CN110312808A - 双链核酸信号探针以及利用上述双链核酸信号探针的靶分子检测方法 - Google Patents
双链核酸信号探针以及利用上述双链核酸信号探针的靶分子检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种通过使构成双链核酸的单链核酸互补性地交联结合(或共价结合)而防止其受到如温度、pH、盐、离子强度(ionic strength)等的影响的稳定的双链核酸信号探针。此外，本发明公开一种能够在对靶分子进行检测时，首先利用上述稳定的双链核酸信号探针形成上述信号探针与靶分子的复合体，接下来再通过加热等方式从上述复合体分离出上述信号探针并对信号探针进行检测，从而检测出靶分子的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种双链核酸信号探针以及利用上述双链核酸信号探针的靶分子检测方法(DOUBLE-STRANDED NUCLEIC ACID SIGNAL PROBE AND METHOD FOR DETECTINGTARGET MOLECULE USING SAME)。
背景技术
在细胞的DNA中编码的遗传信息能够通过DNA复制的方式传递给子孙后代。此外，遗传信息能够通过从DNA到RNA以及从RNA到蛋白质的路径表达。所有细胞都是由遗传信息的传递或表达相关的生物分子构成，而这些细胞的存在状态会对生物体的机能造成非常重要的影响。
靶分子(或生物标志物)是一种临床可检测且为了特定用途选择的生物分子。生物分子可能会伴随着疾病的发生或进展而在细胞的内部呈现出增减或发生分泌，尤其是能够通过血流轻易地从特定组织扩散到末梢组织。此外，在细胞被破坏时也会呈现出生物分子的变化。
作为代表性的生物分子，包括核酸以及氨基酸。核酸能够构成用于携带遗传信息的DNA以及起到信息载体作用的RNA，如染色体异常、DNA甲基化以及遗传基因变异(GeneVariation)等会对遗传信息的表达过程造成影响。作为双重遗传基因变异的类型，包括如单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)以及结构变异(StructuralVariation)等。SNP是指DNA碱基序列中的单个碱基序列(A、T、G、C)呈现出差异的遗传性变化或变异。结构变异是指如缺失、逆位、增添以及重复等DNA结构变异。目前已经得知遗传基因变异会决定如表型(phenotype)的变化、对疾病的敏感性以及对治疗药剂的反应差异等个体之间的差异，尤其是与疾病的发生以及进展过程相关的变异被称之为疾病相关遗传变异(Disease-associated Genetic Variants)。
遗传基因是用于构成性状的因子，是遗传信息的基本单位。各个细胞中包含5万至10个左右的遗传基因，但是细胞会选择性地使用遗传基因。其中，大多数是用于细胞自身的生命维持活动或日常活动的遗传基因。内源性标准表达遗传基因是用于对特定的遗传基因或多数的遗传基因的表达量进行比较的遗传基因，以信使RNA(messenger RNA；以下称之为mRNA)的形态为基础。生物体内样本的定量分析主要用于如特定遗传基因的功能检索、呈现出特定功能的遗传基因检索、在特定条件下的遗传基因表达状态确认以及其他多种分子生物学目的，目前已经开发出了利用内源性标准表达遗传基因的多种遗传基因表达测定方法。
最具代表性的遗传基因表达测定方法，包括高速并列分析技术即DNA微阵列法。因为DNA微阵列法只是单纯地通过杂交方式对靶序列进行检测，因此会造成交叉反应所诱发的真阳性问题，从而需要对杂交信号的可靠性进行改善。此外，因为现有的微阵列法是通过杂交方式对样本内的核酸进行检测，因此需要在杂交之后执行细致的洗涤过程，而且还必须在杂交之前执行将靶序列转换成单链的过程。此外，因为最近发表的片上PCR(on-chipPCR)是通过杂交或探针延伸(probe extension)的方式进行检测，是与现有的微阵列法相同的非均相测定系统(heterogenous assay system)，因此无法实现实时检测且难以实现准确定量。
生物分子除核酸之外还包括如氨基酸、肽、蛋白质、碳水化合物、脂质、多糖类、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、病原菌、毒性物质、基质、代谢产物、过渡态类似物(transition state analog)、辅因子(cofactor)、抑制剂、药剂、染料、营养成分、成长因子、细胞以及组织等，其范围在理论上并不受到任何限制。几乎包括所有的化学或生物效应物(effector)并由多种大小的分子构成。目前，需要开发出能够有效地对如上所述的生物分子进行实时检测以及准确定量的方法。
虽然各种生物分子分析方法在检测灵敏度的提升以及多重分析能力的提升方面均取得了长足的发展，但是仍然面临着如节省分析成分、缩短分析时间、提升灵敏度以及提高重现性等诸多技术课题。
此外，在美国注册专利第8,519,115号(相关论文为Nat Biotechnol.2008，26:317-325)中使用了能够对靶生物分子进行分子计数的荧光条形码探针，上述荧光条形码探针包括：信号发生区域，通过将7个单体RNA片段互补地连续连接到与其互补的DNA主链而构成；以及，靶分子结合区域，与靶核酸特异性结合的互补单链核酸。上述荧光条形码探针能够通过与靶核酸进行结合而形成复合体并在靶分子上生成特异性的检测信号，从而可以对上述复合体(即靶分子)进行分子计数。上述荧光条形码探针是一种DNA-RNA双链核酸，通过单链核酸的碱基对之间的氢键结合而构成，其稳定性会受到如温度、pH、盐、离子强度(ionic strength)等的影响。即，当荧光条形码探针的双链核酸因为受到温度等的影响而发生分离时，将无法提供与靶分子相关的准确信息。因此，在上述美国注册专利第8,519,115号中所公开的靶分子的分析方法，具有必须考虑如温度、pH、盐、离子强度(ionicstrength)等的内在限制。
本发明的目的在于克服如上述所的限制。本发明公开一种能够通过由单链核酸互补性地构成双链核酸并形成互补共价结合而防止其受到如温度、pH、盐、离子强度(ionicstrength)等的影响的双链核酸探针。
发明内容
本发明的目的在于公开一种能够通过由单链核酸互补性地构成双链核酸并形成交联结合(或共价结合)而防止其受到如温度、pH、盐、离子强度(ionic strength)等的影响的稳定的双链核酸信号探针。
本发明的另一目的在于提供一种利用上述双链核酸信号探针的靶分子检测方法。
本发明的其他目的或具体的目的将在后续的内容中进行公开。
在一方面，本发明提供一种双链核酸信号探针。
如上所述，适用本发明的双链核酸信号探针的特征在于，构成上述双链核酸的单链核酸互补性地交联结合(或共价结合)。
具体来讲，适用本发明的双链核酸信号探针的特征在于，包括：(i)靶分子特异性结合区域(其中，为了能够在部分情况下将“区域”与其他部分的相同或类似术语进行明确区分可能会被标记为“部分(moiety)”)；以及，(ii)信号发生区域，结合到上述靶分子特异性结合区域，用于生成上述信号探针的固有(或特异性)信号；其中，上述信号发生区域为互补交联结合(即共价结合)的双链核酸，上述双链核酸中包括利用相同的信号发生物质标记或利用不同的信号发生物质标记的2个以上的区域(其中，为了能够在部分情况下将“区域”与其他部分的相同或类似术语进行明确区分可能会被标记为“片段(segment)”)。
在适用本发明的信号探针中，上述靶分子特异性结合区域的代表性实例能够是单链核酸、抗体或适配体。当上述特异性结合区域由单链核酸构成时上述靶分子能够是mRNA等核酸，当由抗体构成时上述靶分子能够是具有上述抗体可特异性识别的表位的抗原，当由适配体构成时能够是上述适配体可特异性识别并结合的抗原等蛋白质。
作为靶分子特异性结合区域，单链核酸除单链DNA或单链RNA之外还能够是具有与上述靶分子即mRNA等核酸的特异性结合能力的核酸酶或热稳定的PNA(Peptide NucleicAcid，肽核酸)、LNA(Locked Nucleic Acid,锁核酸)、HNA(Hexitol Nucleic Acids，己糖醇核酸)、ANA(阿卓糖醇核酸，Altritol Nucleic Acids)或MNA(甘露糖醇核酸，MannitolNucleic Acids)等核酸类似物。而且，只要具有与上述靶分子即mRNA等核酸的特异性结合能力，则不仅能够使用天然核苷酸(natural nucleotide)，还能够使用修饰核苷酸(modified nucleotide)。如上所述的修饰核苷酸，能够是对上述糖、上述磷酸盐和/或上述碱基进行修饰的产物。如上所述的对糖、磷酸盐和/或碱基进行修饰而得的修饰核苷酸及其制造方法在本行业中属于公知的事项。例如，对糖进行修饰而得的修饰核苷酸，能够是上述糖的氢氧基(OH group)被如卤素基、脂肪族基、乙醚基或胺基等修饰的产物，以及糖即核糖或二氧核糖本身被可对其进行替代的糖衍生物如α-异头糖(a-anomeric sugars)、阿拉伯糖(arabinose)、木糖(xyloses)或来苏糖(lyxoses)等异构糖(epimeric sugars)、吡喃糖(pyranose sugars)或呋喃糖(furanose sugars)等置换的产物。此外，对磷酸盐进行修饰而得的修饰核苷酸，能够是磷酸盐被如P(O)S(thioate)、P(S)S(dithioate)、P(O)NR2(amidate)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(formacetal)修饰的产物等。其中，上述R或W是H或被置换或未被置换的烷基等，在对磷酸盐进行修饰时的连接基为-O-、-N-、-S-或-C-，通过如上所述的连接基能够使相邻的核苷酸相互结合。
关于核酸类似物或修饰核苷酸或包含上述修饰核苷酸的单链核酸等，在本行业中已经有如文献[Sproat，etal，Nucl.Acid Res.19:733-738(1991)]、文献[Cotten，et al，Nucl.Acid Res.19:2629-2635(1991)]以及文献[Hobbs，et al，Biochemistry 12:5138-5145(1973)]等诸多文献被公布，相关的详细信息请参阅上述文献。包括上述文献在内，在本说明书中所引用的文献均应视为构成本说明书的一部分。
作为靶分子特异性结合区域，单链核酸的长度只要能够维持上述单链核酸的靶分子特异性结合就不受到特殊限制。通常是由5至70个核苷酸构成，但是因为当探针的长度过长或过短时可能会发生非特异性结合，因此由15至20个碱基构成为宜。
作为靶分子特异性结合区域，抗体除单克隆抗体或多克隆抗体之外还能够包括多重特异性抗体(即能够对两个以上的抗原或两个以上的表位进行识别的抗体，包括如双特异性抗体等)或具有靶分子特异性结合能力的抗体片段、化学修饰抗体、人源化抗体或重组抗体等。抗体片段、化学修饰抗体的多种形态在本行业中属于公知的事项，能够包括如Fab、F(ab')2、scFv(利用适当的连接肽对重链或轻链的Fv进行连接的抗体)、Fv、Fab/c(具有1个Fab以及完整Fc的抗体)等或利用如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等蛋白质裂解酶对抗体进行处理而得的抗体片段等。
作为靶分子特异性结合区域，适配体能够是单链DNA适配体或单链RNA适配体。适配体与抗体相同，是指能够与靶蛋白等靶分子特异性结合的核酸配体，只要能够与靶分子特异性结合，适配体也能够是双链DNA或RNA适配体。如上所述的能够与靶分子特异性结合的适配体的制造以及筛选方法等在本行业中属于公知的事项，尤其是能够利用SELEX技术。上述SELEX技术是一种名为“Systematic Evolution of Ligands by Exponentialenrichment，指数富集的配体系统进化技术”的技术的缩写，关于相关的技术可以参考文献[Science 249(4968):505-510，1990]、美国注册专利第5,475,096号、美国专利注册第5,270,163号、国际专利公开第WO 91/19813号等中的内容，而关于适配体筛选的具体方法或适当的试剂、材料等的使用可以参考文献[Methods Enzymol 267:275-301，1996]、文献[Methods Enzymol 318:193-214，2000]等中的内容。适配体也能够是对上述糖、上述磷酸盐和/或上述碱基进行修饰的产物。
