ES2604764T3 - Análisis de muestras de ensayo - Google Patents

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Dan Nieuwlandt
Bruce Eaton
Marty Stanton
Shashi Gupta
Stephan Kraemer
Dominic Zichi
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Abstract

Un metodo de deteccion de la cantidad de una molecula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, comprendiendo el metodo: (a) preparar una mezcla poniendo en contacto la muestra de ensayo con un aptamero que comprende una primera marca y que tiene una afinidad especifica por la molecula diana, en donde si dicha molecula diana esta presente en dicha muestra de ensayo, se forma un complejo de afinidad con el aptamero no covalente del aptamero y la molecula diana, en donde la tasa de disociacion (t1/2) del aptamero de la molecula diana es mayor de 20 minutos; (b) exponer la mezcla a un primer soporte solido que comprende un primer elemento de captura y dejar que la primera marca se asocie al primer elemento de captura; (c) eliminar cualquier componente de la mezcla no asociado a dicho primer soporte solido; (d) liberar el complejo de afinidad por aptamero de dicho primer soporte solido; (e) unir una segunda marca a dicha molecula diana en el complejo de afinidad por aptamero; (f) exponer el complejo de afinidad por aptamero liberado a un segundo soporte solido que comprende un segundo elemento de captura y dejar que la segunda marca se asocie a dicho segundo elemento de captura; (g) eliminar cualquier aptamero sin complejar de dicha mezcla por separacion del aptamero sin complejar de dicho complejo de afinidad por aptamero; y (h) disociar el aptamero de dicho complejo de afinidad por aptamero y recoger aptameros libres; (i) detectar la cantidad de aptameros libres recogidos y cuantificar dicha diana cuantificando dichos aptameros.

Description

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DESCRIPCION
Analisis de muestras de ensayo Campo de la invencion
La presente invencion se refiere generalmente a metodos, dispositivos, reactivos y kits para la deteccion de una molecula diana en una muestra y, mas espedficamente, a la deteccion y/o la cuantificacion de una o mas moleculas diana que pueden estar contenidas en una muestra de ensayo. Tales metodos tienen una amplia utilidad en aplicaciones de diagnostico, ademas de en el descubrimiento de biomarcadores y el diseno y el desarrollo de terapeuticos.
Antecedentes
La siguiente description proporciona un resumen de information relevante para la presente divulgation y no es una concesion de que cualquiera de la informacion proporcionada o las publicaciones citadas en el presente documento sea estado de la tecnica para la invencion presentemente reivindicada.
Los ensayos dirigidos a la deteccion y la cuantificacion de moleculas fisiologicamente significativas en muestras biologicas y otras muestras son herramientas importantes en la investigation cientifica y en el campo sanitario. Una clase de tales ensayos implica el uso de una micromatriz que incluye uno o mas aptameros inmovilizados sobre un soporte solido. Los aptameros son cada uno capaces de unirse a una molecula diana de una manera altamente especifica y con afinidad muy alta. Vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 5.475.096 titulada "Nucleic Acid Ligands"; vease, por tanto, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 6.242.246, la patente de EE.UU. N.° 6.458.543 y la patente de EE.uU. N.° 6.503.715, cada una de las cuales se titula "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip". Una vez la micromatriz se pone en contacto con una muestra, los aptameros se unen a sus moleculas diana respectivas presentes en la muestra y asi permiten una determination de la ausencia, presencia, cantidad y/o concentration de las moleculas diana en la muestra.
Una variation de este ensayo emplea aptameros que incluyen grupos funcionales fotorreactivos que permiten que los aptameros se unan covalentemente o "fotorreticulen" sus moleculas diana. Vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 6.544.776 titulada "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip". Estos aptameros fotorreactivos tambien se denominan fotoaptameros. Vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 5.763.177, la patente de EE.UU. N.° 6.001.577 y la patente de EE.UU. N.° 6.291.184, cada una de las cuales se titula "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX"; vease, por tanto, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 6.458.539, titulada "Photoselection of Nucleic Acid Ligands". Despues de que la micromatriz se ponga en contacto con la muestra y los fotoaptameros hayan tenido la oportunidad de unirse a sus moleculas diana, los fotoaptameros se fotoactivan, y el soporte solido se lava para eliminar cualquier molecula no espedficamente unida. Pueden usarse condiciones de lavado agresivas, ya que las moleculas diana que estan unidas a los fotoaptameros no se eliminan generalmente, debido a los enlaces covalentes creados por el (los) grupo(s) funcional(es) fotoactivado(s) en los fotoaptameros. De este modo, el ensayo permite una determinacion de la ausencia, presencia, cantidad y/o concentracion de las moleculas diana en la muestra de ensayo.
En ambos de estos formatos de ensayo, los aptameros se inmovilizan sobre el soporte solido antes de ponerse en contacto con la muestra. En ciertas circunstancias, sin embargo, la inmovilizacion de los aptameros antes del contacto con la muestra puede no proporcionar un ensayo optimo. Por ejemplo, la pre-inmovilizacion de los aptameros puede producir una mezcla ineficiente de los aptameros con las moleculas diana sobre la superficie del soporte solido, conduciendo quizas a tiempos de reaction largos y, por tanto, periodos de incubation prolongados para permitir la eficiente union de los aptameros a sus moleculas diana. Ademas, cuando se emplean fotoaptameros en el ensayo y dependiendo del material utilizado como soporte solido, el soporte solido puede tender a dispersar o absorber la luz usada para efectuar la formation de enlaces covalentes entre los fotoaptameros y sus moleculas diana. Ademas, dependiendo del metodo empleado, la deteccion de moleculas diana unidas a sus aptameros puede estar sujeta a imprecision, ya que la superficie del soporte solido tambien puede estar expuesta a y ser afectada por cualquier agente de marcado que se use. Finalmente, la inmovilizacion de los aptameros sobre el soporte solido generalmente implica una etapa de preparation de aptameros (es decir, la inmovilizacion) antes de la exposition de los aptameros a la muestra, y esta etapa de preparacion puede afectar la actividad o funcionalidad de los aptameros. El documento US2003/0219801 desvela metodos de identification de moleculas diana en una muestra biologica mediante el uso de aptameros disenados para unirse a moleculas diana espedficas e hibridando una subsecuencia de acido nucleico del aptamero con una matriz de acido nucleico.
Por consiguiente, existe la necesidad de metodos, dispositivos, reactivos y kits que proporcionen ensayos de alta sensibilidad para la deteccion y/o cuantificacion de moleculas diana en una muestra de ensayo optimizando las condiciones que afectan a uno o mas de los siguientes: (1) la actividad de aptameros, (2) la eficiencia de lograr equilibrios de union para complejos aptamero-molecula diana, (3) la formacion de enlace(s) covalente(s) entre un aptamero y su molecula diana, (4) la elimination de componentes de muestras externos y el exceso de aptameros,
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(5) disociacion del complejo de afinidad formado mediante el uso de aptamero de constante de disociacion lenta, y
(6) la detection de complejos aptamero-molecula diana.
Sumario
La presente divulgation incluye metodos, dispositivos, reactivos y kits para la deteccion y/o la cuantificacion de una o mas moleculas diana que pueden estar presentes en una muestra de ensayo. Mas especificamente, la divulgacion proporciona metodos para la purification de complejos de afinidad por aptamero (o complejos covalentes de aptamero), eliminando tanto la diana libre como los aptameros libres de los complejos de afinidad por aptamero (o complejos covalentes de aptamero), eliminando asi posibles fuentes de ruido en el ensayo. La presente divulgacion tambien proporciona ensayos basados en aptameros y fotoaptameros para la cuantificacion de molecula diana en los que el aptamero (o fotoaptamero) puede separarse del complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de fotoaptamero) para la deteccion final usando cualquier metodo de deteccion de acidos nucleicos adecuado. La divulgacion tambien describe construcciones de aptamero que facilitan la separation de los componentes del ensayo del complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de fotoaptamero) y permiten el aislamiento del aptamero para la deteccion y/o cuantificacion. La divulgacion tambien describe metodos, dispositivos, kits y reactivos que ofrecen sensibilidad y especificidad mejoradas empleando aptameros que tienen constantes de disociacion lentas de sus dianas y eficiencias de union mejoradas. La presente divulgacion tambien proporciona metodos, dispositivos, kits y reactivos para el analisis multiple de una muestra de ensayo, en los que multiples dianas en la muestra de ensayo pueden detectarse y/o cuantificarse simultaneamente. Por ultimo , estos metodos y reactivos permiten la conversion de una concentration de diana (por ejemplo, una concentration de proteina diana en una muestra de ensayo) en una concentracion de acido nucleico que puede detectarse y cuantificarse por cualquiera de una amplia variedad de metodos de deteccion y cuantificacion de acidos nucleicos. Ademas, una vez la concentracion de diana se ha convertido eficazmente en una concentracion de acido nucleico correspondiente, pueden entonces emplearse etapas de amplificacion y de deteccion de acidos nucleicos estandar para aumentar la senal. Finalmente, la presente divulgacion proporciona metodos para el analisis multiple de una muestra de ensayo. Los metodos segun la presente divulgacion pueden realizarse in vitro.
Ensayo de afinidad de captura unica. En una realization, una muestra de ensayo se pone en contacto con un aptamero que tiene una afinidad especifica por una molecula diana. Si la muestra de ensayo contiene la molecula diana, se formara un complejo de afinidad por aptamero en la muestra de ensayo. En una realizacion, una marca se une a la molecula diana del complejo de afinidad por aptamero (observese que la marca se disena de forma que pueda unirse a la diana de un modo que no altere el complejo de afinidad por aptamero). En otra realizacion, la marca se une a la diana antes de la formation del complejo de afinidad por aptamero. El complejo de afinidad por aptamero marcado se captura a continuation sobre un soporte solido. La union se lleva a cabo poniendo en contacto el soporte solido con el complejo de afinidad por aptamero y dejando que la marca se asocie tanto directa como indirectamente con un agente de captura apropiado que esta unido al soporte solido. El complejo de afinidad por aptamero que se ha asociado al agente de captura sobre el soporte solido se separa del resto de la mezcla de muestra de ensayo, eliminando asi cualquier aptamero libre. Los aptameros que son complejados con la diana en el complejo de afinidad por aptamero pueden ser liberados del soporte solido por disociacion del complejo de afinidad por aptamero. Finalmente, los aptameros liberados pueden detectarse y/o cuantificarse usando cualquiera de varios metodos de deteccion de acidos nucleicos adecuados, que incluyen, pero no se limitan a, espectrometria de masas, el metodo de ensayo Invader, un chip de acido nucleico, reaction en cadena de la polimerasa cuantitativa (Q-PCR), y similares. En algunas realizaciones, que dependen de los metodos de deteccion de acidos nucleicos particulares usados, los aptameros pueden detectarse mientras que todavia una parte del complejo de afinidad por aptamero.
Ensayo de afinidad de captura doble. En otra realizacion, una muestra de ensayo se pone en contacto con un aptamero que incluye una primera marca separable y tiene una afinidad especifica por una molecula diana. Si la muestra de ensayo contiene la molecula diana, se formara un complejo de afinidad por aptamero en la muestra de ensayo. El complejo de afinidad por aptamero se captura sobre un primer soporte solido. La union se lleva a cabo poniendo en contacto un primer soporte solido con el complejo de afinidad por aptamero y dejando que la primera marca separable incluida en el aptamero se disocie, tanto directa como indirectamente, con un primer agente de captura apropiado que esta unido al primer soporte solido. Observese que ademas de complejos de afinidad por aptamero, el aptamero sin complejar tambien se unira al primer soporte solido. El complejo de afinidad por aptamero y el aptamero sin complejar que se ha asociado a la sonda sobre el soporte solido se separa entonces del resto de la mezcla, eliminando asi la diana libre y toda la otra materia sin complejar en la muestra de ensayo. Tras la separacion, el complejo de afinidad por aptamero (junto con cualquier aptamero sin complejar) se libera del primer soporte solido usando un metodo apropiado para la primera marca separable particular que se emplea. Una segunda marca (que puede ser igual o diferente de la primera marca separable) se une a la molecula diana del complejo de afinidad por aptamero (observese que la segunda marca se disena de forma que pueda unirse a la diana de un modo que no altere el complejo de afinidad por aptamero). El complejo de afinidad por aptamero se captura sobre un segundo soporte solido dejando que la segunda marca se asocie tanto directa como indirectamente con un segundo agente de captura apropiado que esta unido a un segundo soporte solido. El complejo de afinidad por aptamero que se ha asociado a la sonda sobre el soporte solido se separa del resto de la mezcla, eliminando asi cualquier aptamero libre. Los aptameros que son complejados con la diana en el complejo de afinidad por aptamero pueden ser liberados del soporte solido por disociacion del complejo de afinidad por
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aptamero. Finalmente, los aptameros que han sido liberados del complejo de afinidad por aptamero pueden detectarse y/o cuantificarse usando cualquiera de varios metodos de acidos nucleicos adecuados, que incluyen, pero no se limitan a, espectrometria de masas, el metodo de ensayo Invader, un chip de ADN, reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa (Q-PCR), y similares. En algunas realizaciones, la diana puede hacerse reaccionar con la segunda marca mientras que el complejo de afinidad por aptamero esta todavia inmovilizado al primer soporte solido. El anadir la segunda marca despues de la etapa de separacion elimina el marcado de moleculas diana que no son parte de un complejo de afinidad por aptamero. En algunas realizaciones, donde se usa un metodo de deteccion de acidos nucleicos, los aptameros pueden detectarse mientras que todavia una parte del complejo de afinidad por aptamero.
Ensayo de fotorreticulacion por captura unica. En otra realizacion (el "ensayo de fotorreticulacion por captura unica de base"), una muestra de ensayo se pone en contacto con un fotoaptamero que tiene una afinidad especifica por una molecula diana. Si la muestra de ensayo contiene la molecula diana, se formara un complejo de afinidad por fotoaptamero en la muestra de ensayo. El complejo de afinidad por aptamero se convierte en un complejo covalente de aptamero by la excitacion apropiada del grupo de fotorreticulacion. Una marca se une a la molecula diana del complejo covalente de aptamero (observese que la marca se disena de forma que pueda unirse a la diana de un modo que no altere el complejo covalente de aptamero). El complejo covalente de aptamero se captura sobre un soporte solido. La union se lleva a cabo poniendo en contacto el soporte solido con el complejo covalente de aptamero y dejando que la marca se asocie tanto directa como indirectamente con un agente de captura apropiado que esta unido al soporte solido. El complejo covalente de aptamero que se ha asociado al agente de captura sobre el soporte solido se separa del resto de la mezcla de muestra de ensayo, eliminando asi cualquier fotoaptamero libre. El fotoaptamero que es parte del complejo covalente de aptamero puede detectarse y/o cuantificarse (mientras que todavia esta unido al soporte solido) usando cualquiera de varios metodos, que incluyen, pero no se limitan a, el metodo de ensayo Invader, reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa (Q-PCR), y similares.
En otra realizacion, el ensayo de fotorreticulacion por captura unica descrito anteriormente se modifica de forma que, antes de la deteccion del fotoaptamero, se use una etapa de amplificacion de acido nucleico tal como, por ejemplo, reaccion en cadena de la polimerasa, para crear una o mas copias de los fotoaptameros que son una parte de los complejos covalentes de aptamero que estan unidos al soporte solido. Estas copias de los fotoaptameros pueden entonces liberarse y posteriormente detectarse y/o cuantificarse usando cualquiera de varios metodos adecuados, que incluyen, pero no se limitan a, espectrometria de masas, el metodo de ensayo Invader, un chip de ADN, reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa (Q-PCR), y similares.
En otra realizacion del ensayo de fotorreticulacion por captura unica, el grupo de fotorreticulacion del fotoaptamero se une al aptamero mediante un conector escindible. En una realizacion, este conector escindible es un conector fotoescindible, pero puede ser un conector quimicamente escindible o cualquier otro conector escindible que pueda escindirse para liberar la molecula diana de la marca en cualquier momento deseable en el ensayo. En esta realizacion, el ensayo de fotorreticulacion por captura unica de base descrito anteriormente se modifica de forma que, antes de la deteccion del fotoaptamero, el conector escindible se use para liberar el fotoaptamero del complejo covalente de fotoaptamero que esta unido al soporte solido. Los aptameros liberados pueden detectarse y/o cuantificarse usando cualquiera de varios metodos adecuados, que incluyen, pero no se limitan a, espectrometria de masas, el metodo de ensayo Invader, un chip de ADN, reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa (Q-PCR), y similares.
En otra realizacion mas del ensayo de fotorreticulacion por captura unica, la marca que se une a la molecula diana se une mediante un conector escindible. En una realizacion, este conector escindible es un conector fotoescindible. En otras realizaciones de este ensayo, la marca se une mediante un conector quimicamente escindible o cualquier otro conector escindible adecuado que pueda escindirse para liberar la molecula diana de la marca en cualquier momento deseable en el ensayo. En esta realizacion, el ensayo de fotorreticulacion por captura unica descrito anteriormente se modifica de forma que, antes de la deteccion del fotoaptamero, el conector escindible se use para liberar el complejo covalente de aptamero del soporte solido. El complejo covalente de aptamero liberado puede detectarse y/o cuantificarse usando cualquiera de varios metodos adecuados, que incluyen, pero no se limitan a, espectrometria de masas, el metodo de ensayo Invader, un chip de ADN, reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa (Q-PCR), y similares.
Ensayo de fotorreticulacion por captura doble. En otra realizacion (el "ensayo de fotorreticulacion por captura doble de base"), una muestra de ensayo se pone en contacto con un fotoaptamero que contiene una primera marca separable y que tiene una afinidad especifica por una molecula diana. Si la muestra de ensayo contiene la molecula diana, se formara un complejo de afinidad por fotoaptamero en la muestra de ensayo. El complejo de afinidad por fotoaptamero se convierte en un complejo covalente de aptamero por la excitacion apropiada del grupo de fotorreticulacion. El complejo covalente de aptamero se captura sobre un primer soporte solido. La union se lleva a cabo poniendo en contacto un primer soporte solido con el complejo covalente de aptamero y dejando que la primera etiqueta separable incluida en el fotoaptamero se asocie tanto directa como indirectamente con un primer agente de captura apropiado unido al primer soporte solido. Observese que ademas de complejos covalentes de fotoaptamero, tambien pueden unirse fotoaptameros sin complejar al soporte solido. El complejo covalente de aptamero y el aptamero sin complejar que se ha asociado a la sonda sobre el soporte solido se separa del resto de
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la mezcla, eliminando asi la diana libre y toda la otra materia sin complejar en la muestra de ensayo. Tras la separacion, el complejo covalente de fotoaptamero (junto con cualquier fotoaptamero sin complejar) se libera del soporte solido usando un metodo apropiados para la primera marca separable particular que se emplea. Una segunda marca se une a la molecula diana del complejo covalente de aptamero (observese que la segunda marca se disena de forma que pueda unirse a la diana de un modo que no altere el complejo covalente de aptamero). El complejo covalente de aptamero se captura sobre un segundo soporte solido. La union se lleva a cabo poniendo en contacto el segundo soporte solido con el complejo covalente de aptamero y dejando que la segunda marca se asocie tanto directa como indirectamente con un segundo agente de captura apropiado unido al segundo soporte solido. El complejo covalente de aptamero que se ha asociado al segundo agente de captura sobre el soporte solido se separa del resto de la mezcla, eliminando asi cualquier fotoaptamero libre. El fotoaptamero que es parte del complejo covalente de aptamero puede detectarse y/o cuantificarse (mientras que todavia este unido al soporte solido) usando cualquiera de varios metodos adecuados, que incluyen, pero no se limitan a, el metodo de ensayo Invader, reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa (Q-PCR), y similares.
En otra realizacion, el ensayo de fotorreticulacion por captura doble descrito anteriormente se modifica de forma que, antes de la deteccion, se use una etapa de amplificacion de acidos nucleicos tal como, por ejemplo, reaccion en cadena de la polimerasa, para crear una o mas copias de los fotoaptameros que son una parte del complejo covalente de aptamero que esta unido al soporte solido. Estas copias del fotoaptamero pueden ser liberadas y posteriormente detectarse y/o cuantificarse usando cualquiera de varios metodos adecuados, que incluyen, pero no se limitan a, espectrometria de masas, el metodo de ensayo Invader, un chip de ADN, reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa (Q-PCR), y similares.
En otra realizacion, el ensayo de fotorreticulacion por captura doble descrito anteriormente se modifica de forma que el grupo de fotorreticulacion del fotoaptamero este unida al aptamero mediante un conector escindible. En una realizacion, este conector escindible es un conector fotoescindible. En otras realizaciones de este ensayo, el grupo de fotorreticulacion del fotoaptamero se une al aptamero mediante un conector quimicamente escindible o cualquier otro conector escindible adecuado que pueda escindirse para liberar el grupo de fotorreticulacion del complejo covalente de fotoaptamero en cualquier momento deseable en el ensayo. En esta realizacion, el ensayo de fotorreticulacion por captura doble descrito anteriormente se modifica de forma que, antes de la deteccion del fotoaptamero, el conector escindible se use para liberar el fotoaptamero del complejo covalente de fotoaptamero que esta unido al soporte solido. Los fotoaptameros liberados pueden detectarse y/o cuantificarse usando cualquiera de varios metodos adecuados, que incluyen, pero no se limitan a, espectrometria de masas, el metodo de ensayo Invader, un chip de ADN, reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa (Q-PCR), y similares.
En otra realizacion mas en el ensayo de fotorreticulacion por captura doble, la marca que se une a la molecula diana se une mediante un conector escindible. En una realizacion, este conector escindible es un conector fotoescindible. En otras realizaciones de este ensayo, la marca se une mediante un conector quimicamente escindible o cualquier otro conector escindible adecuado que pueda escindirse para liberar la molecula diana de la marca en cualquier momento deseable en el ensayo. En esta realizacion, el ensayo de fotorreticulacion por captura doble descrito anteriormente se modifica de forma que, antes de la deteccion del fotoaptamero, el conector escindible se use para liberar el complejo covalente de fotoaptamero del soporte solido. El complejo covalente de fotoaptamero liberado puede detectarse y/o cuantificarse usando cualquiera de varios metodos adecuados, que incluyen, pero no se limitan a, espectrometria de masas, el metodo de ensayo Invader, un chip de ADN, reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa (Q-PCR), y similares.
Exposition cinetica. En otra realizacion, puede usarse una exposition cinetica para aumentar la especificidad y sensibilidad de los ensayos desvelados en el presente documento. La exposicion cinetica, descrito por primera vez en los documentos US2007/0166741 y US2007/0166740, proporciona el uso de constantes de disociacion relativamente larga de complejos aptamero-diana especificos con respecto a complejos no especificos para aumentar la especificidad de ciertos ensayos. Ademas, el documento US2009/0004667 titulado "Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates", desvela que pueden identificarse aptameros de constante de disociacion lenta empleando un proceso de enriquecimiento de constante de disociacion lenta durante el proceso SELEX y/o usando ciertos nucleotidos modificados (vease el documento US2009/0098549 titulado "Improved SELEX and PhotoSELEX" ).
Los ensayos anteriormente descritos (los ensayos de afinidad de captura unica, los ensayos de afinidad de captura doble, el ensayo de fotorreticulacion por captura unica y el ensayo de fotorreticulacion por captura doble) pueden cada uno mejorarse mediante la incorporation de una exposicion cinetica. Para fines de ilustracion solo, lo siguiente describe como una exposicion cinetica puede anadirse a realizaciones seleccionadas del ensayo de afinidad de captura doble y el ensayo de fotorreticulacion por captura doble. Debe entenderse que una exposicion cinetica puede anadirse a cualquiera de otros ensayos y metodos descritos en el presente documento de una manera similar. Debe entenderse adicionalmente que la exposicion cinetica puede anadirse en cualquier momento adecuado en cualquiera de los ensayos y metodos descritos, ademas de los sitios (etapas) indicados en las diversas realizaciones descritas en el presente documento.
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En una realizacion, una exposicion cinetica se inserta en el ensayo de afinidad de captura doble despues de la etapa en la que el complejo de afinidad por aptamero y el aptamero sin complejar que se ha asociado a la sonda sobre el primer soporte solido se separa del resto de la mezcla y antes de la etapa en la que el aptamero en el complejo de afinidad por aptamero es tanto liberado como directamente detectado o cuantificado. En una realizacion, la exposicion cinetica se realiza despues de que el complejo de afinidad por aptamero se libere del primer soporte solido. En esta realizacion, la exposicion cinetica se realiza liberando el complejo de afinidad por aptamero en un tampon que contiene una alta concentracion de un competidor y posteriormente incubando los complejos de afinidad por aptamero en la solucion de competidor durante un tiempo inferior o igual a la semivida de disociacion del complejo de afinidad por aptamero.
En otra realizacion, una exposicion cinetica se inserta en el ensayo de fotorreticulacion por captura doble despues de la formation del complejo de afinidad por aptamero y antes de la etapa de reticulation. En una realizacion, la exposicion cinetica se realiza anadiendo un competidor a la mezcla que contiene el complejo de afinidad por aptamero y posteriormente incubando los complejos de afinidad por aptamero en la solucion de competidor durante un tiempo inferior o igual a la semivida de disociacion del complejo de afinidad por aptamero.
Metodos de deteccion y cuantificacion. Como se ha mencionado anteriormente, es posible detectar el complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero en el caso de los ensayos de fotorreticulacion) empleando varias tecnicas de deteccion de acidos nucleicos diferentes, que incluye espectrometria de masas, el ensayo Invader, chips de ADN, metodos de PCR cuantitativa, y similares.
