PT2172566E - Método para gerar aptámeros com taxas de dissociação melhoradas - Google Patents

Método para gerar aptámeros com taxas de dissociação melhoradas Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO
MÉTODO PARA GERAR APTÁMEROS COM TAXAS DE DISSOCIAÇÃO MELHORADAS CAMPO DA INVENÇÃO A presente divulgação refere-se em geral a métodos para a geração de aptámeros e fotoaptámeros que têm melhores propriedades e os aptámeros e fotoaptámeros melhorados que são gerados desta maneira. Em particular, a presente divulgação descreve aptámeros com uma taxa de dissociação lenta que são altamente específicos para um alvo de interesse. A divulgação descreve a composição destes aptámeros com uma taxa de dissociação lenta assim como os métodos para sua seleção. Além disso a divulgação descreve construções de aptámeros com melhores funcionalidades para os métodos de deteção. Além disso, a divulgação descreve aplicações habilitadas para estes aptámeros melhorados.
ANTECEDENTES A seguinte descrição proporciona um resumo de informação relevante para a presente divulgação e sem que seja uma concessão de que qualquer informação proporcionada ou as publicações às quais é feita referência no presente documento sejam anteriores à invenção reivindicada. 0 processo SELEX é um método para a seleção in vitro de moléculas de ácido nucleico que são capazes de se ligar a moléculas alvo com uma alta especificidade e é descrito na Patente U.S. N° 5.475.096 intitulada "Nucleic Acid Ligands" e a Patente U.S. N° 5.270,163 (veja-se também o documento WO 91/19813) intitulada "Nucleic Acid Ligands". Estas patentes, que são denominadas coletivamente no presente documento Patentes SELEX, descrevem métodos para fabricar um aptámero para qualquer molécula alvo desejada. O processo SELEX básico foi modificado para conseguir vários objetivos específicos. Por exemplo, a Patente U.S. N° 5.707.796, intitulada "Method for Seleting Nucleic Acids on the Base of Structure", descreve a utilização do processo SELEX em conjunção com eletroforese em gel para selecionar moléculas de ácido nucleico com características estruturais específicas, tais como o ADN dobrado. APatenteU.S. N° 5.580.737, intitulada "High-Affinity Nucleic Acid Ligands That Discriminate Between Theophylline and Caffeine", descreve um método para identificar aptámeros altamente específicos capazes de discriminar entre moléculas estreitamente relacionadas, chamado Contra-SELEX. A Patente U.S. N° 5,567,588, intitulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Solution SELEX", descreve um método basado em SELEX que consegue uma separação altamente eficaz entre oligonucleótidos que têm uma alta ou baixa afinidade por uma molécula alvo. A Patente U.S. N° 5.496.938, intitulada "Nucleic Acid Ligands to HIV-RT and HIV-1 Rev", descreve métodos para obter aptámeros melhorados depois de que se tenha levado a cabo o SELEX. A Patente U.S. N° 5.705.,337, intitulada "Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX", descreve métodos para ligar covalentemente um aptámero a seu alvo. O processo SELEX abrange a identificação de aptámeros de alta afinidade que contêm nucleótidos modificados que conferem características melhoradas ao ligando, tais como uma melhor estabilidade in vivo ou umas melhores características de fornecimento. Exemplos de tais modificações incluem substituições químicas na ribose e/ou o fosfato e/ou as posições das bases. Os aptámeros identificados pelo processo SELEX que contêm nucleótidos modificados são descritos na Patente U.S. N° 5.660.985, intitulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", que descreve oligonucleótidos que contêm derivados de nucleótidos modificados quimicamente nas posições 5' e 2' das pirimidinas. A Patente U.S. N° 5.580.737, veja-se supra, descreve aptámeros altamente específicos que contêm um ou mais nucleótidos modificados com 2'-amino (2'-NH2), 2'-fluoro (2'-F), e/ou 2'-0-metil (2'-OMe). São descritas outras modificações do processo SELEX na Patente U.S. N° 5.763.177, Patente U.S. N° 6,001,577, e Patente U.S. N° 6.291,184, cada uma das quais se entitula "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Photoseletion of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX"; veja-se também, por exemplo, a Patente U.S. N° 6.458.539, intitulada "Photoseletion of Nucleic Acid Ligands". Estas patentes, às quais se denomina coletivamente "As patentes FotoSELEX", descrevem vários métodos SELEX para selecionar aptámeros que contêm grupos funcionais fotorreativos capazes de se ligar e/ou fotorreticular com e/ou fotoinativar uma molécula alvo. Os aptámeros fotorreativos resultantes são denominados aptámeros de fotorreticulação ou fotoaptámeros.
Embora estes processos SELEX e fotoSELEX sejam úteis, sempre se necessitam processos que originem a aptámeros com propriedades melhoradas que sejam gerados por técnicas de seleção in vitro. Por exemplo, existe uma necessidade de aptámeros contra moléculas alvo com melhores afinidades de ligação que as que são alcançadas com os nucleótidos ADN ou ARN de origem natural, assim como métodos para produzir tais aptámeros. Para muitas aplicações, tais como por exemplo, ensaios in vitro, diagnósticos, terapêuticas, ou aplicações de diagnóstico por imagem, é interessante produzir aptámeros com taxas de dissociação lentas do complexo de afinidade aptámero/alvo. Foram propostas várias técnicas para produzir tais reativos (veja-se por exemplo, os documentos W099/27133 e US2005/0003362). No entanto, estes processos de seleção não discriminam entre a seleção de reagentes que têm cinéticas de associação com o alvo rápidas (isto é, taxas de associação rápidas) e a seleção de reagentes que têm cinéticas de dissociação com o alvo lentas (isto é, taxas de dissociação lentas). Portanto, existe a necessidade de novos processos e técnicas que favoreçam a seleção de aptámeros com taxas de dissociação lentas ao mesmo tempo em que se inibe a seleção de aptámeros que simplesmente têm uma taxa de associação rápida com o alvo.
Finalmente, existe a necessidade de construções de aptámero que incluam diferentes funcionalidades incorporadas.
Estas funcionalidades podem incluir marcadores para imobilização, marcadores para deteção, meios para promover ou controlar a separação, etc.
DiDonato, D. A. (Parte II. Synthese and Evaluation of Modified Nucleotides for DNA Aptamer Seletion. University of North Carolina, Raleigh, UTILIZA, 9 de agosto de 2006 (09-08-2006). Dissertation, páginas I-XI, 26-115) descreve intentos para aumentar a diversidade química do ADN por meio da síntese de desoxiuridinas e desoxicitidinas modificadas em que a funcionalidade é introduzida na posição 5 por meio de uma reação de carboxiamidação.
Davis et al., (Isolation of high-affinity GTP aptamers from partially structured RNA libraries. PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA 3 SEP 2002" vol. 99, n° 18, 3 de Setembro de 2002 (03-09-2002), páginas 11616-11621) descreve o isolamento de aptámeros GPT de alta afinidade a partir de bibliotecas de ARN parcialmente estruturadas em que foi utilizado um protocolo de seleção por taxa de dissociação que implicava quatro incubações sucessivas de 30 min cada uma com um tampão de eluição que continha GPT. SUMÁRIO
Apresente divulgação descreve novos aptámeros, e métodos para produzir e utilizar ditos aptámeros. Em particular, a divulgação descreve aptámeros com uma taxa de dissociação lenta (taxa lenta de dissociação) , aptámeros com uma taxa de dissociação lenta que contêm pirimidinas modificadas em C-5, e processos para a seleção de aptámeros com uma taxa de dissociação lenta por diluição, por adição de um competidor, ou por combinação de ambas estratégias. Além disso, são descritos aptámeros com uma taxa de dissociação lenta de vários alvos tais como proteínas e péptidos. Também são descritos aptámeros com uma taxa de dissociação lenta com características estruturais e temperaturas de fusão únicas . A divulgação também descreve aptámeros com uma taxa de dissociação lenta com grupos funcionais fotorreativos, aptámeros que são refratários à presença de materiais poli-aniónicos, e um processo de seleção para estes aptámeros, assim como aptámeros construídos com uma variedade de outras funcionalidades para melhorar sua utilidade em várias aplicações. A presente divulgação descreve métodos SELEX melhorados para gerar aptámeros que são capazes de se ligar a moléculas alvo. Mais especificamente, a presente divulgação descreve métodos para produzir aptámeros e/ou fotoaptámeros que têm taxas de dissociação mais lentas de suas moléculas alvo respetivas que os aptámeros e fotoaptámeros que são obtidos com os métodos SELEX anteriores. Em geral, após por em contato a mistura de candidatos com a molécula alvo e permitir que se produza a formação de complexos ácido nucleico-alvo, é introduzido um processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta em que os complexos ácido nucleico-alvo com taxas de dissociação rápida serão dissociados e não se formam de novo, enquanto que os complexos com taxas de dissociação lentas permanecerão intatos. Os métodos para introduzir um processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta incluem, mas não se limitam à adição de moléculas competidoras à mistura de ácidos nucleicos e moléculas alvo, a diluição da mistura de ácidos nucleicos e moléculas alvo, ou uma combinação de ambas. A divulgação descreve além disso aptámeros e fotoaptámeros que são obtidos utilizando estes métodos.
Numa disposição, o método compreende a preparação de uma mistura de candidatos de ácidos nucleicos; por em contato a mistura de candidatos com uma molécula alvo, formando complexos ácido nucleico-alvo; introduzir um processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta para induzir a dissociação dos complexos ácido nucleico-molécula alvo com taxas de dissociação relativamente rápidas; separar os complexos ácido nucleico-molécula alvo que permanecem unidos e os ácidos nucleicos livres na mistura de candidatos; e identificar os ácidos nucleicos que estavam ligados à molécula alvo. 0 processo pode, além disso, incluir a etapa repetitiva de amplificação dos ácidos nucleicos que se ligam à molécula alvo para obter uma mistura enriquecida de ácidos nucleicos com ácidos nucleicos que se ligam à molécula alvo produzindo ainda mais complexos ácido nucleico-molécula alvo que têm taxas de dissociação lentas.
Em outra disposição, a mistura de candidatos de ácidos nucleicos inclui ácidos nucleicos que contêm bases de nucleótidos modificadas que podem ajudar à formação de complexos ácido nucleico-molécula alvo que tenham taxas de dissociação lentas. Os métodos melhorados para levar a cabo o SELEX com nucleótidos modificados, que incluem nucleótidos que contêm grupos fotoativos ou outros grupos funcionais, ou nucleótidos que contêm locais de substituição para grupos fotoativos são revelados no Pedido U.S. N° de série 12/175.388, apresentada 17 de julho de 2008 e intitulada "Improved SELEX and PHOTOSELEX" que foi apresentada concorrentemente com o presente pedido. Os nucleótidos dos locais de substituição também podem ser utilizados para a introdução em meio do SELEX ou pós-SELEX de nucleótidos modificados embora não sejam fotorreativos.
Os distintos métodos e etapas descritos no presente documento podem ser utilizados para gerar um aptámero capaz de (1) se ligar a uma molécula alvo ou (2) se ligar a uma molécula alvo e posteriormente formar uma ligação covalente com a molécula alvo por irradiação com luz no espectro UV ou visível.
Os distintos métodos e etapas descritos no presente documento podem ser utilizados para gerar um aptámero capaz de modificar a bioatividade de uma molécula alvo por meio da ligação e/ou a reticulação com a molécula alvo. Numa disposição se identifica um aptámero para uma única molécula alvo que se associa com ou é relevante para um processo de doença específico. Este aptámero pode ser utilizado como um reagente de diagnóstico seja in vitro ou in vivo. Em outra forma de realização, um aptámero para uma molécula alvo que se associa com um estado de doença se pode administrar a um indivíduo e utilizar para tratar a doença in vivo. Os aptámeros e fotoaptámeros descritos no presente documento podem ser utilizados em qualquer das técnicas ou procedimentos ou ensaios de diagnóstico, diagnóstico por imagem, seleção de alto rendimento ou validação de alvos para os quais podem ser utilizados aptámeros, oligonucleótidos, anticorpos e ligandos, sem limitação. Os aptámeros identificados no presente documento podem ser utilizados de acordo com os métodos.
