (a)리간드(10)가 함유된 리간드 용액, 리간드(10)와 탈착 가능하게 결합 반응하여 구조가 변하는 바인더(20), 구조가 변한 바인더(20)와 특이적으로 결합하는 인식소재(30), 및 바인더(20) 및 인식소재(30) 중 어느 하나와 중합되어 중합체(C)를 형성하는 포획소재(50)를 반응시켜, 바인더(20) 및 인식소재(30) 중 다른 하나와, 중합체(C)를 결합시키는 단계(S100), (b) 포획소재(50)가 특이적으로 결합하는 목표 아집단 대상물질(1)을 포함하는 샘플 용액을 첨가하여, 중합체(C)와 목표 아집단 대상물질(1)을 결합시키는 단계(S200), 및 (c) 바인더(20)에 결합된 리간드(10)가 탈착되도록, 리간드(10)가 비함유된 회수용액을 첨가하여, 인식소재(30) 및 바인더(20) 중 다른 하나로부터, 목표 아집단 대상물질(1)과 결합된 중합체(C)를 분리하는 단계(S300)를 포함한다.
샘플 용액 내에서 목표 아집단 대상물질(1)을 분리하고 회수하기 위해서, 먼저 리간드 용액, 바인더(20), 인식소재(30), 및 포획소재(50)를 반응시킨다(S100). 이때, 바인더(20) 및 인식소재(30) 중 어느 하나는 포획소재(50)와 중합되어 중합체(C)를 형성하고, 다른 하나는 그 중합체(C)와 결합한다. 여기서, 리간드 용액 내에 함유된 리간드(10)가 바인더(20)에 결합되어 바인더(20)의 구조변화가 야기되고, 구조가 변한 바인더(20)를 인식소재(30)가 특이적으로 인식하여 결합한다.
즉, 도 3을 참고로, 전술한 제1 실시예와 같이, 바인더(20)와 포획소재(50)가 중합되어 바인더-포획소재 중합체(C)가 형성되고, 바인더(20)는 리간드 용액 첨가에 의해 구조변화가 야기되므로, 인식소재(30)가 바인더(20)와 결합할 수 있다. 이때, 바인더(20) 및 포획소재(50)는 중합체(C)가 형성된 상태로 첨가되거나, 또는 개별적으로 첨가되어 중합체(C)를 형성할 수 있다. 일실시예로서, 인식소재(30)를 고정 부재(40)의 표면에 고정시키고, 바인더-포획소재 중합체(C)가 용해된 리간드 용액을 고정 부재(40)에 첨가함으로써, 인식소재(30)와 중합체(C)를 결합시킬 수 있다.
또한, 도 4를 참고로, 전술한 제2 실시예와 같이, 인식소재-포획소재 중합체(C)가 형성되고, 리간드 용액에 의해 구조가 변한 바인더(20)가 중합체(C)의 인식소재(30)와 결합할 수 있다. 이때에도 인식소재(30) 및 포획소재(50)는 중합체(C) 상태로 첨가될 수 있지만, 개별적으로 첨가되어 중합체(C)를 형성할 수도 있다. 일예로서, 바인더(20)를 고정 부재(40)의 표면에 고정시키고, 인식소재-포획소재 중합체(C)가 용해된 리간드 용액을 고정 부재(40)에 첨가함으로써, 바인더(20)와 중합체(C)를 결합시킬 수 있다.
다음, 목표 아집단 대상물질(1)을 포함하는 샘플 용액을 첨가한다(S200). 이때, 중합체(C)의 포획소재(50)가 목표 아집단 대상물질(1)과 특이적으로 결합하게 된다. 여기서, 샘플 용액은 체액을 포함할 수 있고, 이때 목표 아집단 대상물질(1)은 상기 체액 내의 이종 벌크집단으로부터 분리된다. 여기서, 이종 벌크집단은 조성의 질환 진단에 사용되는 세포, 엑소좀, DNA, RNA, 단백질, 지질, 당, 및 대사 성분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개 이상을 포함할 수 있으므로, 일례로 엑소좀을 포함하는 이종 벌크집단에서 엑소좀을 목표 아집단 대상물질(1)로 분리할 수 있다.
이후에, 회수용액을 첨가한다(S300). 회수용액은 리간드(10)를 함유하지 않은 리간드(10) 비함유 용액으로서, 회수용액이 첨가되면 바인더(20)에 결합된 리간드(10)가 탈락하게 되고, 이로 인해 바인더(20)의 변화된 구조가 원래 상태로 회복되면서 바인더(20)와 인식소재(30) 사이의 결합이 해제된다. 따라서, 목표 아집단 대상물질(1)과 결합된 중합체(C)가, 인식소재(30)로부터 분리되거나(제1 실시예 및 도 3 참조), 또는 바인더(20)로부터 분리되므로(제2 실시예 및 도 4 참조), 최종적으로 목표 아집단 대상물질(1)을 회수할 수 있다. 이때, 목표 아집단 대상물질(1)은 중합체(C)와 함께 회수되고, 고정 부재(40) 상에는 초기와 같은 형태로 인식소재(30)가 고정되거나(제1 실시예 및 도 3 참조), 바인더(20)가 고정되므로(제2 실시예 및 도 4 참조), 인식소재(30) 또는 바인더(20)가 고정된 고정 부재(40)를 활용해 새로운 샘플 용액을 분리할 수도 있다.
한편, 샘플용액을 첨가한 후, 회수용액을 첨가하기 전에, 목표 아집단 대상물질(1)을 농축할 수 있다. 구체적으로, 자력, 중력, 및 원심력 중 어느 하나 이상을 이용해, 목표 아집단 대상물질(1)과 결합된 고정 부재(40)를, 리간드 용액 및 샘플 용액이 혼합된 혼합용액 내의 소정의 공간 영역에 포획한다. 다음에, 고정 부재(40)가 미함유된 혼합용액의 일부(예를 들어, 상층액)를 제거함으로써, 목표 아집단 대상물질(1)을 농축할 수 있다.
상기의 공정은 반응기에서 이루어질 수 있는데, 반응기 내부에 인식소재(30) 또는 바인더(20)가 고정된 고정 부재(40)를 충진시키고, 여기에 리간드 용액, 중합체(C), 샘플 용액 등을 첨가한다. 여기서, 반응기는 크로마토그래피 칼럼으로서 크로마토그래피 방식으로 결합 및 탈착 반응을 수행하거나, 회분 용기로서 회분(batch) 방식으로 반응을 수행하고, 자력, 중력, 또는 원심력을 이용하여 분리하는 공정을 수행할 수 있다.
일례로, 본 발명은 특정 질환 진단을 위한 액체 생검 시 체액 내의 엑소좀 아집단을 분리 농축하는 기술로 활용될 수 있는바, 이하에서는 도 5를 참고로, 본 발명을 이용하여 엑소좀 아집단을 분리하는 공정에 대해 설명한다. 도 5는 본 발명의 실시예에 따른 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 방법을 이용하여 흑색종 암세포와 관련된 엑소좀 아집단을 분리하는 공정을 도시한 순서도이다.
체액 내 엑소좀을 이용한 액체 생검 시, 단순히 농축한 벌크 모집단 형태의 샘플에서 검사대상 질병에 선택적으로 분리된 엑소좀(disease relevant exosome) 샘플의 사용은 진단 정확도를 향상시킬 수 있다. 이러한 접근법을 실험적으로 예시하기 위해, 멜라닌 생성세포에서 발생하는 피부암인 흑색종 암을 대상으로 선택하였다. 참고로, 흑색종 암은 악성도가 가장 높으며 전이율이 높아서 생존률을 높이기 위해 신속하고 정확한 진단이 필요한 질병이다. 과거 한 연구에 따르면, 엑소좀의 표면 단백질인 Caveolin 1 (Cav1)은 정상인에 비해 흑색종 암 환자의 혈액에서 현저하게 증가하여서 Cav1 양성 (Cav1+) 엑소좀 기반의 진단 민감도는 68%로 다른 흑색종 암 마커인 CD63 기반 진단민감도인 43%보다 상대적으로 높다. 이러한 액체 생검의 성능 향상을 통해 임상에 이용하기 위해서는 타켓 엑소좀의 선택적인 분리 및 농축이 필요하지만, 체액 내 전체 엑소좀 중 그 비율이 매우 낮기 때문에 기존에 알려진 일반적인 공정으로는 실현하기 어렵다.