En una realizacion, el complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero) se detecta y/o cuantifica usando un chip de ADN. En esta realizacion, el complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero) que se ha asociado al soporte solido se eluye y se hibrida con una secuencia de sonda complementaria que se ha impreso sobre un chip de ADN. En una realizacion, la secuencia de sonda complementaria es complementaria al aptamero entero. En otra realizacion, la secuencia de sonda complementaria es complementaria a solo una portion del aptamero. En otra realizacion, la sonda es complementaria a una secuencia anadida al aptamero con el fin de hibridacion. Con el fin de detectar el aptamero hibridado (o fotoaptamero) sobre el chip de ADN, puede introducirse una etiqueta. En una realizacion, la etiqueta se incorpora en el aptamero en el momento en el que el aptamero (o fotoaptamero) se sintetiza. Por ejemplo, puede incorporarse un colorante fluorescente en un aptamero quimicamente (o enzimaticamente) sintetizado. En una realizacion, una etiqueta se anade al aptamero durante la sintesis del aptamero. En otras realizaciones, una etiqueta se anade al aptamero en cualquier momento antes, durante o despues del ensayo. En otra realizacion, pueden usarse tecnicas de amplification de acidos nucleicos tales como PCR para amplificar la poblacion de aptameros (o fotoaptameros). En este caso, una etiqueta tambien puede incorporarse como parte de la etapa de amplificacion.
En otra realizacion, el complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero) se detecta y/o cuantifica usando espectrometria de masas. En esta realizacion, el complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero) que se ha asociado al soporte solido se eluye y analiza usando espectrometria de masas, que produce un espectro de picos que puede usarse para identificar, y por tanto detectar, la molecula diana. Una vez se ha detectado la molecula diana, opcionalmente tambien puede cuantificarse por cualquier tecnica adecuada. En una realizacion, donde la molecula diana es una proteina o polipeptido, antes de usar espectrometria de masas para analizar el complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero), el complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero) puede digerirse con enzimas proteasas, tales como, por ejemplo, proteinasa K o tripsina, para producir fragmentos de la molecula diana unida que pueden usarse para identificar la molecula diana, y asi permitir la deteccion y cuantificacion opcional de la molecula diana.
En otra realizacion, el complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero) se detecta y/o cuantifica usando Q-PCR. Como se ha mencionado anteriormente, esto puede hacerse tanto mientras que el complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero) esta unido al soporte solido como despues de liberarse del soporte solido. El complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero) se cuantifica realizando PCR y determinando, tanto directa como indirectamente, la cantidad o concentracion de aptamero que se habia unido a su molecula diana en la muestra de ensayo. La cantidad o concentracion de la molecula diana en la muestra de ensayo es generalmente directamente proporcional a la cantidad o concentracion del aptamero cuantificado usando Q-PCr. Un metodo a modo de ejemplo que puede emplearse para cuantificar un complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero) de este modo es el ensayo TaqMan® (PE Biosystems, Foster City, Calif.; vease tambien la patente de EE.Uu. N.° 5.210.015).
En otra realizacion, el aptamero se disocia opcionalmente de su molecula diana correspondiente, antes de la deteccion y/o cuantificacion. El aptamero libre puede detectarse y medirse usando cualquier metodo adecuado conocido para la deteccion y/o cuantificacion de acidos nucleicos.
Ensayos multiples. En otra realizacion, los ensayos y metodos descritos anteriormente se usan para detectar y/o cuantificar dos o mas dianas. En una realizacion, se usan multiples aptameros en el ensayo de afinidad de captura doble para cuantificar y/o detectar multiples dianas. Despues de la liberation final de los aptameros de los complejos de afinidad por aptamero, cada uno de los aptameros puede entonces detectarse usando metodos adecuados para
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la deteccion multiple de acidos nucleicos. En un metodo, se usa un chip de ADN multiple para detectar y/o cuantificar los aptameros. Cualquiera de los ensayos desvelados en el presente documento puede realizarse en un modo multiple para detectar multiples dianas. Debido a que no hay limites inherentes a la escala del multiplexado, estos ensayos multiples pueden usarse para detectar, por ejemplo, 2 o mas dianas, 10 o mas dianas, 25 o mas dianas, 50 o mas dianas, 100 o mas dianas, 250 o mas dianas, 500 o mas dianas, o 1000 o mas dianas.
Reactivos y kits. En una realizacion, los kits para las diversas aplicaciones de deteccion, que incluyen, sin limitacion, kits de diagnostico, kits de descubrimiento de biomarcadores, kits de ensayo ambiental, kit de deteccion de riesgos biologicos o armas biologicas y kits para detectar dianas en aplicaciones de ciencias de la vida y de quimica analitica, pueden prepararse basandose en los metodos desvelados en el presente documento.
Breve descripcion de las figuras
Las FIGS. 1A y 1B ilustran metodos a modo de ejemplo para la deteccion y/o cuantificacion de una o mas moleculas diana que pueden estar presentes en una muestra de ensayo.
Las FIGS. 2A y 2b ilustran metodos a modo de ejemplo para la deteccion y/o cuantificacion de una o mas moleculas diana que pueden estar presentes en una muestra de ensayo.
Las FIGS. 3A-L ilustran construcciones de aptamero a modo de ejemplo para su uso con los ensayos descritos en el presente documento.
La FIG. 4 presenta una lista de mas de 500 dianas para las que se han producido aptameros. Muchos de estos aptameros se han disenado para tener constantes de disociacion lentas de su diana respectiva.
Las FIGS. 5A ilustran un ejemplo de una marca de hibridacion. Las FIG. 5B a 5D ilustran ejemplos de construcciones de aptamero que incluyen un elemento escindible o separable, una marca (por ejemplo, biotina), un espaciador y una etiqueta (por ejemplo, Cy3).
La FIG. 6 ilustra las construcciones de aptamero y de cebador usadas en los metodos de ensayo descritos en la presente divulgacion. Cy3 representa un colorante de cianina 3, B una biotina, PC un conector fotoescindible, ANA un grupo de reticulacion fotorreactivo, (AB)2 un par de restos de biotina separados por residuos dA, y (T)8 un conector poli dT. Las construcciones de cebador son complementarias a la region fija de 3' completa de las construcciones de aptamero. FIG. 6A. Construccion de aptamero usada en el protocolo del ensayo de afinidad de captura unica. FIG. 6B. Construccion de aptamero usada en el protocolo del ensayo de afinidad de captura doble. FIG. 6C. Construccion de aptamero usada en el protocolo del ensayo de reticulacion por captura unica. FIG. 6D. Construccion de aptamero usada en el protocolo del ensayo de reticulacion por captura doble.
Las FIGS. 7A, 7B y 7C ilustran curvas de respuesta a dosis (URF frente al logaritmo de la concentracion de proteina diana de entrada) para la deteccion de proteinas diana en tampon usando el protocolo del ensayo de afinidad con deteccion por micromatriz. Se representan valores de control no de proteina por duplicado en el marco del eje y. Las lineas continuas representan un ajuste sigmoide a traves de los puntos de datos. Las lineas discontinuas representan dos desviaciones estandar de los valores no de proteina por duplicado. FIG. 7A. Proteina diana bFGF. FIG. 7B. Proteina diana FGF7. FIG. 7C. Proteina diana linfotactina.
La FIG. 8 ilustra las curvas de respuesta a dosis para tres mediciones por duplicado de la proteina diana linfotactina en tampon usando el protocolo de ensayo por afinidad con deteccion por micromatriz. Se representan los valores de control no de proteina por duplicado en el marco del eje y. Las lineas continuas representan ajustes sigmoides a traves de los puntos de datos para cada uno de los tres duplicados.
La FIG. 9 ilustra la curva de respuesta a dosis (URF frente al logaritmo de la concentracion de proteina diana de entrada) para la deteccion de la proteina diana linfotactina en 10 % de plasma humano usando el protocolo de ensayo de afinidad y deteccion por micromatriz. Se representan los valores de control no de proteina por duplicado en el marco del eje y y en circulo. La linea continua representa un ajuste sigmoide a traves de los puntos de datos.
La FIG. 10 ilustra la curva de respuesta a dosis (URF frente al logaritmo de la concentracion de proteina diana de entrada) para la deteccion de la proteina diana linfotactina en 10 % de sangre humana completa usando el protocolo de ensayo de afinidad y deteccion por micromatriz. Se representan los valores de control no de proteina por duplicado en el marco del eje y y en circulo. La linea continua representa un ajuste sigmoide a traves de los puntos de datos.
La FIG. 11 ilustra la curva de respuesta a dosis (URF frente al logaritmo de la concentracion de proteina diana de entrada) para la deteccion de la proteina diana angiogenina en tampon usando el protocolo del ensayo de fotorreticulacion con deteccion por micromatriz. La linea continua representa un ajuste sigmoide a traves de los puntos de datos. Estan en circulo cuatro puntos de datos no de proteina por duplicado.
La FIG. 12 ilustra la curva de respuesta a dosis (concentracion de aptamero detectada frente a la concentracion de proteina diana de entrada) para la deteccion de angiogenina en tampon usando el protocolo de ensayo de afinidad con deteccion por Q-PCR. Se indican cuatro mediciones de no proteina por duplicado en el eje y como circulos blancos.
Las FIGS. 13A a 13C ilustran curvas de respuesta a dosis para aptameros de constante de disociacion lenta frente a aptameros tradicionales para tres dianas diferentes.
La FIG. 14 ilustra la disposicion de muestras para un estudio de reproducibilidad del ensayo.
La FIG. 15 ilustra los CV del estudio de muestras reunidas y no reunidas.
La FIG. 16 presenta las modificaciones de bases de nucleotidos tratadas en la presente divulgacion. Los grupos R que pueden usarse se describen ademas de los conectores (X) que pueden usarse entre el punto de
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union de nucleotidos y se muestra el grupo R. Tambien se indican las posiciones para la modificacion de los nucleotidos.
Descripcion detallada
La practica de la presente invencion emplea, a menos que se indique lo contrario, metodos convencionales de quimica, microbiolog^a, biolog^a molecular y tecnicas de ADN recombinante dentro del nivel de experiencia en la materia. Tales tecnicas se explican completamente en la bibliografia. Vease, por ejemplo, Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Edicion actual); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Edicion actual); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Edicion actual); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., Edicion actual).
Todas las publicaciones, documentos de patente publicados y solicitudes de patente citados en esta memoria descriptiva son indicativos del nivel de experiencia en la(s) materia(s) al que se refiere la invencion.
La presente divulgacion incluye metodos, dispositivos, reactivos y kits mejorados para la deteccion y/o cuantificacion de una o mas moleculas diana que pueden estar presentes en una muestra de ensayo. Los metodos, dispositivos, reactivos y kits desvelados proporcionan ensayos de alta sensibilidad para la deteccion y/o cuantificacion de moleculas diana en una muestra de ensayo optimizando las condiciones que afectan a uno o mas de (1) la actividad de aptameros, (2) la eficiencia de lograr equilibrios de union para complejos aptamero-molecula diana, (3) la formacion de enlace(s) covalente(s) entre un aptamero y su molecula diana, (4) la eliminacion de reactivos y componentes de muestra en exceso, (5) el uso de aptameros de constante de disociacion lenta, (6) construcciones de aptamero deseables, y (7) la deteccion de complejos aptamero-molecula diana.
Es de notar que, a menos que se especifique de otro modo en una realizacion particular, los metodos para la deteccion y/o cuantificacion de una molecula diana descritos en el presente documento son independientes del orden especifico en el que se describen las etapas. Para fines de ilustracion, los metodos se describen como una secuencia especifica de etapas; sin embargo, debe entenderse que es posible cualquier numero de permutaciones de la secuencia especificada de etapas, mientras que se lleve a cabo el objetivo del ensayo particular que se describe. Dicho de otra forma, las etapas citadas en cualquiera de los metodos desvelados pueden realizarse en cualquier orden factible, y los metodos de la divulgacion no se limitan a ningun orden particular presentado en cualquiera de las realizaciones descritas, los ejemplos, o las reivindicaciones adjuntas. Ademas, por comodidad y facilidad de presentacion, los diversos metodos se describen con referencia a una unica molecula diana y un unico aptamero. Sin embargo, debe entenderse que cualquiera de los metodos descritos puede realizarse en un formato multiple que puede proporcionar la deteccion y/o cuantificacion simultanea de multiples dianas usando multiples aptameros, de forma que, por ejemplo, multiples moleculas diana en una muestra de ensayo puedan detectarse y/o cuantificarse poniendo en contacto la muestra de ensayo con multiples aptameros, en los que cada aptamero tiene una afinidad especifica por una molecula diana particular (es decir, en un formato multiple).
Con referencia a las FIGS. 1A y 1B, la presencia de una molecula diana en una muestra de ensayo se detecta y/o cuantifica poniendo primero en contacto una muestra de ensayo con un aptamero que tiene una afinidad especifica por una molecula diana. El metodo puede aplicarse a la deteccion y/o cuantificacion de varias dianas especificas por el uso del numero correspondiente de aptameros especificos, es decir, un formato multiple. Se presenta una unica discusion objetivo solo para facilitar la presentacion. Se forma un complejo de afinidad por aptamero por el aptamero que se une a su molecula diana si la muestra de ensayo contiene la molecula diana. El complejo de afinidad por aptamero se convierte opcionalmente, usando un metodo apropiado para el aptamero que se emplea, en un complejo covalente de aptamero donde el aptamero esta covalentemente unido a su molecula diana. Entonces se emplea una etapa de separation para eliminar el aptamero libre. El complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero) se detecta y/o cuantifica. Pueden usarse varios metodos de deteccion diferentes para detectar el complejo de afinidad por aptamero, por ejemplo, ensayos de hibridacion, espectroscopia de masas, o Q- PCR.
Como se trata anteriormente, los ensayos descritos aqui se han agrupado para fines de ilustracion en 4 categorias: Ensayos de afinidad de captura unica; ensayos de afinidad de captura doble, ensayos de fotorreticulacion por captura unica; y ensayos de fotorreticulacion por captura doble. Sin embargo, debe entenderse que se contemplan otras agrupaciones, combinaciones y orden de etapas y todos entran dentro del alcance de la divulgacion.
Las cuatro categorias de ensayo comparten una etapa comun en la que los complejos aptamero-diana se separan del aptamero libre (o fotoaptamero libre) por una etapa de separacion que captura la proteina (diana). Esta etapa de separacion se denomina en el presente documento la separacion de "Captura 2". Los dos ensayos de "captura doble" comparten una cosa en comun adicional en la que los complejos aptamero-diana se separan de la diana libre por una etapa de separacion que captura el aptamero. Esta ultima etapa de separacion se denomina en el presente documento la separacion de "Captura 1". Metodos de implementation de cada una de estas etapas se describen en detalle mas adelante.
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Se desvela ademas el uso de una exposicion cinetica en cada una de estas categorias de ensayo. Tradicionalmente, la especificidad en la deteccion de una diana deseada ha mejorado mediante el uso de un ensayo de sandwich en el que se usan dos reactivos de captura. Se ha observado sorprendentemente que la aplicacion de una exposicion cinetica a un procedimiento de deteccion que emplea aptameros elimina la necesidad de potenciar la especificidad introduciendo un segundo reactivo de captura. Si se introduce una exposicion cinetica, es poco probable que se vuelvan a formar complejos no especificos entre el aptamero y cualquier molecula no diana tras su disociacion. Como los complejos no especificos generalmente se disocian mas rapidamente que un complejo de afinidad por aptamero, una exposicion cinetica reduce la verosimilitud de que un aptamero participe en un complejo no especifico con una no diana. Una exposicion cinetica eficaz puede proporcionar al ensayo especificidad adicional, mas alla de la del evento de union del aptamero inicial y cualquier interaccion covalente posterior. Asi, la exposicion cinetica ofrece un segundo determinante de especificidad en estos metodos de deteccion. Metodos de implementacion de la exposicion cinetica se describen en detalle mas adelante.
Con referencia a las FIGS. 2A (ensayo de afinidad de etapa doble) y 2B (ensayo de reticulacion de etapa doble), en un metodo a modo de ejemplo para la deteccion y/o cuantificacion de una molecula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, una muestra de ensayo se pone en contacto con un aptamero (o fotoaptamero) que incluye una primera marca y tiene una afinidad especifica por una molecula diana. Se deja que se forme un complejo de afinidad por aptamero que incluye un aptamero (o fotoaptamero) unido a su molecula diana, donde la muestra de ensayo contiene la molecula diana. En el ejemplo de fotorreticulacion (2B), el complejo de afinidad por aptamero se convierte, usando un metodo apropiado para el aptamero que se emplea, en un complejo covalente de aptamero donde el fotoaptamero esta covalentemente unido a su molecula diana. El complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero) se une a un primer soporte solido mediante un primer elemento de captura. La union se lleva a cabo poniendo en contacto el primer soporte solido con el complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero) y dejando que la marca incluida en el aptamero se asocie tanto directa como indirectamente con un primer elemento de captura que esta unido al primer soporte solido. El complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero) que se ha asociado al primer elemento de captura sobre el primer soporte solido se separa del resto de la mezcla. Tras la separation, el complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero) se libera del primer soporte solido usando un metodo apropiado para la marca particular que se emplea. Alternativamente, la marca puede unirse al aptamero mediante un resto escindible, donde tal resto escindible se escinde ahora para liberar la afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero) del primer soporte solido. Se une una segunda marca (que puede ser igual o diferente de la primera marca) a la molecula diana del complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero). Opcionalmente, puede realizarse una exposicion cinetica para aumentar la especificidad del ensayo y disminuir la senal de fondo. El complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero) se une a un segundo soporte solido. La union se lleva a cabo poniendo en contacto el segundo soporte solido con el complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero) y dejando que la segunda marca incluida en la diana se asocie tanto directa como indirectamente con un segundo elemento de captura que esta unido al segundo soporte solido. El complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero) que se ha asociado al segundo elemento de captura sobre el segundo soporte solido se separa del resto de la mezcla. El complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero) se detecta y opcionalmente se cuantifica.
En otra realization, el aptamero (o fotoaptamero) se disocia primero de su molecula diana respectiva y el aptamero libre (o fotoaptamero) se detecta y opcionalmente se cuantifica.
El complejo de afinidad por aptamero puede detectarse utilizando cualquier tecnica de deteccion de acidos nucleicos adecuada, tal como, por ejemplo, hibridacion, Q-PCR, EM, y similares. Dependiendo de que tecnica se emplee, el aptamero puede disenarse o modificarse para incluir una marca. Esto puede llevarse a cabo en el momento durante la sintesis (tanto enzimatica como quimicamente) o en cualquier momento durante el ensayo (es decir, en cualquier momento antes de la deteccion).
El metodo desvelado en el presente documento permite la deteccion de la presencia y cantidad de una molecula diana detectando el aptamero libre eluido del ensayo. Esto permite la deteccion y cuantificacion convenientes de la molecula diana, debido a la relativa simplicidad de deteccion, cuantificacion y amplification de acidos nucleicos, y proporciona ensayos de deteccion de diana que tienen una relation senal con respecto a ruido muy favorable.
Ensayos de afinidad
Ensayo de afinidad de captura unica (solo Captura 2)
En una realizacion, se realiza un ensayo de afinidad de captura unica usando un separacion de Captura 2. Este metodo funciona bien cuando la matriz de muestra no es muy compleja, de manera que otros componentes en la muestra no compiten por la marca. Tambien funciona bien para muestras en las que la diana esta presente en alto numero de copias o concentration.
Se proporcionan aptameros que tienen alta afinidad y especificidad por una molecula diana. En una realizacion, se usa la construction de aptamero ilustrada en la FIG. 6A. En esta realizacion, los aptameros se ponen en contacto
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con una muestra que puede contener una molecula diana para formar una mezcla que contiene los aptameros, la molecula diana, y opcionalmente molecula no diana. Donde la molecula diana esta presente en la muestra, se forman complejos de afinidad por aptamero. La mezcla puede incubarse opcionalmente durante un periodo de tiempo suficiente para lograr la union en equilibrio del aptamero a la molecula diana (por ejemplo, al menos aproximadamente 10 minutos, al menos aproximadamente 20 minutos, al menos aproximadamente 30 minutos).
En una realization, la mezcla puede opcionalmente someterse a una exposition cinetica. La exposition cinetica ayuda a reducir cualquier union no especifica entre el aptamero y cualquier molecula no diana presente en la muestra. En una realizacion, se anade sulfato de dextrano 10 mM y la mezcla se incuba durante aproximadamente 15 minutos. Esta y otras realizaciones de la exposicion cinetica se describen en mas detalle mas adelante.
En una realizacion, se realiza la separation de Captura 2 para eliminar el aptamero libre. En una realizacion, la mezcla que contiene complejos de afinidad por aptamero se trata con un agente que introduce una marca de captura al componente de molecula diana de los complejos de afinidad por aptamero. En otras realizaciones, la marca se introduce antes de que los aptameros se pongan en contacto con la mezcla del texto, tanto antes de la union en equilibrio como antes de la exposicion cinetica. En una realizacion, la diana es una proteina o peptido, y una marca de biotina se une a la molecula diana tratando con NHS-PEO4-biotina (este y otros metodos de marcado se describen en detalle mas adelante). La mezcla se pone entonces en contacto con un soporte solido, que tiene un elemento de captura adherido a su superficie que es capaz de unirse a la marca de captura diana. En esta realizacion, el elemento de captura sobre el soporte solido normalmente se selecciona de forma que se una a la marca de captura diana con alta afinidad y especificidad. En una realizacion, el soporte solido es perlas magneticas (tales como DynaBeads MyOne Streptavidin C1) contenidas dentro de un pocillo de una placa de microtitulacion y el elemento de captura es estreptavidina. Las perlas magneticas proporcionan un metodo conveniente para la separacion de componentes separados de la mezcla (estos y otros soportes solidos y elementos de captura se describen en detalle mas adelante). Asi, los complejos de afinidad por aptamero contenidos en la mezcla se unen al soporte solido mediante la interaction de union de la marca de captura diana y el elemento de captura. El complejo de afinidad por aptamero se separa entonces del resto de la mezcla, por ejemplo, lavando el soporte para eliminar aptameros no complejados. En una realizacion, el aptamero del complejo de afinidad por aptamero puede entonces liberarse para procesamiento adicional por uno o mas de los siguientes tratamientos: sal alta, pH alto, pH bajo o temperatura elevada. Esta y otras separaciones de Captura 2 se describen en mas detalle mas adelante.
En otra realizacion, el aptamero liberado de la separacion de Captura 2 se detecta y opcionalmente cuantifica por cualquier metodo de detection de acidos nucleicos adecuado, tal como, por ejemplo, hibridacion en chip de ADN, Q- PRC, espectroscopia de masas, y similares. Estos metodos de deteccion se describen en mas detalle mas adelante. En otra realizacion, el aptamero en el complejo de afinidad por aptamero se detecta y opcionalmente cuantifica mientras que todavia esta en contacto con el soporte solido. En una realizacion, el aptamero comprende un resto detectable para facilitar esta etapa de deteccion. El resto detectable se elige basandose en el metodo de deteccion que va a emplearse. En una realizacion, el resto detectable o etiqueta se anade al aptamero durante la sintesis o antes del ensayo. En otra realizacion, el resto detectable se anade al aptamero tanto durante el ensayo como durante la deteccion. El aptamero detectado puede entonces correlacionarse con la cantidad o concentration de diana en la muestra de ensayo original.
Ensayo de afinidad de captura doble (Captura 1 y 2)
El ensayo de afinidad de captura doble es similar al ensayo de afinidad de captura unica con la adicion de una etapa de separacion adicional. Esta etapa de separacion adicional generalmente proporciona sensibilidad y especificidad adicionales.
En una realizacion, se proporcionan aptameros que tienen alta afinidad y especificidad por una molecula diana y que tiene una primera marca separable. En otra realizacion, la primera marca separable se anade en cualquier momento en el ensayo antes de la separacion de Captura 1. En una realizacion, esta primera marca separable es una biotina fotoescindible. En una realizacion, se usa la construction de aptamero ilustrada en la FIG. 6B. Estas y otras marcas y restos escindibles y aptamero que contiene tales marcas y restos escindibles se describen en detalle mas adelante. Los aptameros se ponen en contacto con una muestra que puede contener una molecula diana para formar una mezcla que contiene el aptamero, la molecula diana, y opcionalmente molecula no diana. Donde la molecula diana esta presente en la muestra, se forman complejos aptamero-molecula diana (complejos de afinidad por aptamero). La mezcla puede opcionalmente incubarse durante un periodo de tiempo suficiente para lograr la union en equilibrio del aptamero a la molecula diana (por ejemplo, al menos aproximadamente 10 minutos, al menos aproximadamente 20 minutos, al menos aproximadamente 30 minutos).
En una realizacion, la separacion de Captura 1 se realiza para eliminar cualquier diana libre. La mezcla se pone en contacto con un primer soporte solido que tiene un elemento de captura adherido a su superficie que es capaz de unirse a la marca de captura del aptamero, preferentemente con alta afinidad y especificidad. En una realizacion, la primera marca separable es una biotina fotoescindible, el primer soporte solido es perlas de agarosa en una columna y el elemento de captura es estreptavidina. Por ejemplo, pueden usarse perlas de estreptavidina inmovilizadas de Pierce. Estos y otros soportes solidos y elementos de captura se describen en detalle mas
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adelante. Asi, los complejos de afinidad por aptamero contenidos en la mezcla se unen al primer soporte solido mediante la interaccion de union de la primera marca separable y el primer elemento de captura. Los complejos de afinidad por aptamero se separaron del resto de la mezcla, por ejemplo, lavando el primer soporte solido para eliminar moleculas no unidas.
En una realizacion, los complejos de afinidad por aptamero que siguen unidos al soporte solido se tratan entonces con un agente que introduce una segunda marca al componente de molecula diana de los complejos de afinidad por aptamero. En una realizacion, la diana es una proteina o un peptido, y la diana se biotinila tratandola con NHS- PEO4-biotina. La segunda marca introducida a la molecula diana puede ser la misma o diferente de la marca de captura del aptamero. Si la segunda marca es la misma que la primera marca, o la marca de captura del aptamero, sitios de captura libres sobre el primer soporte solido pueden bloquearse antes del inicio de esta etapa de marcado. En esta realizacion a modo de ejemplo, el primer soporte solido se lava con biotina libre antes del inicio del marcado de dianas. Los metodos de marcado, y en particular, el marcado de dianas tales como peptidos y proteinas, se describen en detalle mas adelante. En otras realizaciones, el marcado de la diana se realiza en cualquier otro momento en el ensayo antes del inicio de la separation de Captura 2 (observese que si se usa el mismo resto de marca, la diana se marca despues de que se realice la etapa de captura de la separacion de Captura 1).