靶分子特异性结合区域的代表性实例为单链核酸、抗体或适配体，但是当将与生物样本中的侵入抗原对应的抗体作为靶分子并对其进行检测时也能够是抗原。其中，侵入抗原源于侵入到人体等的细菌或病毒等，通过对与上述侵入抗原对应的抗体进行检测，能够有效地对上述细菌或病毒的感染与否进行判定。
除此之外，只要具有靶分子特异性结合能力，如抗体的Fc片段、肽、拟肽物(peptidomimetic)、接合物(gapmer)等也能够不受特殊限制地作为靶分子特异性结合区域进行使用。
适用本发明的信号探针可检测的靶分子是能够与上述靶分子特异性结合的上述信号探针的靶分子特异性结合区域(如上所述的单链核酸、抗体、适配体或抗原等)可特异性识别并结合的任意分子。上述分子，较佳地是人体或动物等的生物分子，更较佳地是生物分子中的人体分子。更较佳地，能够是可用于疾病诊断的生物标志物。最具代表性的是源于如mRNA等核酸、细菌或病毒等的抗原或与上述抗原对应的抗体等。进而，靶分子能够是适用本发明的信号探针的靶分子特异性结合区域可特异性结合的细菌或病毒的表面上的蛋白质，借此能够对细菌或病毒进行检测。
在适用本发明的信号探针中的信号发生区域为双链核酸，借助于上述双链之间的交联结合，能够在高温状态下维持稳定的双重结合状态，从而不会受到如pH、盐或离子强度(ionic strength)等的影响。借此，能够在靶分子的检测过程中防止因为温度等的变化造成双链的分离并因此导致用于生成检测信号的单链核酸的消失，从而克服靶分子的检测准确性下降的问题，如后所述，在利用适用本发明的信号探针对靶分子进行检测时，首先形成适用本发明的信号探针与靶分子的复合体并对其进行分离，接下来再对上述复合体进行加热并对从上述复合体分离出来的信号探针进行检测，从而实现对靶分子的检测。
在本发明中，信号发生区域的双链之间的交联结合能够利用本行业中公知的方法诱导。具体来讲，能够通过在利用如补骨脂素(soralen)、8-甲氧基补骨脂素(8-methoxypsoralen)等补骨脂素衍生物、丝裂霉素-C(mitomycin C)、吡咯并苯二氮卓(pyrrolobenzodiazepine)、左旋溶肉瘤素(melphalan)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、溴化乙锭(ethidium bromide)、原黄素(proflavine)、道诺霉素(daunomycin)、阿霉素(doxorubicin)、酞胺哌啶酮(thalidomide)等已知的核酸双链嵌入剂(intercalator)对杂交的双链进行处理之后再照射适当波长的UV而实现。在如下所述的适用本发明的实施例中，通过将8-甲氧基补骨脂素作为嵌入剂进行使用并照射365nm波长的UV而诱导双链之间的交联结合，并确认在95℃的温度下能够稳定地维持双链状态。
在本发明中，信号发生区域的信号发生物质(detectable label，可检测标签)是能够生成可检测信号的本行业中公知的任意物质，如上所述的物质将与构成信号发生区域的核酸片段的单链或双链(或上述核酸片段的构成单位即核苷酸)进行共价或非共价结合。
作为上述信号发生物质能够使用如荧光物质、化学发光物质或放射性同位素等公知的多种物质，作为荧光物质能够使用如花青素苷荧光物质(Cy2、Cy3、Cy5)、Alexa Fluor荧光物质系列(Alexa Fluor 350、405、430、488、514、594、610、647等；ThermoFisherSCIENTIFIC公司，美国)、异硫氰酸荧光素、四甲基若丹明异硫氰酸酯、置换若丹明异硫氰酸酯或二氯三嗪异硫氰酸酯等，作为化学发光物质能够使用如氨基苯二酰肼(luminol)、异氨基苯二酰肼(isoluminol)、萤光素(luciferin)、光泽精(lucigenin)或CSPD(3-(2'-Spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3"-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetane(AMPPD)、Disodium 3-(4-methoxyspiro{1,2-dioxetane-3,2'-(5'-chloro)tricyclo[3.3.1.13,7]decan}-4-yl)phenyl phosphate)等，作为放射性同位素能够使用如氚、碘(131I、125I、123I、121I)、磷(32P)、硫(35S)或金属类(如68Ga、67Ga、68Ge、54Mn、99Mo、99Tc、133Xe等)等。包括荧光物质在内的信号发生物质的其他实例，能够参考如国际公开专利第WO 92/15673号、国际公开专利第WO 95/07463号、国际公开专利第WO 98/14605号、国际公开专利第WO 98/26277号、美国专利第5,292,658号、美国专利第5,418,155号、美国专利第5,683,888号、美国专利第5,741,668号、美国专利第5,777,079号以及美国专利第5,876,995号等。
较佳地，能够使用不同颜色的花青素苷荧光物质或Alexa Fluor荧光物质。通常，在利用花青素苷荧光物质或Alexa Fluor荧光物质对核酸进行标记的过程中，能够在对核酸进行扩增制备时利用4个氨烯丙基核苷酸(氨烯丙基nucleotide，在碱基中包含芳基胺的核苷酸)中的特定的一个(4个核苷酸中的一个，例如氨烯丙基-dCTP或氨烯丙基-UTP)或多个氨烯丙基核苷酸对核酸进行扩增制备，从而在将如上所述的一个以上的氨烯丙基核苷酸以一定的间隔(例如在使用氨烯丙基-dCTP时为dCTP位置)整合到核酸链上之后再将上述特定的一个以上的氨烯丙基核苷酸的胺基与荧光物质结合(共价结合)而完成标记，这是本行业中公知的方法。在适用本发明的下述实施例中，利用氨烯丙基-dCTP对核酸进行了扩增制备并在氨烯丙基-dCTP中利用Alexa Fluor 488(blue，蓝色)以及Cy3(绿色)等4种类型的荧光物质进行了结合和标记。
在本发明中，信号发生区域能够在包含上述信号发生区域的信号探针中生成固有的信号。因为信号探针具有上述靶分子特异性结合区域，因此信号发生区域所生成的上述固有信号将成为上述靶分子的固有信号。所以，当因为信号发生区域仅由一个核酸片段的一个区域构成而只能利用一个信号发生物质进行标记时，所生成的固有信号将根据可使用的信号发生物质的类型数量受到极大的限制，因此可检测和识别的靶分子的类型数量也将受到限制。所以，信号发生区域由至少2个以上的区域构成为宜。当信号发生区域由2个区域构成时，通过利用可生成3种不同类型信号的荧光物质(如Alexa Fluor 488(blule，蓝色)、Cy3(绿色)以及Cy5(红色))进行标记，能够根据各个区域所生成的信号的线性次序(linearorder)生成9(＝32)种固有信号，因此可检测和识别的靶分子的类型数量也将增加到9种。在适用本发明的下述实施例中，通过由6个区域构成信号发生区域并利用4种不同的荧光物质进行标记，制备出可生成共计4,096(＝46)种不同信号的信号发生区域(即包含上述各个信号发生区域的4,096种信号探针)进行使用。作为参考，在美国注册专利第8,519,115号(相关论文为Nat Biotechnol.2008，26:317-325)的实施例中，公开了一种通过由共计7个区域构成信号发生区域并利用4种不同的荧光物质进行标记而能够使用共计16,384(＝46)种信号探针的实例。关于信号发生区域的各个区域所生成的信号的线性次序(linearorder)，能够利用在适用本发明的下述实施例中所使用的nCounter数字分析器(nCounterdigital analyzer，Nanostring technology公司，美国)或在美国注册专利第8,519,115号的实施例或与其相关的论文即文献(Nat Biotechnol.2008，26:317-325)中所使用的NiconEclipse TE2000E(配备有Perfect Focus，1.4NA Plan Apo VC 60X oil-immersion lens(Nikontk公司，日本)、anX-cite 120metal halide light source(Exfo公司，美国)、automated H117stage(Prior Scientific公司，美国)以及Smart Shutter(SutterInstrument公司，美国)的装置)获取各个信号的图像，然后对上述各个图像进行整合并以线性方式对信号进行排列和检测，从而实现定量化。上述美国注册专利第8,519,115号或与其相关的论文即文献(NatBiotechnol.2008，26:317-325)也应视为构成本说明书的一部分。
通过由2个区域构成上述信号发生区域并利用可生成3种不同类型信号的荧光物质(如Alexa Fluor 488(blule，蓝色)、Cy3(绿色)以及Cy5(红色))进行标记，将得到可根据信号的线性次序(linear order)生成9(＝32)种固有信号的共计9种信号发生区域(或包括各个信号发生区域的9种信号探针)，其中的3种信号发生区域将被相同的信号发生物质标记而剩余的6种将被不同的信号发生物质以不同的顺序标记。同理，如适用本发明的下述实施例，通过由6个区域构成上述信号发生区域并利用可生成4种不同类型信号的荧光物质进行标记，将得到可根据信号的线性次序(linear order)生成16,384(＝46)种固有信号的共计16,384种信号发生区域(或包括各个信号发生区域的16,384种信号探针)，其中4种的6个区域将被相同的信号发生物质标记。
因此本发明可以理解为当信号发生区域由2个以上的区域构成时，上述2个以上的区域被相同的信号发生物质标记，或其中一个以上的区域被可生成与其他区域不同的信号的信号发生物质标记。
构成信号发生区域的各个区域的长度(相互连接的核苷酸的数量)，能够在考虑信号发生物质的标记程度(即所生成信号的强度)的情况下决定。上述区域的长度通常能够在0.1kb(kilo base，千碱基)至1.5kb的范围之内。在适用本发明的下述实施例中，通过使用3种天然核苷酸(即dATP、dTTP以及dGTP)和100％的氨烯丙基-dCTP(所有dCTP都替代使用氨烯丙基-dCTP)对核酸进行扩增制备而得到1/4的核苷酸整合到氨烯丙基-dCTP的903bp长度的核酸片段并利用信号发生物质进行标记。当使用2种氨烯丙基-NTP对核酸进行扩增制备之后再进行标记时，上述区域的长度能够在0.2kb至0.5kb的范围之内。此外，虽然在适用本发明的实施例中使用了100％的氨烯丙基-dCTP，但是即使使用30％至70％的氨烯丙基-dCTP，只要长度能够达到约0.9bp就可以标记成可生成足够信号的程度。
信号发生区域为双链核酸，能够是完整双链核酸或部分双链核酸。如适用本发明的下述实施例，在制备出用于构成信号发生区域的双链核酸片段并分别对其进行标记之后再利用如T4连接酶(ligase)等连接酶对上述被标记的双链核酸片段进行连接时，构成上述双链核酸的2个单链核酸将形成长度相同的完整的双链核酸。与此相反，如美国注册专利第8,519,115号(相关论文为Nat Biotechnol.2008，26:317-325)中的实施例，在首先利用PCR进行扩增之后再进行分离而制备出单链核酸，接下来将上述单链核酸作为模板并利用T7RNA聚合酶、T3聚合酶或SP6聚合酶等制备出长度小于上述模板的RNA转录产物片段，接下来在对上述RNA转录产物进行标记之后再将其互补杂交到上述模板中而构成信号发生区域时，将形成部分双链核酸。
适用本发明的信号发生区域为双链核酸，如在上述内容中对靶分子特异性结合区域进行的说明，构成上述双链的核酸能够是如PNA等核酸类似物，也能够包括修饰核苷酸。
