ES2537322T3 - Método para generar aptámeros con tasas de disociación mejoradas - Google Patents

Método para generar aptámeros con tasas de disociación mejoradas Download PDF

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Abstract

Un método para identificar un aptámero que tiene una tasa de disociación (t1/2) lenta de su molécula diana, en donde el aptámero comprende al menos una pirimidina con una base modificada, comprendiendo el método: (a) poner en contacto una mezcla de candidatos con una molécula diana, en donde los ácidos nucleicos que tienen una mayor afinidad por la molécula diana con respecto a otros ácidos nucleicos de la mezcla de candidatos se unen a la molécula diana, formando complejos ácido nucleico-molécula diana y en donde la mezcla de candidatos comprende ácidos nucleicos modificados en los que una, varias o todas las pirimidinas en al menos uno, o cada uno, de los ácidos nucleicos de la mezcla de candidatos están modificadas químicamente en la posición 5 para formar una pirimidina con una base modificada; (b) separar los complejos ácido nucleico-molécula diana de la mezcla de candidatos; (c) disociar los complejos ácido nucleico-molécula diana para generar ácidos nucleicos libres; (d) amplificar los ácidos nucleicos libres para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecidos en secuencias que son capaces de unirse a la molécula diana con afinidad aumentada, por lo que se puede identificar un aptámero para la molécula diana; (e) opcionalmente, repetir (a) a (d) si es necesario; (f) identificar al menos un aptámero para la molécula diana, en donde el aptámero comprende al menos una pirimidina con una base modificada, y (g) seleccionar el aptámero(s) identificado en (f) para identificar el aptámero(s) que tiene una tasa de disociación lenta (t1/2) de la molécula diana.

Description

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Como se utiliza en el presente documento, “ácido nucleico”, “oligonucleótido”, y “polinucleótido” se utilizan de manera intercambiable para referirse a un polímero de nucleótidos de cualquier longitud, y tales nucleótidos pueden incluir desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, y/o análogos o desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos modificados químicamente. Los términos “polinucleótido”, “oligonucleótido”, y “ácido nucleico” incluyen moléculas de cadena
5 doble o sencilla así como moléculas de triple hélice.
Si están presentes, las modificaciones químicas de un nucleótido pueden incluir, de manera única o en cualquier posición, modificaciones en el azúcar en la posición 2’, modificaciones de pirimidina de la posición 5 (por ejemplo, 5(N-benzilcaroxiamida)-2’-desoxiuridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida-2’-desoxiuridina, 5-(N-[2-(1H-indol-3 il) etil] 10 carboxiamida) -2’-desoxiuridina, cloruro de 5-(N-[1-(3-trimetil amonio) propil] carboxiamida)-2’-desoxiuridina, 5-(Nnaftilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina, o 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)] carboxiamida)-2’-desoxiuridina), modificaciones de purinas en la posición 8, modificaciones en aminas exocíclicas, sustitución de 4-tiouridina, sustitución de 5-bromo
o 5-yodouracilo, modificaciones en la estructura, metilaciones, combinaciones de pares de bases no habituales tales como las isobases isocitidina e isoguanina, y similares. Las modificaciones pueden incluir también modificaciones 3’ 15 y 5’, tales como sellado o pegilación. Otras modificaciones pueden incluir la sustitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural por un análogo, modificaciones internucleótido, tales como, por ejemplo, las que tienen enlaces sin carga (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) y las que tienen enlaces con carga (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), las que tienen intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), las que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales 20 oxidativos, etc.), las que contienen alquilantes, y las que tienen enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). Además, cualquiera de los grupos hidroxilo que están presentes habitualmente en un azúcar se pueden remplazar por un grupo fosfonato o un grupo fosfato; protegerse por grupos protectores de referencia; o activarse para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales o a un soporte sólido. Los grupos OH de los extremos 3’ y 5’ se pueden fosforilar o sustituir con aminas, restos de un grupo de sellado orgánico de 25 aproximadamente 1 a aproximadamente 20 átomos de carbono, o restos de un grupo de sellado orgánico de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 polímeros de polietilenglicol (PEG) y otros polímeros hidrófilos o hidrófobos biológicos o sintéticos. Si están presentes, se puede hacer una modificación de la estructura del nucleótido antes o después del ensamblaje con un polímero. Una secuencia de nucleótidos puede estar interrumpida por componentes no nucleótidos. Un polinucleótido se puede modificar además después de la polimerización, tal
30 como por conjugación con un componente marcador.