Entonces, la separacion de Captura 1 se completa liberando los complejos de afinidad por aptamero del primer soporte solido. En una realizacion, la primera marca separable es un resto fotoescindible que se escinde por irradiation con una lampara de UV en condiciones que escinden > aproximadamente el 90 % de la primera marca separable. En otras realizaciones, la liberation se lleva a cabo por el metodo apropiado para el resto separable seleccionado en la primera marca separable. Los complejos de afinidad por aptamero pueden eluirse y recogerse para uso adicional en el ensayo o pueden ponerse en contacto con otro soporte solido para realizar las restantes etapas del ensayo descritas mas adelante.
En una realizacion, la mezcla puede opcionalmente someterse a una exposition cinetica. La exposition cinetica ayuda a reducir cualquier union no especifica entre aptameros y la molecula no diana. En una realizacion, se anade sulfato de dextrano 10 mM a los complejos de afinidad por aptamero, y la mezcla se incuba durante aproximadamente 15 minutos. En otra realizacion, la exposicion cinetica se inicia realizando la elucion de Captura 1 en presencia de sulfato de dextrano 10 mM. En otras realizaciones, la exposicion cinetica se realiza despues de la etapa de union en equilibrio y antes de la separacion de Captura 2. Estas y otras realizaciones de la exposicion cinetica se describen en mas detalle mas adelante.
En una realizacion, la separacion de Captura 2 se realiza para eliminar el aptamero libre. Como se ha descrito anteriormente, en una realizacion, una segunda marca usada en la separacion de Captura 2 puede anadirse a la diana mientras que el complejo de afinidad por aptamero esta todavia en contacto con el soporte solido usado en la separacion de Captura 1. En otras realizaciones, la segunda marca puede anadirse a la diana en otro momento en el ensayo antes del inicio de la separacion de Captura 2. La mezcla se pone entonces en contacto con un soporte solido, teniendo el soporte solido un elemento de captura adherido a su superficie que es capaz de unirse a la marca de captura diana, preferentemente con alta afinidad y especificidad. En una realizacion, el soporte solido es perlas magneticas (tales como DynaBeads MyOne Streptavidin C1) contenidas dentro de un pocillo de una placa de microtitulacion y el elemento de captura es estreptavidina. Las perlas magneticas proporcionan un metodo conveniente para la separacion de componentes separados de la mezcla (estos y otros soportes solidos y elementos de captura se describen en detalle mas adelante). Asi, los complejos de afinidad por aptamero contenidos en la mezcla se unen al soporte solido mediante la interaccion de union de la marca de captura diana y el elemento de captura sobre el soporte solido. El complejo de afinidad por aptamero se separa entonces del resto de la mezcla, por ejemplo, lavando el soporte para eliminar aptameros no complejados. En una realizacion, el aptamero del complejo de afinidad por aptamero puede entonces liberarse para procesamiento adicional por uno o mas de los siguientes tratamientos: sal alta, pH alto, pH bajo o temperatura elevada. Esta y otras separaciones de Captura 2 se describen en mas detalle mas adelante.
En otra realizacion, el aptamero liberado de la separacion de Captura 2 se detecta y opcionalmente cuantifica por cualquier metodo de detection de acidos nucleicos adecuado, tal como, por ejemplo, hibridacion en chip de ADN, Q- PRC, espectroscopia de masas, y similares. Estos metodos de deteccion se describen en mas detalle mas adelante. En otra realizacion, el aptamero en el complejo de afinidad por aptamero se detecta y opcionalmente cuantifica mientras que todavia esta en contacto con el soporte solido. En una realizacion, el aptamero comprende un resto detectable para facilitar esta etapa de deteccion. El resto detectable se elige basandose en el metodo de deteccion que va a emplearse. En una realizacion, el resto detectable (etiqueta) se anade al aptamero durante la sintesis o antes del ensayo. En otra realizacion, el resto detectable se anade al aptamero tanto durante el ensayo como durante la deteccion. El aptamero detectado puede correlacionarse con la cantidad o concentration de la diana en la muestra de ensayo.
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Ensayos de reticulacion
Ensayo de reticulacion de captura unica (solo Captura 2)
En una realizacion, se realiza un ensayo de reticulacion de captura unica usando una separacion de Captura 2. Este metodo funciona bien cuando la matriz de muestra no es muy compleja, de manera que otros componentes en la muestra no compiten por la marca. Tambien funciona bien para muestras en las que la diana esta presente en alto numero de copias o concentracion. En algunos casos, se proporciona beneficio adicional por el enlace covalente entre el fotoaptamero y la diana ya que puede permitir lavados mas rigurosos en las etapas despues de realizarse la reticulacion.
Se proporcionan fotoaptameros que tienen alta afinidad y especificidad por una molecula diana. En una realizacion, el resto de reticulacion del fotoaptamero se une al aptamero mediante un conector escindible. En una realizacion, el grupo de reticulacion es ANA (4-azido-2-nitro-anilina) y el grupo fotoescindible es PC Linker. En una realizacion, se usa la construccion de aptamero ilustrada en la FIG. 6C. Los fotoaptameros se ponen en contacto con una muestra que puede contener moleculas diana para formar una mezcla que contiene el aptamero-la molecula diana, y opcionalmente molecula no diana. Donde la molecula diana esta presente en la muestra, se forman complejos de (foto)afinidad por aptamero. La mezcla puede opcionalmente incubarse durante un periodo de tiempo suficiente para lograr la union en equilibrio de los aptameros y moleculas diana (por ejemplo, durante al menos aproximadamente 10 minutos, al menos aproximadamente 20 minutos, o al menos aproximadamente 30 minutos).
En una realizacion, la mezcla puede opcionalmente someterse a una exposicion cinetica. La exposicion cinetica ayuda a reducir cualquier union no especifica entre los fotoaptameros y la molecula no diana. En una realizacion, se anade sulfato de dextrano 10 mM y la mezcla se incuba durante aproximadamente 15 minutos. Esta y otras realizaciones de la exposicion cinetica se describen en mas detalle mas adelante.
Se convierten complejos de (foto)afinidad por aptamero en complejos covalentes de aptamero por irradiacion con luz a la longitud de onda apropiada. Por ejemplo, puede usarse irradiacion a aproximadamente 470 nM para reticular ANA que contiene fotoaptameros con una proteina o peptido diana.
En una realizacion, la separacion de Captura 2 se realiza para eliminar el fotoaptamero libre. En una realizacion, la mezcla que contiene el complejo covalente de aptamero se trata con un agente que introduce una marca de captura al componente de molecula diana de los complejos covalentes de aptamero. En otras realizaciones, la marca se introduce antes de que los aptameros se pongan en contacto con la muestra de ensayo, antes de la union en equilibrio o antes de la exposicion cinetica. En una realizacion, la diana es una proteina o un peptido, y se une una marca de biotina a la molecula diana mediante tratamiento con NHS-PEO4-biotina (este y otros metodos de marcado se describen en detalle mas adelante). La mezcla se pone en contacto entonces con un soporte solido, teniendo el soporte solido un elemento de captura adherido a su superficie que es capaz de unirse a la marca de captura diana, preferentemente con alta afinidad y especificidad. En una realizacion, el soporte solido es perlas magneticas (tales como DynaBeads MyOne Streptavidin C1) contenidas dentro de un pocillo de una placa de microtitulacion y el elemento de captura es estreptavidina. Las perlas magneticas proporcionan un metodo conveniente para la separacion de componentes separados de la mezcla (estos y otros soportes solidos y elementos de captura se describen en detalle mas adelante). Asi, los complejos covalentes de aptamero contenidos en la mezcla se unen al soporte solido mediante la interaccion de union de la marca de captura diana y el elemento de captura. El complejo covalente de aptamero se separa entonces del resto de la mezcla, por ejemplo, lavando el soporte para eliminar aptameros no complejados. En una realizacion, el fotoaptamero del complejo covalente de aptamero puede entonces liberarse para procesamiento adicional por un metodo apropiado para el resto escindible. Por ejemplo, para escindir PC Linker, la mezcla se irradia con una lampara de UV durante aproximadamente 20 minutos. Esta y otras separaciones de Captura 2 se describen en mas detalle mas adelante.
En otra realizacion, el fotoaptamero liberado de la separacion de Captura 2 se detecta y opcionalmente cuantifica, por cualquier metodo de deteccion de acidos nucleicos adecuado, tal como, por ejemplo, hibridacion en chip de ADN, Q-PRC, espectroscopia de masas, y similares. Estos metodos de deteccion se describen en mas detalle mas adelante. En otra realizacion, el fotoaptamero en el complejo covalente de aptamero se detecta y opcionalmente cuantifica mientras que todavia esta en contacto con el soporte solido. El fotoaptamero detectado puede correlacionarse con la cantidad o concentracion de diana en la muestra de ensayo original.
Ensayo de fotorreticulacion por captura doble (Captura 1 y 2)
El ensayo de fotorreticulacion por captura doble es similar al ensayo de fotorreticulacion por captura unica con la adicion de una etapa de separacion adicional. Esta etapa de separacion adicional generalmente proporciona sensibilidad y especificidad adicionales.
Se proporcionan fotoaptameros que tienen alta afinidad y especificidad por una molecula diana. En una realizacion, el resto de reticulacion del fotoaptamero se une al aptamero mediante un conector escindible. En una realizacion, el grupo de reticulacion es ANA (4-azido-2-nitro-anilina) y el grupo fotoescindible es PC Linker. En una realizacion, el
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fotoaptamero tambien comprende una primera marca separable. En otra realizacion, la primera marca separable se anade en cualquier momento en el ensayo antes de la separacion de Captura 1. En una realizacion, el resto de la primera marca separable es una biotina y el elemento separable es un conector de hibridacion. En una realizacion, se usa la construccion de fotoaptamero ilustrada en la FIG. 6D. El fotoaptamero se pone en contacto con una muestra que puede contener moleculas diana para formar una mezcla que contiene el aptamero, la molecula diana, y opcionalmente molecula no diana. Donde la molecula diana esta presente en la muestra, se forman complejos de afinidad por (foto)aptamero. La mezcla puede opcionalmente incubarse durante un periodo de tiempo suficiente para lograr la union en equilibrio de los aptameros y moleculas diana (por ejemplo, durante al menos aproximadamente 10 minutos, al menos aproximadamente 20 minutos, o al menos aproximadamente 30 minutos).
En una realizacion, la mezcla puede opcionalmente someterse a una exposicion cinetica. La exposicion cinetica ayuda a reducir cualquier union no especifica entre los fotoaptameros y la molecula no diana. En una realizacion particular, se anade sulfato de dextrano 10 mM y la mezcla se incuba durante aproximadamente 15 minutos. Esta y otras realizaciones de la exposicion cinetica se describen en mas detalle mas adelante.
Se convierten complejos de afinidad por (foto)aptamero en complejos covalentes de aptamero por irradiacion con luz a la longitud de onda apropiada. Por ejemplo, puede usarse irradiacion a aproximadamente 470 nM para reticular ANA que contiene fotoaptameros con una proteina diana.
En una realizacion, se realiza la separacion de Captura 1 para eliminar diana libre. La mezcla se pone en contacto con un primer soporte solido que tiene un elemento de captura adherido a su superficie que es capaz de unirse a la marca de captura del aptamero, preferentemente con alta afinidad y especificidad. En una realizacion, la primera marca separable comprende un resto de marca que es a biotina, el primer soporte solido es perlas de agarosa en una columna y el elemento de captura es estreptavidina. Por ejemplo, pueden usarse perlas de estreptavidina inmovilizadas de Pierce. Estos y otros soportes solidos y elementos de captura se describen en detalle mas adelante. Asi, los complejos covalentes de aptamero contenidos en la mezcla se unen al primer soporte solido mediante la interaccion de union de la primera marca separable y primer elemento de captura. Los complejos covalentes de aptamero se separan del resto de la mezcla, por ejemplo, lavando el primer soporte solido para eliminar moleculas no unidas.
En una realizacion, los complejos covalentes de aptamero que siguen unidos al soporte solido se tratan entonces con un agente que introduce una segunda marca al componente de molecula diana de los complejos de afinidad por aptamero, por ejemplo, biotinilacion de una molecula diana de proteina o peptido mediante tratamiento con NHS- PEO4-biotina. La segunda marca introducida a la molecula diana puede ser igual o diferente a la primera marca. Si la segunda marca es la misma que la primera marca, los sitios de captura libres sobre los primeros soportes solidos pueden bloquearse antes del inicio de esta etapa de marcado. En una realizacion, el primer soporte solido se lava con biotina libre antes del inicio del marcado de la diana. Los metodos de marcado, y en particular, el marcado de dianas tales como peptidos y proteinas, se describen en detalle mas adelante. En otras realizaciones, el marcado de la diana se realiza en cualquier otro punto en el ensayo antes del inicio de la separacion de Captura 2 (observese que si se usa el mismo resto de marcado, la diana se marca despues realizarse la etapa de captura de la separacion de Captura 1).
Entonces, la separacion de Captura 1 se completa liberando los complejos covalentes de aptamero del primer soporte solido. En una realizacion, la primera marca separable se escinde tratando la mezcla con condiciones que alteraran el conector de hibridacion, tales como pH alto. En una realizacion, se anade NaOH 20 mM a la mezcla. En otras realizaciones, la liberacion del complejo covalente de aptamero se lleva a cabo por cualquier metodo que sea apropiado para el resto separable en la primera marca separable. Los complejos covalentes de aptamero pueden eluirse y recogerse para uso posterior en el ensayo o pueden ponerse en contacto con otro soporte solido con el fin de realizar las restantes etapas del ensayo.
En una realizacion, la separacion de Captura 2 se realiza para eliminar el fotoaptamero libre. La mezcla se pone en contacto con un soporte solido que tiene un elemento de captura adherido a su superficie que es capaz de unirse a la segunda marca de captura, preferentemente con alta afinidad y especificidad. En una realizacion, el soporte solido es perlas magneticas (tales como DynaBeads MyOne Streptavidin C1) contenidas dentro de un pocillo de una placa de microtitulacion y el elemento de captura es estreptavidina. Las perlas magneticas proporcionan un metodo conveniente para la separacion de componentes separados de la mezcla (estos y otros soportes solidos y elementos de captura se describen en detalle mas adelante). Asi, los complejos covalentes de aptamero contenidos en la mezcla se unen al soporte solido mediante la interaccion de union de la marca de captura diana y el elemento de captura. El complejo covalente de aptamero se separa entonces del resto de la mezcla, por ejemplo, lavando el soporte para eliminar aptameros no complejados. En una realizacion, el fotoaptamero del complejo covalente de aptamero puede entonces liberarse para procesamiento adicional por un metodo apropiado para el resto escindible. Por ejemplo, para escindir PC Linker, la mezcla se irradia con una lampara de UV durante aproximadamente 20 minutos. Esta y otras separaciones de Captura 2 se describen en mas detalle mas adelante.
En otra realizacion, el fotoaptamero liberado de la separacion de Captura 2 se detecta y opcionalmente cuantifica por cualquier metodo de deteccion de acidos nucleicos adecuado, tal como, por ejemplo, hibridacion en chip de
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ADN, Q-PRC, espectroscopia de masas, y similares. Estos metodos de detection se describen en mas detalle mas adelante. En otra realization, el fotoaptamero en el complejo covalente de aptamero se detecta y opcionalmente cuantifica mientras que todav^a esta en contacto con el soporte solido. El fotoaptamero detectado puede correlacionarse con la cantidad o concentration de diana en la muestra de ensayo original.
Variaciones
Variaciones: Conjunto de dilucion
En cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento, la muestra de ensayo puede prepararse como dos o mas diluciones de la muestra de ensayo, que puede aumentar el intervalo dinamico de la deteccion de diana por los metodos desvelados en el presente documento. Las muestras de ensayo de dilucion individuales se ensayan por separado hasta e incluyendo la formation de complejos de aptamero (o covalentes), despues de lo cual las muestras de ensayo de dilucion pueden reunirse para el resto del ensayo y detectarse simultaneamente en un unico soporte solido. En una realizacion, cada muestra de ensayo de dilucion incluye un unico aptamero, permitiendo asi una unica medicion de la diana correspondiente. En otra realizacion, puede anadirse un aptamero a dos o mas diluciones, poniendo cada dilucion en contacto un aptamero marcado de forma distinta para una diana particular, permitiendo la deteccion de una senal de aptamero especifica para cada una de las diferentes muestras de dilucion en un unico soporte solido. Encadenando juntas muestras diluidas de este modo puede extenderse el intervalo dinamico para una unica molecula diana con respecto a muchos ordenes de magnitud y anadir exactitud cuando las regiones de solapamiento de cuantificacion conduzcan a multiples determinaciones de una unica concentracion de diana.
En otra realizacion, el ensayo se realiza como se ha expuesto resumidamente anteriormente, hasta e incluyendo la etapa donde las perlas se suspenden despues de desechar el sobrenadante que contiene diana y muestra de ensayo sin complejar. Antes de eluir el aptamero libre y complejo de aptamero (o covalente) de las perlas, el complejo de aptamero (o covalente) puede ponerse en contacto con un agente de marcado, seguido de sedimentation y lavado repetidos para eliminar el agente de marcado no reactivo antes de poner en contacto el soporte solido con el complejo de aptamero (o covalente) para la deteccion y/o cuantificacion de la molecula diana.
En una realizacion, se prepara un conjunto de muestras de ensayo como diluciones sucesivas a las que se introduce un aptamero marcado (o fotoaptamero marcado) con una afinidad especifica por una molecula diana. Puede anadirse el mismo aptamero con una marca diferente a cada dilucion de muestra de ensayo. Como se ha descrito adicionalmente en el presente documento, tras la formacion de un complejo de afinidad por aptamero (o la conversion opcional en un complejo covalente de aptamero), las muestras de ensayo individuales pueden reunirse y ponerse en contacto con un agente de marcado tanto antes como despues de la union del complejo de aptamero (o covalente) al soporte solido. La molecula diana, si esta presente en la muestra de ensayo, se detecta y/o cuantifica detectando el agente de marcado en el complejo de aptamero (o covalente). Las senales resultantes detectadas para cada aptamero que tienen una marca diferente pueden combinarse para cuantificar con exactitud la cantidad o concentracion de la molecula diana en la muestra de ensayo originales. Por ejemplo, la primera dilucion puede producir una senal maxima para la diana, dando solo information semi-cuantitativa, mientras que la segunda dilucion puede producir una senal que es inferior a la saturation, permitiendo una cuantificacion precisa de la diana en las muestras de ensayo originales.
En otra realizacion, se prepara un conjunto de muestras de ensayo como diluciones sucesivas a las que se introduce un aptamero marcado (o fotoaptamero marcado) con una afinidad especifica por una molecula diana. Pueden anadirse diferentes aptameros que tienen marcas unicas a cada dilucion de muestra. Como se ha descrito adicionalmente en el presente documento, tras la formacion de complejos de afinidad por aptamero (o la conversion opcional en complejos covalentes de aptamero), las muestras de ensayo individuales pueden reunirse y ponerse en contacto con un agente de marcado tanto antes como despues de la union de los complejos de aptamero (o covalentes) al soporte solido. Las moleculas diana presentes en la muestra de ensayo se detectan y/o cuantifican detectando el agente de marcado en el complejo de aptamero (o covalente). Las senales resultantes pueden cuantificarse para intervalos de diana con respecto a muchos ordenes de magnitud dependiendo de las diferentes diluciones sucesivas de la muestra original.
Variacion: Muestra de referencia
En cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento, una muestra de ensayo puede compararse con una muestra de referencia. Una "muestra de referencia" se refiere en el presente documento a cualquier material, solution o mezcla que contiene una pluralidad de moleculas y que se sabe que incluye al menos una molecula diana. La cantidad o concentracion precisa de cualquier molecula diana presente en la muestra de referencia tambien puede ser conocida. El termino muestra de referencia incluye muestras biologicas, como se define en el presente documento, y muestras que pueden usarse para ensayos ambientales o toxicologicos, tales como, por ejemplo, agua contaminada o posiblemente contaminada y efluentes industriales. Una muestra de referencia tambien puede ser un producto final, producto intermedio o subproducto de un proceso de preparation, por ejemplo, un proceso de fabrication. Una muestra de referencia puede incluir cualquier medio de ensayo, tampon o diluyente
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adecuado que se haya anadido a un material, solucion o mezcla obtenida de un organismo o de alguna otra fuente (por ejemplo, el entorno o una fuente industrial).
En una realizacion, se preparan aptameros con dos sondas diferentes. Por ejemplo, un aptamero puede tener un colorante CY3 y el otro el colorante CY5. Usando el ensayo de reticulacion por captura doble como ejemplo, la muestra de referencia se expone a un aptamero y la muestra de ensayo al otro. Cada muestra se trata por separado de un modo identico hasta e incluyendo la etapa de reticulacion. Despues de la reticulacion, las muestras pueden mezclarse igualmente y pueden llevarse a cabo las etapas restantes del ensayo. Es posible una comparacion directa de cualquier expresion diferencial (es decir, cantidad o concentracion diferencial de la diana en las muestras) entre la muestra de referencia y la muestra de ensayo midiendo la senal de cada agente de marcado por separado. Debe entenderse que este metodo puede incorporarse en cualquiera de los otros ensayos descritos en el presente documento. Ademas, ademas de usar diferentes colorantes, que incluye el uso de colorantes fluorescentes, pueden emplearse otras marcas o etiquetas para diferenciar la senal de cada uno de los diferentes aptameros. Por ejemplo, en otra realizacion, los aptameros usados en cada una de las muestras pueden tener diferentes marcas de secuencia. Este metodo es util, por ejemplo, cuando la lectura es Q-PCR o matrices de hibridacion de ADN.
En una realizacion, la muestra de referencia puede ser una muestra biologica reunida que representa un grupo de control. En otra realizacion, la muestra de referencia puede ser una muestra biologica obtenida de un individuo, recogida en un primer momento, y la muestra de ensayo puede obtenerse del mismo individuo, pero recogida en un segundo momento, facilitando asi un estudio longitudinal de un individuo midiendo y evaluando cualquier cambio en la cantidad o concentracion de una o mas moleculas diana en multiples muestras biologicas proporcionadas por el individuo con el tiempo.
Variacion: Multiple
Cualquiera de los metodos descritos en el presente documento puede usarse para realizar un analisis multiple de una muestra de ensayo. Cualquier analisis multiple tal puede incluir el uso de al menos dos, al menos decenas, al menos cientos, o al menos miles de aptameros para ensayar simultaneamente un numero igual de moleculas diana en una muestra de ensayo, tal como, por ejemplo, una muestra biologica. En estas realizaciones, una pluralidad de aptameros (o fotoaptamero marcados, cada uno de los cuales reconoce y opcionalmente se reticula con un analito diferente), se introduce en la muestra de ensayo y puede realizarse cualquiera de los ensayos anteriormente descritos. Despues de liberar los aptameros, puede emplearse cualquier metodo de deteccion de acidos nucleicos multiple adecuado para medir los diferentes aptameros que han sido liberados. En una realizacion, esto puede llevarse a cabo por hibridacion con sondas complementarias que estan dispuestas por separado sobre una superficie solida. En otra realizacion, cada uno de los diferentes aptameros puede detectarse basandose en el peso molecular usando espectroscopia de masas. En otra realizacion mas, cada uno de los diferentes aptameros puede detectarse basandose en una movilidad electroforetica, tal como, por ejemplo, en electroforesis capilar, en un gel, o por cromatografia de liquidos. En otra realizacion, pueden usarse sondas de PCR unicas para cuantificar cada uno de los diferentes aptameros usando Q-PCR. En otra realizacion, cada uno de los diferentes aptameros puede detectarse basandose en el peso molecular usando espectroscopia de masas.
Variacion: Preincubacion con competidor
En cada uno de los ensayos desvelados en el presente documento, se usa una exposition cinetica para aumentar la especificidad del ensayo y para reducir la union no especifica. En una realizacion, que puede opcionalmente emplearse en cada uno de los ensayos descritos en el presente documento, puede llevarse a cabo reduction adicional en la union no especifica por tanto preincubacion de un competidor con la muestra de ensayo como mediante la adicion de un competidor a la mezcla durante la union en equilibrio. En una realizacion, se preincuba 4 |jM de un oligonucleotido competidor Z-Block (5'-(ACZZ)28AC-3', donde Z = 5-bencil-dUTP) durante aproximadamente 5 minutos con la mezcla del texto.
Kits
Otro aspecto de la presente divulgation se refiere a kits utiles para realizar convenientemente cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento para analizar muestras de ensayo. Para potenciar la versatilidad de los metodos desvelados, los reactivos pueden proporcionarse en combination envasada, en el mismo recipiente o recipientes separados, de manera que la relation de los reactivos proporcione optimization sustancial del metodo y ensayo. Los reactivos pueden cada uno estar en recipientes separados o diversos reactivos pueden combinarse en uno o mas recipientes dependiendo de la reactividad cruzada y la estabilidad de los reactivos.
Un kit comprende, en combinacion envasada, al menos un aptamero marcado y uno o mas soportes solidos, cada uno que incluye al menos un agente de captura. El kit tambien puede incluir soluciones de lavado tales como medio acuoso tamponado para la dilution de muestra, ademas del lavado de matrices, reactivos de preparation de muestras, etc. El kit puede contener adicionalmente reactivos utiles en la introduction de una segunda marca, generalmente a traves de la modificacion de la diana. Ademas, el kit puede contener reactivos adecuados para realizar la exposicion cinetica deseada durante el metodo analitico. Las cantidades relativas de los diversos
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reactivos en los kits pueden variarse ampliamente para proporcionar concentraciones de los reactivos que sustancialmente optimizan las reacciones que necesitan producirse durante el ensayo y que adicionalmente optimizan sustancialmente la sensibilidad del ensayo. Bajo circunstancias apropiadas, uno o mas de los reactivos en el kit puede proporcionarse como un polvo seco, normalmente liofilizado, que incluye excipientes, que tras la disolucion proporcionaran una solucion de reactivo que tiene las concentraciones apropiadas para realizar un metodo o ensayo segun la presente divulgacion. El kit puede incluir adicionalmente una descripcion escrita de un metodo segun cualquiera de los metodos que se describe en el presente documento.
