WO2011007860A1 - スフィンゴシルホスホリルコリンに結合するアプタマー分子 - Google Patents

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WO2011007860A1
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spc
seq
biotinylated
stranded rna
molecule
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PCT/JP2010/062044
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French (fr)
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克紀 堀井
嘉仁 吉田
真木雄 古市
巌 和賀
和也 小見
有香 今井
麻子 岡
徹二 谷本
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Ｎｅｃソフト株式会社
富士レビオ株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers

Definitions

  • the present invention relates to an aptamer molecule having binding ability to sphingosylphosphorylcholine.
  • Ischemic diseases such as ischemic heart disease and ischemic stroke are mostly caused by thrombus or arterial vasospasm.
  • the majority of ischemic heart disease is coronary artery disease, clinically accompanied by symptoms of angina, myocardial infarction, and sudden cardiac death.
  • arteriosclerosis for example, atherosclerosis
  • abnormal lipid metabolism such as hyperlipidemia
  • Various intrinsic factors and environmental factors are involved in the basic disease.
  • Phospholipid is one of the components of cell membrane having a lipid bilayer structure and is also involved in signal transmission in vivo. Phospholipids are roughly classified into glycerophospholipids and sphingophospholipids. Sphingomyelin (SPH) is a kind of sphingophospholipid, and in humans, it is reported that it accounts for about 85% of the total amount of sphingolipid present in the body. Sphingomyelin is mainly present in the outer membrane of mammalian cell membranes.
  • lipid raft exists in mammalian cell membranes. This lipid raft is a domain rich in sphingolipids and cholesterol. Lipid rafts accumulate membrane proteins or proteins that migrate into the membrane, and have important roles in signal transduction through the membrane, bacterial and viral infection, cell adhesion or intracellular vesicle transport, and intracellular polarity It has been elucidated to be a functional domain.
  • Lipid rafts are mainly composed of sphingophospholipids or glycosphingolipids containing saturated fatty acids as fatty acids. Saturated fatty acids are linear in molecules, so there are few steric hindrances, and sphingolipids are closely associated with each other. On the other hand, other regions containing a large amount of lipids composed of unsaturated fatty acids, which are bent molecules, associate relatively slowly. As a result, lipid rafts have relatively low fluidity compared to other areas of the cell membrane. Furthermore, cholesterol has a high affinity for sphingolipids and exists in a form sandwiched between the sphingolipids. This cholesterol imparts fluidity to lipid rafts while retaining a high degree of membrane structure packing.
  • the src family, G protein, etc. which are signal transduction substances, are localized in this lipid raft in the form of piercing the acyl group into the membrane domain when subjected to N-acylation. As a result, these signaling substances also associate with receptors located in lipid rafts and relay signals.
  • the half-life of the acyl group of the N-acylated protein is shorter than the half-life of the protein itself, and the localization to the lipid raft is regulated using the cycle of acylation and deacylation. It is speculated.
  • Sphingomyelin which is the sphingophospholipid, is one of the components of the cell membrane, but its deacylated metabolite is not fixed to the cell membrane and is contained in the blood as a water-soluble phospholipid. .
  • Sphingosylphosphorylcholine has a structure in which the fatty acid that is N-acylated in the above sphingomyelin is deacylated.
  • SPC causes calcium-independent abnormal contraction
  • ischemic diseases such as angina pectoris, myocardial infarction, and stroke
  • it is a biomarker that can be used for estimating the risk of developing ischemic diseases, particularly angina pectoris, myocardial infarction, and sudden cardiac death caused by thrombus or arterial vasospasm.
  • Sphingosine-1-phosphate (S1P) is released from choline (H-CH 2 CH 2 -N + (CH 3 ) 3 ) by hydrolysis of phosphate ester in sphingomyelin, Further, the fatty acid that is N-acylated has a structure that has undergone deacylation.
  • Sphingosine-1-phosphate is a kind of lysophospholipid.
  • S1P cleaved by an enzyme from sphingomyelin present in the outer membrane of the cell membrane is a living active substance that induces cell migration and the like by binding to a G protein-coupled receptor expressed on the cell membrane surface. Induction of cell migration by S1P is also caused at a low concentration of 10 to 100 nM.
  • lipoproteins such as HDL, which are blood proteins, and albumin, and as a result, the above functions are suppressed.
  • S1P When S1P undergoes a dephosphorylation reaction by S1P phosphatase-1 (SPP-1) or S1P phosphatase-2 (SPP-2), it loses its ability to bind to the G protein-coupled receptor, and as a result, its activity is reduced. lose.
  • S1P receptors of the G protein-coupled receptor type which are receptors for S1P
  • the presence of at least five types of S1P receptors: S1P 1 to S1P 5 has been reported.
  • S1P is produced by phosphorylation of sphingosine by sphingosine kinase (SphK), which will be described later, and released from the cell via the ABC transporter. It has been reported.
  • SphK there are two types of SphK, SphK1 and SphK2, such as interleukin-1 ⁇ (IL-1 ⁇ ), platelet-derived growth factor (PDGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), and TNF- ⁇ .
  • IL-1 ⁇ interleukin-1 ⁇
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • TNF- ⁇ TNF- ⁇ .
  • S1P has a function of a second messenger that causes calcium ion influx from the outside of the cell. Therefore, S1P is also known to be involved in various intracellular processes. For example, S1P has a function of inducing control of cell movement, cell proliferation, formation of cytoskeleton, and the like.
  • Sphingosine by hydrolysis of phosphoric acid esters of sphingomyelin, apart phosphorylcholine (HO-PO (OH) -O -CH 2 CH 2 -N + (CH 3) 3) is de, further a N- acylated
  • the fatty acid being used has a structure subjected to deacylation.
  • Sphingosine itself has an activity that leads cells to apoptosis.
  • the concentration of various sphingomyelin metabolites contained in the blood as water-soluble phospholipids and the risk of developing ischemic diseases such as angina pectoris, myocardial infarction, and stroke Research on the correlation with is ongoing.
  • the concentration of various sphingomyelin metabolites contained in blood collected from patients with ischemic diseases such as angina pectoris, myocardial infarction, and stroke, and the patient's Studies on the correlation with symptoms and the direct cause of the onset are underway.
  • the concentration of SPC contained in the blood of healthy individuals is reported to be about several nM. Therefore, at present, for the quantification of the blood concentration of SPC, for example, a method is used in which SPC contained in plasma is separated by applying a chromatographic method and then quantifying using mass spectrometry. Has been.
  • SPC can be used as a biomarker in predicting the risk of developing angina, myocardial infarction, stroke, and sudden cardiac death, for example, clinical
  • a method for more easily measuring the blood concentration of SPC is required. Specifically, development of a biosensor that can more easily measure the concentration of SPC contained in blood is desired.
  • anti-phospholipid antibody syndrome an autoimmune disease caused by the ability of autoantibodies to phospholipids, which are endogenous biological substances common to mammals
  • APS anti-phospholipid antibody syndrome
  • aptamers which are nucleic acid molecules exhibiting specific binding ability
  • SPC sphingosylphosphorylcholine
  • SPC sphingosylphosphorylcholine
  • an object of the present invention is to provide an aptamer that exhibits a specific binding ability to sphingosylphosphorylcholine (SPC).
  • an object of the present invention is to provide an aptamer that has low cross-reactivity to sphingosine-1-phosphate (S1P) and sphingosine and exhibits specific binding ability to sphingosylphosphorylcholine (SPC). is there.
  • RNA aptamer molecule for SPC that shows a certain level of binding ability to sphingosylphosphorylcholine (SPC) actually exists. Went. Furthermore, if there is an “RNA aptamer molecule against SPC” that exhibits a certain level of binding ability, an attempt is made to specify the base sequence of the single-stranded nucleic acid molecule that constitutes the “RNA aptamer molecule against SPC”. It was.
  • RNA aptamer molecule against SPC Prior to the search for “RNA aptamer molecule against SPC” that exhibits a certain binding ability to sphingosylphosphorylcholine (SPC), sphingosylphosphorylcholine (SPC), sphingosine-1-phosphate (S1P), and sphingosine was considered as to how it was dissolved in an aqueous solution of around 7.
  • SPC Sphingosylphosphorylcholine
  • S1P sphingosine-1-phosphate
  • sphingosine are biotinylated, respectively. Derivatives that have been subjected to are used. The biotinylated derivative was also considered in what form it exists in an aqueous solution having a pH of around 7.
  • the target molecule sphingosyl phosphorylcholine (SPC) has a hydroxyl group (—OH) of sphingosine, which is a hydrophobic moiety, and a phosphate group (—O—PO (OH) 2, of phosphorylcholine (choline phosphate), which is a hydrophilic moiety. ) And a phosphate ester bond (—O—PO (OH) —O—).
  • a hydrophilic atomic group (—CH (—OH) —CH (—NH 2 ) —CH 2 —O—PO (OH) —O—CH 2 CH 2 —N + (CH) derived from this phosphorylcholine (choline phosphate) 3 )
  • ionization of the phosphate ester bond (—O—PO (OH) —O—) occurs, and the zwitterionic structure (—CH (—OH) —CH (—NH 2 ) — CH 2 —O—PO (O ⁇ ) —O—CH 2 CH 2 —N + (CH 3 ) 3 ). Therefore, it is presumed that the sphingosyl phosphorylcholine (SPC) has a function of a cationic or amphoteric surfactant.
  • SPC sphingosyl phosphorylcholine
  • the hydrophilic atomic group derived from phosphorylcholine (choline phosphate) present in sphingomyelin has a certain ratio of zwitterionic structure (—O—PO (O ⁇ ) —O—CH 2 CH 2 —N). + (CH 3 ) 3 ).
  • Biotinylated biotinylated SPC in which sphingosylphosphorylcholine (SPC) has been biotinylated (biotin: 5-[(3aS, 4S, 6aR) -2-oxohexahydro-1H-Sieno [3,4- d) imidazol-4-yl] pentanoic acid) is bound to the amino group introduced at the end of the sphingosine skeleton by N-acylation reaction. Therefore, the hydrophilic atomic group of biotinylated SPC has substantially the same partial structure as that of the SPC.
  • hydrophilic atomic group derived from phosphorylcholine (choline phosphate) present in biotinylated SPC has a certain ratio of zwitterionic structure (—O—PO (O ⁇ ) —O—CH 2 CH 2 —). N + (CH 3 ) 3 ).
  • sphingosine-1-phosphate S1P has phosphoric acid ester bonds (HO—PO (OH) 2 ) to a hydroxyl group (—OH) at the end of sphingosine, which is a hydrophobic moiety.
  • -O-PO (OH) 2 This phosphate ester moiety is ionized in an aqueous solution having a pH of about 6 to 8, and is converted into, for example, an anionic atomic group (—O—PO (OH) —O ⁇ ).
  • the phosphorylated site has a partial structure of —CH (—OH) —CH (—NH 2 ) —CH 2 —O—, and the amino group (—NH 2 ) of the moiety is It has a function as a proton accepting site. Consequently, when such intramolecular proton donation / acceptance is achieved, the zwitterionic structure: —CH (—OH) —CH (— + NH 3 ) —CH 2 —O—PO (OH) —O 2 — Composed. Alternatively, partially, when ionization further proceeds, the following structure is reached: —CH (—OH) —CH (— + NH 3 ) —CH 2 —O—PO 3 2 ⁇ .
  • the sphingosine-1-phosphate (S1P) has a hydrophobic portion and the amphoteric ionic structure or an anionic hydrophilic portion, and has the function of an anionic surfactant. Inferred.
  • biotinylated S1P which is biotinylated against sphingosine-1-phosphate (S1P)
  • biotin is bound to the amino group introduced at the end of the sphingosine skeleton by N-acylation reaction.
  • the hydrophilic atomic group has substantially the same partial structure as that of S1P. That is, when intramolecular proton donation / acceptance is achieved, the zwitterionic structure: —CH (—OH) —CH (— + NH 3 ) —CH 2 —O—PO (OH) —O 2 — is formed. .
  • the following structure is reached: —CH (—OH) —CH (— + NH 3 ) —CH 2 —O—PO 3 2 ⁇ .
  • sphingosine itself has a hydrophilic group (—CH () having a linear hydrocarbon group portion rich in hydrophobicity, and an amino group (—NH 2 ) and a hydroxyl group (—OH), which are hydrophilic groups. -NH 2 ) -CH 2 -OH).
  • —NH 2 amino group
  • —OH hydroxyl group
  • ethanolamine functions as a chelate ligand for metal surfaces and metal cations.
  • this chelate ligand it is presumed that ethanolamine (HO—CH 2 CH 2 —NH 2 ) often does not show the shape of a cationic species.
  • the hydrophilic atomic group —CH (—OH) —CH (—NH 2 ) —CH 2 —OH) in the sphingosine often does not show the shape of the cationic species.
  • biotinylated sphingosine which is biotinylated with respect to sphingosine
  • biotin is bound to the amino group introduced at the end of the sphingosine skeleton by N-acylation reaction. Therefore, also in biotinylated sphingosine, the hydrophilic atomic group has substantially the same partial structure as that of the sphingosine region. That is, it is presumed that the hydrophilic atomic group (—CH (—OH) —CH (—NH 2 ) —CH 2 —OH) in the biotinylated sphingosine also does not show the shape of the cationic species in many cases. .
  • RNA aptamer molecule against SPC selected in the screening process using biotinylated SPC
  • hydrophobic interaction with the hydrocarbon chain portion of sphingosine which is the hydrophobic portion in the biotinylated SPC
  • a hydrophilic atomic group derived from phosphocholine —CH (—OH) —CH (—NH 2 ) —CH 2 —O—PO (O ⁇ ) —O—CH 2 CH 2 —N + ( It is inferred that it has a part having an interaction with CH 3 ) 3 ).
  • RNA aptamer molecule for a target molecule, a “random single-stranded nucleic acid molecule library” is prepared, and screening that applies the SELEX method is used for binding ability to the target molecule.
  • the size of the SPC portion in the biotinylated SPC is 30 mm or less considering that the CC bond distance is about 1.5 mm.
  • the “RNA aptamer molecule” that forms an intermolecular bond with a compound of this molecular size has a 30-base length having a random base sequence between the 5′-terminal fixed region and the 3′-terminal fixed region. (N 30 ) was present in the “random single-stranded RNA molecule library” in the inserted form.
  • the present inventors use a 30-base-long portion (N 30) having a random base sequence between a 5′-terminal fixed region and a 3′-terminal fixed region, which is used for screening to which the SELEX method is applied.
  • N 30 a 30-base-long portion having a random base sequence between a 5′-terminal fixed region and a 3′-terminal fixed region, which is used for screening to which the SELEX method is applied.
  • N 30 Zadom single-stranded RNA molecule library
  • 5 'terminal fixed region GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC
  • (26 bases) 30 base-long random sequence portion: (N 30 ); 3 'terminal fixed region: UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU; (24 bases)
  • RNA aptamer molecule having binding ability to the biotinylated SPC was searched.
  • RNA aptamer molecule was selected.
  • RNA aptamer molecules collected in the 12th round was further screened for the ability to bind to biotinylated SPC using a surface plasmon resonance measuring apparatus, and a total of 13 rounds were selected.
  • RNA aptamer molecule prepared by reverse transcription was introduced into Escherichia coli and cloned.
  • an “RNA aptamer molecule” is prepared using the introduced cDNA as a template, and the binding ability to biotinylated SPC is evaluated using a surface plasmon resonance measurement apparatus.
  • At least the binding buffer solution dissociation constant, K D, the middle has selected satisfying the condition of K D ⁇ 1 [mu] M "RNA aptamer molecule".
  • the base sequence of the “RNA aptamer molecule” that satisfies the above selection conditions was analyzed.
  • a clone family in which a group of clones of “RNA aptamer molecules” satisfying the above-mentioned selection conditions based on the results of nucleotide sequence analysis has two or more clones with the same “random nucleotide sequence” portion. Sorted out. Furthermore, a clone having a single base difference was selected by comparison with the “random base sequence” portion of the selected clone family, and a single-base mutant member of the clone family was selected.
  • the complex of “RNA aptamer molecule” and biotinylated SPC contains 50 mM HEPES buffer (pH 7) containing 10 mM EDTA. .4) It was confirmed that it quickly dissociated when immersed in. Therefore, in these clone families, the complex formation site between the “RNA aptamer molecule” and biotinylated SPC contains Mg cations. When the Mg cations are removed by EDTA, the complex dissociates.
  • RNA aptamer molecule includes 10mM of EDTA, 50 mM HEPES It was confirmed that dissociation was not accelerated at all even when immersed in a buffer solution (pH 7.4). Therefore, in this clone family, the complex formation site between the “RNA aptamer molecule” and the biotinylated SPC does not contain Mg cations. As a result, even when EDTA is allowed to act, the complex is completely dissociated. If not promoted, it was inferred.
  • the consensus sequence of “5′-CCGUUAUUGG-3 ′” was included in the region showing the shape of the “Hair pin” loop in the estimated secondary structure. Furthermore, the site of "5'- G C A UUAUUG U -3 '' similar to the well, were included in the region showing the shape of a" Hair pin "loop. That is, the “random base sequence” portion of each “RNA aptamer molecule” clone family contained an area showing the shape of the “Hair pin” loop.
  • binding to the biotinylated SPC using the partial secondary structure centered on the region indicating the shape of the “Hair pin” loop in the estimated secondary structure. We were guessed that we had achieved. On the other hand, it was presumed that the secondary structure portion composed of the 5′-end fixed region and the 3′-end fixed region was not directly involved in the binding to the biotinylated SPC.
  • RNA aptamer molecule having binding ability to biotinylated SPC was selected.
  • the “single-stranded RNA molecule library” having a length of 62 bases is 5'-terminal fixed region: GGCAACCACGACAUCCGG; (18 bases) First random sequence portion having a length of 6 bases: N 1 N 2 N 3 N 4 N 5 N 6 ; (6 bases) “Hair pin” loop-forming constant region containing a consensus sequence of “5′-CCGUUAUUGG-3 ′”: UACCGUUAUUGGUG; (14 bases) Second random sequence portion having a length of 6 bases: N ′ 6 N ′ 5 N ′ 4 N ′ 3 N ′ 2 N ′ 1 ; (6 bases) Fixed region at the 3 ′ end: CCGGAUGUCACACACACG; (18 bases) It has.
  • RNA aptamer molecule having low binding ability to biotinylated S1P and biotinylated sphingosine but having high binding ability to biotinylated SPC using the“ single-stranded RNA molecule library ”having a length of 62 bases ”Was searched.
  • RNA aptamer molecule was selected.
  • RNA aptamer molecules collected in the 5 rounds is further subjected to a two-stage screening for the binding ability to biotinylated SPC using a surface plasmon resonance measuring apparatus, and a total of 7 rounds of screening are selected.
  • a group of “RNA aptamer molecules” having low binding ability to biotinylated S1P and biotinylated sphingosine but having relatively high binding ability to biotinylated SPC was collected.
  • RNA aptamer molecule From the “RNA aptamer molecule” after the selection of 7 rounds in total, cDNA prepared by reverse transcription was introduced into Escherichia coli and cloned. For each clone, an “RNA aptamer molecule” is prepared using the introduced cDNA as a template, and the binding ability to biotinylated SPC is evaluated using a surface plasmon resonance measurement apparatus. At least the binding buffer solution dissociation constant, K D, the middle has selected satisfying the condition of K D ⁇ 1 [mu] M "RNA aptamer molecule". Furthermore, the base sequence of an “RNA aptamer molecule” having a total length of 62 bases or less that satisfies the above selection conditions was analyzed.
  • the secondary structure of an “RNA aptamer molecule” having a total length of 62 bases or less that satisfies the above selection conditions was estimated.
  • the selected secondary structure of the “RNA aptamer molecule” having a length of 62 bases or less retains the “Hair pin” loop shape including the consensus sequence of “5′-CCGUUAUUGG-3 ′”. It was estimated that
  • a small-sized “single-stranded RNA molecule” was prepared by selecting a partial sequence of 30 to 34 bases including a constant region for formation and a second random sequence part having a length of 6 bases. These miniaturized “single-stranded RNA molecules” were evaluated for their ability to bind to biotinylated SPC.
  • the "single-stranded RNA molecule" miniaturized also, the dissociation constant, K D, in the binding buffer solution is confirmed to correspond to meet the K D ⁇ 1 [mu] M "RNA aptamer molecule" It was done.
  • RNA aptamer molecule having a length of 62 bases or less and the reduced “single-stranded RNA molecule” having a length of 30 to 34 bases and including a partial sequence thereof are The biotinylated SPC complex was confirmed to dissociate rapidly when immersed in 20 mM HEPES buffer (pH 7.4) containing 10 mM EDTA. Therefore, in these “single-stranded RNA molecules”, Mg cations are contained in the complex-forming site between the “single-stranded RNA molecules” and biotinylated SPC, and the Mg cations are removed by EDTA. It was presumed that the complex was dissociated.
  • the inventors have completed the present invention based on the results of the series of studies described above.
  • RNA aptamer having a binding ability to sphingosylphosphorylcholine (SPC) according to the first aspect of the present invention, An RNA aptamer capable of binding to sphingosylphosphorylcholine,
  • the RNA aptamer is a single-stranded RNA molecule having a base sequence selected from the group consisting of the following base sequences I-1 to I-11 (I-1) SPC-198: 5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAUGUUA UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3 ′ (SEQ ID NO: 1); (I-2) SPC-203: 5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCGUAUCCCGA UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU -3 ′ (SEQ ID NO: 2); (I-3) SPC-209: 5'-GGGAAUGGAUCCACA
  • RNA aptamer having binding ability to sphingosylphosphorylcholine is as follows:
  • An RNA aptamer capable of binding to sphingosylphosphorylcholine is a single-stranded RNA having a base sequence selected from the group consisting of the following base sequences II-1 to II-8, including a consensus sequence of “5′-CCGUUAUUGG-3 ′” as a part thereof:
  • RNA aptamer capable of binding to sphingosylphosphorylcholine is a single-stranded RNA of the following II-9 nucleotide sequence, which includes the sequence of “5′-GCAUUAUUGU-3 ′” similar to the consensus sequence of “5′-CCGUUAUUGG-3 ′” as a part thereof: It is a molecule (II-9) SPC-m007: 5'-G G GUCCGCACGCAAAGCAUUAUUGUGA UUCACUGCAGACUUGAC C C-3 ′ (SEQ ID NO: 20); It is an aptamer characterized by this.
  • RNA aptamer having binding ability to sphingosylphosphorylcholine is as follows:
  • An RNA aptamer capable of binding to sphingosylphosphorylcholine is a single-stranded RNA having a base sequence selected from the group consisting of the following base sequences of III-1 to III-8, including a consensus sequence of “5′-CCGUUAUUGG-3 ′” as a part thereof:
  • RNA aptamer capable of binding to sphingosylphosphorylcholine is a single-stranded RNA having a base sequence selected from the group consisting of the following base sequences of III-9 to III-12, including a consensus sequence of “5′-CCGUUAUUGG-3 ′” as a part thereof:
  • RNA aptamer having binding ability to sphingosylphosphorylcholine is as follows:
  • An RNA aptamer capable of binding to sphingosylphosphorylcholine is a single-stranded RNA having a base sequence selected from the group consisting of the following base sequences of III-13 to III-14, including a consensus sequence of “5′-CCGUUAUUGG-3 ′” as a part thereof:
  • An example of an aptamer having binding ability to sphingosylphosphorylcholine (SPC) according to the fourth aspect of the present invention is as follows:
  • An RNA aptamer capable of binding to sphingosylphosphorylcholine is a single-stranded RNA having a base sequence selected from the group consisting of the following base sequences of IV-1 to IV-4, including a consensus sequence of “5′-CCGUUAUUGG-3 ′” as a part thereof:
  • the “RNA aptamer molecule” having binding ability to sphingosylphosphorylcholine (SPC) according to the present invention is a sphingosylphosphorylcholine (SPC) which is a kind of free sphingophospholipid among free phospholipids contained in the circulating blood. ) And a specific complex can be formed. Therefore, the “RNA aptamer molecule” having the binding ability to sphingosylphosphorylcholine (SPC) according to the present invention utilizes a specific complex formation for sphingosylphosphorylcholine (SPC), which is a kind of free sphingophospholipid. Therefore, it can be applied to the purpose of quantifying the concentration in the circulating blood.
  • SPC sphingosylphosphorylcholine
  • FIG. 1 shows that the “RNA aptamer molecule” capable of binding to SPC according to the first embodiment of the present invention is contained in a selection sample in each round in the step of selecting using an SELEX screening method. It is a figure which shows an example of the result of having evaluated the enrichment degree of "RNA aptamer molecule" using a surface plasmon resonance measuring apparatus.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence of the cDNA of a clone family in which a plurality of clones were found in a clone of “RNA aptamer molecule” capable of binding to SPC, which was selected using the SELEX screening method. It is a figure which shows the result of contrast.
  • FIG. 1 shows that the “RNA aptamer molecule” capable of binding to SPC according to the first embodiment of the present invention is contained in a selection sample in each round in the step of selecting using an SELEX screening method. It is a figure which shows an example of the result of having evaluated the enrichment degree of "
  • FIG. 3 shows the behavior of the complex formation process with biotinylated SPC and the dissociation process of the complex with biotinylated SPC with respect to the “RNA aptamer molecule” capable of binding to SPC according to the first embodiment of the present invention. It is a figure which shows an example of the result evaluated using the surface plasmon resonance measuring apparatus.
  • FIG. 4-1 shows the rate constant ka of the complex formation process with biotinylated SPC, biotinylated SPC regarding the “RNA aptamer molecule” SPC-198 capable of binding to SPC according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 4-2 shows the rate constant ka
  • FIG. 5-1 shows a complex formation process with biotinylated SPC and a complex with biotinylated SPC regarding “RNA aptamer molecule” SPC-289 having binding ability to SPC according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 5-2 shows a complex formation process with biotinylated SPC and a complex with biotinylated SPC regarding “RNA aptamer molecule” SPC-267 capable of binding to SPC according to the first embodiment of the present invention. It is a figure which shows an example of the result of having evaluated the behavior of the dissociation process of using a surface plasmon resonance measuring apparatus.
  • FIG. 6-1 is a diagram showing the estimation results of the secondary structure of “RNA aptamer molecule” SPC-198 having binding ability to SPC according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 6-2 is a diagram showing the estimation results of the secondary structure of the “RNA aptamer molecule” SPC-203 having binding ability to SPC according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 6-3 is a diagram showing the estimation results of the secondary structure of “RNA aptamer molecule” SPC-289 having binding ability to SPC according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 6-4 is a diagram showing the estimation results of the secondary structure of “RNA aptamer molecule” SPC-267 having the ability to bind to SPC according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 6-5 is a diagram showing the estimation results of the secondary structure of “RNA aptamer molecule” SPC-213 having binding ability to SPC according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 7-1 shows a single-stranded RNA molecule according to the second embodiment of the present invention designed based on “RNA aptamer molecule” SPC-198 capable of binding to SPC; SPC-m009, SPC-m010. It is a figure which shows the presumed secondary structure.
  • FIG. 7-2 shows a single-stranded RNA molecule according to the second embodiment of the present invention designed based on “RNA aptamer molecule” SPC-203 having binding ability to SPC; SPC-m011, SPC-m012 It is a figure which shows the presumed secondary structure.
  • FIG. 7-1 shows a single-stranded RNA molecule according to the second embodiment of the present invention designed based on “RNA aptamer molecule” SPC-198 capable of binding to SPC; SPC-m009, SPC-m010. It is a figure which shows the presumed secondary structure.
  • FIG. 7-2 shows a single-stranded RNA molecule according to the second embodiment of the present
  • FIG. 7-3 shows a single-stranded RNA molecule according to the second embodiment of the present invention designed based on “RNA aptamer molecule” SPC-289 having binding ability to SPC; SPC-m013, SPC-m014; It is a figure which shows the presumed secondary structure.
  • FIG. 7-4 shows a single-stranded RNA molecule according to the second embodiment of the present invention designed based on “RNA aptamer molecule” SPC-267 having binding ability to SPC; SPC-m015, SPC-m016 It is a figure which shows the presumed secondary structure.
  • FIG. 7-3 shows a single-stranded RNA molecule according to the second embodiment of the present invention designed based on “RNA aptamer molecule” SPC-289 having binding ability to SPC; SPC-m013, SPC-m014; It is a figure which shows the presumed secondary structure.
  • FIG. 7-4 shows a single-stranded RNA molecule according to the second embodiment of the present
  • FIG. 7-5 shows a presumed single-stranded RNA molecule; SPC-m007 according to the second embodiment of the present invention, designed based on “RNA aptamer molecule” SPC-213 capable of binding to SPC. It is a figure which shows a secondary structure.
  • FIG. 8-1 shows biotinylated SPC for single-stranded RNA molecules; SPC-m009, SPC-m010, SPC-m011, SPC-m012, SPC-m013, SPC-m014, SPC-m015, and SPC-m016. It is a figure which shows an example of the result of having evaluated the behavior of the complex formation process and the dissociation process of a complex using the surface plasmon resonance measuring apparatus.
  • FIG. 8-1 shows biotinylated SPC for single-stranded RNA molecules; SPC-m009, SPC-m010, SPC-m011, SPC-m012, SPC-m013, SPC-m014, S
  • FIG. 8-2 shows the results of evaluating the behavior of the complex formation process and the complex dissociation process for biotinylated SPC with respect to the single-stranded RNA molecule; SPC-m007, using a surface plasmon resonance measuring apparatus. It is a figure which shows an example.