Los polinucleótidos pueden contener también formas de azúcares análogas de ribosa o desoxirribosa que se conocen en general en la técnica, incluyendo 2’-O-metil-, 2’-O-alil, 2’-fluoro-o 2’-azido-ribosa, análogos de azúcar carbocíclico, azúcares α-anoméricos, azúcares epiméricos tales como arabinosa, xilosas, y lixosas, azúcares 35 furanosa, seudoheptulosas, análogos acíclicos y análogos abásicos de nucleósidos tales como metil ribósido. Como se ha señalado anteriormente, se pueden remplazar uno o más enlaces fosfodiéster por grupos de unión alternativos. Estos grupos de unión alternativos incluyen realizaciones en los que el fosfato se remplaza por P(O)S (“tioato”), P(S)S (“ditioato”), (O)NR2 (“amidato”) P(O)R, P(O)OR’, CO o CH2 ("formacetal"), en que cada R o R’ es independientemente H o alquilo sustituido o no sustituido (1-20 C) que contiene opcionalmente un enlace éter (-O-),
40 arilo, alquenilo, cicloalquilo o araldilo. No es necesario que todos los enlaces en un polinucleótido sean idénticos. La sustitución de formas análogas de azúcares, purinas, y pirimidinas puede ser ventajosa en el diseño de un producto final, como pueden ser por ejemplo, estructuras de armazón alternativas como una estructura de poliamida.
En una realización, la región variable del aptámero incluye nucleótidos que incluyen bases modificadas. Ciertos
45 aptámeros modificados se pueden utilizar en cualquiera de los métodos, dispositivos y kits descritos. Estos nucleótidos modificados han demostrado que producen nuevos aptámeros que tienen tasas de disociación muy lentas de sus respectivas dianas mientras que mantienen una alta afinidad por la diana. En una realización, se puede modificar la posición C-5 de las bases pirimidínicas. Los aptámeros que contienen nucleótidos con bases modificadas tienen varias propiedades que son diferentes de las propiedades de los aptámeros de referencia que
50 incluyen solamente nucleótidos de origen natural (es decir, nucleótidos sin modificar). En una realización, el método para la modificación de los nucleótidos incluye el uso de un enlace amida. Sin embargo, se pueden utilizar otros métodos para la modificación. Se ha observado sorprendentemente que la estructura de los aptámeros identificados con una tasa de disociación lenta no parece estar de acuerdo completamente con la estructura prevista por los modelos de emparejamiento de bases de referencia. La observación se apoya en el hecho de que las temperaturas
55 de fusión que se han medido en los aptámeros con una tasa de disociación lenta no son consistentes con las temperaturas de fusión previstas para los modelos, véase la Fig. 13. Como se muestra, parece que no hay correlación entre las temperaturas de fusión medidas y previstas de los aptámeros con una tasa de disociación lenta. Como media, la temperatura de fusión (Tm) calculada es 6 ºC más baja que la Tm medida. Las temperaturas de fusión medidas indican que los aptámeros con una tasa de disociación lenta que incluyen estos nucleótidos
60 modificados son más estables que lo que se puede prever y poseen potencialmente nuevas estructuras secundarias. Estos aptámeros modificados también tienen espectros de dicorismo circular diferentes de los aptámeros correspondientes que incluyen solo nucleótidos sin modificar. En el caso de muchas dianas, es más probable que se identifiquen los aptámeros con una tasa de disociación lenta para una diana cuando se utilizan nucleótidos modificados en la producción de la biblioteca inicial o la mezcla de candidatos.
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intercambiable para referirse a cualquier molécula que puede formar un complejo no específico con una molécula no diana. En este contexto, las moléculas no dianas incluyen aptámeros libres, en los que, por ejemplo, se puede utilizar un competidor para inhibir la unión del aptámero (re-unión), no específicamente, a otra molécula no diana. Una “molécula competidora” o “competidor” es un grupo de copias de un tipo o especie de molécula. “Moléculas
5 competidoras” o “competidores” se refieren a más de uno de tales grupos de moléculas. Las moléculas competidoras incluyen, pero no se limitan a oligonucleótidos, polianiones (por ejemplo, heparina, ADN de esperma de arenque, ADN de esperma de salmón, ARNt, sulfato de dextrano, polidextrano, polímeros de fosfodiéster abásico, dNTP, y pirofosfato). En varias realizaciones, se puede utilizar una combinación de uno o más competidores.