En una realizacion, un kit para la deteccion y/o cuantificacion de una o mas moleculas diana que pueden estar presentes en una muestra de ensayo incluye al menos un aptamero que tiene afinidad especifica por una molecula diana y que comprende una marca; y un soporte solido, en el que el soporte solido incluye al menos un agente de captura dispuesto encima, y en el que el elemento de captura es capaz de asociarse a la marca en el aptamero.
En otra realizacion, un kit para la deteccion y/o cuantificacion de una o mas moleculas diana que pueden estar presentes en una muestra de ensayo incluye al menos un aptamero que tiene afinidad especifica por una molecula diana y que comprende una marca y una etiqueta; y un soporte solido, en el que el soporte solido incluye al menos un agente de captura dispuesto encima, y en el que el elemento de captura es capaz de asociarse a la marca en el aptamero.
En otra realizacion, un kit para la deteccion y/o cuantificacion de una o mas moleculas diana que pueden estar presentes en una muestra de ensayo incluye al menos un aptamero que tiene afinidad especifica por una molecula diana y que comprende una marca separable y una etiqueta; y un soporte solido, en el que el soporte solido incluye al menos un agente de captura dispuesto encima, y en el que el elemento de captura es capaz de asociarse a la marca en el aptamero.
Ademas, cualquiera de los kits anteriormente descritos puede contener reactivos y materiales para la realizacion de una exposicion cinetica durante el metodo de deteccion del kit.
Metodos
I. Oligonucleotidos Oligonucleotidos: Bases modificadas
Como se usa en el presente documento, "acido nucleico", "oligonucleotido" y "polinucleotido" se usan indistintamente para referirse a un polimero de nucleotidos de cualquier longitud, y tales nucleotidos pueden incluir desoxirribonucleotidos, ribonucleotidos, y/o analogos o desoxirribonucleotidos o ribonucleotidos quimicamente modificados. Los terminos "polinucleotido", "oligonucleotido" y "acido nucleico" incluyen moleculas bi- o monocatenarias, ademas de moleculas de triple helice.
Si estan presentes, las modificaciones quimicas de un nucleotido pueden incluir, individualmente o en cualquier combinacion, modificaciones del azucar en la posicion 2', modificaciones de piridina en la posicion 5 (por ejemplo, 5- (N-bencilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-[2-(1 H-indol-
3il)etil]carboxiamida)-2'-desoxiuridina, cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetilamonio)propil]carboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5- (N-naftilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(imidazoliletil)-2'-desoxiuridina y 5-(N-[l-(2,3-dihidroxipropil)]carboxiamida)- 2'-desoxiuridina), modificaciones de purina en la posicion 8, modificaciones en aminas exociclicas, sustitucion de 4- tiouridina, sustitucion de 5-bromo- o 5-yodo-uracilo, modificaciones del esqueleto, metilaciones, combinaciones de apareamientos de bases poco usuales como las isobases isocitidina e isoguanidina, y similares. Las modificaciones tambien pueden incluir modificaciones en 3' y 5', tales como terminaciones. Otras modificaciones pueden incluir la sustitucion de uno o mas de los nucleotidos que existen de forma natural con un analogo, modificaciones de internucleotidos tales como, por ejemplo, aquellas con enlaces sin carga (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriesteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y aquellos con enlaces cargados (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.), aquellos que contienen alquilantes, y aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, acidos nucleicos alfa-anomericos, etc.). Ademas, cualquiera de los grupos hidroxilo generalmente presentes en un azucar puede sustituirse por un grupo fosfonato o un grupo fosfato; protegerse por cualquier grupo protector adecuado; o activarse para preparar enlaces adicionales a nucleotidos adicionales o a un soporte solido. Los grupos OH de los extremos 5' y 3' pueden estar fosforilados o sustituidos con aminas, restos de grupos de terminacion organicos de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 atomos de carbono, o restos de grupos de terminacion organicos de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 polimeros de polietilenglicol (PEG) u otros polimeros biologicos o sinteticos hidrofilos o hidrofobos. Si esta presente, una modificacion a la estructura del nucleotido puede conferirse antes o despues del ensamblaje de un polimero. Una secuencia de nucleotidos puede interrumpirse por componentes de no nucleotido. Un polinucleotido puede ser adicionalmente modificado despues de la polimerizacion, tal como por conjugacion con un componente de marca.
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Los polinucleotidos tambien pueden contener formas analogas de azucares de ribosa o desoxirribosa que son generalmente conocidas en la tecnica, que incluyen 2'-O-metil-, 2'-O-alil-, 2'-fluoro- o 2'-azido-ribosa, analogos de azucar carbodclicos, azucares a-anomericos, azucares epimericos tales como arabinosa, xilosas o lixosas, azucares de piranosa, azucares de furanosa, sedoheptulosas, analogos aciclicos y analogos de nucleosidos abasicos tales como metil-ribosido. Como se observa anteriormente, uno o mas enlaces fosfodiester pueden sustituirse por grupos de enlace alternativos. Estos grupos de enlace alternativos incluyen realizaciones en las que el fosfato esta sustituido con P(O)S ("tioato"), P(S)S ("ditioato"), (O)NR2 ("amidato"), P(O)R, P(O)OR', CO o CH2 ("formacetal"), en los que cada R o R' es independientemente H o alquilo (C1-20) sustituido o sin sustituir que contiene opcionalmente un enlace eter (-O-), arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces en un polinucleotido necesitan ser identicos. La sustitucion de formas analogas de azucares, purinas y pirimidinas puede ser ventajosa en el diseno de un producto final, como pueden las estructuras de esqueleto alternativas como, por ejemplo, un esqueleto de poliamida.
En una realizacion, las construcciones de aptamero pueden incluir uno o mas nucleotidos en C5 modificados en la region variable del aptamero que ralentiza eficazmente la tasa de disociacion del aptamero de su diana. Se ha mostrado que las modificaciones de bases de los nucleotidos usadas en la produccion de la region variable del aptamero producen aptameros que tienen constantes de disociacion muy lentas de sus dianas respectivas. Por ejemplo, hay evidencia de que un aptamero que contiene pirimidinas modificadas en la posicion 5, tales como cualquiera de aquellas ilustradas en la FIG. 16, tiene una constante de disociacion lenta de su diana. En algunas realizaciones, el uso de un aptamero que incluye nucleotidos que han sido modificados de este modo en un metodo de ensayo que incluye una exposicion cinetica da sensibilidad y especificidad potenciadas en la deteccion de una diana. Como se indica en la FIG. 5, se han producido aptameros de mas de 500 dianas hasta la fecha. Muchos de estos aptameros tienen caracteristicas de constante de disociacion lenta.
En una realizacion, la region variable del aptamero incluye nucleotidos que tienen bases modificadas. Estos aptameros pueden usarse en cualquiera de los metodos, dispositivos y kits descritos en el presente documento. Hay evidencia de que estos nucleotidos modificados pueden conducir a la identificacion de aptameros que tienen constantes de disociacion muy lentas de su diana respectiva mientras que mantienen la alta afinidad por la diana. En una realizacion, puede modificarse la posicion C-5 de las bases de pirimidina. En otras realizaciones, algunas o todas de las purinas o pirimidinas en el aptamero pueden ser los nucleotidos modificados en la base. En todavia otras realizaciones, tambien pueden usarse combinaciones de tanto purinas modificadas como pirimidinas modificadas. Los aptameros que contienen nucleotidos con bases modificadas tienen varias propiedades que son diferentes de los aptameros que contienen solo nucleotidos no modificados (es decir, nucleotidos que existen de forma natural). En una realizacion, el metodo para la modificacion de los nucleotidos es a traves de un enlace carboxiamida. Sin embargo, pueden ser adecuados otros metodos para la modificacion. Se ha observado sorprendentemente que la estructura de los aptameros de constante de disociacion lenta identificados no parece adaptarse a las estructuras predichas por los modelos de apareamiento de bases. Esto esta soportado por el hecho de que las temperaturas de fusion medidas de los aptameros no son las que los modelos pueden predecir. Como se muestra en el presente documento, parece haber poca o ninguna correlacion entre las temperaturas de fusion medidas y predichas. Ademas, en promedio, la Tm calculada es 6 °C mas baja que la Tm medida. Las temperaturas de fusion medidas indican que los aptameros que incluyen estos nucleotidos modificados son mas estables que lo que puede predecirse y posiblemente poseen estructuras secundarias novedosas. Tambien es mas probable la identificacion de aptameros de constante de disociacion lenta cuando los nucleotidos modificados se usan en la produccion de la biblioteca inicial o mezcla de candidatos.
Modificaciones de piridina en la posicion 5 particulares incluyen aquellas descritas en las patentes de EE.UU. 5.719.273 y 5.945.527, especificamente aquellas mostradas en la FIG. 19. Como se usa en el presente documento, "acido nucleico modificado" se refiere a una secuencia de acidos nucleicos que contiene uno o mas nucleotidos modificados que son compatibles con el proceso SELEX.
En otra realizacion de la presente divulgacion, se proporciona un complejo no covalente de un aptamero y una diana, en el que el aptamero tiene una Kd por la diana de aproximadamente 100 nM o menos, en el que la tasa de disociacion (ti/2) del aptamero de la diana es mayor o igual a aproximadamente 30 minutos, y en el que una, varias o todas las pirimidinas en la secuencia de acidos nucleicos del aptamero estan modificadas en la posicion 5 de la base. Las modificaciones pueden seleccionarse del grupo de compuestos mostrados en la FIG. 19. Los aptameros pueden disenarse con cualquier combinacion de los nucleotidos modificados en la base deseados.
II. SELEX y aptamero
Como se usa en el presente documento, "aptamero" y "ligando de acido nucleico" se usan indistintamente para referirse a un acido nucleico que tiene una afinidad de union especifica por una molecula diana. Se reconoce que las interacciones de afinidad son una cuestion del grado; sin embargo, en este contexto, la "afinidad de union espedfica" de un aptamero por su diana significa que el aptamero se une a su diana generalmente con un grado de afinidad mucho mas alto que con el que se une a otros componentes en una muestra de ensayo. Un "aptamero" es un conjunto de copias de un tipo o especie de molecula de acido nucleico que tiene una secuencia de nucleotidos particular. Un aptamero puede incluir cualquier numero adecuado de nucleotidos. "Aptameros" se refiere a mas de
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un conjunto tal de moleculas. Diferentes aptameros pueden tener tanto los mismos numeros como diferentes de nucleotidos. Cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento puede incluir el uso de uno o mas aptameros. Cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento tambien puede incluir el uso de dos o mas aptameros que se unen espedficamente a la misma molecula diana. Como se ha describe adicionalmente mas adelante, un aptamero puede incluir una marca. Si un aptamero incluye una marca, todas las copias del aptamero no necesitan tener la misma marca. Ademas, si diferentes aptameros incluyen cada uno una marca, estos aptameros diferentes puede tener tanto la misma marca como una marca diferente.
Un aptamero puede identificarse usando cualquier metodo conocido, que incluye el proceso SELEX. Vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 5.475.096 titulada "Nucleic Acid Ligands". Una vez identificado, un aptamero puede prepararse o sintetizarse segun cualquier metodo conocido, que incluye metodos sinteticos quimicos y metodos sinteticos enzimaticos.
Los terminos "SELEX" y "proceso SELEX" se usan indistintamente en el presente documento para referirse generalmente a una combinacion de (1) la seleccion de acidos nucleicos que interaccionan con una molecula diana de una manera deseable, por ejemplo, union con alta afinidad a una proteina, con (2) la amplificacion de aquellos acidos nucleicos seleccionados. Vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 5.475.096 titulada "Nucleic Acid Ligands". El proceso SELEX puede usarse para generar un aptamero que se une covalentemente a su diana, ademas de un aptamero que se une no covalentemente a su diana. Vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 5.705.337 titulada "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX". El proceso SELEX tambien puede usarse para generar aptameros con constantes de disociacion mejoradas como se describe en el documento US2009/0004667 titulado "Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates".
Como se usa en el presente documento, el termino "complejo de afinidad por aptamero" o "complejo de aptamero" se refiere a un complejo no covalente que se forma por la interaction de un aptamero con su molecula diana. Un "complejo de afinidad por aptamero" o "complejo de aptamero" es un conjunto de copias de un tipo o especie de complejo formado por un aptamero unido a su molecula diana correspondiente. "Complejos de afinidad por aptamero" o "complejos de aptamero" se refieren a mas de un conjunto tal de complejos. Un complejo de afinidad por aptamero o complejo de aptamero puede generalmente invertirse o disociarse por un cambio en una condition ambiental, por ejemplo, un aumento en la temperatura, un aumento en la concentration de sales, o una adicion de un desnaturalizante.
Como se usa en el presente documento, "complejo no espedfico" se refiere a una asociacion no covalente entre dos o mas moleculas distintas de un aptamero y su molecula diana. Debido a que un complejo no espedfico no se selecciona basandose en una interaccion de afinidad entre sus moleculas constituyentes, sino que representa una interaccion entre clases de moleculas, las moleculas asociadas en un complejo no espedfico presentaran, en promedio, afinidades mucho mas bajas entre si y tendran una constante de disociacion correspondientemente mas alta que un aptamero y su molecula diana. Los complejos no espedficos incluyen complejos formados entre un aptamero y una molecula no diana, un competidor y una molecula no diana, un competidor y una molecula diana, y una molecula diana y una molecula no diana.
El proceso SELEX generalmente empieza con la preparation de una mezcla de candidatos de acidos nucleicos de secuencia diferente. La mezcla de candidatos generalmente incluye secuencias de acidos nucleicos que incluyen dos regiones fijas (es decir, cada uno de los miembros de la mezcla de candidatos contiene las mismas secuencias en la misma localization) y una region variable. Normalmente, las regiones de secuencia fija se seleccionan de forma que ayuden en las etapas de amplificacion descritas mas adelante, o potencien el potencial de una disposition estructural dada de los acidos nucleicos en la mezcla de candidatos. La region variable normalmente proporciona la region de union diana de cada acido nucleico en la mezcla de candidatos, y esta region variable puede ser completamente al azar (es decir, siendo la probabilidad de hallazgo de una base en cualquier position una de entre cuatro) o solo parcialmente al azar (por ejemplo, la probabilidad de hallazgo de una base en cualquier localizacion puede seleccionarse en cualquier nivel entre el 0 y el 100 por ciento). La mezcla de candidatos preparada se pone en contacto con la diana seleccionada en condiciones que son favorables para que se produzca la union entre la diana y los miembros de la mezcla de candidatos. Bajo estas condiciones, la interaccion entre la diana y los acidos nucleicos de la mezcla de candidatos generalmente forma pares acido nucleico-diana que tienen la afinidad relativa mas fuerte entre los miembros del par. Los acidos nucleicos con la mayor afinidad por la diana se separaron de aquellos acidos nucleicos con la menor afinidad por la diana. El proceso de separation se realiza de un modo que se retenga el maximo numero de candidatos de alta afinidad. Aquellos acidos nucleicos seleccionados durante la separacion por tener una afinidad relativamente alta por la diana se amplifican para crear una nueva mezcla de candidatos que esta enriquecida en acidos nucleicos que tienen una afinidad relativamente alta por la diana. Repitiendo las etapas de separacion y de amplificacion anteriores, la mezcla de candidatos recien formada contiene cada vez menos secuencias unicas, y generalmente aumentara el grado de afinidad promedio de la mezcla de acidos nucleicos por la diana. Llevado a su extremo, el proceso SELEX dara una mezcla de candidatos que contiene uno o un numero muy pequeno de acidos nucleicos unicos que representan aquellos acidos nucleicos de la mezcla de candidatos original que tiene la mayor afinidad por la molecula diana.
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III. FotoSELEX Definicion de fotoaptamero Metodos de reticulacion
Como se usa en el presente documento, "fotoaptamero", "ligando de acido nucleico fotorreactivo" y "aptamero fotorreactivo" se usan indistintamente para referirse a un aptamero que contiene uno o mas grupos funcionales fotorreactivos que pueden unirse covalentemente con o "reticularse" con una molecula diana. Por ejemplo, puede modificarse un resto de acido nucleico que existe de forma natural para incluir un grupo funcional quimico que confiere fotorreactividad al resto de acidos nucleicos tras la exposicion a una fuente de radiacion de una longitud de onda apropiada. Un fotoaptamero puede identificarse y/o prepararse usando cualquier metodo conocido. En algunas realizaciones, un aptamero fotorreactivo se identifica usando el proceso fotoSELEx. Vease, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 5.763.177, la patente de EE.UU. N.° 6.001.577 y la patente de EE.UU. N.° 6.291.184, cada una de las cuales se titula "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX"; vease, por tanto, por ejemplo, la patente de EE.UU. N.° 6.458.539, titulada "Photoselection of Nucleic Acid Ligands" y el documento US2009/0098549 titulado "Improved SELEX and PHOTOSELEX".
Grupos funcionales fotorreactivos a modo de ejemplo que pueden incorporarse en un fotoaptamero incluyen 5- bromouracilo, 5-yodouracilo, 5-bromoviniluracilo, 5-yodoviniluracilo, 5-azidouracilo, 4-tiouracilo, 5-tiouracilo, 4- tiocitosina, 5-bromocitosina, 5-yodocitosina, 5-bromovinilcitosina, 5-yodovinilcitosina, 5-azidocitosina, 8-
azidoadenina, 8-bromoadenina, 8-yodoadenina, 8-azyodoguanina, 8-bromoguanina, 8-yodoguanina, 8-
azidohipoxantina, 8-bromohipoxantina, 8-yodohipoxantina, 8-azidoxantina, 8-bromoxantina, 8-yodoxantina, 5-[(4- azidofenacil)tio]citosina, 5-[(4-azidofenacil)tio]uracilo, 7-deaza-7-yodoadenina, 7-deaza-7-yodoguanina, 7-deaza-7- bromoadenina y 7-deaza-7-bromoguanina.
Ademas de estos grupos funcionales fotorreactivos basados en nucleosido a modo de ejemplo, puede usarse otros grupos funcionales fotorreactivos que pueden anadirse a un extremo terminal de un aptamero mediante una molecula de conector apropiada. Tales grupos funcionales fotorreactivos incluyen benzofenona, antraquinona, 4- azido-2-nitro-anilina, psoraleno, derivados de cualquiera de estos, y similares.
Un grupo funcional fotorreactivo incorporado en un fotoaptamero puede activarse por cualquier metodo adecuado. En una realizacion, un fotoaptamero que contiene un grupo funcional fotorreactivo se reticula con su diana exponiendo el complejo de afinidad por fotoaptamero a una fuente de radiacion electromagnetica. Tipos adecuados de radiacion electromagnetica incluyen luz ultravioleta, luz visible, rayos X y rayos gamma. Fuentes de radiacion adecuadas incluyen fuentes que utilizan tanto luz monocromatica como luz policromatica filtrada.
Como se usa en el presente documento, el termino "complejo covalente de aptamero" se refiere a un complejo de afinidad por aptamero en el que el aptamero ha sido inducido para formar o de otro modo forma un enlace covalente con su molecula diana. Un "complejo covalente de aptamero" es un conjunto de copias de un tipo o especie de complejo formado por un aptamero covalentemente unido a su molecula diana correspondiente. "Complejos covalentes de aptamero" se refiere a mas de un conjunto tal de complejos. Un enlace covalente o enlace entre un aptamero y su molecula diana puede inducirse por fotoactivacion de un resto quimico en el aptamero, que incluye aquellos restos descritos anteriormente con respecto a fotoaptameros. Un enlace covalente o enlace entre un aptamero y su molecula diana tambien puede inducirse quimicamente. Grupos quimicos que pueden incluirse en un aptamero y usarse para inducir un enlace covalente con la diana incluyen, pero no se limitan a, aldehidos, maleimidas, derivados de acrililo, derivados de diazonio, tioles, etc. En algunas realizaciones, grupos de reticulacion quimica, tales como maleimida o sales de diazonio, por ejemplo, pueden convertir complejos de afinidad por aptamero en complejos covalentes de aptamero simplemente proporcionando el entorno y yuxtaposicion apropiados de grupos reactivos requeridos para que se produzca la reactividad quimica especifica y suficientemente potenciada. En otras realizaciones, reticulantes quimicos, tales como grupos aldehido, pueden requerir la adicion de otro componente, por ejemplo, cianoborohidruro de sodio, para convertir los complejos de afinidad por aptamero en complejos covalentes de aptamero irreversibles estables. En todavia otras realizaciones, ninguno de tales reticulantes quimicos esta incluido en un aptamero; mas bien, se usa un tercer reactivo para convertir un complejo de afinidad por aptamero en un complejo covalente de aptamero facilitando una union covalente entre el aptamero y su diana. Por ejemplo, un reactivo homo- o hetero-bifuncional que contiene tanto un resto reactivo con amina (por ejemplo, un ester de N-hidroxisuccinimidilo, un aldehido, o un imidato) como un grupo reactivo con nucleosido (por ejemplo, una yodoacetamida o un aldehido activado) pueden inducir la complejacion covalente de un complejo de afinidad por aptamero, tal como un complejo de afinidad formado por un aptamero y una proteina diana.
Los fotoaptameros pueden identificarse identificando primero un aptamero de afinidad y sustituyendo en uno o mas restos de nucleotidos fotorreactivos. Alternativamente, los fotoaptameros pueden identificarse por un proceso SELEX que comprende lo siguiente: (a) preparar una mezcla de candidatos de acidos nucleicos, en la que cada acido nucleico comprende (i) al menos una pirimidina marcadora de posicion no fotorreactiva y (ii) al menos una pirimidina modificada; (b) poner en contacto la mezcla de candidatos con una diana, en la que acidos nucleicos que
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tienen una elevada afinidad por la diana con respecto a la mezcla de candidatos pueden separarse del resto de la mezcla de candidatos; (c) separar los acidos nucleicos de afinidad elevada del resto de la mezcla de candidatos; (d) amplificar los acidos nucleicos de afinidad elevada para dar una mezcla de acidos nucleicos enriquecida en ligando de acido nucleico, por lo que puede identificarse un aptamero para el compuesto diana; (e) repetir (b)-(d) segun se desee; (f) producir un fotoaptamero candidato reemplazando en cada acido nucleico de la mezcla enriquecida en ligando de acido nucleico de (d) una o mas pirimidinas marcadoras de posicion no fotorreactivas con una pirimidina fotorreactiva; (g) poner en contacto el fotoaptamero candidato con la diana en el que se forma un complejo de fotoaptamero-diana candidato; (h) irradiar dicho complejo de fotoaptamero-diana candidato; (i) determinar si dicho complejo de fotoaptamero-diana candidato se ha fotorreticulado; (j) repetir (f)-(i) segun se desee; y (k) identificar al menos un fotoaptamero para la diana.
IV. Muestra de ensayo y molecula diana
El termino "muestra de ensayo" se refiere en el presente documento a cualquier material, solucion o mezcla que contenga una pluralidad de moleculas y puede incluir al menos una molecula diana. El termino muestra de ensayo incluye muestras biologicas, como se define mas adelante, y muestras que pueden usarse para ensayos ambientales o toxicologicos, tales como, por ejemplo, agua contaminada o posiblemente contaminada y efluentes industriales. Una muestra de ensayo tambien puede ser un producto final, producto intermedio o subproducto de un proceso de preparacion, por ejemplo, un proceso de fabrication. Una muestra de ensayo puede incluir cualquier medio de ensayo, tampon o diluyente adecuado que se haya anadido a un material, solucion o mezcla obtenida de un organismo o de alguna otra fuente (por ejemplo, el entorno o una fuente industrial).
El termino "muestra biologica" se refiere a cualquier material, solucion o mezcla obtenida de un organismo. Esta incluye sangre (incluyendo sangre completa, leucocitos, celulas mononucleares de sangre periferica, plasma y suero), esputo, aliento, orina, semen, saliva, liquido meningeo, liquido amniotico, liquido glandular, liquido linfatico, aspirado del pezon, aspirado bronquial, liquido sinovial, aspirado de articulation, celulas, un extracto celular y liquido cefalorraquideo. Esta tambien incluye fracciones experimentalmente separadas de todos los precedentes. El termino "muestra biologica" tambien incluye materiales, soluciones o mezclas que contienen material solido homogeneizado, tal como, por ejemplo, de una muestra de heces, una muestra de tejido, o una biopsia de tejido. El termino "muestra biologica" tambien incluye materiales, soluciones o mezclas derivadas de un cultivo de tejido, cultivo celular, cultivo bacteriano o cultivo viral.
Como se usa en el presente documento, "molecula diana" y "diana" se usan indistintamente para referirse a cualquier molecula de interes a la que un aptamero puede unirse con alta afinidad y especificidad y que puede estar presente en una muestra de ensayo. Una "molecula de interes" incluye cualquier variation menor de una molecula particular, tal como, en el caso de una proteina, por ejemplo, variaciones menores en la secuencia de aminoacidos, formation de enlaces disulfuro, glucosilacion, lipidacion, acetilacion, fosforilacion, o cualquier otra manipulation o modification, tal como conjugation con un componente de marca que no altera sustancialmente la identidad de la molecula. Una "molecula diana" o "diana" es un conjunto de copias de un tipo o especie de molecula o estructura multimolecular que es capaz de unirse a un aptamero. "Moleculas diana" o "dianas" se refiere a mas de un conjunto tal de moleculas. Moleculas diana a modo de ejemplo incluyen proteinas, polipeptidos, acidos nucleicos, hidratos de carbono, lipidos, polisacaridos, glucoproteinas, hormonas, receptores, antigenos, anticuerpos, affibodies, mimeticos de anticuerpos, virus, patogenos, sustancias toxicas, sustratos, metabolitos, analogos del estado de transition, cofactores, inhibidores, farmacos, colorantes, nutrientes, factores de crecimiento, celulas, tejidos, y cualquier fragmento o portion de cualquiera de los anteriores. Un aptamero puede identificarse para practicamente cualquier molecula quimica o biologica de cualquier tamano, y asi practicamente cualquier molecula quimica o biologica de cualquier tamano puede ser una diana adecuada. Una diana tambien puede modificarse para potenciar la verosimilitud o intensidad de una interaction entre la diana y el aptamero. Una diana tambien puede modificarse para incluir una marca, como se ha definido anteriormente. En realizaciones a modo de ejemplo, la molecula diana es una proteina. Vease la patente de EE.UU. N.° 6.376.190 titulada "Modified SELEX Processes Without Purified Protein" para metodos en los que la diana SELEX es un peptido.