Os aptámeros anteriores que não têm propriedades de taxa de dissociação lenta dos aptámeros da presente invenção foram utilizados para uma variedade de finalidades. Em quase todas tais utilizações, os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta terão uma melhor atuação com respeito a os aptámeros não selecionados por sus propriedades de taxa de dissociação lenta. 0 aptámero Macugen®, (veja-se, por exemplo, a Patente U.S. N° 6.168.778; Patente U.S. N° 6.051.698; Patente U.S. N° 6.426.335; e Patente U.S. N° 6.962.784) foi aprovado para o tratamento da degeneração macular, e funciona devido a sua afinidade especifica pelo VEGF. Foram estudados outros aptámeros e/ou estão em desenvolvimento para utilização como agentes terapêuticos. Os aptámeros não selecionados por suas propriedades de taxa de dissociação lenta também têm sido utilizado em muitas aplicações de diagnóstico e diagnóstico por imagem (veja-se, por exemplo, a Patente U.S. N° 5.843.653; Patente U.S. N° 5.789.163; Patente U.S. N° 5.853.984; Patente U.S. N° 5.874.218; Patente U.S. N° 6,261,783; Patente U.S. N° 5.989.823; Patente U.S. N° 6.177.555; Patente U.S. N° 6.531.286), seleção de alto rendimento (veja-se, por exemplo, Patente U.S. N° 6.329.14,5; Patente U.S. N° 6.670.132; Patente U.S. N° 7.258.980) e em kits de PCR (veja-se, por exemplo, Patente U.S. N° 6.183.967; Patente U.S. N° 6.020.130; Patente U.S. N° 5.763.173; Patente U.S. N° 5.874.557; Patente U.S. N° 5.693.502). Os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta desta divulgação podem ser utilizados em qualquer diagnóstico, terapêutica, diagnóstico por imagem ou qualquer outro utilização em que sejam utilizados anticorpos, aptámeros e pares de ligação de ligandos. A divulgação proporciona aptámeros e fotoaptámeros que se identificam pelos métodos melhorados revelados no presente documento, kits diagnósticos que incluem tais aptámeros e fotoaptámeros, e utilizações terapêuticas ou de diagnóstico de tais aptámeros ou fotoaptámeros. Os novos aptámeros com uma taxa de dissociação lenta que se identificam utilizando os métodos descritos podem ser utilizados numa variedade de ensaios que incluem, ensaios que utilizam matrizes planas, contas, e outros tipos de suportes sólidos. Os ensaios podem ser utilizados numa variedade de contextos que incluem aplicações de investigação cientifica em vida, aplicações de diagnóstico clinico (por exemplo, um ensaio diagnóstico para uma doença, ou uma ensaio de "bem-estar" para saúde preventiva); ensaios ALONA e UPS, e aplicações de diagnóstico por imagem in vivo. Em algumas aplicações, podem ser utilizados ensaios múltiplos que utilizam os aptámeros e fotoaptámeros descritos.
Os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta (ou fotoaptámeros) descritos no presente documento podem ser utilizados como agentes de contraste intravenoso ou oral para rastreios CAT e outras aplicações de diagnóstico por imagem. Os rastreios CAT são utilizados no diagnóstico de distúrbios musculares ou ósseos, coágulos sanguíneos localizados, detetar hemorragias internas, controlar doenças tais como o cancro, etc. Os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta podem ser marcados com um componente detetável por rastreio CAT, tal como por exemplo, iodo, bário, ou gastrografina. Além disso, para levar o componente detetável, o aptámero pode ser projetado para dirigir esse componente a um tecido específico ou a um alvo desejado. 0 aptámero pode servir para concentrar ou localizar o componente detetável e, portanto, melhora a relação de sinal para ruído, aumentando o sinal disponível. Devido a que a taxa de dissociação do aptámero pode ser o suficientemente lenta, a duração da rastreio pode ser aumentada, e a relação de sinal para ruido pode ser melhorada nestas aplicações de diagnóstico por imagem. 0 aptámero com uma taxa de dissociação lenta ser marcado com um material diamagnético ou paramagnético. Nesta disposição o aptámero marcado pode ser utilizado para melhorar o desempenho da imagem de ressonância magnética (MRI). A MRI é particularmente adequada para o diagnóstico por imagem de áreas pequenas seletivas e tecidos com alto conteúdo em água ou para controlar o fluxo sanguíneo. A especificidade dos aptámeros com uma taxa de dissociação lenta pode melhorar a localização do reagente MRI numa seção de tecido desejada. De maneira similar, os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta podem ser modificados com materiais tais como o flúor, carbono 11, oxigénio 15, ou azoto 13, para utilização em rastreios PET. Em outra disposição, os aptámeros podem ser marcados com materiais IR ativos que podem ser utilizados para diagnóstico por imagem por infravermelho. Também se contempla que os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta podem ser marcados para utilização com outras modalidades de diagnóstico por imagem.
Os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta podem ser utilizados como um reagente muito sensível e específico para sua incorporação numa variedade de métodos ou kits de diagnóstico in vitro. Em algumas formas de realização, os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta são utilizados como substitutos de anticorpos em vários métodos de deteção de doenças infeciosas ou de outro tipo onde o aptámero para o alvo de interesé incluído qualquer ou ambos de um material detetável e um componente de imobilização ou captura. Nestas disposições, o formato de ensaio pode incluir extinção de fluorescência, métodos de hibridação, citometria de fluxo, espetrometria de massas, métodos de competição ou inibição, ensaios de oligonucleótidos ligados a enzimas, SPR, métodos de onda evanescente, etc. Em algumas disposições, o aptámero é proporcionado no kit em solução. Em outras disposições, o aptámero no kit é imobilizado num suporte sólido que é utilizado em conjunção com o ensaio para testar o espécime. Em várias disposições, o suporte sólido é projetado para a deteção de um ou mais alvos de interesse. Em outras disposições, o kit pode, além disso, incluir reagentes para extrair o alvo de interesse, reagentes para a amplificação do aptámero, reagentes para levar a cabo os lavagems, reagentes de deteção, etc.
Os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta podem ser utilizados em estudos terapêuticos por imagem. Durante o desenvolvimento dos novos compostos terapêuticos, com frequência é difícil avaliar certas características do composto, tais como, por exemplo, a biodistribuição, a taxa de eliminação, a biodisponibilidade, as interações do fármaco/alvo in vivo, etc. Em muitos casos, se for utilizado um material detetável adequado para modificar o composto terapêutico, poderiam ser utilizados estudos por imagem para avaliar todas estas características. Embora a modificação direta de um composto terapêutico iniba frequentemente sua capacidade para interagir com seu alvo e, portanto, sua eficácia é reduzida, o pequeno tamanho do aptámero e sua especificidade a medida, o converte em muito adequado para reagir com um composto terapêutico (por exemplo, um anticorpo ou outro agente terapêutico basado em proteínas) enquanto se minimiza qualquer dos efeitos indesejáveis sobre a eficácia terapêutica do composto. Para avaliar tais características como a biodistribuição e a taxa de eliminação, o complexo aptámero/agente terapêutico pode sobreviver durante um longo período de tempo. Estes tipos de estudos podem ser simplificados em casos em que o composto terapêutico é um aptámero com uma taxa de dissociação lenta. Em várias formas de realização, os aptámeros que são utilizados em aplicações terapêuticas, de diagnóstico por imagem, e de diagnóstico podem incluir várias modificações, tais como por exemplo 2' fluoro e outras modificações, para aumentar a estabilidade do aptámero na exposição a vários componentes que podem estar presentes numa amostra de ensaio ou in vivo, tal como, por exemplo, nucleases e outros componentes da amostra ou fluidos corporais. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A FIG. IA ilustra um método SELEX exemplar e a FIG. 1B ilustra um método SELEX exemplar que inclui a etapa de incorporação de um processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta ou um processamento. A FIG. ilustra a matriz, iniciador e sequências de oligonucleótidos representativas de aptámeros que são utilizados na divulgação. Os oligonucleótidos foram preparados por técnicas de síntese em fase sólida. B = dT-biotina. A FIG. 3 ilustra os histogramas das constantes da taxa de dissociação para aptámeros de afinidade que são selecionados sem (A) e com (B) um processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta como é descrito no Exemplo 2.
As FIG. 4A e B mostram oligonucleótidos que são utilizados para preparar as misturas de candidatos ou levar a cabo várias etapas do processo de seleção que é descrito nos Exemplos 3 e 4. Os oligonucleótidos foram preparados por técnicas de síntese em fase sólida. São utilizados duas sequências da mistura de candidatos neste exemplo, que foram designados como 1 e 2. B = dT-biotina. Os cromóforos BrdU (5-bromo-dUTP) , Antraquinona (AQ), e psoraleno (Psor) foram adquiridos como fosforamiditas e foram adicionados à extremidade 5' do iniciador direto durante a síntese. Foi preparado 4-azido-2-nitro-anilina (ANA) como um derivado carbonato de para-nitro-fenilo e acoplado a uma fosforamidita 5' hexilamina após a síntese. São utilizadas duas sequências da mistura de candidatos neste exemplo, denominadas 1 e 2. (A) A matriz 1 foi utilizada com misturas de candidatos que continham 5' -BrdU, AQ, e ANA, e (B) a matriz 2 foi utilizada com misturas de candidatos que continha 5'-Psor. A FIG. 5 ilustra as estruturas químicas dos cromóforos acoplados à extremidade 5' do iniciador direto como é ilustrado nas FIG. 4A e 4B. A FIG. 6 ilustra um análise PAGE de atividade de reticulação da biblioteca enriquecida TIMP-3 5' ANA/BzdU utilizando o FotoSELEX fixo em 5' descrito no Exemplo 3. 0 gel ilustra a separação do aptámero livre (Af) , o aptámero reticulado intramolecular (Af*), e o reticulação de complexos proteína:aptámero (P:A). A FIG. 7 é um gráfico de mais de 500 alvos para as que foram identificados aptámeros com uma taxa de dissociação lenta. As FIG. 8A a 8D ilustram construções de aptámeros que contêm uma variedade de funcionalidades diferentes e opcionais que incluem, marcadores de imobilização, marcadores, resíduos de fotorreticulação, espaçadores, e resíduos liberáveis.
As FIG. 9A a 9F ilustram exemplos de construções de aptámeros que incluem um elemento clivável ou libertável, um marcador (por exemplo, biotina), um espaçador, e um marcador (por exemplo Cy3). A FIG. 10 ilustra construções de aptámero e iniciador que são descritos na divulgação. Cy3 representa um corante de Cianina 3, PC um ligante fotoclivável, ANA um grupo de reticulação fotorreativo, (AB)2 um par de resíduos de biotina separados por resíduos dA, e (T) 8 um ligante polidT. As construções de iniciador são complementárias à região 3' fixa completa das construções de aptámero.
As FIG. 11A a 11C ilustram as curvas de resposta à dose para os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta versus os aptámeros tradicionais para três alvos diferentes.
As FIG. 12A e 12B ilustram as curvas de desempenho de um aptámero com uma taxa de dissociação lenta quando o alvo era um péptido. A FIG. 13 ilustra um gráfico da medição da temperatura de fusão de vários aptámeros com uma taxa de dissociação lenta com respeito à temperatura de fusão prevista. A FIG. 14 descreve as modificações de bases de nucleótidos incluídas na presente divulgação. Os grupos R que podem ser utilizados são descritos em adição aos ligantes (X) que podem ser utilizados entre os pontos de ligação do nucleótido e o grupo R. Também são indicadas as posições para a modificação dos nucleótidos. A FIG. 15 ilustra um gráfico que é utilizado para a determinação da constante de ligação de um aptámero que contém pirimidinas modificadas em C-5.
