WO2018004309A1 - 이중가닥 핵산 신호 프로브 및 이를 이용한 표적분자의 검출방법 - Google Patents

이중가닥 핵산 신호 프로브 및 이를 이용한 표적분자의 검출방법 Download PDF

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    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence

Definitions

  • the signal generating region Is a double-stranded nucleic acid that is complementarily crosslinked (ie covalently) with each other, wherein the double-stranded nucleic acid is labeled with the same signaling agent or two or more regions (wherein the "region” is optionally Is characterized by the presence of a "segment (segment)" in order to clearly distinguish it from other parts of the same or similar terms.
  • Single-stranded nucleic acid as a specific binding region with a target molecule is a nuclease or a thermally stable PNA (Peptide Nucleic Acid) as long as it has a specific binding ability with not only single-stranded DNA or single-stranded RNA but also a nucleic acid such as mRNA, which is its target molecule.
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • nucleic acid analogs such as Locked Nucleic Acid (LNA), Hexitol Nucleic Acids (HNA), Altritol Nucleic Acids (ANA), and Mannitol Nucleic Acids (MNA).
  • Antibodies as target molecules and specific binding regions are monoclonal antibodies, polyclonal antibodies, as well as multispecific antibodies (ie, bispecific antibodies as antibodies that recognize two or more antigens or two or more epitopes), or As long as it retains the ability to specifically bind to a target molecule, it may be a fragment of an antibody, a chemically modified antibody, a humanized antibody, a recombinant antibody, or the like.
  • Fc fragments, peptides, peptidomimetics, gapmers, etc. of antibodies may also be used as specific binding regions of the target molecules, as long as they have the ability to specifically bind to the target molecules. Can be used.
  • the signal generating region is a double-stranded nucleic acid, which is crosslinked with each other between the strands to maintain a stable double bond even at high temperature, and is not affected by pH, salt, ionic strength, and the like. Do not.
  • a detectable label of a signaling region is any substance known in the art for generating a detectable signal, and the substance may be a single strand or double strand (or a strand) of a nucleic acid fragment constituting the signaling region. Nucleotides which are structural units of the nucleic acid fragments).
  • the linear order of signals generated by each region of the signal generating region is determined by the nCounter digital analyzer (Nanter digital analyzer, Nanostring technology, USA) or US Patent No. 8,519, 115 used in the following embodiments of the present invention.
  • Nikon Eclipse TE2000E Perfect Focus, 1.4 NA Plan Apo VC 60X oil-immersion lens (Nikontk, Japan), anX-) used in its related article, Nat Biotechnol.
  • the signal generating region is composed of six regions and labeled using fluorescent materials capable of generating four different signals as in the following embodiments of the present invention
  • 16,384 A total of 16,384 signal generating areas (or 16,384 signal probes including each signal generating area) capable of generating 6 unique signals are obtained, of which four are labeled with the same signaling material. It is obtained.
  • each region constituting it in the signaling region may be determined in consideration of the extent to which the signaling substance is labeled (that is, the intensity of the generated signal).
  • the length of such regions can typically range from 0.1 kb (kilo base) to 1.5 kb.
  • nucleic acid amplification is prepared using three kinds of natural nucleotides (ie, dATP, dTTP and dGTP) and 100% aminoaryl-dCTP (all of which use aminoaryl-dCTP instead of dCTP).
  • a 903 bp long nucleic acid fragment incorporated into aminoaryl-dCTP was labeled with a signaling material.
  • the length of the region may be in the range of 0.2 kb to 0.5 kb.
  • 100% of aminoaryl-dCTP is used in the embodiment of the present invention, even when 30% to 70% of aminoaryl-dCTP is used, the length of about 0.9bp may be enough to generate a sufficient signal.
  • the binding of a specific binding region and a signal generating region to a target molecule is performed when both are nucleic acids (ie, when the specific binding region with the target molecule is a single-stranded nucleic acid for detecting the target nucleic acid).
  • Ligase known in the art such as T4 ligase, can be linked.
  • an appropriate functional group such as an amino group, a hydroxyl group, a carboxyl group, a carbonyl group, a thiol group ( functional groups (reactive groups) and introduce amide bonds, ester bonds, sulfide ester bonds, ether bonds, and the like to covalently connect the signaling region.
  • a spacer and / or a fixed region may exist between the specific binding region and the signal generating region with the target molecule, as shown in FIG. 1.
  • Figure 1 shows the signal probe of the present invention and the main components used in the detection method of the target molecule of the present invention using the signal probe.
  • the spacer is for separating the specific binding region and the signal generating region from the target molecule, and when the specific binding region to the target molecule is bound to the target molecule, the conjugate prevents the binding from blocking the signal detection of the signal generating portion. It is to facilitate the signal detection of the signal generator.
  • the spacer may be a single stranded nucleic acid, a double stranded nucleic acid, RNA, DAN, or the like, and may comprise a nucleic acid analog such as PNA or modified nucleotides.
  • the length is not particularly limited as long as it can facilitate signal detection of the signal generator. It will usually be 20 to 50 bp in length.
  • the fixed region is a region where one or more fixed nucleic acid molecules (or fixed molecules), which will be described later, are complementarily combined to additionally fix and straighten the signal probe of the present invention to an analysis support as described below. Consists of known sequences. Therefore, the fixed region is composed of a single-stranded nucleic acid of the sequence complementary to the fixed nucleic acid molecule, the sequence of the same substrate may be repeated two or more times so that two or more fixed nucleic acid molecules can bind.
  • the fixed region may be RNA, DNA, or the like as long as it can complementarily bind to the fixed nucleic acid molecule, and may include a nucleic acid analog such as PNA or modified nucleotide, and its length may exert sufficient binding force with the fixed nucleic acid molecule. As long as it can be. In general, the sequence of the same substrate of 20 to 50bp long will be composed of 2 to 20 repetitions.
  • both the spacer or the fixed region are present in the signal probe of the present invention, they are covalently coupled to the adjacent region, and the order may be any order, but the fixed region is adjacent to the signal generating region, that is, the signal generating region. It is preferable to exist on the 5 'side or the 3' side.
  • the fixed region additionally fixes the signal probe of the present invention to the analytical support, the fixed region must exist adjacent to the signal generating region to fix the signal generating region to the analytical support in a linear or streached form. This is because signal detection in the signal generation area is facilitated.
  • the binding tag functions to fix the signal probe of the present invention through specific binding with the binding partner to an analytical support coated with a binding partner capable of binding thereto.
  • a representative material of the binding tag that can be used is biotin, and a representative binding partner for this is streptavidin.
  • Streptavidin is an avidin-based antibiotic protein isolated from Streptomyces avidinii that is a tetrameric structure and can bind up to four biotin molecules.
  • the binding tag may use biotin analogues such as desthiobiotin and iminobiotin as well as biotin, and the binding partner coated on the analytical support may specifically bind to biotin in addition to streptavidin.
  • Streptavidin analogs such as avidin, traptavidin, and neutravidin (NeutrAvidin, Thermofisher SCIENTIFIC, USA) may be used.
  • the present invention relates to a method for detecting a target molecule in a sample using a signal probe as described above.
  • the detection method of the present invention includes the steps of (a) treating the signal probe on the sample to be analyzed to form a complex of a target molecule and a signal probe in the sample, and (b) detecting the signal probe of the complex. It is configured by.
  • the sample to be analyzed may be any mixture or solution containing or suspected of containing the target molecule to be detected and having the need for detection.
  • the sample may be a biological sample obtained from a human body or an animal, as well as a processed sample in which such a biological sample is processed to increase the concentration of the target molecule, and furthermore, environmental pollution factors such as water, food, industrial wastewater, or the like containing or containing the target powder. It may also be a sample that requires testing for toxic factors.
  • a sample may include a proper diluent, a buffer solution, and may be a bacterial culture or a viral culture containing a medium or a medium component when detecting the presence of bacteria or viruses.
  • the sample to be analyzed may preferably be a biological sample obtained from a human body or an animal or a processed sample thereof.
  • the biological sample may be obtained from a human or animal having a need for detection because it is suspected to contain or contain target molecules to be detected such as blood, urine, saliva, semen, amniotic fluid, lymph fluid, sputum, and tissues.
  • Processed samples include, for example, plasma, serum, and biological samples using protein extraction kits with high protein concentrations, samples with high nucleic acid (DNA or RNA) concentrations, tissue extracts, cells obtained from tissues, cell lysates, and cell cultures. And the like.
  • the step of forming the target molecule and the signal probe complex in the sample if the sample contains a variety of target molecules using a variety of signal probes specific to each target molecule, multiple complexes It is possible to form and detect it.
  • detection is understood as meaning qualitative analysis of the presence or absence of a target molecule or further including quantitative analysis of the amount and concentration of a target molecule.
  • the sample is treated with a nitrocellulose membrane having a high binding affinity for the protein and then in the sample containing the target molecule.
  • Adsorbing proteins to the nitrocellulose membrane may include removing the other molecules such as lipids, nucleic acids, metabolites, and the like other than the protein adsorbed onto the nitrocellulose membrane using a suitable washing solution.
  • the washing solution may be purchased and used in the art or properly prepared, and the washing solution includes a surfactant and a salt.
  • Surfactants include SDS, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, Triton X-405, Triton X-100, Tetronic 908, Cholesterol PEG 900, Polyoxyethylene Ether W-1, Span 20, Span 40, Span 85, these Mixtures may be used, and salts may be acetate, lactate, citrate, phosphate, nitrate, sulfate, chloride salts, mixtures thereof (particularly SSC, SSPE, etc.) of lithium, sodium, potassium and ammonium.
  • a blocking solution containing an appropriate blocking agent such as bovine serum albumin may be included to block the non-adsorbed surface of the nitrocellulose membrane.
  • This blocking step prevents the antibody from adsorbing the signal probe from degrading the detection accuracy when the specific binding region with the target molecule is used as a signal probe for the formation of a complex of the target molecule and the signal probe. It is to.
  • the signal probe is processed to form a complex of the signal probe and the target molecule of step (a). In the case where the specific binding region with the target molecule is used as a signal probe that is not an antibody but an aptamer, the blocking step is not necessarily required.
  • the signal probe of the present invention is cross-linked with the double-stranded nucleic acids constituting the same, so that even when heated, the signal generating region is not lost and remains stable and does not affect the accuracy of detection of target molecules.
  • the signal of the signal probe is a signal generated by a signal generating material labeled on the signal probe
  • the signal detecting step of the signal probe may be performed by using an appropriate device capable of detecting the signal according to the signal generating material used.
  • a device may be a spectrophotometer, a fluorometer, an absorption spectrometer, a luminometer, a chemiluminometer, an actinometer, etc., depending on the characteristics of the signal.
  • nCounter digital analyzer NCounter digital analyzer, Nanostring technology, USA
  • a fixed molecule having a single-stranded nucleic acid sequence complementary to the fixed region of the signal probe and having a binding tag capable of binding to the complementary single-stranded nucleic acid sequence and binding to a binding partner coated on the analytical support.
  • fixed nucleic acid molecules to an analytical support having a fixed signal probe.
  • the binding tag of the fixed molecule biotin or a biotin analogue may be used as described above with respect to the signal probe.
  • an analytical support that can be used in the method of the present invention may be formed in a shape or a shape so long as a binding partner (eg, streptavidin, etc.) to a binding tag of a signal probe can be coated on its surface through covalent or non-covalent association
  • a binding partner eg, streptavidin, etc.
  • Such as film form, bead form, particulate form, substrate form (such as glass slide), column form, well form, well plate form, etc., and the material may be plastic, resin, polysaccharide, silica, functionalized glass, Modified silicon, carbon, metal, inorganic glasses, membranes, nylon, natural resins, and the like.
  • the material of the polymeric support is polystyrene, polyethylene glycol tetraphthalate, polyvinyl acetate, polyvinyl chloride, polyvinyl pyrrolidone, polyacrylo Nitrile (polyacrylonitrile), polymethyl methacrylate, polytetrafluoroethylene, butyl rubber, styrenebutadiene rubber, natural rubber, polyethylene, polypropylene ( polypropylene), (poly) tetrafluoroethylene, (poly) vinylidenefluoride, polycarbonate, polymethylpentene and the like.
  • Figure 1 shows the main constituents, including signal probes and fixed molecules, used in the method of the present invention.
  • the overall process of detecting proteins as target molecules using the nitrocellulose membrane as described above is shown in Figures 2 and 3.
  • the specific binding regions with the target molecules of the signal probe are divided into the case of the antibody and the case of the aptamer, respectively.
  • the detection method of the target molecule of the present invention may be made by using a capture probe in addition to the signal probe as described above.
  • capture detection method of the present invention (a) by processing a signal probe and a capture probe that specifically binds to the target molecule to the sample to be analyzed the target Forming a complex of a molecule with the signal probe and the capture probe, and obtaining a mixture comprising the complex, the complex comprising the signal probe, the capture probe, etc., and (b) And detecting the signal probe.
  • the capture probe is a region (i.e., an epitope) of a target molecule to which the signal probe specifically binds and a region that specifically binds to another region and magnetic particles (or magnetic beads) in the region.
  • a region i.e., an epitope
  • the signal probe specifically binds
  • a region that specifically binds to another region and magnetic particles (or magnetic beads) in the region has a connected configuration, a schematic diagram of which is shown in FIG.
  • Magnetic particles are proteins, nucleic acids, cells in the art as disclosed in US Pat. No. 5,665,554, US Pat. No. 6,0279.45, US Pat. No. 7,078,224, Korean Patent Publication No. 2006-0061494, Korean Patent No. 0541282, and the like.
  • the magnetic particles that have been used for the separation of biomaterials are iron oxide magnetic particles, and as such iron oxide magnetic particles, magnetite (Fe 3 O 4 ), maghemite (Fe 2 O 3 ), hematite (mematite; Fe 2 O 3 ) and the like have been used.
  • Magnetic particles can be modified with silica, polymer, gold, and silver nonmagnetic materials to be used for separation of biomolecules such as proteins and nucleic acids, and can be combined with biomolecules such as proteins and nucleic acids.
  • a functional group such as a carboxyl group, an epoxy group, a tosyl group, an amino group, or a siloxane group, or a biotin or streptavidin binding substance needs to be introduced.
  • Magnetic particles having such properties or methods for producing the same are well known in the art, and are described in US Pat. No. 6,027,945, US Pat. No. 6,673,631, US Pat. No. 7,183,002, Japanese Patent No. 3,253,638, and Japanese Patent Laid-Open No. 2001-136970. And many other documents, such as Korean Patent Publication No. 2009-0088299, and Dynabeads magnetic beads coated with streptavidin (Thermo Fisher Scientific, USA), DYNAL M-270 and DYNAL M-280 having a tosyl group introduced therein. (Dynal Biotech ASA, Norway) and the like are commercially available.
  • the capture probe may have a specific binding region with its target molecule covalently linked to such a magnetic particle through a functional group or through a noncovalent bond between biotin and streptavidin.
  • the specific binding region of the capture probe with the target molecule is recognized and bound by the specific binding region of the signal probe with the target molecule in order to prevent competitive binding to the target molecule and the specific binding region of the signal probe. It is designed to recognize and bind a site different from the site to be.
  • the step (a) is performed by processing a signal probe and a capture probe on the sample to be analyzed, in which case a complex between the target molecule, the signal probe, and the capture probe is formed, together with the A mixture comprising a complex, a signal probe without forming a complex, a capture probe without forming a complex, a nontarget molecule, and the like is obtained.
  • the next step is to detect the signal probe of the complex in the mixture (b).
  • the detection of the signal probe is that the capture probe contains magnetic particles, so when the mixture is applied to the magnet, only the capture probe which does not form a complex with the complex including the capture probe binds to the magnet.
  • signal probes and non-target molecules which do not form a complex are removed.
  • the signal probe After bonding the composite or the like to the magnet, only the signal probe is separated from the composite, which is possible by heating or treatment with a surfactant as described above. As described above, the double-stranded nucleic acid constituting the signal probe is crosslinked with each other to maintain a stable state even when heated.
  • the detecting step of the signal probe of step (b) includes only a capture probe that does not form a complex with the complex by applying a magnet to the mixture (b-1). And (b-2) separating the signal probe from the complex bound to the magnet, and (b-3) detecting the separated signal probe.
  • a capture probe that does not form a complex with the complex by applying a magnet to the mixture (b-1).
  • b-2 separating the signal probe from the complex bound to the magnet
  • (b-3) detecting the separated signal probe.
  • the detection method of the target molecule can be made by using a capture competition molecule in addition to the signal probe as shown in Figures 6 and 7.
  • the method using the capture competition molecule of the present invention (hereinafter referred to as "competition detection method of the present invention” for convenience) (a) by processing a signal probe and a capture competition molecule that specifically binds the target molecule to the sample to be analyzed. Forming a complex of the capture competition molecule and the signal probe, obtaining a mixture comprising the complex, and (b) detecting the signal probe of the complex in the mixture.
  • the mixture may include a complex of a target molecule and a signal probe, a signal probe that does not form a complex, a competition molecule that does not form a complex, a target molecule that does not form a complex, and a nontarget molecule, in addition to a complex of a capture competition molecule and a signal probe.
  • the capture competition molecule has a region that specifically binds to the same site (ie, an epitope) of the target molecule to which the signal probe specifically binds, and a structure in which magnetic particles are connected to the region.
  • the capture competition molecule will generally be the same molecule as the target molecule, but as long as it has the same site as the site of the target molecule (ie epitope) to which the signal probe specifically binds, it can compete in binding with the signal probe. It may be.
  • Such analogous molecules include proteins in which the target protein is fused with another protein (Fc of an antibody).
  • the capture competition molecule has a binding site of the same signal probe as the target molecule, so it competes with the target molecule for binding to the signal probe, and when the signal probe is processed to the sample in a limited amount and the capture competition molecule is quantified and processed, the capture competition
  • the detection result of the molecule may provide information (ie, presence or absence of the target molecule, concentration, etc.) of the target molecule in the sample to be analyzed.
  • the "signal probe is processed to the sample in a limited amount” means that it is processed below the amount capable of detecting both the capture competition molecule and the target molecule, and theoretically, the concentration (quantitative value) of the capture competition molecule quantified This means that the sample is treated with a concentration capable of detecting less than the sum of the estimated concentrations (quantitative values) of the target molecules present in the sample to be analyzed, but the actual processed signal probes bind to the capture competition molecules or target molecules. And may be processed beyond the summation value. However, in general, since it is difficult to estimate the concentration of the target molecule in the sample, the limit amount of the signal probe will be a concentration capable of detecting below the concentration of the captured competitive molecule.
  • detecting the signal probe of the complex in the mixture of step (b) can be performed as in the capture detection method of the present invention.
  • the details of the (b-3-i) fixation of the signal probe to the support for analysis and (b-3-ii) the detection step may refer to the descriptions related to the protein detection method using the nitrocellulose membrane.
  • the present invention uses the stable double-stranded nucleic acid signal probe in the detection of the target molecule to form a complex with the target molecule of the target molecule, and then by separating only the signal probe from the complex by heating or the like and detecting the signal probe It is possible to provide a method for detecting a target molecule.
  • FIGS. 2 and 3 show step by step the detection method of the protein of the present invention using a nitrocellulose membrane.
  • 4 and 5 show step by step detection method of the target molecule using the capture probe.
  • 6 and 7 illustrate stepwise detection methods of target molecules using capture competition molecules.
  • nCounter digital analyzer 10 is an image obtained by using a signal probe of the present invention to detect bacteria and the results using an nCounter digital analyzer (NCounter digital analyzer, Nanostring technology, USA).
  • FIG. 11 is a schematic diagram showing that the signal probe of the present invention is imaged in the nCounter digital analyzer (NCounter digital analyzer, Nanostring technology, USA).
  • FIG. 12 is a graph of analyzing two types of standard target molecules using the signal probe of the present invention and displaying the target molecule amounts and signal values in log vs. log scale.
  • FIG. 13 is a graph in which 13 types of target molecules are analyzed twice using the signal probe of the present invention, and the results are displayed on the log-log scale of the target molecules and the signal values.
  • the "signal probe” is described as “first probe” or used interchangeably in the following examples, and the “signal generation area” is described as “color indicator bar code” or as used interchangeably with the “signal probe”.
  • Specific binding regions with target molecules "have been described as” first probe “or” first ligand "or in combination with them.
  • Nucleotide sequence information of M13 DNA which is a skeleton of signal tag, was obtained from GenBank data system (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (Accession number NC_003287).