따라서, 본 발명은 체액 내 엑소좀을 선택적으로 분리하여 Cav1+ 엑소좀을 함유한 아집단을 획득하고, 이를 검사 샘플로 이용하여 흑색종 암 진단 정확도 및 민감도를 증가시키는 방법으로 활용하고자 한다. 엑소좀 분리 시 그 수율과 재현성을 고려하여 Cav1+ 엑소좀을 분리대상으로 타겟팅하지 않고 암 발생과 연관성 있는 그 상위 엑소좀 집단을 분리대상으로 삼았다. 예를 들어, 다른 표면 단백질과 비교하여 일반적인 엑소좀에 많이 존재하는 house-keeping protein인 CD63 단백질은 흑색종 암을 포함한 몇 가지 암 발생 시에 엑소좀 표면에 증가되어 발현되므로, 이 표면단백질을 분리 매개체로 이용하는 기술이다. 실제로, 엑소좀 표면단백질 CD63+ 엑소좀을 흑색종 암에 대한 진단 마커로 이용 시 그 민감도가 43%로서 엑소좀 표면단백질 Cav1+ 이용 시보다 낮은 것으로 보고되고 있지만, 분리된 CD63+ 엑소좀 아집단에 Cav1+ 엑소좀이 포함된다면 이를 검사 샘플로 이용한 흑색종 암 진단의 민감도는 벌크 모집단 샘플의 이용 시보다 훨씬 증가될 것이라고 가정할 수 있다 (도 5의 상단 참조).
표면 단백질 마커에 따른 엑소좀 분리를 위해, 타켓 마커에 특이한 항체를 이용한 면역분리 방법을 적용할 수 있다. 이 방법에 의하면, 엑소좀 샘플을 자성비드나 젤비드와 같은 고체표면에 고정된 항체와 반응시킨 후 해리시켜 타겟 엑소좀을 분리할 수 있다. 항원-항체 반응은 선택성이 매우 높기 때문에 현존하는 다른 분리방법 (예를 들어, 초원심분리, 가속 침강, 크기에 따른 분리 등)에 비해, 표면 단백질에 연관된 엑소좀을 분리하기에는 더 적합하다. 하지만, 항원-항체 반응에 의해 결합된 엑소좀을 고체표면으로부터 회수하기 위해서는 산성 pH와 같은 가혹한 조건을 사용해야 하는데 이 경우 엑소좀에 손상을 줄 수 있고 또한 고수율의 회수가 어렵다는 문제점이 있다. 그러나 본 발명에 따르면 새로운 가역성 항원-항체 반응과 같은 부착반응을 이용하여 타겟 마커를 포함한 엑소좀 아집단을 가혹하지 않은 조건에서 고효율로 분리 및 농축할 수 있다.
본 발명에 따른 일실시예에 따라, 엑소좀을 분리하기 위해서는 가역적 인식소재를 고체표면(Bead surface)에 고정시키고(도 5의 Ⅰ), 칼슘결합단백질(CBP)은 엑소좀 표면 단백질(예: CD63)에 대한 특이항체와 biotin-streptavidin linkage를 통해 중합한다(CBP-포획항체 중합체). 고정된 가역적 인식소재에 칼슘이온(예 >10 mM Ca 2+)이 포함된 용액에 용해된 CBP-포획항체 중합체를 첨가하면 '스위치 켬' 인식반응에 의해 중합체는 고체표면에 고정된다(도 5의 Ⅱ). 동일한 용액에 준비된 벌크 엑소좀 시료를 순차적으로 첨가하면 CD63 마커 포함 엑소좀이 고체표면의 포획항체와 반응하여 포획된다(도 5의 Ⅲ). 동일 용액으로 세척 후, 칼슘이 제거된 엑소좀 회수용액을 첨가하면, CBP와 결합되었던 칼슘이온이 탈착되어 '스위치 끔' 상태가 되므로 포획되었던 엑소좀을 포획항체와 결합된 상태로 용액 내로 회수할 수 있다(도 5의 Ⅳ). 그 결과, CD63 마커 포함 엑소좀 아집단이 분리 회수되는데, 사용된 시료용액과 회수용액의 부피 비율에 따라 엑소좀의 농축도 가능하다. 추가적으로, 고체표면은 재생되어 다른 시료의 분리에 재활용될 수 있다.
이하에서는 구체적 실시예 및 평가예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
재료
칼슘이온이 칼슘 부착단백질(CBP)에 부착반응 시 변화된 CBP의 독특한 구조를 특이하게 인식하는 단일클론 항체는 본 발명자들에 의해 생산되었다 (Paek et al. Analyst 139, 3781-3789, 2014). 또한, CBP로서 돌연변이 된 glucose-galactose binding protein (GGBP)를 선택하였고 이 단백질을 대장균 ( Escherichia coli; E. coli)으로부터 생산한 후 정제하였다. Sodium chloride, Trizma, casein (sodium salt form, extract from bovine milk), 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), sodium dodecyl sulfate (SDS), bovine serum albumin (BSA), 및 CNBr-activated Sepharose 4B gel (4% agarose)들은 Sigma 사(St. Louis, MO, 미국)로부터 구입하였다. Calcium chloride dehydrate 및 potassium chloride는 Daejung (시흥, 한국)에서 공급하였다. Sulfosuccinimidyl-6-[biotinamido]-6-hexanamido hexanoate (NHS-LC-LC-biotin), succinimidyl 4-(N-maleinidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), N-succinimidyl 3-(2-pyridyldithio)-propionate (SPDP), dithiotheritol (DTT), maleimide, streptavidin (SA), 및 horseradish peroxidase (HRP)들은 Thermo Fisher Scientific 사(Rockford, IL, 미국)로부터 구입하였다. 항 CD63 항체 (Cat. No. 353014)는 BioLegend (San Diego, CA, 미국)에서 공급하였고, CD9 (Cat. No. MAB1880), CD81 (Cat. No. MAB4615), 혹은 Caveolin-1 (Cav1; Cat. No. MAB5736)에 특이한 단일클론 항체들은 R&D Systems (Minneapolis, MN, 미국)에서 공급하였다. 냉동 건조된 정상인의 엑소좀 표준시약 (인간혈장 유래) 및 흑색종 암세포 배양액은 HansaBioMed (Tallinn, 에스토니아)로부터 구입하였다. 자성비드 (Dynabeads M-280 Tosylactivated, 직경 2.8㎜) 및 streptavidin-poly-HRP20는 Invitrogen (Carlsbad, CA, 미국) 및 Fitzgerald (Acton, MA, 미국)에서 각각 공급하였다. 여러 다른 엑소좀 분리키트를 즉, ExoQuickTM kit (System Biosciences; Mountain View, CA, 미국), MagCaptureTM kit (Wako; Osaka, 일본), 및 exoEasy MaxiTM kit (Qiagen; Hilden, 독일)들은 각기 다른 공급원으로부터 구입하였다. 그 외 다른 시약들도 분석용 제품을 사용하였다.
