JP5967687B2 - スフィンゴシルホスホリルコリンに結合するアプタマー分子 - Google Patents
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Description
5’末端の固定領域:GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC;(26塩基)
30塩基長のランダム配列部分:(N30);
3’末端の固定領域:UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU;(24塩基)
を具える、全長80塩基長の「ランダム一本鎖RNA分子ライブラリー」を選択した。
5’末端の固定領域:GGCAACCACGACAUCCGG;(18塩基)
6塩基長の第一ランダム配列部分:N1N2N3N4N5N6;(6塩基)
「5’−CCGUUAUUGG−3’」のコンセンサス配列を含む
“Hair pin”ループ形成用の定常領域:UACCGUUAUUGGUG;(14塩基)
6塩基長の第二ランダム配列部分:N’6N’5N’4N’3N’2N’1;(6塩基)
3’末端の固定領域:CCGGAUGUCACACACACG;(18塩基)
を具えている。
スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するRNAアプタマーであって、
該RNAアプタマーは、下記のI-1〜I-11の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖RNA分子である
(I-1) SPC-198:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC
UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAUGUUA
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3' (配列番号:1);
(I-2) SPC-203:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC
UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCGUAUCCCGA
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3' (配列番号:2);
(I-3) SPC-209:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC
UACCGUUAUUGGAGCACGCGUAGUAUGGUU
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3' (配列番号:3);
(I-4) SPC-289:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC
UACCGUUAUUGGAGCACGCGUAGUAUGGGU
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3' (配列番号:4);
(I-5) SPC-261:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC
UACCGUUAUUGGUGUAACGUAAUUGUGA
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3' (配列番号:5);
(I-6) SPC-267:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC
UACCGUUAUUGGUGUAACGUAAUUGUGG
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3' (配列番号:6);
(I-7) SPC-215:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC
UACCGUUAUUGGAGCUGUCGAUUUGCUGGA
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3' (配列番号:7);
(I-8) SPC-219:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC
UCCCGUUAUUGGAGUCACGCGUAGUCCUCC
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3' (配列番号:8);
(I-9) SPC-259:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC
UACCGUUAUUGGAGACGCUUAGAUGUCCGA
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3' (配列番号:9);
(I-10) SPC-213:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC
GCAUUGUCCGCACGCAAAGCAUUAUUGUGA
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3' (配列番号:10);
(I-11) SPC-273:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC
GUCCGUUAUUGGCGCCAGCGUACAUGCGGG
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3' (配列番号:11);
ことを特徴とするアプタマーである。
スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するRNAアプタマーであって、
該RNAアプタマーは、「5’−CCGUUAUUGG−3’」のコンセンサス配列をその一部に含む、下記のII-1〜II-8の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖RNA分子である
(II-1) SPC-m009:
5'-GGGAUCCACAUCUACGAAUUC
UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAUGUUA
UUCC -3' (配列番号:12);
(II-2) SPC-m010:
5'-GGAUCUACGAAUUC
UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAU
CC -3' (配列番号:13);
(II-3) SPC-m011:
5'-GGGAUCCACAUCUACGAAUUC
UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCGUAUCCCGA
UUCC -3' (配列番号:14);
(II-4) SPC-m012:
5'-GGCGAAUUC
UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCG
CC -3' (配列番号:15);
(II-5) SPC-m013:
5'-GGAUCCACAUCUACGAAUUC
UACCGUUAUUGGAGCACGCGUAGUAUGGGU
CC -3' (配列番号:16);
(II-6) SPC-m014:
5'-GGACGAAUUC
UACCGUUAUUGGAGCACGCGU
CC -3' (配列番号:17);
(II-7) SPC-m015:
5'-GGACAUCUACGAAUUC
UACCGUUAUUGGUGUAACGUAAUUGU
CC -3' (配列番号:18);
(II-8) SPC-m016:
5'-GGCGAAUUC
UACCGUUAUUGGUGUAACG
CC -3' (配列番号:19);
ことを特徴とするアプタマーである。
スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するRNAアプタマーであって、
該RNAアプタマーは、「5’−CCGUUAUUGG−3’」のコンセンサス配列に類する「5’−GCAUUAUUGU−3’」の配列をその一部に含む、下記のII-9の塩基配列の一本鎖RNA分子である
(II-9) SPC-m007:
5'-G G
GUCCGCACGCAAAGCAUUAUUGUGA
UUCACUGCAGACUUGAC C C -3' (配列番号:20);
ことを特徴とするアプタマーである。
スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するRNAアプタマーであって、
該RNAアプタマーは、「5’−CCGUUAUUGG−3’」のコンセンサス配列をその一部に含む、下記のIII-1〜III-8の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖RNA分子である
(III-1) SPC-514:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
AAAGCC
UACCGUUAUUGGAG
AAAAAA
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号:21);
(III-2) SPC-520:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
GAAGCC
UACCGUUAUUGGAG
AAAAAA
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号:22);
(III-3) SPC-524:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
AAAGCC
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号:23);
(III-4) SPC-562:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
CAGGCC
UACCGUUAUUGGAG
AAAAUA
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号:24);
(III-5) SPC-536:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
AAGGCC
UACCGUUAUUGGAG
AAUAUU
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号:25);
(III-6) SPC-501:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
GCGGCC
UACCGUUAUUGGAG
UAAACU
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号:26);
(III-7) SPC-569:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
GCGGCC
UACCGUUAUUGGAG
ACAACU
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号:27);
(III-8) SPC-511:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
CGGGCC
UACCGUUAUUGGAG
AUAACU
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号:28);
ことを特徴とするアプタマーである。
スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するRNAアプタマーであって、
該RNAアプタマーは、「5’−CCGUUAUUGG−3’」のコンセンサス配列をその一部に含む、下記のIII-9〜III-12の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖RNA分子である
(III-9) SPC-556:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
CAAGCA
UACCGUUAUUGGUG
AAAAAC
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号:29);
(III-10) SPC-546:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
AAAGAC
UACCGUUAUUGGUG
CAAAAU
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号:30);
(III-11) SPC-551:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
AAAUUA
UACCGUUAUUGGUG
CAAACA
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号:31);