  • FIG. 9-1 shows the behavior of the complex formation process and the complex dissociation process for biotinylated SPC with respect to the “RNA aptamer molecule” SPC-198 capable of binding to SPC according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 9-2 shows the behavior of the complex formation process and the complex dissociation process with respect to biotinylated S1P regarding the “RNA aptamer molecule” SPC-198 capable of binding to SPC according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 9-3 shows the behavior of the complex formation process and the complex dissociation process with respect to biotinylated sphingosine with respect to the “RNA aptamer molecule” SPC-198 capable of binding to SPC according to the first embodiment of the present invention.
  • FIG. 9-3 shows the behavior of the complex formation process and the complex dissociation process with respect to biotinylated sphin
  • FIG. 10-1 shows a single-stranded RNA molecule; SPC-m009, SPC-m010, SPC-m011, SPC-m012, SPC-m013, SPC-m014, SPC-m015, SPC-m016, and the basis of the design.
  • FIG. 10-2 shows a single-stranded RNA molecule; SPC-m009, SPC-m010, SPC-m011, SPC-m012, SPC-m013, SPC-m014, SPC-m015, SPC-m016, and the basis of their design.
  • FIG. 10-3 shows a single-stranded RNA molecule; SPC-m009, SPC-m010, SPC-m011, SPC-m012, SPC-m013, SPC-m014, SPC-m015, SPC-m016 and the basis of the design.
  • FIG. 11 shows the complex formation process with biotinylated SPC and the behavior of the complex dissociation process with respect to the “RNA aptamer molecule” SPC-198 capable of binding to SPC according to the first embodiment of the present invention. It is a figure which shows an example of the result of having evaluated the influence of the NaCl density
  • FIG. 12 shows the comparison of the base sequences of single-stranded RNA molecules; SPC-m009, SPC-m010, SPC-m011, SPC-m012, SPC-m013, SPC-m014, SPC-m015, and SPC-m016. It is a figure which shows the result.
  • FIG. 12 shows the comparison of the base sequences of single-stranded RNA molecules; SPC-m009, SPC-m010, SPC-m011, SPC-m012, SPC-m013, SPC-m014, SPC-m015, and
  • FIG. 13 shows a comparison of the nucleotide sequences of single-stranded RNA molecules; SPC-m009, SPC-m010, SPC-m011, SPC-m012, SPC-m013, SPC-m014, SPC-m015, and SPC-m016.
  • FIG. 3 is a view showing a site derived from a 5′-terminal fixed region and a 3′-terminal fixed region of an “RNA aptamer molecule” on a predicted secondary structure of a single-stranded RNA molecule; FIG.
  • FIG. 14 shows a nucleotide sequence of a “single-stranded RNA molecule library” having a total length of 62 bases, designed based on the base sequence of “RNA aptamer molecule” SPC-198 capable of binding to SPC, and “6 base lengths”. It is a figure which shows the expected secondary structure containing "the 1st random arrangement
  • FIG. 15 shows that the binding ability to biotinylated S1P and biotinylated sphingosine is relatively low from the “single-stranded RNA molecule library” having a total length of 62 bases, but relatively high binding ability to biotinylated SPC.
  • FIG. 16 shows each clone of “RNA aptamer molecule” having a binding ability to biotinylated SPC selected from a “single-stranded RNA molecule library” having a length of 62 bases using a SELEX screening method. It is a figure which shows the result of having contrasted the base sequence of the cDNA.
  • FIG. 17-1 shows the binding to biotinylated SPC according to the third embodiment of the present invention, which was selected from a “single-stranded RNA molecule library” having a length of 62 bases using the SELEX screening method. It is a figure which shows an example of the result of having evaluated the behavior of the complex formation process with respect to biotinylated SPC, and the dissociation process of a complex using the surface plasmon resonance measuring apparatus about the "RNA aptamer molecule" which has an ability.
  • FIG. 17-2 shows the binding to biotinylated SPC according to the third embodiment of the present invention, which was selected from a “single-stranded RNA molecule library” having a total length of 62 bases using the SELEX screening method.
  • FIG. 17-3 shows binding to biotinylated SPC according to the third embodiment of the present invention, which was selected from a “single-stranded RNA molecule library” having a total length of 62 bases using the SELEX screening method.
  • FIG. 18-1 shows two conditions of a liquid temperature of 25 ° C. and 37 ° C. for the “RNA aptamer molecule” SPC-198 having the ability to bind to SPC and the miniaturized “RNA aptamer molecule” SPC-m012 having the ability to bind to SPC.
  • FIG. 18-1 shows two conditions of a liquid temperature of 25 ° C. and 37 ° C. for the “RNA aptamer molecule” SPC-198 having the ability to bind to SPC and the miniaturized “RNA aptamer molecule” SPC-m012 having the ability to bind to SPC.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of the results of evaluating the behavior of the complex formation process and the complex dissociation process with respect to biotinylated SPC, biotinylated S1P, and biotinylated sphingosine using a surface plasmon resonance measurement apparatus.
  • FIG. 18-2 shows two temperature conditions of 25 ° C. and 37 ° C. for the “RNA aptamer molecules” SPC-524 and SPC-520 having the binding ability to biotinylated SPC according to the third embodiment of the present invention.
  • FIG. 18-2 shows two temperature conditions of 25 ° C. and 37 ° C. for the “RNA aptamer molecules” SPC-524 and SPC-520 having the binding ability to biotinylated SPC according to the third embodiment of the present invention.
  • FIG. 19 shows the nucleotide sequence of the cDNA of a clone family in which a plurality of clones were found in a clone of “RNA aptamer molecule” capable of binding to biotinylated SPC according to the third embodiment of the present invention. It is a figure which shows the result of having contrasted.
  • FIG. 19 shows the nucleotide sequence of the cDNA of a clone family in which a plurality of clones were found in a clone of “RNA aptamer molecule” capable of binding to biotinylated SPC according to the third embodiment of the present invention. It is a figure which shows the result of having contrasted.
  • FIG. 19 shows the nucleotide sequence of the cDNA of a clone family in which a plurality of clones were found in a clone of “RNA aptamer molecule” capable of binding to biotinylated SPC according to the third embodiment
  • FIG. 20 shows the secondary structure deduced from the base sequence of “RNA aptamer molecule” SPC-524 having the ability to bind to biotinylated SPC according to the third embodiment of the present invention, and the deduced secondary structure of SPC-524.
  • FIG. 2 is a diagram showing the base sequences of single-stranded RNA molecules; SPC-m017, SPC-m018, SPC-m019, and SPC-m020 designed based on the following structures and their expected secondary structures.
  • FIG. 2 is a diagram showing the base sequences of single-stranded RNA molecules; SPC-m017, SPC-m018, SPC-m019, and SPC-m020 designed based on the following structures and their expected secondary structures.
  • RNA aptamer molecule SPC-198 having an ability to bind to SPC, a miniaturized single-stranded RNA molecule: SPC-m012, and an “RNA aptamer molecule” SPC according to the third embodiment of the present invention.
  • SPC-m017, SPC-m018, SPC-m019, and SPC-m020 using a surface plasmon resonance measurement apparatus the relative amount of binding to biotinylated SPC It is a figure which shows an example of the result of having evaluated.
  • FIG. 21 shows various modified SPC-m017 molecules obtained by substituting the 2′-OH groups of U and C with F, H and —OCH 3 in SRNA-m017.
  • An example of the result of evaluating the relative amount of binding to biotinylated SPC using a surface plasmon resonance measuring apparatus is also shown.
  • RNA aptamer molecule capable of binding to SPC according to the present invention will be described in more detail.
  • the aptamer having the ability to bind to sphingosylphosphorylcholine (SPC) according to the first aspect of the present invention is replaced with biotinylated sphingosylphosphorylcholine (SPC) instead of the following sphingosylphosphorylcholine (SPC), which is a water-soluble sphingophospholipid.
  • SPC biotinylated sphingosylphosphorylcholine
  • SPC sphingosylphosphorylcholine
  • Biotinylated SPC was selected as a single-stranded RNA molecule capable of forming a complex with the biotinylated SPC.
  • RNA pool a single-stranded RNA molecule that can form a complex with the biotinylated SPC is selected by applying the SELEX method.
  • RNA pool for “First Round” Single-stranded RNA molecules constituting the “random single-stranded RNA molecule library (RNA pool)” are the following “random double-stranded DNA molecules” It is prepared by in vitro transcription using T7 RNA polymerase, using double-stranded DNA molecules constituting a library as a transcription template.
  • Each double-stranded DNA molecule constituting the “random double-stranded DNA molecule library” is composed of the following “T7 promoter region”, a 5′-end fixed region, a 30-base-long random sequence portion, and a 3′-end fixed. It has a base sequence R candidate0 consisting of a region.
  • T7 promoter region at the 5 ′ end: GATAATACGACTCACTATA; (19 bases) 5 'terminal fixed region: GGGAATGGATCCACATCTACGAATTC; (26 bases) N 30 random array part: NNNNNNNN NNNNNNNNNNNN; Fixed region at the 3 ′ end: TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTT; (24 bases) The N 30 random sequence portion is selected to have a GC content ratio of 50%.
  • biotinylated SPC is commercially available (PIERCE) “Streptavidin protein immobilized on agarose beads” (Streptavidin Agarose bead: SA bead), “Immobilized Neutravidin protein on agarose beads” (Neutravidin Agarose bead: NA bead) is used to immobilize on the beads by binding of biotin with Streptavidin protein or Neutravidin protein.
  • PIERCE “Streptavidin protein immobilized on agarose beads” (Streptavidin Agarose bead: SA bead), “Immobilized Neutravidin protein on agarose beads” (Neutravidin Agarose bead: NA bead) is used to immobilize on the beads by binding of biotin with Streptavidin protein or Neutravidin protein.
  • a single-stranded RNA molecule dissolved in a binding buffer solution having the following composition is allowed to act on biotinylated SPC immobilized on the beads to form a complex with biotinylated SPC. Make it.
  • the composition of the binding buffer solution used is HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) +5 mM MgCl 2 +5 mM KCl.
  • each single-stranded RNA molecule dissolved in the binding buffer solution are subjected to a “folding” treatment in advance. That is, each single-stranded RNA molecule has, according to its base sequence, a secondary structure including a double-stranded structure comprised between the underlying “complementary partial base sequences”, and a tertiary structure as a whole. Is formed.
  • the double-stranded structure composed of “complementary partial base sequences” between the strands of the single-stranded RNA molecule is eliminated, and each single-stranded RNA molecule is Each of them has a tertiary structure containing only a double-stranded structure formed in the chain.
  • the single-stranded RNA molecule is arranged in a “nucleotide complex” type with respect to the divalent metal cation species: Mg 2+ present in the binding buffer solution. Coordinate bonds may be formed. That is, in the tertiary structure of the single-stranded RNA molecule formed by the “folding” treatment, there is a site where a “nucleotide complex” type coordinate bond is formed with respect to the divalent metal cation species: Mg 2+ . Sometimes it is inherent.
  • the binding buffer solution is removed by solid-liquid separation, and the beads are collected.
  • Single-stranded RNA molecules that are non-selectively attached to the surface of the collected beads are quickly redissolved in the washing solution by performing a washing treatment using the binding buffer solution.
  • elution into the washing solution proceeds relatively slowly.
  • single-stranded RNA molecules forming a complex with biotinylated SPC are recovered together with beads recovered by solid-liquid separation.
  • the beads recovered in the SELEX selection round using the bead separation method are based on the composition: HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 7 M Urea elution buffer solution, bead amount, column volume (CV).
  • HBS 50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl
  • Urea elution buffer solution 7 M Urea elution buffer solution
  • bead amount 7 M
  • column volume (CV) column volume
  • the “unfolding” treatment eliminates the secondary structure and tertiary structure of the single-stranded RNA molecule, and as a result, the single-stranded RNA molecule is eluted in a high concentration solution of the denaturing urea.
  • the eluted elution buffer solution containing single-stranded RNA molecules is solid-liquid separated from the beads and collected.
  • the single-stranded RNA molecules contained in the recovered elution buffer solution are subjected to, for example, ethanol precipitation, centrifuged, and separated and recovered as a precipitate fraction.
  • RNA aptamer molecule capable of binding to sphingosylphosphorylcholine (SPC) using a surface plasmon resonance measurement apparatus After repeating a SELEX selection round using a bead separation method, finally biotin
  • SPC sphingosylphosphorylcholine
  • biotin The “RNA aptamer molecule” having the ability to bind to SPC is separated from the RNA pool in which the “RNA aptamer molecule” having the ability to bind to activated SPC is concentrated using a surface plasmon resonance measuring apparatus under the following conditions.
  • ⁇ Streptavidin protein or Neutravidin protein is immobilized on the sensor chip of the surface plasmon resonance measuring apparatus, and biotinylated SPC is bound to the immobilized Streptavidin protein or Neutravidin protein.
  • RNA pool enriched with “RNA aptamer molecules” capable of binding to biotinylated SPC is allowed to act on biotinylated SPC immobilized on this sensor chip.
  • the “RNA aptamer molecule” contained in the RNA pool and capable of binding to biotinylated SPC forms a complex with the immobilized biotinylated SPC.
  • the RNA pool itself is obtained by dissolving single-stranded RNA molecules in the binding buffer solution, and the complex formation between the “RNA aptamer molecule” and the immobilized biotinylated SPC is performed by Proceed in buffer solution.
  • RNA aptamer molecule After finishing the complex formation process, a binding buffer solution containing no RNA is flowed on the sensor chip, and the RNA pool solution is poured out. During the washing process using the binding buffer solution containing no RNA, a part of the “RNA aptamer molecule” complexed with the immobilized biotinylated SPC is also dissociated. The “RNA aptamer molecule” maintains the state in which a complex is formed.
  • an eluate having the following composition is allowed to flow on the sensor chip to elute the “RNA aptamer molecule” complexed with the immobilized biotinylated SPC.
  • the composition of the eluate used in this elution process is HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 10 mM EDTA.
  • RNA aptamer molecule is subjected to, for example, ethanol precipitation, centrifuged, and separated and recovered as a precipitate fraction.
  • the treatment of removing Mg 2+ ions as an EDTA complex does not promote the dissociation of the complex, but during the elution process, Dissociation proceeds. For this reason, the recovered eluate contains a small amount of single-stranded RNA molecules having binding ability independent of magnesium ions.
  • RNA aptamer molecules capable of binding to biotinylated SPC
  • Single-stranded RNA molecules capable of binding to agarose beads themselves or Streptavidin protein or Neutravidin protein immobilized on the beads "Pre-selection operation” is used to avoid “concentration”.
  • the “Pre-selection operation” uses an RNA pool solution used in a SELEX selection round using a bead separation method for immobilizing biotinylated SPC, “an immobilized Streptavidin protein on agarose beads” (SA bead ), “An immobilized Neutravidin protein on agarose beads” (NA bead).
  • RNA pool solution that has been previously subjected to the “Pre-selection operation”
  • binding ability to the agarose beads themselves or the Streptavidin protein or Neutravidin protein immobilized on the beads The “single-stranded RNA molecule” having a concentration in the “single-stranded RNA molecule” contained in the elution buffer solution recovered as a result of reducing the concentration in the RNA pool solution in advance.
  • the ratio of “single-stranded RNA molecules” capable of binding to Streptavidin protein or Neutravidin protein immobilized on the agarose beads themselves or on the beads is at a relatively low level.
  • the agarose bead itself or the Streptavidin protein or Neutravidin protein immobilized on the bead is used. Concentration of “single-stranded RNA molecules” having binding ability can be substantially avoided.
  • RNA pool to be used after “2nd round”
  • RNA pool to be used after “2nd round” is prepared from “single-stranded RNA molecules” collected in the previous round. This is prepared by in vitro transcription using T7 RNA polymerase using a double-stranded cDNA molecule as a transcription template.
  • RT-PCR is applied using the following Forward Primer and Reverse Primer.
  • Reverse Primer (SEQ ID NO: 39) 5'- GATAATACGACTCACTATA GGGAATGGATCCACATCTACGA -3 '
  • Reverse Primer (SEQ ID NO: 40) 5'- AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA -3 '
  • the Reverse Primer is a base sequence complementary to the fixed region at the 3 ′ end of the “single-stranded RNA molecule” to be recovered.
  • the Forward Primer is composed of a base sequence that can be used as a “T7 promoter region” and most of the fixed region at the 5 ′ end of the “single-stranded RNA molecule” to be recovered.
  • T7 promoter region 5'- GATAATACGACTCACTATA -3 ' Most of the fixed region at the 5 ′ end: 5′-GGGGAATGGATCCACATCTACGA -3 ′
  • the base sequence of the double-stranded cDNA molecule prepared using the recovered “single-stranded RNA molecule” as a template is a region originating from the forward primer at the 5 ′ end and complementary to the reverse primer at the 3 ′ end.
  • the prepared “single-stranded RNA molecule” is recovered from the in vitro transcription reaction solution, dissolved in the above binding buffer solution at a predetermined concentration, and used as the “RNA pool” to be used in the next round. .
  • the “single-stranded RNA molecule” is subjected to a “re-folding” process. As a result, the double-stranded structure formed between “complementary partial base sequences” between the strands of the single-stranded RNA molecule is eliminated, and each single-stranded RNA molecule is formed within the strand. It has a tertiary structure that contains only a double-stranded structure.
  • an aptamer having a binding ability to sphingosylphosphorylcholine is selected using the conditions described in Table 1 below.
  • biotinylated SPC is bound to “immobilized Streptavidin protein on agarose beads” (SA bead) and “immobilized Neutravidin protein on agarose beads” (NA bead).
  • SA bead immobilized Streptavidin protein on agarose beads
  • NA bead immobilized Neutravidin protein on agarose beads
  • the “Pre-selection operation” using the beads is performed according to the type of beads used in the round. Avoiding the concentration of “single-stranded RNA molecules” capable of binding to the agarose beads themselves or the Streptavidin protein or Neutravidin protein immobilized on the beads.
  • the amount of “immobilized Streptavidin protein on agarose beads” (SA bead) or “immobilized Neutravidin protein on agarose beads” (NA bead) used for “Pre-selection operation” is the amount of beads.
  • the quantity ratio shown in Table 1 is based on the quantity of “beads bound with biotinylated SPC” used in each round. Considering that as the round progresses, “single-stranded RNA molecules” that have the ability to bind to the agarose beads themselves or to the Streptavidin protein or Neutravidin protein that are immobilized on the beads tend to be gradually concentrated. However, as the round progresses, the amount of beads used for the “Pre-selection operation” increases.
  • the liquid temperature is 25 ° C., and the time is selected to be equal to the “Incubation Time”.
  • the “RNA pool” is removed by solid-liquid separation.
  • a washing step is provided to wash away the single-stranded RNA molecules that are non-selectively attached to the beads.
  • a binding buffer solution containing no RNA molecule is used, the liquid temperature is 25 ° C., and the total liquid amount (shown in Table 1) based on the bead amount and the column volume (CV) ( The number of times is used for cleaning.
  • the final 13th round is a SELEX selection round using a surface plasmon resonance measuring device.
  • a surface plasmon resonance measuring apparatus: BIACORE 3000 is used, a Streptavidin protein is immobilized on the sensor chip, and biotinylated SPC is bound to the immobilized Streptavidin protein.
  • the “RNA pool” solution used in the 13th round contains 5 ⁇ M of single-stranded RNA molecules in the binding buffer solution.
  • This “RNA pool” solution is flowed on the sensor chip at a flow rate of 20 ⁇ L / min to form a complex of biotinylated SPC bound to the immobilized Streptavidin protein and a single-stranded RNA molecule.
  • the liquid temperature is 25 ° C.
  • the time for circulating the “RNA pool” liquid on the sensor chip is 5 minutes.
  • a binding buffer solution containing no RNA molecules is allowed to flow at a flow rate of 20 ⁇ L / min for 5 minutes to remove the “RNA pool” solution on the sensor chip.
  • the liquid temperature is 25 ° C.
  • an eluate having the following composition is filled on the sensor chip and incubated to elute single-stranded RNA molecules complexed with the immobilized biotinylated SPC.
  • the composition of the eluate used in this elution process is HBS (20 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 10 mM EDTA.
  • Single-stranded RNA molecules contained in the recovered eluate are subjected to ethanol precipitation, centrifuged, and separated and recovered as a precipitate fraction.
  • double-stranded cDNA molecules are similarly prepared by applying RT-PCR method using the single-stranded RNA molecules separated and recovered as a template.
  • the contained double-stranded cDNA molecule is cloned using a commercially available TA cloning kit (Promega Corporation). Specifically, according to a standard protocol attached to the kit, a group of amplification products (double-stranded DNA molecules) by RT-PCR is ligated to a cloning vector; pGEM-T Easy. After this ligation, E. coli strain Mach1 (Invitrogen) is transformed with the cloning vector.
  • TA cloning kit Promega Corporation
  • the transformed strain carrying the cloning vector is colony selected according to a conventional method.
  • RNA pool a “single-stranded RNA molecule” is prepared by in vitro transcription using T7 RNA polymerase to produce an “RNA pool”.
  • a surface plasmon resonance measuring apparatus BIACORE 3000 is used, a Streptavidin protein is immobilized on the sensor chip, and biotinylated SPC is bound to the immobilized Streptavidin protein.
  • “RNA sample” solution containing 2 ⁇ M of single-stranded RNA molecules in the binding buffer solution from the “RNA pool” at the end of the 13th round and the 8th to 12th rounds. To prepare.
  • RNA sample solution of the 13th and 8th to 12th rounds was allowed to flow on the sensor chip at a flow rate of 20 ⁇ L / min for 120 seconds to bind to the immobilized Streptavidin protein.
  • a complex of single-stranded RNA molecules is formed with the biotinylated SPC.
  • a binding buffer solution containing no RNA molecules is flowed on the sensor chip at a flow rate of 20 ⁇ L / min to dissociate single-stranded RNA molecules forming a complex with the immobilized biotinylated SPC.
  • the time course of the surface plasmon resonance signal intensity in the complex formation process and the complex dissociation process is summarized in FIG.
  • the content ratio of single-stranded RNA molecules that can form a complex with biotinylated SPC increases with each round from the 8th to the 12th round, and further through the 13th round. It was confirmed.
  • the “random sequence portion” includes “5′-GCAUUAUUGU-” which shows similarity to the partial base sequence of “5′-CCGUUAUUGG-3 ′”.
  • the partial base sequence “3 ′” exists.
  • three types of motifs “CXUUXXU”, “CXUUA”, and “CXXUXAU” are inherent.
  • the single-stranded RNA molecules of each clone classified into the above 9 types of clone families A to I have IDs described in Table 3 below.
  • the single-stranded RNA molecules of each clone classified into the nine types of clone families A to I actually have a binding ability to biotinylated SPC, Verified.
  • a surface plasmon resonance measuring apparatus BIACORE 3000 is used, a Streptavidin protein is immobilized on the sensor chip, and biotinylated SPC is bound to the immobilized Streptavidin protein.
  • RNA sample For each single-stranded RNA molecule classified into clone family A to I, prepare an “RNA sample” solution containing 500 nM of each single-stranded RNA molecule in the binding buffer solution. . On the sensor chip, this “RNA sample” solution is allowed to flow at a flow rate of 20 ⁇ L / min to form a complex of biotinylated SPC bound to the immobilized Streptavidin protein and a single-stranded RNA molecule. In this complex formation process, the liquid temperature is 25 ° C., and the time for circulating the “RNA sample” liquid on the sensor chip is 2 minutes.
  • a running buffer solution containing the following composition and containing no RNA molecules is allowed to flow at a flow rate of 20 ⁇ L / min for 4 minutes to remove the “RNA sample” solution on the sensor chip.
  • Advance body dissociation In the dissociation process of the complex, the liquid temperature is 25 ° C.
  • the composition of the running buffer solution without RNA molecules is HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) +5 mM MgCl 2 +5 mM KCl + 0.005% Tween20.
  • an EDTA solution having the following composition was allowed to flow on the sensor chip at a flow rate of 60 ⁇ L / min. The remaining single-stranded RNA molecules were eluted.
  • the composition of the EDTA solution is HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) +10 mM EDTA. From the complex of immobilized biotinylated SPC and single-stranded RNA molecules remaining on the sensor chip due to the inflow of the EDTA solution, the metal cation species (Mg 2+ ) is complexed with EDTA. As a result of forming, it is removed.
  • the single-stranded RNA molecules of the clones belonging to the clone family H are removed, and the single strands of the respective clones belonging to the eight clone families A to G, I are removed. RNA molecules were eluted quickly.
  • single-stranded RNA molecules of clones belonging to clone family H are kept in a state of forming a complex with the immobilized biotinylated SPC even by removal of the metal cation species (Mg 2+ ).
  • the three-dimensional structure of the single-stranded RNA molecule is By eliminating it, a treatment that loses the ability to bind to biotinylated SPC is adopted. Specifically, 20 ⁇ L of 50 mM NaOH + 1 M NaCl solution is flowed on the sensor chip at a flow rate of 100 ⁇ L / min, and the single-stranded RNA molecule is subjected to “alkali denaturation treatment”.
  • Figure 3 shows single-stranded RNA molecules: SPC-198, SPC-243, SPC-256, SPC-203, SPC-209, SPC-289, SPC-261, SPC-267, SPC-215, SPC-216, The results of the above verification for SPC-219, SPC-259, SPC-213, SPC-273, SPC-242, and SPC-246 are also shown.
  • FIG. 4-1 shows the measurement results for SPC-198 at a liquid temperature of 25 ° C. Based on the measurement results, biotinylated SPC and the one were obtained under the conditions of a liquid temperature of 25 ° C.
  • HBS (20 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) +5 mM MgCl 2 +5 mM KCl.
  • the rate constant of complex formation with the strand RNA molecule: ka, the rate constant of dissociation of the complex: kd, and the dissociation constant K D kd / ka were calculated.
  • RNA sample a clone single-stranded RNA molecule belonging to clone family B
  • concentration of the single-stranded RNA molecule contained in the “RNA sample” solution is 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM.
  • the time-dependent change of the surface plasmon resonance signal intensity in the complex formation process and the complex dissociation process was measured using the above conditions as the other conditions.
  • Fig. 4-2 shows the measurement results for SPC-203 at a liquid temperature of 25 ° C. Based on the measurement results, biotinylated SPC and the one were obtained under the conditions of a liquid temperature of 25 ° C.
  • HBS (20 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) +5 mM MgCl 2 +5 mM KCl.
  • RNA sample a single-stranded RNA molecule of a clone belonging to clone family H
  • concentration of the single-stranded RNA molecule contained in the “RNA sample” solution is 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM.
  • the time-dependent change of the surface plasmon resonance signal intensity in the complex formation process and the complex dissociation process was measured using the above conditions as the other conditions.
  • Fig. 4-3 shows the measurement results for SPC-213 at a liquid temperature of 25 ° C. Based on the measurement results, biotinylated SPC and the one were obtained under the conditions of a liquid temperature of 25 ° C.
  • HBS (20 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) +5 mM MgCl 2 +5 mM KCl.
  • RNA sample For SPC-289, a single-stranded RNA molecule of a clone classified as clone family C, the concentration of the single-stranded RNA molecule contained in the “RNA sample” solution is 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM.
  • the temporal change in the surface plasmon resonance signal intensity during the complex formation process and the complex dissociation process was measured using the above conditions.
  • FIG. 5-1 shows the measurement results for the SPC-289 at a liquid temperature of 25 ° C.
  • the dissociation process of the complex cannot be expressed by a single rate constant kd, but at least two types characterized by two rate constants kd. It became clear that it was necessary to analyze the dissociation process. In other words, it is necessary to analyze a “fast dissociation process” having a kd of 10 ⁇ 2 (s ⁇ 1 ) or more and a “slow dissociation process” having a kd of 10 ⁇ 3 (s ⁇ 1 ) or less. It has been found.
  • Fig. 5-1 shows the dissociation process of the complex, assuming a single dissociation process (1: 1 model) and two dissociation processes (1: 2 model). The result of the curve fitting attempt is shown.
  • RNA sample a single-stranded RNA molecule of a clone belonging to clone family D
  • concentration of the single-stranded RNA molecule contained in the “RNA sample” solution is 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM.
  • the time-dependent change of the surface plasmon resonance signal intensity in the complex formation process and the complex dissociation process was measured using the above conditions as the other conditions.
  • FIG. 5-2 shows the measurement results for the SPC-267 at a liquid temperature of 25 ° C.
  • FIG. 5-2 shows a case where a single dissociation process is assumed (1: 1 model) and a case where two dissociation processes are assumed (1: 2 model). The result of the curve fitting attempt is shown.
  • RNA aptamers having the ability to bind to biotinylated SPC and SPC.
  • Fig. 6-1 shows the presumed secondary structure of SPC-198, a single-stranded RNA molecule of a clone belonging to clone family A.
  • the consensus sequence of “5′-CCGUUAUUGG-3 ′” existing in the “random sequence portion” constitutes a “hairpin loop”.
  • the shape of the entire secondary structure also has a “hairpin” shape.
  • Fig. 6-2 shows the presumed secondary structure for SPC-203, a single-stranded RNA molecule belonging to clone family B.
  • the consensus sequence of “5′-CCGUUAUUGG-3 ′” existing in the “random sequence portion” constitutes a “hairpin loop”.
  • the shape of the entire secondary structure also has a “hairpin” shape.
  • Fig. 6-3 shows the presumed secondary structure of SPC-289, a single-stranded RNA molecule of clones classified into clone family C.
  • the consensus sequence of “5′-CCGUUAUUGG-3 ′” existing in the “random sequence portion” constitutes a “hairpin loop”.
  • the shape of the entire secondary structure also has a “hairpin” shape.
  • Fig. 6-4 shows the presumed secondary structure of SPC-267, a single-stranded RNA molecule of clones classified into clone family D.