  • one type selected from four types of fifth domain signal tags is divided into four tubes, each containing a final concentration of 10 ug / mL, and each tube containing four types of sixth domain signal tags having a final concentration of 10 ug / mL.
  • Put each mL into the final volume of 100L T4 ligase reaction solution 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 10 mM DTT, pH 7.5
  • the remaining three types of the fifth domain signal tag were also processed in the same manner as described above to mix all four types of the fifth domain signal tag and four types of the sixth domain signal tag, respectively. , 6 domain mixed solution.
  • FIG. 9 An image of the result of electrophoresis of the reaction product for each reaction step is shown in FIG. 9.
  • 5'-color indicator barcode-spacer-first probe-3 ' An unfixed first probe was made with the structure of 5'-color indicator barcode-spacer-first probe-3 '.
  • 5 'and 3' are used to mean the direction or order of the arrangement of nucleic acids, such as color indicator bar code, spacer, such as when the nucleic acid is used as a component of the probe.
  • reaction solution 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2, with 10 ul of 5'-spacer-first probe-3 'structure at 1 mg / ml and 10 ul of color indicator barcode at 1 mg / ml
  • reaction solution 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl 2, with 10 ul of 5'-spacer-first probe-3 'structure at 1 mg / ml and 10 ul of color indicator barcode at 1 mg / ml
  • 5 unit / uL T4 ligase N4 ligase
  • 5'-Spacer-NH 2 a spacer of single stranded nucleic acid with the next reactive group (NH 2 ), was custom made (Integrated DNA Technologies, USA). Next, the activated antibody and the spacer having the reactive group were reacted in an N-succinimidyl-S-acetyl-thioacetate solution to prepare a 5'-spacer-antibody-3 'structure.
  • reaction solution with 10 ul of 5'-spacer-antibody-3 'structure at 1 mg / ml and 10 ul of color indicator barcode at 1 mg / ml (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 2 uL of 5 unit / uL T4 ligase (NEB, USA) was added to mM ATP, 10 mM DTT, pH 7.5) to prepare a non-fixed first probe for the detection of proteins and the like.
  • the fixed first probe was made with a 5'-first probe-spacer-fixed region-color indicator barcode-biotin-3 'structure.
  • the fixed region is composed of a repeating sequence with a known sequence, and a fixed molecule (ie, a fixed nucleic acid molecule) comprising a sequence complementary to the fixed region is used to fix the first probe to the support by complementarily binding.
  • a fixed first probe using a single stranded nucleic acid as a first probe was prepared as follows. First, a 5'-spacer-fixed region-3 'construct of single-stranded nucleic acid was prepared and prepared (Integrated DNA Technologies, USA). The reaction of adding biotin to the following color indicator barcodes was made using the Thermo Scientific Biotin 3 End DNA Labeling Kit (Thermo Scientific, USA) to prepare 5'-color indicator barcode-biotin-3 'constructs.
  • a fixed first probe using an antibody as the first probe was prepared as follows. First, an antibody to which a 5'-color indicator barcode-biotin-3 'structure and a reactive group (SH group) were added was prepared in the same manner as above, and 5'-NH, a single-stranded nucleic acid having a reactive group (NH 2 ), was prepared. The 2 -spacer-fixed region-3 ′ construct was made to order and prepared (Integrated DNA Technologies, USA).
  • An unfixed first probe using an aptamer as the first probe was prepared as follows. First, the 5'-color indicator barcode-biotin-3 'construct was prepared in the same manner as above, and the single-stranded nucleic acid of the 5'-aptammer-spacer-fixed region-3' was prepared by order production (Integrated DNA Technologies Inc.). , United States of America).
  • the second probe was prepared by combining magnetic beads with a capture probe or a capture probe and a second probe, which is a specific binding region with the target molecule, and a harvesting material, and a competition molecule, with a target molecule (or target molecule). It was prepared by combining magnetic beads with a competitive target molecule analog) and a harvesting material.
  • a second probe, a single stranded nucleic acid or an aptamer, a second probe was prepared by using biotin and streptavidin as a mediator to the second probe.
  • the reaction of adding biotin to the previously prepared mononucleic acid or aptamer was performed using the Thermo Scientific Biotin 3 End DNA Labeling Kit (Thermo Scientific, Inc., USA). Prepared. Specifically, according to the standard method provided by the manufacturer in a reaction mixture of 45 uL (100 mM Potassium Acetate, 20 mM Tris) in which 100 ul of the structure of 1 mg / ml concentration and 5 uL of Biotin-11-UTP were mixed at a concentration of 5 uM.
  • the second probe wherein the second probe is an antibody
  • 100 ⁇ g of antibody and 5 mg of Tosyl group (Tosylactivated) magnetic beads (M-280 Tosylactivated magnetic beads, Dynal Biotech ASA, Norway) were added to the buffer solution (0.1 M borate buffer, pH 9.5).
  • the reaction was carried out at room temperature for 48 hours.
  • Magnetic beads to which antibodies were bound through a tosyl group were separated using a magnet, and the beads were washed with the same buffer solution to remove unbound antibodies.
  • the magnetic beads (hereinafter referred to as capture probes) in which the molecules were bonded were inactivated tosyl groups not bound to the molecules by washing at 37 ° C. for 4 hours with 0.1% BSA solution (Bovine Serum Albumin, Sigma, USA) after washing. . After washing several times, the magnetic beads were mixed with the buffer solution (0.1 M PBS, pH 7.4) and stored at 4 ° C.
  • Capture competition molecules whose competition molecules are single-stranded nucleic acids are used for detection of nucleic acids that are target molecules, which were prepared in the same manner as the preparation of the second probe, wherein the second probe is a single-stranded nucleic acid or aptamer.
  • Capture competition molecules whose competition molecules are proteins are used to detect proteins that are target molecules, which were prepared in the same manner as the preparation of the second probe wherein the second probe is a single-stranded nucleic acid or aptamer.
  • the competition molecule used the same protein as the target protein.
  • the fixed molecule was prepared by custom-made a single-stranded nucleic acid labeled with a biotin at the 5 'end of the base sequence complementary to the repeat sequence constituting the fixed region of the first probe (Integrated DNA Technologies, USA).
  • Representative food poisoning bacteria E. coli, Salmonella, Listeria and Staphylococcus were detected using a fixed first probe prepared using the antibodies of Table 2 and the aptamer of Table 3 as the first probe (ligand).
  • Antibodies that bind to food poisoning surface molecules Antibody type Catalog Number Supplier E. coli / Anti-E. coli antibody ab25823 Abcam loves Listeria / Anti-Listeria Antibody 01-90-95 KPL Salmonella CSA-1 / Anti-Salmonella CSA-1 Antibody 01-91-99 KPL
  • the reaction solution is 10 mM PBS buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl pH 7.4) for antibody ligands and Selex buffer (20 mM Tris-Cl buffer, pH 7.6 contained 100 mM NaCl, for aptamer ligands). 2 mM MgCl 2 , 5 mM KCl, 1 mM CaCl 2 and 0.02% Tween) were used.
  • the reaction solution contained 0.05 to 0.2% (w / v) of sodium azide for inhibiting bacterial growth and 0.1 to 0.3% (w / v) of bovine serum albumin for inhibiting nonspecific binding. The reaction was carried out at a temperature of 20-30 ° C.
  • 70 ul of the sample containing bacteria was mixed with 15 ul of the first probe combined with biotin and reacted by shaking for 30 minutes.
  • 20 ul of the reaction solution was treated with a streptavidin-coated glass slide (Nanocs, USA), and the glass slide was washed three times with a washing solution containing 0.1X SSPE and 0.1% tween-20 to bind bacteria.
  • the first probe that did not or was in nonspecific binding was removed. Spots where the presence signal of the bacteria in the complex formed by covering the cover slip and the first probe combined with the bacteria are generated, using the manufacturer's protocol using a nCounter digital analyzer (Nanostring technology, USA). And imaged according to FIG. 9.
  • Sequence information of the target molecules ⁇ -actin, IL17, and IL17R mRNA can be obtained from the GenBank data system (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) (Accession number of IL17 is NM_002190, And Accession number of IL17RA: NM_014339).
  • Probe Sequence for Target mRNA kinds First probe (5'-3 ') Second probe (5'-3 ') ⁇ -actin mRNA gggcgacgaggcccagagcaagaga (SEQ ID NO: 19) ggcatcctcaccctgaagtacccca (SEQ ID NO: 20) IL17 mRNA ccctcaggaaccctcatccttcaa (SEQ ID NO: 21) gacagcctcatttcggactaaactc (SEQ ID NO: 22) IL17RA mRNA ggagcagaagcctcccagccactag (SEQ ID NO: 23) ccttttgggctcagtctctccaata (SEQ ID NO: 24)
  • Human cartilage tissue (Promocell, Germany) was used for the sample.
  • the target molecule mRNA in the sample was isolated using an AllPrep DNA / RNA / Protein Mini kit (Qiagen, USA).
  • cartilage tissue was dissolved in a buffer provided by the manufacturer according to the manufacturer's protocol, and then the dissolved sample was treated in a column and centrifuged to bind RNA to the column membrane.
  • RNA separation on the column membrane was performed by washing the column with RNA, extracting RNA from the membrane, and then centrifuging to harvest RNA.
  • the first probe-target mRNA-second probe complex was induced by hybridization by mixing and shaking the first probe 200 ng / uL and the second probe 200 ng / uL to 100 ng / uL total RNA.
  • Hybridization reaction was carried out at 65 °C conditions in a reaction solution containing 0.5 M NaHPO 4 , 7% sodium dodecyl sulfate (SDS) and 1 mM EDTA.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the reaction solution was then treated with a magnet to induce the fixation of the second probe with the magnet by the magnetic beads, followed by washing with a washing solution to remove the unbound first probe and the non-target RNA.
  • the wash was performed once at 48 ° C using 6X standard saline citrate / 0.1% SDS, once at 68 ° C using 0.1X SSC / 0.1% SDS, and once at 42 ° C using 0.2X SSC / 0.1% SDS. Three times were performed.
  • a magnet containing 0.1X SSPE and 0.1% tween-20 was treated in a magnet bound to the first probe-target mRNA-second probe complex and heated at 95 ° C. for 5 minutes to induce separation of the first probe from the complex. Then, the supernatant containing the first probe was harvested.
  • the first probe was immobilized on a streptavidin-coated cover slip using a molecular counting analyzer, nCounter digital analyzer (Nanostring technology, USA), according to the manufacturer's protocol. Spots were imaged to detect and quantify.
  • the first probe was further immobilized on the surface by adding 60 uL of 500 nM fixed molecule to the unrolled first probe to induce complementary binding to the fixed region including the repeat sequence of the first probe. The current was held for 5 minutes during this immobilization process.
  • the TAE solution was removed and imaging was prepared by adding SlowFade reagent (Invitrogen), an anti-photobleaching reagent. After this preparation, four images were acquired at four different excitation wavelengths (480, 545, 580, 622) corresponding to four fluorescent materials through the analyzer of the analyzer. Spatial clustering was performed to obtain the images for the first probe as shown in the schematic diagram of FIG. 11. Imaging Procedure The resolution of the analyzer was set to 600 field of view (FOV).
  • the data was downloaded from the analyzer and analyzed on Excel according to the analysis instructions provided by the manufacturer. Data were initially normalized to the reference and target molecules in the sample using the positive assay control standard curve provided. Normalized values were averaged over the target molecule values using the values of the reference materials included in the sample. Quantitative values of target molecules were calculated by averaging the results of three replicate performance analysis.
  • the detection reaction was performed for the target molecules of Table 5 below using only the fixed first probe including the polyclonal antibody of Table 5 as the first probe for the target molecule.
  • the overall process of this protein detection reaction can be seen in FIGS. 2 and 3.
  • Target Molecules and Antibodies Target molecule / antibody Catalog Number manufacturer NGF / NGF Anti-NGF / NGF ⁇ Antibody OKBB00229 Aviva Systems Biology Amyloid beta (A4) Precursor Protein (APP) Anti-Amyloid beta (A4) Precursor Protein (APP) antibody ab12266 Abcam (Tau) / Anti- (Tau) antibody T6402 SIGMA phospho-Tau (pSer400) / Anti-phospho-Tau (pSer400) antibody T1700 SIGMA C Reactive Protein (CRP) / Anti-C Reactive Protein (CRP) ab99995 abcam TGF alpha / Anti-TGF alpha antibody ab9585 abcam IL1 beta / Anti-IL1 beta antibody ab2105 abcam Serum Amyloid A / Anti-Serum Amyloid A antibody ab200584 abcam p53 / p53 Antibody (DO-7) MA5-12557 abcam CEACAM5 / CEACAM5 Polyclonal Antibody MBS170144 Bio
  • a solution containing 100 ug / ml of the target molecule of Table 5 was prepared using 10 mM PBS buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl pH 7.4), and the solution was diluted in steps.
  • the final biomolecule concentrations were 1,000 pg / mL, 100 pg / mL, 10 pg / mL, 0.1 pg / mL and 0 pg / mL.
  • Analytical mixed samples were prepared by mixing the above diluted solutions for various biomolecules at various concentrations.
  • the fixed first probe solution was prepared to contain the first probe at a concentration of 200 ng / ul using 10 mM PBS buffer (137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl pH 7.4).
  • Nitrocellulose membrane disc was added to the reaction solution containing the sample to be shaken for 30 minutes to allow the protein in the sample to be adsorbed onto the membrane.
  • the disc was washed with 150 uL of 0.1X SSPE / 0.1% tween-20 solution and placed in a Blocking solution [washing solution with 2% (w / v) Bovine Serum Albumin (BSA)] to react.
  • 70 ul of the fixed first probe solution for each target molecule was added thereto, and stirred for 1 hour to induce complex formation between the target molecule and the first probe.
  • 150 ⁇ L of 0.1X SSPE / 0.1% tween-20 solution was added to the disk to remove excess first probe that did not form a complex and first probe that formed a nonspecific complex, and washed three times.
  • 0.1X SSPE / 0.1% tween-20 solution was added to the washed disc and heated at 95 ° C. for 5 minutes to induce separation of the first probe from the complex. Then, the supernatant containing the first probe was harvested.
  • the first probe was streaked in accordance with the manufacturer's protocol using an nCounter digital analyzer (NCounter digital analyzer, Nanostring technology, USA) in the same manner as in Example 3-1.
  • Tabidine was fixed on the coated slip and the fixed spots were imaged to detect and quantify.
  • the polyclonal antibody of Table 5 Similar to the fixed first probe comprising the polyclonal antibody of Table 5 as the first probe for the target molecule, the polyclonal antibody of Table 5 as the second probe for each target molecule
  • the detection probe for the target molecule of Table 5 was carried out using 2 probes. The overall process of this protein detection reaction can be seen in FIGS. 4 and 5.
  • Analytical samples were prepared in the same manner as in Example 4-1. To 25 ul of the sample, a mixture of 70 ul of the fixed first probe solution and 70 uL of the second probe solution for each target molecule was stirred for 1 hour while shaking to induce complex formation between the first probe-target molecule and the second probe. It was. The reaction solution was then treated with a magnet to induce fixation of the second probe with a magnetic bead to the magnet, followed by washing with a wash solution to remove unbound first probe and non-target molecules. The washing was performed three times using 150 uL of 0.1X SSPE / 0.1% tween-20 solution.
  • the first probe was streaked in accordance with the manufacturer's protocol using an nCounter digital analyzer (NCounter digital analyzer, Nanostring technology, USA) in the same manner as in Example 3-1.
  • Tabidine was fixed on the coated slip and the fixed spots were imaged to detect and quantify.
  • FIG. Very high reproducibility was observed between pg / mL.
  • the analytical results also showed that the linear regression correlation coefficient of concentration vs. count was linear with ⁇ 0.989 logo at 0.1 log or more of concentration.
  • a detection reaction is performed on the target molecules of ⁇ Table 5> by using a first probe having the antibody of Table 6 as the first probe and a capture competition molecule using each protein of Table 5 as a competition molecule. It was.
  • the overall process of this protein detection reaction can be seen in FIGS. 6 and 7.
  • the first probe was streaked in accordance with the manufacturer's protocol using an nCounter digital analyzer (NCounter digital analyzer, Nanostring technology, USA) in the same manner as in Example 3-1.
  • Tabidine was fixed on the coated slip and the fixed spots were imaged to detect and quantify.
  • the quantitative result of the target molecule was obtained using the standard curve from the quantitative result of the capture competition molecule.

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Abstract

본 발명은 이중가닥 핵산을 구성하는 단일가닥 핵산이 서로 상보적으로 가교결합(또는 공유결합)하고 있어 온도, pH, 염, 이온 강도(ionic strength) 등의 영향을 받지 않은 안정한 이중가닥 핵산 신호 프로브를 개시한다. 또한 본 발명은 여 표적분자의 검출에 있어서 상기 안정한 이중가닥 핵산 신호 프로브를 이용하여 그 신호 프로브를 표적분자와 복합체를 형성시킨 후에 가열 등에 의해 그 복합체로부터 그 신호 프로브만을 분리하고 신호 프로브를 검출함으로써 표적분자를 검출할 수 있는 방법을 개시한다.

Description

이중가닥 핵산 신호 프로브 및 이를 이용한 표적분자의 검출방법
본 발명은 이중가닥 핵산 신호 프로브 및 이를 이용한 표적분자의 검출방법에 관한 것이다.
세포의 DNA에 암호화되어 있는 유전정보는 DNA 복제를 통하여 자손에게 전달된다. 또한 유전정보는 DNA에서 RNA, 그리고 RNA에서 단백질의 경로를 통하여 발현된다. 모든 세포는 유전정보의 전달 또는 발현과 관련된 생체분자들로 이루어져 있으며 이들의 존재양상은 생물체의 기능에 중요한 영향을 준다.
표적분자(또는 바이오마커)는 임상적으로 검출가능하며 특정 용도를 위하여 선택된 생체분자이다. 생체분자는 질병의 발생 또는 진행에 따라 세포내에서 증감을 나타내거나 분비될 수 있으며 특정 조직에서 말단 조직까지 혈류를 통하여 쉽게 퍼질 수 있다. 또한 세포가 파괴될 경우에도 생체분자들의 변화가 나타난다.
대표적인 생체분자로는 핵산과 아미노산이 있다. 핵산은 유전정보를 지니는 DNA와 정보의 중개자 역할을 하는 RNA를 구성하며, 염색체 이상, DNA 메틸화 및 유전자 변이(Gene Variation) 등은 유전정보의 발현과정에 영향을 준다. 이중 유전자 변이의 종류로는 단일염기다형성(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)와 구조변이(StructuralVariation) 등이 있다. SNP은 DNA 염기서열에서 하나의 염기서열 (A, T, G, C)의 차이를 보이는 유전적 변화 또는 변이를 의미한다. 구조변이는 결실, 역위, 첨가, 복제 등과 같은 DNA 구조변이를 의미한다. 유전자 변이는 표현형(phenotype)의 변화, 질병에 대한 민감성, 그리고 치료 약제에 대한 반응의 차이 등 개체 간의 차이를 결정짓는다고 알려졌으며, 특히 질환 발생과 진행과정에 관여하는 변이들을 질환연관 유전적 변이(Disease-associated Genetic Variants)라고 칭한다.
유전자란 형질을 만들어 내는 인자로서 유전정보의 단위이다. 각각의 세포에는 5만 내지 10만 개 정도의 유전자가 있지만, 세포는 선택적으로 유전자를 사용한다. 그 중 상당수는 세포 자신의 생명유지활동이나 일상적인 활동을 위하여 사용되는 유전자이다. 내인성 표준 발현 유전자는 특정 유전자나 다수의 유전자 발현량의 비교를 위해 사용되는 유전자이며 전령 RNA(messenger RNA; 이하 mRNA)의 형태를 기반으로 한다. 생체 내 시료의 정량분석은 특정 유전자의 기능 탐색, 특정 기능을 나타내는 유전자 탐색, 특정 조건에서 유전자 발현 양상 확인 및 그 외의 여러 분자생물학적 목적에서 중요하며, 내인성 표준 발현 유전자를 활용한 다양한 유전자발현 측정법이 개발되고 있다.