DESCRIÇÃO DETALHADA A prática da prática da invenção revelada no presente documento utiliza, a menos que seja indicado de outro modo, métodos convencionais de química, biologia, biologia molecular, e técnicas de ADN recombinante ao nível da experiência da técnica. Tais técnicas são explicadas completamente na bibliografia. Veja-se, por exemplo, Sambrook, et al. Molecular Closing: A Laboratory Manual (Edição atual); DNA Closing: A Practical Approach, vol. I & II (D . Glover, ed. ) ; Oligonucleotide Synthese (N. Gait, ed., Edição atual); Nucleic Acid Hybridization (B. Harness S. Higgins, eds . , Edição atual) ; Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., Edição atual).
Todas as publicações, documentos de patente publicados, e pedidos de patente citados na presente especificação são indicadores do nível da experiência da técnica (s) à que pertence a invenção.
Como é utilizado na presente especificação, que inclui as reivindicações adjuntas, as formas singulares "um", "um" e "o" inclui as referências plurais, a menos que o conteúdo dite claramente de outro modo, e são utilizados de maneira intercambiável com "pelo menos um" e "um ou mais". Portanto, a referência a "um aptámero" inclui misturas de aptámeros, a referência a "uma sonda" inclui misturas de sondas, e semelhantes.
Como é utilizado no presente documento, o termo "cerca de" representa uma modificação ou variação insignificante dos valores numéricos tal que a função básica do elemento ao que refere-se o valor numérico não mudou.
Como é utilizado no presente documento, os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "contém", "contendo", e qualquer variação dos mesmos, pretendem cobrir uma inclusão não exclusiva, tal que um processo, método, produto do processo ou composição de matéria que compreende, inclui, ou contém um elemento ou lista de elementos não inclui somente esses elementos, mas que podem incluir outros elementos não listados expressamente ou inerentes a tal processo, método, produto do processo, ou composição de matéria.
Como é utilizado no presente documento, "ligando de ácido nucleico", "aptámero" e "clone" são utilizados de maneira intercambiável para se refereir a ácidos nucleicos de origem não natural que têm ou podem ter uma ação desejável sobre uma molécula alvo. Uma ação desejável inclui, mas não se limita a estas, a ligação do alvo, mudança catalítica do alvo, reação com o alvo de maneira que se modifique ou altere o alvo ou a atividade funcional do alvo, ligação covalente ao alvo (como num inibidor suicida), e facilitação da reação entre o alvo e outra molécula. Numa forma de realização, a ação é a afinidade de ligação específica para uma molécula alvo, tendo tal molécula alvo uma estrutura tridimensional, distinta de um polinucleótido, que se liga ao aptámero por meio de um mecanismo que é predominantemente independente do emparelhamento de bases de Watson/Crick ou ligação em tripla hélice, em que o aptámero não é um ácido nucleico que tem a função fisiológica conhecida de se ligar à molécula alvo. Os aptámeros incluem ácidos nucleicos que são identificados dentre uma mistura de ácidos nucleicos candidatos, sendo o aptámero um ligando de um alvo determinado, pelo método que compreende: (a) por em contato a mistura de candidatos com o alvo, em que os ácidos nucleicos que têm afinidade aumentada para o alvo com respeito a outros ácidos nucleicos da mistura de candidatos podem ser separados do resíduo da mistura de candidatos; (b) separar os ácidos nucleicos com afinidade aumentada e/ou com uma taxa de dissociação lenta do resíduo da mistura de candidatos; e (c) amplificar os ácidos nucleicos com afinidade aumentada para produzir uma mistura enriquecida de ácidos nucleicos com taxa de dissociação lenta, em que são identificados os aptámeros para a molécula alvo. Reconhece-se que a afinidade das interações é uma matéria com graus; no entanto, neste contexto, a "especificidade de ligação específica" de um aptámero por seu alvo significa que o aptámero se liga a seu alvo geralmente com um grau de afinidade muito mais alto que com o que pode se ligar a outros componentes, não alvos de uma mistura ou amostra. Um "aptámero" ou "ligando de ácido nucleico" é um grupo de cópias de um tipo ou espécie de molécula de ácido nucleico que tem uma sequência de nucleótidos particular. Um aptámero pode incluir qualquer quantidade adequada de nucleótidos. "Aptámeros" refere-se a mais de um de tais grupos de moléculas. Os diferentes aptámeros podem ter o mesmo número ou um número diferente de nucleótidos. Os aptámeros podem ser ADN ou ARN e podem ser de cadeia simples ou de cadeia dupla, ou conter regiões de cadeia dupla.
Como é utilizado no presente documento, "taxa de dissociação lenta" ou "taxa lenta de dissociação" refere-se ao tempo que se necessita para que um complexo aptámero/alvo comece a se dissociar. Isto pode ser expresso em semivida, ti/2, ou o ponto em que foi dissociado 50% do complexo aptámero/alvo. A taxa de dissociação ou taxa de dissociação de um aptámero com uma taxa de dissociação lenta, que se expressa com valores ti/2, pode ser cerca de > 30 min., > 60 min., > 90 min., > 120 min., > 150 min., > 180 min., > 210 e cerca de > 240 min.
Numa disposição, um método para produzir uma biblioteca sintética de ácidos nucleicos compreende: 1) sintetizar os ácidos nucleicos; 2) desproteger os ácidos nucleicos; 3) purificar os ácidos nucleicos; e 4) analisar os ácidos nucleicos. Na etapa de síntese, é preparada uma mistura de monómeros em que a relação dos distintos nucleótidos da mistura é otimizada para produzir a proporções iguais de cada nucleótido no produto final. Um ou mais dos monómeros da mistura podem compreender um nucleótido modificado. São utilizados grupos de proteção amidita neste procedimento e numa forma de realização, a concentração de monómeros é 0,1 M. Durante a síntese é mantido o grupo protetor cinco prima no produto de ácido nucleico. A síntese é produzida num suporte sólido (cristal de poro controlado, CPG) , e são completados pelo menos cerca de 80 ciclos para a síntese do produto final.
Após o processo de síntese, o produto de ácido nucleico é desprotegido. É utilizado um tampão aquoso de lisina 1,0 M, pH 9,0 para clivar locais apurinicos enquanto que se retém o produto no suporte (cristal de poro controlado, CPG) . Estas sequências truncadas clivadas são eliminadas com água desionizada (dl) duas vezes. São adicionados 500 ui de água dl após as duas lavagens na preparação da etapa de desproteção. Esta etapa implica o tratamento com 1,0 ml de T-butilamina: metanol: água, 1:1:2, durante 5 horas a 70 °C, seguido por congelamento, filtração e evaporação até a secura. O produto de ácido nucleico é purificado com base na hidrofobia do grupo de proteção numa coluna PRP-3 HPLC (Hamilton). As frações de coluna adequadas são recolhidas e agrupadas, dessalgadas e se evaporadas até secura para eliminar os tampões de eluição voláteis. O produto final é lavagem com água por um processo de centrifugação e depois e ressuspenso. Finalmente, o material re-suspenso é tratado para desproteger o produto final. O produto final caracteriza-se por sua composição de bases, extensão do iniciador, e gel de sequenciamento.
Uma mistura de ácidos nucleicos candidatos pode ser produzido também por um método enzimático utilizando uma fase sólida. Numa forma de realização este método compreende as mesmas etapas básicas descritas anteriormente. Neste caso o objetivo é a síntese de uma biblioteca antisense e estas bibliotecas são produzidas com uma modificação de biotina 5' . Todos os processos sintéticos restantes são como foi descrito anteriormente. Uma vez que é preparada a biblioteca sintética, os ácidos nucleicos podem ser utilizados numa mistura de iniciador de extensão que contém um ou mais nucleótidos modificados para produzir a mistura de candidatos final num método clássico de extensão do iniciador.
Os aptámeros podem ser sintetizados pelo mesmo processo químico que é utilizado para a síntese de uma biblioteca. No entanto, em vez de uma mistura de nucleótidos, é introduzido um nucleótido em cada etapa de síntese para controlar a sequência final gerada por métodos de rotina. Os nucleótidos modificados podem ser introduzidos no processo de síntese nas posições desejadas na sequência. Podem ser introduzidas outras funcionalidades, se for desejado, utilizando modificações químicas conhecidas dos nucleótidos.
Como é utilizado no presente documento, uma "mistura de candidatos" é uma mistura de ácidos nucleicos de sequências diferentes dentre a qual é selecionado um ligando desejado. A fonte de uma mistura de candidatos pode ser a partir de ácidos nucleicos de origem natural ou fragmentos dos mesmos, ácidos nucleicos sintetizados quimicamente, ácidos nucleicos sintetizados enzimaticamente ou ácidos nucleicos produzidos por uma combinação das técnicas anteriores. Podem ser incorporados nucleótidos modificados, tais como os nucleótidos com grupos fotorreativos ou outras modificações, à mistura de candidatos. Além disso, pode ser utilizado um processo SELEX para produzir uma mistura de candidatos, isto é, pode ser utilizado uma primeira experiência do processo SELEX para produzir uma mistura de ácidos nucleicos enriquecida em ligandos que é utilizada como a mistura de candidatos num segundo experiência de processo SELEX. Uma mistura de candidatos pode compreender também ácidos nucleicos com um ou mais motivos estruturais comuns. Como é utilizado no presente documento, uma mistura de candidatos também refere-se a vezes a um "grupo" ou uma "biblioteca". Por exemplo, um "grupo ARN" refere-se a uma mistura de candidatos composta por ARN.
Em várias formas de realização, cada ácido nucleico de uma mistura de candidatos pode ter sequências fixas a cada lado de uma região aleatória, para facilitar o processo de amplificação. Os ácidos nucleicos da mistura de ácidos nucleicos candidatos podem compreender ainda, cada um, regiões fixas ou sequências "de cauda" em suas extremidades 5' e 3' para evitar a formação de parasitas de massa molecular alta durante o processo de amplificação.
Como é utilizado no presente documento, "ácido nucleico", "oligonucleótido", e "polinucleótido" são utilizados de maneira intercambiável para se referir a um polímero de nucleótidos de qualquer comprimento, e tais nucleótidos podem incluir desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, e/ou análogos ou desoxirribonucleótidos e ribonucleótidos modificados quimicamente. Os termos "polinucleótido", "oligonucleótido", e "ácido nucleico" incluem moléculas de cadeia dupla ou simples assim como moléculas de tripla hélice.