  • the consensus sequence of “5′-CCGUUAUUGG-3 ′” existing in the “random sequence portion” constitutes a “hairpin loop”.
  • the shape of the entire secondary structure also has a “hairpin” shape.
  • Fig. 6-5 shows the presumed secondary structure of SPC-213, a single-stranded RNA molecule belonging to clone family H.
  • the “5′-GCAUUAUUGU-3 ′” portion present in the “random sequence portion” constitutes a “hairpin loop” -like structure.
  • the sites involved in complex formation with SPC of the target substance are “AUUC” and “random sequence part (N 30 ) "is presumed to be present in the region involved in the formation of the tertiary structure.
  • the “AUUC” and “random arrangement part (N 30 )” parts form the secondary structure. It is inferred that there is a site involved in complex formation with the SPC of the target substance in the region involved in the process.
  • the aptamer having the binding ability to sphingosylphosphorylcholine (SPC) according to the second aspect of the present invention is the “AUUC” and “random sequence portion (N 30) in the RNA aptamer molecule according to the first aspect of the present invention described above. ) "Retains the ability to bind to sphingosylphosphorylcholine (SPC) by forming substantially the same secondary structure as the region involved in the formation of the secondary structure.
  • the 5′-end and 3′-end portions have a base sequence capable of forming two G: C pairs so as to form a double-stranded structure.
  • SPC-m011 5'-GGGAUCCACAUCUACGAAUUC UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCGUAUCCCGA UUCC-3 '(SEQ ID NO: 14);
  • SPC-m012 5'-GGCGAAUUC UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCG CC-3 ′ (SEQ ID NO: 15);
  • SPC-m011, SPC-m012 deduced secondary structure includes single-stranded RNA, including the structure of “hairpin loop” containing the consensus sequence of “5′-CCGUUAUUGG-3 ′” It holds the main part of the predicted secondary structure of the molecule, SPC-203.
  • the 5′-end and 3′-end portions have a base sequence capable of forming two G: C pairs so as to form a double-stranded structure.
  • SPC-m013 5'-GGAUCCACAUCUACGAAUUC UACCGUUAUUGGAGCACGCGUAGUAUGGGU CC-3 '(SEQ ID NO: 16);
  • SPC-m014 5'-GGACGAAUUC UACCGUUAUUGGAGCACGCGU CC-3 ′ (SEQ ID NO: 17);
  • SPC-m013, SPC-m014 deduced secondary structures include single-stranded RNA, including the structure of “hairpin loop” containing the consensus sequence of “5′-CCGUUAUUGG-3 ′” It retains the major part of the predicted secondary structure of the molecule, SPC-289.
  • the 5′-end and 3′-end portions have a base sequence capable of forming two G: C pairs so as to form a double-stranded structure.
  • SPC-m015 5'-GGACAUCUACGAAUUC UACCGUUAUUGGUGUAACGUAAUUGU CC-3 '(SEQ ID NO: 18);
  • SPC-m016 5'-GGCGAAUUC UACCGUUAUUGGUGUAACG CC-3 ′ (SEQ ID NO: 19);
  • SPC-m015, SPC-m016 putative secondary structures include single-stranded RNA, including the structure of “hairpin loop” containing the consensus sequence of “5′-CCGUUAUUGG-3 ′” It retains the main part of the predicted secondary structure of the molecule, SPC-267.
  • the 5′-end and 3′-end portions have a base sequence capable of forming two G: C pairs so as to form a double-stranded structure.
  • SPC-m007 5'-GG GUCCGCACGCAAAGCAUUAUUGUGA UUCACUGCAGACUUGAC C C-3 ′ (SEQ ID NO: 20); Single-stranded RNA molecule; the predicted secondary structure of SPC-m007 includes a “hairpin loop” -like structure including “5′-GCAUUAUUGU-3 ′”, including single-stranded RNA molecule, SPC-213 The main part of the presumed secondary structure is retained.
  • the 5′-end and 3′-end portions have a base sequence capable of forming two G: C pairs so as to form a double-stranded structure.
  • RNA molecules SPC-m009, SPC-m010, SPC-m011, SPC-m012, SPC-m013, SPC-m014, SPC-m015, and SPC-m016 are actually complexed with biotinylated SPC. It was verified by using a surface plasmon resonance measuring apparatus that it can be formed.
  • a surface plasmon resonance measuring apparatus BIACORE 3000 is used, a Streptavidin protein is immobilized on the sensor chip, and biotinylated SPC is bound to the immobilized Streptavidin protein.
  • RNA sample For each single-stranded RNA molecule, prepare an “RNA sample” solution containing 500 nM of each single-stranded RNA molecule in the binding buffer solution. On the sensor chip, this “RNA sample” solution is allowed to flow at a flow rate of 20 ⁇ L / min to form a complex of biotinylated SPC bound to the immobilized Streptavidin protein and a single-stranded RNA molecule.
  • the liquid temperature is 25 ° C.
  • the time for circulating the “RNA sample” liquid on the sensor chip is 2 minutes.
  • a running buffer solution containing the following composition and containing no RNA molecules is allowed to flow at a flow rate of 20 ⁇ L / min for 3.5 minutes to remove the “RNA sample” solution on the sensor chip.
  • Advance dissociation of the complex In the dissociation process of the complex, the liquid temperature is 25 ° C.
  • the composition of the running buffer solution without RNA molecules is HBS (20 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) +5 mM MgCl 2 +5 mM KCl + 0.005% Tween20.
  • an EDTA solution having the following composition was passed over the sensor chip at a flow rate of 60 ⁇ L / min. The remaining single-stranded RNA molecules were eluted.
  • the composition of the EDTA solution is HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) + 10 mM EDTA. From the complex of immobilized biotinylated SPC and single-stranded RNA molecules remaining on the sensor chip due to the inflow of the EDTA solution, the metal cation species forms a complex with EDTA. Removed.
  • FIG. 8-1 shows the single-stranded RNA molecules: SPC-m009, SPC-m010, SPC-m011, SPC-m012, SPC-m013, SPC-m014, SPC-m015, and SPC-m016 using the above conditions.
  • the results of measuring the temporal change of the surface plasmon resonance signal intensity during the complex formation process and the complex dissociation process are also shown.
  • the concentration of the single-stranded RNA molecule contained in the “RNA sample” solution is 200 nM, 400 nM, or 800 nM.
  • the time-dependent change of the surface plasmon resonance signal intensity in the complex formation process and the complex dissociation process was measured using the above conditions as the other conditions. Based on the measurement results, biotinylated SPC and the one were obtained under the conditions of a liquid temperature of 25 ° C. and a binding buffer solution composition: HBS (20 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) +5 mM MgCl 2 +5 mM KCl.
  • the complex formation site of single-stranded RNA molecules SPC-m009, SPC-m010 and biotinylated SPC is common. Furthermore, the complex formation site of single-stranded RNA molecule: SPC-198 and biotinylated SPC, and the complex formation site of single-stranded RNA molecule: SPC-m009, SPC-m010, and biotinylated SPC are substantially Is presumed to be common.
  • the complex formation site of single-stranded RNA molecules SPC-m011, SPC-m012 and biotinylated SPC is common. Furthermore, the complex formation site of single-stranded RNA molecule: SPC-203 and biotinylated SPC, and the complex formation site of single-stranded RNA molecule: SPC-m011, SPC-m012, and biotinylated SPC are substantially Is presumed to be common.
  • the complex formation site with biotinylated SPC is It is inferred that it exists in the secondary structure predicted in the single-stranded RNA molecule, SPC-m010, SPC-m012.
  • the dissociation process of the complex is judged to be common to the complex of single-stranded RNA molecules: SPC-m013, SPC-m014, and biotinylated SPC. That is, it is determined that the complex formation site of single-stranded RNA molecules: SPC-m013, SPC-m014 and biotinylated SPC is common. Furthermore, the complex formation site of single-stranded RNA molecule: SPC-289 and biotinylated SPC, and the complex formation site of single-stranded RNA molecule: SPC-m013, SPC-m014 and biotinylated SPC, It is assumed that they are substantially common.
  • the complex formation site with biotinylated SPC is a presumed secondary in the single-stranded RNA molecule, SPC-m014. If it exists in the structure, it is inferred.
  • the dissociation process of the complex is judged to be common to the complex of single-stranded RNA molecules: SPC-m015, SPC-m016, and biotinylated SPC. That is, it is judged that the complex formation site of the single-stranded RNA molecule: SPC-m015, SPC-m016 and biotinylated SPC is common. Furthermore, the complex formation site of single-stranded RNA molecule: SPC-267 and biotinylated SPC that gives at least a “fast dissociation process”, and single-stranded RNA molecules: SPC-m015, SPC-m016, and biotinylation It is presumed that the complex formation site with SPC is substantially common.
  • the complex formation site with biotinylated SPC that gives at least a “fast dissociation process” is a single-stranded RNA molecule, If it exists in the secondary structure estimated in SPC-m016, it is inferred.
  • a surface plasmon resonance measuring apparatus BIACORE 3000 is used, a Streptavidin protein is immobilized on the sensor chip, and biotinylated SPC is bound to the immobilized Streptavidin protein.
  • the concentration of the single-stranded RNA molecule contained in the “RNA sample” solution is changed in a 2-fold dilution series of 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, and 800 nM, As other conditions, the above-described conditions were used to measure temporal changes in the surface plasmon resonance signal intensity during the complex formation process and the complex dissociation process.
  • FIG. 8-2 shows the measurement results for the SPC-m007 at a liquid temperature of 25 ° C.
  • the single-stranded RNA molecule, SPC-m007 Similar to the single-stranded RNA molecule of clone family H, SPC-213, the single-stranded RNA molecule, SPC-m007, also uses metal cation species, particularly Mg 2+ cation species, using an EDTA solution. When this was removed, it was kept in a state of forming a complex with the immobilized biotinylated SPC.
  • biotinylation was performed under the conditions of a solution temperature of 25 ° C. and a binding buffer solution composition: HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) +5 mM MgCl 2 +5 mM KCl.
  • HBS 50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl
  • kd the rate constant of dissociation of the complex
  • K D kd / ka
  • the complex formation site of single-stranded RNA molecule SPC-213 and biotinylated SPC
  • the complex of single-stranded RNA molecule SPC-m007 and biotinylated SPC
  • the formation site is judged to be substantially common. Therefore, in the single-stranded RNA molecule: SPC-m007 and SPC-213, the complex formation site with biotinylated SPC exists in the secondary structure presumed in the single-stranded RNA molecule, SPC-m007. Then, it is guessed.
  • the complex formation site of single-stranded RNA molecule SPC-198 and biotinylated SPC has a structure similar to biotinylated SPC, and it is assumed that biotinylated S1P and biotinylated sphingosine can also form a complex. Is done.
  • RNA molecule single-stranded RNA molecule: SPC-198, as well as biotinylated SPC, verified that it can form a complex with biotinylated S1P and biotinylated sphingosine using surface plasmon resonance measurement equipment. did.
  • the Streptavidin protein was immobilized on the sensor chip, and the following biotinylated SPC, biotinylated S1P, biotin were immobilized on the immobilized Streptavidin protein. Sphingosine is bound.
  • the concentration of the single-stranded RNA molecule contained in the “RNA sample” solution is changed in a 2-fold dilution series of 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, As other conditions, the above-described conditions were used to measure temporal changes in the surface plasmon resonance signal intensity during the complex formation process and the complex dissociation process.
  • Fig. 9-1, Fig. 9-2 and Fig. 9-3 show the complex formation process and dissociation of the SPC-198 with respect to biotinylated SPC, biotinylated S1P and biotinylated sphingosine at a liquid temperature of 25 ° C. The measurement results of the process are shown in comparison.
  • the single-stranded RNA molecule: SPC-198 is the same as the complex with biotinylated SPC described above. Furthermore, it was determined that the dissociation process of the complex of biotinylated S1P and biotinylated sphingosine can be expressed by a single rate constant kd.
  • the liquid temperature is 25 ° C.
  • the complex of SPC-198 and biotinylated SPC, the complex of SPC-198 and biotinylated S1P, and the complex of SPC-198 and biotinylated sphingosine are substantially the same. It is judged. That is, in the complex of SPC-198 and biotinylated SPC, the complex of SPC-198 and biotinylated S1P, the complex of SPC-198 and biotinylated sphingosine, the interaction between molecules in the complex Is presumed to be virtually no difference.
  • SPC-m010 In addition to SPC-198, SPC-203, SPC-267, SPC-289, SPC-213, and SPC-m009, SPC-m010, SPC-m011, SPC-m012, SPC-m013, SPC-m014 , SPC-m015, SPC-m016 also have a structure similar to biotinylated SPC at the site where the complex is formed with biotinylated SPC, and it is assumed that biotinylated S1P and biotinylated sphingosine can also form a complex Is done.
  • any of the single-stranded RNA molecules can form a complex with biotinylated S1P and biotinylated sphingosine as well as biotinylated SPC. did.
  • a Streptavidin protein is immobilized on the sensor chip, and biotinylated SPC, biotinylated S1P, biotinylated sphingosine is immobilized on the immobilized Streptavidin protein.
  • biotinylated SPC, biotinylated S1P, biotinylated sphingosine is immobilized on the immobilized Streptavidin protein.
  • Single-stranded RNA molecules For SPC-198, SPC-203, SPC-267, SPC-289, and SPC-213, the concentration of the single-stranded RNA molecule contained in the “RNA sample” solution is 400 nM. As for other conditions, the above conditions were used, and the temporal change of the surface plasmon resonance signal intensity in the complex formation process and the complex dissociation process was measured. In addition, single-stranded RNA molecules: SPC-m009, SPC-m010, SPC-m011, SPC-m012, SPC-m013, SPC-m014, SPC-m015, and SPC-m016 are included in the “RNA sample” solution. The concentration of the single-stranded RNA molecule to be used was 800 nM, and other conditions were measured using the above conditions, and the temporal change in the surface plasmon resonance signal intensity in the complex formation process and the complex dissociation process was measured. .
  • Figures 10-1, 10-2, and 10-3 show SPC-198, SPC-203, SPC-267, SPC-289, SPC-213, and SPC-m009, SPC- at a liquid temperature of 25 ° C.
  • Complex formation for biotinylated SPC, biotinylated S1P, and biotinylated sphingosine for each single-stranded RNA molecule of m010, SPC-m011, SPC-m012, SPC-m013, SPC-m014, SPC-m015, SPC-m016 The measurement results of the process and the dissociation process of the complex are shown in comparison.
  • each single-stranded RNA molecule the single-stranded RNA once formed in the complex of the single-stranded RNA molecule and biotinylated S1P, the complex of the single-stranded RNA molecule and biotinylated sphingosine
  • the interaction between the RNA molecule and the biotinylated S1P molecule and the interaction between the single-stranded RNA molecule and the biotinylated sphingosine molecule are substantially the same.
  • the phosphate group (—O—PO (OH) 2 ) is composed of a monovalent anion (—O—PO (OH) —O ⁇ ) and a divalent anion (—O—). It is presumed that two ionization states of -PO 3 2- ) can be taken, but only one of them can be complexed with a single-stranded RNA molecule.
  • a free anion species (—O—PO (OH) —O ⁇ ) and a metal cation species are coordinated (for example, —O—PO (OH) —O ⁇ : Mg 2+ ) is assumed, and when it becomes a divalent anion, a free anion species (—O—PO 3 2 ⁇ ) and a metal cation species are coordinated.
  • —O—PO 3 2 ⁇ : Mg 2+ is assumed, and it is assumed that one of these shapes can form a complex. In that case, it is presumed that the ratio of biotinylated S1P having a shape capable of forming a complex varies depending on the liquid temperature and the composition of the liquid.
  • biotinylated sphingosine does not have an ionized state, the ratio of biotinylated sphingosine having a shape capable of forming a complex is high.
  • the dissociation process of the complex cannot be expressed by a single rate constant kd, and is judged to be analyzed as at least two types of dissociation processes characterized by two rate constants kd.
  • the single-stranded RNA molecule SPC-267, SPC-289, and SPC-m013, SPC-m014, SPC-m015, SPC-m016, the ratio of contribution of “fast dissociation process” and “slow dissociation process” is biotinylated There is a significant difference between the complex with SPC and the complex with biotinylated sphingosine.
  • the dissociation process of the complex can be expressed by a single rate constant kd. Can be considered to be substantially the same between the complex with biotinylated SPC and the complex with biotinylated sphingosine. Therefore, in these single-stranded RNA molecules, once the complex is formed, the interaction between the single-stranded RNA molecule and the biotinylated SPC molecule and the interaction between the single-stranded RNA molecule and the biotinylated sphingosine molecule Is presumed to be substantially small.
  • 1 x buffer 50 mM HEPES (pH 7.4) + 150 mM NaCl + 5 mM MgCl 2 0.1 ⁇ buffer: 5 mM HEPES (pH 7.4) + 15 mM NaCl + 5 mM MgCl 2
  • the amount of the complex of the single-stranded RNA molecule and biotinylated S1P, the single-stranded RNA molecule and Differences in the amount of complex formed with biotinylated sphingosine and the amount of complex formed between single-stranded RNA molecules and biotinylated SPC were observed using a surface plasmon resonance measuring apparatus.
  • Streptavidin protein is immobilized on the sensor chip, and biotinylated SPC, biotinylated S1P, and biotinylated sphingosine are bound to the immobilized Streptavidin protein. .
  • the concentration of the single-stranded RNA molecule contained in the “RNA sample” solution is set to 400 nM.
  • the above two types of binding buffer solutions are also used for the running buffer solution, and the other conditions are the same as those described above, and the time of surface plasmon resonance signal intensity in the complex formation process and complex dissociation process is determined. Changes were measured.
  • FIG. 11 shows temporal changes in the surface plasmon resonance signal intensity in the complex formation process and the complex dissociation process at the liquid temperature of 25 ° C. measured when the above two types of binding buffer solutions are used. Are also shown.
  • the ratio of the amount of complex of single-stranded RNA molecule and biotinylated S1P is 40/320;
  • the ratio of the amount of complex of single-stranded RNA molecule and biotinylated sphingosine is 510/800;
  • the ratio of the amount of complex of single-stranded RNA molecule and biotinylated SPC is 240/860 It has become.
  • SPC sphingosylphosphorylcholine
  • an aptamer having the binding ability to sphingosylphosphorylcholine (SPC) according to the third embodiment of the present invention is utilized using a “single-stranded RNA molecule library” having a total length of 62 bases shown in FIG.
  • SPC sphingosylphosphorylcholine
  • a single-stranded RNA molecule contained in the “single-stranded RNA molecule library” having a total length of 62 bases is a partial sequence corresponding to “Critical region”, which is a part that greatly contributes to complex formation with biotinylated SPC.
  • “UACCGUUAUUGGUG” that constitutes the “Hair pin” loop is adopted.
  • “GACAUCCGG” is provided on the 5 ′ end side and “CCGGAUGUC” is provided on the 3 ′ end side as sites capable of constituting a double-stranded structure.
  • the complex formation site with the biotinylated SPC is It is presumed that it also functions as a complex formation site with biotinylated S1P and biotinylated sphingosine.
  • the biotinylated SPC observed using a surface plasmon resonance measurement apparatus is used.
  • production amount of complex with biotinylated S1P: P S1P is usually P Sph > P SPC >> P S1P It was.
  • sphingosylphosphorylcholine SPC
  • P Sph P S1P
  • RNA aptamer molecules having binding ability to biotinylated SPC were selected.
  • the “single-stranded RNA molecule library” having a length of 62 bases is 5'-terminal fixed region: GGCAACCACGACAUCCGG; (18 bases) First random sequence portion having a length of 6 bases: N 1 N 2 N 3 N 4 N 5 N 6 ; (6 bases) “Hair pin” loop-forming constant region containing a consensus sequence of “5′-CCGUUAUUGG-3 ′”: UACCGUUAUUGGUG; (14 bases) Second random sequence portion having a length of 6 bases: N ′ 6 N ′ 5 N ′ 4 N ′ 3 N ′ 2 N ′ 1 ; (6 bases) Fixed region at the 3 ′ end: CCGGAUGUCACACACACG; (18 bases) It has.
  • an aptamer having a binding ability to sphingosylphosphorylcholine is selected using the conditions described in Table 4 below.
  • the SELEX selection round using the bead separation method is repeated 5 rounds to concentrate single-stranded RNA molecules having binding ability to biotinylated SPC.
  • two rounds of SELEX selection using a surface plasmon resonance measuring apparatus are performed from a single-stranded RNA molecule capable of binding to concentrated biotinylated SPC, and then released in addition to biotinylated SPC.
  • Single-stranded RNA molecules having the ability to bind to SPCs are selected.
  • biotinylated SPC is bound to “immobilized Streptavidin protein on agarose beads” (SA bead) and “immobilized Neutravidin protein on agarose beads” (NA bead).
  • SA bead immobilized Streptavidin protein on agarose beads
  • NA bead immobilized Neutravidin protein on agarose beads
  • FIG. 15 schematically shows the process flow of the SELEX selection round using the bead separation method, which is composed of “S1P-bead-selection operation”, “Sphingosine-bead-selection operation” and “SPC-bead-selection process”. Indicate.
  • the S1P beads are obtained by binding biotinylated S1P to “immobilized Streptavidin protein on agarose beads” (SA bead) and “immobilized Neutravidin protein on agarose beads” (NA bead).
  • SA bead immobilized Streptavidin protein on agarose beads
  • NA bead immobilized Neutravidin protein on agarose beads
  • the sphingosine beads are obtained by binding biotinylated sphingosine to “immobilized Streptavidin protein on agarose beads” (SA bead) and “immobilized Neutravidin protein on agarose beads” (NA bead).
  • SA bead immobilized Streptavidin protein on agarose beads
  • NA bead immobilized Neutravidin protein on agarose beads
  • the “SPC-bead-selection process” is a process in which biotinylated SPC is bound to “immobilized Streptavidin protein on agarose beads” (SA bead) and “immobilized Neutravidin protein on agarose beads” (NA bead).
  • SA bead immobilized Streptavidin protein on agarose beads
  • NA bead immobilized Neutravidin protein on agarose beads
  • the composition of the binding buffer solution used is 50 mM HEPES (pH 7.4) +150 mM NaCl + 5 mM MgCl 2 + 0.005% Tween20.
  • RNA pool for the “first round” is performed according to the following procedure.
  • RNA molecules constituting the above-mentioned “single-stranded RNA molecule library (RNA pool)” having a total length of 62 bases are double-stranded DNA molecules constituting the following “double-stranded DNA molecule library”.
  • RNA pool single-stranded RNA molecule library
  • Each double-stranded DNA molecule constituting the “double-stranded DNA molecule library” is composed of the following “T7 promoter region”, a 5′-end fixed region, a 30-base-long random sequence portion, and a 3′-end fixed region. It has a base sequence R candidate1 .
  • liquid temperature is 25 ° C. when performing “S1P-bead-selection operation” and “Sphingosine-bead-selection operation”.
  • RNA pool is removed by solid-liquid separation.
  • a washing step is provided to wash away the single-stranded RNA molecules that are non-selectively attached to the beads.
  • a binding buffer solution that does not contain RNA molecules is used, the solution temperature is 25 ° C., and the total solution described in Table 4 based on the amount (CV) of the “RNA pool” Cleaning is performed using the amount (number of times).
  • the beads are recovered by solid-liquid separation.
  • the recovered single-stranded RNA molecules complexed with biotinylated SPC immobilized on the beads are eluted using a high-concentration Urea solution, and only the single-stranded RNA molecules are recovered.
  • the composition of the high-concentration Urea solution used in this Urea elution process is HBS (50 mM HEPES (pH 7.4) + 150 mM NaCl) solution containing 7 MUrea, and the liquid temperature is 90 ° C. in the high-concentration Urea solution. Heating treatment (boiling treatment) is performed for 5 minutes.
  • RNA pool to be used after the “2nd round” is prepared by using a double-stranded cDNA molecule prepared from the “single-stranded RNA molecule” collected in the previous round as a transcription template. And prepared by in vitro transcription.
  • RT-PCR is applied using the following Forward Primer 2 and Reverse Primer 2.
  • Reverse Primer 2 is a base sequence complementary to the fixed region at the 3 ′ end of the “single-stranded RNA molecule” to be recovered.
  • the Forward Primer 2 is composed of a base sequence that can be used as a “T7 promoter region” and most of the fixed region at the 5 ′ end of the “single-stranded RNA molecule” to be recovered.
  • T7 promoter region 5'- GATAATACGACTCACTATA -3 ' Most of the fixed region at the 5 'end: 5'-GGCAACCACGACATCCGG -3'
  • the base sequence of the double-stranded cDNA molecule prepared using the recovered “single-stranded RNA molecule” as a template is the region originating from Forward Primer 2 at the 5 ′ end and the reverse primer 2 at the 3 ′ end.
  • the prepared “single-stranded RNA molecule” is recovered from the in vitro transcription reaction solution, dissolved in the above binding buffer solution at a predetermined concentration, and used as the “RNA pool” to be used in the next round. .
  • the “single-stranded RNA molecule” is subjected to a “folding” process. As a result, the double-stranded structure formed between “complementary partial base sequences” between the strands of the single-stranded RNA molecule is eliminated, and each single-stranded RNA molecule is formed within the strand. It has a tertiary structure that contains only a double-stranded structure.
  • Single-stranded RNA molecules contained in the recovered eluate are subjected to ethanol precipitation, centrifuged, and separated and recovered as a precipitate fraction.
  • double-stranded cDNA molecules are similarly prepared by applying RT-PCR method using the single-stranded RNA molecules separated and recovered as a template.
  • the contained double-stranded cDNA molecule is cloned using a commercially available TA cloning kit (Promega Corporation). Specifically, according to a standard protocol attached to the kit, a group of amplification products (double-stranded DNA molecules) by RT-PCR is ligated to a cloning vector; pGEM-T-Easy. After this ligation, E. coli strain Mach1 (Invitrogen) is transformed with the cloning vector.
  • TA cloning kit Promega Corporation
  • the transformed strain carrying the cloning vector is colony selected according to a conventional method.
  • FIG. 16 summarizes the base sequences of cDNAs of single-stranded RNA molecules classified into three types of clone families, and the base sequences of single-stranded RNA molecules that are not classified into any family. .
  • EDTA elution causes rapid dissociation from the complex with biotinylated SPC, and the selected single-stranded RNA molecule and biotinylated SPC have a Mg 2+ cation. It is judged that the seed is included. Moreover, it is presumed that the complex of the selected single-stranded RNA molecule and biotinylated SPC can be rapidly dissociated by removing the Mg 2+ cation species.
  • a surface plasmon resonance measuring apparatus BIACORE 3000 is used, a Streptavidin protein is immobilized on the sensor chip, and biotinylated SPC is bound to the immobilized Streptavidin protein.
  • RNA sample For each single-stranded RNA molecule of each clone, prepare an “RNA sample” solution containing 400 nM of each single-stranded RNA molecule in the binding buffer solution. On the sensor chip, this “RNA sample” solution is allowed to flow at a flow rate of 20 ⁇ L / min to form a complex of biotinylated SPC bound to the immobilized Streptavidin protein and a single-stranded RNA molecule. In this complex formation process, the liquid temperature is 25 ° C., and the time for circulating the “RNA sample” liquid on the sensor chip is 2 minutes.
  • a running buffer solution containing no RNA molecules having the following composition is flowed at a flow rate of 20 ⁇ L / min to remove the “RNA sample” solution on the sensor chip and dissociate the complex.
  • the liquid temperature is 25 ° C.
  • the composition of the running buffer solution without RNA molecules is 50 mM HEPES (pH 7.4) +150 mM NaCl + 5 mM MgCl 2 .
  • SPC-198 and SPC-m012 are also measured under the same conditions.
  • FIGS. 17-1 to 17-3 show the “RNA aptamer molecule” having the ability to bind to biotinylated SPC according to the third embodiment of the present invention, which is classified into the above three clone families.
  • the amount of complex formation with biotinylated SPC observed using a surface plasmon resonance measurement apparatus at a liquid temperature of 25 ° C . complex with P SPC and biotinylated sphingosine Production amount: P Sph , production amount of complex with biotinylated S1P: P S1P is P Sph > P SPC >> P S1P .
  • complex dissociation rate constant kd SPC with biotinylated SPC and the complex with biotinylated sphingosine body dissociation rate constant kd Sph complex dissociation rate constant kd S1P with biotinylated S1P is apparently has a relation kd SPC «kd Sph ⁇ kd S1P.
  • the liquid temperature increases and the complex dissociation rate constant kd increases.
  • the surface of SPC-198, SPC-m012, and SPC-520, SPC-524 selected in the third embodiment were used. Evaluation was performed using a plasmon resonance measuring apparatus.
  • FIGS. 18-1 and 18-2 show biotinylated SPC and biotinylated S1P for SPC-198, SPC-m012, SPC-524, and SPC-520 at two liquid temperatures of 25 ° C. and 37 ° C.
  • the behavior of the complex formation process and the complex dissociation process with respect to biotinylated sphingosine is shown in comparison with an example of the results of evaluation using a surface plasmon resonance measuring apparatus.
  • FIG. 19 shows the result of comparison of cDNA base sequences.
  • the base sequence of the “Hair pin” loop forming constant region is not the original base sequence “TACCGTTATTGGTG”, but is mutated to “TACCGTTATTGGAG”. I understand.
  • clones mutated to "TACCGUUATTGGAG” compared to clones held in "TACCGTTATTGGTG”
  • P SPC was also found to be relatively high.
  • the aptamer having the ability to bind to sphingosylphosphorylcholine (SPC) according to the fourth aspect of the present invention is a part involved in the “Hair pin” loop formation in the RNA aptamer molecule according to the third aspect of the present invention.