대표적인 유전자발현 측정법으로 고속병렬분석 기술인 DNA 마이크로어레이 방법이 있다. DNA 마이크로어레이는 단지 혼성화 방식에 의해서 표적 서열을 검출하기 때문에 교차반응에 의한 진양성 문제가 발생되어, 혼성화 시그널의 신뢰도를 개선하여야 하는 문제점이 있다. 또한, 종래의 마이크로어레이의 경우 혼성화 방식에 의해서 시료 내 핵산을 검출하기 때문에 혼성화 후 까다로운 세척 과정이 요구되는 문제점이 있으며, 혼성화 전에 표적서열을 단일가닥으로 만드는 과정이 필수적으로 요구된다. 한편, 최근에 발표된 on-chip PCR은 혼성화 또는 probe extension방식에 의해 검출하기 때문에, 기존 마이크로 어레이와 같이 heterogenous assay system이며, 실시간 검출이 불가능 하고 정확한 정량이 어렵다는 문제점이 있다.
생체분자는 핵산이외에도 아미노산, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 지질(lipid), 다당류, 당단백질, 호르몬, 수용체, 항원, 항체, 바이러스, 병원균, 독성 물질, 기질, 대사산물, 전이 상태 유사체(transition state analog), 보조 인자(cofactor), 저해제, 약, 염료, 영양분, 성장 인자, 세포, 조직 등을 포함하며, 이론적으로는 그 범위는 제한이 없다. 거의 모든 화학적 또는 생물학적 작동체(effector)가 해당되며 다양한 크기의 분자들로 구성되어 있다. 이러한 생체분자에 대한 효율적인 실시간 검출 및 정확한 정량에 대한 개발이 요망되고 있다.
다양한 생체분자 분석법은 검출 감도의 향상 및 다중 분석능의 향상 측면에서 발전을 거듭했지만, 여전히 분석 비용 절감, 분석 시간의 단축, 민감도 향상 및 재현성 증대라는 기술적 과제에 직면해 있다.
한편 미국 등록특허 제8,519,115호(관련 논문은 Nat Biotechnol. 2008, 26:317-325임)에서는 표적 생체분자를 분자 계수할 수 있는 형광 바코드 프로브를 이용하였는데, 이 형광 바코드 프로브는 단위체인 RNA 절편 7개가 이에 상보적인 DNA 백본에 상보적이며 연속적으로 연결됨으로써 이루어진 신호발생영역과 표적핵산과 특이적으로 결합하는 상보적인 단일가닥 핵산인 표적분자 결합영역으로 이루어져 있다. 이 형광 바코드 프로브는 표적 핵산과 결합하여 복합체를 형성하고 표적분자에 특이적인 검출 신호를 발생시키며 그 복합체(즉 표적분자)의 분자계수를 가능하게 한다. 상기 형광 바코드 프로브는 DNA-RNA 이중가닥 핵산으로 단일가닥 핵산이 염기쌍 간 수소결합으로 이루어져 그 안정성이 온도, pH, 염, 이온 강도(ionic strength) 등의 영향을 받는다. 즉 온도 등에 의하여 형광 바코드 프로브의 이중가닥 핵산이 분리될 경우 표적분자에 대한 정확한 정보를 제공할 수 없다. 그러므로 상기 미국 등록특허 제8,519,115호가 개시하는 표적분자의 분석 방법은 온도, pH, 염, 이온 강도(ionic strength) 등을 고려해야 하는 내재적인 한계를 갖는다.
본 발명은 이러한 한계점을 극복하기 위하여 제안되는 것이다. 단일가닥 핵산이 서로 간에 상보적으로 이중가닥 핵산을 형성하되 상보적 공유결합을 형성하여 온도, pH, 염, 이온 강도(ionic strength) 등의 영향을 받지 않은 이중가닥 핵산 프로브를 개시한다.
본 발명의 목적은 단일가닥 핵산이 서로 간에 상보적으로 이중가닥 핵산을 형성하되 가교결합(또는 공유결합)을 형성하여 온도, pH, 염, 이온 강도(ionic strength) 등에 영향을 받지 않고 안정한 이중가닥 핵산 신호 프로브를 개시한다.
본 발명의 다른 목적은 상기 이중가닥 핵산 신호 프로브를 이용한 표적분자의 검출방법을 개시한다.
본 발명의 다른 목적이나 구체적인 목적은 이하에서 제시된다.
일 측면에 있어서 본 발명은 이중가닥 핵산 신호 프로브를 제공한다.
본 발명의 이중가닥 핵산 신호 프로브는 전술한 바와 같이 그 이중가닥 핵산을 구성하는 단일가닥 핵산이 서로 상보적으로 가교결합(또는 공유결합)하고 있는 특징을 갖는다.
구체적으로 본 발명의 이중가닥 핵산 신호 프로브는 (i) 표적분자에 특이적으로 결합하는 영역(여기서 "영역"은 경우에 따라서는 다른 부분의 같거나 비슷한 용어와의 명확한 구분을 위해서 "모이어티(moiety)로 표시될 수도 있다)과 (ii) 그 표적분자와의 특이적 결합영역에 결합되고 그 신호 프로브에 고유한(또는 특이적인) 신호를 발생시키는 신호발생영역을 포함하되, 그 신호발생영역은 서로 상보적으로 가교결합(즉 공유결합)된 이중가닥 핵산으로 그 이중가닥 핵산에는 동일한 신호발생물질로 표지되거나 서로 다른 신호발생물질로 표지된 2개 이상의 영역(여기서 "영역"은 경우에 따라서는 다른 부분의 같거나 비슷한 용어와의 명확한 구분을 위해서 "세그먼트(segment)로 표시될 수도 있다)이 존재하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 신호 프로브에서, 상기 표적분자와 특이적으로 결합하는 영역은 대표적으로 단일가닥 핵산, 항체, 또는 압타머일 수 있다. 상기 특이적 결합영역이 단일가닥 핵산으로 구성될 경우 그 표적분자는 mRNA 등의 핵산이고, 항체로 구성될 경우 그 표적분자는 그 항체가 특이적으로 인식하는 에피토프를 가진 항원이며, 압타머일 경우 그 압타머가 특이적으로 인식하여 결합하는 항원 등의 단백질일 수 있다.
표적분자와의 특이적 결합영역으로서의 단일가닥 핵산은 단일가닥 DNA 또는 단일가닥 RNA 뿐만 아니라, 그 표적분자인 mRNA 등의 핵산과 특이적인 결합 능력을 가지는 한 뉴클레아제나 열에 안정한 PNA(Peptide Nucleic Acid), LNA(Locked Nucleic Acid), HNA(Hexitol Nucleic Acids), ANA(Altritol Nucleic Acids), MNA(Mannitol Nucleic Acids) 등 핵산 유사체이어도 무방하다. 또 마찬가지로 그 표적분자인 mRNA 등의 핵산과 특이적인 결합 능력을 가지는 한 자연적 뉴클레오티드(natural nucleotide) 뿐만 아니라 변형된 뉴클레오티드(modified nucleotide)를 포함할 수 있다. 이러한 변형된 뉴클레오티드는 그 당, 그 포스페이트 및/또는 그 염기에서 변형된 것일 수 있다. 이러한 당, 포스페이트 및/또는 염기에서 변형된 뉴클레오티드는 당업계에 그 제조방법을 포함하여 구체적으로 공지되어 있다. 예컨대 당에서 변형된 뉴클레오티드는, 그 당의 하이드록실 기(OH group)가 할로겐 기, 지방족 기, 에테르 기, 아민 기 등으로 수식된 것, 당인 리보스 또는 디옥시 리보오스 자체가 이를 대신할 수 있는 당 유사체 α-아노머 당(α-anomeric sugars), 아라비노스(arabinose), 자일로스(xyloses) 또는 릭소오스(lyxoses)와 같은 에피머 당(epimeric sugars), 피라노오스 당(pyranose sugars), 퓨라노오스 당(furanose sugars) 등으로 치환된 것을 들수 있다. 또한 예컨대 포스페이트에서의 변형은 포스페이트가 P(O)S(thioate), P(S)S(dithioate), P(O)NR2(amidate), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2(formacetal)로의 변형된 것 등을 들수 있다. 여기서 상기 R 또는 R'는 H 또는 치환되거나 치환되지 않은 알킬 등이며, 포스페이트에서 변형될 경우 그 연결기는 -O-, -N-, -S- 또는 -C-가 되어, 이러한 연결기를 통해 인접 뉴클레오티드가 서로 결합하게 된다.
핵산 유사체나 변형된 뉴클레오티드, 그러한 변형된 뉴클레오티드를 포함하는 단일가닥 핵산 등과 관련해서는 문헌[Sproat, et al, Nucl. Acid Res. 19:733-738(1991)], 문헌[Cotten, et al, Nucl. Acid Res. 19:2629-2635(1991)], 문헌[Hobbs, et al, Biochemistry 12:5138-5145(1973)] 등 당업계에 상당한 문헌이 공지되어 있으며, 보다 구체적인 것은 이들 문헌들을 참조할 수 있다. 이들 문헌을 포함하여 본 명세서에서 인용되는 문헌은 모두 본 명세서의 일부로서 간주된다.
표적분자와의 특이적 결합영역으로서의 단일가닥 핵산의 길이는 그 단일가닥 핵산이 표적분자와 특이적 결합을 유지할 수 있다면 특별한 제한이 없다. 통상 5 내지 70개의 뉴클레오티드들로 구성되지만, 프로브의 길이가 너무 길거나 짧을 경우 비특이적 결합이 일어날 수 있으므로 바람직하게는 15 내지 50개의 염기들로 구성될 것이다.
표적분자와 특이적 결합영역으로서의 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체뿐만 아니라 다중특이적 항체(즉 두 개 이상의 항원 또는 두 개 이상의 에피토프를 인식하는 항체로서 이특이적 항체 등을 말함)이거나, 표적분자와 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 한, 항체의 단편, 화학적으로 수식된 항체, 인간화 항체, 재조합 항체 등일 수도 있다. 항체 단편, 화학적 수식된 항체의 다양한 형태들이 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 Fab, F(ab')2, scFv(중쇄나 경쇄의 Fv를 적당한 링커로 연결시킨 항체), Fv, Fab/c(1개의 Fab와 완전한 Fc를 가지는 항체) 등이나 항체를 단백질 절단 효소 예컨대, 파파인, 펩신으로 처리하여 얻어진 항체 단편 등을 들수 있다.
표적분자와 특이적 결합영역으로서의 압타머는 단일가닥 DNA 압타머 또는 단일가닥 RNA 압타머일 수 있다. 압타머는 항체와 마찬가지로 표적 단백질 등의 표적분자에 특이적으로 결합할 수 있는 핵산 리간드를 의미하는데, 표적분자와 특이적으로 결합할 수 있다면, 압타머는 이중가닥 DNA 또는 RNA 압타머일 수도 있다. 이러한 표적분자와의 특이적 결합할 수 있는 압타머의 제조, 선별 방법 등은 모두 당업계에 공지되어 있으며, 특히 SELEX 기술을 이용할 수 있다. 이 SELEX 기술은 "Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment"의 준말로 이름 붙여진 기술로 해당 기술에 대해서는 문헌[Science 249 (4968):505-510, 1990], 미국 등록특허 제5,475,096, 미국 특허등록 제5,270,163호, 국제특허공개 WO 91/19813 등을 참조할 수 있으며, 압타머의 선별을 위한 구체적인 방법이나 적절한 시약, 재료 등의 사용에 대해서는 문헌[Methods Enzymol 267:275-301, 1996], 문헌[Methods Enzymol 318:193-214, 2000] 등을 참조할 수 있다. 압타머도 그 당, 그 포스페이트 및/또는 그 염기에서 변형된 것일 수 있다.
표적분자와 특이적 결합영역은 대표적으로 단일가닥 핵산, 항체, 압타머이지만, 생체시료 중의 침입 항원에 대한 항체를 표적분자로 하여 이를 검출하기 위한 경우에는 항원일 수도 있다. 여기서 침입 항원은 인체 등에 침입한 세균, 바이러스 등으로부터 유래한 것이며, 그러한 침입 항원에 대한 항체의 검출은 이들 세균, 바이러스의 감염 여부를 판정하는데 유용할 수 있다.
이외에도 표적분자에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 갖는 한, 항체의 Fc 조각, 펩티드, 펩티도미네틱(peptidomimetic), 게프머(gapmer) 등이 또한 특별한 제한없이 표적분자의 특이적 결합영역으로 사용될 수 있다.
본 발명의 신호 프로브가 검출할 수 있는 표적분자는 이 표적분자에 특이적으로 결합할 수 있는 전술한 바의 단일가닥 핵산, 항체, 압타머, 항원 등, 그 신호 프로브의 표적분자와의 특이적 결합영역이 특이적으로 인식, 결합할 수 있는 임의의 분자이다. 그 분자는 바람직하게는 사람 또는 동물 등의 생체분자, 더 바람직하게는 생체분자 중 인체분자이다. 더욱 바람직하게는 질병 진단에 유용한 바이오마커일 수 있다. 대표적으로는 mRNA 등의 핵산, 세균, 바이러스 등으로부터 유래한 항원이나 또는 그 항원에 대한 항체 등이다. 나아가 표적분자는 본 발명의 신호 프로브의 표적분자와의 특이적 결합영역이 특이적으로 결합할 수 있는 세균, 바이러스의 표면상의 단백질일 수 있으며, 이 경우 세균이나 바이러스의 검출이 가능할 수 있다.
본 발명의 신호 프로브에서, 신호발생영역은 이중가닥 핵산으로, 그 가닥 간에서 서로 가교결합되어 있어 고온 상태에도 안정한 이중결합을 유지하며, pH, 염, 이온 강도(ionic strength) 등의 영향을 받지 않는다. 이는 표적분자의 검출 과정에서 온도 등의 변화에 의하여 이중가닥이 풀려 검출 신호를 발생시키는 단일가닥 핵산의 소실됨에 의해 표적분자의 검출 정확성이 떨어지는 단점을 극복할 수 있게 하며, 후술하는 바와 같이 본 발명의 신호 프로브를 이용하여 표적분자를 검출할 때 본 발명의 신호 프로브가 표적분자와 복합체를 형성시키고 분리한 후에 그 복합체를 가열하여 그 복합체로부터 분리된 신호 프로브만을 검출함으로써 표적분자를 검출하는 것을 가능하게 한다.
본 발명에서, 신호발생영역의 두 가닥 사이의 가교결합은 당업계에 공지된 방법을 이용하여 유도될 수 있다. 구체적으로 핵산 이중가닥 간 가교제(intercalator)로 알려진 소랄렌(psoralen), 8-메톡시소랄렌(8-methoxypsoralen) 등의 소라렌 유도체, 미토마이신-C(mitomycin C), 피롤로벤조디아제핀(pyrrolobenzodiazepine), 멜팔란(melphalan), 시클로포스파마이드 (cyclophosphamide), 에티디움 브로마이드(ethidium bromide), 프로플라빈(proflavine), 다우노마이신(daunomycin), 독소루비신(doxorubicin), 탈리도미드(thalidomide) 등을 혼성화환 이중가닥에 처리하고 적정 파장의 UV를 조사하여 이루어질 수 있다. 아래의 본 발명의 실시예에서는 8-메톡시소랄렌을 가교제로 사용하여 365nm 파장의 UV를 조사하여 이중가닥 간 가교결합을 유도한 경우 95℃의 온도에서도 안정적으로 이중가닥을 유지하고 있음을 확인하였다.
본 발명에서 신호발생영역의 신호발생물질(detectable label)은 검출 가능한 신호를 발생시키는 당업계에 공지된 임의의 물질로, 이러한 물질은 신호발생영역을 구성하는 핵산 단편의 단일가닥 또는 이중가닥(또는 그 핵산 단편의 구성단위인 뉴클레오티드)에 공유적 또는 비공유적으로 결합한다.
이러한 신호발생물질은 형광물질, 화학 발광물질, 방사성 동위원소 등 공지된 다양한 물질이 사용될 수 있으며, 형광물질로서는 시아닌 형광물질(Cy2, Cy3, Cy5), 알렉사 플루오르 형광물질 시리즈(Alexa Fluor 350, 405, 430, 488, 514, 594, 610, 647 등; ThermoFisher SCIENTIFIC 사, 미국), 플루오레세인이소티오시아네이트, 테트라메틸로다민이소티오시아네이트, 치환 로다민이소티오시아네이트, 디클로로트리아진이소티오시아네이트 등을 사용할 수 있고, 화학 발광물질로서는 루미놀(luminol), 이소루미놀(isoluminol), 루시퍼린(luciferin), 루시게닌(lucigenin), CSPD(3-(2'-Spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3''-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetane (AMPPD), Disodium 3-(4-methoxyspiro {1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro)tricyclo[3.3.1.13,7]decan}-4-yl) phenyl phosphate) 등을 사용할 수 있으며, 방사성 동위원소로서는 트리티움, 요오드(131I, 125I, 123I, 121I), 인(32P), 황(35S), 금속류(예를 들면, 68Ga, 67Ga, 68Ge, 54Mn, 99Mo, 99Tc, 133Xe 등) 등을 사용할 수 있다. 형광물질을 비롯한 신호발생물질의 다른 예들은 예컨대 국제 공개특허 WO 92/15673, 국제 공개특허 WO 95/07463, 국제 공개특허 WO 98/14605, 국제 공개특허 WO 98/26277, 국제 공개특허 WO 99/49019 등을 비롯하여 미국 특허 제5,292,658호, 미국 특허 제5,418,155호, 미국 특허 제5,683,888호, 미국 특허 제5,741,668호, 미국 특허 제5,777,079호, 미국 특허 제5,876,995호 등을 참조할 수 있다.
바람직하게는 서로 다른 색상을 가진 시아닌 형광물질이나 알렉사플루오르 형광물질을 사용하는 경우이다. 일반적으로 시아닌 형광물질이나 알렉사플루오르 형광물질을 핵산에 표지시킬 때, 핵산 증폭 제조시 4개의 아미노아릴 뉴클레오티드(aminoallyl nucleotide, 염기에 아릴아민을 포함하는 뉴클레오티드) 중 특정 하나(4개 뉴클레오티드 중 하나, 예컨대 아미노아릴-dCTP 또는 아미노아릴-UTP) 또는 그 이상의 아미노아릴 뉴클레오티드를 사용하여 핵산을 증폭 제조함으로써 그러한 하나 이상의 아미노아릴 뉴클레오티드가 핵산 가닥에 일정 간격으로(예컨대 아미노아릴-dCTP를 사용할 경우 dCTP 위치에) 통합되도록 한 후, 그 특정 하나 이상의 아미노아릴 클레오티드의 아민기를 형광물질과 결합(공유결합)시켜 표지화시키는 것이 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 아래의 실시예에서도 아미노아릴-dCTP를 사용하여 핵산을 증폭 제조하고 아미노아릴-dCTP에 Alexa Fluor 488(blule), Cy3(green) 등 4종류의 형광물질을 결합, 표시화시켰다.
본 발명에서, 신호발생영역은 그 신호발생영역을 포함하는 신호 프로브에 고유한 신호를 발생시킨다. 신호 프로브는 그 표적분자와의 특이적 결합영역을 가지므로 신호발생영역이 발생시키는 이러한 고유 신호는 그 표적분자에 고유한 신호가 된다. 따라서 신호발생영역이 하나의 핵산 단편에 의한 하나의 영역으로만 구성되어 하나의 신호발생물질로만 표지될 경우 그것이 발생시키는 고유신호는 사용 가능한 신호발생물질 종류의 갯수에 따라 극히 제한될 수밖에 없으며, 결과적으로 검출·식별할 수 있는 표적분자 종류의 갯수도 극히 제한을 받게 된다. 따라서 신호발생영역이 적어도 2개 이상의 영역으로 구성되는 것이 바람직하다. 신호발생영역이 2개 영역으로 구성될 경우 3종류의 서로 다른 신호를 발생킬 수 있는 형광물질(예컨대 Alexa Fluor 488(blule), Cy3(green) 및 Cy5(red))을 사용하여 표지시키면 각 영역이 발생시키는 신호의 선상 순서(linear order)에 따라 9(=32)가지 고유신호를 발생시킬 수 있으며, 따라서 그것이 검출·식별할 수 있는 표적분자 종류의 갯수도 9가지로 늘어난다. 본 발명의 아래의 실시예에서는 신호발생영역을 6개 영역으로 구성하고 4종류의 서로 다른 형광물질로 표지시켰으며, 이렇게 총 4,096(=46)가지의 서로 다른 신호를 발생시키는 신호발생영역(즉 그 각 신호발생영역을 포함하는 4,096가지의 신호프로브)을 제조하여 사용하였다. 참고로 미국 등록특허 제8,519,115호(관련 논문은 Nat Biotechnol. 2008, 26:317-325임)의 실시예에서는 신호발생영역을 총 7개의 영역으로 구성하고 4종류의 서로 다른 형광물질로 표지시켜 16,384(=46)가지의 신호 프로브를 사용하는 것이 가능한 경우를 개시하고 있다. 신호발생영역의 각 영역이 발생시키는 신호의 선상 순서(linear order)는 본 발명의 아래 실시예에서 사용한 nCounter 디지탈 분석기(nCounter digital analyzer, Nanostring technology 사, 미국)나 미국 등록특허 제8,519,115호의 실시예 또는 그 관련 논문인 문헌(Nat Biotechnol. 2008, 26:317-325)에서 사용한 니콘 이클립스 TE2000E(Nicon Eclipse TE2000E)(Perfect Focus, 1.4 NA Plan Apo VC 60X oil-immersion lens(Nikontk 사, 일본), anX-cite 120 metal halide light source(Exfo 사, 미국), automated H117 stage(Prior Scientific 사, 영국) 및 Smart Shutter(Sutter Instrument 사, USA)이 구비된 장치임)를 이용하여 각 신호에 따른 이미지를 획득하고 그 각 이미지를 통합하여 선상으로 신호를 정렬, 검출함으로써 정량화하는 것이 가능하다. 상기 미국 등록특허 제8,519,115호 또는 그 관련 논문인 문헌(Nat Biotechnol. 2008, 26:317-325) 역시 본 명세서의 일부로서 간주된다.