Se estiverem presentes, as modificações químicas de um nucleótido podem incluir, de maneira única ou em qualquer posição, modificações no açúcar na posição 2' , modificações de pirimidina da posição 5 (por exemplo, 5-(N-benzilcaroxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida-2'-desoxiuridina, 5-(N-[2-(lH-indol-3 il) etil] carboxiamida) -2'-desoxiuridina, cloreto de 5-(N-[1-(3-trimetil amonio) propil] carboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-naftilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina, ou 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)] carboxiamida)-2'-desoxiuridina), modificações de purinas na posição 8, modificações em aminas exocíclicas, substituição de 4-tiouridina, substituição de 5-bromo ou 5-iodouracilo, modificações na estrutura, metilações, combinações de pares de bases não habituais tais como as isobases isocitidina e isoguanina, e similares. As modificações podem incluir também modificações 3' e 5', tais como recobrimento ou pegilação. Outras modificações podem incluir a substituição de um ou mais dos nucleótidos de origem natural por um análogo, modificações internucleótido, tais como, por exemplo, as que têm ligações sem carga (por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfoamidatos, carbamatos, etc.) e as que têm ligações com carga (por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), as que têm intercaladores (por exemplo, acridina, psoraleno, etc.), as que contêm quelantes (por exemplo, metais, metais radioativos, boro, metais oxidativos, etc.), as que contêm alquilantes, e as que têm ligações modificadas (por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.) . Além disso, qualquer dos grupos hidroxilo que estão presentes habitualmente num açúcar podem ser substituídos por um grupo fosfonato ou um grupo fosfato; protegidos por grupos protetores de referência; ou ativados para preparar ligações adicionais a nucleótidos adicionais ou a um suporte sólido. Os grupos OH dos extremidades 3' e 5' podem ser fosforilados ou substituídos com aminas, resíduos de um grupo de recobrimento orgânico de cerca de 1 a cerca de 20 átomos de carbono, ou resíduos de um grupo de recobrimento orgânico de cerca de 1 a cerca de 20 polímeros de polietilenglicol (PEG) e outros polímeros hidrófilos ou hidrófobos biológicos ou sintéticos. Se estiverem presentes, pode ser feita uma modificação da estrutura do nucleótido antes ou depois da montagem com um polímero. Uma sequência de nucleótidos pode estar interrompida por componentes não nucleótidos. Um polinucleótido pode ser modificado além disso depois da polimerização, tal como por conjugação com um componente marcador.
Os polinucleótidos podem conter também formas de açúcares análogas de ribose ou desoxirribose que conhecem-se em geral na técnica, incluindo 2'-O-metil-, 2'-0-alil, 2'-fluoro- ou 2'-azido-ribose, análogos de açúcar carbocíclico, açúcares α-anoméricos, açúcares epiméricos tais como arabinose, xiloses, e lixosas, açúcares furanose, pseudoheptuloses, análogos acíclicos e análogos abásicos de nucleósidos tais como metil ribósido. Como foi destacado anteriormente, podem ser substituídas uma ou mais ligações fosfodiéster por grupos de ligação alternativos. Estes grupos de ligação alternativos incluem formas de realização em que o fosfato é substituído por P (O) S ("tioato") , P(S)S ("ditioato"), (0)NR2 ("amidato") P(O)R, P(O)OR', CO ou CH2 ("formacetal") , em que cada R ou R' é independentemente H ou alquilo substituído ou não substituído (1-20 C) que contém opcionalmente uma ligação éter (-0-), arilo, alquenilo, cicloalquilo ou araldilo. Não é necessário que todas as ligações num polinucleótido sejam idênticas. A substituição de formas análogas de açúcares, purinas, e pirimidinas pode ser vantajosa no projeto de um produto final, como podem ser, por exemplo, estruturas de estrutura principal alternativas como uma estrutura de poliamida.
Numa forma de realização, a região variável do aptámero inclui nucleótidos que incluem bases modificadas. Certos aptámeros modificados podem ser utilizados em qualquer dos métodos, dispositivos e kits descritos. Estes nucleótidos modificados demostraram que produzem novos aptámeros que têm taxas de dissociação muito lentas de seus respetivos alvos enquanto que mantêm uma alta afinidade pelo alvo. Numa forma de realização, a posição C-5 das bases pirimidínicas pode ser modificada. Os aptámeros que contêm nucleótidos com bases modificadas têm várias propriedades que são diferentes das propriedades dos aptámeros de referência que incluem somente nucleótidos de origem natural (isto é, nucleótidos sem modificar). Numa forma de realização, o método para a modificação dos nucleótidos inclui a utilização de uma ligação amida. No entanto, podem ser utilizados outros métodos para a modificação. Observou-se surpreendentemente que a estrutura dos aptámeros identificados com uma taxa de dissociação lenta não parece estar de acordo completamente com a estrutura prevista pelos modelos de emparelhamento de bases de referência. A observação apoia-se no facto de que as temperaturas de fusão que foram medidas nos aptámeros com uma taxa de dissociação lenta não são consistentes com as temperaturas de fusão previstas para os modelos, veja-se a Fig. 13. Como é mostrado, parece que não há correlação entre as temperaturas de fusão medidas e previstas dos aptámeros com uma taxa de dissociação lenta. Como média, a temperatura de fusão (Tm) calculada é 6 °C mais baixa que a Tm medida. As temperaturas de fusão medidas indicam que os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta que incluem estes nucleótidos modificados são mais estáveis que o que se pode prever e têm potencialmente novas estruturas secundárias. Estes aptámeros modificados também têm espectros de dicorismo circular diferentes dos aptámeros correspondentes que incluem somente nucleótidos sem modificar. No caso de muitos alvos, é mais provável que se identifiquem os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta para um alvo quando são utilizados nucleótidos modificados na produção da biblioteca inicial ou a mistura de candidatos.
As modificações particulares na posição 5 de pirimidinas incluem que são descritos nas Patentes U.S. 5.719.273 e 5.945.527, assim como as que se ilustram na Fig. 14.
Como é utilizado no presente documento, "ácido nucleico modificado" refere-se a uma sequência de ácido nucleico que contém um ou mais nucleótidos modificados. Em algumas formas de realização pode ser desejável que os nucleótidos modificados sejam compatíveis com o processo SELEX. "Polipéptido", "péptido", e "proteína" são utilizados de maneira intercambiável no presente documento para se referir a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. 0 polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados, e/ou pode estar interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácidos que foi modificado de forma natural ou por intervenção; por exemplo, formação de ligações dissulfureto, glucosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente marcador. Também se incluem na definição, por exemplo, os péptidos que contêm um ou mais análogos de um aminoácido (que incluem, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.), assim como outras modificações conhecidas na técnica. Os polipéptidos podem ser cadeias simples ou cadeias associadas.
Como é utilizado no presente documento, "nucleótido fotorreativo" significa qualquer nucleótido modificado que é capaz de se fotorreticular com um alvo, tal como uma proteína, ao ser irradiado com luz de certos comprimentos de onda. Por exemplo, os fotoaptámeros produzidos pelo processo fotoSELEX podem incluir um grupo fotorreativo que é selecionado a partir dos seguintes: 5-bromouracilo (BrU), 5-iodouracilo (IU), 5-bromoviniluracilo, 5-iodoviniluracilo, 5-azidouracilo, 4- tiouracilo, 5-bromocitosina, 5-iodocitosina, 5- bromovinilcitosina, 5-iodovinilcitosina, 5-azidocitosina, 8-azidoadenina, 8-bromoadenina, 8-iodoadenina, 8-azidoguanina, 8-bromoguanina, 8-iodoguanina, 8-azidohipoxantina, 8-bromohipoxantina, 8-iodohipoxantina, 8-azidoxantina, 8-bromoxantina, 8-iodoxantina, 5-bromodesoxiuridina, 8-bromo-2'' -desoxiadenina, 5-iodo-2'-desoxiuracilo, 5-iodo-2'-desoxicitosina, 5 - [ (4-azidofenacil)tio]citosina, 5-[(4-azidofenacil)tio]uracilo, 7-deaza-7-iodoadenina, 7-deaza-7-iodoguanina, 7-deaza-7-bromoadenina, e 7-deaza-7-bromoguanina. Uma "pirimidina fotorreativa" significa qualquer pirimidina modificada que é capaz de se f otorret icular com um alvo ao ser irradiada com certos comprimentos de onda. As pirimidinas fotorreativas exemplares incluem 5-bromo-uracilo (BrdU), 5-bromo-citosina (BrdC), 5-iodo-uracilo (IdU), e 5-iodo-citosina (IdC). Em várias formas de realização, o grupo fotorreativo funcional absorverá os comprimentos de onda de luz que não são absorvidos pelo alvo ou as porções não modificadas do oligonucleótido. "SELEX" refere-se a um processo que combina a seleção de ácidos nucleicos que interagem com um alvo de uma maneira desejável (por exemplo, se ligando a uma proteína) com a amplificação dos ácidos nucleicos selecionados. A ciclagem iterativa opcional das etapas de seleção/amplificação permite a seleção de um ou um pequeno número de ácidos nucleicos que interagem mais fortemente com o alvo dentre um grupo de um número muito grande de ácidos nucleicos. 0 ciclo do procedimento de seleção/amplificação continua até que se alcança um objetivo selecionado. A metodologia SELEX é descrita nas Patentes SELEX. Em algumas formas de realização do processo SELEX, são gerados aptámeros que se ligam não covalentemente a seus alvos. Em outras formas de realização do processo SELEX, são gerados aptámeros que se ligam covalentemente a seus alvos.
Como é utilizado no presente documento o termo "amplificação" ou "amplificando" significa qualquer processo ou combinação de etapas de processo que aumenta a quantidade ou número de cópias de uma molécula ou classes de moléculas. "Alvo SELEX" ou "molécula alvo" ou "alvo" refere-se no presente documento a qualquer composto com o qual pode agir um ácido nucleico de uma maneira desejada. Uma molécula alvo SELEX pode ser uma proteína, péptido, ácido nucleico, hidrato de carbono, lípido, polissacárido, glicoproteína, hormona, recetor, antigénio, anticorpo, vírus, agente patogénico, substância tóxica, substrato, metabolito, análogo em estado de transição, cofator, inibidor, fármaco, corante, nutriente, fator de crescimento, célula, tecido, qualquer parte ou fragmento de qualquer dos anteriores, etc., sem limitação. Numa forma de realização, um alvo SELEX não inclui moléculas que se sabe que se ligam a ácidos nucleicos, tais como, por exemplo, ácidos nucleicos conhecidos por se ligar a proteínas (por exemplo, fatores de transcrição) . Virtualmente, qualquer efetor químico ou biológico pode ser um alvo SELEX adequado. As moléculas de qualquer tamanho podem servir como alvos SELEX. Um alvo pode ser modificado de certas maneiras para aumentar a probabilidade ou a força de uma interação entre o alvo e o ácido nucleico. Um alvo também pode incluir uma variação menor de um composto ou molécula em particular, tal como, no caso de uma proteína, por exemplo, variações menores na sequência de aminoácidos, formação de ligações dissulfureto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como a conjugação com um componente marcador, que não altere substancialmente a identidade da molécula. Uma "molécula alvo" ou "alvo" é um grupo de cópias de um tipo ou espécie de molécula ou estrutura multimolecular que é capaz de se ligar a um aptámero. "Moléculas alvo" ou "alvos" referem-se a mais de um de tais grupos de moléculas. As formas de realização do processo SELEX em que o alvo é um péptido são descritas na Patente U.S. N° 6,376,190, intitulada "Modified SELEX Processes Without Purified Protein". A Figura 7 enumera mais de 500 alvos para os quais foram produzidos aptámeros que incluem uma variedade de aptámeros com uma taxa de dissociação lenta.
Como é utilizado no presente documento, "molécula competidora" ou "competidor" são utilizados de maneira intercambiável para se referir a qualquer molécula que pode formar um complexo não específico com uma molécula não alvo. Neste contexto, as moléculas não alvos incluem aptámeros livres, em que, por exemplo, pode ser utilizado um competidor para inibir a ligação do aptámero (re-ligação), não especificamente, a outra molécula não alvo. Uma "molécula competidora" ou "competidor" é um grupo de cópias de um tipo ou espécie de molécula. "Moléculas competidoras" ou "competidores" referem-se a mais de um de tais grupos de moléculas. As moléculas competidoras incluem, mas não se limitam a oligonucleótidos, polianiões (por exemplo, heparina, ADN de esperma de arenque, ADN de esperma de salmão, ARNt, sulfato de dextrano, polidextrano, polímeros de fosfodiéster abásico, dNTP, e pirofosfato). Em várias formas de realização, pode ser utilizado uma combinação de um ou mais competidores.
Como é utilizado no presente documento, "complexo não específico" refere-se a uma associação não covalente entre duas ou mais moléculas que não são um aptámero e sua molécula alvo. Um complexo não específico representa uma interação entre classes de moléculas. Os complexos não específicos incluem complexos formados entre um aptámero e uma molécula não alvo, um competidor e uma molécula não alvo, um competidor e uma molécula alvo, e uma molécula alvo e uma molécula não alvo.