在适用本发明的核酸探针中，在靶分子特异性结合区域以及信号发生区域均为核酸的情况下(即，在靶分子特异性结合区域是用于对靶核酸进行检测的单链核酸的情况下)能够利用如T4连接酶等本行业公知的连接酶对上述两者进行连接，而在靶分子特异性结合区域为抗体或适配体的情况下，能够在导入如氨基、羟基、羧基、羰基或硫醇基等适当的功能基(functional group，反应基)之后再诱导如酰胺结合、酯结合、硫醚酯结合或醚结合等而实现与信号发生区域的共价连接。
在适用本发明的信号探针中，在靶分子特异性结合区域以及信号发生区域之间能够包括如图1所示的间隔区域(spacer)和/或固定区域。图1中对适用本发明的信号探针以及在利用上述信号探针的适用本发明的靶分子检测方法中所使用的主要构成因子进行了图示。
间隔区域用于对靶分子特异性结合区域以及信号发生区域进行隔离，能够在靶分子特异性结合区域与靶分子结合时防止上述结合体对信号发生部的信号检测造成干扰，从而更加轻易地完成信号发生部的信号检测。间隔区域能够是单链核酸、双链核酸、RNA或DNA等，也能够包括如PNA等核酸类似物或修饰核苷酸。只要能够轻易地完成信号发生部的信号检测，其长度并不受到特殊的限制。通常，其长度能够是20～50bp。
固定区域是用于通过与后续说明的1个以上的固定核酸分子(或固定分子)进行互补结合而将适用本发明的信号探针追加固定展开(stretching)到后续说明的分析用载体的区域，是由已知的序列构成。因此，固定区域由与固定核酸分子互补序列的单链核酸构成，而且为了能够与2个以上的固定核酸分子结合，可由相同基质的序列重复2次以上构成。固定区域能够是可与固定核酸分子互补结合的RNA、DNA等，能够包括如PNA等核酸类似物或修饰核苷酸，其长度能够是与固定核酸分子具有足够结合力的任意长度。通常，能够由20～50bp长度的相同基质的序列重复2～20次构成。
当适用本发明的信号探针中同时包含上述间隔区域以及固定区域时，将通过共价结合的方式与相邻区域连接，其顺序能够是任意顺序，但是使固定区域与信号发生区域相邻，即使其存在于信号发生区域的5'一侧或3'一侧为宜。这是因为当将适用本发明的信号探针追加固定到分析用载体中时，只有使固定区域与信号发生区域相邻才能够将信号发生区域以线性形态(linear form或stretched form)固定到分析用载体上，从而更加轻易地完成信号发生区域的信号检测。
在适用本发明的信号探针中，上述靶分子特异性结合区域的相反一侧(相反一侧是指当靶分子特异性结合区域存在于5'一侧时的3'一侧)能够与结合标记物结合。
结合标记物用于通过与结合配偶体的特异性结合而将适用本发明的信号探针结合固定到涂布有可与其结合的上述结合配偶体的分析用支撑体上。可使用的结合标记物的代表性物质为生物素(biotin)，而与此对应的代表性的结合配偶体为链霉亲和素(streptavidin)。链霉亲和素是从链霉菌抗生物素蛋白(Streptomyces avidinii)分离出的亲和素类的抗生物质蛋白质，属于4分体结构，能够与最多4个生物素分子结合。结合标记物除生物素之外还能够使用如脱硫生物素(desthiobiotin)或亚氨基生物素(iminobiotin)等生物素类似物，而涂布到分析用支撑体上的结合配偶体除链霉亲和素之外还能够使用可与生物素等进行特异性结合的如亲和素、Traptavidin或中性亲和素(NeutrAvidin，Thermofisher SCIENTIFIC公司，美国)等链霉亲和素类似物。
关于将结合标记物结合到适用本发明的信号探针中的方法，在本行业中已经公布了多种方法且已经有大量的文献(文献[Nucleic Acids Res.1987Jun 11；15(11)：4513-4534]、文献[RNA.2014Mar；20(3)：421-427]、文献[Methods Mol Biol.2009；498：185-196]等)被公开，还有大量的试剂盒(Thermofisher SCIENTIFIC公司，APEXBIO公司)等在市面上销售。
在另一方面，本发明涉及一种利用上述信号探针对样本中的靶分子进行检测的方法。
具体来讲，适用本发明的检测方法，包括：(a)通过利用上述信号探针对分析目标样本进行处理而形成样本中的靶分子与信号探针的复合体的步骤；以及，(b)对上述复合体的信号探针进行检测的步骤。
在适用本发明的方法中，分析目标样本能够是因为包含或可能包含需要检测的靶分子而有必要进行检测的任意的混合物或溶液。样本不仅能够是从人体或动物获取的生物样本，还能够是通过对上述生物样本进行加工而提升靶分子浓度的加工样本，进而还能够是包含或可能包含靶分子的如水、食品、产业废水、环境污染因子、毒性因子等有必要进行检测的样本。如上所述的样本能够包括适当的稀释剂或缓冲溶液，当需要对细菌或病毒的存在与否进行检测时，还能够是培养基或包含培养基成分的细菌培养物或病毒培养物。
此外，在适用本发明的方法中，分析目标样本较佳地能够是从人体或动物获取的生物样本或其加工样本。生物样本能够是如血液、尿液、唾液、精液、羊水、淋巴液、痰液或组织等因为包含或可能包含需要检测的靶分子而有必要进行检测的从人体或动物获取的样本。加工样本能够是利用蛋白质提取试剂盒对如血浆、血清或生物样本等中的蛋白质浓度进行提升的样本、利用同样的原理对核酸(DNA或RNA)浓度进行提升的样本、组织提取物、从组织获取的细胞、细胞溶解物或细胞培养物等。
此外，在适用本发明的方法中，形成上述样本中的靶分子与信号探针的复合体的步骤，在样本中包含多种靶分子的情况下，能够利用分别对上述各个靶分子具有特异性的多种信号探针形成多重复合体并对其进行检测。如上所述，当构成信号探针的信号发生区域的区域为如适用本发明之下述实施例所述的6个且利用4种不同的信号发生物质进行标记时，能够对16,384(＝46)种不同的靶分子进行检测。
在本说明书中，“检测”是指对靶分子的存在与否的定性分析，进而还包括对靶分子的存在量以及浓度的定量分析。
在适用本发明的方法中，当需要检测的靶分子为蛋白质时，在上述步骤(a)之前，还能够包括：利用与蛋白质呈现出高度的结合亲和性的硝化纤维膜(nitrocellulosemembrane)对样本进行处理，从而将包含靶分子的样本中的蛋白质吸附到硝化纤维膜中的步骤；以及，利用适当的洗涤溶液对吸附在硝化纤维膜中的除蛋白质之外的脂质、核酸以及代谢产物等其他分子进行去除的步骤。洗涤溶液能够购买使用在本行业中广泛使用的产品或自行调配使用，洗涤溶液中包含表面活性剂以及盐。表面活性剂能够使用如SDS、Tween20、Tween 40、Tween 60、Tween 80、Triton X-405、Triton X-100、Tetronic 908、Cholesterol PEG 900、Polyoxyethylene Ether W-1、Span 20、Span 40、Span 85或上述之混合物，盐能够使用如锂、纳、钾以及铵的醋酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、硝酸盐、硫酸盐、氯化物盐或上述之混合物(尤其是SSC、SSPE等)。尤其是，洗涤溶液能够使用如TBST溶液(10mM Tris-Cl，pH 8.0，150mM NaCl，0.05％Tween 20)、PBST溶液(PBS，pH 7.0，0.05％Tween 20)或包含Tween 20等的SSPE溶液(0.2M phosphate buffer，2.98M NaCl，20mMEDTA，pH 7.4)等。
在洗涤步骤之后，还能够包括：利用包含如牛血清白蛋白等适当封阻剂(blockingagent)的封阻溶液进行处理，从而对硝化纤维膜的蛋白质非吸附表面进行封阻的步骤。如上所述的封阻步骤，是为了防止在接下来的步骤中为了形成靶分子与信号探针的复合体而使用靶分子特异性结合区域为抗体的信号探针时因为信号探针的抗体吸附而导致的检测准确性下降的问题。在封阻步骤之后，对信号探针进行处理并执行上述(a)形成信号探针与靶分子的复合体的步骤。其中，当使用靶分子特异性结合区域为适配体等而不是抗体的信号探针时，则不一定需要执行上述封阻步骤。
为了在利用信号探针进行处理之后去除非特异性结合的信号探针，能够利用如上所述的洗涤溶液等执行洗涤步骤。
在利用硝化纤维膜对靶分子即蛋白质进行检测时，在硝化纤维膜上形成上述复合体之后，上述(b)信号探针检测步骤，能够包括：(b-1)从结合到硝化纤维膜上的复合体分离出信号探针的步骤；以及，(b-2)对上述所分离出的信号探针进行检测的步骤。从复合体分离出信号探针的步骤，能够通过对结合有复合体的硝化纤维膜进行加热(将适当的缓冲溶液或反应溶液作为媒介进行加热)或在加热的同时利用表面活性剂进行处理而实现。
如上所述，因为适用本发明的信号探针是由交联结合的双链核酸构成，因此即使是在受到加热时也不会导致信号发生区域的消失并维持稳定的状态，从而不会对靶分子检测的准确性造成影响。
上述(b-1)对所分离出的信号探针进行检测的步骤，能够包括：(b-1-i)利用上述信号探针的结合标记物将上述所分离出的信号探针处理到涂布有与上述结合标记物对应的结合配偶体的分析用支撑体上，从而借助于结合标记物与结合配偶体之间的特异性结合而将上述信号探针固定到分析用支撑体的步骤；以及，(b-1-ii)对固定到上述支撑体中的信号探针的信号进行检测的步骤。
其中，信号探针的信号是标记到信号探针中的信号发生物质所生成的信号，上述信号探针的信号检测步骤能够根据所使用的信号发生物质利用可对上述信号进行检测的适当装置实现。如上所述的装置能够根据信号的特性选用如分光光度计(spectrophotometer)、荧光计(fluorometer)、吸收分光计(absorption spectrometer)、发光计(luminometer)、化学发光计(chemiluminometer)或光量计(actinometer)等，在作为信号发生物质使用Alexa Fluor荧光物质系列或花青素苷荧光物质对上述信号进行检测时，使用在适用本发明的下述实施例中所使用的nCounter数字分析器(nCounter digitalanalyzer，Nanostring technology公司，美国)或在美国注册专利第8,519,115号的实施例或与其相关的论文即文献(Nat Biotechnol.2008，26:317-325)中所使用的Nicon EclipseTE2000E(配备有Perfect Focus，1.4NA Plan Apo VC 60X oil-immersion lens(Nikontk公司，日本)、anX-cite 120metal halide light source(Exfo公司，美国)、automatedH117stage(Prior Scientific公司，英国)或Smart Shutter(Sutter Instrument公司，美国)的装置)为宜。nCounter数字分析器等能够对各个信号发生区域的特异性信号的线性次序(linear order of signal)进行检测，并从上述所检测到的信号对靶分子进行计数以及定量化。
在利用nCounter数字分析器等对信号的线性次序进行检测时，为了能够更加轻易地实现上述信号检测，将信号探针的信号发生区域以线性形态(linear form或stretchedform)固定到分析用支撑体上为宜，这能够通过利用具有与信号探针的固定区域互补的单链核酸序列并具有可与上述互补的单链核酸序列连接并结合到涂布于上述分析用支撑体上的结合配偶体的结合标记物的固定分子(或固定核酸分子)，对固定有信号探针的分析用支撑体进行处理而实现。固定分子的结合标记物与在上述内容中对信号探针进行的说明内容相同，也能够使用生物素或生物素类似物。
此外，在适用本发明的方法中使用的分析用支撑体，只要能够将与信号探针的结合标记物对应的结合配偶体(如链霉亲和素等)通过共价结合或非共价结合的方式涂布到表面，其形态或形状以及材料并不受到特殊的限制。