(III-12) SPC-583:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
CCAGCA
UACCGUUAUUGGUG
CAACAA
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号:32);
ことを特徴とするアプタマーである。
スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するRNAアプタマーであって、
該RNAアプタマーは、「5’−CCGUUAUUGG−3’」のコンセンサス配列をその一部に含む、下記のIII-13〜III-14の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖RNA分子である
(III-13) SPC-548:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
CACCUA
UACCGUUAUUGGUG
CGCAUA
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号:33);
(III-14) SPC-547:
5'- GGCAACCACGACAUCCGG
CAAACA
UACCGUUAUAGGUG
CGCAUA
CCGGAUGUCACACACAC -3' (配列番号:34);
ことを特徴とするアプタマーである。
スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するRNAアプタマーであって、
該RNAアプタマーは、「5’−CCGUUAUUGG−3’」のコンセンサス配列をその一部に含む、下記のIV-1〜IV-4の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖RNA分子である
(IV-1) SPC-m017:
5'- GGGG
AAAGCC
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
CCCC -3' (配列番号:35);
(IV-2) SPC-m018:
5'- GGG
AAAGCC
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
CCC -3' (配列番号:36);
(IV-3) SPC-m019:
5'- GGG
AAAGCC
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
CC -3' (配列番号:37);
(IV-4) SPC-m020:
5'- GGG
AAAGCC
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
C -3' (配列番号:38);
ことを特徴とするアプタマーである。
本発明の第一の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン(SPC)に対する結合能を有するアプタマーは、水溶性のスフィンゴリン脂質である、下記のスフィンゴシルホスホリルコリン(SPC)に代えて、ビオチン化スフィンゴシルホスホリルコリン(ビオチン化SPC)を利用して、該ビオチン化SPCと複合体形成可能な一本鎖RNA分子として、選別されたものである。
30塩基長のランダム配列部分:(N30);
3’末端の固定領域:UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU;(24塩基)
SELEX法を適用した、前記ビオチン化SPCとの複合体形成能に基づく、スクリーニング工程では、前記ビオチン化SPCとの複合体形成、ならびに、形成された複合体の解離は、下記の条件を採用している。
上記の「ランダム一本鎖RNA分子ライブラリー(RNAプール)」を構成する一本鎖RNA分子は、下記の「ランダム二本鎖DNA分子ライブラリー」を構成する、二本鎖DNA分子を転写テンプレートとして利用して、T7RNAポリメラーゼを用いて、in vitro転写によって調製する。
5’末端の固定領域:GGGAATGGATCCACATCTACGAATTC;(26塩基)
N30ランダム配列部分:NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN;
3’末端の固定領域:TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTT;(24塩基)
そのN30ランダム配列部分は、GCの含有比率は、50%に選択されている。
ビーズ分離法を利用するSELEX選択ラウンドでは、ビオチン化SPCは、市販(PIERCE社)の「アガロース・ビーズ上の固定化Streptavidinタンパク質」(Streptavidin Agarose bead: SA bead)、「アガロース・ビーズ上の固定化Neutravidinタンパク質」(Neutravidin Agarose bead: NA bead)を利用して、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質による、ビオチンの結合によって、前記ビーズ上に固定化する。
ビーズ分離法を利用するSELEX選択ラウンドでは、ビーズ上に固定化されている、ビオチン化SPCと複合体を形成している、一本鎖RNA分子を回収するため、下記の条件で、該複合体の解離を行う。
ビーズ分離法を利用するSELEX選択ラウンドを繰り返した後、最終的に、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「RNAアプタマー分子」が濃縮されたRNAプールから、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、SPCに対する結合能を有する「RNAアプタマー分子」を下記の条件で分離する。
ビーズ分離法を利用するSELEX選択ラウンドでは、アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖RNA分子」の濃縮も、不可避的に進行する。
「2回ラウンド」以降で利用する「RNAプール」は、前段のラウンドで回収された「一本鎖RNA分子」より調製される、二本鎖cDNA分子を転写テンプレートとして利用して、T7RNAポリメラーゼを用いて、in vitro転写によって調製する。
5'- GATAATACGACTCACTATA GGGAATGGATCCACATCTACGA -3'
Reverse Primer:(配列番号:40)
5'- AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA -3'
前記Reverse Primerは、回収される「一本鎖RNA分子」の3’末端の固定領域と相補的な塩基配列である。