Como é utilizado no presente documento, a expressão "processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta" refere-se a um processo de alteração das concentrações relativas de certos componentes numa mistura de candidatos tal que a concentração de complexos de afinidade de aptámeros que têm taxas de dissociação lentas está aumentada com respeito à concentração de complexos de afinidade de aptámeros que têm umas taxas mais rápidas e menos desejáveis de dissociação. Numa forma de realização, o processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta é um processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta que se baseia numa solução. Nesta forma de realização, o processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta que se baseia numa solução tem lugar numa solução, tal que nem o alvo nem os ácidos nucleicos que formam os complexos de afinidade do aptámero na mistura estão imobilizados num suporte sólido durante o processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta. Em várias formas de realização, o processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta pode incluir uma ou mais etapas, que incluem a adição de e a incubação com uma molécula competidora, diluição da amostra, ou uma combinação destas (por exemplo, diluição da mistura em presença de uma molécula competidora). Devido a que o efeito do processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta depende em geral das diferentes taxas de dissociação dos distintos complexos de afinidade de aptámeros (isto é, os complexos de afinidade de aptámero formados entre a molécula alvo e os diferentes ácidos nucleicos da mistura de candidatos), a duração do processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta é selecionado de forma que mantenha uma alta proporção de complexos de afinidade de aptámero que tenham umas taxas de dissociação lenta ao mesmo tempo que é reduzido substancialmente o número de complexos de afinidade de aptámero que têm taxas de dissociação rápidas. 0 processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta pode ser utilizado num ou mais ciclos durante o processo SELEX. Quando a diluição e a adição de um competidor são utilizados em combinação, podem ser levados a cabo simultânea ou sequencialmente, em qualquer ordem. 0 processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta pode ser utilizado quando a concentração total de alvo (proteína) na mistura é baixa. Numa forma de realização, quando o processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta inclui a diluição, a mistura se pode diluir tanto como seja prático, tendo em mente que os ácidos nucleicos retidos no aptámero se recuperam para ciclos posteriores do processo SELEX. Numa forma de realização, o processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta inclui a utilização de um competidor assim como a diluição, permitindo que a mistura seja diluída menos do que pode ser necessário sem a utilização de um competidor.
Numa disposição, o processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta inclui a adição de um competidor, e o competidor é um polianião (por exemplo, heparina ou sulfato de dextrano (dextrano) ) . A heparina ou o dextrano foram utilizados na identificação de aptámeros específicos nas seleções SELEX anteriores. Em tais métodos, no entanto, a heparina ou o dextrano estão presentes durante a etapa de equilíbrio em que se ligam o alvo e o aptámero para formar complexos. Em tais métodos, de acordo com aumenta a concentração de heparina ou dextrano, aumenta a relação de complexos alvo/aptámero de alta afinidade com respeito a os complexos alvo/aptámero de baixa afinidade. No entanto, uma alta concentração de heparina ou dextrano pode reduzir o número de complexos alvo/aptámero de alta afinidade em equilíbrio devido à competição pela ligação ao alvo entre o ácido nucleico e o competidor. Pelo contrário, os presentes métodos descritos adicionam o competidor depois de que se tenha permitido a formação de complexos alvo/aptámero, e, portanto, não afeta ao número de complexos que se formam. A adição do competidor depois de que se tenha produzido a ligação em equilíbrio entre o alvo e o aptámero cria um estado de não equilíbrio que evolui no tempo a um equilíbrio com menos complexos alvo/aptámero. A captação de complexos alvo/aptámero antes de que se alcance o novo equilíbrio enriquece a amostra em aptámeros com uma taxa de dissociação lenta enquanto que os aptámeros com uma taxa de dissociação rápida terão se dissociado antes.
Em outra forma de realização, é utilizado um competidor polianiónico (por exemplo, sulfato de dextrano ou outro material polianiónico) no processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta para facilitar a identificação de um aptámero que é refratário à presença do polianião. Neste contexto, "aptámero refratário polianiónico" é um aptámero que é capaz de formar um complexo aptámero/alvo que é menos probable que se dissocie na solução que também contém material refratário polianiónico que um complexo aptámero/alvo que inclui um aptámero não refratário polianiónico. Desta maneira, podem ser utilizados os aptámeros refratários polianiónicos na forma de realização de métodos analíticos para detetar a presença ou quantidade ou concentração de um alvo numa amostra, em que o método de deteção inclui a utilização do material polianiónico (por exemplo, sulfato de dextrano) ao que é refratário o aptámero.
Portanto, numa disposição, proporciona-se um método para produzir um aptámero refratário polianiónico. Nesta forma de realização, depois de por em contato uma mistura de ácidos nucleicos candidatos com o alvo. Permite-se que o alvo e os ácidos nucleicos da mistura de candidatos cheguem ao equilíbrio. É introduzido um competidor polianiónico e é deixado em incubação na solução durante um período de tempo suficiente para assegurar que a maioria dos aptámeros com uma taxa de dissociação rápida da mistura de candidatos se dissocie da molécula alvo. Também, serão dissociados da molécula alvo os aptámeros da mistura de candidatos que possam ser dissociados em presença do competidor polianiónico. A mistura é separada para isolar os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta de alta afinidade que permaneçam em associação com a molécula alvo e para retirar qualquer material que não forme complexos da solução. 0 aptámero então pode ser libertado da molécula alvo e isolado. 0 aptámero isolado também pode ser amplificado e são aplicadas ciclos de seleção adicionais para aumentar o desempenho total dos aptámeros selecionados. Este processo pode ser utilizado também com um tempo mínimo de incubação se não for necessária a seleção de aptámeros com uma taxa de dissociação lenta para uma aplicação específica.
Portanto, numa disposição proporciona-se um processo SELEX modificado para a identificação ou produção de aptámeros que têm umas taxas de dissociação lentas (longas) em que é posto em contato uma molécula alvo e uma mistura de candidatos e são incubadas juntamente durante um período de tempo suficiente para que seja produzida a ligação em equilíbrio entre a molécula alvo e os ácidos nucleicos que contém a mistura de candidatos. A seguir da ligação em equilíbrio é adicionado à mistura um excesso de molécula competidora, por exemplo, um competidor polianiónico, e incuba-se a mistura juntamente com o excesso de molécula competidora durante um período de tempo predeterminado. Uma proporção significativa de aptámeros que têm taxas de dissociação menores que este período de incubação predeterminado serão dissociados do alvo durante o período de incubação predeterminado. A reassociação destes aptámeros com uma taxa de dissociação "rápida" com o alvo se minimiza devido ao excesso de molécula competidora que pode se ligar não especificamente ao alvo e ocupar os locais de ligação do alvo. Uma proporção significativa de aptámeros que têm taxas de dissociação mais longas permanecerá formando complexos com o alvo durante o período de incubação predeterminado. Ao final do período de incubação, a separação dos complexos ácido nucleico-alvo do resíduo da mistura permite a separação de uma população de aptámeros com uma taxa de dissociação lenta dos que têm taxas de dissociação rápidas. Pode ser utilizada uma etapa de dissociação para dissociar os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta de seus alvos e permitir o isolamento, identificação, sequenciamento, síntese e amplificação de aptámeros com uma taxa de dissociação lenta (sejam aptámeros individuais ou de um grupo de aptámeros com uma taxa de dissociação lenta) que têm uma alta afinidade e especificidade pela molécula alvo. Como com o SELEX convencional as sequências de aptámeros identificadas numa ronda do processo SELEX modificado podem ser utilizados na síntese de uma nova mistura de candidatos tal que as etapas de por em contato, ligação em equilíbrio, adição de uma molécula competidora, incubação com a molécula competidora e separação de aptámeros com uma taxa de dissociação lenta pode ser iterada/repetida tantas vezes como for desejado. A combinação de permitir a ligação em equilíbrio da mistura de candidatos com o alvo antes da adição do competidor, seguida pela adição de um excesso de competidor e a incubação com o competidor durante um período de tempo predeterminado permite a seleção de uma população de aptámeros que têm taxas de dissociação que são muito maiores que as que se alcançavam anteriormente.
Com a finalidade de conseguir a ligação em equilíbrio, a mistura de candidatos pode ser incubada com o alvo durante pelo menos cerca de 5 minutos, ou pelo menos cerca de 15 minutos, cerca de 30 minutos, cerca de 45 minutos, cerca de 1 hora, cerca de 2 horas, cerca de 3 horas, cerca de 4 horas, cerca de 5 horas ou cerca de 6 horas. O período de incubação predeterminado da molécula competidora com a mistura da mistura de candidatos e a molécula alvo pode ser selecionado conforme for desejado, levando em consideração fatores tais como a natureza do alvo e as taxas de dissociação conhecidas (se houver) de aptámeros do alvo. Os períodos de incubação predeterminados podem ser escolhidos a partir de: pelo menos cerca de 5 minutos, pelo menos cerca de 10 minutos, pelo menos cerca de 20 minutos, pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 45 minutos, pelo menos cerca de 1 hora, pelo menos cerca de 2 horas, pelo menos cerca de 3 horas, pelo menos cerca de 4 horas, pelo menos cerca de 5 horas, pelo menos cerca de 6 horas.
Em outras disposições, é utilizada uma diluição como processo de aumento da taxa de dissociação e a incubação da mistura de candidatos diluída, pode ocasionar a formação de complexos de molécula alvo/aptámeros durante um período de tempo determinado, que pode ser escolhido a partir de: pelo menos cerca de 5 minutos, pelo menos cerca de 10 minutos, pelo menos cerca de 20 minutos, pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 45 minutos, pelo menos cerca de 1 hora, pelo menos cerca de 2 horas, pelo menos cerca de 3 horas, pelo menos cerca de 4 horas, pelo menos cerca de 5 horas, pelo menos cerca de 6 horas.
Disposições da presente divulgação referem-se à identificação, produção, síntese e utilização de aptámeros com uma taxa de dissociação lenta. Estes são aptámeros que têm uma taxa de dissociação (ti/2) a partir de um complexo aptámero-alvo não covalente que é maior que a dos aptámeros que são obtidos normalmente pelo SELEX convencional. Para uma mistura que contém complexos não covalentes de aptámero e alvo, o ti/2 representa o tempo que necessitam a metade dos aptámeros para se dissociar dos complexos aptámero-alvo. 0 ti/2 dos aptámeros com uma taxa de dissociação lenta de acordo com a presente divulgação é escolhida dentre um de: mais ou igual a cerca de 30 minutos; entre cerca de 30 minutos e cerca de 240 minutos; entre cerca de 30 minutos a cerca de 60 minutos; entre cerca de 60 minutos a cerca de 90 minutos, entre cerca de 90 minutos a cerca de 120 minutos; entre cerca de 120 minutos a cerca de 150 minutos; entre cerca de 150 minutos a cerca de 180 minutos; entre cerca de 180 minutos a cerca de 210 minutos; entre cerca de 210 minutos a cerca de 240 minutos.