상기 신호발생영역이 2개 영역으로 구성하고 3종류의 서로 다른 신호를 발생킬 수 있는 형광물질(예컨대 Alexa Fluor 488(blule), Cy3(green) 및 Cy5(red))을 사용하여 표지시키면 신호의 선상 순서(linear order)에 따라 9(=32)가지 고유신호를 발생시킬 수 있는 총 9가지의 신호발생영역(또는 각 신호발생영역을 포함하는 9가지의 신호 프로브)이 얻어지는데, 이중 3가지의 신호발생영역은 동일한 신호발생물질로 표지되게 되고, 나머지 6가지는 서로 다른 신호발생물질이 서로 다른 순서로 표지된다. 마찬가지로 본 발명의 아래 실시예에처럼 신호발생영역이 6개 영역으로 구성하고 4종류의 서로 다른 신호를 발생킬 수 있는 형광물질을 사용하여 표지시키면 신호의 선상 순서(linear order)에 따라 16,384(=46)가지 고유신호를 발생시킬 수 있는 총 16,384가지의 신호발생영역(또는 각 신호발생영역을 포함하는 16,384가지의 신호 프로브)이 얻어지는데, 이중 4가지는 6개 영역 모두 동일한 신호발생물질로 표지된 것이 얻어지게 된다.
그러므로 본 발명에서, 신호발생영역이 2개 이상의 영역을 포함하여 구성될 경우 그 2개 이상의 영역은 모두 동일한 신호발생물질로 표지되거나 그 하나 이상의 영역은 나머지 영역과는 다른 신호를 발생시키는 신호발생물질로 표지화되는 것으로 이해될 수 있다.
신호발생영역에서 이를 구성하는 각 영역의 길이(서로 연결된 뉴클레오티드의 숫자)는 신호발생물질이 표지화되어 있는 정도(즉 발생신호의 강도)를 고려하여 결정될 수 있다. 그러한 영역의 길이는 통상 0.1 kb(kilo base) 내지 1.5 kb 범위일 수 있다. 본 발명의 아래의 실시예에서는 자연적 뉴클레오티드(즉 dATP, dTTP 및 dGTP) 3종류와 아미노아릴-dCTP 100%(dCTP 대신 모두 아미노아릴-dCTP를 사용함)를 사용하여 핵산 증폭 제조하여 1/4의 뉴클레오티드가 아미노아릴-dCTP로 통합된 903bp 길이의 핵산 단편을 얻고 이를 신호발생물질로 표지화시켰다. 만일 2종류의 아미노아릴-NTP를 사용하여 핵산을 증폭 제조하여 표지화시킬 경우 그 영역의 길이는 0.2 kb 내지 0.5 kb 범위이어도 무방할 것이다. 또한 본 발명의 실시예에서 아미노아릴-dCTP 100%를 사용하였지만 30% 내지 70%의 아미노아릴-dCTP를 사용하더라도 약 0.9bp의 길이라면 충분한 신호를 발생시킬 수 정도로 표지화될 수 있다.
신호발생영역은 이중가닥 핵산으로 완전한 이중가닥 핵산일 수 있고 또는 부분적 이중가닥 핵산일 수 있다. 본 발명의 아래의 실시예에서와 같이, 신호발생영역을 구성할 이중가닥 핵산 단편들을 제조하고 이들 각각을 표지화시킨 후에 그 표지화된 이중가닥 핵산 단편들을 T4 라이게이즈(ligase) 등의 연결효소로 연결시켜 제조할 경우, 그 이중가닥 핵산을 이루는 2개의 단일가닥 핵산은 길이 서로 같은 완전한 이중가닥 핵산을 형성하게 된다. 반면 미국 등록특허 제8,519,115호(관련 논문은 Nat Biotechnol. 2008, 26:317-325임)의 실시예에서처럼 PCR로 증폭 후 분리하여 단일가닥 핵산을 제조하고 그 단일가닥 핵산을 주형으로 T7 RNA 폴리머라제, T3 폴리머라제 또는 SP6 폴리머라제 등으로 상기 주형보다 길이가 작은 RNA 전사물 단편을 제조하고 그 RNA 전사물을 표지화시킨 후에 이를 상기 주형에 상보적으로 혼성화시켜 신호발생영역을 구성할 경우 부분적 이중가닥 핵산을 형성시킬 수도 있다.
본 발명의 신호발생영역은 이중가닥 핵산으로, 앞서 표적분자와의 특이적인 결합영역과 관련하여 설명한 바와 같이 그 이중가닥을 구성하는 핵산은 PNA 등 핵산 유사체일 수 있으며 변형된 뉴클레오티드를 포함하여 이루어질 수도 있다.
본 발명의 신호 프로브에서 표적분자와의 특이적 결합영역과 신호발생영역의 결합은 그 둘 모두가 핵산일 경우(즉 표적분자와의 특이적 결합영역이 표적핵산을 검출하기 위한 단일가닥 핵산인 경우) T4 리가제 등 당업계에 공지된 리가제를 사용하여 연결시킬 수 있으며, 표적분자와의 특이적 결합영역이 항체나 압타머인 경우 아미노기, 히드록시기, 카르복실기, 카르보닐기, 티올기 등 적정 기능기(functional group, 반응성 그룹)을 도입하고 아미드결합, 에스테르결합, 황화에스테르결합, 에테르결합 등을 유도하여 공유적으로 신호발생영역과 연결시킬 수 있다.
본 발명의 신호 프로브에서 표적분자와의 특이적 결합영역과 신호발생영역 사이에는 도 1에서 보여지는 바와 같이, 스페이서(spacer) 및/또는 고정영역이 존재할 수 있다. 도 1에는 본 발명의 신호 프로브와 이 신호 프로브를 이용한 본 발명의 표적분자의 검출방법에 사용되는 주요 구성인자들이 도시되어 있다.
스페이서는 표적분자와의 특이적 결합영역과 신호발생영역을 이격시키기 위한 것으로, 표적분자와의 특이적 결합영역이 표적분자에 결합하였을 때 그 결합체가 신호발생부의 신호 검출에 장애로 작용하는 것을 방지하여 신호발생부의 신호 검출을 용이하게 하기 위한 것이다. 스페이서는 단일가닥 핵산, 이중가닥 핵산, RNA, DAN 등일 수 있으며, PNA 등 핵산 유사체이거나 변형된 뉴클레오티드를 포함하여 이루어질 수 있다. 그 길이는 신호발생부의 신호 검출을 용이하게 할 수 있는 한 특별한 제한이 없다. 통상은 20~50bp의 길이로 이루어질 것이다.
고정영역은 후술하는 바의 1개 이상의 고정핵산분자(또는 고정분자)가 상보적으로 결합하여 본 발명의 신호 프로브를 후술하는 바의 분석용 지지체에 추가적으로 고정시켜 펴주기(streaching) 위하여 존재하는 영역으로 기지의 서열로 이루어진다. 따라서 고정영역은 고정핵산분자에 상보적인 서열의 단일가닥 핵산으로 구성되며, 2개 이상의 고정핵산분자가 결합할수 있도록 동일한 기질의 서열이 2회 이상 반복하여 이루어질 수 있다. 고정영역은 그것이 고정핵산분자와 상보적으로 결합할 수 있는 한 RNA, DNA 등일 수 있고, PNA 등 핵산 유사체이거나 변형된 뉴클레오티드를 포함하여 이루어질 수 있으며, 그 길이는 고정핵산분자와의 충분한 결합력을 발휘할 수 있는 한 임의의 길이일 수 있다. 일반적으로는 20~50bp 길이의 동일한 기질의 서열이 2~20회 반복하여 구성될 것이다.
상기 스페이서나 고정영역이 모두 본 발명의 신호 프로브에 존재할 경우 이들은 그 인접영역과는 공유결합으로 연결되며, 그 순서는 임의의 순서일 수 있으나 고정영역이 신호발생영역에 인접하여 즉 신호발생영역의 5'쪽이나 3'쪽에 존재하는 것이 바람직하다. 그것은 고정영역이 본 발명의 신호 프로브를 분석용 지지체에 추가적으로 고정시킬 때 고정영역이 신호발생영역과 인접하여 존재하여야 신호발생영역을 선상의 형태(linear form 또는 streached form)로 분석용 지지체에 고정시켜 신호발생영역의 신호 검출을 용이하게 하기 때문이다.
본 발명의 신호 프로브는 그 표적분자와의 특이적인 결합영역의 반대쪽에(반대쪽은 예컨대 표적분자와의 특이적 결합영역이 5'쪽에 존재할 경우 3'쪽을 의미한다) 결합태그가 결합할 수 있다.
결합태그는 이와 결합할 수 있는 결합 파트너가 코팅된 분석용 지지체에 그 결합 파트너와의 특이적 결합을 통하여 본 발명의 신호 프로브를 고정시키는 작용을 한다. 사용될 수 있는 결합태그의 대표적인 물질은 비오틴(biotin)이며, 이에 대한 대표적인 결합 파트너는 스트렙타비딘(straptavidin)이다. 스트렙타비딘은 스트렙토마이세스 아비디니(Streptomyces avidinii)로부터 분리된 아비딘 계열의 항생물질의 단백질로 4량체 구조이며 최대 4개의 바이오틴 분자와 결합할 수 있다. 결합태그는 비오틴뿐만 아니라 데스티오비오틴(desthiobiotin), 이미노비오틴(iminobiotin) 등 비오틴 유사체를 사용하여도 무방하며, 분석용 지지체에 코팅되는 결합 파트너도 스트렙타비딘 이외에도 비오틴 등과 특이적으로 결합할 수 있는 스트렙타비딘 유사체인 아비딘, 트랩타비딘(Traptavidin), 뉴트라비딘(NeutrAvidin, Thermofisher SCIENTIFIC 사, 미국) 등을 사용하여도 무방하다.
결합태그를 본 발명의 신호 프로브에 결합시키는 방법과 관련해서는 당업계에 다양한 방법이 공지되어 있고, 상당한 문헌(문헌[Nucleic Acids Res. 1987 Jun 11; 15(11): 4513-4534], 문헌[RNA. 2014 Mar; 20(3): 421-427], 문헌[Methods Mol Biol. 2009; 498:185-196] 등)이 축적되어 있으며, 다양한 키트(Thermofisher SCIENTIFIC 사, APEXBIO 사) 등이 시판되고 있다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 전술한 바의 신호 프로브를 이용한 시료 중의 표적분자를 검출하는 방법에 관한 것이다.
구체적으로 본 발명의 검출방법은 (a) 분석 대상 시료에 상기 신호 프로브를 처리하여 시료 중의 표적분자와 신호 프로브의 복합체를 형성시키는 단계, 및 (b) 그 복합체의 신호 프로브를 검출하는 단계를 포함하여 구성된다.
본 발명의 방법에서, 분석 대상 시료는 검출하고자 하는 표적분자를 포함하거나 포함하고 있을 것으로 의심되어 검출의 필요성을 가지는 임의의 혼합물 또는 용액일 수 있다. 시료는 인체 또는 동물로부터 얻어진 생체시료뿐만 아니라 그러한 생체시료를 가공하여 표적분자의 농도를 높인 가공시료일 수 있고, 나아가 표적분가 포함되어 있거나 있을 것으로 여겨지는 물, 식품, 산업폐수 등, 환경오염인자, 독성인자 등의 검사가 필요한 시료일 수도 있다. 이러한 시료는 적정 희석제, 완충용액을 포함할 수 있으며, 세균이나 바이러스 존재 여부를 검출하고자 할 때에는 배지나 배지 성분이 포함되어 있는 세균 배양물, 바이러스 배양물일 수도 있다.
또 본 발명의 방법에서, 분석 대상 시료는 바람직하게는 인체 또는 동물로부터 얻어진 생체시료 또는 그 가공시료일 수 있다. 생체시료는 혈액, 소변, 침, 정액, 양수, 림프액, 객담, 조직 등 검출하고자 하는 표적분자를 포함하거나 포함하고 있을 것으로 의심되어 검출의 필요성을 가지는 인체 또는 동물로부터 얻어진 것일 수 있다. 가공시료는 예컨대 혈장, 혈청, 생체시료를 단백질 추출 키트를 이용하여 단백질 농도를 높인 시료, 마찬가지로 핵산(DNA or RNA) 농도를 높인 시료, 조직 추출물, 조직에서 얻어진 세포, 세포 용해물, 세포 배양물 등일 수 있다.
또 본 발명의 방법에서, 상기 시료 중의 표적분자와 신호 프로브 복합체를 형성시키는 단계는 시료 중에 다양한 표적분자가 포함되어 있을 경우 그 표적분자에 각 특이적인 다양한 신호 프로브를 사용하여, 다중적으로 복합체를 형성시키고 이를 검출하는 것이 가능하다. 앞서 설명한 바와 같이, 신호 프로브의 신호발생영역을 구성하는 영역이 본 발명의 아래의 실시예에서와 같이 6개이고 4종류의 서로 다른 신호발생물질을 사용하여 표지화시킬 경우 16,384(=46) 종의 서로 다른 표적분자를 검출할 가능성을 가진다.
본 명세서에서, "검출"은 표적분자의 존재 유무에 대한 정성적 분석을 의미하거나 나아가 표적분자의 존재 양, 농도에 대한 정량적 분석까지 포함하는 의미로서 이해된다.
본 발명의 방법에서, 검출하고자 하는 표적분자가 단백질일 경우, 상기 (a) 단계 전에, 시료를 단백질에 대한 높은 결합 친화성을 가지는 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)에 처리하여 표적분자를 포함한 시료 중의 단백질들을 니트로셀룰로오스 막에 흡착시키는 단계와, 다음 단계로 적정 세척용액을 사용하여 니트로셀룰로오스 막에 흡착된 단백질 이외의 지질, 핵산, 대사산물 등의 다른 분자들을 제거하는 단계가 포함될 수 있다. 세척용액은 당업계에 널리 이용되는 것을 구입하여 이용하거나 적절히 조제하여 사용할 수 있는데, 세척용액에는 계면활성제와 염이 포함된다. 계면활성제로서는 SDS, Tween 20, Tween 40, Tween 60, Tween 80, Triton X-405, Triton X-100, Tetronic 908, Cholesterol PEG 900, Polyoxyethylene Ether W-1, Span 20, Span 40, Span 85, 이들의 혼합물이 사용될 수 있으며, 염은 리튬, 나트륨, 칼륨 및 암모늄의 아세트산염, 젖산염, 구연산염, 인산염, 질산염, 황산염, 염화물염, 이의 혼합물(특히 SSC, SSPE 등)이 사용될 수 있다.특히 세척용액은 TBST 용액(10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20), PBST 용액(PBS, pH 7.0, 0.05% Tween 20), Tween 20 등이 포함된 SSPE 용액(0.2M phosphate buffer, 2.98M NaCl, 20mM EDTA, pH7.4) 등을 사용할 수 있다.
세척 단계 후에는 소혈청알부민 등 적절한 차단제(blocking agent)를 포함하는 차단용액을 처리하여 니트로셀룰로오스 막의 단백질 비흡착 표면을 차단시키는 단계가 포함될 수 있다. 이러한 차단 단계는 그 다음 단계인 표적분자와 신호 프로브의 복합체의 형성을 위하여 표적분자와의 특이적 결합영역이 항체인 신호 프로브로 사용할 경우 신호 프로브의 항체가 흡착하여 검출의 정확성을 떨어뜨리는 것을 방지하기 위한 것이다. 차단 단계 후에는 신호 프로브를 처리하여 상기 (a) 단계의 신호 프로브와 표적분자의 복합체를 형성시키는 단계를 수행한다. 여기서 표적분자와의 특이적 결합영역이 항체가 아닌 압타머 등인 신호 프로브로 사용할 경우는 상기 차단 단계가 반드시 요구되는 것은 아니다.
신호 프로브 처리 후에는 비특이적으로 결합한 신호 프로브를 제거하기 위해서 전술한 바의 세척 용액 등을 사용하여 세척 단계가 수행될 수 있다.
니트로셀룰로오스 막을 사용하여 표적분자인 단백질을 검출할 경우, 니트로셀룰로오스 막에서 상기 복합체를 형성시킨 후에는, 상기 (b) 단계의 신호 프로브 검출 단계가, (b-1) 니트로셀룰로오스 막에 결합되어 있는 복합체로부터 신호 프로브를 분리시키는 단계, 및 (b-1) 그 분리된 신호 프로브를 검출하는 단계를 포함하여 수행될 수 있다. 복합체로부터 신호 프로브를 분리하는 단계는 복합체가 결합되어 있는 니트로셀룰로오스 막을 가열하거나(적정 버퍼나 반응용액을 매개로 가열하거나) 가열과 함께 계면활성제 처리함으로써 가능하다.
본 발명의 신호 프로브는 전술한 바와 같이 이를 구성하는 이중가닥 핵산이 서로 가교결합되어 있어 가열하더라도 신호발생영역이 소실되지 않고 안정한 상태를 유지하여 표적분자 검출의 정확성에 영향을 미치지 않는다.
상기 (b-1) 분리된 신호 프로브를 검출하는 단계는 (b-1-i) 그 분리된 신호 프로브를, 그 신호 프로브의 결합 태그를 통해 그 결합 태그에 대한 결합 파트너가 코팅되어 있는 분석용 지지체에 처리하여 결합 태그와 결합 파트너의 특이적 결합을 통해 분석용 지지체에 고정시키는 단계와, (b-1-ii) 그 지지체에 고정된 신호 프로브의 신호를 검출하는 단계를 수행함으로써 이루어질 수 있다.
여기서 신호 프로브의 신호는 신호 프로브에 표지된 신호발생물질이 발생시키는 신호로, 상기 신호 프로브의 신호 검출 단계는 사용된 신호발생물질에 따라 그 신호를 검출할 수 있는 적정 장치를 이용하여 이루어질 수 있다. 그러한 장치는 신호의 특성에 따라 분광광도계(spectrophotometer), 형광계(fluorometer), 흡광 광도계(absorption spectrometer), 발광분석계(luminometer), 화학발광분석계(chemiluminometer), 광량계(actinometer) 등일 수 있으며, 신호발생물질로 알렉사 플루오르 형광물질 시리즈나 시아닌 형광물질을 사용하여 그 신호를 검출할 경우는 본 발명의 아래 실시예에서 사용한 nCounter 디지탈 분석기(nCounter digital analyzer, Nanostring technology 사, 미국)나 미국 등록특허 제8,519,115호의 실시예 또는 그 관련 논문인 문헌(Nat Biotechnol. 2008, 26:317-325)에서 사용한 니콘 이클립스 TE2000E(Nicon Eclipse TE2000E)(Perfect Focus, 1.4 NA Plan Apo VC 60X oil-immersion lens(Nikontk 사, 일본), anX-cite 120 metal halide light source(Exfo 사, 미국), automated H117 stage(Prior Scientific 사, 영국) 및 Smart Shutter(Sutter Instrument 사, USA)이 구비된 장치임)를 이용하는 바람직하다. nCounter 디지탈 분석기 등은 각 신호발생영역의 특이적인 신호를 선상 순서(linear order of signal)를 감지하고 그 감지된 신호로부터 표적분자를 계수하고 정량화하는 것을 가능하게 한다.
nCounter 디지탈 분석기 등을 이용하여 신호를 선상의 순서를 검출할 경우, 그러한 신호 검출을 용이하게 하기 위해서 신호 프로브의 신호발생영역을 선상의 형태(linear form 또는 streached form)로 분석용 지지체에 고정시키는 것이 바람직한데, 이는 신호 프로브의 고정영역에 상보적인 단일가닥 핵산 서열을 가지고, 그 상보적인 단일가닥 핵산 서열에 연결되어 상기 분석용 지지체에 코팅된 결합 파트너에 결합할 수 있는 결합 태그를 가진 고정분자(또는 고정핵산분자)를, 신호 프로브를 고정시킨 분석용 지지체에 처리하여 이루어질 수 있다. 고정분자의 결합 태그도 앞서 신호 프로브와 관련하여 설명한 바와 같이 비오틴이나 비오틴 유사체가 사용될 수 있다.