3'- AAGTGACGTCTGAACTGCTTCGAA -5'
前記Forward Primerは、「T7プロモーター領域」として利用可能な塩基配列と、回収される「一本鎖RNA分子」の5’末端の固定領域の大部分とで構成されている。
5’末端の固定領域の大部分:5'- GGGAATGGATCCACATCTACGA -3'
その結果、回収された「一本鎖RNA分子」を鋳型として調製される、二本鎖cDNA分子の塩基配列は、5’末端にForward Primerに起因する領域、3’末端にReverse Primerに相補的な領域、その間に、回収された「一本鎖RNA分子」の5’末端の固定領域の一部:AUUCと「ランダム配列部分」に由来する領域とで構成されている。
GATAATACGACTCACTATA GGGAATGGATCCACATCTACGA
5’末端の固定領域の一部:AUUCと「ランダム配列部分」に由来する領域:
ATTC NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN
Reverse Primerに相補的な領域:
TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTT
調製された二本鎖cDNA分子を転写テンプレートとして利用して、T7RNAポリメラーゼを用いて、in vitro転写により調製される「一本鎖RNA分子」は、前段のラウンドで回収された「一本鎖RNA分子」とは、その「ランダム配列部分」の頻度分布は、本質的に同じ分布を示すものとなっている。
第一の実施態様では、本発明の第一の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン(SPC)に対する結合能を有するアプタマーを選別する一連の工程の一例を以下に説明する。
5’末端の固定領域:GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC;(26塩基)
3’末端の固定領域:UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU;(24塩基)
の部分には、類似性を示す部分配列が存在しないものを、「5’−CCGUUAUUGG−3’」の部分塩基配列に特徴的な「モチーフ配列」として、選択した。
表3に示す各クローンの一本鎖RNA分子は、それぞれ、固有の三次構造にfoldingされた状態で、ビオチン化SPCならびにSPCと複合体を形成していると、推断される。三次構造の推定は困難であるため、該三次構造を構成する際、その基本的な構造要素となる二次構造の推定を試みた。この一本鎖RNA分子における、二次構造の推定には、特開2008−283943号公報に開示される手法を適用し、二次構造推定プログラム:VALFOLDを利用した。
第二の実施態様では、本発明の第二の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン(SPC)に対する結合能を有するアプタマーを設計する工程の一例を以下に説明する。
(II-1) SPC-m009:
5'-GGGAUCCACAUCUACGAAUUC
UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAUGUUA
UUC C -3' (配列番号:12);
(II-2) SPC-m010:
5'-GGAUCUACGAAUUC
UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAU
CC -3' (配列番号:13);
一本鎖RNA分子;SPC−m009、SPC−m010の推定される二次構造は、「5’−CCGUUAUUGG−3’」のコンセンサス配列を含む「ヘアピン・ループ」の構造を含め、一本鎖RNA分子、SPC-198の推定される二次構造の主要部を保持している。なお、5’−末端と3’−末端の部分は、二本鎖構造となるように、二つのG:C対を形成可能な塩基配列としている。
(II-3) SPC-m011:
5'-GGGAUCCACAUCUACGAAUUC
UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCGUAUCCCGA
UUCC -3' (配列番号:14);
(II-4) SPC-m012:
5'-GGCGAAUUC
UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCG
CC -3' (配列番号:15);
一本鎖RNA分子;SPC−m011、SPC−m012の推定される二次構造は、「5’−CCGUUAUUGG−3’」のコンセンサス配列を含む「ヘアピン・ループ」の構造を含め、一本鎖RNA分子、SPC-203の推定される二次構造の主要部を保持している。なお、5’−末端と3’−末端の部分は、二本鎖構造となるように、二つのG:C対を形成可能な塩基配列としている。
(II-5) SPC-m013:
5'-GGAUCCACAUCUACGAAUUC
UACCGUUAUUGGAGCACGCGUAGUAUGGGU
CC -3' (配列番号:16);
(II-6) SPC-m014:
5'-GGACGAAUUC
UACCGUUAUUGGAGCACGCGU
CC -3' (配列番号:17);
一本鎖RNA分子;SPC−m013、SPC−m014の推定される二次構造は、「5’−CCGUUAUUGG−3’」のコンセンサス配列を含む「ヘアピン・ループ」の構造を含め、一本鎖RNA分子、SPC-289の推定される二次構造の主要部を保持している。なお、5’−末端と3’−末端の部分は、二本鎖構造となるように、二つのG:C対を形成可能な塩基配列としている。
(II-7) SPC-m015:
5'-GGACAUCUACGAAUUC
UACCGUUAUUGGUGUAACGUAAUUGU
CC -3' (配列番号:18);
(II-8) SPC-m016:
5'-GGCGAAUUC
UACCGUUAUUGGUGUAACG
CC -3' (配列番号:19);
一本鎖RNA分子;SPC−m015、SPC−m016の推定される二次構造は、「5’−CCGUUAUUGG−3’」のコンセンサス配列を含む「ヘアピン・ループ」の構造を含め、一本鎖RNA分子、SPC-267の推定される二次構造の主要部を保持している。なお、5’−末端と3’−末端の部分は、二本鎖構造となるように、二つのG:C対を形成可能な塩基配列としている。
(II-9) SPC-m007:
5'-GG
GUCCGCACGCAAAGCAUUAUUGUGA
UUCACUGCAGACUUGAC C C -3' (配列番号:20);