  • the secondary structure formed by using "UACCGUUAUUGGAG” and the secondary structure that is substantially the same as the secondary structure it retains the ability to bind to sphingosylphosphorylcholine (SPC) Yes.
  • SPC-573 has the ability to bind to biotinylated SPC despite the lack of a part of the 3′-terminal fixed region. Therefore, as long as the “bulge” part composed of the 6-base long first random sequence part and the 6-base second random sequence part can be retained, it has a great influence on the binding ability to biotinylated SPC. It is presumed not to affect.
  • SPC-m017, SPC-m018, SPC-m019, and SPC-m020 were prepared.
  • IV-1 SPC-m017: 5'- GGGG AAAGCC UACCGUUAUUGGAG UAAAAA CCCC-3 '(SEQ ID NO: 35);
  • IV-2) SPC-m018: 5'- GGG AAAGCC UACCGUUAUUGGAG UAAAAA CCC-3 '(SEQ ID NO: 36);
  • SPC-m020 5'- GGG AAAGCC UACCGUUAUUGGAG UAAAAA C-3 ′ (SEQ ID NO: 38);
  • a surface plasmon resonance measuring apparatus BIACORE 3000 is used, a Streptavidin protein is immobilized on the sensor chip, and biotinylated SPC is bound to the immobilized Streptavidin protein.
  • RNA sample For each single-stranded RNA molecule, prepare an “RNA sample” solution containing 400 nM of each single-stranded RNA molecule in the binding buffer solution. On the sensor chip, this “RNA sample” solution is allowed to flow at a flow rate of 20 ⁇ L / min to form a complex of biotinylated SPC bound to the immobilized Streptavidin protein and a single-stranded RNA molecule.
  • the liquid temperature is 25 ° C.
  • the time for circulating the “RNA sample” liquid on the sensor chip is 2 minutes.
  • a running buffer solution containing no RNA molecules having the following composition is flowed at a flow rate of 20 ⁇ L / min to remove the “RNA sample” solution on the sensor chip and dissociate the complex.
  • the liquid temperature is 25 ° C.
  • the composition of the running buffer solution without RNA molecules is HBS (50 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl) +5 mM MgCl 2 +5 mM KCl + 0.005% Tween20.
  • the amount of complex formed with biotinylated SPC is estimated. It was. Specifically, a value obtained by dividing the surface plasmon resonance signal intensity by the base length (corresponding to the molecular weight) of each single-stranded RNA was calculated, and the amount of complex formed with biotinylated SPC: P SPC (number of molecules ).
  • FIG. 21 shows the amount of complex formed with the biotinylated SPC evaluated for single-stranded RNA molecules; SPC-m017, SPC-m018, SPC-m019, and SPC-m020: P SPC (number of molecules) Indicates the index value.
  • FIG. 21 also shows an index value of the production amount of complex with biotinylated SPC: P SPC (number of molecules) evaluated under the same measurement conditions.
  • RNA aptamer molecule capable of binding to sphingosylphosphorylcholine (SPC) according to the present invention is for the purpose of quantifying the concentration in the circulating blood of sphingosylphosphorylcholine (SPC), which is a kind of free sphingophospholipid. Is available.

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Abstract

　本発明は、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を提供する。本発明にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」、例えば、SPC-198: 5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC　 UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAUGUUA　 UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU　-3' は、ヘアピン構造を形成可能な「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列をその一部に含んでおり、該ヘアピン構造部分を利用して、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）と特異的な複合体を形成可能である。

Description

スフィンゴシルホスホリルコリンに結合するアプタマー分子
　本発明は、スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するアプタマー分子に関する。
　虚血性疾患、例えば、虚血性心疾患、虚血性脳卒中は、その直接の原因は、多くは、血栓、あるいは、動脈血管の攣縮である。虚血性心疾患の大半は、冠状動脈疾患であり、臨床的には、狭心症、心筋梗塞、さらには、突然心臓死の症状を伴う。
　冠状動脈疾患を引き起こす、基礎疾患として、動脈硬化症、例えば、アテローム動脈硬化症、ならびに、高脂血症などの脂質代謝異常などが、指摘されている。前記の基礎疾患には、種々の内因性因子と環境因子（生活習慣など）が関与している。
　虚血性疾患、例えば、急性の心筋梗塞においては、血液中に含まれる脂質代謝物、例えば、遊離脂肪酸の濃度の上昇が観測されることが報告されている。また、哺乳動物の細胞膜の構成成分の一つであるリン脂質の代謝物の血中濃度の上昇も観測されることも報告されている。
　リン脂質は、脂質二重膜の構成を有する細胞膜の構成成分の一つであるとともに、生体内での信号伝達にも関与している。リン脂質は、グリセロリン脂質と、スフィンゴリン脂質に大別される。スフィンゴミエリン（Sphingomyelin:SPH）は、スフィンゴリン脂質の一種であり、ヒトにおいては、その体内に存在するスフィンゴ脂質全体量の８５％程度を占めるという報告もある。スフィンゴミエリンは、主に、哺乳動物の細胞膜の外膜に存在している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 　哺乳動物の細胞膜には、脂質ラフトと呼ばれる膜ミクロドメインの一種が存在している。この脂質ラフトは、スフィンゴ脂質とコレステロールに富むドメインである。脂質ラフトは、膜タンパク質あるいは膜へと移行するタンパク質を集積し、膜を介したシグナル伝達、細菌やウィルスの感染、細胞接着あるいは細胞内小胞輸送、さらに細胞内極性などに重要な役割を有する機能ドメインであることが解明されてきている。
　脂質ラフトは、脂肪酸として飽和脂肪酸を含むスフィンゴリン脂質あるいはスフィンゴ糖脂質を主成分としている。飽和脂肪酸は分子が直線状であるため、立体障害が少なく、スフィンゴ脂質は互いの分子が密に会合している。一方、折れ曲がった分子である不飽和脂肪酸で構成される脂質を多く含む他の領域は、比較的緩やかに会合している。その結果、脂質ラフトは、細胞膜の他の領域と比較して、流動性が比較的低くなっている。さらに、コレステロールはスフィンゴ脂質と親和性が高く、スフィンゴ脂質の間に挟み込まれる形で存在している。このコレステロールは、膜構造の高度なパッキングを保持しつつ、脂質ラフトに流動性を与えている。
　シグナル伝達物質であるｓｒｃファミリーやＧタンパク質などは、Ｎ－アシル化を受けた状態では、そのアシル基を膜ドメインに突き刺す形態で、この脂質ラフトに局在する。その結果、これらのシグナル伝達物質は、同じく、脂質ラフトに局在している受容体と会合し、シグナルを中継する。一方、前記Ｎ－アシル化タンパク質のアシル基の半減期は、タンパク質自身の半減期よりも短く、アシル化と脱アシル化のサイクルを利用して、該脂質ラフトへの局在が調節されていると推測されている。
　前記スフィンゴリン脂質であるスフィンゴミエリンは、細胞膜の構成成分の一つであるが、脱アシル化を受けたその代謝産物は、細胞膜に固定されず、水溶性のリン脂質として、血液中に含まれる。
　スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC：Sphingosylphosphorylcholine）は、上記のスフィンゴミエリンにおいて、Ｎ－アシル化を行っている脂肪酸が脱アシル化を受けた構造を有している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 　SPCは、カルシウム非依存性異常収縮を惹起することから、虚血性疾患、例えば、狭心症、心筋梗塞、さらには、脳卒中の要因との相関性が着目されている。すなわち、血栓、あるいは、動脈血管の攣縮に起因する、虚血性疾患、特には、狭心症、心筋梗塞、さらには、突然心臓死の発症リスクを推定する際に利用可能な、バイオマーカーの一つとなり得る。
　スフィンゴシン－１－リン酸（Sphingosine-1-phosphate:S1P）は、スフィンゴミエリン中のリン酸エステルの加水分解により、コリン（H-CH2CH2-N+(CH3)3）が脱離し、さらに、Ｎ－アシル化を行っている脂肪酸が脱アシル化を受けた構造を有している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 　スフィンゴシン－１－リン酸は、リゾリン脂質の一種である。細胞膜の外膜に存在する、スフィンゴミエリンから酵素により切り出されたS1Pは、細胞膜表面に発現しているＧタンパク質共役受容体に結合することによって、細胞遊走などを誘起する生活活性物質である。このS1Pによる細胞遊走の誘起は、１０～１００ｎＭの低濃度でも引き起こされる。一方、循環血液中に存在するS1Pの大部分は、血中タンパク質である、ＨＤＬなどのリポタンパク質やアルブミンと結合している結果、前記の機能は抑制されていると報告されている。
　S1Pは、S1Pホスファターゼ－１（SPP-1）あるいはS1Pホスファターゼ－２（SPP-2）による脱リン酸化反応を受けると、前記Ｇタンパク質共役受容体に対する結合能を失い、結果的に、その活性を失う。S1Pに対する受容体である、Ｇタンパク質共役受容体型のS1P受容体として、少なくとも５種のS1P受容体：S1P１～S1P５の存在が報告されている。
　S1Pの産生機構としては、前記のスフィンゴミエリンの代謝による機構に加えて、後述するスフィンゴシンのスフィンゴシン・キナーゼ（SphK）によるリン酸化により産生され、ABCトランスポーターを介して細胞外へ放出される機構も報告されている。
　SphKにはSphK1とSphK2の２種類が存在しており、細胞に対してインターロイキン-1β（IL-1β）や血小板由来成長因子（PDGF）、血管内皮増殖因子（VEGF）、TNF-αなどの様々な刺激が加わった場合に、SphKが活性化し、S1Pの産生が促進される。前記の各種の因子による刺激を受ける、血小板やマクロファージ、赤血球などでは、SphKによるリン酸化の機構によって、S1Pが多く産生される。
　その他、S1Pは、細胞外からカルシウムイオン流入を引き起こすセカンドメセンジャーの機能を有しており、そのため、様々な細胞内プロセスに関与することも知られている。S1Pは、例えば、細胞運動の制御、細胞増殖、細胞骨格の形成等を誘起する機能を有している。
　スフィンゴシンは、スフィンゴミエリン中のリン酸エステルの加水分解により、ホスホリルコリン（HO-PO(OH)-O-CH2CH2-N+(CH3)3）が脱離し、さらに、Ｎ－アシル化を行っている脂肪酸が脱アシル化を受けた構造を有している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 　スフィンゴシン自体は、細胞をアポトーシスに導く活性を有している。
　上記の観点から、水溶性のリン脂質として、血液中に含有される、各種のスフィンゴミエリンの代謝産物の濃度と、虚血性疾患、例えば、狭心症、心筋梗塞、さらには、脳卒中の発症リスクとの相関性の研究が進められている。具体的には、虚血性疾患、例えば、狭心症、心筋梗塞、さらには、脳卒中を発症した患者から採取した血液中に含有される、各種のスフィンゴミエリンの代謝産物の濃度と、その患者の症状との相関性、その発症の直接的原因との相関性の研究が進められている。
　例えば、健常者の血液中に含有されるSPCの濃度は、数ｎＭ程度と報告されている。そのため、現状、SPCの血中濃度の定量には、例えば、血漿中に含有されるSPCをクロマト法を適用して、分取した後、質量分析を利用して、その定量を行う方法が利用されている。
　将来的に、SPCが、例えば、狭心症、心筋梗塞、脳卒中、さらには突然心臓死の発症リスクを予測する際に、そのバイオマーカーとして利用可能であることが解明された場合には、臨床的に応用する上では、SPCの血中濃度をより簡便に測定する手法が必要となる。具体的には、血液中に含有されるSPCの濃度を、より簡便に測定可能なバイオセンサの開発が望まれている。
　血液中に含有される生体物質を特異的に検出する手段としては、従来から、検出対象の生体物質に対して、特異的な反応性を有する抗体が利用されている。
　例えば、哺乳動物が共通して有している、内因性の生体物質である、リン脂質に対する自己抗体ができることによる、自己免疫疾患である、抗リン脂質抗体症候群（Anti-phospholipid　antibody　syndrome;　APS）は知られているが、通常、内因性の生体物質である、リン脂質に対する特異的抗体の創製は極めて困難である。
　従って、特異的抗体の創製が極めて困難である、内因性の生体物質に対しては、特異的な結合能を示す核酸分子であるアプタマーの作製が広く応用されつつある。哺乳動物に共通する内因性の生体物質である、スフィンゴリン脂質の一種である、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に関しても、該SPCに対する特異的な結合能を示すアプタマーの創製と、該アプタマーを利用するバイオセンサの開発が望まれる。
　その際、血液中には、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に加えて、類似の分子構造を有する、スフィンゴシン－１－リン酸（S1P）ならびにスフィンゴシンが共存している。従って、これらスフィンゴシン－１－リン酸（S1P）ならびにスフィンゴシンに対する交差反応性は低く、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対して、特異的な結合能を示すアプタマーの創製が望まれる。
　本発明は前記の課題を解決するものである。すなわち、本発明の目的は、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対して、特異的な結合能を示すアプタマーを提供することにある。特には、本発明の目的は、スフィンゴシン－１－リン酸（S1P）ならびにスフィンゴシンに対する交差反応性は低く、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対して、特異的な結合能を示すアプタマーを提供することにある。
　本発明者らは、前記の課題を解決すべく、まず、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対して、一定以上の結合能を示す「SPCに対するＲＮＡアプタマー分子」が実際に存在するか否かの確認を行った。さらに、仮に、一定以上の結合能を示す「SPCに対するＲＮＡアプタマー分子」が存在する際には、その「SPCに対するＲＮＡアプタマー分子」を構成する一本鎖核酸分子の塩基配列を特定することを試みた。
　スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対して、一定以上の結合能を示す「SPCに対するＲＮＡアプタマー分子」の探索に先立ち、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）、スフィンゴシン－１－リン酸（S1P）ならびにスフィンゴシンは、ｐＨが７前後の水溶液中において、どのような形状で溶解しているかに関して、考察した。
　加えて、「ＲＮＡアプタマー分子の探索」を進める際、これら水溶性化合物を固定化する必要があり、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）、スフィンゴシン－１－リン酸（S1P）ならびにスフィンゴシンに、それぞれ、ビオチン化を施した誘導体を利用している。該ビオチン化を施した誘導体に関しても、ｐＨが７前後の水溶液中において、どのような形状で存在するかに関して、考察した。
　対象分子であるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）は、疎水性部分であるスフィンゴシンのヒドロキシル基（－ＯＨ）と、親水性部分であるホスホリルコリン（コリンリン酸）のリン酸基（－Ｏ－ＰＯ（ＯＨ）２）とが、リン酸エステル結合（－Ｏ－ＰＯ（ＯＨ）－Ｏ－）を形成した構造を有している。このホスホリルコリン（コリンリン酸）に由来する親水的な原子団（－ＣＨ（－ＯＨ）－ＣＨ（－ＮＨ２）－ＣＨ２－Ｏ－ＰＯ（ＯＨ）－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｎ＋（ＣＨ３）３）は、ｐＨによっては、そのリン酸エステル結合（－Ｏ－ＰＯ（ＯＨ）－Ｏ－）のイオン化が起こり、両性イオン構造（－ＣＨ（－ＯＨ）－ＣＨ（－ＮＨ２）－ＣＨ２－Ｏ－ＰＯ（Ｏ－）－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｎ＋（ＣＨ３）３）に変換可能である。従って、該スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）は、カチオン性、または、両性界面活性剤の機能を有していると推断される。
　なお、スフィンゴシン骨格のアミノ基が、Ｎ－アシル化されている、スフィンゴミエリンにおいては、該リン酸エステル結合（－Ｏ－ＰＯ（ＯＨ）－Ｏ－）のｐＫは、約１３であると報告されている。従って、スフィンゴミエリン中に存在する、該ホスホリルコリン（コリンリン酸）に由来する親水的な原子団は、ある比率で、両性イオン構造（－Ｏ－ＰＯ（Ｏ－）－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｎ＋（ＣＨ３）３）となっていると推断される。
　スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対して、ビオチン化を施した、ビオチン化SPCでは、ビオチン（biotin：5-[(3aS,4S,6aR)-2-オキソヘキサヒドロ-1H-　シエノ[3,4-d]イミダゾル-4-イル]ペンタン酸）を、スフィンゴシン骨格の末端に導入したアミノ基上にＮ－アシル化反応により結合している。従って、ビオチン化SPCの親水的な原子団は、SPCのかかる領域と、その部分構造は、実質的に同一である。すなわち、ビオチン化SPC中に存在する、該ホスホリルコリン（コリンリン酸）に由来する親水的な原子団は、ある比率で、両性イオン構造（－Ｏ－ＰＯ（Ｏ－）－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｎ＋（ＣＨ３）３）となっていると推断される。
　また、スフィンゴシン－１－リン酸（S1P）は、疎水性部分であるスフィンゴシンの末端のヒドロキシル基（－ＯＨ）に対して、リン酸（ＨＯ－ＰＯ（ＯＨ）２）が、リン酸エステル結合（－Ｏ－ＰＯ（ＯＨ）２）を形成した構造を有している。このリン酸エステル部分は、ｐＨが、６～８程度の水溶液中では、イオン化し、例えば、アニオン性原子団（－Ｏ－ＰＯ（ＯＨ）－Ｏ－）に変換される。その際、リン酸化されている部位は、－ＣＨ（－ＯＨ）－ＣＨ（－ＮＨ２）－ＣＨ２－Ｏ－の部分構造を有しており、該部分のアミノ基（－ＮＨ２）は、プロトン受容部位としての機能を具えている。結果的に、かかる分子内のプロトン供与／受容が達成されると、両性イオン構造：－ＣＨ（－ＯＨ）－ＣＨ（－＋ＮＨ３）－ＣＨ２－Ｏ－ＰＯ（ＯＨ）－Ｏ－が構成される。あるいは、部分的に、さらにイオン化が進行すると、次の構造：－ＣＨ（－ＯＨ）－ＣＨ（－＋ＮＨ３）－ＣＨ２－Ｏ－ＰＯ３ ２－に達する。
　従って、該スフィンゴシン－１－リン酸（S1P）は、疎水性部分と、前記両性イオン構造、あるいは、アニオン性の親水性部分を具えており、アニオン性界面活性剤の機能を有していると推断される。
　スフィンゴシン－１－リン酸（S1P）に対して、ビオチン化を施した、ビオチン化S1Pでも、ビオチンを、スフィンゴシン骨格の末端に導入したアミノ基上にＮ－アシル化反応により結合している。従って、ビオチン化S1P中においても、その親水的な原子団は、S1Pのかかる領域と、その部分構造は、実質的に同一である。すなわち、分子内のプロトン供与／受容が達成されると、両性イオン構造：－ＣＨ（－ＯＨ）－ＣＨ（－＋ＮＨ３）－ＣＨ２－Ｏ－ＰＯ（ＯＨ）－Ｏ－が構成される。あるいは、部分的に、さらにイオン化が進行すると、次の構造：－ＣＨ（－ＯＨ）－ＣＨ（－＋ＮＨ３）－ＣＨ２－Ｏ－ＰＯ３ ２－に達する。
　さらには、スフィンゴシン自体も、疎水性に富む直鎖の炭化水素基部分と、親水性基であるアミノ基（－ＮＨ２）とヒドロキシル基（－ＯＨ）を具える親水性原子団（－ＣＨ（－ＮＨ２）－ＣＨ２－ＯＨ）を具えている。その際、水溶液中では、ｐＨによっては、該アミノ基（－ＮＨ２）はイオン化し、カチオン（－＋ＮＨ３）に変換される。従って、該スフィンゴシンは、疎水性部分と、非イオン性、または、カチオン性の親水性部分を具えており、非イオン性、または、カチオン性界面活性剤の機能を有していると推断される。
　一方、例えば、エタノールアミン（ＨＯ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ２）は、金属表面や金属カチオンに対するキレート配位子として機能する。このキレート配位子の機能を考慮すると、エタノールアミン（ＨＯ－ＣＨ２ＣＨ２－ＮＨ２）は、多くの場合、カチオン種の形状を示していないと推断される。同様に、該スフィンゴシン中の親水性原子団（－ＣＨ（－ＯＨ）－ＣＨ（－ＮＨ２）－ＣＨ２－ＯＨ）も、多くの場合、カチオン種の形状を示していないと推断される。
　スフィンゴシンに対して、ビオチン化を施した、ビオチン化スフィンゴシンでも、ビオチンを、スフィンゴシン骨格の末端に導入したアミノ基上にＮ－アシル化反応により結合している。従って、ビオチン化スフィンゴシンにおいても、その親水的な原子団は、スフィンゴシンのかかる領域と、その部分構造は、実質的に同一である。すなわち、該ビオチン化スフィンゴシン中の親水性原子団（－ＣＨ（－ＯＨ）－ＣＨ（－ＮＨ２）－ＣＨ２－ＯＨ）も、多くの場合、カチオン種の形状を示していないと推断される。
　従って、ビオチン化SPCを利用するスクリーニング過程で、選別される「SPCに対するＲＮＡアプタマー分子」中には、該ビオチン化SPC中の疎水性部分である、スフィンゴシンの炭化水素鎖部分との疎水的相互作用を行う部分と、ホスホコリンに由来する親水的な原子団（－ＣＨ（－ＯＨ）－ＣＨ（－ＮＨ２）－ＣＨ２－Ｏ－ＰＯ（Ｏ－）－Ｏ－ＣＨ２ＣＨ２－Ｎ＋（ＣＨ３）３）との相互作用を有する部分を具えていると、推断される。
　一般に、対象分子に対する「ＲＮＡアプタマー分子」の探索には、「ランダム一本鎖核酸分子ライブラリー」を作製し、対象分子に対する結合能に関して、ＳＥＬＥＸ法を適用するスクリーニングが利用される。
　ビオチン化SPC中のSPC部分のサイズは、Ｃ－Ｃ結合距離は、１．５Å程度であることを考慮すると、３０Å以下である。この程度の分子サイズの化合物と分子間結合を形成する「ＲＮＡアプタマー分子」は、５'末端の固定領域と、３'末端の固定領域との間に、ランダムな塩基配列を有する、３０塩基長の部分（Ｎ３０）が挿入されている形態の「ランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」中に存在していると予測した。
　本発明者らは、ＳＥＬＥＸ法を適用するスクリーニングに利用する、５'末端の固定領域と、３'末端の固定領域との間に、ランダムな塩基配列を有する、３０塩基長の部分（Ｎ３０）が挿入されている形態の「ランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」として、
　５'末端の固定領域：GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC；（２６塩基）
　３０塩基長のランダム配列部分：（Ｎ３０）；
　３'末端の固定領域：UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU；（２４塩基）
を具える、全長８０塩基長の「ランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」を選択した。
　アガロース・ビーズ上に固定化したStreptavidinタンパク質、あるいは、Neutravidinタンパク質に、結合させたビオチン化SPCを利用して、アガロース・ビーズ上に固定化したStreptavidinタンパク質、あるいは、Neutravidinタンパク質には結合能を有さないが、前記ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を探索した。
　バインディング・バッファ溶液として、HBS　(50　mM　HEPES　pH　7.4,　150　mM　NaCl)　+　5　mM　MgCl2　+　5　mM　KClを用いて、ＳＥＬＥＸ・スクリーニング・ラウンドを延べ１２ラウンド繰り返し、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」の選別を行った。
　前記１２ラウンドで採取された「ＲＮＡアプタマー分子」の一群に対して、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、ビオチン化SPCに対する結合能に関して、さらに、スクリーニングを行い、合計１３ラウンドの選別を行った、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」の群を回収した。
　前記合計１３ラウンドの選別を終えた「ＲＮＡアプタマー分子」から、逆転写によって調製されるｃＤＮＡを、それぞれ大腸菌に導入して、クローン化を行った。各クローンについて、導入されているｃＤＮＡを鋳型として「ＲＮＡアプタマー分子」を調製し、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、ビオチン化SPCに対する結合能の評価を行って、少なくとも、前記バインディング・バッファ溶液中における解離定数ＫＤが、ＫＤ≦１μＭの条件を満たす「ＲＮＡアプタマー分子」を選択した。さらに、前記の選択条件を満足する「ＲＮＡアプタマー分子」について、その塩基配列を解析した。
　塩基配列の解析結果に基づき、前記の選択条件を満足する「ＲＮＡアプタマー分子」の一群のクローンにおいて、その「ランダムな塩基配列」部分が一致しているクローン数が２以上存在する、クローン・ファミリーを選別した。さらに、選別されたクローン・ファミリーの「ランダムな塩基配列」部分と比較し、一塩基が相違するクローンを選別して、該クローン・ファミリーの一塩基変異型メンバーとした。
　前記の選別されたクローン・ファミリーの間において、その「ランダムな塩基配列」部分を比較した結果、一つのクローン・ファミリーを除き、共通性を示す部位が存在していることを見出した。この共通性を示す部位は、実際に、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列が、全体の塩基配列上、同じ位置に存在しており、一つのクローン・ファミリーを除き、残るクローン・ファミリーは、相互に類似する二次構造を有すると、推断された。実際に、前記の選別されたクローン・ファミリーについて、その二次構造の推定を行った結果、一つのクローン・ファミリーを除き、相互に類似する二次構造を有すると推定された。
　加えて、前記「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列中の"CGUUAUU"、"CCGUU"、"CGUUA"、"CCGUUAU"の部分配列に相当する、"CXUUXXU"、"CCXUU"、"CXUUA"、"CXXUXAU"のモチーフ配列は、選別された「ＲＮＡアプタマー分子」クローンの過半数以上が有していることも、確認された。また、前記「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列を有していない、一つのクローン・ファミリーも、前記のモチーフ配列を有しており、類似する「５'－GCAUUAUUGT－３'」という部位を有していた。
　前記「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列を具えているクローン・ファミリーでは、該「ＲＮＡアプタマー分子」とビオチン化SPCとの複合体は、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中に浸すと、速やかに解離することが確認された。従って、これらのクローン・ファミリーでは、該「ＲＮＡアプタマー分子」とビオチン化SPCとの複合体形成部位には、Ｍｇカチオンが含有されており、該ＭｇカチオンをＥＤＴＡにより除去すると、該複合体の解離がなされると推断された。一方、類似する「５'－GCAUUAUUGT－３'」の配列を有するクローン・ファミリーでは、該「ＲＮＡアプタマー分子」とビオチン化SPCとの複合体は、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中に浸しても、全く、解離の促進はなされないことが確認された。従って、このクローン・ファミリーでは、該「ＲＮＡアプタマー分子」とビオチン化SPCとの複合体形成部位には、Ｍｇカチオンが含有されていない結果、ＥＤＴＡを作用させても、該複合体の解離は全く促進されないと、推断された。
　前記の選別されたクローン・ファミリーについて、推定された二次構造中において、前記「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列は、"Hair　pin"ループの形状を示す領域に含まれていた。また、前記の類似する「５'－GCAUUAUUGU－３'」という部位も、"Hair　pin"ループの形状を示す領域に含まれていた。すなわち、各「ＲＮＡアプタマー分子」クローン・ファミリーの「ランダムな塩基配列」部分は、前記の"Hair　pin"ループの形状を示す領域を内在していた。各選別されたクローン・ファミリーについて、推定された二次構造中、前記の"Hair　pin"ループの形状を示す領域を中心とする部分的な二次構造を利用して、前記ビオチン化SPCに対する結合を達成していると、推断された。一方、５'末端の固定領域と３'末端の固定領域とで構成される、二次構造部分は、前記ビオチン化SPCに対する結合に直接関与していないと、推断された。
　実際に、前記の"Hair　pin"ループの形状を示す領域を中心とする部分的な二次構造が形成可能な、前記「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列、または、類似の「５'－GCAUUAUUGU－３'」の部分配列を含む、５５塩基長以下、３０塩基長以上の一本鎖ＲＮＡ分子を調製し、該一本鎖ＲＮＡ分子も、ビオチン化SPCに対する結合能を具えていることを検証した。
　さらに、前記の"Hair　pin"ループの形状を示す領域を内在し、全体として、"Hair　pin"状の二次構造を形成可能な、下記の全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」を利用して、ビオチン化SPCに対する結合能を具えている「ＲＮＡアプタマー分子」の選別を行った。該全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」は、
　５'末端の固定領域：GGCAACCACGACAUCCGG；（１８塩基）
　６塩基長の第一ランダム配列部分：Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５Ｎ６；（６塩基）
　「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列を含む
　"Hair　pin"ループ形成用の定常領域：UACCGUUAUUGGUG；（１４塩基）
　６塩基長の第二ランダム配列部分：Ｎ'６Ｎ'５Ｎ'４Ｎ'３Ｎ'２Ｎ'１；（６塩基）
　３'末端の固定領域：CCGGAUGUCACACACACG；（１８塩基）
を具えている。
　前記全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」を利用して、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンに対する結合能は低いが、ビオチン化SPCに対して、高い結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を探索した。
　バインディング・バッファ溶液として、HBS　(50　mM　HEPES　pH　7.4,　150　mM　NaCl)　+　5　mM　MgCl2　+　5　mM　KClを用いて、ＳＥＬＥＸ・スクリーニング・ラウンドを延べ５ラウンド繰り返し、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」の選別を行った。
　前記５ラウンドで採取された「ＲＮＡアプタマー分子」の一群に対して、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、ビオチン化SPCに対する結合能に関して、さらに、２段階のスクリーニングを行い、合計７ラウンドの選別を行った、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンに対する結合能は低いが、ビオチン化SPCに対して、相対的に高い結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」の群を回収した。
　前記合計７ラウンドの選別を終えた「ＲＮＡアプタマー分子」から、逆転写によって調製されるｃＤＮＡを、それぞれ大腸菌に導入して、クローン化を行った。各クローンについて、導入されているｃＤＮＡを鋳型として「ＲＮＡアプタマー分子」を調製し、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、ビオチン化SPCに対する結合能の評価を行って、少なくとも、前記バインディング・バッファ溶液中における解離定数ＫＤが、ＫＤ≦１μＭの条件を満たす「ＲＮＡアプタマー分子」を選択した。さらに、前記の選択条件を満足する、全長６２塩基長以下の「ＲＮＡアプタマー分子」について、その塩基配列を解析した。
　解析された塩基配列に基づき、前記の選択条件を満足する、全長６２塩基長以下の「ＲＮＡアプタマー分子」の二次構造の推定を行った。その結果、選別された、前記全長６２塩基長以下の「ＲＮＡアプタマー分子」の二次構造は、前記「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列を含む、"Hair　pin"ループ形状を保持していると推定された。
　選別された、前記全長６２塩基長以下の「ＲＮＡアプタマー分子」の塩基配列中、６塩基長の第一ランダム配列部分、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列を含む"Hair　pin"ループ形成用の定常領域、６塩基長の第二ランダム配列部分を含む、３０塩基～３４塩基の部分配列を選択して、小型化された「一本鎖ＲＮＡ分子」を調製した。これらの小型化された「一本鎖ＲＮＡ分子」について、ビオチン化SPCに対する結合能の評価を行った。その結果、前記の小型化された「一本鎖ＲＮＡ分子」も、前記バインディング・バッファ溶液中における解離定数ＫＤが、ＫＤ≦１μＭの条件を満たす「ＲＮＡアプタマー分子」に相当することが確認された。
　なお、選別された、前記全長６２塩基長以下の「ＲＮＡアプタマー分子」と、その部分配列を含んでいる、３０塩基～３４塩基長の、小型化された「一本鎖ＲＮＡ分子」は、それらとビオチン化SPCの複合体は、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中に浸すと、速やかに解離することが確認された。従って、これらの「一本鎖ＲＮＡ分子」では、該「一本鎖ＲＮＡ分子」とビオチン化SPCとの複合体形成部位には、Ｍｇカチオンが含有されており、該ＭｇカチオンをＥＤＴＡにより除去すると、該複合体の解離がなされると推断された。
　本発明者らは、以上に述べた一連の検討の結果に基づき、本発明を完成するに至った。
　本発明の第一の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーは、
　スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
　該ＲＮＡアプタマーは、下記のI-1～I-11の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
（I-1）　SPC-198:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAUGUUA　
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU　-3'　(配列番号：１)；
（I-2）　SPC-203:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCGUAUCCCGA　
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU　-3'　(配列番号：２)；
（I-3）　SPC-209:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
UACCGUUAUUGGAGCACGCGUAGUAUGGUU　
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU　-3'　(配列番号：３)；
（I-4）　SPC-289:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
UACCGUUAUUGGAGCACGCGUAGUAUGGGU　
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU　-3'　(配列番号：４)；
（I-5）　SPC-261:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
UACCGUUAUUGGUGUAACGUAAUUGUGA　
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU　-3'　(配列番号：５)；
（I-6）　SPC-267:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