한편 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 분석용 지지체는 신호 프로브의 결합 태그에 대한 결합 파트너(예컨대 스트렙타비딘 등)가 공유결합 또는 비공유결합을 통하여 그 표면 상에 코팅될 수 있다면 그 형태이나 형상 그 재료에 있어 특별한 제한이 없다.
예컨대 막 형태, 비드 형태, 미립자 형태, 기판 형태(유리 슬라이드 등), 칼럼 형태, 웰 형태, 웰 플레이트 형태 등일 수 있으며, 그 재료는 플라스틱, 레진, 다당류, 실리카, 관능기 부착 유리(functionalized glass), 개질된 실리콘(modified silicon), 탄소, 금속, 무기 유리(inorganic glasses), 막, 나일론, 천연수지 등일 수 있다. 고분자성 지지체의 재료는 폴리스티렌(polystyrene), 폴리에틸렌 글리콜 테트라프탈레이트(polyethylene glycol tetraphthalate), 폴리비닐 아세테이트(polyvinyl acetate), 폴리비닐 클로라이드(polyvinyl chloride), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 폴리아크릴로니트릴(polyacrylonitrile), 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethyl methacrylate), 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene), 부틸 고무(butyl rubber), 스티렌부타디엔 고무(styrenebutadiene rubber), 천연고무, 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리프로필렌(polypropylene), (폴리)테트라플루오로에틸렌((poly)tetrafluoroethylene), (폴리)비닐리덴플루오라이드((poly)vinylidenefluoride), 폴리카보네이트(polycarbonate) 및 폴리메틸펜텐(polymethylpentene) 등일 수 있다.
도 1에는 본 발명의 방법에 사용되는, 신호 프로브, 고정분자를 포함한 주요 구성인자들이 도시되어 있으며, 전술한 바의 니트로셀룰로오스 막을 이용하여 표적분자인 단백질을 검출하는 전체적인 프로세스가 도 2 및 도 3에, 각각 신호 프로브의 표적분자와의 특이적 결합영역이 항체인 경우와 압타머인 경우로 나뉘어 제시되어 있다.
한편 도 4 및 도 5에 제시된 바와 같이, 본 발명의 표적분자의 검출방법은 전술한 바의 신호 프로브 이외에 포획 프로브를 추가적으로 사용하여 이루어질 수도 있다.
이러한 본 발명의 포획 프로브를 이용한 방법(이하 편의상 "본 발명의 포획 검출방법"이라 함)은 (a) 분석대상 시료에 그 표적분자에 특이적으로 결합하는 신호 프로브와 포획 프로브를 처리하여 상기 표적분자와 상기 신호 프로브 그리고 상기 포획 프로브의 복합체를 형성시킴과 함께, 그 복합체를 포함하고 복합체를 형성하지 않은 신호 프로브와 포획 프로브 등을 포함하는 혼합물을 얻는 단계, 및 (b) 그 혼합물 중의 복합체의 신호 프로브를 검출하는 단계를 포함하여 구성된다.
본 발명의 포획 검출방법에서, 상기 포획 프로브는 그 신호 프로브가 특이적으로 결합하는 표적분자의 부위(즉 에피토프)와 다른 부위에 특이적으로 결합하는 영역과 그 영역에 자성입자(또는 자성비드)가 연결된 구성을 가지며, 도 1에 그 모식도가 도시되어 있다.
자성입자는 미국 특허 제5,665,554호, 미국 특허 제6,0279.45호, 미국 특허 제7,078,224호, 한국공개특허 제2006-0061494호, 한국등록특허 제0541282호 등에 개시된 바와 같이 당업계에서 단백질, 핵산, 세포, 세균 등의 분리에 널리 이용해 왔던 소재로, 미크론 또는 나노 단위의 크기(수 미크론의 크기, 수십 내지 수백 나노 크기)를 가진다. 바이오 물질의 분리에 대표적으로 사용되어 왔던 자성입자는 산화철 자성입자이며, 그러한 산화철 자성입자로서 마그네타이트(magnetite; Fe3O4), 마그헤마이트(maghemite; Fe2O3), 헤마타이트(mematite; Fe2O3) 등이 사용되어 왔다. 자성입자는 단백질, 핵산 등 생체분자의 분리에 사용되기 위해서는 자성입자 간 상호작용과 응집을 방지할 수 있도록 실리카, 고분자, 금, 은 비자성 물질로 개질되고 생체분자인 단백질, 핵산 등과 결합이 가능하도록 카르복시기, 에폭시기, 토실기, 아미노기, 실록산기 등 기능기나 비오틴, 스트렙타비딘 결합물질이 도입되어 있을 필요가 있다. 그러한 특성을 갖는 자성입자들이나 그 제조방법들은 당업계에 잘 공지되어 있고, 미국 특허 제6,027,945호, 미국 특허 제6,673,631호, 미국 특허 제7,183,002호, 일본 특허 제3,253,638호, 일본 공개특허 제2001-136970호, 한국 공개특허 제2009-0088299호 등 많은 문헌이 축적되어 있으며, 또한 스트렙타비딘이 코팅된 Dynabeads 자성비드(Thermo Fisher Scientific 사, 미국), 토실기가 도입된 DYNAL M-270, DYNAL M-280(Dynal Biotech ASA 사, Norway) 등이 시판되고 있다.
본 발명에서, 포획 프로브는 그 표적분자와의 특이적 결합영역이 이러한 자성입자와, 기능기를 통해 공유결합되거나 비오틴과 스트렙타비딘 사이의 비공유결합을 통해 연결될 수 있다. 포획 프로브의 표적분자와의 특이적 결합영역은 신호 프로브의 표적분자와의 특이적 결합영역과 표적분자에 대해 경쟁적 결합을 방지하기 위하여, 신호 프로브의 표적분자와의 특이적 결합영역이 인식하여 결합하는 부위와는 다른 부위를 인식하여 결합하도록 설계된다.
포획 프로브의 표적분자와의 특이적 결합영역은 상기 신호 프로브의 특이적 결합영역과 마찬가지로 항체, 압타머, 단일가닥 핵산, 표적분자가 항체인 경우 항원 등일 수 있으며, 단일가닥 핵산인 경우 PNA 등 핵산 유사체이거나 변형된 뉴클레오티드를 포함하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 포획 검출방법에 있어서, 상기 (a) 단계는 분석 대상 시료에 신호 프로브와 포획 프로브를 처리하여 수행되는데, 그럴 경우 표적분자와 신호 프로브 그리고 포획 프로브 사이의 복합체가 형성되고, 이와 함께 그 복합체, 복합체를 형성하지 않은 신호 프로브, 복합체를 형성하지 않은 포획 프로브, 비표적 분자 등을 포함하는 혼합물을 얻어진다.
표적분자의 검출을 위해서는 그 다음 단계로 상기 (b) 단계인 그 혼합물 중의 복합체의 신호 프로브를 검출하여야 한다. 이러한 신호 프로브의 검출은 포획 프로브가 자성입자를 포함하고 있으므로 상기 혼합물을 자석에 적용하면 포획 프로브를 포함하는 복합체와 복합체를 형성하지 않는 포획 프로브만이 자석에 결합하게 된다. 이 과정에서 복합체를 형성하지 않은 신호 프로브나 비표적분자 등은 제거된다. 이 과정에서 복합체를 형성하지 않은 신호 프로브나 비표적분자 등의 효과적인 제거를 위하여 앞서 예시한 바의 적정 세척용액을 이용하여 세척하는 단계가 바람직할 수 있다.
자석에 복합체 등을 결합시킨 후에는 그 복합체로부터 신호 프로브만을 분리하게 되는데, 이는 전술한 바와 같이 가열하거나 가열과 함께 계면활성제 처리 등에 의하여 가능하다. 신호 프로브는 전술한 바와 같이 이를 구성하는 이중가닥 핵산이 서로 가교결합되어 있어 가열 등에도 안정한 상태를 유지한다.
전술한 바를 고려할 때, 본 발명의 포획 검출방법에서, 상기 (b) 단계의 신호 프로브의 검출 단계는 (b-1) 상기 혼합물에 자석을 적용하여 상기 복합체와 복합체를 형성하지 않은 포획 프로브만을 자석에 결합시켜 혼합물의 나머지 성분을 제거하는 단계, (b-2) 자석에 결합되어 있는 복합체로부터 신호 프로브를 분리시키는 단계, 및 (b-3) 그 분리된 신호 프로브를 검출하는 단계를 포함하여 수행될 수 있다.
상기 (b-3) 단계의 분리된 신호 프로브만을 검출하는 단계는, 전술한 바의 니트로셀룰로오스 막을 이용한 단백질 검출방법과 마찬가지로, (b-3-i) 그 분리된 신호 프로브를, 그 신호 프로브의 결합 태그를 통해 그 결합 태그에 대한 결합 파트너가 코팅되어 있는 분석용 지지체에 처리하여 결합 태그와 결합 파트너의 특이적 결합을 통해 분석용 지지체에 고정시키는 단계와, (b-3-ii) 그 지지체에 고정된 신호 프로브의 신호를 검출하는 단계를 수행함으로써 이루어질 수 있다. 이러한 (b-3-i) 분석용 지지체에의 신호 프로브의 고정 단계와 (b-3-ii) 검출 단계의 구체적 내용은 니트로셀룰로오스 막을 이용한 단백질 검출방법과 관련한 설명한 바를 그대로 참조할 수 있다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 표적분자의 검출방법은 도 6 및 도 7에 도시된 바와 같이 신호 프로브 이외에 포획 경쟁분자를 추가적으로 이용하여 이루어질 수 있다.
본 발명의 포획 경쟁분자를 이용한 방법(이하 편의상 "본 발명의 경쟁 검출방법"이라 함)은 (a) 분석 대상 시료에 그 표적분자에 특이적으로 결합하는 신호 프로브와 포획 경쟁분자를 처리하여 상기 포획 경쟁분자와 상기 신호 프로브의 복합체를 형성시킴과 함께, 그 복합체를 포함하는 혼합물을 얻는 단계, 및 (b) 그 혼합물 중의 복합체의 신호 프로브를 검출하는 단계를 포함하여 구성된다.
상기 혼합물은 포획 경쟁분자와 신호 프로브의 복합체 이외에, 표적분자와 신호 프로브의 복합체, 복합체를 형성하지 않는 신호 프로브, 복합체를 형성하지 않은 경쟁분자, 복합체를 형성하지 않은 표적분자, 비표적분자 등을 포함한다.
본 발명의 경쟁 검출방법에서, 상기 포획 경쟁분자는 신호 프로브가 특이적으로 결합하는 표적분자의 부위(즉 에피토프)와 동일한 부위에 특이적으로 결합하는 영역과 그 영역에 자성입자가 연결된 구성을 가진다. 상기 포획 경쟁분자는 일반적으로 표적분자와 동일 분자일 것이진만 신호 프로브가 특이적으로 결합하는 표적분자의 부위(즉 에피토프)와 동일한 부위를 가져 신호 프로브와의 결합에 있어 경쟁할 수 있는 한 유사 분자이어도 무방하다. 그런한 유사 분자로서는 표적단백질이 다른 단백질(항체의 Fc)과의 융합된 단백질 등을 들 수 있다.
포획 경쟁분자는 표적분자와 동일한 신호 프로브의 결합 부위를 가지므로 신호 프로브와의 결합에 있어 표적분자와 경쟁하며, 신호 프로브가 한계량으로 시료에 처리되고 포획 경쟁분자를 정량하여 처리할 경우, 포획 경쟁분자의 검출 결과는 분석 대상 시료 중의 표적분자에 대한 정보(즉 표적분자의 존재 여부, 농도 등)를 제공할 수 있다.
상기에서 "신호 프로브가 한계량으로 시료에 처리된다"는 것은, 포획 경쟁분자와 표적분자 모두를 검출할 수 있는 양 이하로 처리된다는 것으로, 이론적으로는 정량한 포획 경쟁분자의 농도(정량 값)와 분석 대상 시료에 존재하는 표적분자의 추정된 농도(정량 값)를 합산한 값 미만을 검출할 수 있는 농도로 처리되는 것을 의미하지만, 실제 처리된 신호 프로브가 모두 포획 경쟁분자나 표적분자에 결합하는 것은 아니므로 상기 합산 값 이상으로 처리될 수도 있다. 그러나 일반적으로는 시료 중의 표적분자의 농도 추정이 어려우므로 상기 신호 프로브의 한계량은 정량한 포획 경쟁분자의 농도 이하를 검출할 수 있는 농도가 될 것이다.
분석대상 시료 중의 표적분자의 검출, 정량은, 동일한 반응용액 등을 사용한 동일한 검출 조건에서 신호 프로브의 처리 농도와 포획 경쟁분자의 처리 농도를 달리한 수회 반복실험을 통해, 신호 프로브와 처리 농도와 포획 경쟁분자의 처리 농도 사이의 상관 관계를 보여주는 표준곡선을 작성하여 얻어질 수 있다. 일반적으로 포획 경쟁분자의 검출·정량 값은 시료 중에 표적분자의 농도에 반비례하게 된다.
본 발명의 경쟁 검출방법에서, 상기 (b) 단계의 그 혼합물 중의 복합체의 신호 프로브를 검출하는 단계는 상기 본 발명의 포획 검출방법에서와 같이 수행될 수 있다.
구체적으로 (b-1) 상기 혼합물에 자석을 적용하여 포획 경쟁분자와 신호 프로브의 복합체를 자석에 결합시키는 단계, (b-2) 자석에 결합되어 있는 복합체로부터 신호 프로브만을 분리시키는 단계, 및 (b-3) 그 분리된 신호 프로브를 검출하는 단계를 포함하여 수행될 수 있다. 상기 (b-1) 단계에서 혼합물에 자석을 적용하면 복합체를 형성하지 않은 포획 경쟁분자도 자석에 결합하게 되지만 이를 가열할 경우 신호 프로브만을 분리시키는 것이 가능하다.
상기 (b-3) 단계의 분리된 신호 프로브만을 검출하는 단계는, 전술한 바의 니트로셀룰로오스 막을 이용한 단백질 검출방법, 포획 검출방법과 마찬가지로, (b-3-i) 그 분리된 신호 프로브를, 그 신호 프로브의 결합 태그를 통해 그 결합 태그에 대한 결합 파트너가 코팅되어 있는 분석용 지지체에 처리하여 결합 태그와 결합 파트너의 특이적 결합을 통해 분석용 지지체에 고정시키는 단계와, (b-3-ii) 그 지지체에 고정된 신호 프로브의 신호를 검출하는 단계를 수행함으로써 이루어질 수 있다. 이러한 (b-3-i) 분석용 지지체에의 신호 프로브의 고정 단계와 (b-3-ii) 검출 단계의 구체적 내용은 니트로셀룰로오스 막을 이용한 단백질 검출방법과 관련한 설명한 바를 그대로 참조할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 발명은 이중가닥 핵산을 구성하는 단일가닥 핵산이 서로 상보적으로 가교결합(또는 공유결합)하고 있어 온도, pH, 염, 이온 강도(ionic strength) 등의 영향을 받지 않은 안정한 이중가닥 핵산 신호 프로브를 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 여 표적분자의 검출에 있어서 상기 안정한 이중가닥 핵산 신호 프로브를 이용하여 그 신호 프로브를 표적분자와 복합체를 형성시킨 후에 가열 등에 의해 그 복합체로부터 그 신호 프로브만을 분리하고 신호 프로브를 검출함으로써 표적분자를 검출할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 신호 프로브와 이 신호 프로브를 이용한 본 발명의 표적분자의 검출방법에 사용되는 주요 구성인자들을 도시한 것이다.
도 2 및 도 3은 니트로셀룰로오스 막을 이용한 본 발명의 단백질의 검출방법을 단계적으로 도시한 것이다.
도 4 및 도 5는 포획 프로브를 이용한 표적분자의 검출방법을 단계적으로 도시한 것이다.
도 6 및 도 7은 포획 경쟁분자를 이용한 표적분자의 검출방법을 단계적으로 도시한 것이다.
도 8은 본 발명의 신호 프로브가 고온에서도 이중가닥 핵산을 유지함을 보여주는 실험 결과이다.
도 9는 본 발명의 신호 프로브의 신호발생영역을 구성하는 이중가닥 핵산 단편 또는 그 연결체를 전기영동한 결과이다.
도 10은 본 발명의 신호 프로브를 이용하여 세균을 검출하고 그 결과를 nCounter 디지탈 분석기(nCounter digital analyzer, Nanostring technology 사, 미국)를 이용하여 얻은 이미지이다.
도 11은 본 발명의 신호 프로브가 nCounter 디지탈 분석기(nCounter digital analyzer, Nanostring technology 사, 미국)에서 이미지화된 것을 보여주는 모식도이다.
도 12는 본 발명의 신호 프로브를 사용하여 2 종류의 표준 표적분자들을 분석하고 그 결과를 표적분자 양과 신호 값을 로그대 로그 스케일로 표시한 그래프이다.
도 13은 본 발명의 신호 프로브를 사용하여 13종류의 표적분자들을 2회 분석하고 그 결과를 표적분자의 양과 신호 값을 로그대 로그 스케일로 표시한 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예의 용어
아래 실시예에서 사용된 용어는 청구범위를 포함한 본 명세서의 다른 부분에서 사용된 용어와 서로 아래와 같은 의미상 관계를 갖는다.
먼저 "신호 프로브"는 아래 실시예에서 "제1 탐침"으로 기재되었거나 이와 혼용되어 기재되었고, "신호발생영역"은 "색상지시바코드"로 기재되었거나 이와 혼용되어 기재되었으며, "신호 프로브"의 "표적분자와의 특이적 결합영역"은 "제1 프로브" 또는 "제1 리간드"로 기재되었거나 이들과 혼용되어 기재되었다.
또 "포획 프로브"는 아래 실시예에서 "제2 탐침" 또는 "포획 프로브"로 기재되었거나 이들과 혼용되어 기재되었고, "포획 프로브"의 "표적분자와의 특이적인 결합영역"은 "제2 프로브" 또는 "제2 리간드"로 기재되었거나 이들과 혼용되어 기재되었다.
신호 프로브의 신호발생영역을 구성하는, 신호발생물질로 표지된 각 영역은 "신호태그"로 기재되었다.
또 "고정핵산분자"는 아래 실시예에서 "고정분자"로 기재되었거나 이와 혼용되어 기재되었다.
<실시예 1> 시약의제조
1-1. 제1 탐침(신호 프로브) 제조
제1 탐침은 표적분자와 결합하여 그 표적분자 고유의 신호를 발생시키는 기능을 한다. 그 구성은 표적분자 고유의 신호를 발생시키는 신호발생영역과 표적분자와의 특이적 결합영역인 제1 프로브를 결합된 구조가 기본적 구성이며, 이에 추가적으로 고정영역과 결합태그가 추가된 구성일 수 있다.
1) 신호태그의 제조
신호태그는 신호발생영역을 구성하는 기본 구성 단위를 지칭하며, 이중가닥의 핵산 절편에 신호발생물질이 표지되어 있는 구성이다.
본 실험에서는 M13 DNA를 주형으로 PCR(Polymerase Chain Reaction) 방법으로 합성한 크기가 약 900bp PCR 산물에 신호발생물질이 표지된 이중가닥 핵산을 제조하여 사용하였다.
신호태그의 골격이 되는 M13 DNA의 염기서열 정보는 진뱅크(GenBank) 데이터 시스템 (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 확보하였다(Accession number NC_003287).