一本鎖RNA分子;SPC−m007の推定される二次構造は、「5’− GCAUUAUUGU−3’」を含む「ヘアピン・ループ」状の構造を含め、一本鎖RNA分子、SPC-213の推定される二次構造の主要部を保持している。なお、5’−末端と3’−末端の部分は、二本鎖構造となるように、二つのG:C対を形成可能な塩基配列としている。
1×buffer:50 mM HEPES(pH 7.4) + 150 mM NaCl + 5 mM MgCl2
0.1×buffer:5 mM HEPES(pH 7.4) + 15 mM NaCl + 5 mM MgCl2
上記の二種を使用して、一本鎖RNA分子:SPC-198について、複合体の形成過程において、一本鎖RNA分子とビオチン化S1Pとの複合体の生成量、一本鎖RNA分子とビオチン化スフィンゴシンとの複合体の生成量、一本鎖RNA分子とビオチン化SPCとの複合体の生成量の相違を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、観測した。
一本鎖RNA分子とビオチン化S1Pとの複合体の生成量の比は、40/320;
一本鎖RNA分子とビオチン化スフィンゴシンとの複合体の生成量の比は、510/800;
一本鎖RNA分子とビオチン化SPCとの複合体の生成量の比は、240/860
となっている。
また、複合体の形成過程の速度定数kaも、僅かに相違するのみであるが、
複合体の生成量は、有意な相違が生じている。
上記の本発明の第二の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン(SPC)に対する結合能を有するアプタマー:SPC-m009, SPC-m010,ならびに、SPC-m011, SPC-m012における、ビオチン化SPCとの複合体形成部位の推定結果から、SPC-m010あるいはSPC-m012の推定二次構造と類似する二次構造を有する一本鎖RNA分子は、同様にビオチン化SPCに対する結合能を有すると推断される。
第三の実施態様では、本発明の第三の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン(SPC)に対する結合能を有するアプタマーを選別する工程の一例を以下に説明する。
5’末端の固定領域:GGCAACCACGACAUCCGG;(18塩基)
6塩基長の第一ランダム配列部分:N1N2N3N4N5N6;(6塩基)
「5’−CCGUUAUUGG−3’」のコンセンサス配列を含む
“Hair pin”ループ形成用の定常領域:UACCGUUAUUGGUG;(14塩基)
6塩基長の第二ランダム配列部分:N'6N'5N'4N'3N'2N'1;(6塩基)
3’末端の固定領域:CCGGAUGUCACACACACG;(18塩基)
を具えている。
5’末端の固定領域:GGCAACCACGACATCCGG;(18塩基)
6塩基長の第一ランダム配列部分:N1N2N3N4N5N6;(6塩基)
「5’−CCGUUAUUGG−3’」のコンセンサス配列を含む
“Hair pin”ループ形成用の定常領域:TACCGTTATTGGTG;(14塩基)
6塩基長の第二ランダム配列部分:N'6N'5N'4N'3N'2N'1;(6塩基)
3’末端の固定領域:CCGGATGTCACACACACG;(18塩基)
各回のラウンドの「SPC-bead-selection工程」では、ビーズ上に固定化されているビオチン化SPCと「RNAプール」を接触させる際、その液温度は、25℃とし、その時間:「Incubation Time」は、表4に示す。
5'- GATAATACGACTCACTATA GGCAACCACGACATCCGG -3'
Reverse Primer 2:(配列番号:42)
5'- GTGTGTGTCACATCCGG -3'
前記Reverse Primer 2は、回収される「一本鎖RNA分子」の3’末端の固定領域と相補的な塩基配列である。
3'- GGCCTACACTGTGTGTG -5'
前記Forward Primer 2は、「T7プロモーター領域」として利用可能な塩基配列と、回収される「一本鎖RNA分子」の5’末端の固定領域の大部分とで構成されている。
5’末端の固定領域の大部分:5'- GGCAACCACGACATCCGG -3'
その結果、回収された「一本鎖RNA分子」を鋳型として調製される、二本鎖cDNA分子の塩基配列は、5’末端にForward Primer 2に起因する領域、3’末端にReverse Primer 2に相補的な領域、その間に、回収された「一本鎖RNA分子」の「6塩基長の第一ランダム配列部分」、“Hair pin”ループ形成用の定常領域、「6塩基長の第二ランダム配列部分」に由来する領域とで構成されている。
GATAATACGACTCACTATA GGCAACCACGACATCCGG
「6塩基長の第一ランダム配列部分」、“Hair pin”ループ形成用の定常領域、「6塩基長の第二ランダム配列部分」に由来する領域:
N1N2N3N4N5N6UACCGUUAUUGGUG N'6N'5N'4N'3N'2N'1
Reverse Primer 2 に相補的な領域:
CCGGAUGUCACACACAC
調製された二本鎖cDNA分子を転写テンプレートとして利用して、T7RNAポリメラーゼを用いて、in vitro転写により調製される「一本鎖RNA分子」は、前段のラウンドで回収された「一本鎖RNA分子」とは、その「ランダム配列部分」の頻度分布は、本質的に同じ分布を示すものとなっている。
上記の本発明の第三の形態にかかる一本鎖RNA分子において、図14に示す推定二次構造において特徴的な“Hair pin”ループ形成に適する、“UACCGUUAUUGGUG”が“UACCGUUAUUGGAG”に変異すると、当該部分の二次構造は、異なっていると推断される。実際に、SPC-524について、その二次構造の推定を行った結果を、図20に示す。「5’−CCGUUAUUGG−3’」のコンセンサス配列は、“Hair pin”ループを形成しているが、二重鎖構造を構成すべき部分が、部分的に異なる構造を形成すると推定された。
第四の実施態様では、本発明の第四の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン(SPC)に対する結合能を有するアプタマーを設計する工程の一例を以下に説明する。
6塩基長の第一ランダム配列部分:AAAGCC;(6塩基)
「5’−CCGUUAUUGG−3’」のコンセンサス配列を含む
“Hair pin”ループ形成用の領域:UACCGUUAUUGGAG;(14塩基)
6塩基長の第二ランダム配列部分:UAAAAA;(6塩基)
の部分により構成される部分構造に関して、実質的に同じ部分構造を形成すると推定される、一本鎖RNA分子を設計した。具体的には、図20に示す二次構造を形成すると推定される、一本鎖RNA分子;SPC−m017、SPC−m018、SPC−m019、ならびにSPC−m020を作製した。