UACCGUUAUUGGUGUAACGUAAUUGUGG　
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU　-3'　(配列番号：６)；
（I-7）　SPC-215:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
UACCGUUAUUGGAGCUGUCGAUUUGCUGGA　
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU　-3'　(配列番号：７)；
（I-8）　SPC-219:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
UCCCGUUAUUGGAGUCACGCGUAGUCCUCC　
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU　-3'　(配列番号：８)；
（I-9）　SPC-259:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
UACCGUUAUUGGAGACGCUUAGAUGUCCGA　
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU　-3'　(配列番号：９)；
（I-10）　SPC-213:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
GCAUUGUCCGCACGCAAAGCAUUAUUGUGA　
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU　-3'　(配列番号：１０)；
（I-11）　SPC-273:
5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
GUCCGUUAUUGGCGCCAGCGUACAUGCGGG
UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU　-3'　(配列番号：１１)；
ことを特徴とするアプタマーである。
　本発明の第二の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーの一例は、
　スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
　該ＲＮＡアプタマーは、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列をその一部に含む、下記のII-1～II-8の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
（II-1）　SPC-m009:
5'-GGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAUGUUA　
UUCC　-3'　(配列番号：１２)；
（II-2）　SPC-m010:
5'-GGAUCUACGAAUUC　
UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAU　
CC　-3'　(配列番号：１３)；
（II-3）　SPC-m011:
5'-GGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCGUAUCCCGA　
UUCC　-3'　(配列番号：１４)；
（II-4）　SPC-m012:
5'-GGCGAAUUC　
UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCG　
CC　-3'　(配列番号：１５)；
（II-5）　SPC-m013:
5'-GGAUCCACAUCUACGAAUUC　
UACCGUUAUUGGAGCACGCGUAGUAUGGGU　
CC　-3'　(配列番号：１６)；
（II-6）　SPC-m014:
5'-GGACGAAUUC　
UACCGUUAUUGGAGCACGCGU　
CC　-3'　(配列番号：１７)；
（II-7）　SPC-m015:
5'-GGACAUCUACGAAUUC　
UACCGUUAUUGGUGUAACGUAAUUGU　
CC　-3'　(配列番号：１８)；
（II-8）　SPC-m016:
5'-GGCGAAUUC　
UACCGUUAUUGGUGUAACG　
CC　-3'　(配列番号：１９)；
ことを特徴とするアプタマーである。
　本発明の第二の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーの他の例は、
　スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
　該ＲＮＡアプタマーは、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列に類する「５'－GCAUUAUUGU－３'」の配列をその一部に含む、下記のII-9の塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
（II-9）　SPC-m007:
5'-G　G　
GUCCGCACGCAAAGCAUUAUUGUGA　
UUCACUGCAGACUUGAC　C　C　-3'　(配列番号：２０)；
ことを特徴とするアプタマーである。
　本発明の第三の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーの一例は、
　スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
　該ＲＮＡアプタマーは、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列をその一部に含む、下記のIII-1～III-8の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
（III-1）　SPC-514:
5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
AAAGCC　
UACCGUUAUUGGAG
AAAAAA
CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：２１)；
（III-2）　SPC-520:
5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
GAAGCC　
UACCGUUAUUGGAG
AAAAAA
CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：２２)；
（III-3）　SPC-524:
5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
AAAGCC　
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：２３)；
（III-4）　SPC-562:
5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
CAGGCC
UACCGUUAUUGGAG
AAAAUA
CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：２４)；
（III-5）　SPC-536:
5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
AAGGCC
UACCGUUAUUGGAG
AAUAUU
CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：２５)；
（III-6）　SPC-501:
5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
GCGGCC
UACCGUUAUUGGAG
UAAACU
CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：２６)；
（III-7）　SPC-569:
5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
GCGGCC
UACCGUUAUUGGAG
ACAACU
CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：２７)；
（III-8）　SPC-511:
5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
CGGGCC
UACCGUUAUUGGAG
AUAACU
CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：２８)；
ことを特徴とするアプタマーである。
　本発明の第三の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーの他の例は、
　スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
　該ＲＮＡアプタマーは、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列をその一部に含む、下記のIII-9～III-12の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
（III-9）　SPC-556:
5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
CAAGCA　
UACCGUUAUUGGUG
AAAAAC
CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：２９)；
（III-10）　SPC-546:
5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
AAAGAC　
UACCGUUAUUGGUG
CAAAAU
CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：３０)；
（III-11）　SPC-551:
5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
AAAUUA　
UACCGUUAUUGGUG
CAAACA
CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：３１)；
（III-12）　SPC-583:
5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
CCAGCA　
UACCGUUAUUGGUG
CAACAA
CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：３２)；
ことを特徴とするアプタマーである。
　本発明の第三の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーの他の一例は、
　スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
　該ＲＮＡアプタマーは、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列をその一部に含む、下記のIII-13～III-14の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
（III-13）　SPC-548:
5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
CACCUA　
UACCGUUAUUGGUG
CGCAUA
CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：３３)；
（III-14）　SPC-547:
5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
CAAACA　
UACCGUUAUAGGUG
CGCAUA
CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：３４)；
ことを特徴とするアプタマーである。
　本発明の第四の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーの一例は、
　スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
　該ＲＮＡアプタマーは、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列をその一部に含む、下記のIV-1～IV-4の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
（IV-1）　SPC-m017:
5'-　GGGG　
AAAGCC　
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
CCCC　-3'　(配列番号：３５)；
（IV-2）　SPC-m018:
5'-　GGG　
AAAGCC　
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
CCC　-3'　(配列番号：３６)；
（IV-3）　SPC-m019:
5'-　GGG　
AAAGCC　
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
CC　-3'　(配列番号：３７)；
（IV-4）　SPC-m020:
5'-　GGG　
AAAGCC　
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
C　-3'　(配列番号：３８)；
ことを特徴とするアプタマーである。
　本発明にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」は、循環血液中に含まれる、遊離のリン脂質のうち、遊離のスフィンゴリン脂質の一種であるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）と特異的な複合体形成が可能である。従って、本発明にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」は、遊離のスフィンゴリン脂質の一種であるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）について、特異的な複合体形成を利用して、その循環血液中の濃度を定量する目的に応用可能である。
図１は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」をＳＥＬＥＸ・スクリーニング法を利用して、選別する工程における、各ラウンドにおける選別試料中に含有される「ＲＮＡアプタマー分子」の濃縮程度を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。 図２は、ＳＥＬＥＸ・スクリーニング法を利用して選別された、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」のクローンにおいて、複数のクローンが見出されたクローン・ファミリーに関して、そのｃＤＮＡの塩基配列を対比した結果を示す図である。 図３は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」に関して、ビオチン化SPCとの複合体形成過程、ビオチン化SPCとの複合体の解離過程の挙動について、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。 図４－１は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－１９８に関して、ビオチン化SPCとの複合体形成過程の速度定数ｋａ、ビオチン化SPCとの複合体の解離過程の速度定数ｋｄ、ならびに、解離定数ＫＤ＝ｋｄ／ｋａについて、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。 図４－２は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－２０３に関して、ビオチン化SPCとの複合体形成過程の速度定数ｋａ、ビオチン化SPCとの複合体の解離過程の速度定数ｋｄ、ならびに、解離定数ＫＤ＝ｋｄ／ｋａについて、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。 図４－３は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－２１３に関して、ビオチン化SPCとの複合体形成過程の速度定数ｋａ、ビオチン化SPCとの複合体の解離過程の速度定数ｋｄ、ならびに、解離定数ＫＤ＝ｋｄ／ｋａについて、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。 図５－１は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－２８９に関して、ビオチン化SPCとの複合体形成過程、ビオチン化SPCとの複合体の解離過程の挙動について、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。 図５－２は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－２６７に関して、ビオチン化SPCとの複合体形成過程、ビオチン化SPCとの複合体の解離過程の挙動について、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。 図６－１は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－１９８に関して、その二次構造の推定結果を示す図である。 図６－２は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－２０３に関して、その二次構造の推定結果を示す図である。 図６－３は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－２８９に関して、その二次構造の推定結果を示す図である。 図６－４は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－２６７に関して、その二次構造の推定結果を示す図である。 図６－５は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－２１３に関して、その二次構造の推定結果を示す図である。 図７－１は、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－１９８に基づき設計された、本発明の第二の実施態様にかかる一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ００９、ＳＰＣ－ｍ０１０の推定される二次構造を示す図である。 図７－２は、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－２０３に基づき設計された、本発明の第二の実施態様にかかる一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ０１１、ＳＰＣ－ｍ０１２の推定される二次構造を示す図である。 図７－３は、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－２８９に基づき設計された、本発明の第二の実施態様にかかる一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ０１３、ＳＰＣ－ｍ０１４の推定される二次構造を示す図である。 図７－４は、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－２６７に基づき設計された、本発明の第二の実施態様にかかる一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ０１５、ＳＰＣ－ｍ０１６の推定される二次構造を示す図である。 図７－５は、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－２１３に基づき設計された、本発明の第二の実施態様にかかる、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ００７の推定される二次構造を示す図である。 図８－１は、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ００９、ＳＰＣ－ｍ０１０、ＳＰＣ－ｍ０１１、ＳＰＣ－ｍ０１２、ＳＰＣ－ｍ０１３、ＳＰＣ－ｍ０１４、ＳＰＣ－ｍ０１５、ＳＰＣ－ｍ０１６について、ビオチン化SPCに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。 図８－２は、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ００７について、ビオチン化SPCに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。 図９－１は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－１９８に関して、ビオチン化SPCに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動、ならびに、各解離定数ＫＤ＝ｋｄ／ｋａについて、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。 図９－２は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－１９８に関して、ビオチン化S1Pに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動、ならびに、各解離定数ＫＤ＝ｋｄ／ｋａについて、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。 図９－３は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－１９８に関して、ビオチン化スフィンゴシンに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動、ならびに、各解離定数ＫＤ＝ｋｄ／ｋａについて、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。 図１０－１は、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ００９、ＳＰＣ－ｍ０１０、ＳＰＣ－ｍ０１１、ＳＰＣ－ｍ０１２、ＳＰＣ－ｍ０１３、ＳＰＣ－ｍ０１４、ＳＰＣ－ｍ０１５、ＳＰＣ－ｍ０１６、その設計の基礎とした、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」について、ビオチン化SPCに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。 図１０－２は、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ００９、ＳＰＣ－ｍ０１０、ＳＰＣ－ｍ０１１、ＳＰＣ－ｍ０１２、ＳＰＣ－ｍ０１３、ＳＰＣ－ｍ０１４、ＳＰＣ－ｍ０１５、ＳＰＣ－ｍ０１６、その設計の基礎とした、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」について、ビオチン化S1Pに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。 図１０－３は、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ００９、ＳＰＣ－ｍ０１０、ＳＰＣ－ｍ０１１、ＳＰＣ－ｍ０１２、ＳＰＣ－ｍ０１３、ＳＰＣ－ｍ０１４、ＳＰＣ－ｍ０１５、ＳＰＣ－ｍ０１６、その設計の基礎とした、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」について、ビオチン化スフィンゴシンに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。 図１１は、本発明の第一の実施態様にかかる、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－１９８に関して、ビオチン化SPCとの複合体形成過程、該複合体の解離過程の挙動に対する、バインディング・バッファ溶液中のＮａＣｌ濃度の影響を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。 図１２は、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ００９、ＳＰＣ－ｍ０１０、ＳＰＣ－ｍ０１１、ＳＰＣ－ｍ０１２、ＳＰＣ－ｍ０１３、ＳＰＣ－ｍ０１４、ＳＰＣ－ｍ０１５、ＳＰＣ－ｍ０１６について、その塩基配列の対比を行った結果を示す図である。 図１３は、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ００９、ＳＰＣ－ｍ０１０、ＳＰＣ－ｍ０１１、ＳＰＣ－ｍ０１２、ＳＰＣ－ｍ０１３、ＳＰＣ－ｍ０１４、ＳＰＣ－ｍ０１５、ＳＰＣ－ｍ０１６の塩基配列比較において、「ランダム配列」に由来する領域中に見出された、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列を含む、特徴的な「ヘアピン」構造部分と、その設計の基礎とした、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」の５'末端の固定領域、３'末端の固定領域に由来する部位を、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ００９の予測二次構造上に表示する図である。 図１４は、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－１９８の塩基配列に基づき設計された、全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」の塩基配列と、「６塩基長の第一ランダム配列部分」と「６塩基長の第二ランダム配列部分」を含む期待される二次構造を示す図である。 図１５は、全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」から、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンに対する結合能は相対的に低いが、ビオチン化SPCに対して、相対的に高い結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を、ＳＥＬＥＸ・スクリーニング法を利用して選別する工程を模式的に示す図である。 図１６は、全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」から、ＳＥＬＥＸ・スクリーニング法を利用して選別された、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」の各クローンについて、そのｃＤＮＡの塩基配列を対比した結果を示す図である。 図１７－１は、全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」から、ＳＥＬＥＸ・スクリーニング法を利用して選別された、本発明の第三の実施態様にかかる、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」について、ビオチン化SPCに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。 図１７－２は、全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」から、ＳＥＬＥＸ・スクリーニング法を利用して選別された、本発明の第三の実施態様にかかる、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」について、ビオチン化S1Pに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。 図１７－３は、全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」から、ＳＥＬＥＸ・スクリーニング法を利用して選別された、本発明の第三の実施態様にかかる、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」について、ビオチン化スフィンゴシンに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。 図１８－１は、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－１９８、SPCに対する結合能を有する小型化「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－ｍ０１２について、液温２５℃、３７℃の二温度条件における、ビオチン化SPC、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。 図１８－２は、本発明の第三の実施態様にかかる、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－５２４、ＳＰＣ－５２０について、液温２５℃、３７℃の二温度条件における、ビオチン化SPC、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を示す図である。 図１９は、本発明の第三の実施態様にかかる、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」のクローンにおいて、複数のクローンが見出されたクローン・ファミリーに関して、そのｃＤＮＡの塩基配列を対比した結果を示す図である。 図２０は、本発明の第三の実施態様にかかる、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－５２４の塩基配列から推定される二次構造と、該ＳＰＣ－５２４の推定二次構造に基づき設計された、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ０１７、ＳＰＣ－ｍ０１８、ＳＰＣ－ｍ０１９、ＳＰＣ－ｍ０２０の塩基配列と、その期待される二次構造を示す図である。 図２１は、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－１９８、小型化された一本鎖ＲＮＡ分子：ＳＰＣ－ｍ０１２、本発明の第三の実施態様にかかる、「ＲＮＡアプタマー分子」ＳＰＣ－５２４と、小型化された一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ０１７、ＳＰＣ－ｍ０１８、ＳＰＣ－ｍ０１９、ＳＰＣ－ｍ０２０について、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、ビオチン化SPCに対する相対的な結合量を評価した結果の一例を示す図である。図２１には、ＳＰＣ－ｍ０１７に対して、該ＲＮＡ中に含まれる、Ｕ，Ｃの２'－ＯＨ基をＦ，Ｈ，－ＯＣＨ３に置換してなる、各種の修飾ＳＰＣ－ｍ０１７分子について、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、ビオチン化SPCに対する相対的な結合量を評価した結果の一例も併せて示す。
　本発明にかかるSPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」に関して、より詳細に説明する。
　（第一の形態）
　本発明の第一の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーは、水溶性のスフィンゴリン脂質である、下記のスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に代えて、ビオチン化スフィンゴシルホスホリルコリン（ビオチン化SPC）を利用して、該ビオチン化SPCと複合体形成可能な一本鎖ＲＮＡ分子として、選別されたものである。
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 　具体的には、下記の５'末端の固定領域と３'末端の固定領域、それに挟まれる、３０塩基長の「ランダム配列部分（Ｎ３０）」を具えた一本鎖ＲＮＡ分子で構成される「ランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）」から、ＳＥＬＥＸ法を適用して、前記ビオチン化SPCと複合体形成可能な一本鎖ＲＮＡ分子として、選択されたものである。
　５'末端の固定領域：GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC；（２６塩基）
　３０塩基長のランダム配列部分：（Ｎ３０）；
　３'末端の固定領域：UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU；（２４塩基）
　ＳＥＬＥＸ法を適用した、前記ビオチン化SPCとの複合体形成能に基づく、スクリーニング工程では、前記ビオチン化SPCとの複合体形成、ならびに、形成された複合体の解離は、下記の条件を採用している。
　（ｉ）　「初回ラウンド」用の「ＲＮＡプール」の調製
　上記の「ランダム一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）」を構成する一本鎖ＲＮＡ分子は、下記の「ランダム二本鎖ＤＮＡ分子ライブラリー」を構成する、二本鎖ＤＮＡ分子を転写テンプレートとして利用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写によって調製する。
　「ランダム二本鎖ＤＮＡ分子ライブラリー」を構成する、各二本鎖ＤＮＡ分子は、下記の「Ｔ７プロモーター領域」、５'末端の固定領域、３０塩基長のランダム配列部分、３'末端の固定領域からなる塩基配列Ｒｃａｎｄｉｄａｔｅ０を有している。
　５'末端の「Ｔ７プロモーター領域」：GATAATACGACTCACTATA；（１９塩基）
　５'末端の固定領域：GGGAATGGATCCACATCTACGAATTC；（２６塩基）
　Ｎ３０ランダム配列部分：NNNNNNNNNN　NNNNNNNNNN　NNNNNNNNNN；
　３'末端の固定領域：TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTT；（２４塩基）
　そのＮ３０ランダム配列部分は、ＧＣの含有比率は、５０％に選択されている。
　（ii）　ビオチン化SPCとの複合体形成条件
　ビーズ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドでは、ビオチン化SPCは、市販(PIERCE社)の「アガロース・ビーズ上の固定化Streptavidinタンパク質」（Streptavidin　Agarose　bead:　SA　bead）、「アガロース・ビーズ上の固定化Neutravidinタンパク質」（Neutravidin　Agarose　bead:　NA　bead）を利用して、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質による、ビオチンの結合によって、前記ビーズ上に固定化する。
　前記ビーズ上に固定化されている、ビオチン化SPCに対して、下記の組成のバインディング・バッファ溶液中に溶解している一本鎖ＲＮＡ分子を作用させ、ビオチン化SPCとの複合体形成を行わせる。使用されるバインディング・バッファ溶液の組成は、HBS　(50　mM　HEPES　pH　7.4,　150　mM　NaCl)　+　5　mM　MgCl2　+　5　mM　KClである。
　一方、該バインディング・バッファ溶液中に溶解している、一本鎖ＲＮＡ分子は、予め、"folding"処理を施す。すなわち、各一本鎖ＲＮＡ分子は、その塩基配列に従って、内在する「相補的な部分塩基配列」間で構成される二本鎖構造を含む、二次構造の形成、ならびに、全体として、三次構造の形成がなされた状態とする。通常、"folding"処理を施すことにより、一本鎖ＲＮＡ分子の鎖間における、「相補的な部分塩基配列」間で構成される二本鎖構造は解消され、各一本鎖ＲＮＡ分子は、それぞれ、鎖内で形成される二本鎖構造のみを内在する、三次構造を有するものとなっている。
　なお、三次構造を形成する過程において、一本鎖ＲＮＡ分子は、場合によっては、該バインディング・バッファ溶液中に存在する二価の金属カチオン種：Ｍｇ２＋に対して、「ヌクレオチド錯体」型の配位結合を形成することもある。すなわち、"folding"処理で形成される一本鎖ＲＮＡ分子の三次構造中に、二価の金属カチオン種：Ｍｇ２＋に対して、「ヌクレオチド錯体」型の配位結合が形成されている部位が内在されていることもある。
　バインディング・バッファ溶液を固液分離により除去し、該ビーズを回収する。回収されたビーズの表面に、非選択的に付着している、一本鎖ＲＮＡ分子は、前記バインディング・バッファ溶液を用いて、洗浄処理を行うことで、速やかに洗浄液中に再溶解する。一方、ビオチン化SPCとの複合体形成を介して、該ビーズ上に結合されている、一本鎖ＲＮＡ分子では、洗浄液中への溶出は相対的に緩やかに進行する。その結果、前記の洗浄処理後、固液分離によって回収されるビーズとともに、ビオチン化SPCとの複合体形成している一本鎖ＲＮＡ分子が回収される。
　（iii）　ビオチン化SPCとの複合体の解離条件
　ビーズ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドでは、ビーズ上に固定化されている、ビオチン化SPCと複合体を形成している、一本鎖ＲＮＡ分子を回収するため、下記の条件で、該複合体の解離を行う。
　ビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質と、ビオチン部分との結合の解離を回避し、ビオチン化SPCと一本鎖ＲＮＡ分子との複合体の解離のみが進行する条件を採用する。具体的には、下記の処理を施すことで、一本鎖ＲＮＡ分子の有する二次構造、ならびに三次構造を解消することで、該ビオチン化SPCと一本鎖ＲＮＡ分子との複合体の解離を行っている。
　ビーズ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドで回収されるビーズを、組成：HBS　(50　mM　HEPES　pH　7.4,　150　mM　NaCl)　+　7M　Ureaの溶出バッファ溶液、ビーズ量、カラムボリューム（ＣＶ）を基準として、その三倍容中に浸漬し、９０℃で５分間加熱し、一本鎖ＲＮＡ分子の"unfolding"処理を施す。該"unfolding"処理によって、一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造、ならびに三次構造は解消される結果、該一本鎖ＲＮＡ分子は、変性剤の尿素の高濃度溶液中に溶出される。
　溶出された、一本鎖ＲＮＡ分子を含有する溶出バッファ溶液は、ビーズと固液分離され、回収される。この回収された溶出バッファ溶液中に含まれる一本鎖ＲＮＡ分子は、例えば、エタノール沈澱処理を施し、遠心して、沈澱画分として分離回収する。
　（iv）　表面プラズモン共鳴測定装置を利用する、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」の分離条件
　ビーズ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドを繰り返した後、最終的に、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」が濃縮されたＲＮＡプールから、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」を下記の条件で分離する。
　表面プラズモン共鳴測定装置のセンサ・チップ上に、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質を固定化し、固定化されたStreptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質にビオチン化SPCを結合させる。
　このセンサ・チップ上に固定化された、ビオチン化SPCに、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」が濃縮されたＲＮＡプールを作用させる。その結果、該ＲＮＡプール中に含まれる、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」は、固定化されているビオチン化SPCと複合体を形成する。該ＲＮＡプール自体は、前記バインディング・バッファ溶液中に一本鎖ＲＮＡ分子を溶解したものであり、前記「ＲＮＡアプタマー分子」と、固定化されているビオチン化SPCと複合体形成は、該バインディング・バッファ溶液中において進行する。
　複合体形成過程を終えた後、ＲＮＡを含まないバインディング・バッファ溶液をセンサ・チップ上に流し、ＲＮＡプール液を流し出す。このＲＮＡを含まないバインディング・バッファ溶液を用いた洗浄過程の間に、固定化されているビオチン化SPCと複合体形成している、前記「ＲＮＡアプタマー分子」の一部も解離するが、大部分の「ＲＮＡアプタマー分子」は、複合体を形成した状態を維持している。
　洗浄過程の終了後、下記の組成の溶出液をセンサ・チップ上に流し、固定化されているビオチン化SPCと複合体形成している、前記「ＲＮＡアプタマー分子」を溶出させる。この溶出過程で使用される溶出液の組成は、HBS　(50　mM　HEPES　pH　7.4,　150　mM　NaCl)　+　10　mM　EDTAである。