Como se utiliza en el presente documento, “complejo no específico” se refiere a una asociación no covalente entre dos o más moléculas que no son un aptámero y su molécula diana. Un complejo no específico representa una interacción entre clases de moléculas. Los complejos no específicos incluyen complejos formados entre un aptámero y una molécula no diana, un competidor y una molécula no diana, un competidor y una molécula diana, y una
15 molécula diana y una molécula no diana.
Como se utiliza en el presente documento, la expresión “proceso de enriquecimiento de tasa de disociación lenta” se refiere a un proceso de alteración de las concentraciones relativas de ciertos componentes en una mezcla de candidatos tal que la concentración de complejos de afinidad de aptámeros que tienen tasas de disociación lentas está aumentada con respecto a la concentración de complejos de afinidad de aptámeros que tienen unas tasas más rápidas y menos deseables de disociación. En una realización, el proceso de enriquecimiento de tasa de disociación lenta es un proceso de enriquecimiento de tasa de disociación lenta que se basa en una solución. En esta realización, el proceso de enriquecimiento de tasa de disociación lenta que se basa en una solución tiene lugar en una solución, tal que ni la diana ni los ácidos nucleicos que forman los complejos de afinidad del aptámero en la 25 mezcla están inmovilizados en un soporte sólido durante el proceso de enriquecimiento de tasa de disociación lenta. En varias realizaciones, el proceso de enriquecimiento de tasa de disociación lenta puede incluir una o más etapas, que incluyen la adición de y la incubación con una molécula competidora, dilución de la muestra, o una combinación de estas (por ejemplo, dilución de la mezcla en presencia de una molécula competidora). Debido a que el efecto del proceso de enriquecimiento de tasa de disociación lenta depende en general de las diferentes tasas de disociación de los distintos complejos de afinidad de aptámeros (es decir, los complejos de afinidad de aptámero formados entre la molécula diana y los diferentes ácidos nucleicos de la mezcla de candidatos), la duración del proceso de enriquecimiento de tasa de disociación lenta se selecciona de forma que mantenga una alta proporción de complejos de afinidad de aptámero que tengan unas tasas de disociación lenta a la vez que se reduce sustancialmente el número de complejos de afinidad de aptámero que tienen tasas de disociación rápidas. El proceso de
35 enriquecimiento de tasa de disociación lenta se puede utilizar en uno o más ciclos durante el proceso SELEX. Cuando la dilución y la adición de un competidor se utilizan en combinación, se pueden llevar a cabo simultánea o secuencialmente, en cualquier orden. El proceso de enriquecimiento de tasa de disociación lenta se puede utilizar cuando la concentración total de diana (proteína) en la mezcla es baja. En una realización, cuando el proceso de enriquecimiento de tasa de disociación lenta incluye la dilución, la mezcla se puede diluir tanto como sea práctico, teniendo en mente que los ácidos nucleicos retenidos en el aptámero se recuperan para rondas posteriores del proceso SELEX. En una realización, el proceso de enriquecimiento de tasa de disociación lenta incluye el uso de un competidor así como la dilución, permitiendo que la mezcla se diluya menos de lo que puede ser necesario sin el uso de un competidor.
45 En una disposición, el proceso de enriquecimiento de tasa de disociación lenta incluye la adición de un competidor, y el competidor es un polianión (por ejemplo, heparina o sulfato de dextrano (dextrano)). La heparina o el dextrano se han utilizado en la identificación de aptámeros específicos en las selecciones SELEX anteriores. En tales métodos, sin embargo, la heparina o el dextrano están presentes durante la etapa de equilibrio en la que se unen la diana y el aptámero para formar complejos. En tales métodos, según aumenta la concentración de heparina o dextrano, aumenta la relación de complejos diana/aptámero de alta afinidad con respecto a los complejos diana/aptámero de baja afinidad. Sin embargo, una alta concentración de heparina o dextrano puede reducir el número de complejos diana/aptámero de alta afinidad en equilibrio debido a la competición por la unión a la diana entre el ácido nucleico y el competidor. Por el contrario, los presentes métodos descritos añaden el competidor después de que se haya permitido la formación de complejos diana/aptámero, y por lo tanto no afecta al número de complejos que se forman.