"Polipeptido", "peptido" y "proteina" se usan indistintamente en el presente documento para referirse a polimeros de aminoacidos de cualquier longitud. El polimero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoacidos modificados, y puede interrumpirse por no aminoacidos. Los terminos tambien engloban un polimero de aminoacidos que ha sido modificado naturalmente o por intervention; por ejemplo, formacion de enlaces disulfuro, glucosilacion, lipidacion, acetilacion, fosforilacion, o cualquier otra manipulacion o modificacion, tal como conjugacion con un componente de marca. Tambien estan incluidos dentro de la definition, por ejemplo, polipeptidos que contienen uno o mas analogos de un aminoacido (incluyendo, por ejemplo, aminoacidos no naturales, etc.), ademas de otras modificaciones conocidos en la tecnica. Los polipeptidos pueden ser cadenas individuales o cadenas asociadas.
Como se usa en el presente documento, "molecula no diana" y "no diana" se usan indistintamente para referirse a una molecula contenida en una muestra de ensayo que puede formar un complejo no especifico con un aptamero. Una "molecula no diana" o "no diana" es un conjunto de copias de un tipo o especie de molecula o estructura multimolecular que es capaz de unirse a un aptamero. "Molecula no diana" o "no dianas" se refieren a mas de un conjunto tal de moleculas. Se apreciara que una molecula que es una no diana para un primer aptamero puede ser
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una diana para un segundo aptamero. Asimismo, una molecula que es una diana para el primer aptamero puede ser una no diana para el segundo aptamero.
V: Captura 1 - Separacion basada en aptamero
Como se usa en el presente documento, el termino "separacion" se refiere a una separacion o eliminacion de una o mas especies moleculares de la muestra de ensayo. La separacion puede usarse para aumentar la sensibilidad y/o reducir el nivel de fondo. La separacion es mas eficaz tras la formacion de complejos de aptamero (o covalentes) o cuando el complejo de afinidad por aptamero llega a ser irreversible debido al enlace covalente introducido durante la reticulacion. Puede introducirse una etapa de separacion despues de cualquier etapa, o despues de cada etapa, donde el complejo de afinidad por aptamero se inmoviliza. La separacion puede tambien basarse en un diferencial de tamano u otra propiedad especifica que exista diferencialmente entre el complejo de afinidad por aptamero y otros componentes de la muestra de ensayo. La separacion tambien puede lograrse mediante una interaccion especifica con un aptamero o diana. La separacion tambien puede llevarse a cabo basandose en las propiedades fisicas o bioquimicas del aptamero, diana, complejo de afinidad por aptamero o complejo covalente de aptamero
Como se usa en el presente documento, "Captura 1" se refiere a la separacion de un complejo de afinidad por aptamero o complejo covalente de aptamero basandose en la captura del aptamero. El fin de la etapa de Captura 1 es eliminar sustancialmente todos los componentes en la muestra de ensayo que no esten asociados al aptamero. La eliminacion de la mayoria de tales componentes generalmente mejorara la eficiencia del marcado de diana, eliminando molecula no diana de la etapa de marcado de diana usada para la captura Captura 2 y puede conducir a nivel de fondo del ensayo mas bajo. En una realizacion, una marca se une al aptamero tanto antes del ensayo, durante la preparacion del ensayo, como durante el ensayo anadiendo la marca al aptamero. En una realizacion, la marca es una marca separable. En una realizacion, la marca separable comprende un conector escindible y una marca. Como se ha descrito anteriormente, el aptamero marcado puede ser capturado sobre un soporte solido donde el soporte solido comprende un elemento de captura apropiado para la marca. Despues, el soporte solido puede lavarse para eliminar cualquier material en la mezcla de ensayo que no este asociado al aptamero.
En diversas realizaciones, los complejos de afinidad por aptamero (o covalentes) se capturan o inmovilizan sobre el soporte solido usando la marca de captura incorporada en el aptamero (marca de aptamero). Por ejemplo, si la marca de captura sobre el aptamero es biotina, como se ha descrito anteriormente, pueden usarse perlas que tienen avidina, estreptavidina, neutravidina, extravidina, y similares, sobre la superficie para capturar los complejos de afinidad por aptamero (o covalentes). Las perlas se lavan para eliminar cualquier diana libre (sin complejar) y otros componentes de la matriz de muestra.
En otra realizacion, la marca es una marca de hibridacion complementaria a una sonda inmovilizada sobre el primer soporte solido. El soporte solido en este caso puede incluir microperlas (por ejemplo, perlas paramagneticas), cualquier otro soporte solido adecuado descrito en el presente documento, y similares. La marca de hibridacion puede ser una marca de secuencia unica anadida al aptamero o puede ser una porcion de la secuencia del aptamero o puede ser la secuencia del aptamero entera. Despues de que el aptamero se asocie con el soporte solido mediante hibridacion, la muestra de ensayo puede lavarse para eliminar cualquier material que no este asociado al aptamero. En una realizacion, los complejos covalentes de aptamero y el aptamero libre pueden ser liberados del soporte solido usando cualquier metodo adecuado para hibridacion inversa, tal como sal alta, pH bajo o alto, alta temperatura o una combinacion de cualquiera de estos. La liberacion de una marca de hibridacion en Captura 1 generalmente no es compatible con la preservacion de complejos de afinidad por aptamero, ya que las condiciones que conducen a la alteration de la hibridacion marca-sonda generalmente conduciran a la desnaturalizacion de la estructura del aptamero, produciendo la disociacion del complejo de afinidad por aptamero.
En otra realizacion, la eliminacion de componentes no asociados al aptamero puede llevarse a cabo usando tecnicas fisicas en vez de una marca de aptamero explicita y un primer soporte solido. En una realizacion, esto se lleva a cabo precipitando el aptamero, tanto libre como complejado, en la muestra de ensayo, dejando otras moleculas que pueden reaccionar con el agente de marcado de diana en el sobrenadante que va a desecharse. Observese que este metodo se disena para su uso con los ensayos de fotorreticulacion. Tal precipitation del acido nucleico puede llevarse a cabo con reactivos que incluyen bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), bromuro de dodeciltrimetilamonio (DTAB), y disolventes organicos tales como etanol, por ejemplo.
VI: Captura 2 - Separacion basada en protema
Como se usa en el presente documento, "Captura 2" se refiere a la separacion de un complejo de afinidad por aptamero o complejo covalente de aptamero basandose en la captura de la molecula diana. El fin de la etapa de Captura 2 es eliminar aptamero libre, o sin complejar, de la muestra de ensayo antes de la detection y cuantificacion opcional. El eliminar el aptamero libre de la muestra permite la deteccion de la afinidad del aptamero o complejos covalentes de aptamero por cualquier tecnica de deteccion de acidos nucleicos adecuada. Si se usa Q-PCR para la deteccion y cuantificacion opcional, se necesita la eliminacion del aptamero libre para la deteccion y cuantificacion precisa de la molecula diana.
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En una realizacion, la molecula diana es una protema o peptido y el aptamero libre se separa del complejo de afinidad por aptamero (o covalente) (y el resto de la muestra de ensayo) usando reactivos que pueden incorporarse en proteinas (y peptidos) y complejos que incluyen protemas (o peptidos), tales como, por ejemplo, un complejo de afinidad por aptamero (o covalente). La proteina marcada (o peptido) y el complejo de afinidad por aptamero (o covalente) pueden inmovilizarse sobre un soporte solido, permitiendo la separacion de la proteina (o peptido) y el complejo de afinidad por aptamero (o covalente) de aptamero libre. Tal marcado puede incluir, por ejemplo, un resto de biotina que puede incorporarse en la proteina o peptido.
En una realizacion, una marca de Captura 2 se une a la proteina (o peptido) tanto antes el ensayo, durante la preparacion del ensayo, como durante el ensayo uniendo quimicamente la marca a las dianas. En una realizacion, la marca de Captura 2 es una marca separable. En una realizacion, la marca separable comprende un conector escindible y una marca. Generalmente no es necesario, sin embargo, liberar la proteina (o peptido) del soporte solido de Captura 2. Como se ha descrito anteriormente, las dianas marcadas pueden ser capturadas sobre un segundo soporte solido donde el soporte solido comprende un elemento de captura apropiado para la marca diana. El soporte solido puede entonces lavarse para eliminar el aptamero libre de la solucion.
En una realizacion, la marca diana introducida para Captura 2 es la misma marca que aquella en el aptamero usado para Captura 1. En esta realizacion, el marcado de la diana se realiza despues de la etapa de Captura 1 y antes de la introduccion de soporte solido de Captura 2. En una realizacion, los sitios no ocupados con aptameros sobre el soporte de Captura 1 pueden bloquearse antes de marcar las dianas si el marcado de las dianas se hace mientras que este en el soporte de Captura 1.
En otra realizacion, el complejo de afinidad por aptamero o el complejo covalente de aptamero pueden capturarse sobre el segundo soporte solido directamente mediante la asociacion a un reactivo de captura sobre el segundo soporte solido. En esta realizacion no es necesario el marcado de dianas explicito. En una realizacion, el segundo soporte solido contiene un anticuerpo que se une a la molecula diana. En otra realizacion, el soporte contiene un fragmento Fc que se une a la molecula diana. En otra realizacion, cuando la molecula diana es IgG, IgM, IgA o IgE, el soporte puede contener proteina A para unirse a la proteina diana. Cualquier reactivo de captura que se una a la molecula diana en un complejo de afinidad por aptamero o covalente de aptamero puede usarse para la etapa de Captura 2.
En otra realizacion, la eliminacion del aptamero libre puede llevarse a cabo usando tecnicas fisicas en vez de una marca diana explicita y un segundo soporte solido. En una realizacion donde la molecula diana es una proteina o peptido, esto se lleva a cabo precipitando los complejos covalentes de aptamero y dejando el aptamero libre en el sobrenadante que va a desecharse [observese que esto funciona solo para complejos covalentes]. Tal precipitacion de proteina o peptido puede llevarse a cabo con SDS y sal alta, normalmente K+, por ejemplo. Despues de la precipitacion con SDS- K+, el complejo covalente de aptamero puede recuperarse para la cuantificacion.
Despues de eliminar el aptamero libre lavando el segundo soporte solido, los complejos de afinidad por aptamero se someten entonces a una etapa de disociacion en la que los complejos se alteran para dar el aptamero libre mientras que las moleculas diana generalmente siguen unidas al soporte solido mediante la interaccion de union de la sonda y marca de captura diana. El aptamero del complejo de afinidad por aptamero puede ser liberado por cualquier metodo que altere la estructura de tanto el aptamero como la diana. Esto puede lograrse mediante lavado de los complejos de afinidad por aptamero unidos al soporte en tampon de sal alta que disocia los complejos aptamero- diana no covalentemente unidos. Se recogen y detectan aptameros libres eluidos. En otra realizacion, se usa pH alto o bajo para alterar los complejos de afinidad por aptamero. En otra realizacion se usa temperatura alta para disociar los complejos de afinidad por aptamero. En otra realizacion, puede usarse una combinacion de cualquiera de los metodos anteriores.
En el caso de complejos covalentes de aptamero, la liberation del aptamero para la posterior cuantificacion se lleva a cabo usando un conector escindible en la construction de aptamero. En otra realizacion, un conector escindible en la marca diana producira la liberacion del complejo covalente de aptamero.
Exposicion cinetica usando un competidor
Como se usa en el presente documento, "molecula competidora" y "competidor" se usan indistintamente para referirse a cualquier molecula que pueda formar un complejo no especifico con una molecula no diana, por ejemplo, para prevenir que la molecula no diana se vuelva a unir no especificamente a un aptamero. Una "molecula competidora" o "competidor" es un conjunto de copias de un tipo o especie de molecula. "Moleculas competidoras” o "competidores" se refiere a mas de un conjunto de dichas moleculas. Las moleculas competidoras incluyen oligonucleotidos, polianiones (por ejemplo, heparina, ADN monocatenario de esperma de salmon y polidextranos (por ejemplo, sulfato de dextrano)), polimeros de fosfodiester abasico, dNTPs y pirofosfato. En el caso de una exposicion cinetica que usa un competidor, el competidor tambien puede ser cualquier molecula que pueda formar un complejo no especifico con un aptamero libre, por ejemplo, para prevenir que el aptamero se vuelva a unir no especificamente a una molecula no diana. Tales moleculas competidoras incluyen policationes (por ejemplo, espermina, espermidina, polilisina y poliarginina) y aminoacidos (por ejemplo, arginina y lisina). Cuando se usa un
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competidor como exposicion cinetica se utiliza una concentracion bastante alta con respecto a la concentracion esperada de protema total o aptamero total presente en la muestra. En una realization, como competidor en una exposicion cinetica se usa sulfato de dextrano 10 mM.
Exposicion cinetica usando dilucion
En algunas realizaciones, la exposicion cinetica se realiza diluyendo la muestra de ensayo con tampon de union o cualquier otra solution que no aumente significativamente la tasa de disociacion natural de complejos de afinidad por aptamero. La dilucion puede ser aproximadamente 2X, aproximadamente 3X, aproximadamente 4X, aproximadamente 5X, o cualquier dilucion mayor adecuada. Diluciones mas grandes proporcionan una exposicion cinetica mas eficaz, reduciendo la concentracion de proteina total y aptamero despues de la dilucion y, por tanto, la tasa de su re-asociacion. Si se usa dilucion para introducir una exposicion cinetica, la posterior mezcla de muestra de ensayo que contiene el complejo de afinidad por aptamero puede concentrarse antes del procesamiento adicional. Si es aplicable, esta concentracion puede llevarse a cabo usando metodos descritos en el presente documento con respecto a la separation opcional de cualquier aptamero libre de la muestra de ensayo y/o la elimination opcional de otros componentes de la muestra de ensayo que pueden reaccionar con el agente de marcado. Cuando se usa dilucion como exposicion cinetica, la cantidad de dilucion se selecciona para ser hasta practica, en vista de tanto el volumen de muestra de ensayo inicial como el deseo de recuperar el complejo de afinidad por aptamero del volumen (diluido) final sin incurrir en una perdida significativa de complejo.
Exposicion cinetica usando dilucion y un competidor
En algunas realizaciones, la exposicion cinetica se realiza de tal manera que el efecto de dilucion de muestra y el efecto de introducir un competidor se realicen simultaneamente. Por ejemplo, una muestra de ensayo puede diluirse con un gran volumen de competidor. Combinar estas dos estrategias de exposicion cinetica puede proporcionar una exposicion cinetica mas eficaz que puede lograrse usando una estrategia. En una realizacion, la dilucion puede ser aproximadamente 2X, aproximadamente 3X, aproximadamente 4X, aproximadamente 5X, o cualquier dilucion mayor adecuada y el competidor es sulfato de dextrano 10 mM.
VIM. Elementos de captura, marcas y sondas
En diversas realizaciones, los complejos de afinidad por aptamero (o covalentes) se capturan o inmovilizan sobre el soporte solido usando una marca incorporada en el aptamero (marca de aptamero), o unida a la diana. Por ejemplo, si la marca en el aptamero es biotina, pueden usarse perlas que tienen un elemento de captura tal como avidina, estreptavidina, neutravidina, extravidina, y similares, sobre la superficie para capturar los complejos de afinidad por aptamero (o covalentes). Las perlas se lavan para eliminar cualquier diana libre (sin complejar).
Composiciones de marca
Como se ha desvelado en el presente documento, un aptamero puede comprender ademas una "marca", que se refiere a un componente que proporciona un medio para unir o inmovilizar un aptamero (y cualquier molecula diana que este unida a el) a un soporte solido. Una "marca" es un conjunto de copias de un tipo o especie de componente que es capaz de asociarse a un "elemento de captura". "Marcas" o "elementos de captura" se refiere a mas de un conjunto tal de componentes. La marca puede unirse a o incluirse en el aptamero por cualquier metodo adecuado. Generalmente, la marca permite que el aptamero se disocie, tanto directa como indirectamente, con un elemento de captura o receptor que esta unido al soporte solido. El elemento de captura normalmente se elige (o disena) para ser altamente especifico en su interaction con la marca y para retener esa asociacion durante las posteriores etapas de procesamiento o procedimientos. Una marca puede permitir la localization de un complejo de afinidad por aptamero (o complejo de afinidad por aptamero covalente) en una direction espacialmente definida sobre un soporte solido. Por tanto, diferentes marcas pueden permitir la localizacion de diferentes complejos covalentes de aptamero en diferentes direcciones espacialmente definidas sobre un soporte solido. Una marca puede ser un polinucleotido, un polipeptido, un acido nucleico peptidico, un acido nucleico bloqueado, un oligosacarido, un polisacarido, un anticuerpo, un affibody, un mimetico de anticuerpo, un receptor de celula, un ligando, un lipido, biotina, polihistidina, o cualquier fragmento o derivado de estas estructuras, cualquier combination de los anteriores, o cualquier otra estructura con la que un elemento de captura (o molecula de conector, como se describe mas adelante) pueda disenarse o configurarse para unirse o asociarse de otro modo con especificidad. Generalmente, una marca esta configurada de forma que no interaccione intramolecularmente con tanto ella misma como el aptamero con el que se une o del que es una parte. Si se usa SELEX para identificar un aptamero, la marca puede anadirse al aptamero tanto pre- como post-SELEX. En una realizacion, la marca se incluye en el extremo 5' del aptamero post-SELEX. En otra realizacion, la marca se incluye en el extremo 3' del aptamero post-SELEX. En otra realizacion mas, las marcas pueden incluirse en tanto los extremos 3' como 5' de los aptameros en un proceso de modification post-SELEX. En otra realizacion, la marca puede estar interna en el aptamero.
En una realizacion, la marca es el grupo biotina y el elemento de captura es una proteina de union a biotina tal como avidina, estreptavidina, neutravidina, extravidina. Esta combinacion puede usarse convenientemente en diversas realizaciones, ya que la biotina se incorpora facilmente en aptameros durante la sintesis y las perlas de
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estreptavidina estan facilmente disponibles.
En una realizacion, la marca es polihistidina y el elemento de captura es acido nitrilotriacetico (NTA) quelado con un ion metalico tal como mquel, cobalto, hierro, o cualquier otro ion metalico capaz de formar un compuesto de coordinacion con poli-histidina cuando se quela con NTA.
En una realizacion, la marca es un polinucleotido que se disena para hibridarse directamente con un elemento de captura que contiene una secuencia de polinucleotidos complementaria. En este caso, la marca se denomina algunas veces una "marca de secuencia" y el elemento de captura se denomina generalmente una "sonda". En esta realizacion, la marca esta generalmente configurada y la reaccion de hibridacion se lleva a cabo en condiciones tales que la marca no se hibride con una sonda distinta de la sonda para la que la marca es un complemento perfecto. Esto permite el diseno de un formato de ensayo multiple, ya que combinacion de marca/sonda puede tener secuencias unicas.
En algunas realizaciones, la marca comprende nucleotidos que son una parte del propio aptamero. Por ejemplo, si se usa SELEX para identificar un aptamero, el aptamero generalmente incluye un extremo fijo en 5' separado del extremo fijo en 3' por una secuencia de nucleotidos que varia, dependiendo del aptamero, es decir, una region variable. En una realizacion, la marca puede comprender cualquier numero adecuado de nucleotidos incluidos en un extremo fijado del aptamero, tal como, por ejemplo, un extremo fijo entero o cualquier porcion de un extremo fijo, que incluye nucleotidos que estan internos en un extremo fijo. En otra realizacion, la marca puede comprender cualquier numero adecuado de nucleotidos incluidos dentro de la region variable del aptamero, tal como, por ejemplo, la region variable entera o cualquier porcion de la region variable. En otra realizacion, la marca puede comprender cualquier numero adecuado de nucleotidos que solapan tanto la region variable como uno de los extremos fijos, es decir, la marca puede comprender una secuencia de nucleotidos que incluye cualquier porcion (incluyendo todas) de la region variable y cualquier porcion (incluyendo todas) de un extremo fijo.
En otra realizacion, una marca puede asociarse directamente a una sonda y unirse covalentemente a la sonda, uniendo asi covalentemente el aptamero a la superficie del soporte solido. En esta realizacion, la marca y la sonda pueden incluir grupos reactivos adecuados que, tras la asociacion de la marca a la sonda, se aproximan lo suficientemente entre si para someterse a una reaccion quimica que produce un enlace covalente. La reaccion puede producirse espontaneamente o puede requerir activacion, tal como, por ejemplo, foto-activacion o activacion quimica. En una realizacion, la marca incluye un resto de dieno y la sonda incluye un dienofilo, y la formacion del enlace covalente resulta de una reaccion de conjugation de Diels-Alder espontanea del dieno y el dienofilo. Puede usarse cualquier quimica complementaria apropiada, tal como, por ejemplo, reaccion de N-Mannich, formacion de disulfuros, reaccion de Curtius, condensation de Aldol, formacion de base de Schiff y adicion de Michael.
En otra realizacion, la marca se asocia indirectamente a una sonda, tal como, por ejemplo, mediante una molecula de conector, como se describe adicionalmente mas adelante. En esta realizacion, la marca puede incluir una secuencia de polinucleotidos que es complementaria a una region o componente particular de una molecula de conector. La marca esta generalmente configurada y la reaccion de hibridacion se lleva a cabo de forma que la marca no se hibride con una secuencia de polinucleotidos distinta de la secuencia de polinucleotidos incluida en la molecula de conector.
Si la marca incluye un polinucleotido, el polinucleotido puede incluir cualquier numero adecuado de nucleotidos. En una realizacion, una marca incluye al menos aproximadamente 10 nucleotidos. En otra realizacion, la marca incluye de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 nucleotidos. En otra realizacion mas, la marca incluye al menos aproximadamente 30 nucleotidos. Diferentes marcas que incluyen un polinucleotido pueden incluir tanto el mismo numero de nucleotidos como un numero diferente de nucleotidos.
En algunas realizaciones, el componente de marca es bi-funcional porque incluye funcionalidad para la interaction especifica con un elemento de captura sobre un soporte solido o "sonda" como se define mas adelante (componente de asociacion de sonda), y funcionalidad para disociar la molecula con la que esta unida el componente de asociacion de sonda de la marca. Los medios para disociar el componente de asociacion de sonda de la marca incluyen medios quimicos, medios fotoquimicos, u otros medios que dependen de la marca particular que se emplea.
En algunas realizaciones, la marca se une al aptamero. En otras realizaciones, la marca se une a la molecula diana. La marca puede unirse a la molecula diana antes de la etapa de union del aptamero, o puede unirse a la molecula diana o complejo de afinidad por aptamero (o foto) despues de alcanzarse el equilibrado de union (o fotorreticulacion).
Composiciones de elemento de captura
Como se usa en el presente documento, "elemento de captura", "sonda" o "receptor" se refiere a una molecula que esta configurada para asociarse, tanto directa como indirectamente, a una marca. Un "elemento de captura", "sonda" o "receptor" es un conjunto de copias de un tipo de molecula o un tipo de estructura multi-molecular que es capaz de
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inmovilizar el resto al que la marca se une a un soporte solido asociandose, tanto directa como indirectamente, a la marca. "Elementos de captura", "sondas" o "receptores" se refieren a mas de un conjunto tal de moleculas. Un elemento de captura, sonda o receptor puede ser un polinucleotido, un polipeptido, un acido nucleico peptidico, un acido nucleico bloqueado, un oligosacarido, un polisacarido, un anticuerpo, un affibody, un mimetico de anticuerpo, un receptor de celula, un ligando, un lipido, biotina, polihistidina, o cualquier fragmento o derivado de estas estructuras, cualquier combinacion de los anteriores, o cualquier otra estructura con la que una marca (o molecula de conector) pueda disenarse o configurarse para unirse o asociarse de otro modo con especificidad. Un elemento de captura, sonda o receptor puede unirse a un soporte solido tanto covalentemente como no covalentemente por cualquier metodo adecuado.
Mientras que los terminos "elemento de captura", "sonda" y "receptor" se usan indistintamente, sonda generalmente se refiere a una secuencia de polinucleotidos. En una realizacion, la sonda incluye un polinucleotido que tiene una secuencia que es complementaria a una secuencia de marca de polinucleotido. En esta realizacion, la secuencia de sonda esta generalmente configurada y la reaccion de hibridacion se lleva a cabo en condiciones tales que la sonda no se hibride con una secuencia de nucleotidos distinta de la marca para que la sonda incluye la secuencia complementaria (es decir, la sonda esta generalmente configurada y la reaccion de hibridacion se lleva a cabo en condiciones tales que la sonda no se hibride con una marca o un aptamero diferente).
En otra realizacion, la sonda se asocia indirectamente a una marca, por ejemplo, mediante una molecula de conector. En esta realizacion, la sonda puede incluir una secuencia de polinucleotidos que es complementaria a una region o componente particular de una molecula de conector. La sonda esta generalmente configurada y la reaccion de hibridacion se lleva a cabo de forma que la sonda no se hibride con una secuencia de polinucleotidos distinta de la secuencia de polinucleotidos incluida en la molecula de conector.
Si una sonda incluye un polinucleotido, el polinucleotido puede incluir cualquier numero adecuado de nucleotidos. En una realizacion, una sonda incluye al menos aproximadamente 10 nucleotidos. En otra realizacion, una sonda incluye de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 nucleotidos. En otra realizacion mas, una sonda incluye al menos aproximadamente 30 nucleotidos. Diferentes sondas que incluyen un polinucleotido pueden incluir tanto el mismo numero de nucleotidos como un numero diferente de nucleotidos.