100 ng의 M13 DNA(미국, NEB 사)를 주형으로 각각 0.1 uM의 아래 PCR 프라이머 쌍(한국, 바이오니아)으로 1.25 units의 Taq Polymerase(미국, Promega 사)를 사용하여 표준 PCR 방법으로 DNA 절편(903 bp)을 제조하였다
정방향 프라이머(서열번호 1): atcaggcgaatccgttattg
역방향 프라이머(서열번호 2): tcggccttgctggtaatatc
제조사에서 제공한 표준방법에 따라, 상기 생산된 PCR 산물인 DNA절편을 주형으로 상기 제조된 프라이머 쌍과 3 종류의 dNTP와 aminoallyl-dCTP(미국, TriLink 사)를 사용하여 다시 표준 PCR 방법으로 aminoallyl-dCTP 통합된 DNA 절편을 제조하였다.
제한효소 아탭터 염기서열
아댑터의 종류 염기서열 일렬번호
Eco RI/Sma I Adaptor 5'-AATTCCCCGGG--3' 3-GGGGCCCp-5' 서열번호 3서열번호 4
Hind III/Not I Adaptor 5'-AGCTTGCGGCCGC--3' 3-ACGCCGGCGp-5' 서열번호 5서열번호 6
Xho I/Pst I Adaptor 5'-TCGAGCTGCAGG--3' 3-CGACGTCCp-5' 서열번호 7서열번호 8
Sal I/Bam HI Adaptor 5'-TCGACGGATCC--3' 3-GCCTAGGp-5' 서열번호 9서열번호 10
상기 PCR 산물의 제한효소 지도를 작성하여 상기 PCR 산물을 절단할 수 없는제한효소(Restriction enzyme)를 선정하였으며 이들의 인식부위로 이루어진 상기 <표 1>의 아댑터들을 구입하였다(Gene Link 사, 미국).
상기 아댑터를 상기 aminoallyl-dCTP가 통합된 PCR 산물에 아래와 같은 구성이 되도록 제조사의 표준방법에 따라 연결하였다.
제1도메인: 5'-Blunt end-DNA 절편-Eco R1/Sma I adaptor-3'
제2도메인: 5'-Eco RI/Sma I adaptor-DNA 절편-Sal I/Bam HIadaptor-3'
제3도메인: 5'-Sal I/Bam HI adaptor-DNA 절편-Hind III/Not Iadaptor-3'
제4도메인: 5'-Hind III/Not Iadaptor-DNA 절편-Xho I/Pst1adaptor-3'
제5도메인: 5'-Xho I/Pst1adaptor-DNA 절편-Sal I/Bam HIadaptor-3'
제6도메인: 5'-Sal I/Bam HIadaptor-DNA 절편-3'
구체적으로, 상기 3 nmol 아댑터와 0.3 nmol PCR 산물인 DNA 절편으로 이루어진 19 uL의 혼합용액에 1 uL의 5 unit/uL T4 ligase(미국, NEB 사)을 첨가하여 연결반응을 수행한 후, 얻은 반응산물을 DNA & RNA Precipitation Solutions Pack(Gene Link 사, 미국)으로 정제하여 상기 아댑터가 부착되고 aminoallyl-dCTP가 통합된 DNA 절편을 획득하여 상기 제한효소를 처리한 후 다시 정제하고 수확하였다.
N-hydroxysuccinimide(NHS)-ester(에스테르) 형광물질인 Alexa 488,Alexa 594,Alexa 647(미국, Invitrogen 사) 및 Cy3(미국, GE Healthcare 사) 4종류의 신호발생물질 세트를 준비하였다.
제조사가 제공한 표준방법에 따라, 먼저 상기 아댑터가 부착되고 amino-allyl dCTP가 통합된 16 ~ 20 ug의 DNA 절편을 각 도메인별로 20 uL의 멸균 증류수에 녹인 후, 12 uL의 표지 용액(25 mg의 NaHCO3을 1 mL의 멸균 증류수에 녹인 용액)을 첨가하여 반응용액을 제조하였다. 다음 상기 신호발생물질을 DMSO에 최종농도 30 ug/L로 녹여 신호발생물질 용액을 제조하였다. 그 다음 상기 반응용액을 4개의 튜브에 5 uL씩 나누어 넣고 각각에 한 종류의 상기 2 uL의 신호발생물질 용액을 넣어 암 상태, 실온에서 1시간 동안 반응시켰다.
이와 같은 반응으로 DNA 절편에 신호발생물질을 표지한 후, QIAquick PCR Purification Kit (미국, QIAGEN 사)으로 정제하여 상기 아댑터가 부착되고 신호발생물질이 표지된 DNA 절편을 획득하였다.
이렇게 하여, 각 도메인별로 상기 4 종류의 신호발생물질이 각각 표지된 이중가닥 DNA 절편 4 종류의 신호태그들을 제조하였으며, 이들을 편의상 "H 신호태그"로 지칭하였다.
2) 공유결합 유도 및 검증
상기 제조된 1 mg의 H 신호태그를 1 mL의 반응버퍼(10 mM Tris (pH 7.0), 200 mM NaCl)에 녹였다. 상기 용액을 동일 부피의 95% 에탄올에 녹인 0.3 umol 8-methoxypsoralen(8-MOP; 미국, Sigma 사)에 첨가하여 암 상태에서 1시간 반응시켰다. 이 반응물에 자외선 365 nm 파장 (4 W)을 3시간 동안 주사하여 상기 H 신호태그 사슬의 염기쌍 간의 공유결합을 유도하였다(A. Arabzadeh et al., International Journal of Pharmaceutics 237 (2002) 47~55).
상기 반응용액에 4배 부피의 chloroform을 부과하여 추출공정으로 미반응 psoralen이 제거된 상층액을 수확하였다. 상기 수확물에 5M NaCl을 최종농도 0.2M가 되도록 첨가한 후, 3배 부피의 에탄올을 첨가하여 상기 공유결합이 유도된 H 신호태그를 수확하였다. 이렇게 얻어진 공유결합이 유도된 H 신호태그를 편의상 "C 신호태크"로 지칭하였다.
H 신호태그와 이에 상응하는 C 신호태그를 0.5℃씩 온도를 95℃까지 상승시키면서 UV-1800(Shimadzu 사, 일본)으로 260 nm에서 흡광도를 측정한 결과, 도 8과 같이 나타났다.
H 신호태그는 온도가 증가하면서 이중가닥 핵산이 해리가되어 단일가닥 핵산으로 전환되고 Tm이 약 85℃이고 95℃에서 단일가닥 핵산으로 존재하였다. 반면 C 신호태그는 95℃에서도 이중가닥 핵산을 유지하고 있음을 알수 있었다.
3) 신호발생영역인 색상지시바코드의제조
상기 제조된 C 신호태그를 사용하여 신호발생영역인 색상지시바코드(Color-coded barcode)를 아래와 같이 제조하였다.
먼저 4종류의 제1 도메인 신호태그에서 선택되어진 한 종류를 4개의 튜브에 나누어 각각 최종농도 10 ug/mL씩 넣고 각 튜브에 제2 도메인 신호태그의 4종류를 한 종류씩 최종농도 10 ug/mL씩 넣어 최종부피 100L의 T4 ligase의 반응용액(50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 10 mM DTT, pH 7.5)에서 혼합시켰다. 상기 제1 도메인 신호태그의 나머지 3종류도 상기와 같은 방법으로 처리하여 제1 도메인 신호태그의 4종류와 제2 도메인 신호태그의 4종류를 모두 각각 혼합시켰으며, 상기 16개의 반응 결과물을 제1,2 도메인 혼합용액이라고 명명하였다.
마찬가지로 4종류의 제3 도메인 신호태그에서 선택되어진 한 종류를 4개의 튜브에 나누어 각각 최종농도 10 ug/mL씩 넣고, 각 튜브에 제4 도메인 신호태그의 4종류를 한 종류씩 최종농도 10 ug/mL씩 넣어 최종부피 100L의 T4 ligase의 반응용액(50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 10 mM DTT, pH 7.5)에서 혼합시켰다. 상기 제3 도메인 신호태그의 나머지 3종류도 상기와 같은 방법으로 처리하여 제3 도메인 신호태그의 4종류와 제4 도메인 신호태그의 4종류 모두를 각각 혼합시켰으며,상기 16개의 반응 결과물을 제3,4 도메인 혼합용액이라고 명명하였다.
또 마찬가지로 4종류의 제5 도메인 신호태그에서 선택되어진 한 종류를 4개의 튜브에 나누어 각각 최종농도 10 ug/mL씩 넣고 각 튜브에 제6 도메인 신호태그의 4종류를 한 종류씩 최종농도 10 ug/mL씩 넣어 최종부피 100L의 T4 ligase의 반응용액(50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 10 mM DTT, pH 7.5)에서 혼합시켰다. 상기 제5도메인 신호태그의 나머지 3종류도 상기와 같은 방법으로 처리하여 제5 도메인 신호태그의 4종류와 제6 도메인 신호태그의 4종류를 모두 각각 혼합시켰으며,상기 16개의 반응 결과물을 제5,6 도메인 혼합용액이라고 명명하였다.
상기와 같은 방법으로 제1,2 도메인 혼합용액의 16개 튜브, 제3,4 도메인 혼합용액의 16개의 튜브 그리고 제5,6 도메인 혼합용액의 16개의 튜브를 완성하였다.
제1,2 도메인 혼합용액의 16개 튜브에서 선택된 튜브, 제3,4 도메인 혼합용액의 16개의 튜브에서 선택된 튜브 그리고 제5,6 도메인 혼합용액의 16개의 튜브에서 선택된 튜브를 각각 같은 농도로 혼합하여 얻은 95 uL의 반응용액에 5 uL의 5 unit/uL T4 ligase(미국, NEB 사)를 처리하여 12시간 연결반응을 하여 6개의 도메인 신호태그가 일렬로 연속적 배열을 한 최종구조체인 총 4,096개(16×16×16=46)의 신호발생영역을 제조하였으며, 이를 편의상 "색상지시바코드"라 지칭하였다.
상기 각 반응 단계별 반응산물을 전기영동한 결과의 이미지를 도 9에 나타내었다.
이렇게 얻어진 색상지시바코드는 그 구성인자인 신호태그(신호발생물질이 표지된 이중가닥의 핵산 절편) 6개가 일렬로 배열된 구성이고 각 신호태그는 4 종류의 형광물질(Alexa dye 3종류 및 Cy3) 중 어느 하나로 표지되어 있어 각 신호의 선상 조합 순서(linear order)에 의해 고유의 검출 신호를 발생시키며, 아래에서 설명하는 바와 같이 제1 프로브인 표적분자와의 특이적 결합영역에 연결될 경우 총 4,096개(16×16×16=46)의 표적분자를 구분할 수 있게 된다. 이들 색상지시바코드는 300nm 크기의 스폿을 형성하며, 에피-형광현미경(epi-fluorescent microscope, US 8,519,115 B2; NatBiotechnol. 2008 Mar;26(3):293-4)에 의해 이미지화된다.
4) 탐침의 제조
제1 탐침은 표적분자를 인지하여 결합하고 고유의 신호를 발생시켜 표적분자를 검출하고 하기 위한 구조체(construct)로, 표적분자와의 특이적 결합영역인 제1 프로브가 상기 신호발생영역과 결합한 구조이다.
이러한 제1 탐침은 지지체와의 결합물질(바이오틴 등) 유무에 따라 비고정형과 고정형으로 나누어 제조하였으며, 제1 프로브로서는 핵산 검출을 위한 단일가닥 핵산, 및 단백질 등의 검출을 위한 항체와 압타머를 사용하였다.
(1) 비고정 제1 탐침
비고정 제1 탐침은 5'-색상지시바코드-스페이서-제1 프로브-3'의 구조로 제조하였다. 여기서 그리고 이하에서 5'과 3'은 색상지시바코드, 스페이서 등 핵산이 탐침의 구성요소로 사용된 경우 그러한 핵산의 배열의 방향 또는 순서를 의미하기 위해 사용하였다.
스페이서로서는 아래의 서열의 단일가닥 핵산을 주문 제조하여 사용하였다.
스페이서 서열: 5'-AGAAGCGCAGAGCTTGGGCGCAGAACAC-3'
① 제1 프로브가 단일가닥 핵산인 비고정 제1 탐침 제조
제1 프로브로 단일가닥 핵산을 이용한 비고정 제1 탐침을 다음과 같이 제조하였다. 먼저 단일가닥 핵산인 5'-스페이서-제1 프로브-3' 구조체를 주문하여 제조하였다(Integrated DNA Technologies 사, 미국). 다음 1 mg/ml 농도의 5'-스페이서-제1 프로브-3' 구조체 10 ul와 1 mg/ml 농도의 색상지시바코드 10 ul가 있는 48uL의 반응용액(50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 10 mM DTT, pH 7.5)에 2 uL의 5 unit/uL T4 ligase(미국, NEB 사)을 첨가하여 연결반응을 수행하여 핵산 검출을 위한 비고정 제1 탐침을 제조하였다.
② 제1 프로브가 항체인 비고정 제1 탐침 제조
제1 프로브로 항체를 이용한 비고정 제1 탐침을 다음과 같이 제조하였다. 먼저 항체에 반응성 그룹(DTT를 사용하여 항체의 disulfide bond를 환원시켜 얻어진 -SH 기) 부가 반응을 Thunder-Link oligo conjugation system(Innova Biosciences 사, 영국)의 프로토콜에 따라 실시하고, 반응성 그룹이 부가된 항체를 제조하였다. 구체적으로 제조사에서 제공하는 표준방법에 따라, 1 mg/ml 농도의 항체 100 ul를 제조사에서 제공하는 Antibody Activation Reagent 튜브에 첨가하여 실온에서 1시간 반응시켜 반응성 그룹이 부가된 활성화된 항체를 제조하였다. 다음 반응성 그룹(NH2)이 있는 단일가닥 핵산의 스페이서인 5'-스페이서-NH2를 주문 제조하였다(Integrated DNA Technologies 사, 미국). 다음 상기 활성화된 항체와 상기 반응성 그룹이 있는 스페이서를 N- succinimidyl-S-acetyl-thioacetate 용액에서 반응시켜 5'-스페이서-항체-3' 구조체를 제조하였다. 마지막으로 1 mg/ml 농도의 5'-스페이서-항체-3' 구조체 10 ul와 1 mg/ml 농도의 색상지시바코드 10 ul가 있는 48uL의 반응용액(50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 10 mM DTT, pH 7.5)에 2 uL의 5 unit/uL T4 ligase(미국, NEB 사)을 첨가하여 연결반응을 수행하여 단백질 등의 검출을 위한 비고정 제1 탐침을 제조하였다.
③ 제1 프로브가 압타머인 비고정 제1 탐침의 제조
제1 프로브로 압타머를 이용한 비고정 제1 탐침을 다음과 같이 제조하였다. 먼저 5'-스페이서-압타머-3' 구조체를 이를 주문하여 제조하였다(Integrated DNA Technologies사, 미국). 다음 1 mg/ml 농도의 5'-스페이서-압타머-3' 구조체 10 ul와 1 mg/ml 농도의 색상지시바코드 10 ul가 있는 48uL의 반응용액(50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 10 mM DTT, pH 7.5)에 2 uL의 5 unit/uL T4 ligase(미국, NEB 사)을 첨가하여 연결반응을 수행하여 핵산 검출을 위한 비고정 제1 탐침을 제조하였다.
(2) 고정 제1 탐침
고정 제1 탐침은 5'-제1 프로브-스페이서-고정영역-색상지시바코드-바이오틴-3' 구조로 제조하였다. 여기서 고정영역은 기지의 서열로 반복서열로 구성되는데, 상기 고정영역에 상보적인 서열을 포함하는 고정분자(즉 고정핵산분자)가 상보적으로 결합하여 지지체에 제1 탐침을 고정하기 위하여 사용된다.
고정영역은 아래 서열의 단일가닥 핵산을 사용하였다.
고정영역: 5'-(GCCACAGCACCTTGGTGCGTAGGATCTG)10-3'
여기서 10은 정수로 위 서열의 반복수를 의미한다.
① 제1 프로브가 단일가닥 핵산인 고정 제1 탐침 제조
제1 프로브로 단일가닥 핵산을 이용한 고정 제1 탐침을 다음과 같이 제조하였다. 먼저 단일가닥 핵산의 5'-스페이서-고정영역-3' 구조체를 주문 제조하여 준비하였다(Integrated DNA Technologies 사, 미국). 다음 색상지시바코드에 바이오틴을 부가하는 반응을 Thermo Scientific Biotin 3 End DNA Labeling Kit(미국, Thermo Scientific 사)를 사용하여 5'-색상지시바코드-바이오틴-3' 구조체를 제조하였다. 구체적으로 제조사가 제공한 표준방법에 따라 1 mg/ml 농도의 색상지시바코드 100 ul와 5 uM 농도의 Biotin-11-UTP((Biotin-11-Uridine-5'-triphosphate) 5 uL가 혼합된 45 uL의 반응용액에(50 mM Potassium Acetate, 20 mM Tris-acetate, 10 mM Magnesium Acetate,pH 7.9)에 5 uL의 1.5 U/uL terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)을 첨가하여 37℃에 1시간 반응시켜 제조하였다. 그 다음 1 mg/ml 농도의 5'-스페이서-고정역역-3' 구조체 10 ul와 1 mg/ml 농도의 5'-색상지시바코드-바이오틴-3' 구조체 10 ul가 혼합된 45 uL의 반응용액에(50 mM Potassium Acetate, 20 mM Tris-acetate, 10 mM Magnesium Acetate,pH 7.9)에 2 uL의 5unit/uL T4 ligase(미국, NEB 사)를 첨가하여 연결반응을 수행하여 5'-스페이서-고정영역-색상지시바코드-바이오틴-3' 구조체를 제조하고 정제하였다. 마지막으로 1 mg/ml 농도의 상기 제조 정제된 구조체 상기 10 ul와 1 mg/ml 농도의 제1 프로브 10 ul가 혼합된 45 uL의 반응용액에(50 mM Potassium Acetate, 20 mM Tris-acetate, 10 mM Magnesium Acetate,pH 7.9)에 2 uL의 5unit/uL T4 ligase(미국, NEB 사)을 첨가하여 연결반응을 수행하여, 5'-제1 프로브-스페이서-고정영역-색상지시바코드-바이오틴-3'인 제1 프로브가 단일가닥 핵산인 고정 제1 탐침 제조하였다.
② 제1 프로브가 항체인 고정 제1 탐침 제조
제1 프로브로 항체를 이용한 고정 제1 탐침을 다음과 같이 제조하였다. 먼저, 5'-색상지시바코드-바이오틴-3' 구조체와 반응성 그룹(SH 기)이 부가된 항체는 상기와 동일한 방법으로 준비하였고, 반응성 그룹(NH2)이 있는 단일가닥 핵산인 5'-NH2-스페이서-고정영역-3' 구조체는 주문 제조하여 준비하였다(Integrated DNA Technologies 사, 미국). 다음 1 mg/ml 농도의 NH2-스페이서-고정영역 구조체 100 ul와 1 mg/ml 농도의 5'-색상지시바코드-바이오틴-3' 구조체 100 ul가 혼합된 45 uL의 반응용액에(50 mM Potassium Acetate, 20 mM Tris-acetate, 10 mM Magnesium Acetate,pH 7.9)에 2uL의 5unit/uL T4 ligase(미국, NEB 사)을 첨가하여 연결반응을 수행함으로써, NH2-스페이서-고정영역-색상지시바코드-바이오틴-3' 구조체를 제조하였다. 그 다음 반응성 그룹이 부가된 상기 항체와 상기 구조체를 실온에서 12 ~ 24 시간 반응시키고 Conjugate Clean Up Reagent(Innova Biosciences 사, 영국)을 상기 반응 혼합용액에 첨가하여 10분간 반응시킨 다음 15,000g에서 5분간 원심분리를 수행하였다. 이러한 Conjugate Clean Up Reagent 첨가 반응과 원심분리를 2회 수행하여, 정제된 상태의 5'-제1 프로브-스페이서-고정영역-색상지시바코드-바이오틴-3'인 제1 프로브가 항체인 고정 제1 탐침 제조하였다.
③ 제1 프로브가 압타머인 고정 제1 탐침의 제조
제1 프로브로 압타머를 이용한 비고정 제1 탐침을 다음과 같이 제조하였다. 먼저 5'-색상지시바코드-바이오틴-3' 구조체는 상기와 동일한 방법으로 준비하였고, 5'-압타머-스페이서-고정영역-3'의 단일가닥 핵산은 주문 제조하여 준비하였다(Integrated DNA Technologies 사, 미국). 다음 1 mg/ml 농도의 5'-색상지시바코드-바이오틴-3' 구조체 100 ul와 1 mg/ml 농도의 5'-압타머-스페이서-고정영역-3' 구조체 100 ul가 혼합된 45 uL의 반응용액에(50 mM Potassium Acetate, 20 mM Tris-acetate, 10 mM Magnesium Acetate,pH 7.9) 2 uL의 5unit/uL T4 ligase(미국, NEB 사)을 첨가하여 연결반응을 수행함으로써 5'-제1 프로브-스페이서-고정영역-색상지시바코드-바이오틴-3'인 제1 프로브가 압타머인 고정 제1 탐침 제조하였다.