55 La adición del competidor después de que se haya producido la unión en equilibrio entre la diana y el aptámero crea un estado de no equilibrio que evoluciona en el tiempo a un equilibrio con menos complejos diana/aptámero. La captación de complejos diana/aptámero antes de que se alcance el nuevo equilibrio enriquece la muestra en aptámeros con una tasa de disociación lenta mientras que los aptámeros con una tasa de disociación rápida se habrán disociado antes.
En otra realización, se utiliza un competidor polianiónico (por ejemplo, sulfato de dextrano u otro material polianiónico) en el proceso de enriquecimiento de tasa de disociación lenta para facilitar la identificación de un aptámero que es refractario a la presencia del polianión. En este contexto, “aptámero refractario polianiónico” es un aptámero que es capaz de formar un complejo aptámero/diana que es menos probable que se disocie en la solución 65 que también contiene material refractario polianiónico que un complejo aptámero/diana que incluye un aptámero no refractario polianiónico. De esta manera, se pueden utilizar los aptámeros refractarios polianiónicos en la realización
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En una disposición, se proporciona un método para identificar un aptámero que tiene una tasa de disociación lenta de su molécula diana, el método comprende (a) preparar una mezcla de candidatos de secuencias de ácidos nucleicos; (b) poner en contacto la mezcla de candidatos con una molécula diana en que los ácidos nucleicos con las mayores afinidades relativas para la molécula diana se unen preferentemente a la molécula diana, formando 5 complejos ácido nucleico-molécula diana; (c) aplicar un proceso de enriquecimiento de tasa de disociación lenta para permitir la disociación de los complejos ácido nucleico-molécula diana con tasas de disociación relativamente rápidas; (d) separar los complejos ácido nucleico-molécula diana restantes de los ácidos nucleicos y las moléculas no diana de la mezcla de candidatos; y (e) identificar un aptámero para una molécula diana. El proceso puede incluir además la etapa repetida de amplificación de los ácidos nucleicos que se unen a la molécula diana para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en secuencias que son capaces de unirse a la molécula diana y producir complejos ácido nucleico-molécula diana que tienen tasas de disociación lentas. Como se ha definido anteriormente, el proceso de enriquecimiento de tasa de disociación lenta se puede seleccionar de entre diluir la mezcla de candidatos que contiene los complejos de ácido nucleico-diana, añadir al menos un competidor a la mezcla de candidatos que contiene los complejos ácido nucleico-molécula diana, y diluir la mezcla de candidatos
15 que contiene los complejos de ácido nucleico-molécula diana y añadir al menos un competidor a la mezcla de candidatos que contiene los complejos ácido nucleico-molécula diana.
En una disposición, se proporciona un método para identificar un aptámero que tiene una tasa de disociación lenta de su molécula diana, comprendiendo el método: (a) preparar una mezcla de ácidos nucleicos candidatos; (b) poner en contacto la mezcla de candidatos con una molécula diana, en que los ácidos nucleicos tienen una afinidad aumentada por la molécula diana para la molécula diana con respecto a otros ácidos nucleicos de la mezcla de candidatos de la mezcla de candidatos, que se unen a la molécula diana formando complejos ácido nucleicomolécula diana; (c) incubar la mezcla de candidatos y la molécula diana juntos durante un periodo de tiempo suficiente para conseguir la unión en equilibrio; (d) añadir un exceso de al menos una molécula competidora a la
25 mezcla de (c); (e) incubar la mezcla de la mezcla de candidatos, los complejos ácido nucleico-molécula diana y la molécula competidora de (d) durante un periodo de tiempo determinado; (f) separar los complejos de ácido nucleicomolécula diana de la mezcla de candidatos; (g) disociar los complejos de ácido nucleico-molécula diana para generar ácidos nucleicos libres; (h) amplificar los ácidos nucleicos libres para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecida en secuencias de ácidos nucleicos que son capaces de unirse a la molécula diana con una afinidad aumentada, pudiéndose identificar de esta manera un aptámero para una molécula diana.