　該溶出過程では、液温度２５℃で、前記溶出液２μＬを、センサ・チップ上に満たし、５分間インキュベーションする間に、Ｍｇ２＋イオンをＥＤＴＡ錯体として除去する。その結果、マグネシウムイオン依存的にビオチン化SPCと複合体形成している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択的に解離させている。すなわち、該溶出液中には、ビオチン化SPCに対して、マグネシウムイオン依存的な結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子が回収されている。
　センサ・チップ上から、前記溶出液を回収し、該回収された溶出液から、含有されている「ＲＮＡアプタマー分子」は、例えば、エタノール沈澱処理を施し、遠心して、沈澱画分として分離回収する。
　一方、マグネシウムイオン非依存的な結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子に関しては、Ｍｇ２＋イオンをＥＤＴＡ錯体として除去する処理は、複合体の解離を促進しないが、上記の溶出過程の間に、若干解離が進む。そのため、回収される溶出液中には、マグネシウムイオン非依存的な結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子も僅かに含まれている。
　（v）　アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の除去条件
　ビーズ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドでは、アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃縮も、不可避的に進行する。
　ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」の濃縮を行う際、アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃縮を回避するため、「Pre-selection操作」を利用する。
　該「Pre-selection操作」は、ビーズ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドで利用するＲＮＡプール溶液を、ビオチン化SPCの固定化に利用する、「アガロース・ビーズ上の固定化Streptavidinタンパク質」（SA　bead）、「アガロース・ビーズ上の固定化Neutravidinタンパク質」（NA　bead）に予め作用させる操作である。
　「アガロース・ビーズ上の固定化Streptavidinタンパク質」（SA　bead）、「アガロース・ビーズ上の固定化Neutravidinタンパク質」（NA　bead）に作用させると、該ＲＮＡプール溶液中に含まれる、アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」は、該ビーズ上に結合される。その結果、該ビーズと固液分離され、回収される、ＲＮＡプール溶液中に残余する、アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃度は、大幅に低減されている。
　該「Pre-selection操作」を予め施した、ＲＮＡプール溶液を利用して、ＳＥＬＥＸ選択ラウンドを行うと、アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」は濃縮を受けるが、予め、ＲＮＡプール溶液中の含有濃度を低減している結果、回収される溶出バッファ溶液中に含まれる「一本鎖ＲＮＡ分子」中における、アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の比率は、相対的に低い水準となっている。
　従って、該「Pre-selection操作」を利用することで、ビーズ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドを繰り返しても、アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃縮を実質的に回避することが可能となる。
　（vi）　「２回ラウンド」以降で利用する「ＲＮＡプール」の調製
　「２回ラウンド」以降で利用する「ＲＮＡプール」は、前段のラウンドで回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」より調製される、二本鎖ｃＤＮＡ分子を転写テンプレートとして利用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写によって調製する。
　回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」を鋳型として、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製する工程では、下記のForward　Primer　とReverse　Primerを利用して、RT-PCR法を適用する。
　Forward　Primer：（配列番号：３９）
　5'-　GATAATACGACTCACTATA　GGGAATGGATCCACATCTACGA　-3'
　Reverse　Primer：（配列番号：４０）
　5'-　AAGCTTCGTCAAGTCTGCAGTGAA　-3'
　前記Reverse　Primerは、回収される「一本鎖ＲＮＡ分子」の３'末端の固定領域と相補的な塩基配列である。
　5'-　UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU　-3'
　3'-　AAGTGACGTCTGAACTGCTTCGAA　-5'
　前記Forward　Primerは、「Ｔ７プロモーター領域」として利用可能な塩基配列と、回収される「一本鎖ＲＮＡ分子」の５'末端の固定領域の大部分とで構成されている。
　「Ｔ７プロモーター領域」：5'-　GATAATACGACTCACTATA　-3'
　５'末端の固定領域の大部分：5'-　GGGAATGGATCCACATCTACGA　-3'
　その結果、回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」を鋳型として調製される、二本鎖ｃＤＮＡ分子の塩基配列は、５'末端にForward　Primerに起因する領域、３'末端にReverse　Primerに相補的な領域、その間に、回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」の５'末端の固定領域の一部：AUUCと「ランダム配列部分」に由来する領域とで構成されている。
　Forward　Primerに起因する領域：
　GATAATACGACTCACTATA　GGGAATGGATCCACATCTACGA　
　５'末端の固定領域の一部：AUUCと「ランダム配列部分」に由来する領域：
　ATTC　NNNNNNNNNN　NNNNNNNNNN　NNNNNNNNNN
　Reverse　Primerに相補的な領域：
　TTCACTGCAGACTTGACGAAGCTT
　調製された二本鎖ｃＤＮＡ分子を転写テンプレートとして利用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写により調製される「一本鎖ＲＮＡ分子」は、前段のラウンドで回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」とは、その「ランダム配列部分」の頻度分布は、本質的に同じ分布を示すものとなっている。
　調製された「一本鎖ＲＮＡ分子」は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写反応溶液から回収し、上記のバインディング・バッファ溶液中に、所定の濃度で溶解して、次段ラウンドで利用する「ＲＮＡプール」とする。なお、「一本鎖ＲＮＡ分子」に対して、"re-folding"処理を施す。その結果、一本鎖ＲＮＡ分子の鎖間における、「相補的な部分塩基配列」間で構成される二本鎖構造は解消され、各一本鎖ＲＮＡ分子は、それぞれ、鎖内で形成される二本鎖構造のみを内在する、三次構造を有するものとなっている。
　（第一の実施態様）
　第一の実施態様では、本発明の第一の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーを選別する一連の工程の一例を以下に説明する。
　第１の実施態様では、下記の表１に記載する条件を採用して、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーの選別を行っている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
 　表１に示す選択条件では、ビーズ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドを１２ラウンド繰り返し、ビオチン化SPCに対して結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子の濃縮を行っている。最終的に、濃縮されたビオチン化SPCに対して結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子から、表面プラズモン共鳴測定装置を利用する、ＳＥＬＥＸ選択ラウンドを１ラウンド行って、ビオチン化SPCに加えて、遊離のSPCに対して結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子を選別している。
　また、ビーズ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドでは、「アガロース・ビーズ上の固定化Streptavidinタンパク質」（SA　bead）、「アガロース・ビーズ上の固定化Neutravidinタンパク質」（NA　bead）にビオチン化SPCを結合させたものを、交互に使用している。このビーズの種類を変更することによって、初回ラウンドと、２回目のラウンドでは、アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃縮を抑制している。
　３回目のラウンド以降では、二種類のビーズを交互に使用することに加えて、その回のラウンドで使用するビーズの種類に合わせて、該ビーズを用いる「Pre-selection操作」を実施することで、アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃縮を回避している。
　「Pre-selection操作」に利用する、「アガロース・ビーズ上の固定化Streptavidinタンパク質」（SA　bead）あるいは「アガロース・ビーズ上の固定化Neutravidinタンパク質」（NA　bead）の量は、ビーズの量として、各回のラウンドで使用される「ビオチン化SPCを結合させているビーズ」の量を基準として、表１に示す量比としている。ラウンドが進むとともに、アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」は、徐々に濃縮される傾向があることを考慮し、ラウンドが進むとともに、「Pre-selection操作」に利用するビーズの量を増している。
　各回のラウンドにおける、ビーズ上に固定化されているビオチン化SPCと「ＲＮＡプール」を接触させる際、その液温度は、２５℃とし、その時間：「Incubation　Time」は、表１に示す。
　なお、「Pre-selection操作」を実施する際も、その液温度は、２５℃とし、その時間は、前記「Incubation　Time」と等しい時間を選択している。
　各回のラウンドにおける、ビーズ上に固定化されているビオチン化SPCと「ＲＮＡプール」を接触させた後、固液分離により、「ＲＮＡプール」を除去する。次いで、該ビーズに非選択的に付着している一本鎖ＲＮＡ分子を洗浄除去するため、洗浄工程を設けている。該洗浄工程では、ＲＮＡ分子を含まないバインディング・バッファ溶液を利用して、その液温度は、２５℃とし、ビーズ量、カラムボリューム（ＣＶ）を基準として、表１に記載する、合計液量（回数）を用いて、洗浄を行っている。
　最終の１３回目のラウンドは、表面プラズモン共鳴測定装置を利用する、ＳＥＬＥＸ選択ラウンドである。具体的には、表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE　3000を利用し、そのセンサ・チップ上に、Streptavidinタンパク質を固定化し、該固定化されたStreptavidinタンパク質にビオチン化SPCを結合させている。
　この１３回目のラウンドで使用する「ＲＮＡプール」液は、バインディング・バッファ溶液中に一本鎖ＲＮＡ分子を５μＭ含有している。センサ・チップ上に、この「ＲＮＡプール」液を、流速２０μＬ/分で流し、固定化されているStreptavidinタンパク質に結合しているビオチン化SPCと、一本鎖ＲＮＡ分子の複合体を形成させる。この複合体形成過程は、その液温度は、２５℃とし、センサ・チップ上に「ＲＮＡプール」液を流通させる時間は、５分間としている。
　洗浄過程では、ＲＮＡ分子を含まないバインディング・バッファ溶液を、流速２０μＬ/分で、５分間流し、センサ・チップ上の「ＲＮＡプール」液を除去する。該洗浄過程において、その液温度は、２５℃としている。
　洗浄過程の終了後、下記の組成の溶出液をセンサ・チップ上に満たし、インキュベーションすることで、固定化されているビオチン化SPCと複合体形成している、一本鎖ＲＮＡ分子を溶出させる。この溶出過程で使用される溶出液の組成は、HBS　(20　mM　HEPES　pH　7.4,　150　mM　NaCl)　+　10　mM　EDTAである。
　該溶出過程では、該溶出液２μＬを、センサ・チップ上に満たし、５分間インキュベーションする間に、Ｍｇ２＋イオンをＥＤＴＡ錯体として除去する。その結果、マグネシウムイオン依存的にビオチン化SPCと複合体形成している、一本鎖ＲＮＡ分子を選択的に解離させている。すなわち、該溶出液中には、ビオチン化SPCに対して、マグネシウムイオン依存的な結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子が回収されている。
　回収された溶出液中に含まれる一本鎖ＲＮＡ分子は、エタノール沈澱処理を施し、遠心して、沈澱画分として分離回収する。該１３回目のラウンドにおいて、分離回収された、一本鎖ＲＮＡ分子を鋳型として、同様に、RT-PCR法を応用して、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製する。
　調製された二本鎖ｃＤＮＡ分子を溶解する液の一部を使用して、含有される二本鎖ｃＤＮＡ分子を、市販のＴＡクローニング・キット（プロメガ株式会社）を利用して、クローニングする。具体的には、当該キットに添付される標準プロトコルに従って、ＲＴ－ＰＣＲによる増幅産物（二本鎖ＤＮＡ分子）群を、クローニングベクター；ｐＧＥＭ－Ｔ　Ｅａｓｙへ、ライゲーションする。このライゲーション後、クローニングベクターにより、大腸菌株Ｍａｃｈ１（インビトロジェン）を形質転換させる。
　次いで、前記クローニングベクター由来の選択マーカーを利用し、定法に従って、クローニングベクターを保持する形質転換株をコロニー選別する。
　一方、調製された二本鎖ｃＤＮＡ分子を転写テンプレートとして利用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写により、「一本鎖ＲＮＡ分子」を調製し、「ＲＮＡプール」を作製する。
　該１３回目のラウンドを終了した時点の「ＲＮＡプール」、ならびに、８回目～１２回目の各ラウンドを終了した時点の「ＲＮＡプール」に関して、実際に、ビオチン化SPCと複合体形成する一本鎖ＲＮＡ分子の含有比率の上昇（濃縮）がなされていることを、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、検証した。
　具体的には、表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE　3000を利用し、そのセンサ・チップ上に、Streptavidinタンパク質を固定化し、該固定化されたStreptavidinタンパク質にビオチン化SPCを結合させている。上記１３回目、ならびに、８回目～１２回目の各ラウンドを終了した時点の「ＲＮＡプール」から、それぞれ、バインディング・バッファ溶液中に一本鎖ＲＮＡ分子を２μＭ含有している、「ＲＮＡ試料」液を調製する。
　１３回目、ならびに、８回目～１２回目の各ラウンドの「ＲＮＡ試料」液を、センサ・チップ上に、１２０秒間の間、流速２０μＬ/分で流し、固定化されているStreptavidinタンパク質に結合しているビオチン化SPCと、一本鎖ＲＮＡ分子の複合体を形成させる。次いで、センサ・チップ上に、ＲＮＡ分子を含まないバインディング・バッファ溶液を、流速２０μＬ/分で流し、固定化されているビオチン化SPCと複合体を形成している一本鎖ＲＮＡ分子を解離させる。前記複合体の形成過程と、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間経過を、図１に纏めて示す。
　８回目～１２回目の各ラウンド、さらには、１３回目のラウンドと進む間に、ビオチン化SPCと複合体形成可能な一本鎖ＲＮＡ分子の含有比率は、回を追う毎に、上昇していることが確認された。
　上記１３回目のラウンドにおいて、分離回収された、一本鎖ＲＮＡ分子から作製したクローンのうち、無作為に８５クローンを選び、各クローンが保持する、一本鎖ＲＮＡ分子のｃＤＮＡの塩基配列を解析した。解析された８５クローンが保持する、一本鎖ＲＮＡ分子のｃＤＮＡの塩基配列を対比したところ、同じ塩基配列を有するクローンが複数存在している塩基配列が、９種類存在していた。また、前記９種類の塩基配列に対して、一塩基が相違する塩基配列も見出され、それを含め、下記の９種類のクローン・ファミリーが存在することが判明した。図２に、該９種類のクローン・ファミリーで見出される、一本鎖ＲＮＡ分子のｃＤＮＡの塩基配列を纏めて示す。
　更に、表２に、該９種類のクローン・ファミリーで見出される、一本鎖ＲＮＡ分子の塩基配列中、５'末端側のForward　Primerに起因する領域と３'末端側Reverse　Primerに相補的な領域を除いた部分の部分塩基配列を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
 　「ランダム配列部分」を比較すると、上記の９種類のクローン・ファミリーＡ～Ｉのうち、クローン・ファミリーＨを除く、８種のクローン・ファミリーにおいて、「５'－CCGUUAUUGG－３'」の部分塩基配列が、同じ部位に存在している。
　該「５'－CCGUUAUUGG－３'」の部分塩基配列と類似する部分塩基配列が、８５クローンの一本鎖ＲＮＡ分子の塩基配列中、その「ランダム配列部分」中に存在する可能性を調べた。
　具体的には、先ず、「５'－CCGUUAUUGG－３'」の部分塩基配列中に含まれる、塩基長５～７の「部分配列」の群に関して、
　５'末端の固定領域：GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC；（２６塩基）
　３'末端の固定領域：UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU；（２４塩基）
の部分には、類似性を示す部分配列が存在しないものを、「５'－CCGUUAUUGG－３'」の部分塩基配列に特徴的な「モチーフ配列」として、選択した。
　その結果、少なくとも、「CXUUXXU」、「CCXUU」、「CXUUA」、「CXXUXAU」の４種のモチーフが、「５'－CCGUUAUUGG－３'」の部分塩基配列に特徴的な「モチーフ配列」として選択された。
　クローン・ファミリーＨの一本鎖ＲＮＡ分子の塩基配列中、その「ランダム配列部分」中には、「５'－CCGUUAUUGG－３'」の部分塩基配列と類似性を示す、「５'－　GCAUUAUUGU－３'」の部分塩基配列が存在している。該「５'－　GCAUUAUUGU－３'」の部分塩基配列中にも、「CXUUXXU」、「CXUUA」、「CXXUXAU」の３種のモチーフが内在されている。
　８５クローンの一本鎖ＲＮＡ分子の塩基配列中、その「ランダム配列部分」中に、「CXUUXXU」、「CCXUU」、「CXUUA」、「CXXUXAU」の４種のモチーフが存在しているクローンを選別した。
　その「ランダム配列部分」中に、「CXUUXXU」のモチーフが存在しているクローンは、８５クローン中、５３クローン存在していた。
　その「ランダム配列部分」中に、「CCXUU」のモチーフが存在しているクローンは、８５クローン中、５２クローン存在していた。
　その「ランダム配列部分」中に、「CXUUA」のモチーフが存在しているクローンは、８５クローン中、４９クローン存在していた。
　その「ランダム配列部分」中に、「CXXUXAU」のモチーフが存在しているクローンは、８５クローン中、４９クローン存在していた。
　以上の「CXUUXXU」、「CCXUU」、「CXUUA」、「CXXUXAU」の４種のモチーフの存在頻度をも考慮し、「５'－CCGUUAUUGG－３'」の部分塩基配列は、ビオチン化SPCとの複合体形成に関与する、コンセンサス配列と推断した。
　上記の９種類のクローン・ファミリーＡ～Ｉに分類される、各クローンの一本鎖ＲＮＡ分子は、下記の表３に記載するＩＤを付したものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
 　上記の９種類のクローン・ファミリーＡ～Ｉに分類される、各クローンの一本鎖ＲＮＡ分子について、実際に、ビオチン化SPCに対する結合能を有することを、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、検証した。
　具体的には、表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE　3000を利用し、そのセンサ・チップ上に、Streptavidinタンパク質を固定化し、該固定化されたStreptavidinタンパク質にビオチン化SPCを結合させている。
　クローン・ファミリーＡ～Ｉに分類される、各クローンの一本鎖ＲＮＡ分子について、それぞれ、バインディング・バッファ溶液中に各一本鎖ＲＮＡ分子を５００ｎＭ含有している、「ＲＮＡ試料」液を調製する。センサ・チップ上に、この「ＲＮＡ試料」液を、流速２０μＬ/分で流し、固定化されているStreptavidinタンパク質に結合しているビオチン化SPCと、一本鎖ＲＮＡ分子の複合体を形成させる。この複合体形成過程は、その液温度は、２５℃とし、センサ・チップ上に「ＲＮＡ試料」液を流通させる時間は、２分間としている。
　次いで、複合体の解離過程では、下記の組成の、ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液を、流速２０μＬ/分で、４分間流し、センサ・チップ上の「ＲＮＡ試料」液を除去し、複合体の解離を進める。該複合体の解離過程において、その液温度は、２５℃としている。ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液の組成は、HBS　(50　mM　HEPES　pH　7.4,　150　mM　NaCl)　+　5　mM　MgCl2　+　5　mM　KCl　+　0.005%　Tween20である。
　ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液を４分間流した時点で、ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液に代えて、下記の組成のＥＤＴＡ溶液をセンサ・チップ上に、流速６０μＬ/分で流し、残余している一本鎖ＲＮＡ分子の溶出を行った。ＥＤＴＡ溶液の組成は、HBS　(50　mM　HEPES　pH　7.4,　150　mM　NaCl)　+　10　mM　EDTAである。該ＥＤＴＡ溶液の流入によって、センサ・チップ上に残余している、固定化されたビオチン化SPCと一本鎖ＲＮＡ分子の複合体から、金属カチオン種（Ｍｇ２＋）は、ＥＤＴＡとの複合体を形成する結果、除去される。
　この金属カチオン種（Ｍｇ２＋）の除去に伴って、クローン・ファミリーＨに属するクローンの一本鎖ＲＮＡ分子を除き、残る８種のクローン・ファミリーＡ～Ｇ，Ｉに属する各クローンの一本鎖ＲＮＡ分子は、速やかに溶出された。一方、クローン・ファミリーＨに属するクローンの一本鎖ＲＮＡ分子は、金属カチオン種（Ｍｇ２＋）の除去によっても、固定化されたビオチン化SPCと複合体を形成した状態に保たれている。
　上記の測定を終了した後、クローン・ファミリーＨに属するクローンの一本鎖ＲＮＡ分子と固定化されたビオチン化SPCとの複合体を解消する手段としては、該一本鎖ＲＮＡ分子の立体構造を解消することで、ビオチン化SPCに対する結合能を喪失させる処理を採用する。具体的には、センサ・チップ上に、組成50　mM　NaOH　+　1　M　NaClの液２０μＬを、流速１００μＬ/分で流し、前記一本鎖ＲＮＡ分子の「アルカリ変性処理」を施す。
　図３に、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-198,　SPC-243,　SPC-256,　SPC-203,　SPC-209,　SPC-289,　SPC-261,　SPC-267,　SPC-215,　SPC-216,　SPC-219,　SPC-259,　SPC-213,　SPC-273,　SPC-242,　SPC-246について、前記の検証を行った結果を併せてしめす。
　クローン・ファミリーＡに属するクローンの一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-198に関して、「ＲＮＡ試料」液中に含有される該一本鎖ＲＮＡ分子の濃度を、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭの２倍希釈系列で変化させ、他の条件は上記の条件を用いて、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した。図４－１に、液温度２５℃における、該SPC-198に対する測定結果を示す。その測定結果に基づき、液温度２５℃、バインディング・バッファ溶液の組成：HBS　(20　mM　HEPES　pH　7.4,　150　mM　NaCl)　+　5　mM　MgCl2　+　5　mM　KClの条件において、ビオチン化SPCと該一本鎖ＲＮＡ分子との複合体形成の速度定数：ｋａ、複合体の解離の速度定数：ｋｄ、ならびに、解離定数ＫＤ＝ｋｄ／ｋａを算出した。算出された値は、ｋａ＝（2.04±0.01）×１０４　(Ｍ－１ｓ－１)、ｋｄ＝（4.27±0.03）×１０－４　(ｓ－１)、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ=20.9±0.2　（ｎＭ）であった。
　クローン・ファミリーＢに属するクローンの一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-203に関して、「ＲＮＡ試料」液中に含有される該一本鎖ＲＮＡ分子の濃度を、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭの２倍希釈系列で変化させ、他の条件は上記の条件を用いて、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した。図４－２に、液温度２５℃における、該SPC-203に対する測定結果を示す。その測定結果に基づき、液温度２５℃、バインディング・バッファ溶液の組成：HBS　(20　mM　HEPES　pH　7.4,　150　mM　NaCl)　+　5　mM　MgCl2　+　5　mM　KClの条件において、ビオチン化SPCと該一本鎖ＲＮＡ分子との複合体形成の速度定数：ｋａ、複合体の解離の速度定数：ｋｄ、ならびに、解離定数ＫＤ＝ｋｄ／ｋａを算出した。算出された値は、ｋａ＝1.41±0.01×１０４　(Ｍ－１ｓ－１)、ｋｄ＝4.67±0.01×１０－４　(ｓ－１)、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ=33.2±0.2　（ｎＭ）であった。
　クローン・ファミリーＨに属するクローンの一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-213に関して、「ＲＮＡ試料」液中に含有される該一本鎖ＲＮＡ分子の濃度を、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭの２倍希釈系列で変化させ、他の条件は上記の条件を用いて、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した。図４－３に、液温度２５℃における、該SPC-213に対する測定結果を示す。その測定結果に基づき、液温度２５℃、バインディング・バッファ溶液の組成：HBS　(20　mM　HEPES　pH　7.4,　150　mM　NaCl)　+　5　mM　MgCl2　+　5　mM　KClの条件において、ビオチン化SPCと該一本鎖ＲＮＡ分子との複合体形成の速度定数：ｋａ、複合体の解離の速度定数：ｋｄ、ならびに、解離定数ＫＤ＝ｋｄ／ｋａを算出した。算出された値は、ｋａ＝5.93±0.15×１０３　(Ｍ－１ｓ－１)、ｋｄ＝5.36±0.02×１０－４　(ｓ－１)、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ=90.4±2.4　（ｎＭ）であった。
　クローン・ファミリーＣに分類されるクローンの一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-289に関して、「ＲＮＡ試料」液中に含有される該一本鎖ＲＮＡ分子の濃度を、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭの２倍希釈系列で変化させ、他の条件は上記の条件を用いて、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した。図５－１に、液温度２５℃における、該SPC-289に対する測定結果を示す。
　図５－１に示す表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化では、その複合体の解離過程は、単一の速度定数ｋｄで表記できず、少なくとも、二つの速度定数ｋｄで特徴付けられる、二種の解離過程として、解析する必要があることが判明した。すなわち、ｋｄが、１０－２　(ｓ－１)以上の「速い解離過程」と、ｋｄが、１０－３　(ｓ－１)以下の「遅い解離過程」が存在するとして、解析する必要があることが判明した。図５－１には、複合体の解離過程に関して、単一の解離過程を仮定した場合（1:1　model）と、二種の解離過程を仮定した場合（1:2　model）について、それぞれ、カーブ・フィッティングを試みた結果を示している。
　クローン・ファミリーＤに属するクローンの一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-267に関して、「ＲＮＡ試料」液中に含有される該一本鎖ＲＮＡ分子の濃度を、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭの２倍希釈系列で変化させ、他の条件は上記の条件を用いて、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した。図５－２に、液温度２５℃における、該SPC-267に対する測定結果を示す。
　図５－２に示す表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化でも、その複合体の解離過程は、単一の速度定数ｋｄで表記できず、少なくとも、二つの速度定数ｋｄで特徴付けられる、二種の解離過程として、解析する必要があることが判明した。すなわち、ｋｄが、１０－２　(ｓ－１)以上の「速い解離過程」と、ｋｄが、１０－３　(ｓ－１)以下の「遅い解離過程」が存在するとして、解析する必要があることが判明した。図５－２には、複合体の解離過程に関して、単一の解離過程を仮定した場合（1:1　model）と、二種の解離過程を仮定した場合（1:2　model）について、それぞれ、カーブ・フィッティングを試みた結果を示している。
　少なくとも、上記の結果を総合すると、表３に示す各クローンの一本鎖ＲＮＡ分子は、ビオチン化SPCならびにSPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー」として、利用可能であると判断される。
　（第二の形態）
　表３に示す各クローンの一本鎖ＲＮＡ分子は、それぞれ、固有の三次構造にfoldingされた状態で、ビオチン化SPCならびにSPCと複合体を形成していると、推断される。三次構造の推定は困難であるため、該三次構造を構成する際、その基本的な構造要素となる二次構造の推定を試みた。この一本鎖ＲＮＡ分子における、二次構造の推定には、特開２００８－２８３９４３号公報に開示される手法を適用し、二次構造推定プログラム：ＶＡＬＦＯＬＤを利用した。
　図６－１に、クローン・ファミリーＡに属するクローンの一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-198について、推定される二次構造を示す。推定される二次構造において、その「ランダム配列部分」に存在する、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列は、「ヘアピン・ループ」を構成している。また、全体の二次構造の形状も、「ヘアピン」形状を呈している。
　図６－２に、クローン・ファミリーＢに属するクローンの一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-203について、推定される二次構造を示す。推定される二次構造において、その「ランダム配列部分」に存在する、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列は、「ヘアピン・ループ」を構成している。また、全体の二次構造の形状も、「ヘアピン」形状を呈している。
　図６－３に、クローン・ファミリーＣに分類されるクローンの一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-289について、推定される二次構造を示す。推定される二次構造において、その「ランダム配列部分」に存在する、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列は、「ヘアピン・ループ」を構成している。また、全体の二次構造の形状も、「ヘアピン」形状を呈している。
　図６－４に、クローン・ファミリーＤに分類されるクローンの一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-267について、推定される二次構造を示す。推定される二次構造において、その「ランダム配列部分」に存在する、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列は、「ヘアピン・ループ」を構成している。また、全体の二次構造の形状も、「ヘアピン」形状を呈している。
　図６－５に、クローン・ファミリーＨに属するクローンの一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-213について、推定される二次構造を示す。推定される二次構造において、その「ランダム配列部分」に存在する、「５'－　GCAUUAUUGU－３'」の部分は、「ヘアピン・ループ」状の構造を構成している。
　本発明の第一の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーにおいて、対象物質のSPCとの複合体形成に関与する部位は、それぞれ、"AUUC"と「ランダム配列部分（Ｎ３０）」の部分が、その三次構造の形成に関与している領域に存在していると、推断される。具体的には、その三次構造を構成する際に、その構成要素として使用される二次構造のうち、"AUUC"と「ランダム配列部分（Ｎ３０）」の部分が、その二次構造の形成に関与する領域に、対象物質のSPCとの複合体形成に関与する部位が存在すると、推断される。
　本発明の第二の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーは、上記の本発明の第一の形態にかかるＲＮＡアプタマー分子中、"AUUC"と「ランダム配列部分（Ｎ３０）」の部分が、その二次構造の形成に関与する領域部分と、実質的に同じ二次構造を形成することで、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を保持している。
　（第二の実施態様）
　第二の実施態様では、本発明の第二の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーを設計する工程の一例を以下に説明する。
　図６－１に示す、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-198の推定される二次構造中、"AUUC"と「ランダム配列部分（Ｎ３０）」の部分が、その二次構造の形成に関与する領域と、実質的に同じ二次構造を形成すると推定される、一本鎖ＲＮＡ分子を設計した。具体的には、図７－１に示す二次構造を形成すると推定される、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ００９、ＳＰＣ－ｍ０１０を作製した。
（II-1）　SPC-m009:
5'-GGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAUGUUA　
UUC　C　-3'　(配列番号：１２)；
（II-2）　SPC-m010:
5'-GGAUCUACGAAUUC　
UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAU　
CC　-3'　(配列番号：１３)；
　一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ００９、ＳＰＣ－ｍ０１０の推定される二次構造は、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列を含む「ヘアピン・ループ」の構造を含め、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-198の推定される二次構造の主要部を保持している。なお、５'－末端と３'－末端の部分は、二本鎖構造となるように、二つのＧ：Ｃ対を形成可能な塩基配列としている。
　図６－２に示す、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-203の推定される二次構造中、"AUUC"と「ランダム配列部分（Ｎ３０）」の部分が、その二次構造の形成に関与する領域と、実質的に同じ二次構造を形成すると推定される、一本鎖ＲＮＡ分子を設計した。具体的には、図７－２に示す二次構造を形成すると推定される、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ０１１、ＳＰＣ－ｍ０１２を作製した。
（II-3）　SPC-m011:
5'-GGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCGUAUCCCGA　
UUCC　-3'　(配列番号：１４)；
（II-4）　SPC-m012:
5'-GGCGAAUUC　
UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCG　
CC　-3'　(配列番号：１５)；
　一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ０１１、ＳＰＣ－ｍ０１２の推定される二次構造は、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列を含む「ヘアピン・ループ」の構造を含め、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-203の推定される二次構造の主要部を保持している。なお、５'－末端と３'－末端の部分は、二本鎖構造となるように、二つのＧ：Ｃ対を形成可能な塩基配列としている。
　図６－３に示す、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-289の推定される二次構造中、"AUUC"と「ランダム配列部分（Ｎ３０）」の部分が、その二次構造の形成に関与する領域と、実質的に同じ二次構造を形成すると推定される、一本鎖ＲＮＡ分子を設計した。具体的には、図７－３に示す二次構造を形成すると推定される、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ０１３、ＳＰＣ－ｍ０１４を作製した。
（II-5）　SPC-m013:
5'-GGAUCCACAUCUACGAAUUC　
UACCGUUAUUGGAGCACGCGUAGUAUGGGU　
CC　-3'　(配列番号：１６)；
（II-6）　SPC-m014:
5'-GGACGAAUUC　
UACCGUUAUUGGAGCACGCGU　
CC　-3'　(配列番号：１７)；
　一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ０１３、ＳＰＣ－ｍ０１４の推定される二次構造は、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列を含む「ヘアピン・ループ」の構造を含め、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-289の推定される二次構造の主要部を保持している。なお、５'－末端と３'－末端の部分は、二本鎖構造となるように、二つのＧ：Ｃ対を形成可能な塩基配列としている。
　図６－４に示す、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-267の推定される二次構造中、"AUUC"と「ランダム配列部分（Ｎ３０）」の部分が、その二次構造の形成に関与する領域と、実質的に同じ二次構造を形成すると推定される、一本鎖ＲＮＡ分子を設計した。具体的には、図７－４に示す二次構造を形成すると推定される、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ０１５、ＳＰＣ－ｍ０１６を作製した。