例如，能够是如薄膜形态、珠状形态、微粒形态、基板形态(玻璃载片等)、柱状形态、孔状形态或孔板形态等，其材料能够是如塑料、树脂、多糖类、二氧化硅、功能基玻璃(functionalized glass)、改性硅(modified silicon)、碳、金属、无机玻璃(inorganicglasses)、薄膜、尼龙或天然树脂等。聚合物支撑体的材料能够是如聚苯乙烯(polystyrene)、聚对苯二甲酸二乙醇酯(polyethylene glycol tetraphthalate)、聚乙酸乙烯酯(poly vinyl acetate)、聚氯乙烯(poly vinyl chloride)、聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone)、聚丙烯腈(polyacrylonitrile)、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate)、聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene)、丁基橡胶(butylrubber)、丁苯橡胶(styrenebutadiene rubber)、天然橡胶、聚乙烯(polyethylene)、聚丙烯(polypropylene)、(聚)四氟乙烯((poly)tetrafluoroethylene)、(聚)偏氟乙烯((poly)vinylidenefluoride)、聚碳酸酯(polycarbonate)或聚甲基戊烯(polymethylpentene)等。
图1中对在适用本发明的方法中所使用的包括信号探针以及固定分子在内的主要构成因子进行了图示，而图2以及图3中分别对利用如上所述的硝化纤维膜对靶分子即蛋白质进行检测的整体流程中信号探针的靶分子特异性结合区域为抗体的情况以及适配体的情况进行了图示。
此外，如图4以及图5所示，适用本发明的靶分子的检测方法还能够在如上所述的信号探针之外追加使用捕获探针。
如上所述的适用本发明的利用捕获探针的方法(接下来为了说明的便利将称之为“适用本发明的捕获检测方法”)，包括：(a)通过利用与靶分子特异性结合的信号探针以及捕获探针对分析目标样本进行处理而形成上述靶分子与上述信号探针以及上述捕获探针的复合体，同时获得包含上述复合体以及没有形成复合体的信号探针和捕获探针等的混合物的步骤；以及，(b)对上述混合物中的复合体的信号探针进行检测的步骤。
在适用本发明的捕获检测方法中，上述捕获探针包括特异性地结合到靶分子中与上述信号探针的特异性结合部位(即表位)不同的部位的区域，并采用在上述区域中连接有磁性粒子(或磁性珠)的构成，在图1中对其模式图进行了图示。
磁性粒子如美国专利第5,665,554号、美国专利第6,0279.45号、美国专利第7,078,224号、韩国公开专利第2006-0061494号以及韩国注册专利第0541282号等中公开的内容，是一种在本行业中广泛地适用于蛋白质、核酸、细胞或细菌等的分离的材料，具有微米或纳米级别的大小(几微米、几十至几百纳米的大小)。在生物物质的分离中使用的代表性的磁性粒子为氧化铁磁性粒子，上述氧化铁磁性粒子能够使用磁铁矿(magnetite；Fe3O4)、磁赤铁矿(maghemite；Fe203)或赤铁矿(hematite；Fe203)等。为了将磁性粒子用于蛋白质以及核酸等生物分子的分离，需要通过利用如二氧化硅、聚合物、金或银等非磁性物质进行改性而防止磁性粒子之间的相互作用以及凝聚，且为了使其能够与生物分子即蛋白质以及核酸等进行结合，需要导入如羧基、环氧基、对甲苯磺酰基、氨基或硅氧烷基等功能基或如生物素或链霉亲和素等结合物质。具有上述特性的磁性粒子及其制造方法已经在本行业中被公布，包括如美国专利第6,027,945号、美国专利第6,673,631号、美国专利第7,183,002号、日本专利第3,253,638号、日本公开专利第2001-136970号以及韩国公开专利第2009-0088299号等诸多文献，此外还有如涂布有链霉亲和素的Dynabeads磁性珠(Thermo FisherScientific公司，美国)以及导入有甲苯磺酰基的DYNAL M-270以及DYNAL M-280(DynalBiotech ASA公司，Norway)等在市面上销售。
在本发明中，捕获探针与上述靶分子特异性结合区域能够通过如上所述的磁性粒子或功能基共价结合或通过生物素与链霉亲和素之间的非共价结合而连接。为了防止捕获探针的靶分子特异性结合区域与信号探针的靶分子特异性结合区域与靶分子之间的竞争性结合，应设计为对信号探针的靶分子特异性结合区域所识别和结合的部位不同的部位进行识别和结合。
捕获探针的靶分子特异性结合区域与上述信号探针的特异性结合区域相同，能够是抗体、适配体、单链核酸以及抗原(当靶分子为抗体时)等，是单链核酸时能够包括如PNA等核酸类似物或修饰核苷酸。
在适用本发明的捕获检测方法中，上述步骤(a)通过利用信号探针以及捕获探针对分析目标样本进行处理而形成靶分子与信号探针以及捕获探针之间的复合体，同时获得包含上述复合体、没有形成复合体的信号探针、没有形成复合体的捕获探针以及非靶分子等的混合物。
为了对靶分子进行检测，在接下来的上述步骤(b)中需要对上述混合物中的复合体的信号探针进行检测。在如上所述的信号探针的检测中，因为捕获探针包含磁性粒子，因此在利用磁铁对上述混合物进行处理时将只有包含捕获探针的复合体以及没有形成复合体的捕获探针被结合到磁铁。通过上述过程，能够去除没有形成复合体的信号探针或非靶分子等。为了能够在上述过程中更加有效地去除没有形成复合体的信号探针或非靶分子等，执行如上所述的利用适当的洗涤溶液进行洗涤的步骤为宜。
在将复合体等结合到磁铁之后，需要从上述复合体仅分离出信号探针，这能够通过如上所述的加热或在加热的同时利用表面活性剂进行处理等方式实现。如上所述，因为信号探针是由交联结合的双链核酸构成，因此即使是在受到加热时也能够维持稳定的状态。
如上所述，在适用本发明的捕获检测方法中，上述(b)信号探针的检测步骤，能够包括：(b-1)通过利用磁铁对上述混合物进行处理而仅使上述复合体以及没有形成复合体的捕获探针结合到磁铁，从而对混合物中的剩余成分进行去除的步骤；(b-2)从结合到磁铁的复合体分离出信号探针的步骤；以及，(b-3)对上述所分离出的信号探针进行检测的步骤。
上述(b-3)仅对所分离出的信号探针进行检测的步骤，与如上所述的利用硝化纤维膜的蛋白质检测方法相同，能够包括：(b-3-i)利用上述信号探针的结合标记物将上述所分离出的信号探针处理到涂布有与上述结合标记物对应的结合配偶体的分析用支撑体上，从而借助于结合标记物与结合配偶体之间的特异性结合而将上述信号探针固定到分析用支撑体的步骤；以及，(b-3-ii)对固定到上述支撑体中的信号探针的信号进行检测的步骤。上述(b-3-i)将信号探针固定到分析用支撑体的固定步骤以及(b-3-ii)检测步骤的具体内容，能够直接参考对利用硝化纤维膜的蛋白质检测方法进行的说明内容。
在另一方面，适用本发明的靶分子的检测方法如图6以及图7所示，还能够在信号探针之外追加使用捕获竞争分子。
适用本发明的利用捕获竞争分子的方法(接下来为了说明的便利将称之为“适用本发明的竞争检测方法”)，包括：(a)通过利用与上述靶分子特异性结合的信号探针以及捕获竞争分子对分析目标样本进行处理而形成上述捕获竞争分子与上述信号探针的复合体，同时获得包含上述复合体的混合物的步骤；以及，(b)对上述混合物中的复合体的信号探针进行检测的步骤。
上述混合物除捕获竞争分子与信号探针的复合体之外，还包括靶分子与信号探针的复合体、没有形成复合体的信号探针、没有形成复合体的竞争分子、没有形成复合体的靶分子以及非靶分子等。
在适用本发明的竞争检测方法中，上述捕获竞争分子包括特异性地结合到靶分子中与信号探针的特异性结合部位(即表位)相同的部位的区域，并采用在上述区域中连接有磁性粒子的构成。上述捕获竞争分子通常是与靶分子相同的分子，但也能够是具有靶分子中与信号探针的特异性结合部位(即表位)相同的部位，从而能够在与信号探针的结合中实现竞争的类似分子。如上所述的类似分子，能够是靶蛋白与其他蛋白(抗体的Fc)融合的蛋白质等。
因为捕获竞争分子具有与靶分子相同的信号探针结合部位，因此在与信号探针结合时将与靶分子发生竞争，而当利用限量的信号探针对样本进行处理并对捕获竞争分子进行定量处理时，能够通过捕获竞争分子的检测结果提供与分析目标样本中的靶分子相关的信息(即靶分子的存在与否以及浓度等)。
上述“利用限量的信号探针对样本进行处理”是指利用能够同时检测出捕获竞争分子以及靶分子的量以下进行处理，理论上应利用能够检测出低于定量的捕获竞争分子浓度(定量值)以及分析目标样本中存在的靶分子的预测浓度(定量值)之核算值的浓度进行处理，但是因为实际处理的信号探针并不会全部与捕获竞争分子或靶分子结合，因此能够以上述核算值以上进行处理。但是因为在一般情况下难以对样本中的靶分子浓度进行测定，因此上述信号探针的限量是能够对定量的捕获竞争分子浓度以下进行检测的浓度。
分析目标样本中的靶分子的检测以及定量，能够通过利用相同的反应溶液等在相同的检测条件下利用不同的信号探针处理浓度以及捕获竞争分子处理浓度进行多次重复试验而绘制出信号探针的处理浓度与捕获竞争分子的处理浓度之间的相关关系的标准曲线的方式完成。通常，捕获竞争分子的检测以及定量值与样本中靶分子的浓度成反比。
在适用本发明的竞争检测方法中，上述(b)对上述混合物中的复合体的信号探针进行检测的步骤，能够以与上述适用本发明的捕获检测方法相同的方式执行。
具体来讲，能够包括：(b-1)通过利用磁铁对上述混合物进行处理而使捕获竞争分子与信号探针的复合体被结合到磁铁上的步骤；(b-2)从结合到磁铁的复合体中仅分离出信号探针的步骤；以及，(b-3)对上述所分离出的信号探针进行检测的步骤。在上述步骤(b-1)中利用磁铁对复合物进行处理时，虽然没有形成复合体的捕获竞争分子也将结合到磁铁，但是在对其进行加热时能够仅分离出信号探针。
上述(b-3)仅对所分离出的信号探针进行检测的步骤，与如上所述的利用硝化纤维膜的蛋白质检测方法以及捕获检测方法相同，能够包括：(b-3-i)利用上述信号探针的结合标记物将上述所分离出的信号探针处理到涂布有与上述结合标记物对应的结合配偶体的分析用支撑体上，从而借助于结合标记物与结合配偶体之间的特异性结合而将上述信号探针固定到分析用支撑体的步骤；以及，(b-3-ii)对固定到上述支撑体中的信号探针的信号进行检测的步骤。上述(b-3-i)将信号探针固定到分析用支撑体的固定步骤以及(b-3-ii)检测步骤的具体内容，能够直接参考对利用硝化纤维膜的蛋白质检测方法进行的说明内容。
如上所述，本发明能够提供一种通过使构成双链核酸的单链核酸互补性地交联结合(或共价结合)而防止其受到如温度、pH、盐、离子强度(ionic strength)等的影响的稳定的双链核酸信号探针。
此外，本发明能够提供一种在对靶分子进行检测时，首先利用上述稳定的双链核酸信号探针形成上述信号探针与靶分子的复合体，接下来再通过加热等方式从上述复合体分离出上述信号探针并对信号探针进行检测，从而检测出靶分子的方法。
附图说明
图1中对适用本发明的信号探针以及在利用上述信号探针的适用本发明的靶分子检测方法中所使用的主要构成因子进行了图示；
图2以及图3中对利用硝化纤维膜的适用本发明的蛋白质检测方法进行了步骤性图示；
图4以及图5中对利用捕获探针的靶分子检测方法进行了步骤性图示；
图6以及图7中对利用捕获竞争分子的靶分子检测方法进行了步骤性图示；
图8中对能够证明适用本发明的信号探针在高温下维持双链核酸状态的试验结果进行了图示；
图9中对构成适用本发明的信号探针的信号发生区域的双链核酸片段或其连接体的电泳结果进行了图示；
图10中对利用适用本发明的信号探针对细菌进行检测并利用nCounter数字分析器(nCounter digital analyzer，Nanostring technology公司，美国)获得的结果图像进行了图示；
图11中对适用本发明的信号探针在nCounter数字分析器(nCounter digitalanalyzer，Nanostring technology公司，美国)中被图像化的模式图进行了图示；
图12中对利用适用本发明的信号探针对2种标准靶分子进行分析并将上述结果的靶分子量以及信号值的双对数坐标图表进行了图示；
图13中对利用适用本发明的信号探针对13种靶分子进行2次分析并将上述结果的靶分子量以及信号值的双对数坐标图表进行了图示；