En otra disposición, se proporciona un método para producir un aptámero que tiene una tasa de disociación lenta de su molécula diana, comprendiendo el método la preparación o síntesis de un aptámero que incluye una secuencia de ácido nucleico que se identifica por el siguiente proceso que comprende las etapas de: (a) preparar una mezcla 35 de ácidos nucleicos candidatos; (b) poner en contacto la mezcla de candidatos con una molécula diana, en que los ácidos nucleicos tienen una afinidad aumentada por la molécula diana con respecto a otros ácidos nucleicos de la mezcla de candidatos que se unen a la molécula diana, formando complejos ácido nucleico-molécula diana; (c ) incubar la mezcla de candidatos y la molécula diana juntos durante un periodo de tiempo suficiente para conseguir la unión en equilibrio; (d) añadir un exceso de al menos una molécula competidora a la mezcla de (c ); (e) incubar la mezcla de la mezcla de candidatos, complejos de ácido nucleico-molécula diana y la molécula competidora de (d) durante un tiempo de tiempo determinado; (f) separar los complejos de ácido nucleico-molécula diana de la mezcla de candidatos; (g) disociar los complejos de ácido nucleico-molécula diana para generar ácidos nucleicos libres; (h) amplificar los ácidos nucleicos libres para producir una mezcla de ácidos nucleicos enriquecidos en secuencias de ácidos nucleicos que son capaces de unirse a la molécula diana con una afinidad aumentada, identificándose de
45 esta manera un aptámero para la molécula diana.
En otra realización, se proporciona un método para identificar un aptámero que tiene una tasa de disociación lenta de su molécula diana, comprendiendo el método: (a) preparar una mezcla de ácidos nucleicos candidatos, en que la mezcla de candidatos comprende ácidos nucleicos en los que una, varias o todas las pirimidinas en al menos uno, o cada, ácido nucleico de la mezcla de candidatos está modificada en la posición 5; (b) poner en contacto la mezcla de candidatos con una molécula diana, en que los ácidos nucleicos tienen una afinidad aumentada por la molécula diana con respecto a otros ácidos nucleicos de la mezcla de candidatos que se unen a la molécula diana, formando complejos de ácido nucleico-molécula diana; (c) separar los ácidos nucleicos con afinidad aumentada del resto de la mezcla de candidatos; y (d) amplificar los ácidos nucleicos con afinidad aumentada para producir una mezcla de
55 ácidos nucleicos enriquecida en ácidos nucleicos que son capaces de unirse a la molécula diana con una afinidad aumentada, pudiendo identificarse un aptámero para la molécula diana.
En otra realización, se proporciona un método para producir un aptámero que tiene una tasa de disociación lenta de su molécula diana, comprendiendo dicho método la preparación o síntesis de un aptámero que incluye una secuencia de ácido nucleico identificada por el siguiente proceso: (a) preparar una mezcla de ácidos nucleicos candidatos que comprende ácidos nucleicos en los que una, varias o todas las pirimidinas de al menos uno, o cada uno, de los ácidos nucleicos de la mezcla de candidatos está modificada en la posición 5; (b) poner en contacto la mezcla de candidatos con una molécula diana, en que los ácidos nucleicos tienen una afinidad aumentada para la molécula diana con respecto a otros ácidos nucleicos de la mezcla de candidatos que se unen a la molécula diana, 65 formando complejos de ácido nucleico-molécula diana; (c) separar los ácidos nucleicos con afinidad aumentada del resto de la mezcla de candidatos; y (d) amplificar los ácidos nucleicos con afinidad aumentada para producir una
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Ejemplo 3. Generación de aptámeros con una tasa de disociación lenta que utiliza un proceso de enriquecimiento de tasa de disociación lenta con un competidor
5 A. Preparación de las mezclas de candidatos
Se prepararon las mezclas que contenían dATP, dCTP, dGTP, y BzdUTP por extensión con polimerasa de un cebador hibridado con una matriz biotinilada para 94 dianas proteicas. Se combinaron 55 nmol de cebador directo (con cromóforo ANA 5’) y 55 nmol de matriz en 0,5 ml de Tampón de Extensión de Cebador (120 mM de Tris-HCl, 10 pH 7,9, 10 mM de KCl, 6 mM de (NH4)2SO4, 0,1 mg/ml BSA, 0,1 % Triton X-100), se calentaron a 95 ºC durante 5 minutos, 48 ºC durante 5 minutos, y se enfrió en hielo. La mezcla cebador:matriz se añadió a 5,5 ml de la reacción de extensión que contenía el Tampón de Extensión de Cebador, 0,125 U/µl de ADN Polimerasa KOD, y 0,5 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, y BzdUTP, y se incubaron a 70 ºC, 60 minutos. Tras completar la reacción de extensión, la solución se refrescó en hielo. El producto de doble cadena se capturó por medio de las cadenas de 15 biotina de la matriz añadiendo 25 ml de perlas magnéticas revestidas de estreptavidina (MagnaBind-Streptavidin, Pierce, 5 mg/ml en 1 M de NaCl + 0,05 % de TWEEN-20) al producto de extensión del cebador y se incubó a 25 ºC durante 15 minutos con rotación. Las perlas se lavaron tres veces con 40 ml de tampón SB 17T (40 mM de HEPES, pH 7,5, 125 mM de NaCl, 5 mM KCl, 5 mM MgCl2, 1 mM de EDTA, 0,05 % TWEEN-20). La cadena de aptámero se eluyó de las perlas con 35,2 ml de NaOH 20 mM durante 5 minutos con agitado. La cadena eluída se neutralizó con
20 8,8 ml de HCl 80 mM, y se tamponó con 400 µl de HEPES 1 M, pH 7,3. Las mezclas de candidatos se concentraron con un Centricon-30 a aproximadamente 0,7 ml, y se cuantificaron por espectrometría de absorbancia UV.