Uma caracteristica que caracteriza um aptámero que se identifica por um procedimento SELEX é sua alta afinidade pelo alvo. Um aptámero terá uma constante de dissociação (kd) por seu alvo que é escolhida dentre um de: menos de cerca de ΙμΜ, menos de cerca de 100 nM, menos de cerca de 10 nM, menos de cerca de 1 nM, menos de cerca de 100 pM, menos de cerca de 10 pM, menos de cerca de 1 pM. "Tecido alvo" ou "tecido" refere-se no presente documento a um certo subgrupo de alvos SELEX descritas anteriormente. De acordo com esta definição, os tecidos são macromoléculas num ambiente heterogéneo. Como é utilizado no presente documento, tecido refere-se a um único tipo celular, uma coleção de tipos celulares, um agregado de células, ou um agregado de macromoléculas. Isto se diferença dos alvos SELEX mais simples que são tipicamente moléculas solúveis isoladas, tais como proteínas. Em algumas formas de realização, os tecidos são macromoléculas insolúveis que têm ordens de magnitude maiores que os alvos SELEX mais simples. Os tecidos são alvos complexos compostos de numerosas macromoléculas, cada macromolécula têm numerosos epítopos potenciais. As diferentes macromoléculas que compreendem os numerosos epítopos podem ser proteínas, lípidos, hidratos de carbono, etc., ou combinações dos mesmos. Os tecidos geralmente são uma matriz física de macromoléculas que podem ser fluidos ou rígidos, ambos em termos de estrutura e composição. A matriz extracelular é um exemplo de um tecido mais rígido, tanto estruturalmente como composicionalmente, enquanto que uma membrana bicamada é mais fluida em estrutura e composição. Os tecidos geralmente não são solúveis e permanecem em fase sólida, e, portanto, a separação pode ser levada a cabo com relativa facilidade. Um tecido inclui, mas não se limita a, um agregado de células habitualmente de um tipo particular juntamente com sua substância intercelular que forma um dos materiais estruturais que são utilizados comumente para denotar a construção celular geral de um determinado órgão, por exemplo, o tecido renal, tecido cerebral. As quatro classes gerais de tecidos são o tecido epitelial, tecido conjuntivo, tecido nervoso e tecido muscular.
Exemplos de tecidos que se enquadram nesta definição incluem, mas não se limitam a, agregados heterogéneos de macromoléculas tais como os coágulos de fibrina que são agregados celulares de células homogéneas ou heterogéneas; estruturas de maior ordem que contêm células que têm uma função específica, tais como órgãos, tumores, gânglios linfáticos, artérias, etc.; e células individuais. Os tecidos e células podem estar em seu ambiente natural, isolados, ou em cultura de tecido. 0 tecido pode estar intato ou modificado. A modificação pode incluir numerosas mudanças tais como transformação, transfeção, ativação, e isolamento subestrutural, por exemplo, de membranas celulares, núcleos celulares, organelos celulares, etc.
As fontes de tecido, células ou estruturas subcelulares podem ser obtidas de procariotas assim como de eucariotas. Estas incluem estruturas humanas, animais, vegetais, bacterianas, fúngicas e de vírus.
Como é utilizado no presente documento, a expressão "agente marcador", "marcador", ou "resíduo detetável", ou "elemento detetável", ou "componente detetável" refere-se a um ou mais reagentes que podem ser utilizados para detetar uma molécula alvo que se liga a um aptámero. Um resíduo detetável ou marcador é capaz de ser detetado direta ou indiretamente. Em geral, qualquer molécula indicadora que seja detetável pode ser um marcador. Os marcadores incluem, por exemplo, (i) moléculas indicadoras que podem ser detetadas diretamente graças a que geram um sinal, (ii) um par de membros de uma ligação especifica que pode ser detetado indiretamente pela ligação posterior com um equivalente que contém uma molécula indicadora, (iii) marcadores de massas detetáveis por espetrometria de massas, (iv) iniciadores oligonucleótidos que podem proporcionar uma matriz para a amplificação ou ligação, e (v) uma sequência de polinucleótido especifica ou sequência de reconhecimento que pode agir como um ligando, tal como, por exemplo, uma proteína repressora, em que os últimos dois casos o iniciador oligonucleótido ou a proteína repressora terão, ou serão capazes de ter, uma molécula indicadora, e assim. A molécula indicadora pode ser catalítica, tal como uma enzima, um polinucleótido codificado por um catalítico, promotor, corante, molécula fluorescente, quanto pontual, molécula quimiluminescente, coenzima, substrato de enzima, grupo radioativo, molécula orgânica pequena, sequência de polinucleótido amplificável, uma partícula tal como uma partícula de látex ou carbono, sol metálica, cristalito, lipossoma, células, etc. que podem marcarse ou não por um corante, catalítico ou outro grupo detetável, um marcador de massas que altera o peso da molécula à que se conjuga com fines de espetrometria de massas, e similares. Um marcador pode ser selecionado a partir de materiais eletromagnéticos ou eletroquímicos. Numa forma de realização, o marcador detetável é um corante fluorescente. Outros marcadores e esquemas de marcação serão evidentes para um perito na especialidade com base na divulgação do presente documento.
Um resíduo (elemento ou componente) detetável pode incluir qualquer das moléculas indicadoras enumeradas anteriormente e qualquer outro composto químico ou componente que possa ser utilizado de qualquer maneira para gerar um sinal detetável. 0 resíduo detetável pode ser detetado por meio de um sinal fluorescente, um sinal quimiluminescente, ou qualquer outro sinal detetável que depende da identidade do resíduo. No caso em que o resíduo detetável seja uma enzima (por exemplo, fosfatase alcalina), o sinal pode ser gerado em presença do substrato da enzima e qualquer dos fatores adicionais necessários para a atividade enzimática. No caso em que o resíduo detetável seja um substrato enzimático, o sinal pode ser gerado em presença da enzima e qualquer dos fatores adicionais necessários para a atividade enzimática. As configurações de reagentes adequadas para a ligação do resíduo detetável a uma molécula alvo incluem a ligação covalente do resíduo detetável à molécula alvo, a associação não covalente do resíduo detetável com outro componente agente marcador que esteja unido covalentemente à molécula alvo, e a ligação covalente do resíduo detetável a um componente agente marcador que esteja associado não covalentemente com a molécula alvo. As colorações proteicas universais (UPS) são descritas em detalhe no Pedido de Patente U.S. N° de Série 10/504.696, apresentada em 12 de agosto de 2004, intitulada "Methods and Reagents for Deteting Target Binding by Nucleic Acid Ligands". "Suporte sólido" refere-se no presente documento a qualquer substrato que tenha uma superfície à qual as moléculas possam ser ligadas, diretamente ou indiretamente, por meio de ligações covalentes ou não covalentes. Os materiais do substrato podem ser de origem natural, sintéticos ou uma modificação de um material de origem natural. Os materiais de suporte sólido podem incluir, silício, grafite, superfícies especulares, laminados, cerâmicos, plásticos (que incluem polímeros tais como, por exemplo, poli (cloreto de vinilo), copolímeros de ciclo-olefina, poliacrilamida, poliacrilato, polietileno, polipropileno, poli(4-metilbuteno), poliestireno, polimetacrilato, poli(etileno tereftalato), politetrafluoroetileno (PTFE ou Teflon®), náilon, poli(vinil butirato)), germânio, arseneto de gálio, oro, prata, etc., que sejam utilizados por si mesmos ou em conjunção com outros materiais. Podem ser considerados materiais rígidos adicionais, tais como cristal, que inclui silício e além disso inclui, por exemplo, cristal que pode ser adiquirido como
Biocristal. Outros materiais que podem ser utilizados incluem materiais porosos, tais como, por exemplo, contas de cristal de poro controlado. Também se contempla qualquer outro material que seja conhecido na técnica que seja capaz de ter incorporado em sua superfície um ou mais grupos funcionais, tais como qualquer de um grupo funcional amino, carboxi, tiol, ou hidroxilo, por exemplo. 0 suporte sólido pode ter qualquer de uma variedade de configurações que variam desde simples a complexa e pode ter qualquer de várias formas, incluindo uma tira, placa, disco, barra, partícula, incluindo contas, tubos, poços, e similares. A superfície pode ser relativamente plana (por exemplo, um porta-objetos), esférica (por exemplo, uma conta), cilíndrica (por exemplo, uma coluna), ou estriada. Suportes sólidos que podem ser utilizados incluem poços microtiter, porta-objetos de microscópio, membranas, contas paramagnéticas, papel carregado, filmes de Langmuir-Blodgett, chips em hóstias de sílica, chips de fluxo contínuo, e microcontas.
Como é utilizado no presente documento, "separação" significa qualquer processo pelo qual são separados um ou mais componentes de uma mistura de outros componentes da mistura. Por exemplo, os aptámeros ligados a moléculas alvo podem ser separados de outros ácidos nucleicos que não estão ligados a moléculas alvo e de moléculas não alvo. Estabelecido mais amplamente, a separação permite a separação de todos os ácidos nucleicos de uma mistura de candidatos pelo menos em dois grupos com base em sua afinidade relativa e/ou na taxa de dissociação para a molécula alvo. A separação pode ser conseguida por vários métodos conhecidos na técnica, que incluem filtração, cromatografia de afinidade, separação líquido-líquido, HPLC, etc. Por exemplo, os pares de ácido nucleico-proteína se podem ligar a filtros de celulose enquanto que os ácidos nucleicos não ligados não. Podem ser utilizadas também colunas que retêm especificamente complexos de ácido nucleico-alvo para a separação. Por exemplo, o oligonucleótidos capazes de se associar com uma molécula alvo se ligam à coluna permite a utilização de cromatografia de coluna para separar e isolar os aptámeros de maior afinidade. Podem ser utilizados também contas em que se conjugam as moléculas alvo para a separação de aptámeros numa mistura. Se as contas são paramagnéticas, a separação pode ser conseguida por meio da aplicação de um campo magnético. Pode ser utilizado a tecnologia de ressonância de plasmões superficiais para separar ácidos nucleicos numa mistura imobilizando um alvo num chip sensor e fazendo fluir a mistura acima do chip, em que os ácidos nucleicos que têm afinidade pelo alvo podem se ligar ao alvo e o resíduo dos ácidos nucleicos podem ser eliminados por lavagem. Pode ser utilizado a separação líquido-líquido assim como o atraso de filtração em gel e centrifugação em gradiente de densidade. Os marcadores de afinidade nas moléculas alvo também podem ser utilizados para separar moléculas de ácido nucleico ligadas ao alvo marcado dos aptámeros que estão livres em solução. Por exemplo, moléculas marcadas biotiniladas podem ser sequestradas, juntamente com os aptámeros ligados a elas, da solução de sequências de ácido nucleico sem ligar utilizando contas paramagnéticas de estreptavidina biotiniladas. Os marcadores de afinidade também podem ser incorporados no aptámero durante a preparação.
Como é utilizado no presente documento, "fotoSELEX" é um acrónimo de Evolução Sistemática Fotoquímica de Ligandos por enriquecimento Exponencial (do inglês: Photochemical Systematic Evolution of Ligands by Exponential) e refere-se a formas de realização do processo SELEX em que são gerados aptámeros de fotorreticulação. Numa forma de realização do processo fotoSELEX, incorpora-se um nucleótido fotorreativo ativado por absorção de luz em lugar de uma base nativa em qualquer biblioteca ARN - ou ADNss - aleatória de oligonucleótidos, a mistura de ácidos nucleicos moléculas alvo é irradiada fazendo com que alguns ácidos nucleicos incorporados nos complexos ácido nucleico-molécula alvo sejam reticulados com a molécula alvo por meio dos grupos funcionais fotorreativos, e a etapa de seleção é uma seleção pela atividade de fotorreticulação. 0 processo fotoSELEX é descrito com maior detalhe nas Patentes fotoSELEX.
Como é utilizado no presente documento, "fotoaptámero, "aptámero fotorreativo", e "aptámero fotorreativo" são utilizados de maneira intercambiável para se referir a um aptámero que contém um ou mais grupos funcionais fotorreativos que podem ser ligados covalentemente ou ser "reticulados" com uma molécula alvo. Por exemplo, pode ser modificado um resíduo de ácido nucleico de origem natural para incluir um grupo químico funcional que confere fotorreatividade ao resíduo de ácido nucleico ao exponerse a uma fonte de radiação de uma onda de comprimento apropriada. Em algumas formas de realização, um aptámero fotorreativo se identifica inicialmente. Em outras formas de realização, se identifica primeiro o aptámero e posteriormente se modifica para incorporar um ou mais grupos fotorreativos funcionais, gerando desta maneira um fotoaptámero. Nestas formas de realização, podem ser incorporados um ou mais resíduos de ácido nucleico fotorreativo no aptámero substituindo no aptámero um resíduo de ácido nucleico fotorreativo no lugar de um ou mais de outros nucleótidos, tal como uma ou mais nucleótidos timidina e/ou citidina, por exemplo, ou modificando um ou mais resíduos de ácido nucleico para incluir um grupo fotorreativo funcional.