具体实施方式
实施例中使用的术语
在下述实施例中所使用的术语和在包含权利要求书在内的本说明书的其他部分中所使用的术语，具有如下所述的含义关系。
首先，“信号探针”在下述实施例中被记载为“第1探子”或与其混用，“信号发生区域”被记载为“颜色指示条形码”或与其混用，“信号探针”的“靶分子特异性结合区域”被记载为“第1探针”或“第1配体”或与其混用。
此外，“捕获探针”在下述实施例中被记载为“第2探子”或“捕获探针”或与其混用，“捕获探针”的“靶分子特异性结合区域”被记载为“第2探针”或“第2配体”或与其混用。
构成信号探针的信号发生区域且利用信号发生物质标记的各个区域记载为“信号标记物”。
此外，“固定核酸分子”在下述实施例中记载为“固定分子”或与其混用。
<实施例1>试剂的制备
1-1.第1探子(信号探针)的制备
第1探子用于与靶分子结合并生成上述靶分子固有信号。上述构成的基本结构采用用于生成靶分子固有信号的信号发生区域与靶分子特异性结合区域即第1探针结合的结构，此外还能够采用追加有固定区域以及结合标记物的结构。
1)信号标记物的制备
信号标记物是构成信号发生区域的基本构成单位，是双链核酸片段被信号发生物质标记的构成。
在本试验中，制备出了将M13DNA作为模板并通过PCR(Polymerase ChainReaction，聚合酶链反应)法合成的长度约为900bp的PCR产物被信号发生物质标记的双链核酸。
作为信号标记物主体的M13DNA的碱基序列信息，是从GenBank数据库系统(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)获得(Accession number NC_003287)。
将100ng的M13DNA(美国，NEB公司)作为模板并分别利用0.1uM的下述PCR引物对(韩国，Bioneer)以及1.25units的Taq聚合酶(美国，Promega公司)通过标准PCR法制备出了DNA片段(903bp)。
正向引物(序列编号1)：atcaggcgaatccgttattg
逆向引物(序列编号2)：tcggccttgctggtaatatc
按照制造企业所提供的标准方法，将上述所制备出的PCR产物即DNA片段作为模板并利用上述所制备出的引物对以及3种dNTP以及氨烯丙基-dCTP(美国，TriLink公司)再次通过标准PCR法制备出了氨烯丙基-dCTP整合的DNA片段。
【表1】
限制酶衔接子碱基序列
通过绘制出上述PCR产物的限制酶图谱而选择出能够对上述PCR产物进行切割的限制酶(Restriction enzyme)，并购买了由上述识别部位构成的如上述<表1>所示的衔接子(Gene Link公司，美国)。
按照制造企业的标准方法将上述衔接子连接到上述氨烯丙基-dCTP整合的PCR产物，从而得到如下所述的构成。
第1域：5'-Blunt end-DNA片段-Eco Rl/Sma I adaptor-3'
第2域：5'-Eco Rl/Sma I adaptor-DNA片段-Sal I/Bam HIadaptor-3'
第3域：5'-Sal I/Bam HI adaptor-DNA片段-Hind III/Not Iadaptor-3'
第4域：5'-Hind III/NotIadaptor-DNA片段-Xho I/Pstladaptor-3'
第5域：5'-Xho I/Pstladaptor-DNA片段-Sal I/Bam HIadaptor-3'
第6域：5'-Sal I/Bam HIadaptor-DNA片段-3'
具体来讲，在向由上述3nmol的衔接子以及0.3nmol的PCR产物即DNA片段构成的19uL的混合溶液添加1uL的5unit/uL的T4连接酶(美国，NEB公司)执行连接反应之后，将所获得的反应产物利用DNA&RNA Precipitation Solutions Pack(Gene Link公司，美国)进行提纯而获得上述衔接子附着且氨烯丙基-dCTP整合的DNA片段，接下来在利用上述限制酶进行处理之后再次进行提纯并获得结果物。
准备N-羟基丁二酰亚胺(NHS)-ester(酯)荧光物质即Alexa 488、Alexa 594和Alexa 647(美国，Invitrogen公司)以及Cy3(美国，GE Healthcare公司)等4种信号发生物质。
按照制造企业提供的标准方法，在将上述衔接子附着且氨烯丙基-dCTP整合的16～20ug的DNA片段按各个域分别溶解到20uL的灭菌蒸馏水之后，添加12uL的标记溶液(将25mg的NaHCO3溶解到1mL的灭菌蒸馏水中的溶液)制备出反应溶液。接下来以30ug/L的最终浓度将上述信号发生物质溶解到DMSO，制备出信号发生物质溶液。接下来将各5uL的上述反应溶液分装到4个试管并向各个试管投入一种上述2uL的信号发生物质溶液，然后在黑暗的室温状态下进行1小时的反应。
通过如上所述的反应在DNA片段上利用信号发生物质标记之后，利用QIAquickPCR Purification Kit(美国，QIAGEN公司)进行提纯，获得上述衔接子附着且信号发生物质标记的DNA片段。
借此，按4个域制备出分别利用上述4种信号发生物质标记的双链核酸DNA片段的4种信号标记物，为了说明的便利将其称之为“H信号标记物”。
2)共价结合诱导以及验证
将上述所制备出的1mg的H信号标记物溶解到1mL的反应缓冲溶液(10mM Tris(pH7.0)，200mM NaCl)中。将上述溶液添加到溶解于相同体积的95％乙醇中的0.3umol 8-甲氧基补骨脂素(8-MOP；美国，Sigma公司)，并在黑暗状态下进行1小时的反应。向上述反应物照射365nm波长(4W)的紫外线3小时，诱导上述H信号标记物链的碱基对之间的共价结合(A.Arabzadeh et al.，International Journal of Pharmaceutics 237(2002)47-55)。
向上述反应溶液添加4倍体积的三氯甲烷，并通过提取工程获得对未反应的补骨脂素进行去除的上清液。在向上述结果物添加5M的NaCl至0.2M的最终浓度之后，添加3倍体积的乙醇获得上述共价结合诱导的H信号标记物。为了说明的便利，将上述所获得的共价结合诱导的H信号标记物称之为“C信号标记物”。
将H信号标记物和与其对应的C信号标记物以0.5℃的间隔加热至95℃，并利用UV-1800(Shimadzu公司，日本)对260nm的吸光度进行了测定，其结果如图8所示。
可以发现H信号标记物在温度上升的过程中发生双链核酸的分离并转换为单链核酸，Tm为约85℃且在95℃下转换成单链核酸。与此相反，可以发现C信号标记物在95℃下也能够维持双链核酸状态。
3)信号发生区域即颜色指示条形码的制备
通过如下所述的方式，利用上述所制备出的C信号标签制备出了颜色发生区域即颜色指示条形码(Color-codedbarcode)。
首先将从4种第1域信号标记物中选择的一种分别分装到4个试管至10ug/mL的最终浓度，接下来向各个试管分别添加4种第2域信号标记物中的一种至10ug/mL的最终浓度，再混合到最终体积为100L的T4连接酶的反应溶液(50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1mM ATP，10mM DTT，pH 7.5)中。利用相同的方法对剩余的3种上述第1域信号标记物进行处理，从而将4种第1域信号标记物与4种第2域信号标记物分别进行混合，而上述16个反应结果物被命名为第1、2域混合溶液。
同理，将从4种第3域信号标记物中选择的一种分别分装到4个试管至10ug/mL的最终浓度，接下来向各个试管分别添加4种第4域信号标记物中的一种至10ug/mL的最终浓度，再混合到最终体积为100L的T4连接酶的反应溶液(50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1mM ATP，10mM DTT，pH 7.5)中。利用相同的方法对剩余的3种上述第3域信号标记物进行处理，从而将4种第3域信号标记物与4种第4域信号标记物分别进行混合，而上述16个反应结果物被命名为第3、4域混合溶液。
同理，将从4种第5域信号标记物中选择的一种分别分装到4个试管至10ug/mL的最终浓度，接下来向各个试管分别添加6种第4域信号标记物中的一种至10ug/mL的最终浓度，再混合到最终体积为100L的T4连接酶的反应溶液(50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1mM ATP，10mM DTT，pH 7.5)中。利用相同的方法对剩余的3种上述第5域信号标记物进行处理，从而将4种第5域信号标记物与4种第6域信号标记物分别进行混合，而上述16个反应结果物被命名为第5、6域混合溶液。
通过如上所述的方法，完成第1、2域混合溶液的16个试管、第3、4域混合溶液的16个试管以及第5、6域混合溶液的16个试管。
将从第1、2域混合溶液的16个试管中选择的试管、从第3、4域混合溶液的16个试管中选择的试管以及从第5、6域混合溶液的16个试管中选择的试管分别按照相同的浓度进行混合，将所获得的95uL的反应溶液利用5uL的5unit/uL的T4连接酶(美国，NEB公司)进行处理并进行12小时的连接反应，制备出6个域信号标记物被连续排列的最终结构链为共计4,096个(16×16×16＝46)的信号发生区域，为了说明的便利将其称之为“颜色指示条形码”。
在图9中对上述各个反应步骤中的反应产物的电泳结果图像进行了图示。
通过如上所述的方式获得的颜色指示条形码是其构成因子即6个信号标记物(信号发生物质标记的双链核酸片段)被连续排列的构成，且各个信号标记物被4种荧光物质(3种Alexa dye以及Cy3)中的某一种标记，从而能够根据各个信号的线性组合次序(linearorder)生成固有的检测信号，当通过如下所述的方式连接到第1探针即靶分子特异性结合区域时，能够对共计4,096个(16×16×16＝46)靶分子进行区分。这些颜色指示条形码能够形成300nm大小的光斑并通过落射荧光显微镜(epi-fluorescent microscope，US 8,519,115B2；NatBiotechnol.2008Mar；26(3)：293-4)进行图像化。
4)探子的制备
第1探子是通过对靶分子进行认知和结合并生成固有信号而对靶分子进行检测的结构体(construct)，是靶分子特异性结合区域即第1探针与上述信号发生区域结合的结构。
上述第1探子根据支撑体以及结合物质(生物素等)的有无分别制备成非固定性以及固定性，且作为第1探针使用了用于对核酸进行检测的单链核酸以及用于对蛋白质等进行检测的抗体以及适配体。
(1)非固定第1探子
非固定第1探子以5'-颜色指示条形码-间隔区域-第1探针-3'的结构制备。在此以及下述说明中，为了在将如颜色指示条形码以及固定区域等核酸作为探针的构成要素进行使用的情况下对上述核酸的排列方向或顺序进行指示而使用了5'以及3'。
作为间隔区域，订购使用了如下述序列的单链核酸。
间隔区域序列(序列编号11)：5'-AGAAGCGCAGAGCTTGGGCGCAGAACAC-3'
①第1探针为单链核酸的非固定第1探子的制备
通过如下所述的方式，制备出将单链核酸作为第1探针进行使用的非固定第1探子。首先，订购了单链核酸即5'-间隔区域-第1探针-3'结构体(Integrated DNATechnologies公司，美国)。接下来，向包括10ul的1mg/ml浓度的5'-间隔区域-第1探针-3'结构体以及10ul的1mg/ml浓度的颜色指示条形码的48uL的反应溶液(50mM Tris-HCl，10mMMgCl2，1mM ATP，10mM DTT，pH 7.5)添加2uL的5unit/uL的T4连接酶(美国，NEB公司)执行连接反应，制备出用于对核酸进行检测的非固定第1探子。
②第1探针为抗体的非固定第1探子的制备