（II-7）　SPC-m015:
5'-GGACAUCUACGAAUUC　
UACCGUUAUUGGUGUAACGUAAUUGU　
CC　-3'　(配列番号：１８)；
（II-8）　SPC-m016:
5'-GGCGAAUUC　
UACCGUUAUUGGUGUAACG　
CC　-3'　(配列番号：１９)；
　一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ０１５、ＳＰＣ－ｍ０１６の推定される二次構造は、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列を含む「ヘアピン・ループ」の構造を含め、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-267の推定される二次構造の主要部を保持している。なお、５'－末端と３'－末端の部分は、二本鎖構造となるように、二つのＧ：Ｃ対を形成可能な塩基配列としている。
　図６－５に示す、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-213の推定される二次構造中、"AUUC"と「ランダム配列部分（Ｎ３０）」の部分が、その二次構造の形成に関与する領域と、実質的に同じ二次構造を形成すると推定される、一本鎖ＲＮＡ分子を設計した。具体的には、図７－５に示す二次構造を形成すると推定される、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ００７を作製した。
（II-9）　SPC-m007:
5'-GG　
GUCCGCACGCAAAGCAUUAUUGUGA　
UUCACUGCAGACUUGAC　C　C　-3'　(配列番号：２０)；
　一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ００７の推定される二次構造は、「５'－　GCAUUAUUGU－３'」を含む「ヘアピン・ループ」状の構造を含め、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-213の推定される二次構造の主要部を保持している。なお、５'－末端と３'－末端の部分は、二本鎖構造となるように、二つのＧ：Ｃ対を形成可能な塩基配列としている。
　上記の一本鎖ＲＮＡ分子、ＳＰＣ－ｍ００９、ＳＰＣ－ｍ０１０、ＳＰＣ－ｍ０１１、ＳＰＣ－ｍ０１２、ＳＰＣ－ｍ０１３、ＳＰＣ－ｍ０１４、ＳＰＣ－ｍ０１５、ＳＰＣ－ｍ０１６が、実際に、ビオチン化SPCと複合体を形成可能であることを、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、検証した。
　具体的には、表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE　3000を利用し、そのセンサ・チップ上に、Streptavidinタンパク質を固定化し、該固定化されたStreptavidinタンパク質にビオチン化SPCを結合させている。
　各一本鎖ＲＮＡ分子について、それぞれ、バインディング・バッファ溶液中に各一本鎖ＲＮＡ分子を５００ｎＭ含有している、「ＲＮＡ試料」液を調製する。センサ・チップ上に、この「ＲＮＡ試料」液を、流速２０μＬ/分で流し、固定化されているStreptavidinタンパク質に結合しているビオチン化SPCと、一本鎖ＲＮＡ分子の複合体を形成させる。この複合体形成過程は、その液温度は、２５℃とし、センサ・チップ上に「ＲＮＡ試料」液を流通させる時間は、２分間としている。
　次いで、複合体の解離過程では、下記の組成の、ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液を、流速２０μＬ/分で、３．５分間流し、センサ・チップ上の「ＲＮＡ試料」液を除去し、複合体の解離を進める。該複合体の解離過程において、その液温度は、２５℃としている。ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液の組成は、HBS　(20　mM　HEPES　pH　7.4,　150　mM　NaCl)　+　5　mM　MgCl2　+　5　mM　KCl　+　0.005%　Tween20である。
　ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液を５分間流した時点で、ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液に代えて、下記の組成のＥＤＴＡ溶液をセンサ・チップ上に、流速６０μＬ/分で流し、残余している一本鎖ＲＮＡ分子の溶出を行った。ＥＤＴＡ溶液の組成は、HBS　(50　mM　HEPES　pH　7.4,　150　mM　NaCl)　+　10　mM　EDTAである。該ＥＤＴＡ溶液の流入によって、センサ・チップ上に残余している、固定化されたビオチン化SPCと一本鎖ＲＮＡ分子の複合体から、金属カチオン種は、ＥＤＴＡとの複合体を形成する結果、除去される。
　この金属カチオン種、特には、Ｍｇ２＋カチオン種の除去に伴って、一本鎖ＲＮＡ分子、ＳＰＣ－ｍ００９、ＳＰＣ－ｍ０１０、ＳＰＣ－ｍ０１１、ＳＰＣ－ｍ０１２、ＳＰＣ－ｍ０１３、ＳＰＣ－ｍ０１４、ＳＰＣ－ｍ０１５、ＳＰＣ－ｍ０１６は、速やかに溶出された。
　図８－１に、一本鎖ＲＮＡ分子：ＳＰＣ－ｍ００９、ＳＰＣ－ｍ０１０、ＳＰＣ－ｍ０１１、ＳＰＣ－ｍ０１２、ＳＰＣ－ｍ０１３、ＳＰＣ－ｍ０１４、ＳＰＣ－ｍ０１５、ＳＰＣ－ｍ０１６について、前記条件を用いて、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した結果を併せて示す。
　図８－１に示す表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化において、一本鎖ＲＮＡ分子：ＳＰＣ－ｍ０１３、ＳＰＣ－ｍ０１４、ＳＰＣ－ｍ０１５、ＳＰＣ－ｍ０１６に関しては、上述のＳＰＣ－２８９、ＳＰＣ－２６７と同様に、その複合体の解離過程は、単一の速度定数ｋｄで表記できず、少なくとも、二つの速度定数ｋｄで特徴付けられる、二種の解離過程として、解析する必要があることが判明した。すなわち、ｋｄが、１０－２　(ｓ－１)以上の「速い解離過程」と、ｋｄが、１０－３　(ｓ－１)以下の「遅い解離過程」が存在するとして、解析する必要があることが判明した。
　図８－１に示す表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化において、一本鎖ＲＮＡ分子：ＳＰＣ－ｍ００９、ＳＰＣ－ｍ０１０、ＳＰＣ－ｍ０１１、ＳＰＣ－ｍ０１２に関しては、上述のＳＰＣ－１９８、ＳＰＣ－２０３と同様に、その複合体の解離過程は、単一の速度定数ｋｄで表記可能であると判断された。
　一本鎖ＲＮＡ分子、ＳＰＣ－ｍ００９、ＳＰＣ－ｍ０１０、ＳＰＣ－ｍ０１１、ＳＰＣ－ｍ０１２に関して、「ＲＮＡ試料」液中に含有される該一本鎖ＲＮＡ分子の濃度を、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭの２倍希釈系列で変化させ、他の条件は上記の条件を用いて、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した。その測定結果に基づき、液温度２５℃、バインディング・バッファ溶液の組成：HBS　(20　mM　HEPES　pH　7.4,　150　mM　NaCl)　+　5　mM　MgCl2　+　5　mM　KClの条件において、ビオチン化SPCと該一本鎖ＲＮＡ分子との複合体形成の速度定数：ｋａ、複合体の解離の速度定数：ｋｄ、ならびに、解離定数ＫＤ＝ｋｄ／ｋａを算出した。
　ＳＰＣ－ｍ００９に対して、算出された値は、ｋａ＝1.24±0.33×１０４　(Ｍ－１ｓ－１)、ｋｄ＝23.1±0.08×１０－４　(ｓ－１)、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ=186±5.05　（ｎＭ）であった。
　ＳＰＣ－ｍ０１０に対して、算出された値は、ｋａ＝（1.17±0.33）×１０４　(Ｍ－１ｓ－１)、ｋｄ＝29.5±0.09×１０－４　(ｓ－１)、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ=252±7.04　（ｎＭ）であった。
　ＳＰＣ－ｍ０１１に対して、算出された値は、ｋａ＝1.13±0.25×１０４　(Ｍ－１ｓ－１)、ｋｄ＝24.9±0.06×１０－４　(ｓ－１)、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ=221±4.84　（ｎＭ）であった。
　ＳＰＣ－ｍ０１２に対して、算出された値は、ｋａ＝1.11±0.17×１０４　(Ｍ－１ｓ－１)、ｋｄ＝21.8±0.04×１０－４　(ｓ－１)、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ=196±2.98　（ｎＭ）であった。
　複合体の解離過程の類似性を考慮すると、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m009、SPC-m010と、ビオチン化SPCとの複合体形成部位は、共通している判断される。さらに、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-198とビオチン化SPCとの複合体形成部位と、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m009、SPC-m010と、ビオチン化SPCとの複合体形成部位は、実質的に共通していると推断される。
　また、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m011、SPC-m012と、ビオチン化SPCとの複合体形成部位は、共通している判断される。さらに、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-203とビオチン化SPCとの複合体形成部位と、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m011、SPC-m012と、ビオチン化SPCとの複合体形成部位は、実質的に共通していると推断される。
　従って、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m009、SPC-m010、およびSPC-198ならびに、SPC-m011、SPC-m012、およびSPC-203においては、ビオチン化SPCとの複合体形成部位は、それぞれ、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-m010、SPC-m012において推定される二次構造中に存在すると、推断される。
　また、複合体の解離過程は、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m013、SPC-m014と、ビオチン化SPCとの複合体でも、互いに共通している判断される。すなわち、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m013、SPC-m014と、ビオチン化SPCとの複合体形成部位は、共通していると判断される。さらには、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-289とビオチン化SPCとの複合体形成部位と、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m013、SPC-m014と、ビオチン化SPCとの複合体形成部位は、実質的に共通していると推断される。
　従って、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m013、SPC-m014、ならびに、SPC-289においては、ビオチン化SPCとの複合体形成部位は、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-m014において推定される二次構造中に存在すると、推断される。
　また、複合体の解離過程は、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m015、SPC-m016と、ビオチン化SPCとの複合体でも、互いに共通している判断される。すなわち、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m015、SPC-m016と、ビオチン化SPCとの複合体形成部位は、共通している判断される。さらには、少なくとも「速い解離過程」を与える、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-267とビオチン化SPCとの複合体形成部位と、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m015、SPC-m016と、ビオチン化SPCとの複合体形成部位は、実質的に共通していると推断される。
　従って、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m015、SPC-m016、ならびに、SPC-267においては、少なくとも「速い解離過程」を与える、ビオチン化SPCとの複合体形成部位は、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-m016において推定される二次構造中に存在すると、推断される。
　加えて、一本鎖ＲＮＡ分子、ＳＰＣ－ｍ００７が、実際に、ビオチン化SPCと複合体を形成可能であることを、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、検証した。
　具体的には、表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE　3000を利用し、そのセンサ・チップ上に、Streptavidinタンパク質を固定化し、該固定化されたStreptavidinタンパク質にビオチン化SPCを結合させている。
　該一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-m007に関して、「ＲＮＡ試料」液中に含有される該一本鎖ＲＮＡ分子の濃度を、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭの２倍希釈系列で変化させ、他の条件は上記の条件を用いて、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した。図８－２に、液温度２５℃における、該SPC-m007に対する測定結果を示す。
　なお、クローン・ファミリーＨの一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-213と同様に、該一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-m007も、ＥＤＴＡ溶液を利用して、金属カチオン種、特には、Ｍｇ２＋カチオン種の除去を行った際、固定化されたビオチン化SPCと複合体を形成した状態に保たれていた。
　図８－２に示す表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化において、一本鎖ＲＮＡ分子：ＳＰＣ－ｍ００７に関しては、上述のＳＰＣ－２１３と同様に、その複合体の解離過程は、単一の速度定数ｋｄで表記可能であると判断された。
　図８－２に示す測定結果に基づき、液温度２５℃、バインディング・バッファ溶液の組成：HBS　(50　mM　HEPES　pH　7.4,　150　mM　NaCl)　+　5　mM　MgCl2　+　5　mM　KClの条件において、ビオチン化SPCと該一本鎖ＲＮＡ分子との複合体形成の速度定数：ｋａ、複合体の解離の速度定数：ｋｄ、ならびに、解離定数ＫＤ＝ｋｄ／ｋａを算出した。
　ＳＰＣ－ｍ００７に対して、算出された値は、ｋａ＝5.18±0.26×１０３　(Ｍ－１ｓ－１)、ｋｄ＝1.23±0.03×１０－３　(ｓ－１)、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ=238±11.8　（ｎＭ）であった。
　複合体の解離過程の類似性を考慮すると、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-213とビオチン化SPCとの複合体形成部位と、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m007とビオチン化SPCとの複合体形成部位は、実質的に共通していると判断される。従って、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m007、ならびに、SPC-213においては、ビオチン化SPCとの複合体形成部位は、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-m007において推定される二次構造中に存在すると、推断される。
　さらに、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-198とビオチン化SPCとの複合体形成部位には、ビオチン化SPCと類似する構造を有する、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンも複合体形成可能であると推測される。
　実際に、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-198は、ビオチン化SPCと同様に、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンとも複合体を形成可能であることを、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、検証した。
　具体的には、表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE　3000を利用し、そのセンサ・チップ上に、Streptavidinタンパク質を固定化し、該固定化されたStreptavidinタンパク質に、下記のビオチン化SPC、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンを結合させている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 　該一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-198に関して、「ＲＮＡ試料」液中に含有される該一本鎖ＲＮＡ分子の濃度を、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭの２倍希釈系列で変化させ、他の条件は上記の条件を用いて、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した。
　図９－１、図９－２、図９－３に、液温度２５℃における、該SPC-198の、ビオチン化SPC、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の測定結果を、対比させて示す。
　図９－１、図９－２、図９－３に示す表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化において、一本鎖ＲＮＡ分子：ＳＰＣ－１９８に関しては、上述のビオチン化SPCとの複合体と同様に、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンとの複合体の解離過程は、単一の速度定数ｋｄで表記可能であると判断された。
　図９－１、図９－２、図９－３に示す測定結果に基づき、液温度２５℃、バインディング・バッファ溶液の組成：HBS　(20　mM　HEPES　pH　7.4,　150　mM　NaCl)　+　5　mM　MgCl2　+　5　mM　KClの条件において、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンと該一本鎖ＲＮＡ分子との複合体形成の速度定数：ｋａ、複合体の解離の速度定数：ｋｄ、ならびに、解離定数ＫＤ＝ｋｄ／ｋａを算出した。
　SPC-198とビオチン化S1Pとの複合体形成・解離に対して、算出された値は、ｋａ＝1.13±0.04×１０４　(Ｍ－１ｓ－１)、ｋｄ＝7.88±0.07×１０－４　(ｓ－１)、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ=69.9±2.84　（ｎＭ）であった。
　SPC-198とビオチン化スフィンゴシンとの複合体形成・解離に対して、算出された値は、ｋａ＝4.97±0.04×１０４　(Ｍ－１ｓ－１)、ｋｄ＝4.91±0.04×１０－４　(ｓ－１)、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ=9.88±0.11　（ｎＭ）であった。
　なお、SPC-198とビオチン化SPCとの複合体形成・解離に対して、算出された値は、ｋａ＝1.29±0.02×１０４　(Ｍ－１ｓ－１)、ｋｄ＝2.94±0.02×１０－４　(ｓ－１)、ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ=22.8±0.33　（ｎＭ）であった。
　複合体の解離過程に関して、SPC-198とビオチン化SPCとの複合体、SPC-198とビオチン化S1Pとの複合体、SPC-198とビオチン化スフィンゴシンとの複合体は、実質的に同じであると、判断される。すなわち、SPC-198とビオチン化SPCとの複合体、SPC-198とビオチン化S1Pとの複合体、SPC-198とビオチン化スフィンゴシンとの複合体において、該複合体中における、分子間の相互作用は、実質的に差違が無いと推断される。
　さらに、SPC-198に加えて、SPC-203,　SPC-267,　SPC-289,　SPC-213,ならびに、SPC-m009,　SPC-m010,　SPC-m011,　SPC-m012,　SPC-m013,　SPC-m014,　SPC-m015,　SPC-m016においても、そのビオチン化SPCとの複合体形成部位には、ビオチン化SPCと類似する構造を有する、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンも複合体形成可能であると推測される。
　実際に、前記一本鎖ＲＮＡ分子のいずれもが、ビオチン化SPCと同様に、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンとも複合体を形成可能であることを、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、検証した。
　具体的には、表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE　3000を利用し、そのセンサ・チップ上に、Streptavidinタンパク質を固定化し、該固定化されたStreptavidinタンパク質に、ビオチン化SPC、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンを結合させている。
　一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-198,　SPC-203,　SPC-267,　SPC-289,　SPC-213に関しては、「ＲＮＡ試料」液中に含有される該一本鎖ＲＮＡ分子の濃度を、４００ｎＭとし、他の条件は上記の条件を用いて、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した。また、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-m009,　SPC-m010,　SPC-m011,　SPC-m012,　SPC-m013,　SPC-m014,　SPC-m015,　SPC-m016に関しては、「ＲＮＡ試料」液中に含有される該一本鎖ＲＮＡ分子の濃度を、８００ｎＭとし、他の条件は上記の条件を用いて、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した。
　図１０－１、図１０－２、図１０－３に、液温度２５℃における、SPC-198,　SPC-203,　SPC-267,　SPC-289,　SPC-213,ならびに、SPC-m009,　SPC-m010,　SPC-m011,　SPC-m012,　SPC-m013,　SPC-m014,　SPC-m015,　SPC-m016の各一本鎖ＲＮＡ分子について、ビオチン化SPC、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の測定結果を、対比させて示す。
　各一本鎖ＲＮＡ分子において、ビオチン化S1Pとの複合体の解離過程と、ビオチン化スフィンゴシンとの複合体の解離過程とを比較すると、その時間的変化は、実質的に同じであると判断される。すなわち、各一本鎖ＲＮＡ分子において、一旦形成された、該一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化S1Pとの複合体、該一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化スフィンゴシンとの複合体中おける、一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化S1P分子間の相互作用と、一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化スフィンゴシン分子間の相互作用は、実質的に差違が無いと推断される。
　一方、複合体の形成過程において、該一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化S1Pとの複合体の生成量、該一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化スフィンゴシンとの複合体の生成量には、顕著な差違が存在している。この結果は、ビオチン化S1Pのうち、複合体形成可能な形状を有するものの比率と、ビオチン化スフィンゴシンのうち、複合体形成可能な形状を有するものの比率とが、顕著に異なっていることを示唆していると、解釈される。
　具体的には、ビオチン化S1Pでは、そのリン酸基（－Ｏ－ＰＯ（ＯＨ）２）は、一価のアニオン（－Ｏ－ＰＯ（ＯＨ）－Ｏ－）と二価のアニオン（－Ｏ－ＰＯ３ ２－）の二つのイオン化状態を取り得るが、その一方のみが、一本鎖ＲＮＡ分子と複合体形成可能であると、推測される。さらには、ビオチン化S1Pのリン酸基は、一価のアニオンとなった際、遊離のアニオン種（－Ｏ－ＰＯ（ＯＨ）－Ｏ－）と、金属カチオン種が配位した状態（例えば、－Ｏ－ＰＯ（ＯＨ）－Ｏ－：Ｍｇ２＋）が想定され、また、二価のアニオンとなった際、遊離のアニオン種（－Ｏ－ＰＯ３ ２－）と、金属カチオン種が配位した状態（例えば、－Ｏ－ＰＯ３ ２－：Ｍｇ２＋）が想定され、これらの形状の一つが、複合体形成可能であると、推測される。その場合、ビオチン化S1Pのうち、複合体形成可能な形状を有するものの比率は、液温度、液の組成に依存して、変動すると推断される。
　それ対して、ビオチン化スフィンゴシンは、イオン化状態は存在していないので、ビオチン化スフィンゴシンのうち、複合体形成可能な形状を有するものの比率は、高い状態となっている。
　一方、各一本鎖ＲＮＡ分子において、ビオチン化SPCとの複合体の解離過程と、ビオチン化スフィンゴシンとの複合体の解離過程とを比較すると、その時間的変化は、類似しているが、若干の差違が見出される。
　特に、複合体の解離過程は、単一の速度定数ｋｄで表記できず、少なくとも、二つの速度定数ｋｄで特徴付けられる、二種の解離過程として、解析する必要かあると判断される、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-267,　SPC-289ならびに、SPC-m013,　SPC-m014,　SPC-m015,　SPC-m016において、「速い解離過程」と「遅い解離過程」の寄与の比率は、ビオチン化SPCとの複合体とビオチン化スフィンゴシンとの複合体との間で、有意な差違がある。
　一方、複合体の解離過程が、単一の速度定数ｋｄで表記可能であると判断される、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-198,　SPC-203,　SPC-213に関しては、複合体の解離過程は、ビオチン化SPCとの複合体とビオチン化スフィンゴシンとの複合体との間で、実質的に同じであると見做すことが可能である。従って、これらの一本鎖ＲＮＡ分子においては、一旦形成される複合体では、一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化SPC分子間の相互作用と、一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化スフィンゴシン分子間の相互作用は、実質的に差違が僅かであると推断される。
　実際に、液の組成によって、複合体の形成過程において、一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化S1Pとの複合体の生成量、一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化スフィンゴシンとの複合体の生成量、一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化SPCとの複合体の生成量が変動することを示唆する結果が得られている。
　具体的には、複合体の形成過程に使用される、バインディング・バッファ溶液の組成として、
１×buffer：50　mM　HEPES(pH　7.4)　+　150　mM　NaCl　+　5　mM　MgCl2
0.１×buffer：5　mM　HEPES(pH　7.4)　+　15　mM　NaCl　+　5　mM　MgCl2
上記の二種を使用して、一本鎖ＲＮＡ分子：SPC-198について、複合体の形成過程において、一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化S1Pとの複合体の生成量、一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化スフィンゴシンとの複合体の生成量、一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化SPCとの複合体の生成量の相違を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、観測した。
　表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE　3000を利用し、そのセンサ・チップ上に、Streptavidinタンパク質を固定化し、該固定化されたStreptavidinタンパク質に、ビオチン化SPC、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンを結合させている。
　該一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-198に関して、上記の二種類のバインディング・バッファ溶液を用いて、「ＲＮＡ試料」液中に含有される該一本鎖ＲＮＡ分子の濃度を、４００ｎＭとして、二種の「ＲＮＡ試料」液を調製する。ランニング・バッファ溶液にも、上記の二種のバインディング・バッファ溶液を用い、他の条件は上記の条件を用いて、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を測定した。
　図１１に、上記の二種のバインディング・バッファ溶液を用いた際に測定された、液温度２５℃での、複合体形成過程、複合体の解離過程における、表面プラズモン共鳴シグナル強度の時間的変化を併せて示す。
　１×bufferを用いた場合と0.１×bufferを用いた場合の間で、複合体の形成過程において、
　一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化S1Pとの複合体の生成量の比は、40/320;
　一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化スフィンゴシンとの複合体の生成量の比は、510/800；
　一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化SPCとの複合体の生成量の比は、240/860
となっている。
　すなわち、形成された複合体の解離過程の速度定数ｋｄは、実質的に等しいと見做せ、
　また、複合体の形成過程の速度定数ｋaも、僅かに相違するのみであるが、
　複合体の生成量は、有意な相違が生じている。
　その理由として、二種のバインディング・バッファ溶液の組成の相違に起因して、ビオチン化S1P、ビオチン化SPCにおいては、複合体の形成に関与する分子種の存在比率が有意に変化していることが推測される。
　（第三の形態）
　上記の本発明の第二の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマー：SPC-m009,　SPC-m010,ならびに、SPC-m011,　SPC-m012における、ビオチン化SPCとの複合体形成部位の推定結果から、SPC-m010あるいはSPC-m012の推定二次構造と類似する二次構造を有する一本鎖ＲＮＡ分子は、同様にビオチン化SPCに対する結合能を有すると推断される。
　実際に、SPC-m009,　SPC-m010,　SPC-m011,　SPC-m012,　SPC-m013,　SPC-m014,　SPC-m015,　SPC-m016の各一本鎖ＲＮＡ分子のｃＤＮＡの塩基配列を対比した結果を、図１２に示す。その対比から、ビオチン化SPCとの複合体形成に大きな寄与を示す部分、"Critical　region"が、特定された。
　例えば、SPC-m009の推定二次構造において、この"Critical　region"を示すと、図１３に示す部位となっている。
　上記推断に基づき、本発明の第三の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーを、図１４に示す、全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」を利用して、ＳＥＬＥＸ・スクリーニング法を適用して選別している。
　該全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」に含まれる一本鎖ＲＮＡ分子は、ビオチン化SPCとの複合体形成に大きな寄与を示す部分、"Critical　region"に相当する部分配列として、SPC-198,　SPC-m009,　SPC-m010の推定二次構造において、"Hair　pin"ループを構成する"UACCGUUAUUGGUG"を採用している。また、二本鎖構造を構成可能な部位として、５'末端側に"GACAUCCGG"、３'末端側に"CCGGAUGUC"を設けている。
　（第三の実施態様）
　第三の実施態様では、本発明の第三の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーを選別する工程の一例を以下に説明する。
　上記のように、本発明の第一の形態にかかるＲＮＡアプタマー分子と、それから設計される、本発明の第二の形態にかかるＲＮＡアプタマー分子においては、そのビオチン化SPCとの複合体形成部位は、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンとの複合体形成部位としても、機能していると推断される。
　特に、上記の本発明の第一の形態にかかるＲＮＡアプタマー分子と、本発明の第二の形態にかかるＲＮＡアプタマー分子では、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、観測された、ビオチン化SPCとの複合体の生成量：ＰＳＰＣ、ビオチン化スフィンゴシンとの複合体の生成量：ＰＳｐｈ、ビオチン化S1Pとの複合体の生成量：ＰＳ１Ｐは、通常、ＰＳｐｈ＞ＰＳＰＣ≫ＰＳ１Ｐとなっていた。
　第三の実施態様では、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、観測される、前記三種の複合体の生成量が、ＰＳＰＣ＞ＰＳｐｈ≫ＰＳ１Ｐの関係を満たす、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーの選別を試みている。
　具体的には、ビオチン化SPCとの複合体形成に大きな寄与を有する、"Hair　pin"ループの形状を示す領域を内在し、全体として、"Hair　pin"状の二次構造を形成可能な、下記の全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」を利用して、ビオチン化SPCに対する結合能を具えている「ＲＮＡアプタマー分子」の選別を行った。該全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー」は、
　５'末端の固定領域：GGCAACCACGACAUCCGG；（１８塩基）
　６塩基長の第一ランダム配列部分：Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５Ｎ６；（６塩基）
　「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列を含む
　"Hair　pin"ループ形成用の定常領域：UACCGUUAUUGGUG；（１４塩基）
　６塩基長の第二ランダム配列部分：Ｎ'６Ｎ'５Ｎ'４Ｎ'３Ｎ'２Ｎ'１；（６塩基）
　３'末端の固定領域：CCGGAUGUCACACACACG；（１８塩基）
を具えている。
　第三の実施態様では、下記の表４に記載する条件を採用して、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーの選別を行っている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
 　表４に示す選択条件では、ビーズ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドを５ラウンド繰り返し、ビオチン化SPCに対して結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子の濃縮を行っている。最終的に、濃縮されたビオチン化SPCに対して結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子から、表面プラズモン共鳴測定装置を利用する、ＳＥＬＥＸ選択ラウンドを２ラウンド行って、ビオチン化SPCに加えて、遊離のSPCに対して結合能を有する一本鎖ＲＮＡ分子を選別している。
　また、ビーズ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドでは、「アガロース・ビーズ上の固定化Streptavidinタンパク質」（SA　bead）、「アガロース・ビーズ上の固定化Neutravidinタンパク質」（NA　bead）にビオチン化SPCを結合させたものを、交互に使用している。このビーズの種類を変更することによって、アガロース・ビーズ自体、あるいはビーズ上に固定化されている、Streptavidinタンパク質またはNeutravidinタンパク質に対する結合能を有する「一本鎖ＲＮＡ分子」の濃縮を抑制している。
　さらに、各ラウンドで使用される「ＲＮＡプール」に対して、S1Pビーズを用いる「S1P-bead-selection操作」とスフィンゴシン・ビーズを用いる「Sphingosine-bead-selection操作」を施すことで、ビオチン化S1Pと複合体形成する一本鎖ＲＮＡ分子、ならびに、ビオチン化スフィンゴシンと複合体形成する一本鎖ＲＮＡ分子の含有比率を予め低減している。
　図１５に、「S1P-bead-selection操作」、「Sphingosine-bead-selection操作」ならびに「SPC-bead-selection工程」とで構成される、ビーズ分離法を利用するＳＥＬＥＸ選択ラウンドの工程フローを模式的に示す。
　該S1Pビーズは、「アガロース・ビーズ上の固定化Streptavidinタンパク質」（SA　bead）、「アガロース・ビーズ上の固定化Neutravidinタンパク質」（NA　bead）にビオチン化S1Pを結合させたものである。「S1P-bead-selection操作」では、該S1Pビーズ２５μｌに、２５μｌの「ＲＮＡプール」液を加え、１０～２０分間インキュベーション後、遠心分離装置によりスピンダウンさせる。その上清を、素通り画分として、回収する。
　該スフィンゴシン・ビーズは、「アガロース・ビーズ上の固定化Streptavidinタンパク質」（SA　bead）、「アガロース・ビーズ上の固定化Neutravidinタンパク質」（NA　bead）にビオチン化スフィンゴシンを結合させたものである。「Sphingosine　-bead-selection操作」では、該スフィンゴシン・ビーズ２５μｌに、「S1P-bead-selection操作」で回収した、２５μｌの「素通り画分」を１０～２０minインキュベーション後、遠心分離装置によりスピンダウンさせる。その上清を、素通り画分として、回収する。
　「SPC-bead-selection工程」は、「アガロース・ビーズ上の固定化Streptavidinタンパク質」（SA　bead）、「アガロース・ビーズ上の固定化Neutravidinタンパク質」（NA　bead）にビオチン化SPCを結合させた「SPCビーズ」を利用して、「Sphingosine-bead-selection操作」で回収される「素通り画分」をスクリーニングする。
　なお、利用されるバインディング・バッファ溶液の組成は、50　mM　HEPES(pH　7.4)　+　150　mM　NaCl　+　5　mM　MgCl2　+　0.005％　Tween20である。
　「初回ラウンド」用の「ＲＮＡプール」の調製は、下記の手順で実施している。