실시예 1: 엑소좀 분리 및 특성화용 구성성분 제조
SA와 CBP 간 중합. 10 mM 인산 완충용액 (pH 7.4; PB)에 용해된 CBP (400 ㎍)를 20몰 배의 SMCC와 혼합 후 실온에서 1시간 동안 반응시켜 활성화하였다. PB에 용해된 SA (2 ㎎)를 5몰 배의 SPDP와 1시간 동안 반응시킨 후, 5 mM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)를 포함한 10 mM DTT 용액으로 37℃에서 1시간 동안 화학적으로 환원시켜 sulfhydryl groups를 표출시켰다. 각 활성화 된 성분들은 Sephadex G-15 젤 여과칼럼 (10 ㎖ 부피)을 통해 과잉으로 사용된 시약을 제거함으로서 분리하였다. 두 활성화 된 단백질들 즉, maleimide-CBP 및 thilolated_SA를 1:5 몰 비로 혼합하였고 실온에서 4시간 동안 반응시켰다. 그 후, SA와 CBP 간 중합체(CBP-SA)가 포함된 최종 용액을 사용 시까지 잘 봉인된 용기 내에서 4℃에 보관하였다.
항 CD63 항체의 biotinylation. NHS-LC-LC-biotin의 succinimidyl-ester 부분을 항체 분자 상의 아민 그룹과 반응시켜 비오틴화된 항체를 제조하였다. 간략히 과정을 서술하면, 140 mM NaCl을 포함한 PB 용액 (PBS)에 용해된 항 CD63 항체를 dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해된 20몰 배의 NHS-LC-LC-biotin과 혼합하였고, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 혼합물 내 미반응 시약은 PBS로 평형상태에 있는 Sephadex G-15 칼럼을 이용한 size-exclusion chromatography를 통해 제거하였다. 정제된 중합체는 PBS로 2회 투석하였고 Vivaspin 500을 이용하여 1 ㎎/㎖ 농도로 농축한 다음, 사용 시까지 4℃에서 보관하였다.
HRP를 이용한 항 CD63 항체의 표지. 항 CD63 항체를 일반적인 과정을 이용하여 HRP로 표지하였다. 간략히 설명하면, 항체를 먼저 10 mM DTT로 37℃에서 1시간 동안 환원시켰고, 과량의 시약은 젤 여과칼럼을 이용하여 제거하였다. HRP도 또한 30몰 배의 SMCC로 활성화시켰고, 미반응 시약은 전과 동일하게 size-exclusion chromatography를 통해 제거하였다. 환원된 항체를 10몰 배의 활성화된 HRP와 혼합한 후 중합반응을 4℃에서 24시간 이상 수행하였다. 생성된 중합체는 동일 부피의 glycerol과 섞은 후 -20℃에서 보관하였다.
실시예 2: 면역 친화 크로마토그래피
면역 친화 젤 제조. 면역 친화 크로마토그래피를 수행하기 위해, CBP에 특이한 단일클론 항체를 CNBr-activated Sepharose 4B 젤 표면에 고정시켰다. 제조사에서 제공한 설명서에 따라, 항체(수화된 젤 부피 ㎖ 당 2 ㎎)를 agarose gel 상에 화학적으로 결합시키기 위해, 항체 분자상의 lysine 잔기를 젤 상의 기능성 그룹과 알칼리 조건에서 반응시켰다. 항체를 결합시킨 후, 젤 상의 잔여 반응기는 Tris-HCl 완충용액을 이용하여 가수분해시켰다.
제조된 면역 친화 젤을 플라스릭 칼럼에 충진시켜 면역 친화 크로마토그래피 칼럼을 제조하고, 산성과 알칼리성 조건을 교대로 이용하여 세척함으로써, 고체(젤) 표면에 비특이적으로 흡착된 항체를 제거하였다.
전처리 면역 친화 크로마토그래피 칼럼 제조 및 이를 통한 CD63 양성 (CD63+) 엑소좀 분리. 상기에서 제조된 면역 친화 젤을 활용하여 전처리 면역 친화 크로마토그래피 칼럼을 제조하였다. 엑소좀 마커의 일종인 CD63 양성 (CD63+) 엑소좀에 특이한 면역 친화 크로마토그래피 칼럼을 제작하기 위해, 플라스틱 칼럼에 면역 친화 젤을 충진하고, Ca 2+(10 mM)이 포함된 운반용액('Ca 2+ 스위치 켬' 조건)을 이용하여 CBP-SA 중합체(5 ㎍/㎖)를 단일클론 항체와 반응시켜 면역 친화 젤에 고정시킨 후, biotinylated 항 CD63 항체(3 ㎍/㎖)를 biotin-SA 결합을 통해 CBP-SA 중합체에 순차적으로 고정시켰다.
이렇게 제작된 면역 친화 칼럼(9 ㎜ × 3.2 ㎜; 1.5 ㎖ bed volume)을 이용하여 엑소좀을 분리하였다. 준비된 CD63 면역 친화 칼럼에 엑소좀 시료 (정상인 엑소좀 표준샘플 (25 ㎍/㎖; 1 ㎖))를 첨가하였고, Ca 2+ 포함 운반용액을 주입하여 결합되지 않은 성분들을 세척하였다. 그 후, Ca 2+이 제거된 운반용액('Ca 2+ 스위치 끔' 조건)을 주입하여 면역 친화 젤에 부착하였던 CBP-항체-엑소좀 결합체(CD63+ 엑소좀 포함)를 분획 별로 회수하였다. 여기서 전처리 칼럼은 재생 후 다른 샘플 분석에 재사용하였다.
상기 과정을 보다 상세하게 설명하면, 엑소좀 샘플을 면역 친화 칼럼에 첨가하기 전에, 젤을 140 mM NaCl, 10 mM Ca 2+ 및 2% BSA를 포함한 20 mM Tris-HCl(pH 7.4; 부착용액)과 평형상태를 유지시켰다. 실시예 1에서 제조한 CBP-SA (5 ㎍/㎖, 1 ㎖) 및 biotinylated 항 CD63 항체 (3 ㎍/㎖, 1 ㎖) 그리고 엑소좀 표준샘플 (1 ㎖; 정상인 엑소좀 표준시약 혹은 흑색종 암세포 배양액)을 각각 부착용액으로 희석시켰다. 또한, 각 시약의 첨가위치를 확인할 수 있도록 마킹을 위해 HRP 효소 (0.1 ㎍/㎖)를 각 희석용액에 첨가하였다. 제조한 각 용액을 미리 지정된 유출부피에서 유출되도록 젤 칼럼에 순서대로 첨가하였다. 칼럼으로부터의 유출액은 연동펌프를 이용하여 120 ㎕/min의 유출속도로 분획수집기 (분획부피: 1 ㎖)로 이송되었다. 미반응 단백질을 칼럼으로부터 제거하기 위해, 젤 칼럼을 BSA가 배제된 부착용액으로 세척하였다. 최종적으로, 칼럼에 500 mM NaCl이 포함된 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) 완충용액을 공급하여 칼럼에 부착되었던 엑소좀을 유출시켜 회수하였다. 그 후, 젤 칼럼에 500 mM NaCl, 5 % (v/v) Tween-20, 및 0.02 % (w/v) thimerosal이 포함된 100 mM sodium acetate 완충용액 (pH 4.5)을 공급하였고, 칼럼으로부터 단백질 유출이 없을 때까지 완전히 세척하여 칼럼을 재생하였다.
실시예 3 면역 자성분리
CD63+ 엑소좀의 면역 자성농축. 일반적으로, 자성농축기술은 항체가 결합된 면역 자성비드를 이용하여 항원-항체 반응을 통해 자기장 하에서 목표 물질을 분리하고 농축을 동시에 수행하는 방법이다. 이 방법을 이용한 CD63+ 엑소좀의 분리과정은 기본적으로 실시예 2의 면역 친화 크로마토그래피 수행 공정과 동일하다. Ca 2+ 결합에 따른 CBP 구조변화를 인지하는 단일클론 항체를 자성비드에 결합시킨 후, 'Ca 2+ 스위치 켬' 조건하에서 CBP-SA 중합체 그리고 biotinylated 항 CD63 항체를 순차적으로 반응시켰다. 이와 같이 제조한 면역 자성비드를 엑소좀 샘플(정상인 엑소좀 표준샘플 1 ㎖)과 반응시킨 후, 자석을 이용하여 자성비드를 포획한 상태에서 상층액을 제거하고 비드를 세척하였다. 그 다음 'Ca 2+ 스위치 끔' 조건하에서, 초기에 비해 1/10 부피의 완충용액을 첨가하여 CD63+ 엑소좀을 회수 및 농축하였다.