通过如下所述的方式，制备出将抗体作为第1探针进行使用的非固定第1探子。首先，通过按照Thunder-Link oligo conjugation system(Innova Biosciences公司，英国)的协议对抗体执行反应基(利用DTT对抗体的双硫键进行还原而获得的-SH基)附加反应而制备出反应基附加的抗体。具体来讲，通过按照制造企业所提供的标准方法将100ul的1mg/ml浓度的抗体添加到由制造企业提供的Antibody Activation Reagent试管中并在室温下进行1小时的反应而制备出了反应基附加的活性化抗体。接下来，订购了包括反应基(NH2)的单链核酸的间隔区域即5'-间隔区域-NH2(Integrated DNA Technologies公司，美国)。接下来，通过将上述活性化的抗体以及上述包括反应基的间隔区域投入到N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基-硫代乙酸酯溶液中进行反应而制备出5'-固定区域-抗体-3'结构体。最后，向包括10ul的1mg/ml浓度的5'-间隔区域-抗体-3'结构体以及10ul的1mg/ml浓度的颜色指示条形码的48uL的反应溶液(50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1mM ATP，10mM DTT，pH 7.5)添加2uL的5unit/uL的T4连接酶(美国，NEB公司)执行连接反应，制备出用于对蛋白质等进行检测的非固定第1探子。
③第1探针为适配体的非固定第1探子的制备
通过如下所述的方式，制备出将适配体作为第1探针进行使用的非固定第1探子。首先，订购了5'-固定区域-适配体-3'结构体(Integrated DNA Technologies公司，美国)。接下来，向包括10ul的1mg/ml浓度的5'-间隔区域-适配体-3'结构体以及10ul的1mg/ml浓度的颜色指示条形码的48uL的反应溶液(50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，1mM ATP，10mM DTT，pH 7.5)添加2uL的5unit/uL的T4连接酶(美国，NEB公司)执行连接反应，制备出用于对核酸进行检测的非固定第1探子。
(2)固定第1探子
固定第1探子以5'-第1探针-间隔区域-固定区域-颜色指示条形码-生物素-3'的结构制备。其中，固定区域是由已知的序列重复构成，能够通过与包含上述固定区域的互补序列的固定分子(即固定核酸分子)互补结合而将第1探子固定到支撑体上。
作为固定区域，使用了如下述序列的单链核酸。
固定区域(序列编号12)：5'-(GCCACAGCACCTTGGTGCGTAGGATCTG)10-3'
其中，正数10代表上述序列的重复次数。
①第1探针为单链核酸的固定第1探子的制备
通过如下所述的方式，制备出将单链核酸作为第1探针进行使用的固定第1探子。首先，订购了单链核酸的5'-间隔区域-固定区域-3'结构体(Integrated DNATechnologies公司，美国)。接下来，通过利用Thermo Scientific Biotin 3End DNALabeling Kit(美国，Thermo Scientific公司)执行向颜色指示条形码附加生物素的反应而制备出了颜色指示条形码-生物素-3'结构体。具体来讲，按照制造企业所提供的标准方法，通过向混合有100ul的1mg/ml浓度的颜色指示条形码以及5uL的5uM浓度的Biotin-11-UTP(Biotin-11-Uridine-5'-triphosphate)的45uL的反应溶液(50mM PotassiumAcetate，20mM Tris-acetate，10mM Magnesium Acetate，pH 7.9)添加5uL的1.5U/uL末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)并在37℃下进行1个小时的反应而完成制备。接下来，通过向混合有10ul的1mg/ml浓度的5'-间隔区域-固定区域-3'结构体以及10ul的1mg/ml浓度的5'-颜色指示条形码-生物素-3'结构体的45uL的反应溶液(50mM Potassium Acetate，20mMTris-acetate，10mM Magnesium Acetate，pH 7.9)添加2uL的5unit/uL的T4连接酶(美国，NEB公司)进行连接反应而制备出5'-间隔区域-固定区域-颜色指示条形码-生物素-3'结构体并对其进行提纯。最后，通过向混合有10ul的1mg/ml浓度的上述所制造并提纯的结构体以及10ul的1mg/ml浓度的第1探针的45uL的反应溶液(50mM Potassium Acetate，20mMTris-acetate，10mM Magnesium Acetate，pH 7.9)添加2uL的5unit/uL的T4连接酶(美国，NEB公司)进行连接反应而制备出结构为5'-第1探针-间隔区域-固定区域-颜色指示条形码-生物素-3'且第1探针为单链核酸的固定第1探子。
②第1探针为抗体的固定第1探子的制备
通过如下所述的方式，制备出将抗体作为第1探针进行使用的固定第1探子。首先，利用与上述内容相同的方法制备出5'-颜色指示条形码-生物素-3'结构体以及反应基(SH基)附加的抗体，并订购了包括反应基(NH2)的单链核酸即5'-NH2-间隔区域-固定区域-3'结构体(Integrated DNA Technologies公司，美国)。接下来，通过向混合有100ul的1mg/ml浓度的NH2-间隔区域-固定区域结构体以及100ul的1mg/ml浓度的5'-颜色指示条形码-生物素-3'结构体的45uL的反应溶液(50mM Potassium Acetate，20mM Tris-acetate，10mMMagnesium Acetate，pH 7.9)添加2uL的5unit/uL的T4连接酶(美国，NEB公司)进行连接反应而制备出NH2-间隔区域-固定区域-颜色指示条形码-生物素-3'结构体。接下来，在将反应基附加的上述抗体以及上述结构体在室温下进行12～24小时的反应并将ConjugateClean Up Reagent(Innova Biosciences公司，英国)添加到上述反应混合溶液中进行10分钟的反应之后在15,000g下进行了5分钟的离心分离。通过重复执行2次Conjugate CleanUp Reagent添加反应以及离心分离，制备出已提纯状态的结构为5'-第1探针-间隔区域-固定区域-颜色指示条形码-生物素-3'且第1结构体为抗体的固定第1探子。
③第1探针为适配体的固定第1探子的制备
通过如下所述的方式，制备出将适配体作为第1探针进行使用的固定第1探子。首先，利用与上述内容相同的方法制备出5'-颜色指示条形码-生物素-3'结构体，并订购了5'-适配体-间隔区域-固定区域-3'的单链核酸(Integrated DNA Technologies公司，美国)。接下来，通过向混合有100ul的1mg/ml浓度的5'-颜色指示条形码-生物素-3'结构体以及100ul的1mg/ml浓度的5'-适配体-间隔区域-固定区域-3'结构体的45uL的反应溶液(50mM Potassium Acetate，20mM Tris-acetate，10mM Magnesium Acetate，pH 7.9)添加2uL的5unit/uL的T4连接酶(美国，NEB公司)进行连接反应而制备出结构为5'-第1探针-间隔区域-固定区域-颜色指示条形码-生物素-3'且第1探针为适配体的固定第1探子。
1-2.第2探子与捕获竞争分子的制备
第2探子是通过将捕获探针或作为捕获探针的靶分子特异性结合区域即第2探针与作为收获物质的磁性珠进行结合而制备，竞争分子是通过将靶分子(或可与靶分子进行竞争的靶分子类似物)与作为收获物质的磁性珠进行结合而制备。
1)第2探针为单链核酸或适配体的第2探子的制备
第2探针为单链核酸或适配体的第2探子，是在第2探针上以生物素以及链霉亲和素作为媒介物质进行制备。首先，通过利用Thermo Scientific Biotin 3End DNALabeling Kit(美国，Thermo Scientific公司)以如上所述的方法执行向预先准备的单链核酸或适配体附加生物素的反应而制备出了5'-第2探针-生物素-3'。具体来讲，按照制造企业所提供的标准方法，通过向混合有100ul的1mg/ml浓度的上述结构体以及5uL的5uM浓度的Biotin-11-UTP的45uL的反应溶液(50mM Potassium Acetate，20mM Tris-acetate，10mM Magnesium Acetate，pH 7.9)添加5uL的1.5U/uL末端脱氧核苷酰转移酶(TdT)并在37℃下进行1个小时的反应而完成制备。接下来，将50ng/L的上述所制备出的5'-第2探针-生物素-3'以相同的体积添加到5ug/L的涂布有链霉亲和素的磁性珠(Streptavidin-coupledDynabeads，Dynal Biotech ASA，Norway)中并按照制造企业的协议连续旋转的同时进行反应，从而制备出磁性珠与作为第2探针的单链核酸连接的第2探子。
2)第2探针为抗体的第2探子的制备
第2探针为抗体的第2探子，是通过将抗体与作为收获物质的磁性珠直接结合而制备。首先，将100ug的抗体以及5mg的包括对甲苯磺酰基(Tosyl group)的活性化(Tosylactivated)磁性珠(M-280Tosylactivated magnetic beads，Dynal Biotech ASA，Norway)投入到缓冲溶液(0.1M borate buffer，pH 9.5)并在常温下进行48小时的反应。利用磁铁对通过甲苯磺酰基与抗体结合的磁性珠进行分离，然后利用相同的缓冲溶液对磁性珠进行洗涤，从而对没有结合的抗体进行了去除。与分子结合的磁性珠(以下简称为捕获探针)在洗涤之后利用0.1％的BSA(Bovine Serum Albumin，Sigma公司，美国)在37℃下进行4小时的反应，从而使没有与分子结合的溶液甲苯磺酰(tosyl)基失活。接下来，在经过几次洗涤之后将磁性珠混合到缓冲溶液(0.1M PBS，pH 7.4)中并在4℃下进行保管。
3)竞争分子为单链核酸的捕获竞争分子的制备
竞争分子为单链核酸的捕获竞争分子用于对靶分子即核酸进行检测，利用上述第2探针为单链核酸或适配体的第2探子的制造方法相同的方法进行制造。
4)竞争分子为蛋白质的捕获竞争分子的制备
竞争分子为蛋白质的捕获竞争分子用于对靶分子即蛋白质进行检测，利用上述第2探针为单链核酸或适配体的第2探子的制造方法相同的方法进行制造。其中，竞争分子使用了与靶蛋白相同的蛋白质。
1-3.固定分子的制备
固定分子是与构成第1探子的固定区域的重复序列互补的碱基序列，订购了在5'的末端标记生物素的单链核酸(Integrated DNA Technologies公司，美国)。
<实施例2>细菌的检测
利用将<表2>中的抗体以及<表3>中的适配体作为第1探针(配体)制造的第1探子，对代表性的食物中毒菌即大肠杆菌、沙门氏菌、李斯特菌以及金黄色葡萄球菌进行了检测。
【表2】
与食物中毒菌的表面分子结合的抗体
| 抗体类型 | 目录号 | 供应企业 |
| 大肠杆菌/抗大肠杆菌抗体 | ab25823 | Abeam公司 |
| 李斯特菌/抗李斯特菌抗体 | 01-90-95 | KPL公司 |
| 沙门氏菌CSA-1/抗沙门氏菌CSA-1抗体 | 01-91-99 | KPL公司 |
【表3】
与食物中毒菌的表面分子结合的适配体的碱基序列
作为抗体配体的反应溶液使用了10mM PBS缓冲溶液(137mM NaCl，10mMPhosphate，2.7mM Kcl pH 7.4)，作为适配体配体的反应溶液使用了Cellex缓冲溶液(20mMTris-Cl buffer，pH 7.6contained 100mM NaCl，2mM MgCl2，5mM KCl，1mM CaCl2and0.02％Tween)。向反应溶液添加了用于阻碍细菌繁殖的0.05至0.2％(w/v)的叠氮化钠以及用于阻碍非特异性结合的0.1至0.3％(w/v)的牛血清白蛋白。反应是在20至30℃的温度下执行。