　上記の全長６２塩基長の「一本鎖ＲＮＡ分子ライブラリー（ＲＮＡプール）」を構成する一本鎖ＲＮＡ分子は、下記の「二本鎖ＤＮＡ分子ライブラリー」を構成する、二本鎖ＤＮＡ分子を転写テンプレートとして利用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写によって調製する。
　「二本鎖ＤＮＡ分子ライブラリー」を構成する、各二本鎖ＤＮＡ分子は、下記の「Ｔ７プロモーター領域」、５'末端の固定領域、３０塩基長のランダム配列部分、３'末端の固定領域からなる塩基配列Ｒｃａｎｄｉｄａｔｅ1を有している。
　５'末端の「Ｔ７プロモーター領域」：GATAATACGACTCACTATA；（１９塩基）
　５'末端の固定領域：GGCAACCACGACATCCGG；（１８塩基）
　６塩基長の第一ランダム配列部分：Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５Ｎ６；（６塩基）
　「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列を含む
　"Hair　pin"ループ形成用の定常領域：TACCGTTATTGGTG；（１４塩基）
　６塩基長の第二ランダム配列部分：Ｎ'６Ｎ'５Ｎ'４Ｎ'３Ｎ'２Ｎ'１；（６塩基）
　３'末端の固定領域：CCGGATGTCACACACACG；（１８塩基）
　各回のラウンドの「SPC-bead-selection工程」では、ビーズ上に固定化されているビオチン化SPCと「ＲＮＡプール」を接触させる際、その液温度は、２５℃とし、その時間：「Incubation　Time」は、表４に示す。
　なお、「S1P-bead-selection操作」、「Sphingosine-bead-selection操作」を実施する際も、その液温度は、２５℃としている。
　各回のラウンドの「SPC-bead-selection工程」における、ビーズ上に固定化されているビオチン化SPCと「ＲＮＡプール」を接触させた後、固液分離により、「ＲＮＡプール」を除去する。次いで、該ビーズに非選択的に付着している一本鎖ＲＮＡ分子を洗浄除去するため、洗浄工程を設けている。該洗浄工程では、ＲＮＡ分子を含まないバインディング・バッファ溶液を利用して、その液温度は、２５℃とし、「ＲＮＡプール」の液量（ＣＶ）を基準として、表４に記載する、合計液量（回数）を用いて、洗浄を行っている。
　洗浄工程を終えた後、固液分離により、ビーズを回収する。回収された、ビーズ上に固定化されているビオチン化SPCと複合体形成している一本鎖ＲＮＡ分子を、高濃度Urea溶液を利用して、溶出させ、一本鎖ＲＮＡ分子のみを回収する。このUrea溶出工程で利用する、高濃度Urea溶液の組成は、７ＭUreaを含むHBS（50　mM　HEPES(pH　7.4)　+　150　mM　NaCl）溶液であり、該高濃度Urea溶液中において、液温度９０℃の加熱処理（boiling　処理）を、５分間行っている。該"boiling"処理を施す際、該温度条件下では、一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造、ならびに三次構造は解消される（"unfolding"される）結果、該一本鎖ＲＮＡ分子は、変性剤の尿素の高濃度溶液中に溶出される。
　「２回ラウンド」以降で利用する「ＲＮＡプール」は、前段のラウンドで回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」より調製される、二本鎖ｃＤＮＡ分子を転写テンプレートとして利用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写によって調製する。
　回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」を鋳型として、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製する工程では、下記のForward　Primer　2　とReverse　Primer　2を利用して、RT-PCR法を適用する。
　Forward　Primer　2：（配列番号：４１）
　5'-　GATAATACGACTCACTATA　GGCAACCACGACATCCGG　-3'
　Reverse　Primer　2：（配列番号：４２）
　5'-　GTGTGTGTCACATCCGG　-3'
 
　前記Reverse　Primer　2は、回収される「一本鎖ＲＮＡ分子」の３'末端の固定領域と相補的な塩基配列である。
　5'-　CCGGAUGUCACACACACG-3'
　3'-　GGCCTACACTGTGTGTG　-5'
 
　前記Forward　Primer　2は、「Ｔ７プロモーター領域」として利用可能な塩基配列と、回収される「一本鎖ＲＮＡ分子」の５'末端の固定領域の大部分とで構成されている。
　「Ｔ７プロモーター領域」：5'-　GATAATACGACTCACTATA　-3'
　５'末端の固定領域の大部分：5'-　GGCAACCACGACATCCGG　-3'
 
　その結果、回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」を鋳型として調製される、二本鎖ｃＤＮＡ分子の塩基配列は、５'末端にForward　Primer　2に起因する領域、３'末端にReverse　Primer　2に相補的な領域、その間に、回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」の「６塩基長の第一ランダム配列部分」、"Hair　pin"ループ形成用の定常領域、「６塩基長の第二ランダム配列部分」に由来する領域とで構成されている。
　Forward　Primer　1　に起因する領域：
　GATAATACGACTCACTATA　GGCAACCACGACATCCGG
　「６塩基長の第一ランダム配列部分」、"Hair　pin"ループ形成用の定常領域、「６塩基長の第二ランダム配列部分」に由来する領域：
　Ｎ１Ｎ２Ｎ３Ｎ４Ｎ５Ｎ６UACCGUUAUUGGUG　Ｎ'６Ｎ'５Ｎ'４Ｎ'３Ｎ'２Ｎ'１
　Reverse　Primer　2　に相補的な領域：
　CCGGAUGUCACACACAC　
 
　調製された二本鎖ｃＤＮＡ分子を転写テンプレートとして利用して、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写により調製される「一本鎖ＲＮＡ分子」は、前段のラウンドで回収された「一本鎖ＲＮＡ分子」とは、その「ランダム配列部分」の頻度分布は、本質的に同じ分布を示すものとなっている。
　調製された「一本鎖ＲＮＡ分子」は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写反応溶液から回収し、上記のバインディング・バッファ溶液中に、所定の濃度で溶解して、次段ラウンドで利用する「ＲＮＡプール」とする。なお、「一本鎖ＲＮＡ分子」に対して、"folding"処理を施す。その結果、一本鎖ＲＮＡ分子の鎖間における、「相補的な部分塩基配列」間で構成される二本鎖構造は解消され、各一本鎖ＲＮＡ分子は、それぞれ、鎖内で形成される二本鎖構造のみを内在する、三次構造を有するものとなっている。
　回収された溶出液中に含まれる一本鎖ＲＮＡ分子は、エタノール沈澱処理を施し、遠心して、沈澱画分として分離回収する。該７回目のラウンドにおいて、分離回収された、一本鎖ＲＮＡ分子を鋳型として、同様に、RT-PCR法を応用して、二本鎖ｃＤＮＡ分子を調製する。
　調製された二本鎖ｃＤＮＡ分子を溶解する液の一部を使用して、含有される二本鎖ｃＤＮＡ分子を、市販のＴＡクローニング・キット（プロメガ株式会社）を利用して、クローニングする。具体的には、当該キットに添付される標準プロトコルに従って、ＲＴ－ＰＣＲによる増幅産物（二本鎖ＤＮＡ分子）群を、クローニングベクター；ｐＧＥＭ－Ｔ－Ｅａｓｙ　へ、ライゲーションする。このライゲーション後、クローニングベクターにより、大腸菌株Ｍａｃｈ１（インビトロジェン）を形質転換させる。
　次いで、前記クローニングベクター由来の選択マーカーを利用し、定法に従って、クローニングベクターを保持する形質転換株をコロニー選別する。
　上記７回目のラウンドにおいて、分離回収された、一本鎖ＲＮＡ分子から作製したクローンのうち、無作為に４１クローンを選び、各クローンが保持する、一本鎖ＲＮＡ分子のｃＤＮＡの塩基配列を解析した。解析された４１クローンが保持する、一本鎖ＲＮＡ分子のｃＤＮＡの塩基配列を対比したところ、同じ塩基配列を有するクローンが複数存在している塩基配列が、３種類存在していた。また、前記３種類の塩基配列に対して、「６塩基長の第一ランダム配列部分」、「６塩基長の第二ランダム配列部分」の部分塩基配列が類似している、塩基配列も見出された。それらを含め、３種類のクローン・ファミリーが存在することが判明した。図１６に、３種類のクローン・ファミリーに分類される、一本鎖ＲＮＡ分子のｃＤＮＡの塩基配列、ならびに、いずれのファミリーにも分類されない、一本鎖ＲＮＡ分子のｃＤＮＡの塩基配列を纏めて示す。
　なお、上記の選別工程において、ＥＤＴＡ溶出によって、ビオチン化SPCとの複合体から速やかに解離されており、選別された一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化SPCとの複合体中には、Ｍｇ２＋カチオン種が含まれていると、判断される。また、Ｍｇ２＋カチオン種を除去することで、選別された一本鎖ＲＮＡ分子とビオチン化SPCとの複合体は、速やかに解離可能な形態であると推断される。
　図１６に示す、クローン・ファミリー１に分類される一本鎖ＲＮＡ分子；SPC-514,　SPC-520,　SPC-524,　SPC-556,　SPC-546,　SPC-562,　SPC-536,　SPC-551,　SPC-583、クローン・ファミリー２に分類される一本鎖ＲＮＡ分子；SPC-501,　SPC-569,　SPC-511、クローン・ファミリー３に分類される一本鎖ＲＮＡ分子；SPC-548,　SPC-547について、実際に、ビオチン化SPCに対する結合能を有することを、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、検証した。
　具体的には、表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE　3000を利用し、そのセンサ・チップ上に、Streptavidinタンパク質を固定化し、該固定化されたStreptavidinタンパク質にビオチン化SPCを結合させている。
　各クローンの一本鎖ＲＮＡ分子について、それぞれ、バインディング・バッファ溶液中に各一本鎖ＲＮＡ分子を４００ｎＭ含有している、「ＲＮＡ試料」液を調製する。センサ・チップ上に、この「ＲＮＡ試料」液を、流速２０μＬ/分で流し、固定化されているStreptavidinタンパク質に結合しているビオチン化SPCと、一本鎖ＲＮＡ分子の複合体を形成させる。この複合体形成過程は、その液温度は、２５℃とし、センサ・チップ上に「ＲＮＡ試料」液を流通させる時間は、２分間としている。
　次いで、複合体の解離過程では、下記の組成の、ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液を、流速２０μＬ/分で流し、センサ・チップ上の「ＲＮＡ試料」液を除去し、複合体の解離を進める。該複合体の解離過程において、その液温度は、２５℃としている。ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液の組成は、50　mM　HEPES(pH　7.4)　+　150　mM　NaCl　+　5　mM　MgCl2である。
　対比のため、SPC-198，SPC-m012に関しても、同じ条件で測定を行っている。
　さらには、ビオチン化S1Pに対する結合能、ビオチン化スフィンゴシンに対する結合能に関して、同様の条件で測定を行った。
　図１７－１～図１７－３には、上記の３種のクローン・ファミリーの分類された、本発明の第三の実施態様にかかる、ビオチン化SPCに対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」について、ビオチン化SPC、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動を、液温度２５℃で、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を併せて示す。
　SPC-198，SPC-m012に関して、液温度２５℃で、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、観測された、ビオチン化SPCとの複合体の生成量：ＰＳＰＣ、ビオチン化スフィンゴシンとの複合体の生成量：ＰＳｐｈ、ビオチン化S1Pとの複合体の生成量：ＰＳ１Ｐは、ＰＳｐｈ＞ＰＳＰＣ≫ＰＳ１Ｐとなっている。
　それに対して、第三の実施態様で選別された一本鎖ＲＮＡ分子においては、液温度２５℃で、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、観測される、ビオチン化SPCとの複合体の生成量：ＰＳＰＣ、ビオチン化スフィンゴシンとの複合体の生成量：ＰＳｐｈ、ビオチン化S1Pとの複合体の生成量：ＰＳ１Ｐが、ＰＳＰＣ≧ＰＳｐｈ≫ＰＳ１Ｐの関係を満たすものが、相当の比率で見出されている。
　特に、複合体の解離過程の挙動に着目すると、第三の実施態様で選別された一本鎖ＲＮＡ分子においては、ビオチン化SPCとの複合体解離の速度定数ｋｄＳＰＣ、ビオチン化スフィンゴシンとの複合体解離の速度定数ｋｄＳｐｈ、ビオチン化S1Pとの複合体解離の速度定数ｋｄＳ１Ｐは、見掛け上、ｋｄＳＰＣ≪ｋｄＳｐｈ≒ｋｄＳ１Ｐの関係となっている。
　一般に、複合体の解離過程は、液温度が上昇するとともに、複合体解離の速度定数ｋｄは増加する。この液温度の上昇に伴う、複合体解離の速度定数ｋｄの増加の程度について、SPC-198，SPC-m012と、第三の実施態様で選別された、SPC-520,　SPC-524に関して、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価を行った。
　図１８－１と図１８－２に、SPC-198、SPC-m012、ならびに、SPC-524、SPC-520について、液温２５℃、３７℃の二温度条件における、ビオチン化SPC、ビオチン化S1P、ビオチン化スフィンゴシンに対する、複合体形成過程、複合体の解離過程の挙動を、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、評価した結果の一例を対比して示す。
　SPC-524、SPC-520においては、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、観測される、ビオチン化SPCとの複合体の生成量：ＰＳＰＣ、ビオチン化スフィンゴシンとの複合体の生成量：ＰＳｐｈ、ビオチン化S1Pとの複合体の生成量：ＰＳ１Ｐは、液温度３７度においても、ＰＳＰＣ＞ＰＳｐｈ≫ＰＳ１Ｐの関係を満たしている。
　クローン・ファミリー１に分類される一本鎖ＲＮＡ分子；SPC-514,　SPC-520,　SPC-524,　SPC-556,　SPC-546,　SPC-562,　SPC-536,　SPC-551,　SPC-583、クローン・ファミリー２に分類される一本鎖ＲＮＡ分子；SPC-501,　SPC-569,　SPC-511、クローン・ファミリー３に分類される一本鎖ＲＮＡ分子；SPC-548,　SPC-547について、そのｃＤＮＡの塩基配列の対比を行った結果を、図１９に示す。
　その対比の結果、"Hair　pin"ループ形成用の定常領域の塩基配列が、本来の塩基配列である"TACCGTTATTGGTG"ではなく、"TACCGTTATTGGAG"に変異しているものが、過半数を超えていることが判る。また、"TACCGTTATTGGTG"に保持されているクローンに比べて、"TACCGUUATTGGAG"に変異しているクローンでは、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、観測される、ビオチン化SPCとの複合体の生成量：ＰＳＰＣが相対的に高くなっていることも判明した。
　（第四の形態）
　上記の本発明の第三の形態にかかる一本鎖ＲＮＡ分子において、図１４に示す推定二次構造において特徴的な"Hair　pin"ループ形成に適する、"UACCGUUAUUGGUG"が"UACCGUUAUUGGAG"に変異すると、当該部分の二次構造は、異なっていると推断される。実際に、SPC-524について、その二次構造の推定を行った結果を、図２０に示す。「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列は、"Hair　pin"ループを形成しているが、二重鎖構造を構成すべき部分が、部分的に異なる構造を形成すると推定された。
　本発明の第四の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーは、上記の本発明の第三の形態にかかるＲＮＡアプタマー分子中、"Hair　pin"ループ形成に関与する部分として、本来の"UACCGUUAUUGGUG"に代えて、"UACCGUUAUUGGAG"を用いて形成される二次構造と、実質的に同じ二次構造を形成することで、スフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を保持している。
　（第四の実施態様）
　第四の実施態様では、本発明の第四の形態にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有するアプタマーを設計する工程の一例を以下に説明する。
　SPC-573は、その３'末端の固定領域の一部が欠損しているにも拘わらず、ビオチン化SPCに対する結合能を有している。従って、６塩基長の第一ランダム配列部分と６塩基長の第二ランダム配列部分とで構成される、「バルジ」部分が保持可能である限り、ビオチン化SPCに対する結合能に対して、大きな影響を及ぼさないと推断される。
　図２０に示す、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-524の推定される二次構造中、少なくとも、
　６塩基長の第一ランダム配列部分：AAAGCC；（６塩基）
　「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列を含む
　"Hair　pin"ループ形成用の領域：UACCGUUAUUGGAG；（１４塩基）
　６塩基長の第二ランダム配列部分：UAAAAA；（６塩基）
の部分により構成される部分構造に関して、実質的に同じ部分構造を形成すると推定される、一本鎖ＲＮＡ分子を設計した。具体的には、図２０に示す二次構造を形成すると推定される、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ０１７、ＳＰＣ－ｍ０１８、ＳＰＣ－ｍ０１９、ならびにＳＰＣ－ｍ０２０を作製した。
（IV-1）　SPC-m017:
5'-　GGGG　
AAAGCC　
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
CCCC　-3'　(配列番号：３５)；
（IV-2）　SPC-m018:
5'-　GGG　
AAAGCC　
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
CCC　-3'　(配列番号：３６)；
（IV-3）　SPC-m019:
5'-　GGG　
AAAGCC　
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
CC　-3'　(配列番号：３７)；
（IV-4）　SPC-m020:
5'-　GGG　
AAAGCC　
UACCGUUAUUGGAG
UAAAAA
C　-3'　(配列番号：３８)；
　一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ０１７、ＳＰＣ－ｍ０１８、ＳＰＣ－ｍ０１９の推定される二次構造は、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列を含む「ヘアピン・ループ」の構造を含め、一本鎖ＲＮＡ分子、SPC-524の推定される二次構造の主要部を保持している。なお、５'－末端と３'－末端の部分は、二本鎖構造となるように、二つのＧ：Ｃ対を形成可能な塩基配列としている。
　上記の一本鎖ＲＮＡ分子、ＳＰＣ－ｍ０１７、ＳＰＣ－ｍ０１８、ＳＰＣ－ｍ０１９、さらには、ＳＰＣ－ｍ０２０が、実際に、ビオチン化SPCと複合体を形成可能であることを、表面プラズモン共鳴測定装置を利用して、検証した。
　具体的には、表面プラズモン共鳴測定装置：BIACORE　3000を利用し、そのセンサ・チップ上に、Streptavidinタンパク質を固定化し、該固定化されたStreptavidinタンパク質にビオチン化SPCを結合させている。
　各一本鎖ＲＮＡ分子について、それぞれ、バインディング・バッファ溶液中に各一本鎖ＲＮＡ分子を４００ｎＭ含有している、「ＲＮＡ試料」液を調製する。センサ・チップ上に、この「ＲＮＡ試料」液を、流速２０μＬ/分で流し、固定化されているStreptavidinタンパク質に結合しているビオチン化SPCと、一本鎖ＲＮＡ分子の複合体を形成させる。この複合体形成過程は、その液温度は、２５℃とし、センサ・チップ上に「ＲＮＡ試料」液を流通させる時間は、２分間としている。
　次いで、複合体の解離過程では、下記の組成の、ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液を、流速２０μＬ/分で流し、センサ・チップ上の「ＲＮＡ試料」液を除去し、複合体の解離を進める。該複合体の解離過程において、その液温度は、２５℃としている。ＲＮＡ分子を含まないランニング・バッファ溶液の組成は、HBS　(50　mM　HEPES　pH　7.4,　150　mM　NaCl)　+　5　mM　MgCl2　+　5　mM　KCl　+　0.005%　Tween20である。
　複合体形成過程の終了直後（「ＲＮＡ試料」液の流通開示後、１３０秒経過した時点）の表面プラズモン共鳴シグナル強度の測定値から、ビオチン化SPCとの複合体の生成量：ＰＳＰＣを見積もった。具体的には、表面プラズモン共鳴シグナル強度を、各一本鎖ＲＮＡの塩基長（分子量に相当する）で除した値を算出し、ビオチン化SPCとの複合体の生成量：ＰＳＰＣ（分子数）の指標とした。
　図２１に、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ０１７、ＳＰＣ－ｍ０１８、ＳＰＣ－ｍ０１９、ＳＰＣ－ｍ０２０に関して、評価された、前記のビオチン化SPCとの複合体の生成量：ＰＳＰＣ（分子数）の指標値を示す。
　また、同じ測定条件で、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－１９８、ＳＰＣ－ｍ０１２、ＳＰＣ－５２４に関して評価を行った、ビオチン化SPCとの複合体の生成量：ＰＳＰＣ（分子数）の指標値も、併せて、図２１に示す。
　その結果、一本鎖ＲＮＡ分子；ＳＰＣ－ｍ０１７、ＳＰＣ－ｍ０１８、ＳＰＣ－ｍ０１９、ＳＰＣ－ｍ０２０は、実際に、ビオチン化SPCとの複合体を形成可能であることが検証された。
　さらに、上記の一本鎖ＲＮＡ分子中のＵ、ならびに、Ｃに対して、そのヌクレオチドのリボース骨格の２'－ヒドロキシル基（－ＯＨ）に種々の修飾を施した、修飾ＲＮＡ分子を作製し、同じ測定条件で評価を行った、ビオチン化SPCとの複合体の生成量：ＰＳＰＣ（分子数）の指標値も、図２１に示す。
　前記修飾の種類は、各修飾ＲＮＡ分子に付す名称の末尾に、Ｆ、ＦＵ、ＦＣ、ＯＭｅ、ＯＭｅＵ、ＯＭｅＣ、ｄ、ｄＵ、ｄＣの符号を付して示してある。表５に、それぞれの修飾の内容を示す
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
 　各修飾ＲＮＡ分子において、"Hair　pin"ループ形成に関与する「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列において、当該部位のＵを修飾塩基へと変換する、Ｆ、ＦＵ、ＯＭｅ、ＯＭｅＵ、ｄ、ｄＵの修飾を施すと、ビオチン化SPCとの複合体の生成量：ＰＳＰＣ（分子数）の指標値は、顕著に減少している。
　一方、"Hair　pin"ループ形成に関与する「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列において、当該部位のＵに修飾がなされない、ＦＣ、ＯＭｅＣ、ｄＣの修飾を施した場合は、ビオチン化SPCとの複合体の生成量：ＰＳＰＣ（分子数）の指標値は、減少するが、その減少の程度は、相対的に僅かであると、判断される。
　この結果は、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列によって構成される"Hair　pin"ループの部分構造は、当該部位のＵに対する修飾の影響を受け、その結果、ビオチン化SPCに対する結合能の顕著な変化が引き起こされることを暗示している。
　以上、実施形態（及び実施例）を参照して本願発明を説明したが、本願発明は上記実施形態（及び実施例）に限定されものではない。本願発明の構成や詳細には、本願発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。
　この出願は、２００９年７月１７日に出願された日本出願特願２００９－１６９４５９を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
　本発明にかかるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）に対する結合能を有する「ＲＮＡアプタマー分子」は、遊離のスフィンゴリン脂質の一種であるスフィンゴシルホスホリルコリン（SPC）について、その循環血液中の濃度を定量する目的に利用可能である。

Claims (7)

  1. 　スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
    　該ＲＮＡアプタマーは、下記のI-1～I-11の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
    （I-1）　SPC-198:
    5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
    UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAUGUUA　
    UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU　-3'　(配列番号：１)；
    （I-2）　SPC-203:
    5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
    UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCGUAUCCCGA　
    UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU　-3'　(配列番号：２)；
    （I-3）　SPC-209:
    5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
    UACCGUUAUUGGAGCACGCGUAGUAUGGUU　
    UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU　-3'　(配列番号：３)；
    （I-4）　SPC-289:
    5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
    UACCGUUAUUGGAGCACGCGUAGUAUGGGU　
    UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU　-3'　(配列番号：４)；
    （I-5）　SPC-261:
    5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
    UACCGUUAUUGGUGUAACGUAAUUGUGA　
    UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU　-3'　(配列番号：５)；
    （I-6）　SPC-267:
    5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
    UACCGUUAUUGGUGUAACGUAAUUGUGG　
    UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU　-3'　(配列番号：６)；
    （I-7）　SPC-215:
    5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
    UACCGUUAUUGGAGCUGUCGAUUUGCUGGA　
    UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU　-3'　(配列番号：７)；
    （I-8）　SPC-219:
    5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
    UCCCGUUAUUGGAGUCACGCGUAGUCCUCC　
    UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU　-3'　(配列番号：８)；
    （I-9）　SPC-259:
    5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
    UACCGUUAUUGGAGACGCUUAGAUGUCCGA　
    UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU　-3'　(配列番号：９)；
    （I-10）　SPC-213:
    5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
    GCAUUGUCCGCACGCAAAGCAUUAUUGUGA　
    UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU　-3'　(配列番号：１０)；
    （I-11）　SPC-273:
    5'-GGGAAUGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
    GUCCGUUAUUGGCGCCAGCGUACAUGCGGG
    UUCACUGCAGACUUGACGAAGCUU　-3'　(配列番号：１１)；
    ことを特徴とするアプタマー。
  2. 　スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
    　該ＲＮＡアプタマーは、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列をその一部に含む、下記のII-1～II-8の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
    （II-1）　SPC-m009:
    5'-GGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
    UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAUGUUA　
    UUCC　-3'　(配列番号：１２)；
    （II-2）　SPC-m010:
    5'-GGAUCUACGAAUUC　
    UACCGUUAUUGGUGUCACCGAAGAU　
    CC　-3'　(配列番号：１３)；
    （II-3）　SPC-m011:
    5'-GGGAUCCACAUCUACGAAUUC　
    UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCGUAUCCCGA　
    UUCC　-3'　(配列番号：１４)；
    （II-4）　SPC-m012:
    5'-GGCGAAUUC　
    UUCCGUUAUUGGAGCCAAGUCG　
    CC　-3'　(配列番号：１５)；
    （II-5）　SPC-m013:
    5'-GGAUCCACAUCUACGAAUUC　
    UACCGUUAUUGGAGCACGCGUAGUAUGGGU　
    CC　-3'　(配列番号：１６)；
    （II-6）　SPC-m014:
    5'-GGACGAAUUC　
    UACCGUUAUUGGAGCACGCGU　
    CC　-3'　(配列番号：１７)；
    （II-7）　SPC-m015:
    5'-GGACAUCUACGAAUUC　
    UACCGUUAUUGGUGUAACGUAAUUGU　
    CC　-3'　(配列番号：１８)；
    （II-8）　SPC-m016:
    5'-GGCGAAUUC　
    UACCGUUAUUGGUGUAACG　
    CC　-3'　(配列番号：１９)；
    ことを特徴とするアプタマー。
  3. 　スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
    　該ＲＮＡアプタマーは、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列に類する「５'－GCAUUAUUGU－３'」の配列をその一部に含む、下記のII-9の塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
    （II-9）　SPC-m007:
    5'-GG　
    GUCCGCACGCAAAGCAUUAUUGUGA　
    UUCACUGCAGACUUGAC　CC　-3'　(配列番号：２０)；
    ことを特徴とするアプタマー。
  4. 　スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
    　該ＲＮＡアプタマーは、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列をその一部に含む、下記のIII-1～III-8の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
    （III-1）　SPC-514:
    5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
    AAAGCC　UACCGUUAUUGGAG　AAAAAA
    CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：２１)；
    （III-2）　SPC-520:
    5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
    GAAGCC　UACCGUUAUUGGAG　AAAAAA
    CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：２２)；
    （III-3）　SPC-524:
    5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
    AAAGCC　UACCGUUAUUGGAG　UAAAAA
    CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：２３)；
    （III-4）　SPC-562:
    5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
    CAGGCC　UACCGUUAUUGGAG　AAAAUA
    CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：２４)；
    （III-5）　SPC-536:
    5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
    AAGGCC　UACCGUUAUUGGAG　AAUAUU
    CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：２５)；
    （III-6）　SPC-501:
    5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
    GCGGCC　UACCGUUAUUGGAG　UAAACU
    CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：２６)；
    （III-7）　SPC-569:
    5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
    GCGGCC　UACCGUUAUUGGAG　ACAACU
    CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：２７)；
    （III-8）　SPC-511:
    5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
    CGGGCC　UACCGUUAUUGGAG　AUAACU
    CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：２８)；
    ことを特徴とするアプタマー。
  5. 　スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
    　該ＲＮＡアプタマーは、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列をその一部に含む、下記のIII-9～III-12の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
    （III-9）　SPC-556:
    5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
    CAAGCA　UACCGUUAUUGGUG　AAAAAC
    CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：２９)；
    （III-10）　SPC-546:
    5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
    AAAGAC　UACCGUUAUUGGUG　CAAAAU
    CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：３０)；
    （III-11）　SPC-551:
    5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
    AAAUUA　UACCGUUAUUGGUG　CAAACA
    CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：３１)；
    （III-12）　SPC-583:
    5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
    CCAGCA　UACCGUUAUUGGUG　CAACAA
    CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：３２)；
    ことを特徴とするアプタマー。
  6. 　スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
    　該ＲＮＡアプタマーは、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列をその一部に含む、下記のIII-13～III-14の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
    （III-13）　SPC-548:
    5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
    CACCUA　UACCGUUAUUGGUG　CGCAUA
    CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：３３)；
    （III-14）　SPC-547:
    5'-　GGCAACCACGACAUCCGG　
    CAAACA　UACCGUUAUAGGUG　CGCAUA
    CCGGAUGUCACACACAC　-3'　(配列番号：３４)；
    ことを特徴とするアプタマー。
  7. 　スフィンゴシルホスホリルコリンに対する結合能を有するＲＮＡアプタマーであって、
    　該ＲＮＡアプタマーは、「５'－CCGUUAUUGG－３'」のコンセンサス配列をその一部に含む、下記のIV-1～IV-4の塩基配列からなる群から選択される塩基配列の一本鎖ＲＮＡ分子である
    （IV-1）　SPC-m017:
    5'-　GGGG　
    AAAGCC　UACCGUUAUUGGAG　UAAAAA
    CCCC　-3'　(配列番号：３５)；
    （IV-2）　SPC-m018:
    5'-　GGG　
    AAAGCC　UACCGUUAUUGGAG　UAAAAA
    CCC　-3'　(配列番号：３６)；
    （IV-3）　SPC-m019:
    5'-　GGG　
    AAAGCC　UACCGUUAUUGGAG　UAAAAA
    CC　-3'　(配列番号：３７)；
    （IV-4）　SPC-m020:
    5'-　GGG　
    AAAGCC　UACCGUUAUUGGAG　UAAAAA
    C　-3'　(配列番号：３８)；
    ことを特徴とするアプタマー。
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