B. Preparación de las dianas proteicas
25 Las dianas proteicas sin marcar se biotinilaron como se describe en el Ejemplo 2.
C. Selección de aptámeros con el proceso de enriquecimiento de tasa de disociación lenta y fotoentrecruzamiento
Se llevaron a cabo las selecciones por separado como se describe en el Ejemplo 2, con la adición de 10 mM de
30 sulfato de dextrano como competidor para la re-unión del aptámero durante el proceso de enriquecimiento de tasa de disociación lenta en las rondas seis a nueve.
El proceso de enriquecimiento de tasa de disociación lenta se empleó de tres manera distintas. En las rondas dos y tres, se diluyeron las muestras 20x añadiendo 950 µl de SB17T (precalentado a 37 ºC), y se incubaron a 37 ºC 35 durante 30 minutos antes de la captura de los complejos. En las rondas cuatro y cinco, se diluyeron las muestras 20x añadiendo 950 µl de SB17T (precalentado a 37 ºC), y se incubaron a 37 ºC durante 30 minutos antes del entrecruzamiento. En las rondas seis y siete, se diluyeron las muestras 20x añadiendo 950 µl de SB17T (precalentado a 37 ºC). Se diluyeron de nuevo 50 µl de cada muestra diluida transfiriéndola a 950 µl de SB17T + 1’ mM 5000 K de sulfato de dextrano (precalentado a 37 ºC) para dar una dilución total de 400x, y se incubaron a 37 ºC 40 durante 60 minutos antes del entrecruzamiento. En las rondas ocho y nueve, se diluyeron las muestras 20x añadiendo 950 µl de SB17T (precalentado a 37 ºC), y se diluyeron de nuevo y 50 µl de cada muestra transfiriéndolos a 950 µl de SB17T (precalentado a 37 ºC) para dar una dilución de 400x. Finalmente se diluyeron de nuevo 50 µl de las muestras diluidas transfiriéndolas a 950 µl de SB17T + 10 mM 5000 K de sulfato de dextrano (precalentado a 37 ºC) para dar una dilución total de 8000x, y se incubaron a 37 ºC durante 60 minutos antes del entrecruzamiento. Se
45 capturaron los complejos y se lavaron como se describe en el Ejemplo 2. Cuando se empleó el fotoentrecruzamiento, las reacciones de unión de 1 ml tras el proceso de enriquecimiento de tasa de disociación lenta se irradiaron desde arriba con una matriz de LED de 470 nm durante 60 segundos antes de la captura del complejo como en el Ejemplo 2.
50 D. Amplificación y purificación de aptámeros
La amplificación y purificación se llevó a cabo como en el Ejemplo 2.
E. Rigurosidad y retroalimentación de la selección
55 La diana proteica se ajustó en cada ronda como se describe en el Ejemplo 1, excepto en las rondas seis y ocho. Con el fin de maximizar la señal después de estas grandes diluciones, la diana proteica se aumentó a 100 nM en las rondas seis y ocho. Tras cada ronda de selección, el estado de convergencia del grupo enriquecido se determinó como se describe en el Ejemplo 1.
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