1-2. 제2 탐침과 포획 경쟁분자의 제조
제2 탐침은 포획 프로브 또는 포획 프로브로 표적분자와의 특이적인 결합영역인 제2 프로브와 수확을 위한 물질(수확물질)로 자성비드를 결합시켜 제조하였고, 경쟁분자는 표적분자(또는 표적분자와 경쟁할 수 있는 표적분자 유사체)와 수확물질로 자성비드를 결합시켜 제조하였다.
1) 제2 프로브가 단일가닥 핵산 또는 압타머인 제2 탐침의 제조
제2 프로브인 단일가닥 핵산 또는 압타머인 제2 탐침은 제2 프로브에 바이오틴과 스트렙타아비딘을 매개 물질로 하여 제조하였다. 먼저 미리 준비한 단일핵산 또는 압타머에 상기와 동일한 방법으로 바이오틴을 부가하는 반응을 Thermo Scientific Biotin 3 End DNA Labeling Kit(미국, Thermo Scientific 사)를 사용하여 5'-제2 프로브-바이오틴-3'를 제조하였다. 구체적으로 제조사가 제공한 표준방법에 따라 1 mg/ml 농도의 상기 구조체 100 ul와 5 uM 농도의 Biotin-11-UTP 5 uL가 혼합된 45 uL의 반응용액에(50 mM Potassium Acetate, 20 mM Tris-acetate, 10 mM Magnesium Acetate,pH 7.9) 5 uL의 1.5 U/uL terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)을 첨가하여 37℃에 1시간 반응시켜 제조하였다. 다음 상기 제조한 5'-제2 프로브-바이오틴-3' 50 ng/L를 5 ug/L의 스트렙타비딘이 코팅된 자성비드(Streptavidin-coupled Dynabeads, Dynal Biotech ASA, Norway)에 동일 부피로 첨가하여 제조사의 프로토콜에 따라 연속 회전하면서 반응시켜 자성비드에 제2 프로브로 단일가닥 핵산이 연결된 제2 탐침을 제조하였다.
2) 제2 프로브가 항체인 제2 탐침의 제조
제2 프로브가 항체인 제2 탐침은 항체에 직접 수확물질로 자성비드를 결합시켜 제조하였다. 먼저 100 ug의 항체와 5 mg의 토실기(Tosyl group)를 갖고 있는 활성화(Tosylactivated) 자성비드(M-280 Tosylactivated magnetic beads, Dynal Biotech ASA, Norway)를 버퍼용액(0.1 M borate buffer, pH 9.5)에 넣고 상온에서 48시간 반응시켰다. 토실기를 통해 항체가 결합된 자성비드를 자석을 이용해서 분리하였으며, 동일한 버퍼용액으로 비드를 세척하여 결합하지 않은 항체를 제거하였다. 분자가 결합된 자성비드(이하 포획 프로브)는 세척 후 0.1 %의 BSA(Bovine Serum Albumin, Sigma 사, 미국) 용액으로 37℃에서 4시간 반응시켜 분자와 결합하지 않은 토실(tosyl)기를 불활성화시켰다. 이어 수차례 세척 후 버퍼용액(0.1 M PBS, pH 7.4)에 자성비드를 혼합하여 4℃에서 보관하였다.
3) 경쟁분자가 단일가닥 핵산인 포획 경쟁분자의 제조
경쟁분자가 단일가닥 핵산인 포획 경쟁분자는 표적분자인 핵산 검출을 위해 사용되는데, 이는 상기 제2 프로브가 단일가닥 핵산 또는 압타머인 제2 탐침의 제조와 동일한 동일한 방법으로 제조하였다.
4) 경쟁분자가 단백질인 포획 경쟁분자의 제조
경쟁분자가 단백질인 포획 경쟁분자는 표적분자인 단백질 검출을 위해 사용되는데, 이는 상기 제2 프로브가 단일가닥 핵산 또는 압타머인 제2 탐침의 제조와 동일한 동일한 방법으로 제조하였다. 여기서 경쟁분자은 표적 단백질과 동일한 단백질을 사용하였다.
1-3. 고정분자의 제조
고정분자는 제1 탐침의 고정영역을 구성하는 반복서열에 상보적인 염기서열이며 5' 끝에 바이오틴이 표지된 단일가닥 핵산을 주문 제조하여 준비하였다(Integrated DNA Technologies사, USA).
<실시예 2> 세균 검출
대표적인 식중독균인 대장균, 살모넬라균, 리스테리아 및 포도상구균을 <표2>의 항체 및 <표 3>의 압타머가 제1 프로브(리간드)로 사용되어 제조된 고정 제1 탐침을 사용하여 검출하였다.
식중독균 표면 분자에 결합하는 항체
항체 종류 카탈로그번호 공급회사
E. coli / Anti-E. coli antibody ab25823 Abcam 사
Listeria / Anti-Listeria Antibody 01-90-95 KPL 사
Salmonella CSA-1 / Anti-Salmonella CSA-1 Antibody 01-91-99 KPL 사
식중독균 표면 분자에 결합하는 압타머의 염기서열
식중독균 염기서열(5'→3') 일련번호 비고
대장균(e.coli) CGCAGUUUGC GCGCGUUCCA AGUUCUCUCA UCACGGAAUA 서열번호 13 대한민국등록특허 10-0730359
ACACUGCGUG CUUACGACUU CUGGUCCCAU CAUUCGGCUA 서열번호 14
AGUUCGAUGA GGGUGACACC GCCAGGAGUG UUUGCUAGAC 서열번호 15
Salmonella typhimurium AGGTCTGTAGGTCTGCGGGGCGTGG 서열번호 16 대한민국등록특허 10-1459547
CAGCCAGGATGGGAGGTCTGTAGGTCTGCGGGGCGTGG 서열번호 17
Staphylococcus aureus GCAATGGTACGGTACTTCCGGGCTGGCCAGATCAGACCCCGGATGATCATCCTTGTGAGAACCACAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA 서열번호 18 Aptagen사
반응용액은 항체 리간드의 경우는 10mM PBS 버퍼(137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl pH 7.4)이며 압타머 리간드의 경우는 셀렉스 버퍼(20 mM Tris-Cl buffer, pH 7.6 contained 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2 and 0.02% Tween)를사용하였다. 반응용액에 세균 번식 저해를 위한 소듐아지드 0.05 내지 0.2%(w/v), 비특이적 결합 저해를 위한 우혈청알부민 0.1 내지 0.3%(w/v)을 포함시켰다. 반응은 20 내지 30℃의 온도에서 수행하였다.
세균이 포함된 시료 70 ul에 바이오틴이 결합된 제1 탐침 15 ul를 혼합하여 30분간 흔들어 주면서 반응시켰다. 상기 반응용액 20 ul을 스트렙타아비딘이 코팅된 유리슬라이드(Nanocs 사, 미국)에 처리하고, 그 유리슬라이드를 0.1X SSPE와 0.1 % tween-20를 포함하는 세척용액으로 3회 세첵하여 세균과 결합하지 않거나 비특이적 결합을 하고 있는 제1 탐침을 제거하였다. 커버 슬립을 덮고 제1 탐침이 세균과 결합하여 형성된 복합체에 있는 세균의 존재 신호가 발생하는 스폿들(spots)을, nCounter 디지탈 분석기(nCounter digital analyzer, Nanostring technology 사, 미국)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 이미지화시켜 도 9에 나타내었다.
<실시예 3> 핵산 및 단백질 검출
3-1. 핵산 검출 반응
핵산 검출을 위해, 아래 <표 4>의 단일가닥 핵산의 제1 프로브를 포함하는 고정 제1 탐침과 또 아래 <표 4>의 단일가닥 핵산의 제2 프로브를 포함하는 제2 탐침을 사용하였고, β-actin, IL17 및 IL17R mRNA를 표적분자로 하였다. 아래 <표 4>의 β-actin, IL17 및 IL17R mRNA의 단일가닥 핵산들은 주문 제조하여 제1 탐침과 제2 탐침의 제조에 사용하였다(바이오니아. 한국). 표적분자인 β-actin, IL17 및 IL17R mRNA의 염기서열 정보는 진뱅크(GenBank) 데이터 시스템(http:// www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 얻을 수 있다(IL17의 Accession number는NM_002190, 및 IL17RA의 Accession number: NM_014339).
표적 mRNA에 대한 프로브 서열
종 류 제1 프로브 (5'-3') 제2 프로브 (5'-3')
β-actin mRNA gggcgacgaggcccagagcaagaga(서열번호 19) ggcatcctcaccctgaagtacccca(서열번호 20)
IL17 mRNA ccctcaggaaccctcatccttcaaa(서열번호 21) gacagcctcatttcggactaaactc (서열번호 22)
IL17RA mRNA ggagcagaagcctcccagccactag(서열번호 23) ccttttgggctcagtctctccaata(서열번호 24)
시료는 사람의 연골조직(Promocell 사, 독일)을 사용하였다. 먼저 시료에서 표적분자인 mRNA는 AllPrep DNA/RNA/Protein Mini kit (Qiagen사. 미국)를 이용하여 분리하였다. 구체적으로 제조사의 프로토콜에 따라 연골조직을 제조사에 제공된 버퍼로 용해시킨 후 용해된 시료를 컬럼에 처리하고 원심분리하여 RNA를 컬럼막에 결합시켰다. 컬럼막에 있는 RNA 분리는 RNA가 있는 컬럼을 세척하고 막에서 RNA를 추출한 후, 원심분리하여 RNA를 수확하였다.
총 RNA 100 ng/uL에 제1 탐침 200 ng/uL과 제2 탐침 200 ng/uL을 혼합하여 흔들어 주면서 혼합하여 혼성화 반응을 통해 제1 탐침-표적 mRNA-제2 탐침 복합체를 유도하였다. 혼성화 반응은 0.5 M NaHPO4, 7% SDS(sodium dodecyl sulfate) 및 1 mM EDTA를 포함하는 반응용액에서 65℃ 조건에서 수행하였다. 다음 반응용액을 자석에 처리하여 제2 탐침의 자성비드에 의한 상기 복합체의 자석에의 고정을 유도한 후 이를 세척용액으로 세척하여 비결합 제1 탐침, 비표적 RNA를 제거하였다. 상기 세척은 6X SSC(standard saline citrate)/0.1% SDS를 이용 48℃에서 1회, 0.1X SSC/0.1% SDS를 이용 68℃ 1회, 0.2X SSC/0.1% SDS를 이용 42℃ 1회 총 3회 수행하였다.
제1 탐침-표적 mRNA-제2 탐침 복합체가 결합된 자석에 0.1X SSPE 및 0.1% tween-20를 포함하는 용액을 처리하고 95℃에서 5분간 가열하여, 상기 복합체에서제1 탐침의 분리를 유도한 후, 제1 탐침이 포함된 상층액을 수확하였다.
상층액을 수확한 후에는 분자 계수 분석기인 nCounter 디지탈 분석기(nCounter digital analyzer, Nanostring technology 사, 미국)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라, 제1 탐침을 스트렙타비딘이 코팅된 커버 슬립에 고정시키고 고정된 스폿을 이미지화시켜 검출하고 정량화하였다.
구체적으로 상기 수확한 상층액 3 uL에, 0.1% Tetraspeck 형광 마이크로 스피어 용액(Invitrogen 사, USA)을 1:5,000로 희석한 시약 1uL을 첨가하여 혼합하여 분석시료를 준비하고 그 분석시료를 스트렙타비딘이 코팅된 커버 슬립(Optichem, Accelr8 Technology Corporation)이 구비된 상기 분석기의 유체장치에 로딩하여 제1 탐침의 바이오틴과 커버 슬립의 스트렙타비딘의 사이의 결합을 통해 지지체인 커버 슬립에 제1 탐침의 결합을 유도하였다. 이렇게 결합을 유도한 후, 표면을 90 uL의 1X TAE 용액으로 1회 세척하여, 1X TAE 용액 40 uL을 추가적으로 처리하여 제1 탐침이 펴지도록(streching 되도록) 한 후 1분 동안 160 V/cm을 적용하였다. 펴진 제1 탐침에 60 uL의 500 nM 고정분자를 첨가하여 제1 탐침의 반복서열을 포함하는 고정영역에 상보적 결합을 유도함으로써 제1 탐침을 표면에 추가적으로 고정화시켰다. 이러한 고정화 과정 동안에 전류를 5분 동안 유지시켰다. 고정화 후 TAE 용액을 제거하고, 다음 촬영용 안티 광표백제(antiphotobleaching reagent)인 SlowFade 시약 (Invitrogen 사)를 첨가하여 이미지화를 준비하였다. 이렇게 이미지화를 준비한 후에는 상기 분석기의 촬영기를 통해 네 개의 형광물질에 대응하는 네 개의 다른 여기 파장(480, 545, 580, 622)에서 네 개의 이미지를 획득하였다. 획득된 네개의 이미지를 통합하여(spatial clustering) 도 11의 모식도에서 보여지는 바와 같은 제1 탐침에 대한 이미지를 얻었다. 이미지화 과정세서 상기 분석기의 해상도는 600 FOV(field of view)로 설정하였다. 상기 분석기에서 데이터를 다운로딩하고 제조사가 제공하는 분석 지침에 따라 엑셀 상에서 분석하였다. 데이터는 처음에 제공된 양성 검정 대조군 표준곡선을 사용하여 시료 내의 기준물질 및 표적분자를 정상화하였다. 정상화된 값은 시료에 포함된 기준물질들의 값을 사용하여 표적분자 값을 전반적으로 평균 정상화를 수행하였다. 표적분자의 정량값은 3회 반복 수행 분석 결과를 평균하여 계산하였다.
이렇게 상기 분석기를 이용, 표적분자인 mRNA에 대해 분자 계수 분석방법으로 정량적 결과를 얻었다. 이렇게 얻어진 결과는 표적 mRNA에 대한 RT-PCR 결과와 유사하였다.
3-2. 단백질 검출 반응
3-2-1. 제1 탐침만을 이용한 단백질 검출 반응
아래 <표 5>의 폴리클로날 항체를 표적분자에 대한 제1 프로브로 포함하는 고정 제1 탐침만을 이용하여 아래 <표 5>의 표적분자에 대한 검출 반응을 수행하였다. 이 단백질 검출 반응의 전체적인 프로세스는 도 2 및 3에서 확인할 수 있다.
표적분자와 그에 대한 항체
표적분자/항체 카탈로그번호 제조사
NGF/NGF Anti-NGF/NGFβ antibody OKBB00229 Aviva Systems Biology
Amyloid beta (A4) Precursor Protein (APP) Anti-Amyloid beta (A4) Precursor Protein (APP) antibody ab12266 Abcam
(Tau) / Anti- (Tau) antibody T6402 SIGMA
phospho-Tau (pSer400) / Anti-phospho-Tau (pSer400) antibody T1700 SIGMA
C Reactive Protein (CRP)/ Anti-C Reactive Protein (CRP)antibody ab99995 abcam
TGF alpha / Anti-TGF alpha antibody ab9585 abcam
IL1 beta / Anti-IL1 beta antibody ab2105 abcam
Serum Amyloid A / Anti-Serum Amyloid A antibody ab200584 abcam
p53 / p53 Antibody (DO-7) MA5-12557 abcam
CEACAM5 / CEACAM5 Polyclonal Antibody MBS170144 BioSource
alpha Fetoprotein / alpha Fetoprotein antibody (alpha-Fetoprotein) (N-Term) ABIN356914 Biocompare
E. coli Enoyl-ACP Reductase/ Anti-E. coli Enoyl-ACP Reductase antibody Sino Biological Inc. 중국
Phototropin 1 / Anti-Phototropin 1 antibody Cosmo Bio Co. Ltd. 일본
먼저 10mM PBS 버퍼(137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl pH 7.4)를 이용하여 상기 [표 5]의 표적분자가 100 ug/ml로 포함된 용액을 각각 제조하고, 이 용액을 단계적으로 희석하여 최종 생체분자의 농도를 1,000 pg/mL, 100 pg/mL, 10 pg/mL, 0.1 pg/mL 및 0 pg/mL이 되도록하였다. 분석 혼합시료는 13종류의 생체분자에 대한 상기 희석 용액을 다양한 농도로 혼합하여 준비하였다.
또한 고정 제1 탐침 용액은 10mM PBS 버퍼(137 mM NaCl, 10 mM Phosphate, 2.7 mM KCl pH 7.4)를 이용하여 제1 탐침을 200 ng/ul의 농도로 포함하도록 제조하였다.
상기 분석시료가 포함된 반응용액에 나이트로셀룰로오스 막(Nitrocellulose membrane) disc를 넣어 30분간 흔들어 주면서 반응시켜 시료 중의 단백질이 막에 흡착되도록 하였다. 상기 디스크를 150 uL의 0.1X SSPE/0.1% tween-20 용액으로 세척하고 Blocking solution[2% (w/v) Bovine Serum Albumin (BSA)이 있는 세척용액]에 넣어 반응을 시켰다. 각 표적분자에 대한 고정 제1 탐침 용액 70 ul을 첨가하여 흔들어 주면서 1시간 반응시켜 표적분자-제1 탐침 사이의 복합체 형성을 유도하였다. 다음 복합체를 형성하지 않는 과다 제1 탐침과 비특이적 복합체를 형성한 제1 탐침을 제거하기 위해서 상기 디스크에 150 uL의 0.1X SSPE/0.1% tween-20 용액을 첨가하여 3회 세척하였다.
세척된 디스크에서 제1 탐침을 분리시켜 수확하기 위하여, 상기 세척된 디스크에 0.1X SSPE/0.1% tween-20 용액을 첨가하고 95℃에서 5분간 가열하여 상기 복합체에서 제1 탐침의 분리를 유도한 후, 제1 탐침이 포함된 상층액을 수확하였다.
상층액을 수확한 후에는 상기 실시예 3-1에서와 동일한 방법으로 분자 계수 분석기인 nCounter 디지탈 분석기(nCounter digital analyzer, Nanostring technology 사, 미국)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라, 제1 탐침을 스트렙타비딘이 코팅된 커버 슬립에 고정시키고 고정된 스폿을 이미지화시켜 검출하고 정량화하였다.
3-2-2. 제1 탐침과 제2 탐침을 이용한 단백질 검출 반응(포획 검출 반응)
상기 <표 5>의 폴리클로날 항체를 표적분자에 대한 제1 프로브로 포함하는 고정 제1 탐침과 마찬가지로 상기 <표 5>의 폴리클로날 항체를 각 표적분자에 대해 제2 프로브로 포함하는 제2 탐침을 이용하여 상기 <표 5>의 표적분자에 대한 검출 반응을 수행하였다. 이 단백질 검출 반응의 전체적인 프로세스는 도 4 및 5에서 확인할 수 있다.
분석시료는 상기 실시예 4-1과 동일한 방법으로 준비하였다. 분석시료 25 ul에, 각 표적분자에 대한 고정 제1 탐침 용액 70 ul과 제2 탐침 용액 70 uL를 혼합하여 흔들어 주면서 1시간 반응시켜 제1 탐침-표적분자-제2 탐침 사이의 복합체 형성을 유도하였다. 다음 반응용액을 자석에 처리하여 제2 탐침의 자성비드에 의한 상기 복합체의 자석에의 고정을 유도한 후 이를 세척용액으로 세척하여 비결합 제1 탐침, 비표적 분자들을 제거하였다. 이때 세척은 150 uL의 0.1X SSPE/0.1% tween-20 용액을 이용하여 3회 수행하였다.
다음 상기 복합체가 결합된 자석에 0.1X SSPE/0.1% tween-20 용액을 처리하고 95℃에서 5분간 가열하여, 상기 복합체에서제1 탐침의 분리를 유도한 후, 제1 탐침이 포함된 상층액을 수확하였다.
상층액을 수확한 후에는 상기 실시예 3-1에서와 동일한 방법으로 분자 계수 분석기인 nCounter 디지탈 분석기(nCounter digital analyzer, Nanostring technology 사, 미국)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라, 제1 탐침을 스트렙타비딘이 코팅된 커버 슬립에 고정시키고 고정된 스폿을 이미지화시켜 검출하고 정량화하였다.