Os grupos fotorreativos funcionais exemplares que podem ser incorporados num fotoaptámero incluem, 5-bromouracilo, 5-iodouracilo, 5-bromoviniluracilo, 5-iodoviniluracilo, 5-azidouracilo, 4-tiouracilo, 5-tiouracilo, 4-tiocitosina, 5-bromocitosina, 5-iodocitosina, 5-bromovinilcitosina, 5-iodovinilcitosina, 5-azidocitosina, 8-azidoadenina, 8-bromoadenina, 8-iodoadenina, 8-aziodoguanina, 8-bromoguanina, 8-iodoguanina, 8-azidohipoxantina, 8-bromohipoxantina, 8-iodohipoxantina, 8-azidoxantina, 8-bromoxantina, 8-iodoxantina, 5-[(4-azidophenacyl)tio]citosina, 5-[(4-azidophenacyl) tio]uracilo, 7-deaza-7-iodoadenina, 7-deaza-7-iodoguanina, 7-deaza-7-bromoadenina, e 7-deaza-7-bromoguanina.
Além destes grupos fotorreativos funcionais que se baseiam nestes nucleósidos exemplares, podem ser utilizados também outros grupos fotorreativos funcionais que podem ser adicionados a um extremidade terminal de um aptámero utilizando uma molécula ligante apropriada. Tais grupos fotorreativos funcionais incluem benzofenona, antraquinona, 4-azido-2-nitro-anilina, psoraleno, derivados de qualquer de estes, e similares.
Um grupo fotorreativo funcional que é incorporado num fotoaptámero pode ser ativado por qualquer método adequado. Numa forma de realização, um fotoaptámero que contém um grupo fotorreativo funcional pode ser reticulado com seu alvo expondo o fotoaptámero e sua molécula alvo ligada a uma fonte de radiação eletromagnética. Tipos adequados de radiação eletromagnética incluem luz ultravioleta, luz visível, raio X, e raio gama. As fontes de radiação adequadas incluem fontes que utilizam tanto luz monocromática como luz policromática filtrada.
Como é utilizado no presente documento, a expressão "o processo SELEX de afinidade" refere-se às formas de realização do processo SELEX em que são gerados aptámeros sem fotorreticulação com os alvos. Em algumas formas de realização do processo SELEX de afinidade, o alvo é imobilizado num suporte sólido bem antes ou depois de que seja posto em contato o alvo com a mistura de ácidos nucleicos candidatos. A associação do alvo com o suporte sólido permite aos ácidos nucleicos da mistura de candidatos que se liguem e no caso em que se utilize um processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta, permanecer ligados ao alvo para se separar do resíduo da mistura de candidatos. A expressão "processo SELEX de afinidade com contas" refere-se a formas de realização particulares do processo SELEX de afinidade em que o alvo é imobilizado numa conta, por exemplo, antes de pô-la em contato com a mistura de ácidos nucleicos candidatos. Em algumas formas de realização, as contas são contas paramagnéticas. A expressão "processo SELEX de afinidade em placas" refere-se a formas de realização em que os complexos ácido nucleico-alvo são separados da mistura de candidatos graças a seu associação com um filtro, tal como um filtro de nitrocelulose. Isto inclui formas de realização em que o alvo e os ácidos nucleicos inicialmente são postos em contato em solução, e são postos em contato com o filtro, e também inclui formas de realização em que os ácidos nucleicos são postos em contato com o alvo que está pré-imobilizada no filtro. A expressão "processo SELEX de afinidade em placa" refere-se a formas de realização em que o alvo está imobilizada na superfície de uma placa, tal como, por exemplo, uma placa microtiter multipoço. Em algumas formas de realização, a placa está composta de poliestireno. Em algumas formas de realização, o alvo está ligado à placa no processo SELEX de afinidade em placa por meio de interações hidrófobas. A presente divulgação descreve métodos SELEX melhorados para gerar aptámeros que são capazes de se ligar a moléculas alvo. Mais especificamente, a presente divulgação descreve métodos para identificar aptámeros e/ou fotoaptámeros que têm taxas de dissociação mais lentas de suas respetivas moléculas alvo que os aptámeros que são obtidos com os métodos SELEX prévios. A divulgação descreve além disso aptámeros e/ou fotoaptámeros que são obtidos com os métodos que são descritos no presente documento e métodos de utilização dos mesmos.
Numa disposição, proporciona-se um método para identificar um aptámero que tem uma taxa de dissociação lenta de sua molécula alvo, o método compreende (a) preparar uma mistura de candidatos de sequências de ácidos nucleicos; (b) por em contato a mistura de candidatos com uma molécula alvo em que os ácidos nucleicos com as maiores afinidades relativas para a molécula alvo se ligam preferentemente à molécula alvo, formando complexos ácido nucleico-molécula alvo; (c) aplicar um processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta para permitir a dissociação dos complexos ácido nucleico-molécula alvo com taxas de dissociação relativamente rápidas; (d) separar os complexos ácido nucleico-molécula alvo restantes dos ácidos nucleicos e as moléculas não alvo da mistura de candidatos; e (e) identificar um aptámero para uma molécula alvo. 0 processo pode incluir além disso a etapa repetida de amplificação dos ácidos nucleicos que se ligam à molécula alvo para produzir uma mistura de ácidos nucleicos enriquecida em sequências que são capazes de se ligar à molécula alvo e produzir complexos ácido nucleico-molécula alvo que têm taxas de dissociação lentas. Como foi definido anteriormente, o processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta pode ser selecionado dentre diluir a mistura de candidatos que contém os complexos de ácido nucleico-alvo, adicionar pelo menos um competidor à mistura de candidatos que contém os complexos ácido nucleico-molécula alvo, e diluir a mistura de candidatos que contém os complexos de ácido nucleico-molécula alvo e adicionar pelo menos um competidor à mistura de candidatos que contém os complexos ácido nucleico-molécula alvo.
Numa disposição, proporciona-se um método para identificar um aptámero que tem uma taxa de dissociação lenta de sua molécula alvo, compreendendo o método: (a) preparar uma mistura de ácidos nucleicos candidatos; (b) por em contato a mistura de candidatos com uma molécula alvo, em que os ácidos nucleicos têm uma afinidade aumentada pela molécula alvo para a molécula alvo com respeito a outros ácidos nucleicos da mistura de candidatos da mistura de candidatos, que se ligam à molécula alvo formando complexos ácido nucleico-molécula alvo; (c) incubar a mistura de candidatos e a molécula alvo juntamente durante um período de tempo suficiente para conseguir a ligação em equilíbrio; (d) adicionar um excesso de pelo menos uma molécula competidora à mistura de (c) ; (e) incubar a mistura da mistura de candidatos, os complexos ácido nucleico-molécula alvo e a molécula competidora de (d) durante um período de tempo determinado; (f) separar os complexos de ácido nucleico-molécula alvo da mistura de candidatos; (g) dissociar os complexos de ácido nucleico-molécula alvo para gerar ácidos nucleicos livres; (h) amplificar os ácidos nucleicos livres para produzir uma mistura de ácidos nucleicos enriquecida em sequências de ácidos nucleicos que são capazes de se ligar à molécula alvo com uma afinidade aumentada, pudiéndose identificar desta maneira um aptámero para uma molécula alvo.
Em outra disposição, proporciona-se um método para produzir um aptámero que tem uma taxa de dissociação lenta de sua molécula alvo, compreendendo o método a preparação ou síntese de um aptámero que inclui uma sequência de ácido nucleico que se identifica pelo seguinte processo que compreende as etapas de: (a) preparar uma mistura de ácidos nucleicos candidatos; (b) por em contato a mistura de candidatos com uma molécula alvo, em que os ácidos nucleicos têm uma afinidade aumentada pela molécula alvo com respeito a outros ácidos nucleicos da mistura de candidatos que se ligam à molécula alvo, formando complexos ácido nucleico-molécula alvo; (c ) incubar a mistura de candidatos e a molécula alvo juntamente durante um período de tempo suficiente para conseguir a ligação em equilíbrio; (d) adicionar um excesso de pelo menos uma molécula competidora à mistura de (c ); (e) incubar a mistura da mistura de candidatos, complexos de ácido nucleico-molécula alvo e a molécula competidora de (d) durante um tempo de tempo determinado; (f) separar os complexos de ácido nucleico-molécula alvo da mistura de candidatos; (g) dissociar os complexos de ácido nucleico-molécula alvo para gerar ácidos nucleicos livres; (h) amplificar os ácidos nucleicos livres para produzir uma mistura de ácidos nucleicos enriquecidos em sequências de ácidos nucleicos que são capazes de se ligar à molécula alvo com uma afinidade aumentada, sendo identificado desta maneira um aptámero para a molécula alvo.
Em outra forma de realização, proporciona-se um método para identificar um aptámero que tem uma taxa de dissociação lenta de sua molécula alvo, compreendendo o método: (a) preparar uma mistura de ácidos nucleicos candidatos, em que a mistura de candidatos compreende ácidos nucleicos em que uma, várias ou todas as pirimidinas em pelo menos um, ou cada, ácido nucleico da mistura de candidatos está modificada na posição 5; (b) por em contato a mistura de candidatos com uma molécula alvo, em que os ácidos nucleicos têm uma afinidade aumentada pela molécula alvo com respeito a outros ácidos nucleicos da mistura de candidatos que se ligam à molécula alvo, formando complexos de ácido nucleico-molécula alvo; (c) separar os ácidos nucleicos com afinidade aumentada do resíduo da mistura de candidatos; e (d) amplificar os ácidos nucleicos com afinidade aumentada para produzir uma mistura de ácidos nucleicos enriquecida em ácidos nucleicos que são capazes de se ligar à molécula alvo com uma afinidade aumentada, podendo ser identificado um aptámero para a molécula alvo.
Em outra forma de realização, proporciona-se um método para produzir um aptámero que tem uma taxa de dissociação lenta de sua molécula alvo, compreendendo dito método a preparação ou síntese de um aptámero que inclui uma sequência de ácido nucleico identificada pelo seguinte processo: (a) preparar uma mistura de ácidos nucleicos candidatos que compreende ácidos nucleicos em que uma, várias ou todas as pirimidinas de pelo menos um, ou cada um, dos ácidos nucleicos da mistura de candidatos está modificada na posição 5; (b) por em contato a mistura de candidatos com uma molécula alvo, em que os ácidos nucleicos têm uma afinidade aumentada para a molécula alvo com respeito a outros ácidos nucleicos da mistura de candidatos que se ligam à molécula alvo, formando complexos de ácido nucleico-molécula alvo; (c) separar os ácidos nucleicos com afinidade aumentada do resíduo da mistura de candidatos; e (d) amplificar os ácidos nucleicos com afinidade aumentada para produzir uma mistura de ácidos nucleicos enriquecida em sequências de ácido nucleico que são capazes de se ligar à molécula alvo com afinidade aumentada, identificando desta maneira um aptámero para a molécula alvo.
Em outra disposição, se proporciona um complexo não covalente de um aptámero e seu alvo, em que a taxa de dissociação (11/2) do aptámero do alvo é escolhida dentre um de: mais de ou igual a cerca de 30 minutos; entre cerca de 30 minutos e cerca de 240 minutos; entre cerca de 30 minutos a cerca de 60 minutos; entre cerca de 60 minutos a cerca de 90 minutos, entre cerca de 90 minutos a cerca de 120 minutos; entre cerca de 120 minutos a cerca de 150 minutos; entre cerca de 150 minutos a cerca de 180 minutos; entre cerca de 180 minutos a cerca de 210 minutos; entre cerca de 210 minutos a cerca de 240 minutos.