상기 과정을 보다 상세하게 설명하면, 자성농축을 위해, CD63에 특이한 항체를 자성비드의 고체표면 상에 활성화 된 tosyl 부분에 항체 상의 amine 그룹과 화학적으로 결합시켜 고정하였다. Tris-HCl 완충용액으로 3번 세척 후, 잔여표면을 Casein-PBS로 블로킹하였다. 비드 (총 1 ㎎)를 용액으로부터 자성 분리한 다음, 부착용액으로 희석한 CBP-SA 중합체 (5 ㎍/㎖; 1 ㎖)를 첨가하였고 진탕기 위에서 1시간 동안 반응시켰다. 비드를 BSA가 제거된 부착용액으로 세척 후, biotinylated 항 CD63 항체 (3 ㎍/㎖; 1 ㎖)를 같은 조건에서 순차적으로 반응시켰다. 다시 세척 후, 부착용액으로 희석한 엑소좀 샘플 (25 ㎍/㎖; 1 ㎖)을 첨가하였고 3시간 동안 반응시켰다. 마지막으로, 면역 친화 크로마토그래피에서와 같은 프로토콜에 따라 CD63+ 엑소좀의 회수 및 비드의 재생을 수행하였다.
평가예 1: 실시예 1에서 회수된 유출 분획 분석
도 6은 본 발명에 따른 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 시스템 및 방법을 이용하여 샘플 내 CD63+ 엑소좀을 면역 친화 크로마토그래피 공정으로 분리한 결과이다.
실시예 2에서 각 첨가 시료의 크로마토그램 상 유출위치를 확인하기 위해 horseradish peroxidase(HRP)에 대한 발색식 효소분석을 먼저 수행하였다. 실시예 2에 따른 분리과정을 통해 칼럼으로부터 수집한 용출 분획들을 분석해 보면, 각 성분들의 첨가위치 그리고 각 분획 별 CD63+ 엑소좀에 대한 분포를 확인할 수 있다. 전처리 젤 칼럼에 각 성분(즉, CBP-SA 중합체, biotinylated 항 CD63 항체 및 엑소좀 샘플)을 주입 시, 각 용액에 총 0.1 ㎍ HRP를 포함시켜서 용출 후 첨가된 위치를 확인할 수 있도록 하였다. 따라서, 각 분획에서 일부를 샘플링 하여 마이크로 웰에 분주하였고, HRP 기질용액을 첨가하여 얻은 반응결과로부터 각 성분의 주입위치 정보에 대한 크로마토그램을 얻고, 도 6에 점선으로 (a), (b), (c) 피크를 표시하였다. 상기 효소분석 과정에 대해 보다 상세하게 설명하면, 각 분획의 일정량 (5 ㎕)을 microtiter plate에 분주한 후 효소기질용액 (200 ㎕)을 첨가하여 효소로부터 신호를 발생시켰다. 효소기질용액은 3 % (v/v) 과산화수소 수용액 (10 ㎕), dimethyl sulfoxide (DMSO)에 용해된 10 ㎎/㎖ TMB (100 ㎕), 그리고 0.05 M acetate 완충용액 (pH 5.1; 10 ㎖)을 혼합하여 제조하였다. 효소 신호가 포화되기 전에 2 M 황산용액 (50 ㎕)을 첨가하여 반응을 종결시켰고, 광학밀도를 최대 흡광도 450 ㎚에서 microplate reader (Synergy H4, BioTek Inc; Winooski, VT, USA)로 측정하였다.
나아가, 면역친화력에 의해 분리되어 회수된 엑소좀의 유출 위치를 확인하기 위해 각 분획 내 엑소좀에 대한 효소면역분석 (enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA)을 수행하였다. 이를 위해, 항 CD63 항체가 고정된 마이크로 웰에 각 분획에서 일부를 샘플링 하여 첨가하여 반응시켰고, 칼럼 내에서 엑소좀과 반응했을 것으로 예측되는 biotinylated 항체분자 상의 잔여 biotin에 SA-poly HRP 20 중합체를 순차적으로 반응시켰다. 보다 구체적으로, 항체 고정화는 5 ㎍/㎖ 항체 (100 ㎕)를 각 웰에 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 수행하였다. 세척 후, 잔여표면을 0.5 % casein이 포함된 Tris-HCl 완충용액 (Casein-Tris)으로 블로킹하였다. 그 다음, 각 분획의 일정부분 (100 ㎕)을 각 웰에 첨가하였고, 37℃ 및 100% 습도가 유지되는 상자 내에서 12시간 동안 반응시켰다. 웰을 세척하였고, 실시예 1에서 제조한 biotinylated 항 CD63 항체 (1 μg/㎖; 100 ㎕)를 첨가한 후 37℃ 에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 세척 후, Casein-Tris로 희석한 SA-poly HRP20(66 ng/㎖; 웰 당 100 ㎕)을 첨가하였고 37℃ 에서 1시간 동안 반응시켰다. 마지막으로, HRP에 대한 기질용액 (200 ㎕)을 첨가하였고, 발색이 포화되기 전에 2 M 황산용액 (50 ㎕)을 첨가하여 반응을 정지시켰고, 광학밀도를 위와 같이 측정하였다. HRP 기질용액을 첨가하여 엑소좀 특이 크로마토그램을 얻은 결과는 도 6의 실선으로, 'Ca 2+ 스위치 끔' 조건하에서 의미있는 신호는 도 6에 (d) 피크로 표시하였다. 사용된 면역분석에서는 CD63+ 엑소좀을 중심으로 형성된 항 CD63 항체 샌드위치 결합체만이 탐지되므로(도 6의 삽화 참조), 칼럼으로부터 유출된 (d) 피크에는 면역분리 되어 회수된 CD63+ 엑소좀이 포함된 것으로 판단된다. 부가하여, 엑소좀 샘플 주입 위치 (도 6의 (c) 피크)에서도 신호가 약하게 발생한 것으로 보아, 일부 엑소좀 결합체가 유출되거나 혹은 친화력이 없는 과량의 엑소좀이 비특이 반응한 결과로 예측된다. 그러나 이 피크 크기가 (d) 피크의 크기에 비해 10% 이하이므로 더이상 분석대상으로 삼지 않았다.
평가예 2: 실시예 2에 따른 면역 친화 크로마토그래피 재현성 평가
도 7은 도 6의 면역 친화 크로마토그래피 공정을 반복적으로 이용하여 엑소좀 분리 시 재현성을 나타낸 결과이다.
실시예 2에 따른 면역 친화 칼럼을 이용한 엑소좀의 분리 재현성을 확인해 보기 위해, 동일한 면역분리 과정을 반복하였고 각 실험결과로부터 얻은 유출 분획을 이미 언급한 CD63+ 엑소좀에 대한 면역분석을 수행하여 각 크로마토그램을 획득하였다 (도 7의 A 참조) Ca 2+이 제거된 유출용 운반용액으로 전환 후 (35번째 분획 이후), 반복 실험 시에도 CD63+ 엑소좀이 분리되어 단일 독립 피크 형태로 형성됨을 확인 할 수 있었다. 더욱이, CD63+ 엑소좀 피크를 형성하는 분획 번호 및 엑소좀에 대한 특이 신호세기도 매우 유사함을 확인하였다. 특히, 크로마토그램 상의 회수 엑소좀 피크 내 37, 38 및 39번째 분획에 포함된 CD63+ 엑소좀에 대한 면역분석 신호는 평균 변이계수(coefficient of variation; CV)가 9.4 % 이하 정도로 높은 재현성을 나타내었다 (도 7의 B 참조).