向70ul的包含细菌的样本混合15ul的结合有生物素的第1探子并晃动30分钟进行反应。利用涂布有链霉亲和素的玻璃载片(Nanocs公司，美国)对20ul的上述反应溶液进行处理，并利用包含0.1X SSPE以及0.1％tween-20的洗涤溶液对上述玻璃载片进行3次洗涤，从而对没有与细菌结合或非特异性结合的第1探子进行去除。盖上盖玻片之后利用nCounter数字分析器(nCounter digital analyzer，Nanostring technology公司，美国)按照制造企业的协议对第1探子与细菌结合形成的复合体中的细菌存在信号所生成的光斑(spots)进行了图形化，其结果如图9所示。
<实施例3>核酸以及蛋白质的检测
3-1.核酸检测反应
为了对核酸进行检测，使用了包含下述<表4>的单链核酸第1探针的固定第1探子或下述<表4>的单链核酸第2探针的第2探子，并将β-actin、IL17以及IL17RA mRNA作为靶分子使用。订购下述<表4>的β-actin、IL17以及IL17R mRNA的单链核酸并用于第1探子以及第2探子的制备(Bioneer，韩国)。靶分子即β-actin、IL17以及IL17R mRNA的碱基序列信息能够从GenBank的数据库系统(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)获取(IL17的Accessionnumber为NM_002190而IL17RA的Accession number为NM_014339)。
【表4】
与靶mRNA相关的探针序列
作为样本使用了人类的软骨组织(Promocell公司，德国)。首先，利用AllPrepDNA/RNA/Protein Mini kit(Qiagen公司，美国)从样本中分离出了靶分子mRNA。具体来讲，按照制造企业的协议利用制造企业所提供的缓冲溶液对软骨组织进行溶解，接下来利用色谱柱对所溶解的样本进行处理并离心分离，从而将RNA结合到色谱柱膜上。在对色谱柱膜上的RNA进行分离时，首先对包含RNA的色谱柱进行洗涤并从色谱柱膜上提取出RNA，接下来通过离心分离而获得RNA。
向共计100ng/uL的RNA混合200ng/uL的第1探子以及200ng/uL的第2探子并进行晃动混合，从而通过杂化反应诱导第1探子-靶mRNA-第2探子复合体。杂化反应是利用包含0.5M NaHPO4、7％SDS(sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸钠)以及1mM EDTA的反应溶液在65℃的条件下执行。接下来，利用磁铁对反应溶液进行处理，从而借助于第2探子的磁性珠诱导上述复合体被固定到磁铁，接下来利用洗涤溶液对其进行洗涤，从而对未结合的第1探子以及非靶RNA进行了去除。上述洗涤共计执行3次，包括利用6X SSC(standardsaline citrate，标准枸椽酸盐溶液)/0.1％SDS在48℃下执行1次，利用0.1X 330/0.1％303在68℃下执行1次，以及利用0.2X SSC/0.1％SDS在42℃下执行1次。
通过利用包含0.1X SSPE以及0.1％tween-20的溶液对结合有第1探子-靶mRNA-第2探子复合体的磁铁进行处理并在95℃下加热5分钟而诱导第1探子从上述复合体分离之后，获取包含第1探子的上清液。
在获取上清液之后利用分子计数分析器即nCounter数字分析器(nCounterdigital analyzer，Nanostring technology公司，美国)按照制造企业的协议将第1探子固定到涂布有链霉亲和素的盖玻片中，然后通过对固定的光斑进行图像化而执行检测和定量化。
具体来讲，通过向3uL的上述所获取到的上清液添加1uL的将0.1％Tetraspeck荧光微球体溶液(Invitrogen公司，美国)稀释成1:5,000比例的试剂并混合而制备出分析样本，接下来将上述分析样本加样到配备涂布有链霉亲和素的盖玻片(Optichem，Accelr8Technology Corporation)的上述分析器的流体装置，从而借助于第1探子的生物素与盖玻片的链霉亲和素之间的结合诱导第1探子与支撑体即盖玻片的结合。在通过上述方式诱导结合之后，利用90uL的1X TAR溶液对其表面进行1次洗涤，接下来在利用40uL的1X TAE溶液进行追加处理而使第1探子展开(stretching)之后以160V/cm进行1分钟的处理。通过向展开的第1探子添加60uL的50nM固定分子而诱导其与第1探子中包含重复序列的固定区域互补结合，从而将第1探子追加固定到表面。在如上所述的固定化过程中，维持电流5分钟。在固定化之后去除TAE溶液，接下来添加拍摄用抗光漂白剂(anti photobleaching reagent)即SlowFade试剂(Invitrogen公司)准备图像化。在通过如上所述的方式准备图像化之后，利用上述分析器的拍摄器获得与四个荧光物质对应的四个不同激发波长(480，545，580，622)下的四个图像。通过对所获得的四个图像进行整合(spatial clustering，空间聚类)而获得了如图11的模式图所示的与第1探子相关的图像。在图像化过程中，上述分析器的分辨率被设定为600FOV(field of view，视场)。从上述分析器下载数据之后按照制造企业所提供的分析指南利用Excel进行了分析。数据是利用最初提供的阳性验证对照组标准曲线对样本内的标准物质以及靶分子进行了归一化。归一化值是利用样本中所包含的基准物质的值对靶分子值整体进行了平均归一化。靶分子的定量值是对3次的重复执行分析结果进行了平均计算。
通过如上所述的方式，利用上述分析器对靶分子即mRNA以分子系数分析法得到了定量结果。通过如上所述的方式获得的结果与靶mRNA的RT-PCR结果类似。
3-2.蛋白质检测反应
3-2-1.仅利用第1探子的蛋白质检测反应
仅利用作为靶分子的第1探针包含下述<表5>所示的多克隆抗体的固定第1探子，对下述<表5>中的靶分子执行了检测反应。上述蛋白质检测反应的整体流程如图2以及图3所示。
【表5】
靶分子以及与其对应的抗体
首先利用10mM PBS缓冲溶液(137mM NaCl，10mM Phosphate，2.7mM KCl pH 7.4)制备出分别包含100ug/ml的上述【表5】所示靶分子的溶液，接下来对上述溶液进行阶段性稀释，使其最终生物分子的浓度达到1,000pg/mL、100pg/mL、10pg/mL、0.1pg/mL以及0pg/mL。分析混合样本是通过将13种生物分子的上述稀释溶液混合成多种浓度而进行制备。
此外，固定第1探子溶液是利用10mM PBS缓冲溶液(137mM NaCl，10mM Phosphate，2.7mM KCl pH 7.4)以包含200ug/ul浓度的第1探针的方式进行制备。
向上述包含分析样本的反应溶液添加硝化纤维膜(Nitrocellulose membrane)盘并晃动30分钟进行反应，从而使样本中的蛋白质被吸附到膜上。利用150uL的0.1X SSPE/0.1％tween-20溶液对上述盘进行洗涤，并投入到封阻液[包含2％(w/v)Bovine SerumAlbumin(BSA，牛血清白蛋白)的洗涤溶液]中进行反应。添加各个靶分子的70ul的固定第1探子溶液并晃动进行1小时的反应，诱导了靶分子-第1探子之间的复合体的形成。接下来为了对没有形成复合体的过剩第1探子以及形成非特异性复合体的第1探子进行去除，向上述盘添加150uL的0.1X SSPE/0.1％tween-20溶液进行3次洗涤。
为了从洗涤的盘分离并获取第1探子，向上述洗涤的盘添加0.1X SSPE/0.1％tween-20溶液并以95℃进行5分钟的加热而诱导第1探子从上述复合体分离，从而获取了包含第1探子的上清液。
在获取上清液之后按照与上述实施例3-1相同的方法，利用分子计数分析器即nCounter数字分析器(nCounter digital analyzer，Nanostring technology公司，美国)按照制造企业的协议将第1探子固定到涂布有链霉亲和素的盖玻片中，然后通过对固定的光斑进行图像化而执行检测和定量化。
3-2-2.利用第1探子以及第2探子的蛋白质检测反应(捕获检测反应)
利用作为靶分子的第1探针包含上述<表5>所示的多克隆抗体的固定第1探子以及同样作为靶分子的第2探针包含上述<表5>所示的多克隆抗体的固定第2探子，对上述<表5>中的靶分子执行了检测反应。上述蛋白质检测反应的整体流程如图4以及图5所示。
分析样本是利用与上述实施例3-1相同的方法进行了制备。向25ul的分析样本添加各个靶分子的70ul的固定第1探子溶液以及70ul的第2探针溶液混合晃动进行1小时的反应，诱导了第1探子-靶分子-第2探子之间的复合体的形成。接下来，利用磁铁对反应溶液进行处理，从而借助于第2探子的磁性珠诱导上述复合体被固定到磁铁，接下来利用洗涤溶液对其进行洗涤，从而对未结合的第1探子以及非靶分子进行了去除。此时，利用150uL的0.1XSSPE/0.1％tween-20溶液进行了3次洗涤。
接下来，利用0.1X SSPE/0.1％tween-20溶液对结合有上述复合体的磁铁进行处理并在95℃下加热5分钟而诱导第1探子从上述复合体分离之后，获取包含第1探子的上清液。
在获取上清液之后按照与上述实施例3-1相同的方法，利用分子计数分析器即nCounter数字分析器(nCounter digital analyzer，Nanostring technology公司，美国)按照制造企业的协议将第1探子固定到涂布有链霉亲和素的盖玻片中，然后通过对固定的光斑进行图像化而执行检测和定量化。
上述定量化结果如下述<表6>所示。
【表6】
所准备的混合样本中包含的靶分子的实际以及分析浓度
对由2种标准物质(大肠杆菌烯酰-酰基载体蛋白还原酶，向光素1)构成的模拟(mock)比较球和包含标准物质以及包含其他靶分子的对照球进行了3次分析。由标准物质构成的模拟比较球，用于标准浓度曲线的制定并用于对反应、提纯以及捕获效率中存在差异的数据进行归一化。在图12中对标准物质的线性性、动态范围(dynamic range)以及重现性的调查结果进行了图示。图12是对模拟比较球的标准物质进行测定的结果(N＝6)，如双对数坐标图表中的重叠点所示，可以发现在各分析中控制信号值(计数)为0.1pg/mL与100pg/mL之间的重现性最高。此外，分析结果中浓度-计数的线性回归相关系数在0.1以上的浓度对数中为≥0.989对数，呈现出了线性性。
此外，在图13中以双对数坐标图示了通过2次独立反应对上述<表6>的13中生物分子进行检测以及归一化的结果，此时各个信号的偏差为0.7～35.4。
4-2-3.利用第1探子以及捕获竞争分子的蛋白质检测反应(竞争检测反应)
利用将上述<表6>中的抗体作为第1探针的第1探子以及将上述<表5>中的各个蛋白质作为竞争分子的捕获竞争分子，对上述<表5>中的靶分子执行了检测反应。上述蛋白质检测反应的整体流程如图6以及图7所示。
分析样本是利用与上述实施例4-1相同的方法进行了制备。向25ul的分析样本添加各个靶分子的70ul的固定第1探子溶液以及70uL的预先对浓度(30ug/ul)进行定量化的捕获竞争分子混合晃动进行1小时的反应，诱导了第1探子-靶分子和第1探子-捕获竞争分子之间的复合体的形成。接下来，利用磁铁对反应溶液进行处理，从而借助于捕获竞争分子的磁性珠诱导上述复合体被固定到磁铁，接下来利用洗涤溶液对其进行洗涤，从而对未结合的第1探子、靶分子之外的其他靶分子以及第1探针-靶分子进行去除，仅获取了第1探针-捕获竞争分子之间则复合体。此时，利用150uL的0.1X SSPE/0.1％tween-20溶液进行了3次洗涤。
接下来，利用0.1X SSPE/0.1％tween-20溶液对结合有上述第1探子-捕获竞争分子的磁铁进行处理并在95℃下加热5分钟而诱导第1探子从上述复合体分离之后，获取包含第1探子的上清液。
在获取上清液之后按照与上述实施例3-1相同的方法，利用分子计数分析器即nCounter数字分析器(nCounter digital analyzer，Nanostring technology公司，美国)按照制造企业的协议将第1探子固定到涂布有链霉亲和素的盖玻片中，然后通过对固定的光斑进行图像化而执行检测和定量化。从通过如上所述的方式获取到的捕获竞争分子的定量结果，利用标准曲线获得了靶分子的定量结果。