En algunas realizaciones, la sonda de captura es bi-funcional porque incluye funcionalidad para la interaccion especifica con una marca de polinucleotido, y funcionalidad para disociar la sonda del soporte solido de forma que la sonda y el aptamero se liberen simultaneamente. Los medios para disociar la sonda del soporte solido incluyen medios quimicos, medios fotoquimicos o cualquier medio que depende de la sonda de captura particular que se emplea.
Debido a la naturaleza reciproca de la interaccion entre un par marca particular y elemento de captura, una marca en una realizacion puede usarse como elemento de captura en otra realizacion, y un elemento de captura en una realizacion puede usarse como marca en otra realizacion. Por ejemplo, un aptamero con una marca de biotina puede ser capturado con estreptavidina unida a un soporte solido en una realizacion, mientras que un aptamero con una marca de estreptavidina puede ser capturado con biotina unida a un soporte solido en otra realizacion.
Marcado de diana
En algunas realizaciones, se desea inmovilizar complejos de afinidad por aptamero (o covalentes) a un soporte solido para permitir el aislamiento de complejos de afinidad por aptamero (o covalentes) y eliminar el aptamero libre. En una realizacion, la marca se anade a la molecula diana del complejo de afinidad (o covalente) usando un reactivo que es altamente reactivo con la molecula diana y debilmente reactivo (o idealmente no reactivo) con el aptamero. En esta realizacion, la marca se disena de forma que el marcado de diana de complejos de afinidad por aptamero se lleve a cabo con poca o ninguna disociacion del complejo de afinidad, por ejemplo, a un pH y fuerza ionica que es compatible con la interaccion de afinidad y no cambia la conformacion de la diana o el aptamero, y un grado de marcado que no introduce una gran pluralidad de marcas en cada molecula diana de forma que se afecte la interaccion con el aptamero. El marcado de diana de complejos covalentes de aptamero no comparte estas restricciones y puede llevarse a cabo bajo cualquier condicion adecuada para el marcado eficaz.
En algunas realizaciones, puede ser importante asegurar que el reactivo de marcado marque la mayoria, si no todas, de las proteinas presentes en una muestra de ensayo, pero no tienda a marcar, o marque solo mmimamente, acidos nucleicos u otros componentes del ensayo, tales como el soporte solido. Cualquier grupo quimico reactivo encontrado en las proteinas, pero no encontrado en acidos nucleicos o la superficie del sustrato, puede servir de sitio de union covalente. Grupos quimicos reactivos a modo de ejemplo incluyen aminas primarias (por ejemplo, en restos de lisina), tioles (por ejemplo, en cisteina, que puede producirse por la reduccion de enlaces disulfuro), alcoholes (por ejemplo, en serina, treonina, tirosina, y restos de azucar en glucoproteinas (incluyendo los productos de oxidacion de cis-dioles en tales azucares)) y carboxilatos (por ejemplo, en acido glutamico y aspartico). En una realizacion, el reactivo de marcado comprende una marca activada con N-hidroxisuccinimida, que reacciona preferencialmente con restos de lisina en proteinas y peptidos.
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Las condiciones optimas para marcar diferentes complejos de afinidad por aptamero (o foto) pueden ser diferentes, y normalmente se determinan empiricamente para optimizar la sensibilidad del metodo. En una realizacion, la concentracion del agente de marcado es normalmente suficiente para detectar al menos aproximadamente el 1 % de las moleculas diana. En otra realizacion, la concentracion del agente de marcado es normalmente suficiente para detectar al menos aproximadamente el 10 % de las moleculas diana. En otra realizacion, la concentracion del agente de marcado es normalmente suficiente para detectar al menos aproximadamente el 90 % de las moleculas diana.
En una realizacion, la diana es una proteina o peptido y la marca es una biotina unida a la diana usando un reactivo estandar para la biotinilacion de proteinas, tal como, por ejemplo, NHS-PEO4-biotina. Otros reactivos adecuados incluyen sulfo-NHS-LC-biotina, PFP-biotina, TFP-PEO3-biotina, o cualquier otro reactivo adecuado que pueda usarse para unir una marca a una proteina.
IX. Conectores y conectores escindibles
Como se usa en el presente documento, un conector es una estructura molecular que se usa para conectar dos grupos funcionales o estructuras moleculares. Como se usa en el presente documento, "conector espaciador", o mas simplemente un "espaciador", se refiere a un grupo de atomos benignos que proporciona separacion o espacio entre dos grupos funcionales diferentes dentro de un aptamero. Como se usa en el presente documento, un elemento, resto o conector "separable" o "escindible" se refiere a una estructura molecular que puede romperse para producir dos componentes separados. Un elemento separable (o escindible) puede comprender una unica molecula en la que un enlace quimico puede romperse (denominado en el presente documento un "conector escindible integrado"), o puede comprender dos o mas moleculas en las que una interaction no covalente puede romperse o alterarse (denominado en el presente documento un "conector de hibridacion").
Conector espaciador
En algunas realizaciones, es necesario separar espacialmente ciertos grupos funcionales de otros con el fin de prevenir la interferencia con las funcionalidades individuales. Por ejemplo, la presencia de una etiqueta, que absorbe ciertas longitudes de onda de luz, proximas a un grupo fotoescindible puede interferir con la eficiencia de la fotoescision. Por tanto, es deseable separar tales grupos con un resto de no interferencia que proporcione separacion espacial suficiente para recuperar, por ejemplo, la actividad completa de fotoescision. En algunas realizaciones, un "conector espaciador" se ha introducido en un aptamero con tanto una etiqueta como funcionalidad de fotoescision.
En una realizacion, se introducen espaciadores conectores en el aptamero durante la sintesis y asi puede estar comprendido de un numero de espaciadores de fosforamidito, que incluyen, pero limitados a, cadenas de carbono alifaticas de longitud 3, 6, 9, 12 y 18 atomos de carbono, cadenas de polietilenglicol de longitud 1, 3 y 9 unidades de etilenglicol, o un resto de tetrahidrofurano (llamado dSpacer (Glenn Research) o cualquier combination de los anteriores o cualquier otra estructura o componente quimico que pueda disenarse o configurarse para anadir longitud a lo largo de un esqueleto de fosfodiester. En otra realizacion, el conector espaciador incluye polinucleotidos, tales como poli dT, dA, dG, o dC o poli U, A, G, o C o cualquier combinacion de los anteriores. En otra realizacion, los espaciadores incluyen uno o mas restos de ribosa o desoxirribosa abasicos. Observese que tales secuencias se disenan de forma que no interfieran con la estructura o funcion del aptamero.
Conector escindible integrado
Como se usa en el presente documento, un "conector escindible integrado" se refiere a un grupo de atomos que contiene un elemento separable o escindible. En algunas realizaciones, un conector escindible integrado se usa para unir un aptamero a una marca, formando asi una marca separable. Por ejemplo, puede utilizarse un conector separable integrado en cualquiera de los ensayos descritos para crear una conexion separable entre un aptamero y una biotina (por ejemplo, en los ensayos de afinidad y ensayos de reticulation) o una conexion separable entre un aptamero y un grupo de fotorreticulacion (por ejemplo, en los ensayos de reticulacion).
En una realizacion, el conector escindible integrado puede ser foto-escindible porque incluye un enlace que puede escindirse irradiando el elemento separable a la longitud de onda apropiada de luz. En otra realizacion, el conector escindible integrado puede ser quimicamente escindible porque incluye un enlace que puede escindirse tratandolo con un reactivo quimico o enzimatico apropiado. En otra realizacion, el elemento separable incluye un enlace disulfuro que puede escindirse tratandolo con un agente reductor para alterar el enlace.
Conector de hibridacion
Como se usa en el presente documento, un "conector de hibridacion " se refiere a un conector que comprende dos o mas moleculas en las que una interaccion no covalente puede romperse o alterarse mediante metodos quimicos o fisicos. En algunas realizaciones, un conector de hibridacion se usa para unir un aptamero a una marca, formando asi una marca separable. Por ejemplo, puede utilizarse un conector de hibridacion en cualquiera de los ensayos descritos para crear una conexion separable entre un aptamero y una biotina (por ejemplo, en los ensayos de
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afinidad y ensayos de reticulacion) o una conexion separable entre un aptamero y un grupo de fotorreticulacion (por ejemplo, en los ensayos de reticulacion).
En una realizacion, un conector de hibridacion comprende dos acidos nucleicos que se hibridan para formar un enlace no covalente. En una realizacion, uno de los acidos nucleicos que forma el enlace de hibridacion puede ser una region del propio aptamero y el otro acido nucleico puede ser un acido nucleico que es complementario a esa region. La liberacion puede llevarse a cabo por cualquier mecanismo adecuado para alterar los duplex de acido nucleico (mientras que todavia mantengan la compatibilidad con el ensayo). En una realizacion, se usa NaOH 20 mM para altera el conector de hibridacion en el ensayo de fotorreticulacion de captura doble. Un molecula de conector de hibridacion puede tener cualquier configuracion adecuada y puede incluir cualquier componente adecuado, que incluye uno o mas polinucleotidos, polipeptidos, acidos nucleicos peptidicos, acidos nucleicos bloqueados, oligosacaridos, polisacaridos, anticuerpos, affibodies, mimeticos o fragmentos de anticuerpo, receptores, ligandos, lipidos, cualquier fragmento o derivado de estas estructuras, cualquier combination de los anteriores, o cualquier otra estructura o componente quimico que pueda disenarse o configurarse para formar una estructura separable.
En una realizacion, la marca separable consiste en al menos un polinucleotido que consiste en un numero adecuado de nucleotidos. En una realizacion, un componente de polinucleotido de una molecula de conector incluye al menos aproximadamente 10 nucleotidos. En otra realizacion, un componente de polinucleotido de una molecula de conector incluye de aproximadamente 10 a aproximadamente 45 nucleotidos. En otra realizacion mas, un componente de polinucleotido de una molecula de conector incluye al menos aproximadamente 30 nucleotidos. Las moleculas de conector usadas en cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento pueden incluir componentes de polinucleotido que tienen tanto el mismo numero de nucleotidos como un numero diferente de nucleotidos.
X. Soportes solidos para su uso en Captura 1 y Captura 2
"Soporte solido" se refiere a cualquier sustrato que tiene una superficie al que las moleculas pueden unirse, directa o indirectamente, mediante tanto enlaces covalentes como no covalentes. El soporte solido puede incluir cualquier material de sustrato que sea capaz de proporcionar soporte fisico para los elementos de captura o sondas que se unen a la superficie. El material es generalmente capaz de aguantar condiciones relacionadas con la union de los elementos de captura o sondas a la superficie y cualquier tratamiento, manipulation o procesamiento posterior encontrado durante la realizacion de un ensayo. Los materiales pueden existir de forma natural, ser sinteticos, o una modification de un material que existe de forma natural. Materiales de soporte solido adecuados pueden incluir silicio, grafito, superficies de espejo, laminados, ceramicas, plasticos (incluyendo polimeros tales como, por ejemplo, poli(cloruro de vinilo), copolimeros de ciclo-olefinas, geles de agarosa, poliacrilamida, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(tereftalato de etileno), politetrafluoroetileno (PTFE o Teflon®), nailon, poli(butirato de vinilo)), germanio, arseniuro de galio, oro, plata, etc., tanto usados ellos mismos como conjuntamente con otros materiales. Pueden considerarse materiales rigidos adicionales, tales como vidrio, que incluye silice y adicionalmente incluye, por ejemplo, vidrio que esta disponible como Bioglass. Otros materiales que pueden emplearse incluyen materiales porosos, tales como, por ejemplo, perlas de vidrio de poro controlado, Sepharose en perlas reticulada o resinas de agarosa, o copolimeros de bisacrilamida reticulada y azalactona. Tambien se contempla cualquier otro material conocido en la tecnica que sea capaz de tener uno o mas grupos funcionales, tal como cualquiera de un grupo funcional amino, carboxilo, tiol, o hidroxilo, por ejemplo, incorporado sobre su superficie.
El material usado para un soporte solido puede tomar cualquiera de varias configuraciones que varian de simples a complejas. El soporte solido puede tener una cualquiera de varias formas, que incluyen una tira, placa, disco, varilla, particula, que incluye perla, tubo, pocillo y similares. El soporte solido puede ser poroso o no poroso, magnetico, paramagnetico, o no magnetico, polidisperso o monodisperso, hidrofilo o hidrofobo. El soporte solido tambien puede estar en forma de un gel o suspension de particulas estrechamente empaquetadas (como en una matriz de columna) u holgadamente empaquetadas.
En una realizacion, el soporte solido con elemento de captura unido se usa para capturar complejos de afinidad por aptamero o complejos covalentes de aptamero marcados de una mezcla de ensayo. En un ejemplo particular, cuando la marca es un resto de biotina, el soporte solido podria ser una perla recubierta de estreptavidina o resina tal como DynaBeads M-280 Streptavidin, DynaBeads MyOne Streptavidin, DynaBeads M-270 Streptavidin (Invitrogen), Streptavidin Agarose Resin (Pierce), Streptavidin Ultralink Resin, perlas MagnaBind Streptavidin (Thermo Scientific), BioMag Streptavidin, ProMag Streptavidin, Silica Streptavidin (Bangs Laboratories), Streptavidin Sepharose High Performance (GE Healthcare), Streptavidin Polystyrene Microspheres (Microspheres-Nanospheres), Streptavidin Coated Polystyrene Particles (Spherotech), o cualquier otra perla recubierta de estreptavidina o resina comunmente usada por un experto en la materia para capturar moleculas marcadas con biotina.
XI. Metodos de deteccion
Como se ha descrito anteriormente, es un objetivo de la presente divulgation convertir una senal de proteina en una senal de aptamero. Como resultado, la cantidad de aptameros recogidos/detectados es indicativo de, y puede ser
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directamente proporcional a, la cantidad de moleculas diana unidas y a la cantidad de moleculas diana en la muestra. Pueden emplearse varios esquemas de deteccion sin eluir el complejo de afinidad por aptamero o covalente de aptamero del segundo soporte solido despues de la separacion de Captura 2. Ademas de las siguientes realizaciones de metodos de deteccion, otros metodos de deteccion seran conocidos para un experto en la materia/
Deteccion: Etiquetas y marcado de aptamero
Muchos metodos de deteccion requieren que una etiqueta explicita se incorpore en el aptamero antes de la deteccion. Algunas etiquetas, tales como colorantes fluorescentes o quimioluminiscentes, pueden incorporarse en aptameros tanto durante como despues de la sintesis usando tecnicas convencionales para la sintesis de acidos nucleicos. Pueden incorporarse etiquetas radiactivas tanto durante la sintesis como despues de la sintesis usando reacciones enzimaticas estandar con los reactivos apropiados. Tambien puede producirse marcado despues de la separacion de Captura 2 y la elucion usando diversas tecnicas enzimaticas para un experto en la materia. Por ejemplo, usando un cebador con las etiquetas anteriormente mencionadas, la PCR incorporara etiquetas en el producto de amplificacion de los aptameros eluidos. Si se usa una tecnica en gel para la cuantificacion, pueden incorporarse diferentes etiquetas de masa de tamano usando PCR tambien. Estas etiquetas de masa tambien pueden incorporar diferentes colorantes fluorescentes o quimioluminiscentes para la capacidad multiple adicional. Las etiquetas pueden anadirse indirectamente a los aptameros usando una marca especifica incorporada en el aptamero, tanto durante la sintesis como despues de la sintesis, y entonces anadir una sonda que se asocia a la marca y lleva la etiqueta. Las etiquetas incluyen aquellas descritas anteriormente, ademas de enzimas usadas en ensayos estandar para, por ejemplo, lecturas colorimetricas.
Deteccion: Deteccion de un unico aptamero
Por ejemplo, el aptamero puede marcarse, como se ha descrito anteriormente, con un isotopo radiactivo tal como 32P antes de ponerse en contacto con la muestra de ensayo. Empleando uno cualquiera de los cuatro ensayos basicos, y variaciones de los mismos como se trata anteriormente, la deteccion del aptamero puede realizarse simplemente cuantificando la radioactividad sobre el segundo soporte solido al final del ensayo. Los recuentos de radioactividad seran directamente proporcionales a la cantidad de diana en las muestras de ensayo originales. Similarmente, el marcado de un aptamero con un colorante fluorescente, como se ha descrito anteriormente, antes de poner en contacto con la muestra de ensayo permite una lectura fluorescente simple directamente sobre el segundo soporte solido. Puede emplearse una etiqueta quimioluminiscente o un punto cuantico similarmente para la lectura directa del segundo soporte solido, no requiriendo elucion del aptamero.
Eluyendo el aptamero o liberando el complejo covalente de fotoaptamero del segundo soporte solido adicional pueden emplearse esquemas de deteccion, ademas de aquellos descritos anteriormente. Por ejemplo, el aptamero liberado, fotoaptamero o complejo covalente de fotoaptamero pueden ejecutarse sobre un gel PAGE y detectarse y opcionalmente cuantificarse con una tincion de acidos nucleicos, tal como SYBR Gold. Alternativamente, el aptamero liberado, fotoaptamero o complejo covalente de fotoaptamero pueden detectarse y cuantificarse usando electroforesis en gel capilar (CGE) usando una etiqueta fluorescente incorporada en el aptamero como se ha descrito anteriormente. Otro esquema de deteccion emplea PCR cuantitativa para detectar y cuantificar el aptamero eluido, por ejemplo, usando SYBR Green. Alternativamente, puede emplearse el ensayo de ADN Invader® para detectar y cuantificar el aptamero eluido.
En otra realizacion, la cantidad o concentracion del complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero) se determina usando una "sonda fluorescible molecular" durante un proceso de replicacion (vease, por ejemplo, Tyagi et al., Nat. Biotech. 16:49 53, 1998; patente de EE.UU. N.° 5.925.517). Una sonda fluorescible molecular es una sonda de acido nucleico especifica que se pliega en un bucle en horquilla y contiene un fluor sobre un extremo y un extintor sobre el otro extremo de la estructura de horquilla de forma que se genera poca o ninguna senal por el fluor cuando se forma la horquilla. La secuencia del bucle es especifica para una secuencia de polinucleotidos diana y, tras la hibridacion con la secuencia del aptamero, la horquilla se despliega y asi genera una senal fluorescente.
Deteccion: Deteccion de multiples aptameros para pequenos numeros de analitos.
Para la deteccion multiple de un pequeno numero de aptameros todavia unidos al segundo soporte solido, pueden emplearse colorantes fluorescentes con diferentes espectros de excitacion / emision para detectar y cuantificar dos, o tres, o cinco, o hasta diez aptameros individuales. Similarmente, pueden emplearse puntos cuanticos de tamano diferente para las lecturas multiples. Los puntos cuanticos pueden introducirse despues de la separacion del aptamero libre del segundo soporte solido. Usando secuencias de hibridacion especificas de aptamero unidas a puntos cuanticos unicos pueden realizarse lecturas multiples para 2, 3, 5 y hasta 10 aptameros. Tambien puede usarse marcado de diferentes aptameros con diferentes isotopos radiactivos que pueden ser individualmente detectados, tales como 32P, 125I, 3H, 13C y 35S, para lecturas multiples limitadas.
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Deteccion: Deteccion de multiples aptameros a gran escala
Para la deteccion multiple de aptameros liberados del segundo soporte solido de Captura 2, puede usarse un unico colorante fluorescente, incorporado en cada aptamero como se ha descrito anteriormente, con un metodo de cuantificacion que permite la identificacion de la secuencia del aptamero junto con la cuantificacion del nivel de aptamero. Los metodos incluyen, pero no se limitan a, hibridacion en chip de ADN, hibridacion en micro-perla y analisis CGE.
Deteccion: Chips de hibridacion de ADN
En una realizacion, se usa una matriz de hibridacion de ADN estandar, o chip, para hibridar cada aptamero o fotoaptamero con una sonda unica o serie de sondas unicas inmovilizadas sobre un portaobjetos o chip tal como matrices Agilent, matrices Illumina BeadChip o matrices NimbleGen. Cada sonda unica es complementaria a una secuencia en el aptamero. La secuencia complementaria puede ser una marca de hibridacion unica incorporada en el aptamero, o una porcion de la secuencia del aptamero, o la secuencia del aptamero entera. Los aptameros liberados del soporte solido de Captura 2 se anaden a un tampon de hibridacion apropiado y se procesan usando metodos de hibridacion estandar. Por ejemplo, la solucion de aptamero se incuba durante 12 horas con una matriz de hibridacion de ADN a aproximadamente 60 °C para garantizar la rigurosidad de la hibridacion. Las matrices se lavan y entonces se barren en un escaner de portaobjetos fluorescente, produciendo una imagen de la intensidad de hibridacion del aptamero en cada caracteristica de la matriz. Se lleva a cabo segmentacion y cuantificacion de imagenes usando software de procesamiento de imagenes, tal como ArrayVision. En una realizacion, pueden detectarse ensayos de aptamero multiple usando hasta 25 aptameros, hasta 50 aptameros, hasta 100 aptameros, hasta 200 aptameros, hasta 500 aptameros, hasta 1000 aptameros y hasta 10.000 aptameros.
Deteccion: Hibridacion tipo Luminex
En una realizacion, se usan micro-perlas direccionables que tienen sondas de ADN unicas complementarias a los aptameros como se ha descrito anteriormente para la hibridacion. Las micro-perlas pueden ser direccionables con colorantes fluorescentes unicos, tales como tecnologia de perlas Luminex, o usar etiquetas de codigos de barras como en la tecnologia Illumina VeraCode, o transpondedores laser. En una realizacion, los aptameros liberados del soporte solido de Captura 2 se anaden a un tampon de hibridacion apropiado y se procesan usando metodos de hibridacion de micro-perlas estandar. Por ejemplo, la solucion de aptamero se incuba durante dos horas con un conjunto de micro-perlas a aproximadamente 60 °C para garantizar la rigurosidad de la hibridacion. Las soluciones se procesan entonces en un instrumento Luminex que cuenta los tipos de perlas individuales y cuantifica la senal fluorescente del aptamero. En otra realizacion, perlas VeraCode se ponen en contacto con la solucion de aptamero y se hibridan durante dos horas a aproximadamente 60 °C y luego se depositan sobre una superficie de rejilla y se barren usando un escaner de portaobjetos para la identificacion y cuantificacion de fluorescencia. En otra realizacion, las micro-perlas del transpondedor se incuban con la muestra de aptamero a aproximadamente 60 °C y entonces se cuantifican usando un dispositivo apropiado para las micro-perlas del transpondedor. En una realizacion, pueden detectarse ensayos de aptamero multiple por hibridacion con micro-perlas usando hasta 25 aptameros, hasta 50 aptameros, hasta 100 aptameros, hasta 200 aptameros y hasta 500 aptameros.
Deteccion: Electroforesis en gel capilar (CGE)
La muestra que contiene los aptameros eluidos puede procesarse para incorporar etiquetas de masa unicas junto con etiquetas fluorescentes como se ha descrito anteriormente. Los aptameros marcados con masa se inyectan entonces en un instrumento de CGE, esencialmente un secuenciador de ADN, y los aptameros se identifican por sus masas unicas y se cuantifican usando fluorescencia del colorante incorporada durante la reaccion de marcado. Un ejemplo a modo de ejemplo de esta tecnica ha sido desarrollado por Althea Technologies.
Deteccion: Amplificacion antes de la deteccion
En muchos de los metodos descritos anteriormente, la solucion de aptameros puede amplificarse y opcionalmente marcarse antes de la cuantificacion. Puede usarse amplificacion por PCR estandar con la solucion de aptameros eluidos del soporte solido de Captura 2. Tal amplificacion puede usarse antes de la hibridacion en matrices de ADN, hibridacion en micro-perlas y lectura de CGE.
Deteccion: Otros metodos basados en PCR
En otra realizacion, el complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero) se detecta y/o cuantifica usando Q-PCR. Como se usa en el presente documento, "Q-PCR" se refiere a una reaccion de pCr realizada de tal forma y bajo condiciones controladas tales que los resultados del ensayo sean cuantitativos, es decir, el ensayo sea capaz de cuantificar la cantidad o concentracion de aptamero presente en la muestra de ensayo.
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En una realization, la cantidad o concentration del complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero) en la muestra de ensayo se determina usando pCr TaqMan®. Esta tecnica generalmente se basa en la actividad de 5'-3' exonucleasa de la enzima de replication de oligonucleotidos para generar una senal de una secuencia diana. Se selecciona una sonda TaqMan basandose en la secuencia del aptamero que va a cuantificarse y generalmente incluye un fluor del extremo 5', tal como 6-carboxifluorescema, por ejemplo, y un extintor del extremo 3', tal como, por ejemplo, una 6-carboxitetrametilfluorescema, para generar senal a medida que la secuencia del aptamero se amplifica usando reaction en cadena de la polimerasa (PCR). A medida que la polimerasa copia la secuencia del aptamero, la actividad de exonucleasa libera el fluor de la sonda, que se hibrida en la direction 3' de los cebadores de PCR, generando asi la senal. La senal aumenta a medida que se produce el producto de replicacion. La cantidad de producto de PCR depende de tanto el numero de ciclos de replicacion realizados, ademas de la concentracion de partida del aptamero.
En otra realizacion, la cantidad o concentracion de un complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero) se determina usando un colorante fluorescente intercalante durante el proceso de replicacion. El colorante intercalante, tal como, por ejemplo, SYBR® Green, genera una gran senal fluorescente en presencia de ADN bicatenario en comparacion con la senal fluorescente generada en presencia de ADN monocatenario. A medida que el producto de ADN bicatenario se forma durante la PCR, la senal producida por el colorante aumenta. La magnitud de la senal producida depende de tanto el numero de ciclos de PCR como de la concentracion de partida del aptamero.
Deteccion: Espectroscopia de masas
En otra realizacion, el complejo de afinidad por aptamero (o complejo covalente de aptamero) se detecta y/o cuantifica usando espectrometria de masas. Pueden introducirse marcas de masa unica usando las tecnicas enzimaticas descritas anteriormente. Para la lectura de espectroscopia de masas, no se requiere etiqueta de deteccion, mas bien se usa la propia masa para tanto identificar como, usando tecnicas comunmente usadas por aquellos expertos en la materia, cuantificar basandose en la localization y area bajo los picos de masa generados durante los analisis de espectroscopia de masas. Un ejemplo usando espectroscopia de masas es el sistema MassARRAY® desarrollado por Sequinom.