본 평가예 2의 시험 과정을 보다 상세하게 설명하면, 위에서와 같이 면역 친화 크로마토그램을 최초로 얻은 후, 동일한 분리 프로토콜에 따라 각 유출분획에 포함된 엑소좀을 회수하고 분석하는 과정을 3번 반복하였다. 본 평가 실험에서는 각 분리된 엑소좀 피크를 구성하는 주요 분획 내 포함된 CD63+ 엑소좀에 대한 면역분석 결과를 얻었고, 그 측정된 신호 간 변이계수(coefficient of variation; CV)를 각 분리시험에 대한 재현성의 평가지표로 사용하였다. 분리용 젤칼럼을 사용하지 않을 때에는 Tris-HCl 완충용액으로 채워 4℃에서 보관하였다.
평가예 3: 실시예 3의 농축 성능 평가
도 8은 본 발명에 따른 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 시스템 및 방법을 이용하여 샘플 내 CD63+ 엑소좀을 면역 자성분리 공정으로 분리 및 농축한 결과이다.
실시예 3의 농축 성능을 시험하기 위해, 자성분리 공정을 다른 엑소좀 표준샘플(1, 3, 혹은 5 ㎍/㎖)에 대해 반복 적용한 다음, 전술한 CD63+ 엑소좀에 대한 샌드위치 면역분석을 수행하고, 그 결과를 도 8의 A에 검은색 막대 그래프로 표시하였다. 자성농축 전 원래 표준샘플 내 CD63+ 엑소좀에 대한 면역분석 결과는 도 8의 A에 흰색 막대로 표시하였는데, 양자를 비교할 때에 자성농축으로 인해 신호가 평균적으로 약 3.7배 정도 증가한 것으로 나타났다. 분리된 엑소좀의 농축비율을 결정하기 위해, 원래 표준샘플에 대한 면역분석의 농도응답을 log-logit 변환을 통해 선형화하였고 이로부터 농축된 CD63+ 엑소좀 농도를 결정하여, 도 8의 B에 도시했다. 그 중, CD63+ 엑소좀을 기준으로 3 ㎍/㎖ 엑소좀 샘플에 대해 농축한 결과 약 22 ㎍/㎖을 얻을 수 있었으며, 이로부터 약 7.9배의 농축효율을 확인할 수 있었다.
여기서, 분리 전후의 엑소좀 샘플의 농도를 면역분석에서 표준시약으로 얻은 결과와의 비교를 통해 결정하였는데, 먼저 정상인 엑소좀 표준시약을 Casein-Tris로 희석하여 엑소좀 표준샘플 (1 to 100 ㎍/㎖)을 준비하였고, 면역분석을 위해 항 CD63 항체 (5 ㎍/㎖; 100 ㎕)를 마이크로 웰 내에 첨가하였으며, 37℃에서 1시간 동안 반응시켜 웰 내부 표면에 포획 바인더로 고정하였다. 세척 후, Casein-Tris를 첨가하여 잔여표면을 위에서와 동일한 조건하에서 블로킹하였다. 각 엑소좀 샘플 (100 ㎕)을 각기 다른 웰에 첨가하였고, 37 ℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 나머지 분석과정은 전술한 ELISA 프로토콜을 따라 수행되었다.
평가예 4: 실시예 3에 따른 면역 자성분리 재현성 평가
도 9는 도 8의 면역 자성분리 공정을 반복적으로 실시하는 경우의 CD63+ 엑소좀 분리 시 재현성을 나타낸 결과이다.
실시예 3에 따른 스위치 인식소재 기반의 자성농축 기술은 'Ca 2+ 스위치 켬' 조건하에서 타겟 엑소좀을 포획하고, 순차적으로 'Ca 2+ 스위치 끔' 조건하에서 엑소좀을 회수한 후, 전처리된 자성비드는 재생되어 새로운 시료의 분리 및 농축에 재사용 할 수 있는 특성을 제공한다. 실제로 전처리된 비드의 재사용 시 그 농축 성능 재현성을 확인해 보기 위해, 다른 농도의 엑소좀 표준샘플(1, 3, 5 ㎍/㎖; 정상인 혈장으로부터 채취)에 대해 자성분리 및 농축한 다음, 재사용된 전 처리된 비드를 이용하여 동일한 과정을 2회 더 반복하였다. 분리된 엑소좀 샘플의 농도는 CD63+ 엑소좀에 대한 샌드위치 면역분석을 이용하여 분석하였다. 그 결과를 나타내는 도 9의 A를 참고로, 샘플의 분리 및 농축을 전처리된 비드를 재사용하여 수행 시 CD63+ 엑소좀에 대한 농도응답 패턴은 매우 유사하였다. 실제로, 엑소좀 농도에 따른 분리 샘플 내 CD63+ 엑소좀의 농축은 면역분석으로부터의 신호 값을 기준으로 평균 CV 8.3 % 로서 재현성이 매우 높은 것으로 나타났다(도 9의 B 참조).
여기서, 표준샘플 (1, 3 및 5 ㎍/㎖)은 정상인의 엑소좀 표준시약을 부착용액으로 희석하여 제조되었으며, 자성비드를 사용하지 않을 때에는 Casein-Tris에 담가 4 ℃에서 보관하였다.
평가예 5: 실시예 2 및 3에 따라 분리된 CD63+ 엑소좀에 대한 특성화
도 10은 본 발명에 따른 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 시스템 및 방법을 이용하여 분리된 CD63+ 엑소좀에 대한 물리적 특성화 결과이고, 도 11은 본 발명에 따른 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 시스템 및 방법을 이용하여 분리된 CD63+ 엑소좀 샘플들의 엑소좀 표면마커에 대한 특성화 결과이다.
실시예 2 및 3에서 분리한 CD63+ 엑소좀 아집단에 대한 형태학적인 특성화 그리고 표면 단백질에 대한 분석을 통해 실제로 엑소좀의 두 가지 특징 즉, microvesicle 형태 및 이종의 표면 단백질의 분포를 확인하였다. 형태학적 특성화를 위해, 본 발명에서 개발한 방법으로 분리된 엑소좀의 형태를 측정하기 위해 scanning electron microscope (SEM)를 이용하여 이미지를 관찰하였고 또한 dynamic light scattering (DLS) 기술을 이용하여 크기 분포를 측정하였다.
Scanning electron microscopy (SEM) 이미징. 실시예 2 및 3에서 분리된 CD63+ 엑소좀 샘플에 대해 SEM 이미징을 통해 형태학적으로 관찰하였다. 고배율 이미지를 얻기 위해, 상기한 면역친화 크로마토그래피 혹은 면역 자성분리 과정을 통해 각각 분리된 엑소좀 샘플을 표준 프로토콜에 따라 시편을 제작하였다. 고체상태에서 미세구조와 형태를 측정하기 위해, 각 원래 샘플을 현미경 유리 슬라이드에 옮긴 후 커버슬립으로 덮었고, 대상물을 액체질소 내에 담가 급속 냉동시켜 냉각 고정시켰다. 커버슬립을 제거한 후, 냉동 표본을 2.5 % glutaradehyde 용액을 첨가하여 고정시켰고, Tris-HCl 완충용액 및 탈이온수로 각각 1회 세척하였으며, 아세톤을 첨가하여 탈수시켰다. 다음으로, 액체 이산화탄소를 사용하는 임계점건조법(critical point drying)으로 아세톤을 제거하였다. 샘플을 tempfix mounting adhesive를 이용하여 aluminum stubs 위에 올려놓았고, colloidal silver를 첨가하여 표면과 접촉시켰다. 백금을 3-5 ㎚ 두께로 sputter-coating 후, 샘플을 Hitachi S-4700 SEM (Hitachi; 동경, 일본)으로 관찰하였다. SEM 관찰 결과, 각 샘플 시편에서 동일하게 직경이 약 100 ㎚인 구형의 입자 이미지를 얻을 수 있었다(도 10의 A 참조) 실제로, 엑소좀은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 microvesicle로, 직경이 대략 30 ~ 200 ㎚ 인 것으로 알려져 있다.