Claims (41)
1.一种对靶分子能产生独特信号的双链核酸信号探针，其特征在于，包括：
(i)靶分子特异性结合区域；以及，
(ii)信号发生区域，结合到所述靶分子特异性结合区域；
其中，所述信号发生区域为互补交联结合的双链核酸，所述双链核酸中包括利用相同的信号发生物质标记或利用不同的信号发生物质标记的2个以上的区域。
2.根据权利要求1所述的信号探针，其特征在于：
所述2个以上的区域中的一个以上的区域生成与其他区域不同的信号的信号发生物质标记。
3.根据权利要求1所述的信号探针，其特征在于：
所述信号发生区域即双链核酸为完整双链核酸或部分双链核酸。
4.根据权利要求1所述的信号探针，其特征在于：
所述靶分子特异性结合区域为单链核酸、抗体、抗原或适配体。
5.根据权利要求1所述的信号探针，其特征在于：
所述信号发生物质为不同颜色的2种以上的荧光物质。
6.根据权利要求1所述的信号探针，其特征在于：
固定区域以已知的序列与信号发生区域相邻连接。
7.根据权利要求1所述的信号探针，其特征在于：
固定区域以已知的序列与所述信号发生区域相邻追加连接，已知的序列重复2次构成。
8.根据权利要求1所述的信号探针，其特征在于：
所述靶分子特异性结合区域与所述信号发生区域之间包括间隔区域。
9.根据权利要求1所述的信号探针，其特征在于：
所述靶分子特异性结合区域的相反一侧与结合标记物连接。
10.根据权利要求1所述的信号探针，其特征在于：
所述靶分子特异性结合区域的相反一侧与结合标记物连接，所述结合标记物为生物素或生物素类似物。
11.一种分析目标样本中的靶分子的检测方法，其特征在于，包括：
(a)通过利用包含靶分子特异性结合区域的信号探针对分析目标样本进行处理而形成样本中的靶分子与信号探针的复合体的步骤；以及，
(b)对所述复合体的信号探针进行检测的步骤；
所述信号探针，包括：(i)靶分子特异性结合区域；以及，(ii)信号发生区域，结合到上述靶分子特异性结合区域；其中，所述信号发生区域为互补交联结合的双链核酸，所述双链核酸中包括利用相同的信号发生物质标记或利用不同的信号发生物质标记的2个以上的区域，所述信号探针的检测步骤是通过对所述信号发生区域的信号进行检测而执行。
12.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于：
所述靶分子特异性结合区域为单链核酸、抗体、抗原或适配体。
13.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于：
所述信号探针检测步骤，包括：(i)从所述复合体分离出信号探针的步骤；以及(ii)对所分离出的信号探针的信号进行检测的步骤。
14.一种分析目标样本中的靶蛋白的检测方法，其特征在于，包括：
(a)利用硝化纤维膜对分析目标样本进行处理，从而将样本中的蛋白质吸附到硝化纤维膜中的步骤；
(b)利用封阻剂对吸附有所述蛋白质的硝化纤维膜进行处理，从而对蛋白质未吸附的硝化纤维膜表面进行封阻的步骤；
(c)利用包含靶蛋白特异性结合区域的信号探针对所述封阻的硝化纤维膜进行处理，从而形成样本中的靶蛋白与信号探针的复合体的步骤；以及，
(d)对所述复合体的信号探针进行检测的步骤；
所述信号探针，包括：(i)靶蛋白特异性结合区域；以及，(ii)信号发生区域，结合到所述靶蛋白特异性结合区域；其中，所述信号发生区域为互补交联结合的双链核酸，所述双链核酸中包括利用相同的信号发生物质标记或利用不同的信号发生物质标记的2个以上的区域，所述信号探针的检测步骤是通过对所述信号发生区域的信号进行检测而执行。
15.根据权利要求14所述的检测方法，其特征在于：
所述靶分子特异性结合区域为抗体或抗原。
16.根据权利要求14所述的检测方法，其特征在于：
在所述步骤(a)之后，执行用于对吸附到硝化纤维膜中的除蛋白质之外的其他分子进行去除的洗涤步骤。
17.根据权利要求14所述的检测方法，其特征在于：
在所述步骤(c)之后，执行用于对非特异性结合分子进行去除的洗涤步骤。
18.根据权利要求14所述的检测方法，其特征在于：
所述(d)的信号探针检测步骤，包括：(d-1)从所述复合体分离出信号探针的步骤；以及，(d-2)对所述所分离出的信号探针进行检测的步骤。
19.根据权利要求14所述的检测方法，其特征在于：
所述信号探针的靶分子特异性结合区域的相反一侧与结合标记物连接，
所述(d)的信号探针检测步骤，包括：(d-1)从所述复合体分离出信号探针的步骤；以及，(d-2)对所分离出的信号探针进行检测的步骤；
所述(d-2)的信号探针检测步骤，包括：
(d-2-i)利用所述信号探针的结合标记物将所述所分离出的信号探针处理到涂布有与所述结合标记物对应的结合配偶体的分析用支撑体上，从而借助于结合标记物与结合配偶体之间的特异性结合而将所述信号探针固定到分析用支撑体的步骤；以及，(d-2-ii)对固定到所述支撑体中的信号探针的信号进行检测的步骤。
20.根据权利要求19所述的检测方法，其特征在于：
所述结合标记物为生物素或生物素类似物。
21.根据权利要求19所述的检测方法，其特征在于：
所述结合配偶体为链霉亲和素或链霉亲和素类似物。
22.根据权利要求19所述的检测方法，其特征在于：
固定区域以已知的序列与所述信号发生区域相邻追加连接，
所述(d-2-ii)的信号探针的信号检测步骤，包括：
利用具有与所述固定区域互补的单链核酸序列且所述序列具有可与所述结合配偶体特异性结合的结合标记物的固定核酸分子对所述支撑体进行处理的步骤；以及，
在所述处理步骤之后对信号探针的信号进行检测的步骤。
23.根据权利要求22所述的检测方法，其特征在于：
所述固定核酸分子的结合标记物为生物素或生物素类似物。
24.一种分析目标样本中的靶蛋白的检测方法，其特征在于，包括：
(a)通过利用与靶分子特异性结合的信号探针以及包括特异性地结合到靶分子中与所述信号探针的特异性结合部位不同的部位的区域并在所述区域中连接有磁性粒子的捕获探针对分析目标样本进行处理而形成所述靶分子与所述信号探针以及所述捕获探针的复合体，同时获得包含所述复合体以及没有形成复合体的信号探针和捕获探针的混合物的步骤；以及，
(b)对所述混合物中的复合体的信号探针进行检测的步骤；
所述信号探针，包括：(i)靶蛋白特异性结合区域；以及，(ii)信号发生区域，结合到所述靶蛋白特异性结合区域；其中，所述信号发生区域为互补交联结合的双链核酸，所述双链核酸中包括利用相同的信号发生物质标记或利用不同的信号发生物质标记的2个以上的区域，所述信号探针的检测步骤是通过对所述信号发生区域的信号进行检测而执行。
25.根据权利要求24所述的检测方法，其特征在于：
所述靶分子特异性结合区域为单链核酸、抗体、抗原或适配体。
26.根据权利要求24所述的检测方法，其特征在于：
所述(b)的信号探针检测步骤，包括：
(b-1)从所述混合物中的复合体仅分离出信号探针的步骤；以及，
(b-2)对所述所分离出的信号探针进行检测的步骤。
27.根据权利要求24所述的检测方法，其特征在于：
所述(b)的信号探针检测步骤，包括：
(b-1)从所述混合物中的复合体仅分离出信号探针的步骤；以及，
(b-2)对所述所分离出的信号探针进行检测的步骤，
所述(b-1)中仅分离出信号探针的步骤，包括：
(b-1-i)通过利用磁铁对所述混合物进行处理而仅使所述复合体以及没有形成复合体的捕获探针结合到磁铁，从而对混合物中的剩余成分进行去除的步骤；以及，
(b-1-ii)从结合到磁铁的复合体分离出信号探针的步骤。
28.根据权利要求27所述的检测方法，其特征在于：
所述信号探针的靶分子特异性结合区域的相反一侧与结合标记物连接，
所述(b-2)的信号探针检测步骤，包括：
(b-2-i)利用所述信号探针的结合标记物将所分离出的信号探针处理到涂布有与所述结合标记物对应的结合配偶体的分析用支撑体上，从而借助于结合标记物与结合配偶体之间的特异性结合而将所述信号探针固定到分析用支撑体的步骤；以及，(b-2-ii)对固定到所述支撑体中的信号探针的信号进行检测的步骤。
29.根据权利要求28所述的检测方法，其特征在于：
所述结合标记物为生物素或生物素类似物。
30.根据权利要求28所述的检测方法，其特征在于：
所述结合配偶体为链霉亲和素或链霉亲和素类似物。
31.根据权利要求28所述的检测方法，其特征在于：
固定区域以已知的序列与所述信号发生区域相邻追加连接，
所述(b-2-ii)的信号探针的信号检测步骤，包括：
利用具有与所述固定区域互补的单链核酸序列且所述序列具有可与所述结合配偶体特异性结合的结合标记物的固定核酸分子对所述支撑体进行处理的步骤；以及，
在所述处理步骤之后对信号探针的信号进行检测的步骤。
32.根据权利要求31所述的检测方法，其特征在于：
所述固定核酸分子的结合标记物为生物素或生物素类似物。
33.一种分析目标样本中的靶蛋白的检测方法，其特征在于，包括：
(a)通过利用与靶分子特异性结合的信号探针以及包括特异性地结合到靶分子中与所述信号探针的特异性结合部位相同的部位的区域并在所述区域中连接有磁性粒子的捕获竞争分子对目标分析样本进行定量处理而形成所述捕获竞争分子与所述信号探针之间的复合体，同时获得包含所述复合体的混合物的步骤；以及，
(b)对所述混合物中的复合体的信号探针进行检测的步骤；
所述信号探针，包括：(i)靶蛋白特异性结合区域；以及，(ii)信号发生区域，结合到所述靶蛋白特异性结合区域；其中，所述信号发生区域为互补交联结合的双链核酸，所述双链核酸中包括利用相同的信号发生物质标记或利用不同的信号发生物质标记的2个以上的区域，
所述信号探针的检测步骤是通过对所述信号发生区域的信号进行检测而执行，
所述信号配体利用可同时对捕获竞争分子以及靶分子进行检测的量进行处理。
34.根据权利要求33所述的检测方法，其特征在于：
所述靶分子特异性结合区域为单链核酸、抗体、抗原或适配体。
35.根据权利要求33所述的检测方法，其特征在于：
所述(b)的信号探针检测步骤，包括：
(b-1)从所述混合物中的复合体仅分离出信号探针的步骤；以及，
(b-2)对所述所分离出的信号探针进行检测的步骤。
36.根据权利要求33所述的检测方法，其特征在于：
所述(b)信号探针检测步骤，包括：
(b-1)从所述混合物中的复合体仅分离出信号探针的步骤；以及，
(b-2)对所述所分离出的信号探针进行检测的步骤，
所述(b-1)的仅分离出信号探针的步骤，包括：
(b-1-i)通过利用磁铁对所述混合物进行处理而仅使所述复合体以及没有形成复合体的捕获竞争分子结合到磁铁，从而对混合物中的剩余成分进行去除的步骤；以及，
(b-1-ii)从结合到磁铁的复合体分离出信号探针的步骤。
37.根据权利要求36所述的检测方法，其特征在于：
所述信号探针的靶分子特异性结合区域的相反一侧与结合标记物连接，
所述(b-2)信号探针检测步骤，包括：
(b-2-i)利用所述信号探针的结合标记物将所分离出的信号探针处理到涂布有与所述结合标记物对应的结合配偶体的分析用支撑体上，从而借助于结合标记物与结合配偶体之间的特异性结合而将所述信号探针固定到分析用支撑体的步骤；以及，(b-2-ii)对固定到所述支撑体中的信号探针的信号进行检测的步骤。
38.根据权利要求37所述的检测方法，其特征在于：
所述结合标记物为生物素或生物素类似物。
39.根据权利要求37所述的检测方法，其特征在于：
所述结合配偶体为链霉亲和素或链霉亲和素类似物。
40.根据权利要求37所述的检测方法，其特征在于：
固定区域以已知的序列与所述信号发生区域相邻追加连接，
所述(b-2-ii)的信号探针的信号检测步骤，包括：
利用具有与所述固定区域互补的单链核酸序列且所述序列具有可与所述结合配偶体特异性结合的结合标记物的固定核酸分子对所述支撑体进行处理的步骤；以及，
在所述处理步骤之后对信号探针的信号进行检测的步骤。
41.根据权利要求40所述的检测方法，其特征在于：
所述固定核酸分子的结合标记物为生物素或生物素类似物。
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