(IV-1) SPC-m017:
5'- GGGG
AAAGCC
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
CCCC -3' (配列番号:35);
(IV-2) SPC-m018:
5'- GGG
AAAGCC
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
CCC -3' (配列番号:36);
(IV-3) SPC-m019:
5'- GGG
AAAGCC
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
CC -3' (配列番号:37);
(IV-4) SPC-m020:
5'- GGG
AAAGCC
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
C -3' (配列番号:38);
一本鎖RNA分子;SPC−m017、SPC−m018、SPC−m019の推定される二次構造は、「5’−CCGUUAUUGG−3’」のコンセンサス配列を含む「ヘアピン・ループ」の構造を含め、一本鎖RNA分子、SPC-524の推定される二次構造の主要部を保持している。なお、5’−末端と3’−末端の部分は、二本鎖構造となるように、二つのG:C対を形成可能な塩基配列としている。
Claims (4)
- Mg2+イオンの非存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有さず、Mg2+イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するRNAアプタマーであって、
Mg2+イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対して結合させた前記RNAアプタマーが示す解離定数KDは、KD≦1μMであり、
Mg2+イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに加えて、スフィンゴシン−1−リン酸とスフィンゴシンに対しても、交差反応性を有し、
Mg2+イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能と、スフィンゴシンに対する結合能は、スフィンゴシン−1−リン酸に対する結合能より有意に優っているRNAアプタマーであり、
該RNAアプタマーは、「5’−GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC−3’」の5’末端の固定領域、「5’−UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU−3’」の3’末端の固定領域、ならびに、前記二つの固定領域の間に配置される、30塩基長のランダム配列部分に由来する領域により構成され、
該RNAアプタマーは、下記のI-1、I-2、I-4、I-6の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖RNA分子である
(I-1) SPC-198:
5’- GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC
UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAUGUUA
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3’ (配列番号:1);
(I-2) SPC-203:
5’- GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC
UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCGUAUCCCGA
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3’ (配列番号:2);
(I-4) SPC-289:
5’- GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC
UACCGUUAUUGGAGCACGCGUAGUAUGGGU
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3’ (配列番号:4);
(I-6) SPC-267:
5’ - GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC
UACCGUUAUUGGUGUAACGUAAUUGUGG
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3’ (配列番号:6);
ことを特徴とするRNAアプタマー。 - Mg2+イオンの非存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有さず、Mg2+イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するRNAアプタマーであって、
Mg2+イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対して結合させた前記RNAアプタマーが示す解離定数KDは、KD≦1μMであり、
Mg2+イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに加えて、スフィンゴシン−1−リン酸とスフィンゴシンに対しても、交差反応性を有し、
Mg2+イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能と、スフィンゴシンに対する結合能は、スフィンゴシン−1−リン酸に対する結合能より有意に優っているRNAアプタマーであり、
該RNAアプタマーは、「5’−CCGUUAUUGG−3’」のコンセンサス配列をその一部に含む、下記のII-1〜II-8の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖RNA分子である
(II-1) SPC-m009:
5’- GGGAUCCACAUCUACGAAUUC
UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAUGUUA
UUCC -3’ (配列番号:12);
(II-2) SPC-m010:
5’- GGAUCUACGAAUUC
UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAU
CC -3’ (配列番号:13);
(II-3) SPC-m011:
5’- GGGAUCCACAUCUACGAAUUC
UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCGUAUCCCGA
UUCC -3’ (配列番号:14);
(II-4) SPC-m012:
5’- GGCGAAUUC
UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCG
CC -3’ (配列番号:15);
(II-5) SPC-m013:
5’- GGAUCCACAUCUACGAAUUC
UACCGUUAUUGGAGCACGCGUAGUAUGGGU
CC -3’ (配列番号:16);
(II-6) SPC-m014:
5’- GGACGAAUUC
UACCGUUAUUGGAGCACGCGU
CC -3’ (配列番号:17);
(II-7) SPC-m015:
5’- GGACAUCUACGAAUUC
UACCGUUAUUGGUGUAACGUAAUUGU
CC -3’ (配列番号:18);
(II-8) SPC-m016:
5’- GGCGAAUUC
UACCGUUAUUGGUGUAACG
CC -3’ (配列番号:19);
ことを特徴とするRNAアプタマー。 - Mg2+イオンの非存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有さず、Mg2+イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するRNAアプタマーであって、
Mg2+イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対して結合させた前記RNAアプタマーが示す解離定数KDは、KD≦1μMであり、
Mg2+イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに加えて、スフィンゴシン−1−リン酸とスフィンゴシンに対しても、交差反応性を有し、
Mg2+イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能と、スフィンゴシンに対する結合能は、スフィンゴシン−1−リン酸に対する結合能より有意に優っているRNAアプタマーであり、
該RNAアプタマーは、「5’−GGCAACCACGACAUCCGG−3’」の5’末端の固定領域、「5’−CCGGAUGUCACACACAC−3’」の3’末端の固定領域、ならびに、前記二つの固定領域の間に配置される、「5’−CCGUUAUUGG−3’」のコンセンサス配列をその一部に含む「5’-N1N2N3N4N5N6UACCGUUAUUGGAG N’6N’5N’4N’3N’2N’1-3’」の30塩基長の領域により構成される、下記のIII-1〜III-6とIII-8の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖RNA分子である
(III-1) SPC-514:
5’- GGCAACCACGACAUCCGG
AAAGCC UACCGUUAUUGGAG AAAAAA
CCGGAUGUCACACACAC -3’ (配列番号:21);
(III-2) SPC-520:
5’- GGCAACCACGACAUCCGG
GAAGCC UACCGUUAUUGGAG AAAAAA
CCGGAUGUCACACACAC -3’ (配列番号:22);
(III-3) SPC-524:
5’- GGCAACCACGACAUCCGG
AAAGCC UACCGUUAUUGGAG UAAAAA
CCGGAUGUCACACACAC -3’ (配列番号:23);
(III-4) SPC-562:
5’- GGCAACCACGACAUCCGG
CAGGCC UACCGUUAUUGGAG AAAAUA
CCGGAUGUCACACACAC -3’ (配列番号:24);
(III-5) SPC-536:
5’- GGCAACCACGACAUCCGG
AAGGCC UACCGUUAUUGGAG AAUAUU
CCGGAUGUCACACACAC -3’ (配列番号:25);
(III-6) SPC-501:
5’- GGCAACCACGACAUCCGG
GCGGCC UACCGUUAUUGGAG UAAACU
CCGGAUGUCACACACAC -3’ (配列番号:26);
(III-8) SPC-511:
5’- GGCAACCACGACAUCCGG
CGGGCC UACCGUUAUUGGAG AUAACU
CCGGAUGUCACACACAC -3’ (配列番号:28);
ことを特徴とするRNAアプタマー。 - Mg2+イオンの存在下、Mg2+イオンの非存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するRNAアプタマーであって、
Mg2+イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対して結合させた前記RNAアプタマーが示す解離定数KDは、KD≦1μMであり、
Mg2+イオンの存在下、Mg2+イオンの非存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するRNAアプタマーであって、
Mg2+イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに加えて、スフィンゴシン−1−リン酸とスフィンゴシンに対しても、交差反応性を有し、
Mg2+イオンの存在下において、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能と、スフィンゴシンに対する結合能は、スフィンゴシン−1−リン酸に対する結合能より有意に優っているRNAアプタマーであり、
該RNAアプタマーは、「5’−GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC−3’」の5’末端の固定領域、「5’−UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU−3’」の3’末端の固定領域、ならびに、前記二つの固定領域の間に配置される、30塩基長のランダム配列部分に由来する領域により構成され、
該RNAアプタマーは、下記のI-10の塩基配列の一本鎖RNA分子である
(I-10) SPC-213:
5’-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC
GCAUUGUCCGCACGCAAAGCAUUAUUGUGA
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3’ (配列番号:10);
ことを特徴とするRNAアプタマー。
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