Dynamic light scattering (DLS) 분석. 분리된 CD63+ 샘플의 크기 분포를 좀 더 정확하게 측정하기 위해, 엑소좀의 DLS 분석을 실온에서 입자크기 분석기 (ELSZ-1000, Otsuka Electronics; 오사카, 일본)로 수행하였다. 엑소좀 샘플 (0.5 ㎖)을 1회용 cuvette (BI-SCP, Brookhaven Instruments Corporation; NY, 미국)으로 옮긴 후, 분석기 제조자의 수행 안내에 따라 분석하였다. 엑소좀의 크기를 Stokes-Einstein 방정식에 따라 결정한 후, extracellular vesicles의 크기 분포를 특성화하였다. 그 결과, 각 샘플에서의 입자 직경은 평균 약 186.2 ㎚ 혹은 193.8 ㎚ 수준인 것으로 나타났다(도 10의 B 참조) 이와 같이 측정된 입자의 크기 및 그 분포로부터, 면역친화 크로마토그래피 및 면역 자성분리 과정을 통해 분리된 샘플에 포함된 입자는 엑소좀인 것으로 판단된다.
Western blotting. 엑소좀의 일반적인 특징 중 하나인 이종의 표면 단백질의 분포를 확인하기 위해, 실시예 2 및 3에서 분리한 CD63+ 엑소좀 샘플 내 tetraspanin 계열의 단백질 마커들에 대해 Western blotting 분석을 각각 실시하였다. 엑소좀 샘플을 최적화된 조건 하에서 SDS-PAGE 분석을 수행한 후, 분리된 단백질들을 nitrocellulose membrane으로 이송시켜 엑소좀 표면에 일반적으로 많이 분포하는 CD9, CD63, 및 CD81에 대해 각각 특이한 항체-HRP 중합체를 반응시켰다. 보다 상세하게 설명하면, 각 엑소좀 샘플을 우선 150 mM NaCl, 1 % Triton X-100, 0.5 % sodium deoxycholate, 및 0.1 % sodium dodecyl sulfate (SDS)을 포함한 50 mM Tris 완충용액(pH 8.0)으로 처리하였다. 이와 같이 변성된 단백질들을 8 % SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)를 이용하여 분리한 다음, nitrocellulose membrane 상으로 전기영동적 방법을 통해 이송하였다. Casein-PBS로 잔여표면을 블로킹 후, 멤브레인을 미리 HRP와 화학중합시킨 항 CD63, CD9, 및 CD81 항체들을 이용하여 blotting 분석을 수행하였다. 마지막으로, 발색시약으로 3,3'-diaminobenzidine (DAB)을 포함한 HRP 기질용액을 첨가하여 멤브레인 상에 발색신호를 발생시켰다. 기질용액은 50 mM sodium acetate 완충용액 (pH 5.0; 1 ㎖)에 0.05 % DAB (10 ㎕) 및 3 % H2O2 (1 ㎕)를 첨가하여 제조하였다.
염색된 발색신호로부터, 엑소좀의 tetraspanin 단백질 마커들이 실시예 2 및 3의 방법으로 분리한 CD63+ 엑소좀 샘플 내에 모두 발현되어 있음을 확인할 수 있었다(도 11의 A 참조) 참고로, CD9과 CD81에 대한 밴드의 발색신호 선명도와 비교하여 CD63에 대한 밴드 신호가 선명하지 않은데, 이것은 CD63 마커가 당화 단백질이기 때문에 밴드가 30 ~ 60 kDa으로 비교적 넓게 존재한다는 것도 영향이 있지만, 보다 근본적으로 본 평가 실험에서 사용한 엑소좀 표준시료 (도 11의 A, control) 자체에서 CD63 마커 발현에 대한 밴드 신호가 낮기 때문이다(도 11의 A 참조) 위에서 얻은 결과들을 종합해 보면, 면역친화 크로마토그래피 및 면역 자성분리 과정을 통해 분리된 샘플이 엑소좀의 일반적인 특징을 모두 나타내고 있는 점으로 미루어보아, 본 발명에 따라 CD63+ 엑소좀 아집단의 분리가 성취된 것으로 판단된다.
분리 후 CD63+ 엑소좀의 회수율. 엑소좀 분리 시스템의 회수율을 결정하기 위해 분리 전후의 샘플 내 CD63+ 엑소좀에 대한 정량분석을 수행하였는데, 엑소좀 표준시료에 대한 CD63 마커의 면역분석을 통해 구한 표준곡선을 이용하여 CD63+ 엑소좀 아집단의 농도를 우회적으로 측정하였다. 면역분석 시 엑소좀 표면 마커인 CD63 특이 항체를 포획 및 탐지 바인더로 사용한 효소면역분석(ELISA)을 통해 표준곡선을 구하였다(도 11의 B; 왼쪽) 동일한 조건 하에서, 분리 전 그리고 분리 후의 샘플에 대해 면역분석을 수행하였고, 이로부터 발생한 신호를 표준곡선에 대입하여 각 엑소좀의 농도로 환산하였다. 부피 희석비율을 보정한 후, 면역친화 크로마토그래피 및 면역 자성분리 전후의 엑소좀 샘플 내 엑소좀 총량을 계산하여 각 분리공정의 회수 수율을 결정하였다(도 11의 B; 오른쪽) 이로부터, 두 공정의 수율은 각각 78.3% 및 68.5% 정도로 나타났는데, 이러한 결과는 기존의 산성 pH 등 가혹조건을 사용하여 분리 산물을 회수하는 분리공정 (예: 수율 <50%)에 비해 매우 높았다. 이는, 본 발명에 따라 스위치 인식소재를 사용하는 분리공정에서는 용액 내 칼슘이온 제거 시 CBP에 대한 인식소재의 친화력이 배경 수준으로 낮아져 분리된 엑소좀의 회수 수율이 상대적으로 매우 높고 또한 구조적 변형이 최소화되었기 때문이다.
평가예 6: CD63+ 엑소좀 아집단을 진단샘플로 사용 시 분석성능 평가
도 12는 엑소좀 표준샘플들 간 농도변이를 보상하기 위해 CD9 농도를 기준으로 Cav1 마커 농도를 보정한 결과이고, 도 13은 본 발명에 따른 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 시스템 및 방법을 이용하여 분리한 CD63+ 엑소좀을 분석샘플로 이용 시 흑색종 암 진단에 대한 잠재적 효과를 나타낸 결과이다.
타겟 마커의 농도 표준화. 본 발명에 따라 CD63+ 엑소좀 아집단을 분리하여 진단샘플로 사용 시, 흑색종 암 관련 마커인 Cav1+ 엑소좀의 농축효과로 인해 고감도 진단이 가능하게 될 것으로 예측된다. 그러나 단순히 Cav1 단백질의 발현 수준을 측정하는 경우, 엑소좀의 농도가 샘플에 따라 변화하기 때문에 분리효과를 정확하게 판단하기에는 제한적이다. 따라서, 성능 비교 시 불확실성을 최소화하기 위해 일반적으로 엑소좀 표면에 존재하는 정상 마커인 CD9 단백질을 측정하여 보정을 통해 표준화시키는 방법을 도입하였다. 이를 위해, 흑색종 암 관련 마커인 Cav1 단백질 특이항체와 CD9 단백질 특이항체를 각각 다른 microtiter plate well에 고정시키고, 동일한 샘플을 첨가하여 반응시킨 후, CD63 항체를 탐지항체로 이용하여 ELISA를 수행하였다. 이로부터, 암 마커 및 정상 마커에 비례한 신호를 얻었고(도 12; 막대 그래프), 그 두 신호 비율 즉, Cav1/CD9 신호비율을 계산하였다 (도 12; 선 그래프). 이때 정상인 제공 혈장샘플을 희석하여 분석한 경우(도 12의 A), 그 Cav1/CD9 신호비율이 평균 0.147로 희석비율에 따라 대략 일정하게 유지되었다. 또한, 흑색종 암세포 샘플의 경우(도 12의 B)에서는 각 마커에 대한 신호는 상대적으로 높게 측정되었고, 그 Cav1/CD9 비율이 평균 0.206으로 Cav1의 발현수준정상인 표준샘플 보다 평균 40% 정도 높은 것을 알 수 있었다. 이와 같이 총 엑소좀 농도 변화에 대해, CD63+ 엑소좀 아집단 내 Cav1+ 엑소좀을 정상 마커인 CD9+ 엑소좀으로 보정하여 표준화시킬 수 있었다.