이렇게 정량화한 결과를 아래 <표 6>에 나타내었다.
준비된 혼합시료에 있는 표적분자의 실제 및 분석농도
표적분자 일렬번호 실제양(pg/mL) 측정양(pg/mL)
NGF/NGF 1 12.0 12.5
Amyloid beta (A4) Precursor Protein (APP) 2 1.0 0.8
Tau 3 1.0 0.8
phospho-Tau (pSer400) 4 0.2 0.2
C Reactive Protein (CRP) 5 130 125.5
TGF alpha 6 6.0 6.2
IL1 beta / Anti-IL1 beta antibody 7 40.0 38.1
Serum Amyloid A 8 5.0 5.0
p53 9 2.5 2.5
CEACAM5 10 2.0 1.9
alpha Fetoprotein 11 0.5 0.6
E. coli Enoyl-ACP Reductase 12 80.0 81.9
Phototropin 1 13 10.0 9.5
2 종류의 표준물질(E. coli Enoyl-ACP Reductase, Phototropin 1)로 구성된 모의(mock) 비교구와 표준물질을 포함하고 다른 표적분자들을 포함하는 대조구에 대해 3회 분석하였다. 표준물질로 이루어진 모의 비교구를 표준농도곡선 작성과 반응, 정제 및 포집 효율에서 차이가 있는 데이터를 정규화하기 위해 사용하였다. 표준물질의 선형성, 동적 범위(dynamic range) 및 재현성을 조사하여 도 12에 나타내었다. 도 12는 모의 비교구의 표준물질에 대해 측정한 결과이며(N = 6), 로그-로그 플롯상의 점을 중첩하여 나타낸 바와 같이, 각 분석에 대한 제어 신호의 값(카운트) 0.1 pg/mL과 100 pg/mL 사이에서 재현성이 매우 높은 결과를 보였다. 또한 분석 결과는 농도 대 카운트의 선형 회귀 상관 계수는 농도의 0.1 이상 로그에서 ≥0.989 로고로 선형성이 있었다.
또 상기 <표 6>의 13종류의 생체분자를 2회 독립적인 반응으로 검출하고 정규화한 결과를 도 13에 로그-로그 스케일로 나타내었으며 각각 신호의 편차가 0.7 ~ 35.4이였다.
4-2-3. 제1 탐침과 포획 경쟁분자를 이용한 단백질 검출 반응(경쟁 검출 반응)
상기 <표 6>의 항체를 제1 프로브로 한 제1 탐침과 상기 <표 5>의 각 단백질을 경쟁분자로 사용한 포획 경쟁분자를 이용하여 상기 <표 5>의 표적분자에 대한 검출 반응을 수행하였다. 이 단백질 검출 반응의 전체적인 프로세스는 도 6 및 7에서 확인할 수 있다.
분석시료는 상기 실시예 4-1과 동일한 방법으로 준비하였다. 분석시료 25 ul에, 각 표적분자에 대한 고정 제1 탐침 용액 70 ul과 미리 농도(30 ug/ul)를 정량한 포획 경쟁분자 70 uL를 혼합하여 흔들어 주면서 1시간 반응시켜 제1 탐침-표적분자와 제1 탐침-포획 경쟁분자 사이의 복합체 형성을 유도하였다. 다음 반응용액을 자석에 처리하여 포획 경쟁분자의 자성비드에 의한 상기 복합체의 자석에의 고정을 유도한 후 이를 세척용액으로 세척하여 비결합 제1 탐침, 표적분자 이외의 다른 표적분자, 제1 탐침-표적분자를 제거하고 제1 탐침-포획 경쟁분자 사이의 복합체만을 수확하였다. 이때 세척은 150 uL의 0.1X SSPE/0.1% tween-20 용액을 이용하여 3회 수행하였다.
다음 상기 제1 탐침-포획 경쟁분자 결합된 자석에 0.1X SSPE/0.1% tween-20 용액을 처리하고 95℃에서 5분간 가열하여, 상기 복합체에서제1 탐침의 분리를 유도한 후, 제1 탐침이 포함된 상층액을 수확하였다.
상층액을 수확한 후에는 상기 실시예 3-1에서와 동일한 방법으로 분자 계수 분석기인 nCounter 디지탈 분석기(nCounter digital analyzer, Nanostring technology 사, 미국)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라, 제1 탐침을 스트렙타비딘이 코팅된 커버 슬립에 고정시키고 고정된 스폿을 이미지화시켜 검출하고 정량화하였다. 이렇게 얻어진 포획 경쟁분자의 정량 결과로부터 표준곡선을 이용하여 표적분자의 정량 결과를 얻었다.

Claims (41)

  1. (i) 표적분자에 특이적으로 결합하는 영역과
    (ii) 그 표적분자와의 특이적 결합영역에 결합된 신호발생영역을 포함하되,
    그 신호발생영역은 서로 상보적으로 가교결합된 이중가닥 핵산으로 그 이중가닥 핵산에는 동일한 신호발생물질로 표지되거나 서로 다른 신호발생물질로 표지된 2개 이상의 영역이 존재하는
    표적분자에 고유한 신호를 발생시킬 수 있는 이중가닥 핵산 신호 프로브.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 2개 이상의 영역은 그 하나 이상의 영역이 나머지 영역과는 다른 신호를 발생시키는 신호발생물질로 표지된 것을 특징으로 하는
    신호 프로브.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 신호발생영역인 이중가닥 핵산은 완전한 이중가닥 핵산 또는 부분적 이중가닥 핵산인 것을 특징으로 하는
    신호 프로브.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 표적분자와의 특이적 결합영역은 단일가닥 핵산, 항체, 항원 또는 압타머인 것을 특징으로 하는
    신호 프로브.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 신호발생물질은 서로 다른 색상을 가진 2종류 이상의 형광물질인 것을 특징으로 하는
    신호 프로브.
  6. 제1항에 있어서,
    고정영역이 기지의 서열로 신호발생영역에 인접하여 연결된 것을 특징으로 하는
    신호 프로브.
  7. 제1항에 있어서,
    고정영역이 기지의 서열로 상기 신호발생영역에 인접하여 추가로 연결되고,
    기지의 서열이 2회 반복하여 이루어진 것을 특징으로 하는
    신호 프로브.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 표적분자와의 특이적 결합영역과 상기 신호발생영역 사이에 스페이서가 포함되어 연결된 것을 특징으로 하는
    신호 프로브.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 표적분자의 특이적 결합영역 반대쪽에 결합 태크가 연결된 것을 특징으로 하는
    신호 프로브.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 표적분자의 특이적 결합영역 반대쪽에 결합 태크가 연결되고,
    그 결합 태그는 비오틴 또는 비오틴 유사체인 것을 특징으로 하는
    신호 프로브.
  11. (a) 분석 대상 시료에 표적분자와의 특이적 결합영역을 가진 신호 프로브를 처리하여 시료 중의 표적분자와 신호 프로브의 복합체를 형성시키는 단계, 및
    (b) 그 복합체의 신호 프로브를 검출하는 단계를 포함하되,
    상기 신호 프로브는 (i) 표적분자에 특이적으로 결합하는 영역과 (ii) 그 표적분자와의 특이적 결합영역에 결합된 신호발생영역을 포함하고, 그 신호발생영역은 서로 상보적으로 가교결합된 이중가닥 핵산으로 그 이중가닥 핵산에는 동일한 신호발생물질로 표지되거나 서로 다른 신호발생물질로 표지된 2개 이상의 영역이 존재함으로써,
    상기 신호 프로브의 검출 단계는 상기 신호발생영역의 신호를 검출함에 의해 수행되는
    분석 대상 시료 중의 표적분자의 검출방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 표적분자와의 특이적 결합영역은 단일가닥 핵산, 항체, 항원 또는 압타머인 것을 특징으로 하는
    검출방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 신호 프로브의 검출 단계는 (i) 상기 복합체로부터 신호 프로브를 분리하는 단계, 및 (ii) 그 분리된 신호 프로브의 신호를 검출하는 단계를 포함하는
    검출방법.
  14. (a) 분석대상 시료를 니트로셀룰로오스 막에 처리하여 시료 중의 단백질들을 니트로셀룰로오스 막에 흡착시키는 단계,
    (b) 상기 단백질이 흡착된 니트로셀룰로오스 막에 차단제를 처리하여 단백질이 비흡착된 니트로셀룰로오스 표면을 차단시키는 단계,
    (c) 상기 차단된 니트로셀룰로오스 막에 표적단백질과의 특이적 결합영역을 가진 신호 프로브를 처리하여 시료 중의 표적단백질과 신호 프로브의 복합체를 형성시키는 단계, 및
    (d) 그 복합체의 신호 프로브를 검출하는 단계를 포함하되,
    상기 신호 프로브는 (i) 표적단백질에 특이적으로 결합하는 영역과 (ii) 그 표적단백질과의 특이적 결합영역에 결합된 신호발생영역을 포함하고, 그 신호발생영역은 서로 상보적으로 가교결합된 이중가닥 핵산으로 그 이중가닥 핵산에는 동일한 신호발생물질로 표지되거나 서로 다른 신호발생물질로 표지된 2개 이상의 영역이 존재함으로써,
    상기 신호 프로브의 검출 단계는 상기 신호발생영역의 신호를 검출함에 의해 수행되는
    분석대상 시료 중의 표적단백질의 검출방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 표적분자와의 특이적 결합영역은 항체 또는 항원인 것을 특징으로 하는
    검출방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 (a) 단계 후에 니트로셀룰로오스 막에 흡착된 단백질 이외의 다른 분자들을 제거하기 위한 세척 단계가 수행되는 것을 특징으로 하는
    검출방법.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 (c) 단계 후에 비특이적 결합 분자를 제거하기 위한 세척 단계가 수행되는 것을 특징으로 하는
    검출방법.
  18. 제14항에 있어서,
    상기 (d) 단계의 신호 프로브 검출 단계가, (d-1) 상기 복합체로부터 신호 프로브를 분리시키는 단계, 및 (d-2) 그 분리된 신호 프로브를 검출하는 단계를 포함하여 수행되는 것을 특징을 하는
    검출방법.
  19. 제14항에 있어서,
    상기 신호 프로브는 그 표적분자의 특이적 결합영역 반대쪽에 결합 태크가 연결되어 있고,
    상기 (d) 단계의 신호 프로브 검출 단계가, (d-1) 상기 복합체로부터 신호 프로브를 분리시키는 단계, 및 (d-2) 그 분리된 신호 프로브를 검출하는 단계를 포함하여 수행되며,
    상기 (d-2) 신호 프로브 검출 단계는
    (d-2-i) 그 분리된 신호 프로브를, 그 신호 프로브의 결합 태그를 통해 그 결합 태그에 대한 결합 파트너가 코팅되어 있는 분석용 지지체에 처리하여 결합 태그와 결합 파트너의 특이적 결합을 통해 분석용 지지체에 고정시키는 단계와, (d-2-ii) 그 지지체에 고정된 신호 프로브의 신호를 검출하는 단계를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 하는
    검출방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 결합 태그는 그 결합 태그는 비오틴 또는 비오틴 유사체인 것을 특징으로 하는
    검출방법.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 결합 파트너는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 유사체인 것을 특징으로 하는
    검출방법.
  22. 제19항에 있어서,
    고정영역이 기지의 서열로 상기 신호발생영역에 인접하여 추가로 연결되어 있고,
    상기 (d-2-ii) 신호 프로브의 신호 검출 단계는
    상기 고정영역에 상보적인 단일가닥 핵산 서열을 가지고 그 서열에 상기 결합 파트너와 특이적으로 결합할 수 있는 결합 태그를 가진 고정핵산분자를 상기 지지체에 처리하는 단계, 및
    그 처리 단계 후 신호 프로브의 신호를 검출하는 단계를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 하는
    검출방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 고정핵산분자의 결합 태크는 비오틴 또는 비오틴 유사체인 것을 특징으로 하는
    검출방법.
  24. (a) 분석대상 시료에 그 표적분자에 특이적으로 결합하는 신호 프로브와 그 신호 프로브가 특이적으로 결합하는 표적분자의 부위와 다른 부위에 특이적으로 결합하는 영역과 그 영역에 자성입자가 연결된 포획 프로브를 처리하여 상기 표적분자와 상기 신호 프로브 그리고 상기 포획 프로브의 복합체를 형성시킴과 함께, 그 복합체를 포함하고 복합체를 형성하지 않은 신호 프로브와 포획 프로브를 포함하는 혼합물을 얻는 단계, 및
    (b) 그 혼합물 중의 복합체의 신호 프로브를 검출하는 단계를 포함하되,
    상기 신호 프로브는 (i) 표적단백질에 특이적으로 결합하는 영역과 (ii) 그 표적단백질과의 특이적 결합영역에 결합된 신호발생영역을 포함하고, 그 신호발생영역은 서로 상보적으로 가교결합된 이중가닥 핵산으로 그 이중가닥 핵산에는 동일한 신호발생물질로 표지되거나 서로 다른 신호발생물질로 표지된 2개 이상의 영역이 존재함으로써,
    상기 신호 프로브의 검출 단계는 상기 신호발생영역의 신호를 검출함에 의해 수행되는
    분석대상 시료 중의 표적단백질의 검출방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 표적분자와의 특이적 결합영역은 단일가닥 핵산, 항체, 항원 또는 압타머인 것을 특징으로 하는
    검출방법.
  26. 제24항에 있어서,
    상기 (b) 신호 프로브 검출 단계는
    (b-1) 상기 혼합물 중의 복합체로부터 신호 프로브만을 분리시키는 단계, 및
    (b-2) 그 분리된 신호 프로브를 검출하는 단계를 포함하여 수행되는 것을 특징을 하는
    검출방법.
  27. 제24항에 있어서,
    상기 (b) 신호 프로브 검출 단계는
    (b-1) 상기 혼합물 중의 복합체로부터 신호 프로브만을 분리시키는 단계, 및
    (b-2) 그 분리된 신호 프로브를 검출하는 단계를 포함하여 수행되고,
    상기 (b-1) 신호 프로브만을 분리시키는 단계는
    (b-1-i) 상기 혼합물에 자석을 적용하여 상기 복합체와 복합체를 형성하지 않은 포획 프로브만을 자석에 결합시켜 혼합물의 나머지 성분을 제거하는 단계,
    (b-1-ii) 자석에 결합되어 있는 복합체로부터 신호 프로브만을 분리시키는 단계를 포함하여 수행되되는 것을 특징으로 하는
    검출방법.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 신호 프로브는 그 표적분자의 특이적 결합영역 반대쪽에 결합 태크가 연결되어 있고,
    상기 (b-2)의 신호 프로브 검출 단계는
    (b-2-i) 그 분리된 신호 프로브를, 그 신호 프로브의 결합 태그를 통해 그 결합 태그에 대한 결합 파트너가 코팅되어 있는 분석용 지지체에 처리하여 결합 태그와 결합 파트너의 특이적 결합을 통해 분석용 지지체에 고정시키는 단계와, (b-2-ii) 그 지지체에 고정된 신호 프로브의 신호를 검출하는 단계를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 하는
    검출방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 결합 태그는 그 결합 태그는 비오틴 또는 비오틴 유사체인 것을 특징으로 하는
    검출방법.
  30. 제28항에 있어서,
    상기 결합 파트너는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 유사체인 것을 특징으로 하는
    검출방법.
  31. 제28항에 있어서,
    고정영역이 기지의 서열로 상기 신호발생영역에 인접하여 추가로 연결되어 있고,
    상기 (b-2-ii) 신호 프로브의 신호 검출 단계는
    상기 고정영역에 상보적인 단일가닥 핵산 서열을 가지고 그 서열에 상기 결합 파트너와 특이적으로 결합할 수 있는 결합 태그를 가진 고정핵산분자를 상기 지지체에 처리하는 단계, 및
    그 처리 단계 후 신호 프로브의 신호를 검출하는 단계를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 하는
    검출방법.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 고정핵산분자의 결합 태크는 비오틴 또는 비오틴 유사체인 것을 특징으로 하는
    검출방법.
  33. (a) 분석대상 시료에 그 표적분자에 특이적으로 결합하는 신호 프로브와 그 신호 프로브가 특이적으로 결합하는 표적분자의 부위와 동일한 부위에 특이적으로 결합하는 영역과 그 영역에 자성입자가 연결된 포획 경쟁분자를 정량하여 처리하여 상기 포획 경쟁분자와 상기 신호 프로브 사이의 복합체를 형성시킴과 함께, 그 복합체를 포함하는 혼합물을 얻는 단계, 및
    (b) 그 혼합물 중의 복합체의 신호 프로브를 검출하는 단계를 포함하되,
    상기 신호 프로브는 (i) 표적단백질에 특이적으로 결합하는 영역과 (ii) 그 표적단백질과의 특이적 결합영역에 결합된 신호발생영역을 포함하고, 그 신호발생영역은 서로 상보적으로 가교결합된 이중가닥 핵산으로 그 이중가닥 핵산에는 동일한 신호발생물질로 표지되거나 서로 다른 신호발생물질로 표지된 2개 이상의 영역이 존재함으로써,
    상기 신호 프로브의 검출 단계는 상기 신호발생영역의 신호를 검출함에 의해 수행되고,
    상기 신호 리간드는 포획 경쟁분자와 표적분자 모두를 검출할 수 있는 양 이하로 처리되는
    분석대상 시료 중의 표적 단백질의 검출방법.
  34. 제33항에 있어서,
    상기 표적분자와의 특이적 결합영역은 단일가닥 핵산, 항체, 항원 또는 압타머인 것을 특징으로 하는
    검출방법.
  35. 제33항에 있어서,
    상기 (b) 신호 프로브 검출 단계는
    (b-1) 상기 혼합물 중의 복합체로부터 신호 프로브만을 분리시키는 단계, 및
    (b-2) 그 분리된 신호 프로브를 검출하는 단계를 포함하여 수행되는 것을 특징을 하는
    검출방법.
  36. 제33항에 있어서,
    상기 (b) 신호 프로브 검출 단계는
    (b-1) 상기 혼합물 중의 복합체로부터 신호 프로브만을 분리시키는 단계, 및
    (b-2) 그 분리된 신호 프로브를 검출하는 단계를 포함하여 수행되고,
    상기 (b-1) 신호 프로브만을 분리시키는 단계는
    (b-1-i) 상기 혼합물에 자석을 적용하여 상기 복합체와 복합체를 형성하지 않은 포획 경쟁분자만을 자석에 결합시켜 혼합물의 나머지 성분을 제거하는 단계,
    (b-1-ii) 자석에 결합되어 있는 복합체로부터 신호 프로브만을 분리시키는 단계를 포함하여 수행되되는 것을 특징으로 하는
    검출방법.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 신호 프로브는 그 표적분자의 특이적 결합영역 반대쪽에 결합 태크가 연결되어 있고,
    상기 (b-2)의 신호 프로브 검출 단계는
    (b-2-i) 그 분리된 신호 프로브를, 그 신호 프로브의 결합 태그를 통해 그 결합 태그에 대한 결합 파트너가 코팅되어 있는 분석용 지지체에 처리하여 결합 태그와 결합 파트너의 특이적 결합을 통해 분석용 지지체에 고정시키는 단계와, (b-2-ii) 그 지지체에 고정된 신호 프로브의 신호를 검출하는 단계를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 하는
    검출방법.
  38. 제37항에 있어서,
    상기 결합 태그는 그 결합 태그는 비오틴 또는 비오틴 유사체인 것을 특징으로 하는
    검출방법.
  39. 제37항에 있어서,
    상기 결합 파트너는 스트렙타비딘 또는 스트렙타비딘 유사체인 것을 특징으로 하는
    검출방법.
  40. 제37항에 있어서,
    고정영역이 기지의 서열로 상기 신호발생영역에 인접하여 추가로 연결되어 있고,
    상기 (b-2-ii) 신호 프로브의 신호 검출 단계는
    상기 고정영역에 상보적인 단일가닥 핵산 서열을 가지고 그 서열에 상기 결합 파트너와 특이적으로 결합할 수 있는 결합 태그를 가진 고정핵산분자를 상기 지지체에 처리하는 단계, 및
    그 처리 단계 후 신호 프로브의 신호를 검출하는 단계를 포함하여 수행되는 것을 특징으로 하는
    검출방법.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 고정핵산분자의 결합 태크는 비오틴 또는 비오틴 유사체인 것을 특징으로 하는
    검출방법.
PCT/KR2017/006987 2016-06-30 2017-06-30 이중가닥 핵산 신호 프로브 및 이를 이용한 표적분자의 검출방법 WO2018004309A1 (ko)

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