XII. Composicion de aptameros
Se proporcionan construcciones de aptamero que incluyen diferentes funcionalidades incorporadas. Estas funcionalidades pueden incluir marcas para la inmovilizacion, etiquetas para la deteccion, grupos fotorreactivos, medios para promover o controlar la separation, etc. En una realizacion, un aptamero incluye una section escindible o separable (tambien descrita como un elemento o componente) en la secuencia del aptamero. Estos componentes o elementos adicionales son elementos o componentes estructurales que introducen funcionalidad adicional en el aptamero y asi son elementos o componentes funcionales. En otras realizaciones, el aptamero incluye uno o mas de los siguientes componentes adicionales (tambien descritos en el elemento o componente o resto funcional o estructural): un componente marcado o detectable, un componente espaciador, un elemento escindible, y una marca de union especifica o el elemento o componente de inmovilizacion. Por ejemplo, en una realizacion del aptamero de fotorreticulacion, el aptamero incluye una marca conectada al aptamero mediante un resto escindible, una etiqueta, un componente espaciador que separa la etiqueta y el resto escindible, y un resto de fotorreticulacion, como se muestra en la FIG. 3L.
Todas las construcciones de aptamero pueden sintetizarse usando quimica de fosforamidito estandar. Construcciones de aptamero representativas se muestran en las FIG. 3A a FIG. 3L. La funcionalidad puede fraccionarse entre el extremo 5' y 3' o combinarse en cualquier extremo. Ademas de restos fotoescindibles, pueden usarse otros restos escindibles, que incluyen restos quimicamente o enzimaticamente escindibles. Puede usarse varios restos de espaciador y pueden incluirse uno o mas restos de biotina. Tambien pueden incorporarse marcas (tambien denominados los elementos o componentes de inmovilizacion o de union especifica) distintas de biotina. Reactivos de construction adecuados incluyen biotina fosforamidito, PC Linker (Glen Research PN 10-4920-02); PC biotin phosphoramidite (Glen Research PN 10-4950-02); dSpacer CE phosphoramidite (Glen Research PN 10-191402); Cy3 Phosphoramidite (Glen Research PN 10-5913-02); y Arm26-Ach Spacer Amidite (Fidelity Systems PN SP26Ach-05). Como se ilustra en la FIG. 3K, un colorante fluorescente (tal como Cy3), un espaciador, los restos fotoescindibles y de biotina pueden anadirse al extremo del aptamero. En una realizacion, debido a las posibles interacciones entre el resto fotoescindible y el colorante, el espaciador se inserta entre estos dos restos.
En una realizacion, la marca se une covalentemente al aptamero, como se ilustra en las FIGS. 3I-3K. En otra realizacion, la marca se une indirectamente al aptamero en forma de una secuencia de polinucleotidos hibridada, que es complementaria a una portion de la secuencia del aptamero, que tiene una marca covalentemente unida, como se ilustra en las FIGS. 3E-3H.
En una realizacion, un aptamero puede modificarse adicionalmente para incluir un primer resto escindible situado entre el grupo de reticulation y una secuencia unica dentro del aptamero. Este primer resto escindible puede, por ejemplo, ser escindible mediante varios medios diferentes que incluyen quimicos, fotoquimicos o ionicos
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dependiendo del resto escindible empleado. En una realizacion, un aptamero tiene la estructura mostrada en la FIG. 3B. Por ejemplo, el grupo de fotorreticulacion puede ser 4-azido-2-nitro-anilina y el grupo fotoescindible, o resto separable, puede ser un conector PC disponible de Glen Research como fosforamidito (-(4,4'-dimetoxitritil)-1-(2- nitrofenil)-propan-1-il-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidito).
En otras realizaciones, el aptamero incluye una marca de captura que esta unida al aptamero mediante un grupo separable. Por ejemplo, una marca de captura de biotina puede unirse al aptamero mediante un segundo oligonucleotido que se hibrida con el aptamero como se ilustra en la FIG. 3F. En otras realizaciones, otras marcas de captura o elementos escindibles pueden unirse al mismo aptamero. Por ejemplo, una marca de poli-His puede unirse al aptamero mediante un segundo resto quimico o fotoescindible. La ventaja de esta construccion de aptamero es que pueden aplicarse dos etapas de procesamiento diferentes para separar el complejo de afinidad por aptamero (o covalente) de otros componentes en la muestra de ensayo. Estas etapas de separation pueden usarse en cualquier secuencia deseada.
En otra realizacion, tambien puede incluirse una etiqueta de detection dentro del aptamero como se ilustra en la FIG. 3C. Esta etiqueta de deteccion proporciona la deteccion y/o cuantificacion del aptamero libre en la etapa final del ensayo como se describe en detalle anteriormente. Por ejemplo, para la deteccion fluorescente, un colorante fluorescente tal como el colorante Cy3 o Cy5 puede incorporarse dentro del aptamero. Puede introducirse Cy3 usando el fosforamidito Cy3 de Glen Research (cloruro de [3-(4-monometoxitritiloxi) propil]-1'-[3-[(2-cianoetil)-(N,N- diisopropil)fosforamiditil]propil]-3,3,3',3'-tetrametilindocarbocianina)), pero puede incluirse cualquier etiqueta adecuada en el aptamero.
XIII. Definiciones generales
Como se usa en esta memoria descriptiva, que incluye las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular "un", "una", "el" y "la" incluyen referencias en plural, a menos que el contenido dicte claramente de otro modo, y se usan indistintamente con "al menos uno" y "uno o mas." Asi, referencia a "un aptamero" incluye mezclas de aptameros, referencia a "una sonda" incluye mezclas de sondas, y similares.
Como se usa en el presente documento, los terminos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "contiene", "que contiene", y cualquier variation de los mismos, pretende cubrir una inclusion no exclusiva, de forma que un proceso, metodo, producto por proceso, o composition de materia que comprende, incluye o contiene un elemento o lista de elementos, no incluya solo aquellos elementos, sino que puede incluir otros elementos no expresamente enumerados o inherentes a tal proceso, metodo, producto por proceso o composicion de materia.
Como se usa en el presente documento, el termino "aproximadamente" representa una modification o variacion insignificativa de los valores numericos tal que la funcion basica del articulo a la que se refiere el valor numerico sea igual.
Como se usa en el presente documento, "asociar", "se asocia", y cualquier variacion de los mismos, se refiere a una interaction o complejacion entre una marca y una sonda que produce un complejo suficientemente estable para permitir la separacion de materiales "no asociados" o no unidos, tales como, por ejemplo, componentes no unidos de una muestra de ensayo, del complejo marca-sonda bajo condiciones de complejacion o de reaction dadas. Una marca y una sonda pueden asociarse entre si directamente por interaccion y uniendose entre si con especificidad. Una marca y una sonda tambien pueden asociarse entre si indirectamente tal como cuando su complejacion esta mediada por una molecula de conector.
Puede utilizarse un programa informatico para llevar a cabo una o mas etapas de cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento. Otro aspecto de la presente divulgation es un producto de programa informatico que comprende un medio de almacenamiento legible por ordenador que tiene un programa informatico almacenado en el que, cuando se carga en un ordenador, realiza o ayuda en la realizacion de cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento.
Un aspecto de la divulgacion es un producto de cualquiera de los metodos desvelados en el presente documento, concretamente, un resultado de ensayo, que puede evaluarse en el lugar donde se realiza el ensayo o puede transportarse a otro lugar para la evaluation y comunicacion a una parte interesada en una localization remota, si se desea. Como se usa en el presente documento, "localizacion remota" se refiere a una localizacion que es fisicamente diferente de aquella en la que se obtienen los resultados. Por consiguiente, los resultados pueden ser enviados a una sala diferente, un edificio diferente, una parte diferente de la ciudad, una ciudad diferente, etc. Los datos pueden transmitirse por cualquier medio adecuado tal como, por ejemplo, fax, correo, entrega nocturna, correo electronico, ftp, mensaje de voz, y similares.
"Comunicar" information se refiere a la transmision de los datos que representan esa information como senales electricas mediante un canal de comunicacion adecuado (por ejemplo, una red privada o publica). "Remitir" un articulo se refiere a cualquier medio para conseguir ese articulo de una localizacion a la siguiente, tanto transportando fisicamente ese articulo como de otro modo (donde eso sea posible) e incluye, al menos en el caso de
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datos, transportar fisicamente un medio que lleva los datos o que comunica los datos.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se proporcionan para fines ilustrativos solo y no pretenden limitar el alcance de la invencion como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Lo anterior describe la divulgacion con referencia a diversas realizaciones y ejemplos. Ninguna realizacion particular, ejemplo, o elemento de una realizacion o ejemplo particular, debe interpretarse como un elemento o caracteristica critico, requerido o esencial de cualquiera de las reivindicaciones.
Se apreciara que pueden hacerse diversas modificaciones y sustituciones a las realizaciones desveladas. La memoria descriptiva, que incluye las figuras y ejemplos, va a considerarse de una forma ilustrativa, en vez de una restrictiva, y todas tales modificaciones y sustituciones pretenden estar incluidas dentro del alcance de la divulgacion. El alcance de la invencion puede determinarse por las reivindicaciones adjuntas, en vez de por los ejemplos.
Ejemplo 1. Construcciones de aptamero y de cebador
Se produjeron construcciones de aptamero y de cebador biotinilado con diferentes grupos funcionales del extremo 5' y las diferencias se muestran en la FIG. 6. El aptamero contuvo un colorante fluorescente Cy3 (Cy3 Phosphoramidite de Glen Research (cloruro de [3-(4-monometoxitritiloxi)propil]-T-[3-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)fosforamiditir]propil]- 3,3,3',3'-tetramethilindocarbocianina)) en el extremo 5', y el cebador contuvo dos restos de biotina ((AB)2), un conector (T)8 y un resto fotoescindible (PC Linker disponible de Glen Research como fosforamidito (-(4,4'- dimetoxitritil)-1-(2-nitrofenil)-propan-1-il-[(2-cianoetil)-(N,N-diisopropil)]-fosforamidito). Para el metodo descrito en la FIG. 6, el aptamero contuvo un grupo de reticulacion fotorreactivo denominado en el presente documento ANA (4- azido-2-nitro-anilina), un resto fotoescindible (PC Linker) y un colorante Cy3 en el extremo 5', y el cebador contuvo dos restos de biotina y un conector (T)8.
Ejemplo 2. Metodo de union por afinidad (metodo de Captura 2)
a) Tampon
Se combinaron 30 pl de una mezcla Cy3-aptamero (2 nM cada aptamero) con 30 pl de una mezcla (AB)2-T8-PC- cebador (6 nM para cada cebador) en SB 17T y se incubo a 95 °C durante 4 minutos, a 37 °C durante 13 minutos. En una reaccion separada, se prepararon 60 pl de una mezcla de proteina diana (2X concentracion en SB 17T). Se combinaron 55 pl de la mezcla de proteina diana con 55 pl de la mezcla aptamero/cebador en una placa de 96 pocillos (Omni-Tube Plate, Abgene #AB0407) y se incubo a 37 °C durante 15 minutos para lograr el equilibrio de union. Todas las siguientes etapas se realizaron a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario.
b) Plasma, suero o sangre completa
Se combinaron 30 pl de una mezcla Cy3-aptamero (2 nM cada aptamero) con 30 pl de una mezcla (AB)2-T8-PC- cebador (6 nM para cada cebador) en SB 17T y se incubo a 95 °C durante 4 minutos, a 37 °C durante 13 minutos. En una reaccion separada, se prepararon 30 pl de una dilucion 1x a 2,5x de una mezcla compleja de proteinas biologicas (plasma, suero, sangre completa) en un diluyente que contenia el oligonucleotido competidor Z-Block (5'- (ACZZ)7AC-3', donde Z = 5-bencil-duTP, 4 pM) y se incubo durante 5 minutos. La mezcla compleja de proteinas biologicas se combino con 30 pl de una mezcla de proteina diana (concentracion 4X en SB 17T). Se combinaron 55 pl de la mezcla proteina diana/matriz biologica con 55 pl de la mezcla aptamero/cebador y se incubo a 37 °C durante 15 minutos para lograr el equilibrio de union. Todas las siguientes etapas se realizaron a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario.
c) Captura de aptamero biotinilado y eliminacion de proteina libre
Se lavaron 133 pl de resina de estreptavidina-agarosa (estreptavidina inmovilizada de Pierce, #20353, suspension acuosa al 7,5 %) dos veces con 200 pl de SB 17T por filtracion a vacio a traves de una membrana Durapore (MultiScreen-HV45, Millipore #MAHVN4550). Se anadieron 100 pl de la mezcla aptamero:protema a la resina lavada y se mezclo durante 15 minutos. La resina se lavo una vez con 200 pl de SB 17T que contenia biotina 10 pM (Sigma-Aldrich, Inc. #B4501-1G) y una vez con 200 pl de SB 17T por filtracion a vacio.
d) Marcado de proteina y liberacion de aptamero
Se anadieron 100 pl de SB 17T que contenia NHS-PEO4-biotina 1,2 mM (Pierce #21329) a la resina lavada y se mezclo durante 20 minutos. La resina se lavo cinco veces con 200 pl de SB 17T por filtracion a vacio y una vez con 200 pl de SB 17T por centrifugacion, se resuspendio en 75 pl de SB 17T que contenia sulfato de dextrano 10 mM (Mr ~5000, Sigma-Aldrich #31404), y se irradio con una lampara de UV (dos bombillas de luz negra Silvania 350,
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e) Captura de proteina y eliminacion de aptamero libre
Se anadieron 50 pl de resina de estreptavidina (DynaBeads MyOne Streptavidin C1, Invitrogen #650-03, 10 mg/ml en SB 17T) a una membrana Durapore. Se anadieron 225 pl de la mezcla aptamero:protema a la resina y se mezclaron durante 15 minutos. La resina se lavo dos veces con 200 pl de SB 17T que contenia sulfato de dextrano 10 mM, una vez con 200 pl de SB 17T por filtracion a vacio, y una vez con 200 pl de SB 17T por centrifugacion.
f) Liberacion del aptamero complejado
La resina se resuspendio en 90 pl de tampon de elucion (NaOH 2 mM, 0,1 % de Tween-20) y se mezclo durante 5 minutos. Durante este tiempo, el aptamero se libero del complejo protema:aptamero. La resina se elimino por centrifugacion, y se recogio el eluato con el aptamero liberado. Se neutralizaron 80 pl del eluato y se tamponaron con 20 pl de tampon de neutralization (HCl 8 mM, Tris-HCl 0,5 mM (pH 7,5), 0,1 % de Tween-20). El aptamero se detecto como se describe en el Ejemplo 4.
g) Resultados
Se creo una serie de dilution de doce puntos en tampon para once analitos de proteina (bFGF, eotaxina-2, FGF7, FGF-16, GDNF, IL-7, IL-20, linfotactina, TARC, tPA, VEGF) a partir de una concentration 10 nM o 3 nM (bFGF, FGF7, tPA, linfotactina) de cada analito y diluyendo en serie hasta 33 fM con diluciones semilogaritmicas (factor de dilucion de 3,1623). Se incluyeron dos controles no de proteina dando un total de catorce muestras. La mezcla Cy3- aptamero contuvo los once aptameros con las proteinas diana en la serie de dilucion, ademas de veintiocho aptameros de control cuyas proteinas diana estuvieron ausentes. Se prepararon tres series de dilucion por duplicado. Los resultados se exponen en las FIGS. 7- 10.
Las Figuras 7A a C muestran representaciones de unidades relativas de fluorescencia (URF) frente a la concentracion (log-log curva de respuesta a dosis) para tres de las once proteinas diana en tampon. Se calcularon los valores del limite de detection (LOD) para cada proteina como la concentracion de proteina que da una senal igual al promedio mas dos desviaciones estandar de los valores no de proteina). Los LODs para las tres proteinas fueron 630 fM (bFGF), 90 fM (FGF7) y 530 fM (linfotactina). El ensayo de afinidad es capaz de detectar proteinas en tampon a niveles sub-picomolares.
La Figura 8 muestra una representation de unidades de fluorescencia relativas (URF) frente a la concentracion para las tres mediciones por duplicado para la proteina diana linfotactina en tampon. Las tres lineas representan curvas de respuesta a dosis para cada uno de los tres duplicados. Las curvas por duplicado concuerdan muy bien entre si, indicando un alto nivel de reproducibilidad para el protocolo del ensayo de afinidad.
Tambien se realizo una serie de dilucion de doce puntos en 10 % de plasma para cinco analitos de proteina (bFGF, eotaxina-2, linfotactina, tPA y VEGF) a partir de una concentracion 10 nM (VEGF y eotaxina-2) o 3 nM (bFGF, tPA, linfotactina) de cada analito y diluyendo en serie hasta 420 fM o 126 fM con diluciones de 2,5 veces. Se incluyeron dos controles no de proteina dando un total de catorce muestras que posteriormente se hibridaron en un portaobjetos de micromatriz. La mezcla Cy3-aptamero contuvo los cinco aptameros con respecto a las proteinas diana en la serie de dilucion, ademas de cinco aptameros de control cuyas proteinas diana estuvieron ausentes. El ensayo se realizo como se ha descrito anteriormente con las siguientes excepciones. Se diluyo 100 % de PPT- plasma (plasma humano reunido) 1 a 2 con Z-block 5 pM en 0,5x SB18, 0,05 % de Tween-20. Se mezclaron 40 pl de esta solution al 50 % de plasma con 60 pl de una mezcla de proteina a 3,33x concentracion final. Se combinaron 50 pl de la mezcla plasma/proteina con 50 pl de mezcla aptamero/cebador (aptamero 3 nM, cebador 9 nM). La reaction de union de equilibrado se realizo a 37 °C durante 15 min. Se anadieron 40 pl de la mezcla sangre completa- protema-aptamero (en lugar de 100 pl) a la resina de estreptavidina-agarosa y se mezclaron durante 15 min.
La Figura 9 muestra una representacion de unidades de fluorescencia relativas (URF) frente a la concentracion para la proteina diana linfotactina en 10 % de plasma humano. Esta curva es similar en forma y respuesta a las curvas de respuesta a dosis en tampon. Esto muestra que el protocolo de ensayo de afinidad puede realizarse, pero no se limita a la solucion al 10 % de plasma.
La Figura 10 muestra una representacion de unidades de fluorescencia relativas (URF) frente a la concentracion para la proteina diana linfotactina en 10 % de sangre humana completa. Esta curva es similar en forma y respuesta a las curvas de respuesta a dosis en 10 % de plasma humano (Figura 9), y demuestra el rendimiento del protocolo del ensayo de afinidad en matrices biologicas complejas sin ningun efecto de matriz evidente.
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Ejemplo 3. Protocolo de ensayo de fotorreticulacion
Todas las etapas de este protocolo se realizaron con exposicion minima a la luz para prevenir la fotoactivacion del fotoaptamero.
a) Union de proteina
Se combinaron 30 |jl de una mezcla ANA-PC-Cy3-aptamero (2 nM cada aptamero) con 30 |jl de una mezcla (AB)2- T8-cebador (6 nM para cada aptamero) en tampon SB 17T (HEPES 40 mM, pH 7,5, NaCl 120 mM, KCl 5 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 1 mM, 0,05 % de Tween-20) y se incubaron a 95 °C durante 4 minutos, a 37 °C durante 13 minutos. En una reaccion separada, se prepararon 60 jl de una mezcla de proteina a una concentration 2X. Se combinaron 55 jl de la mezcla de proteina diana con 55 jl de la mezcla aptamero/cebador en una placa de 96 pocillos (Omni-Tube Plate, Abgene #AB0407) y se incubaron a 37 °C durante 15 minutos para lograr el equilibrio de union. Todas las siguientes etapas se realizaron a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario.
b) Exposicion cinetica y fotorreticulacion
Se anadieron 100 jl de muestra equilibrada a 1400 jl de SB 17T que contenia sulfato de dextrano 10 mM (Mr ~5000, Sigma-Aldrich #31404) y se incubaron a 37 °C durante 15 minutos. La muestra de 1,5 ml se irradio con 470 nm de luz (matriz de LED a medida) a 37 °C durante 10 minutos para reticular covalentemente las proteinas unidas a los fotoaptameros.
c) Captura de aptamero biotinilado y eliminacion de proteina libre
Se anadieron 40 jl de resina de estreptavidina (DynaBeads MyOne Streptavidin C1, Invitrogen #650-03, 10 mg/ml en SB 17T) a la muestra de 1,5 ml y se incubaron a 25 °C durante 30 minutos con mezcla. La resina se sedimento por centrifugation y se eliminaron 1,4 ml de sobrenadante. La resina y el sobrenadante restante se transfirieron a una membrana Durapore (MultiScreen-HV45, Millipore #MAHVN4550) y el sobrenadante se elimino por filtracion a vacio. La resina se lavo dos veces con 200 jl de SB 17T que contenia biotina 10 jM (Sigma-Aldrich, Inc. #B4501-1 g) y una vez con 200 jl de SB 17T por filtracion a vacio.
d) Marcado de proteina y liberacion de aptamero (libre y complejado)
Se anadieron 100 jl de SB 17T que contenia NHS-PEO4-biotina 1,2 mM (Pierce #21329) a la resina lavada y se mezclo durante 20 minutos. La resina se lavo tres veces con tampon de lavado de guanidina 200 jl (guanidina 3 M, NaCl 50 mM, HEPES 40 mM pH 7,5, EDTA 2 mM, 0,05 % de Tween-20, TROLOX 1 mM), y dos veces con 200 jl de tampon de lavado HEPES (NaCl 50 mM, HEPES 40 mM pH 7,5, 0,05 % de Tween-20, TrOlOX 1 mM) por filtracion a vacio. La resina se resuspendio en 110 jl de NaOH 20 mM y se mezclo durante 5 minutos. La resina se elimino por centrifugacion, y se recogio el eluato de NaOH con complejos aptamero:protema liberados. Se neutralizaron 100 jl de eluato con 25 jl de HCl 80 mM, y se tamponaron con 10 jl de HEPES 55 mM (pH 7,5) que contenia NaCl 2 M y 1 % de Tween-20.
e) Captura de proteina y eliminacion de aptamero libre
Se lavaron 133 jl de resina de estreptavidina (estreptavidina inmovilizada de Pierce, #20347, 10 % de suspension acuosa) dos veces con 200 jl de SB 17T por filtracion a vacio a traves de una membrana de PVDF Durapore. Se anadieron 135 jl de mezcla aptamero:protema a la resina lavada y se mezclaron durante 20 minutos. La resina se lavo una vez con 200 jl de tampon de lavado de guanidina a 50 °C durante 10 minutos con mezcla, una vez con 200 jl de NaOH 20 mM durante 2 minutos con mezcla, dos veces con 200 jl de SB 17T por filtracion a vacio, y una vez con 200 jl de SB 17T por centrifugacion.
f) Liberacion del aptamero fotorreticulado
La resina se resuspendio en 100 jl de SB 17T y se irradio con una lampara de UV (dos bombillas de luz negra Silvania 350, 15W, muestra 5 cm de la fuente) durante 20 minutos con mezcla. Durante este tiempo, el aptamero fotorreticulado con la proteina se libera por fotoescision. La resina se elimino por centrifugacion a traves de la membrana Durapore, y se recogio el eluato con aptamero liberado.
Ejemplo 4. Protocolo de detection por micromatriz
a) Preparation de muestras
Se anadieron 30 jl de 4X tampon de hibridacion (NaCl 3,638 M, fosfato de Na 200 mM, pH 7,5, oligonucleotido marcado de esquinas 1 nM, TROLOX 4 mM, 0,1 % de Tween-20) a 90 jl de muestra de ensayo (producto de la etapa e del Ejemplo 2 o etapa f del Ejemplo 3).
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b) Portaobjetos de micromatriz
Se ensamblo un modulo ProPlate Slide (junta de CSW, adhesivo de FLC; Grace BioLabs, #204841) con un portaobjetos de micromatriz que contenia 14 (7x2) matrices separadas 9 mm. Cada matriz consistio en tres replicas de 96 oligonucleotidos modificados con amina complementarios a la region al azar de los aptameros. Los oligonucleotidos se imprimieron con una impresora de contacto internamente sobre portaobjeto de polimero de 3' x 1' patentados.
c) Bloqueo de micromatrices
Se anadieron 100 pl de tampon de bloqueo (caseina bloqueante en PBS, Pierce #37528, TROLOX 1 mM) a los pocillos del modulo ProPlate Slide y se incubaron a 65 °C durante 15-30 minutos. Se elimino el tampon de bloqueo.
d) Hibridacion y lavado
Se anadieron 110 pl de muestra de ensayo a la micromatriz, y se dispuso un bloque de aluminio de 3 x 1 x 0,125 pulgadas encima del modulo ProPlate Slide. El conjunto se envolvio en lamina de aluminio y se incubo a 65 °C durante 16 horas sin mezcla en una camara de humedad. Se sacaron la lamina de Al y el bloque de Al junto con la muestra de ensayo, y la micromatriz se aclaro una vez con 200 pl de tampon de lavado 1 (fosfato de Na 50 mM, pH 7,5, 0,1 % de Tween-20), precalentado a 65 °C. Se elimino el tampon de lavado 1 y se desmonto el modulo ProPlate Slide. El portaobjetos de micromatriz se dispuso en un frasco de papanicolau que contenia 25 ml de tampon de lavado 1 (precalentado a 65 °C) y se incubo a 65 °C durante 15 minutos con mezcla. El portaobjetos de micromatriz se transfirio a un segundo frasco de papanicolau que contenia 25 ml de tampon de lavado 2 (fosfato de Na 50 mM, pH 7,5, precalentado a 65 °C) y se incubo a 65 °C durante 5 minutos con mezcla. El portaobjetos de micromatriz se transfirio a un tercer frasco de papanicolau que contenia 25 ml de tampon de lavado 2 y se incubo a 65 °C durante 5 minutos con mezcla. El portaobjetos de micromatriz se saco del tampon de lavado 2 y se seco inmediatamente en una corriente de nitrogeno seco.
e) Deteccion
El portaobjetos de micromatriz se barrio con un escaner laser de fluorescencia TECAN LS300 Reloaded, y la senal de fluorescencia se cuantifico en cada caracteristica usando el paquete de software ArrayVision (8.0 Rev 3.0, Imaging Research, Inc.). La senal de fluorescencia se cuantifico usando la densidad como medida principal, con segmentacion y forma de puntos variable. El archivo de exportacion xml se importo de una base de datos para el analisis de datos adicional.
f) Protocolo de deteccion por PCR cuantitativa Diseno de cebadores
Se eligieron cebadores de amplification para cada aptamero usando PrimerQuest (Integrated DNA Technologies) con configuraciones de parametros por defecto, excepto Tm min del cebador = 60 °C, optimo = 65 °C, y max = 70 °C, e intervalo del tamano de productos = 50-100 pb. Los cebadores candidatos fueron aquellos analizados para complementariedad del extremo 3' de horquilla interna, homo-dimero y hetero-dimero, con OligoAnalyser 3.0 (Integrated DNA Technologies) con configuraciones de parametros por defecto, excepto conc. de oligo = 0,2 pM. Los candidatos se rechazaron si AG de la complementariedad del extremo 3' < -3,5 kcal/mol.