상기 평가 실험 과정에 대해 부연하면, 엑소좀 표준샘플 (5 to 100 ㎍/㎖)을 정상인 혈장 혹은 흑색종 암 세포주로부터 얻은 엑소좀을 Casein-Tris로 희석하여 준비하였다. 샘플 내 각 마커 농도를 측정하기 위해, 각 마커에 대해 특이한 포획항체(5 ㎍/㎖; 100 ㎕)들을 각 마이크로 웰 내에 첨가한 후 37 ℃에서 1 시간 동안 반응시켜 고정시켰다. 나머지 실험과정은 위에서 이미 소개한 CD63에 대한 ELISA 과정과 동일하게 수행되었다. CD9과 Cav1에 대해 분석 후 발생된 신호를 측정하였고, Cav1/CD9 신호 비율을 각 샘플에 대해 계산하였다.
진단샘플로서 분리된 엑소좀의 잠재성. 이와 같은 면역분석을 통한 Cav1/CD9 신호비율 측정방법을 이용하여, 스위치 인식소재를 기반으로 분리한 CD63+ 엑소좀 아집단을 진단샘플로 사용 시 흑색종 암 진단에 대한 잠재적 효과를 시험하였다. 정상인의 엑소좀과 흑색종암 엑소좀의 각 표준물질 25 ㎍/㎖을 분리하여 CD63+ 엑소좀 아집단을 얻었고, 그 Cav1 단백질의 발현수준에 대한 분석결과를 분리 전의 결과와 비교하였다. 분리 전인 벌크 엑소좀 샘플 사용 시에는 Cav1/CD9 신호비율이 정상인 샘플의 경우와 비교하여 암 샘플에서 40% 정도 증가하였다(도 13의 A; 왼쪽) 면역 크로마토그래피 방법으로 분리한 CD63+ 엑소좀 아집단 샘플 사용 시에는 그 신호가 정상인의 경우와 비교하여 암 샘플에서 약 4배 (즉, 400%), 증가하였다(도 13의 A; 오른쪽) 즉, 분리된 CD63+ 엑소좀 아집단 샘플 사용 시 흑색종 암세포 스크리닝에 대한 잠재적 민감도가 약 10배 증가하는 것으로 나타났다. 이와 같은 암세포 스크리닝에 대한 효과는 면역 자성분리 방법으로 분리한 아집단 샘플 사용 시에도 유사하게 약 7.7배 증가하였다(도 13의 A 참조) 이러한 효과는 CD63+ 엑소좀 아집단을 스크리닝 샘플로 사용 시 Cav1+ 엑소좀의 증가뿐만 아니라 CD9+ 엑소좀의 감소를 초래한 것에 기인한 것으로 예측된다. 실제로, CD9+ 엑소좀 농도가 암 샘플에서 줄어든다는 보고가 있다.
평가예 7: 기존 엑소좀 분리시스템과의 성능 비교
도 14는 본 발명에 따른 스위치 성 부착반응을 이용한 친화 분리 시스템과 현재 상업적으로 판매되는 다양한 엑소좀 분리 시스템들 간에, 분리된 샘플의 면역분석에 의해 결정된 Cav1/CD9 농도비율을 기준으로, 흑색종 암 샘플을 정상 샘플로부터 구분해내는 성능에 대한 비교 결과이다.
본 발명의 실시예 2 및 3에 따른 스위치 인식소재 기반의 분리 시스템들로부터 얻은 CD63+ 엑소좀 아집단 샘플의 흑색종 암세포 스크리닝에 대한 효과를 객관적으로 평가하기 위해, 현재 상용화되어 있는 엑소좀 분리키트들을 이용하여 얻은 샘플을 이용한 효과와 비교하였다. 상용화된 엑소좀 분리키트들 중 일반적으로 판매되는 다양한 ExoQuickTM, MagCaptureTM, 및 exoEasy MaxiTM 키트를 구입하여 사용하였다. 정상 엑소좀과 흑색종 암 엑소좀 표준물질 25 ㎍/㎖ (1 ㎖)을 각 시스템의 정해진 프로토콜을 준수하여 분리하였다. 각 분리된 엑소좀 샘플을 위에서 설명한 바와 같은 ELISA를 통해 Cav1 및 CD9 단백질의 발현수준을 신호로 측정하여 보정 파라미터인 Cav1/CD9 신호비율을 계산하여 비교하였다. 그 결과를 나타내는 도 14를 참고로, 본 발명의 면역 크로마토그래피 및 면역 자성분리 시스템들로부터 얻은 CD63+ 엑소좀 아집단 샘플 이용 시 위에서 언급한 바와 같이 Cav1/CD9 신호비율이 정상인의 경우와 비교하여 암 샘플에서 각각 5.5, 4.1 배 증가한 반면에, 상용화된 분리키트로부터 구한 샘플 이용 시 사용된 키트에 상관없이 모두 Cav1/CD9 신호비율이 분리 전과 차이가 없거나 오히려 암 샘플에서 감소하는 것으로 나타났다.
이와 같은 결과는 상용화된 엑소좀 분리키트들의 분리원리가 본 발명에서 사용한 원리와 다르기 때문인 것으로 판단된다. 실제로, 상용화 키트들은 polyethylene glycol과 같은 폴리머를 사용한 침전방법(ExoQuickTM, SBI 社)이나, 엑소좀 표면의 phosphatidylserine(PS)과 금속이온 존재 하에서 반응하는 단백질을 이용한 친화적 방법(MagCaprueTM, Wako 社), 또는 회전 칼럼을 이용해서 분리시간을 단축하는 방법(exoEasy MaxiTM, Qiagen 社) 등으로 엑소좀을 분리한다.
이와 같이 판매되는 대부분의 키트들은 단지 벌크 엑소좀 집단을 분리하거나 농축하는 정도로서 진단민감도를 현저히 향상시키기에는 제한적이며 따라서 암세포 스크리닝 등에 적용하기 어렵다. 부가하여, 진단민감도 증가를 위해 특정 엑소좀 표면 마커에 대한 면역분리 방법이 적용될 수는 있으나, 본 발명과 같이 스위치 인식소재 사용 등을 통한 획기적인 방법의 도입 없이는 엑소좀 회수 수율 및 원형 유지 면에서 경쟁하기 어렵다.
이하에서는 본 평가 실험에서 사용된 상용 키트를 이용한 엑소좀 분리 과정을 간단하게 설명한다.
ExoQuick 키트를 이용한 엑소좀 분리. 엑소좀 표준샘플을 사용한 키트의 제조사에서 제공한 안내에 따라 분리하였다. 간략히 소개하면, 구입된 엑소좀 샘플들(각 25 ㎍/㎖; 1 ㎖)을 별개의 마이크로 웰 내에 옮긴 후, 미리 정해진 양의 ExoQuick 엑소좀 침전용액을 첨가하였다. 혼합 후, 4 ℃ 에서 냉장시킨 다음 원심분리 하였다. 상등액을 제거한 후, 알갱이 형태로 침전된 엑소좀을 회수하였고, 완충용액 (500 ㎕)에 재용해시킨 다음 Cav1/CD9 비율을 결정하기 위해 이미 설명한 바와 같이 면역분석을 수행하였다.