Reaccion de PCR cuantitativa
Se diluyeron 5 pl de muestra de ensayo neutralizada (vease la etapa 5 del protocolo del ensayo de afinidad (Ejemplo 2) o la etapa 6 del protocolo del ensayo de fotorreticulacion (Ejemplo 3)) 20X con 95 pl de dH2O. Se prepararon 20 pl de reacciones de amplificacion con 5 pl de muestra de ensayo diluida y 1X tampon KOD (Novagen #), 0,2 mM de cada uno de dATP, dcTP, dGTP y dTTP, 1X SYBR Green I (Invitrogen #), 0,2 pM de cada uno del cebador de 5' y 3', y 0,025 U/pl de ADN Polimerasa KOD XL (Novagen #). Las muestras se prepararon en una campana biologica con reactivos libres de contaminantes. Se usaron un par de cebadores en cada reaccion para la cuantificacion de un aptamero. Tambien se prepararon muestras con cantidades conocidas de aptamero para generar curvas patron. Las muestras se amplificaron en un Bio-Rad iCyler incubando a 95 °C durante 2 minutos, ciclando 40 veces a 95 °C durante 15 segundos, seguido de 72 °C durante 60 segundos.
Analisis de datos
Para cada aptamero, se determinaron valores del ciclo umbral (Ct) para cada muestra de las representaciones de amplificacion, y se usaron para generar una curva patron para cada aptamero con el software de analisis de datos suministrado con Bio-Rad iCycler. El numero de copias de cada aptamero en cada muestra de ensayo se determino usando la curva patron, y se convirtio en la concentration de aptamero despues de ajustar para el factor de dilution y el volumen de muestra. La concentracion de aptamero en cada muestra de ensayo se represento en funcion de la
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concentracion de protema de entrada.
Ejemplo 5. Deteccion de protema en tampon usando el protocolo de ensayo de fotorreticulacion y deteccion de matrices
Se creo una serie de dilucion de diez puntos en tampon para trece analitos de proteina (angiogenina, BLC, C3a, factor de coagulacion V, factor de coagulacion XI, cTacK, endostatina, FGF7, IGFBP-3, precalicrema, PSA-ACT, TIMP-1 y tPA) a partir de una concentracion 10 nM de cada analito y diluyendo en serie hasta 330 fM con diluciones semilogaritmicas (factor de dilucion de 3,1623). Se incluyeron cuatro controles no de proteina dando un total de catorce muestras. La mezcla Cy3-aptamero contuvo los trece aptameros con las proteinas diana en las series de dilucion, junto con catorce aptameros de control cuyas proteinas diana estuvieron ausentes. Las muestras se procesaron usando el protocolo del ensayo de fotorreticulacion (Ejemplo 3) y se cuantificaron con deteccion por micromatriz como se describe en el Ejemplo 4. Los resultados se exponen en la FIG. 11, que muestra una representacion de unidades relativas de fluorescencia (URF) frente a la concentracion para la proteina diana angiogenina en tampon.
Ejemplo 6. Deteccion de proteina en tampon usando el protocolo de ensayo de afinidad y Q-PCR
Se creo una serie de dilucion de diez puntos en tampon para doce analitos de proteina (angiogenina, C1q, complejo C5b.6, CMP-SAS, EG-VEGF, IP-10, PAI-1, PDgF-BB, protrombina, E-selectina, tPA y vWF) a partir de una concentracion 10 nM de cada analito y diluyendo en serie hasta 330 fM con diluciones semilogaritmicas (factor de dilucion de 3,1623). Se incluyeron cuatro controles no de proteina dando un total de catorce muestras. La mezcla Cy3-aptamero contuvo los doce aptameros con las proteinas diana en las series de dilucion. Las muestras se procesaron usando el protocolo de ensayo de afinidad (Ejemplo 2) y se cuantificaron por Q-PCR (Ejemplo 4). Se usaron los cebadores 2175-47-F3 (5'-GAGTGTGTGACGAGTGTGGAG-3') (SEQ ID NO:_) y 2175-47-R3 (5'- TCGGTTGTGGTGACGCCCG-3') (SEQ ID NO:_) para la cuantificacion del aptamero de angiogenina 2175-47 en las muestras de ensayo. Los resultados se exponen en la FIG. 12, que muestra una representacion logaritmica de la concentracion de aptamero detectada frente a la concentracion de proteina de entrada para angiogenina.
Ejemplo 7: Se permiten mediciones de proteina en muestras de ensayo por aptameros con constantes de disociacion lentas.
Preparacion de mezclas aptamero/cebador y muestras de ensayo
Se mezclaron aptameros con una etiqueta de deteccion Cy3-biotina (4 nM cada una) con 3X exceso de sonda de captura (oligonucleotido complementario a la region fija de 3' del aptamero que contenia una marca de biotina y elemento fotoescindible) en 1X SB 17T y se calentaron a 95 °C durante 4 minutos, luego 37 °C durante 13 minutos, y se diluyeron 1:4 en 1x SB 17T. Se anadieron 55 ul de mezcla aptamero/cebador a una placa de microtitulacion (Hybaid # AB-0407) y se sello con lamina. Las muestras de ensayo se preparan en una placa de microtitulacion mezclando concentraciones conocidas de analitos de proteina en SB 17T y diluyendo en serie con SB 17T.
Equilibrado de muestras
Se anaden 55 ul de mezcla aptamero/cebador a 55 ul de muestra de ensayo y se incuba a 37 °C durante 15 minutos en una placa de microtitulacion sellada con lamina. La concentracion final de cada aptamero en la mezcla de equilibrado es 0,5 nM. Despues del equilibrado, todas las etapas posteriores de este metodo se realizan a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario.
Captura de aptamero y eliminacion de proteina libre
Se lava una vez una placa de filtracion DuraPore (Millipore HV cat# MAHVN4550) con 100 ul de 1X SB 17T por filtracion a vacio, se anaden 133,3 ul de 7,5 % de resina de estreptavidina-agarosa (Pierce) a cada pocillo y se lava dos veces con 200 ul de 1X SB 17T. Se transfieren 100 ul de muestras equilibradas a la placa Durapore que contenia la resina de estreptavidina-agarosa y se incuba en una termomezcladora (Eppendorf) a 800 rpm durante 5 minutos. La resina se lava una vez con 200 ul de 1X SB 17T + biotina 100 uM y una vez con 200 ul de 1X SB 17T.
Marcado de proteinas con biotina
Se anaden 100 ul de NHS-PEO4-biotina 1,2 mM en SB 17T, preparado inmediatamente antes de uso, a la resina con aptamero capturado y complejos aptamero:protema y se incubaron en una termomezcladora a 800 rpm durante 20 minutos. La resina se lava cinco veces con 200 ul de 1X SB 17T por filtracion a vacio.
Proceso de enriquecimiento de constante de disociacion lenta y fotoescision
Se elimina el conductor de goteo de la parte inferior de la placa DuraPore y la placa se coloca sobre una placa de recogida de microtitulo de 1 ml. La resina se lava una vez con 200 ul de 1X SB 17T por centrifugacion a 1000 x g
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durante 30 s. Se anaden 80 ul de 1X SB 17T + DxSO4 10 mM a la resina y se irradia con una lampara de mercurio BlackRay en una termomezcladora a 800 rpm durante 10 minutos. La placa DuraPore se transfiere a una nueva placa de pocillos profundos de 1 ml y se centrifuga a 1000 x g durante 30 segundos para recoger el aptamero fotoescidido y los complejos de protema:aptamero.
Captura de proteina y eliminacion de aptamero libre
Se anaden 50 ul de perlas paramagneticas MyOne-streptavidin C1 (Invitrogen) (10 mg/ml en 1X SB 17T) a una placa de microtitulacion. Las perlas se separan con un iman durante 60 segundos y el sobrenadante se elimina. Se anaden 225 ul de mezcla de fotoescision a las perlas y se mezcla durante 5 minutos. Las perlas se lavan cuatro veces con 200 ul de 1X SB 17T separando las perlas magneticas y sustituyendo el tampon de lavado. Se elimina el tampon de lavado final.
Elucion de aptamero
Se anaden 100 ul de tampon de elucion fosfato de sodio (Na2HPO4 10 mM, pH 11) a las perlas y se mezclan durante 5 minutos. Se transfieren 90 ul de eluato a una placa de microtitulacion y se neutralizan con 10 ul de tampon de neutralization de fosfato de sodio (NaH2PO4 10 mM, pH 5).
Hibridacion de aptamero a micromatrices
Se preparan matrices de ADN con sondas de captura de oligonucleotido que comprenden la secuencia complementaria de la region variable de cada aptamero inmovilizado sobre un soporte de portaobjetos de microscopio a medida. Existen multiples matrices (submatrices) sobre cada portaobjetos, y las submatrices se separan fisicamente fijando una junta (Grace) para la aplicacion de muestras. Las matrices se pretratan con 100 ul de tampon de bloqueo y se incubaron durante 15 minutos a 65 °C en una termomezcladora. Se anaden 30 ul de tampon de hibridacion a 90 ul de eluato de aptamero neutralizado en una placa de microtitulacion, se incuban a 95 °C durante 5 minutos en un ciclador termico y se enfrian a 65 °C a 0,1 °C/segundo. Se elimina el tampon de bloqueo de las matrices y se anaden 110 ul de muestra de aptamero a las matrices y se incuban en una camara humeda a 65 °C durante 20 horas.
Lavado de matrices
Se elimina la muestra de aptamero de las matrices y las matrices se lavan una vez con 200 ul de fosfato de sodio, tampon de lavado Tween-20 a 65 °C, con la junta en su sitio, y tres veces con 25 ml de fosfato de sodio, tampon de lavado Tween-20 a 65 °C en un frasco de papanicolau con la junta quitada. Las matrices se secan con una pistola de nitrogeno.
Cuantificacion de senales sobre matrices
Se barren portaobjeto de matriz en un TECAN LS300 Reloaded en un canal apropiado para la detection de Cy3 y se cuantifica la senal de Cy3 en cada caracteristica de matriz.
Resultados:
Se produjeron aptameros especificos para tres dianas diferentes (bFGF, VEGF y mieloperoxidasa) usando metodos y materiales de SELEX tradicionales. Se preparo un segundo conjunto de aptameros especificos para el mismo conjunto de dianas usando nucleotidos modificados en la position 5 y se seleccionaron para constantes de disociacion muy lentas para sus dianas respectivas. Los aptameros preparados en el proceso tradicional tuvieron constantes de disociacion medidas en el orden de menos de 5 minutos. Los aptameros preparados con los nucleotidos modificados y usando el proceso de enriquecimiento de constante de disociacion lenta durante la selection tuvieron constantes de disociacion de mas de 20 minutos. Se prepararon dos conjuntos de aptameros para cada diana por los dos metodos diferentes durante un total de 4 poblaciones de aptameros diferentes para cada diana. La capacidad de estas poblaciones de aptameros para medir las concentraciones de analito en muestras de ensayo se evaluo como se ha descrito anteriormente durante un intervalo de concentraciones de diana. Se represento la deteccion de senal relativa del chip de ADN contra la concentracion de diana de entrada. Veanse las FIG. 13A a 13C. La curva de respuesta de los aptameros tradicionales es muy plana y la sensibilidad de la deteccion es bastante baja. La sensibilidad de deteccion de las dianas respectivas con los aptameros de constante de disociacion lenta es excelente. Los datos soportan la necesidad de usar los aptameros de disociacion lenta para el maximo rendimiento analitico.
Ejemplo 8. Reproducibilidad usando aptameros de constante de disociacion lenta
Usando el metodo del Ejemplo 7, se fracciono una muestra de plasma en 68 alicuotas diferentes. El ensayo del Ejemplo 7 se realizo en cada una de las 68 muestras. 34 de las muestras se combinaron y se fraccionaron otra vez. Las 34 muestras restantes se volvieron a probar simplemente. De este modo, la reproducibilidad del ensayo puede
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20
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35
40
probarse para la consistencia dentro de y entre ensayos. La disposicion de muestras y el esquema de deteccion se muestran en la Figura 14. La Figura 15 muestra el % de CV en la medicion de todas las muestras indicadas en la Figura 14. Las muestras reunidas y sin reunir tienen el mismo CV.
Ejemplo 9: Metodo de union de afinidad de captura unica
a) Equilibrado de aptameros con plasma, suero o sangre completa
Se combinan 30 ul de una mezcla Cy3-aptamero (20 nM cada aptamero) con 30 ul de una mezcla (AB)2-T8-PC- cebador (60 nM para cada cebador) en SB 17T y se incuba a 95 °C durante 4 minutos y a 37 °C durante 13 minutos. Se combinan 55 ul de la mezcla compleja de proteinas biologica (plasma, suero o sangre completa), diluida 1:1000 en SB 17T, con 55 ul de la mezcla aptamero/cebador y se incuba a 37 °C durante 15 minutos para lograr el equilibrio de union. Todas las siguientes etapas se realizan a temperatura ambiente, a menos que se indique lo contrario.
b) Marcado de proteinas
Se combinan 100 ul de mezcla aptamero:protema con 10 ul de SB 17T que contenia NHS-PEO4-biotina 500 uM (Pierce #21329) y se incuba durante 20 minutos a 37 °C. El exceso de reactivo de NHS se inactiva anadiendo 10 ul de tampon Tris 200 mM (pH 7,5) a la mezcla de reaccion e incubando durante 10 minutos a 37 °C.
c) Captura de proteinas y eliminacion de aptamero libre
Se anaden 100 ul de resina de estreptavidina (DynaBeads MyOne Streptavidin C1, Invitrogen #650-03, 10 mg/ml en SB 17T) a una membrana Durapore para capturar complejos aptamero/protema. Se anaden 100 ul de la mezcla aptamero:protema a la resina, se mezcla durante 15 minutos, y se filtra a vacio para eliminar el aptamero libre. La resina se lava tres veces con 200 ul de SB 17T por filtracion a vacio, y una vez con 200 ul de SB 17T por centrifugacion.
d) Liberacion del aptamero complejado
La resina se resuspende en 90 ul de tampon de elucion (NaOH 2 mM, 0,1 % de Tween-20) y se mezcla durante 5 minutos para liberar el aptamero del complejo aptamero/protema. La resina se elimina por centrifugacion, y se recoge el eluato que contenia el aptamero liberado. Se neutralizan 80 ul de eluato y se tamponan con 20 ul de tampon de neutralizacion (HCl 8 mM, Tris-HCl 0,5 mM (pH 7,5), 0,1 % de Tween-20). El aptamero se detecta como se describe en el Ejemplo 4.
Ejemplos en las publicaciones y limitaciones citadas relacionadas con las mismas pretenden ser ilustrativos y no exclusivos. Otras limitaciones de las publicaciones citadas seran evidentes para aquellos expertos en la materia tras una lectura de la memoria descriptiva y un estudio de los dibujos.
Las palabras "comprenden", "comprende" y "que comprende" deben interpretarse de forma incluyente, en vez de excluyente.

Claims (21)

  1. 5
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    50
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    65
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo de deteccion de la cantidad de una molecula diana que puede estar presente en una muestra de ensayo, comprendiendo el metodo:
    (a) preparar una mezcla poniendo en contacto la muestra de ensayo con un aptamero que comprende una primera marca y que tiene una afinidad espedfica por la molecula diana, en donde si dicha molecula diana esta presente en dicha muestra de ensayo, se forma un complejo de afinidad con el aptamero no covalente del aptamero y la molecula diana, en donde la tasa de disociacion (ti/2) del aptamero de la molecula diana es mayor de 20 minutos;
    (b) exponer la mezcla a un primer soporte solido que comprende un primer elemento de captura y dejar que la primera marca se asocie al primer elemento de captura;
    (c) eliminar cualquier componente de la mezcla no asociado a dicho primer soporte solido;
    (d) liberar el complejo de afinidad por aptamero de dicho primer soporte solido;
    (e) unir una segunda marca a dicha molecula diana en el complejo de afinidad por aptamero;
    (f) exponer el complejo de afinidad por aptamero liberado a un segundo soporte solido que comprende un segundo elemento de captura y dejar que la segunda marca se asocie a dicho segundo elemento de captura;
    (g) eliminar cualquier aptamero sin complejar de dicha mezcla por separacion del aptamero sin complejar de dicho complejo de afinidad por aptamero; y
    (h) disociar el aptamero de dicho complejo de afinidad por aptamero y recoger aptameros libres;
    (i) detectar la cantidad de aptameros libres recogidos y cuantificar dicha diana cuantificando dichos aptameros.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que:
    a. la primera marca es la misma que la segunda marca y la segunda marca se anade a la molecula diana en cualquier momento despues de (b) y antes de (f), y que comprende bloquear el primer agente de captura antes de la adicion de la segunda marca; o bien
    b. la primera marca es diferente de la segunda marca y la segunda marca se anade a la molecula diana en cualquier momento antes de (f).
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas introducir una exposition cinetica en cualquier momento despues de (a) y antes de (d).
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 3, en el que dicha exposicion cinetica comprende diluir la mezcla que contiene el complejo de afinidad por aptamero y/o anadir un competidor a la mezcla que contiene el complejo de afinidad por aptamero e incubar la mezcla que contiene el complejo de afinidad por aptamero durante un tiempo que:
    a. esta seleccionado del grupo que consiste en mas de o igual a aproximadamente 30 segundos, 1 minuto, 2 minutos, 3 minutos, 4 minutos, 5 minutos, 10 minutos, 30 minutos, y 60 minutos; o bien
    b. es tal que aumente la relation del nivel medido de complejo de afinidad por aptamero con respecto al nivel medido de complejo no espedfico.
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 3, en el que la exposicion cinetica comprende la introduction de una molecula competidora y dicha molecula competidora esta seleccionada del grupo que consiste en un oligonucleotido, heparina, ADN de esperma de arenque, ADN de esperma de salmon, sulfato de dextrano, polianion, polimero de fosfodiester abasico, dNTP y pirofosfato.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicha tasa de disociacion (ti/2):
    a. es superior o igual a aproximadamente 30 minutos;
    b. es de entre aproximadamente 30 minutos y aproximadamente 240 minutos;
    c. esta seleccionada del grupo que consiste en > aproximadamente 30 minutos, > aproximadamente 60 minutos, > aproximadamente 90 minutos, > aproximadamente 120 minutos, > aproximadamente 150 minutos, > aproximadamente 180 minutos, > aproximadamente 210 minutos y > aproximadamente 240 minutos.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicho aptamero se cuantifica usando un metodo seleccionado del grupo que consiste en EM e hibridacion.
  8. 8. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas anadir al aptamero un resto detectable.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 8, en el que dicho resto detectable esta seleccionado del grupo que consiste en un colorante, un punto cuantico, una radioetiqueta, un grupo funcional electroquimico, una enzima y un sustrato enzimatico.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 9, en el que:
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    a. dicho colorante es un colorante fluorescente; o bien
    b. dicha enzima es fosfatasa alcalina o peroxidasa de rabano picante.
  11. 11. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicho aptamero es un acido nucleico monocatenario o un acido nucleico bicatenario.
  12. 12. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicho aptamero comprende ADN, ARN o tanto ADN como ARN
  13. 13. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicho aptamero comprende al menos una modificacion quimica.
  14. 14. El metodo de la reivindicacion 13, en el que dicha al menos una modificacion quimica es:
    a. una sustitucion quimica en una o mas posiciones independientemente seleccionadas de una posicion de ribosa, una posicion de desoxirribosa, una posicion de fosfato y una posicion de base; o bien
    b. esta seleccionada independientemente del grupo enumerado en la figura 16.
  15. 15. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicha molecula diana esta seleccionada del grupo que consiste en una proteina, un peptido, un hidrato de carbono, un polisacarido, una glucoproteina, una hormona, un receptor, un antigeno, un anticuerpo, un virus, un sustrato, un metabolito, un analogo del estado de transicion, un cofactor, un inhibidor, un farmaco, un colorante, un nutriente, un factor de crecimiento, un tejido y una sustancia controlada.
  16. 16. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicha molecula diana es una proteina o un peptido.
  17. 17. El metodo de la reivindicacion 1, en el que dicha muestra de ensayo:
    a. esta seleccionada del grupo que consiste en una muestra biologica, una muestra ambiental, una muestra quimica, una muestra farmaceutica, una muestra alimentaria, una muestra agricola y una muestra veterinaria
    b. es una muestra biologica seleccionada del grupo que consiste en sangre completa, leucocitos, celulas mononucleares de sangre periferica, plasma, suero, esputo, aliento, orina, semen, saliva, liquido meningeo, liquido amniotico, liquido glandular, liquido linfatico, aspirado del pezon, aspirado bronquial, liquido sinovial, aspirado de articulacion, celulas, un extracto celular, heces, tejido, un extracto de tejido, una biopsia de tejido y liquido cefalorraquideo; o
    c. es plasma o suero.
  18. 18. El metodo de la reivindicacion 1, en el que:
    a. dicha primera marca y dicha segunda marca comprenden cada una al menos un componente independientemente seleccionado del grupo que consiste en un polinucleotido, un polipeptido, un acido nucleico peptidico, un acido nucleico bloqueado, un oligosacarido, un polisacarido, un anticuerpo, un affibody, un mimetico de anticuerpo, un receptor de celula, un ligando, un lipido, biotina, avidina, estrepavidina, extravidina, neutravidina, un metal, histidina y cualquier porcion de cualquiera de estas estructuras;
    b. dicho primer elemento de captura y dicho segundo elemento de captura comprenden cada uno al menos un componente independientemente seleccionado de un polinucleotido, un polipeptido, un acido nucleico peptidico, un acido nucleico bloqueado, un oligosacarido, un polisacarido, un anticuerpo, un affibody, un mimetico de anticuerpo, un receptor de celula, un ligando, un lipido, biotina, avidina, estrepavidina, extravidina, neutravidina, un metal, histidina y cualquier porcion de cualquiera de estas estructuras;
    c. dicho primer soporte solido y segundo soporte solido esta cada uno seleccionado independientemente del grupo que consiste en una perla de polimero, una perla de agarosa, una perla de poliestireno, una perla de acrilamida, un perla de nucleo solido, una perla porosa, una perla paramagnetica, perla de vidrio, perla de poro controlado, un pocillo de microtitulo, un sustrato de copolimero de ciclo-olefina, una membrana, un sustrato de plastico, nailon, una pelicula de Langmuir-Blodgett, vidrio, un sustrato de germanio, un sustrato de silicio, un chip de oblea de silicio, un flujo a traves del chip, una microperla, un sustrato de politetrafluoroetileno, un sustrato de poliestireno, un sustrato de arseniuro de galio, un sustrato de oro y un sustrato de plata.
  19. 19. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la detection del aptamero comprende hibridar el aptamero con un tercer soporte solido, en donde el tercer soporte solido comprende una pluralidad de caracteristicas direccionables y en donde al menos una de dichas caracteristicas comprende al menos un elemento de captura dispuesto encima que es complementario a cualquier secuencia contenida dentro del aptamero.
  20. 20. Un metodo de determination de la cantidad de una molecula diana en una muestra, comprendiendo el metodo:
    i. proporcionar una pluralidad de aptameros a una molecula diana, en donde los aptameros tienen una marca de captura escindible y en donde la tasa de disociacion (ti/2) del aptamero de la molecula diana es mayor de 20 minutos;
    ii. poner en contacto los aptameros con una muestra que contiene moleculas diana para formar una mezcla que contiene complejos aptamero-molecula diana no covalentes;
    10
    15
    20
    iii. proporcionar un soporte solido que tiene sondas adheridas a la superficie del soporte, en donde las sondas son capaces de unirse a la marca de captura escindible;
    iv. poner en contacto la mezcla con el soporte solido de forma que los complejos aptamero-molecula diana lleguen a unirse al soporte mediante la union de la marca de captura escindible y la sonda;
    v. separar los complejos aptamero-molecula diana unidos al soporte solido del resto de la mezcla;
    vi. introducir una segunda marca de captura al componente de molecula diana de los complejos aptamero- molecula diana;
    vii. disociar los complejos aptamero-molecula diana de la superficie del soporte solido escindiendo las marcas de captura escindibles;
    viii. proporcionar un soporte solido que tiene sondas adheridas a la superficie del soporte, en donde las sondas son capaces de unirse a la segunda marca de captura sobre moleculas diana;
    ix. poner en contacto los complejos aptamero-molecula diana disociados con el soporte solido de (viii) de forma que los complejos aptamero-molecula diana lleguen a unirse al soporte mediante la union de la segunda marca de captura y la sonda;
    x. disociar los complejos aptamero-molecula diana para dar aptameros libres y moleculas diana unidas al soporte;
    xi. medir la cantidad de aptamero libre.
  21. 21. El metodo de la reivindicacion 20, en el que despues de la disociacion de los complejos aptamero-molecula diana de la superficie del soporte solido (vii), los complejos aptamero-molecula diana disociados:
    a. se ponen en contacto con un exceso de molecula competidora; y/o
    b. se diluyen.
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