MagCapture 키트를 이용한 엑소좀 분리. 동일한 엑소좀 표준샘플을 해당 키트의 제조사에서 제공한 프로토콜에 따라 분리하였다. 간략히 소개하면, 엑소좀에 대한 특정 포획인자인 phosphatidylserine (PS)-부착단백질로 코팅된 자성비드 (60 ㎕)를 부착증진제인 금속이온을 포함하고 있는 분석샘플 (1 ㎖)에 첨가하였다. 그 혼합물을 3시간 동안 교반시키면서 반응시켰다. 그 후, 비드를 세척용액 (150 mM NaCl, 0.05 % Tween20, 및 2 mM CaCl2을 포함한 20 mM Tris-HCl (pH 7.4; 1 ㎖)으로 3번 세척한 다음 용출용액 (150 mM NaCl 및 2 mM EDTA를 포함한 20 mM Tris-HCl (pH 7.4))으로 용출시켰다. 회수된 엑소좀 샘플에 대한 Cav1/CD9 비율을 결정하기 위해 면역분석을 수행하였다.
exoEasy Maxi 키트를 이용한 엑소좀 분리. 엑소좀 샘플을 또한 상업적으로 구입한 다른 키트를 이용하여 분리하였다. 간략히 설명하면, 키트와 함께 제공된 XBP 완충용액 (1 ㎖)을 같은 부피의 샘플에 첨가하였다. 가볍게 혼합 후, 혼합물을 실온에 두어 실온까지 예열하였다. 이 혼합물을 exoEasy 스핀칼럼 내로 옮긴 후, 1분간 원심분리 하였다. XWP 완충용액 (10 ㎖)을 순차적으로 칼럼 내에 첨가하였고, 넣은 완충용액을 제거하기 위해 5분간 더 원심분리 하였다. 스핀칼럼을 새 회수튜브로 옮긴 다음, XE 완충용액 (500 ㎕)을 칼럼에 첨가한 후 1분간 반응시켰다. 추가로 5분간 원심분리하여 엑소좀을 용출시켜 튜브에 회수하였다. 마지막으로, 용출액을 스핀칼럼에 재투입한 다음 1분간 반응시켰고, 5분간 원심분리하여 용출용액을 회수하였다. 회수된 용액은 위에서 언급한 바와 같이 Cav1/CD9 비율을 측정하기 위해 면역분석을 수행하였다.
이상 본 발명을 구체적인 실시예를 통하여 상세히 설명하였으나, 이는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명은 이에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상 내에서 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 그 변형이나 개량이 가능함이 명백하다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 모두 본 발명의 영역에 속한 것으로 본 발명의 구체적인 보호 범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.
[부호의 설명]
1: 목표 아집단 대상물질
10: 리간드
20: 바인더
30: 인식소재
40: 고정 부재
50: 포획소재
C: 중합체
P: 타겟 마커

Claims (15)

  1. 리간드;
    상기 리간드가 탈착 가능하게 결합되고, 상기 리간드와 결합 반응하여 구조가 변하는 바인더;
    구조가 변한 상기 바인더와 특이적으로 결합하는 인식소재;
    상기 바인더 및 상기 인식소재 중 어느 하나가 표면에 고정되는 고정 부재; 및
    상기 바인더 및 상기 인식소재 중 다른 하나와 중합되어 중합체를 형성하고, 샘플 용액 내의 목표 아집단 대상물질과 특이적으로 결합하는 포획소재;를 포함하는 친화 분리 시스템.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 리간드는, 당 분자, 이온, 기질, 및 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 친화 분리 시스템.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 바인더는, 당 결합단백질, 이온 결합단백질, 효소, 항체, 앱타머, 세포 수용체, 및 나노 구조체로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 친화 분리 시스템.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 인식소재는, 항체, 단백질 수용체, 세포 수용체, 앱타머, 효소, 나노입자, 나노 구조체, 및 중금속 킬레이트제(chelator)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 친화 분리 시스템.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 고정 부재는, 하이드로 젤, 자성비드, 라텍스 비드, 글라스 비드, 나노금속 구조체, 세공성 멤브레인, 및 비세공성 멤브레인으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 친화 분리 시스템.
  6. 청구항 1에 있어서,
    내부에 상기 고정 부재를 수용하는 반응기;를 더 포함하는 친화 분리 시스템.
  7. 청구항 1에 있어서,
    결합된 상기 리간드가 탈착될 때에, 결합된 상기 바인더와 상기 인식소재가 서로 분리되는 친화 분리 시스템.
  8. 청구항 1에 있어서,
    상기 목표 아집단 대상물질과 결합한 상기 고정 부재는, 자력, 중력, 및 원심력 중 어느 하나 이상에 의해 농축되는 친화 분리 시스템.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 샘플 용액은 체액을 포함하고,
    상기 목표 아집단 대상물질은, 상기 체액 내의 이종 벌크집단으로부터 분리되는 물질인 친화 분리 시스템.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 이종 벌크집단은, 소정의 질환 진단에 사용되는 세포, 엑소좀, DNA, RNA, 단백질, 지질, 당, 및 대사 성분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개 이상을 포함하는 친화 분리 시스템.
  11. (a) 리간드가 함유된 리간드 용액, 상기 리간드와 탈착 가능하게 결합 반응하여 구조가 변하는 바인더, 구조가 변한 상기 바인더와 특이적으로 결합하는 인식 소재, 및 상기 바인더 및 상기 인식소재 중 어느 하나와 중합되어 중합체를 형성하는 포획소재를 반응시켜, 상기 바인더 및 상기 인식소재 중 다른 하나와, 상기 중합체를 결합시키는 단계;
    (b) 상기 포획소재가 특이적으로 결합하는 목표 아집단 대상물질을 포함하는 샘플 용액을 첨가하여, 상기 중합체의 상기 포획소재와 상기 목표 아집단 대상물질을 결합시키는 단계; 및
    (c) 상기 바인더에 결합된 상기 리간드가 탈착되도록, 상기 리간드가 비함유된 회수용액을 첨가하여, 상기 인식소재 및 상기 바인더 중 다른 하나로부터, 상기 목표 아집단 대상물질과 결합된 상기 중합체를 분리하는 단계;를 포함하는 친화 분리 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 (a) 단계는,
    상기 바인더 및 상기 인식소재 중 다른 하나를 고정 부재의 표면에 고정시키는 단계; 및
    상기 중합체가 용해된 상기 리간드 용액을, 상기 고정 부재에 첨가하여, 상기 고정 부재에 고정된 상기 바인더 및 상기 인식소재 중 다른 하나와, 상기 중합체를 결합시키는 단계;를 포함하는 친화 분리 방법.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 (b) 단계와 상기 (c) 단계 사이에,
    자력, 중력, 및 원심력 중 어느 하나 이상을 이용해, 상기 목표 아집단 대상물질과 결합된 상기 고정 부재를, 상기 리간드 용액 및 상기 샘플 용액이 혼합된 혼합용액 내의 소정의 공간 영역에 포획하는 단계; 및
    상기 고정 부재가 미함유된 상기 혼합용액의 일부를 제거하여, 상기 목표 아집단 대상물질을 농축하는 단계;를 더 포함하는 친화 분리 방법.
  14. 청구항 11에 있어서,
    상기 샘플 용액은 체액을 포함하고,
    상기 목표 아집단 대상물질은, 상기 체액 내의 이종 벌크집단으로부터 분리되는 물질인 친화 분리 방법.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 이종 벌크집단은, 소정의 질환 진단에 사용되는 세포, 엑소좀, DNA, RNA, 단백질, 지질, 당, 및 대사 성분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 2개 이상을 포함하는 친화 분리 방법.
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