Em outra disposição se proporciona um complexo não covalente de um aptámero e um alvo, em que o aptámero tem uma kd para um alvo de cerca de 100 nM ou menos, em que a taxa de dissociação (11/2) do aptámero do alvo é maior ou igual a cerca de 30 minutos, e em que uma, várias, ou todas as pirimidinas da sequência de ácido nucleico do aptámero estão modificadas na posição 5 da base. As modificações se podem selecionar do grupo de compostos que são mostradas na FIG. 14, estas modificações são designadas como "nucleótidos de base modificada". Os aptámeros podem ser projetados com qualquer combinação de bases pirimidínicas modificadas que se deseje.
Os métodos melhorados para levar a cabo o SELEX com nucleótidos modificados, que incluem nucleótidos que contêm grupos fotoativos ou nucleótidos que contêm locais de substituição para grupos fotoativos são revelados no Pedido U.S. N° Série 12/175.388, intitulado "Improved SELEX and PHOTOSELEX" que foi apresentado ao mesmo tempo que o presente Pedido. Em outra forma de realização a mistura de candidatos de moléculas de ácido nucleico inclui ácidos nucleicos que contêm bases de nucleótido modificadas que podem ajudar na formação de complexos de ácido nucleico-alvo modificados com taxas de dissociação relativamente lentas.
Os distintos métodos e etapas que são descritos no presente documento podem ser utilizados para gerar um aptámero capaz de ou (1) se ligar a uma molécula alvo ou (2) se ligar a uma molécula alvo e posteriormente formar uma ligação covalente com a molécula alvo ao ser irradiado.
Os aptámeros identificados de acordo com os métodos descritos no presente documento são úteis numa variedade de métodos de diagnóstico e terapêuticos. Os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta se ligarão ao alvo durante maior duração. Isto é útil nos métodos de diagnóstico em que a ligação de um aptámero e o alvo pode ser utilizado para detetar a presença, ausência, quantidade de ou quantificar a molécula alvo e uma interação prolongada do aptámero e o alvo facilita tal deteção. Uma vantagem similar pode ser conseguida quando são utilizados os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta em métodos de diagnóstico por imagem, in vitro ou in vivo. Uma interação prolongada do aptámero e o alvo também proporciona métodos de tratamento terapêutico melhores em que a interação prolongada pode permitir um melhor efeito terapêutico, por exemplo, devido à ativação ou inibição mais larga da molécula alvo ou cascata de sinalização a jusante.
Em consequência, em várias formas de realização, os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta que são obtidos, identificam ou produzem pelos métodos descritos podem ser utilizados numa variedade de métodos de tratamento médico ou métodos de diagnóstico (in vitro ou in vivo) . Os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta podem ser utilizados num método para o tratamento de uma doença. Os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta podem ser utilizados num método para o diagnóstico de doenças in vivo. Os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta podem ser utilizados in vitro para o diagnóstico de uma doença. Um aptámero com uma taxa de dissociação lenta pode ser utilizado no fabrico de um agente terapêutico (por exemplo, uma composição farmacêutica) ou o fabrico de um agente diagnóstico para utilização num método de tratamento ou diagnóstico de doenças. As aplicações de diagnóstico ou terapêuticas dos aptámeros com uma taxa de dissociação lenta podem estar implicados num resultado diagnóstico ou terapêutico que depende da ligação especifica e/ou de alta afinidade do aptámero com uma taxa de dissociação lenta a seu alvo. Os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta também podem ser utilizados em ensaios de validação de alvos e de seleção de alto rendimento no processo de desenvolvimento de fármacos.
Os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta são reagentes adequados para o diagnóstico molecular por imagem in vivo. Nesta disposição pode ser utilizado um aptámero com uma taxa de dissociação lenta in vivo para detetar a presença de uma patologia, processo de doença, ou outra condição patológica no corpo de um indivíduo (por exemplo, um ser humano ou um animal) , em que a ligação do aptámero a seu alvo indica a presença do processo de doença ou outra condição patológica. Por exemplo, pode ser utilizado um aptámero para o recetor do VEGF in vivo para detetar a presença de cancro numa área em particular (por exemplo, um tecido, um órgão, etc.) do corpo de um indivíduo já que o recetor do VEGF é expresso abundantemente em tumores e sua neovascularização, ou pode ser utilizado in vivo um aptámero para o recetor do EGF para detetar a presença de cancro numa área em particular (por exemplo, um tecido, um órgão, etc.) do corpo de um indivíduo, já que o recetor do EGF é expresso com frequência com altos níveis nas células tumorais. Isto é, o alvo molecular estará no domínio extracelular (ECD) de um recetor induzido, tais alvos se localizam no exterior das células e são acessíveis por meio do sistema vascular. Além disso, os ECD tendem a se localizar no local da patologia, inclusive algumas partes pequenas do ECD específico podem se desprender por meio de processos biológicos, que incluem a morte celular.
Os candidatos óbvios para o diagnóstico molecular por imagem, os anticorpos monoclonais de alta afinidade, não chegam a ser os reagentes de escolha para esta aplicação. Os reagentes de diagnóstico molecular por imagem têm requisitos precisos. Têm que ter uma alta atividade de ligação para a pretendida alvo, e baixa atividade de ligação para outros alvos num ser humano ou animal. Os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta têm vantagem únicas que os tornam desejáveis para utilização em diagnóstico molecular por imagem in vivo. Por um lado, são selecionados por ter constantes de taxa de dissociação lenta, permitindo desta maneira a residência in vivo do alvo pretendido durante uma quantidade de tempo substancial (pelo menos cerca de 30 minutos). Por outro lado, espera-se que os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta tenham um aclaramento muito rápido do sistema vascular. As constantes de taxa de dissociação lenta e o rápido aclaramento do sistema vascular são duas propriedades que se desejam para o diagnóstico molecular por imagem in vivo. Desde a perspetiva cinética, os bons reagentes de diagnóstico molecular por imagem in vivo devem ser localizados no local da patologia enquanto que a concentração de reagente livre no sistema vascular circundante permanece baixa. Isto é um sinal para ruido restringida. As relações sinal para ruido adequadas podem ser obtidas por acumulação da sinal no local da patologia em excesso respeito à sinal no sistema vascular, ou podem ser obtidas por retenção de um sinal no local da patologia enquanto que diminui a concentração no sistema vascular.
Os aptámeros que não têm propriedades de taxa de dissociação lenta, de cerca do mesmo massa molecular e carga liquida que os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta, foram estudados em animais e seres humanos durante mais de uma década. Em geral, descobriu-se que estes aptámeros são retirados do sistema vascular rapidamente, habitualmente entrando no rim e/ou o fígado e depois são metabolizados mais para a excreção. Tais aptámeros mostram uma retirada denominada de "primeiro passo" a menos que se liguem grupos acessórios de massa molecular alta (tais como por exemplo, PEG) aos aptámeros. Fora feitas experiências com um aptámero cujo alvo era tenascina C, uma proteína extracelular (nãoumECD) que está em altas concentrações em alguns tumores. Nestas experiências, o aptámero específico da tenascina C era retiraod rapidamente e era capaz de permanecer no local do tumor devido a que a concentração local extracelular da tenascina C era muito alta. Os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta, pelo contrário, manterão a taxa de aclaramento rápida de aptámeros mas oferecem uma vantagem cinética devido a suas taxas de dissociação lentas, tornando-os adequados para utilização com alvos cuja presença no local de interesse (por exemplo, o local da patologia) possa ser de alguma maneira escasso (ECD nos tumores, por exemplo).
Os reagentes alternativos para o diagnóstico molecular por imagem não compartem as duas propriedades dos aptámeros com uma taxa de dissociação lenta (isto é, taxa de dissociação lenta e rápida retirada da corpo). Os anticorpos monoclonais com frequência têm uma alta afinidade e especificidade, e pode ter constantes de taxa de dissociação lenta; no entanto, os anticorpos monoclonais têm taxas de retirada do sistema vascular muito lentas. Os péptidos curtos, que são identificados por meio de, por exemplo, fagos de apresentação, podem ter retirada rápida, porém baixa afinidade e especificidade e taxas de dissociação rápidas de sus pretendidas alvos. Os Aficorpos, uma versão peptídica particular de um anticorpo mimético, podem ter uma afinidade e especificidade razoáveis e podem ter uma retirada mais rápida que os anticorpos monoclonais, e com a finalidade de conseguir taxas de dissociação lentas de sus alvos, os aficorpos com frequência são produzidos como dímeros e multímeros de maior ordem, retardando sua retirada aclaramento ao mesmo tempo que se aumentam suas taxas de dissociação.
Os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta podem ser utilizados para o diagnóstico molecular in vivo com um grupo acessório tanto para proteger o aptámero com uma taxa de dissociação lenta das nucleases no corpo como para detetar o alvo pretendido uma vez que se liga ao aptámero com uma taxa de dissociação lenta. Por exemplo, os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta podem ser atacados pelas nucleases no sangue, tipicamente exonucleases (para o ADN) que se bloqueiam facilmente utilizando grupos acessórios refratários a exonucleases nas posições dos extremidades 5' e 3' do aptámero com uma taxa de dissociação lenta, ou endonucleases (para o ARN) que se bloqueiam facilmente incorporando pirimidinas refratarias às endonucleases (tais como, por exemplo, 2' fluoro nucleótidos) no aptámero com uma taxa de dissociação lenta. A deteção do complexo aptámero com uma taxa de dissociação lenta-alvo pode ser conseguida ligando um resíduo de deteção no aptámero com uma taxa de dissociação lenta. Em algumas disposições, o resíduo de deteção para esta finalidade pode incluir jaulas para moléculas radioativas (por exemplo, tecnécio 99), grupos de ferro para a deteção por ressonância magnética, isótopos de flúor para o diagnóstico por imagem PET, e similares. Os modificações que são feitas no aptámero com uma taxa de dissociação lenta para proteger a integridade do aptámero com uma taxa de dissociação lenta no corpo e possibilitar a deteção do alvo pretendido deveriam ser projetadas de forma que não interfiram na interação do aptámero com uma taxa de dissociação lenta com seu alvo e que não produza que o aptámero com uma taxa de dissociação lenta seja retirado demasiado lentamente do sistema vascular.
Também são fornecidos dispositivos de diagnóstico ou ensaio, por exemplo, colunas, tiras de ensaio ou biochips, que têm aderidos um ou mais aptámeros com uma taxa de dissociação lenta a uma superfície sólida do dispositivo. 0(s) aptámero (s) pode (m) ser posicionado (s) de forma que seja capaz de se ligar às moléculas alvo que são postas em contato com a superfície sólida para formar complexos aptámero-alvo que permanecem ligados à superfície do dispositivo, capturando desta maneira o alvo e possibilitando a deteção e opcionalmente a quantificação do alvo. Pode ser proporcionada uma matriz de aptámeros com uma taxa de dissociação lenta (que podem ser iguais ou diferentes) em tal dispositivo. São fornecidos complexos que incluem um aptámero com uma taxa de dissociação lenta e uma molécula alvo. Proporciona-se uma classe de aptámeros que se caracteriza por ter uma alta afinidade para suas correspondentes moléculas alvo e taxas de dissociação lentas (ti/2) de um complexo não covalente do aptámero e o alvo.
Com referência à FIG. IA, o processo SELEX básico geralmente começa com a preparação da mistura de ácidos nucleicos candidatos com sequências diferentes. A mistura de candidatos inclui em geral sequências de ácido nucleico que incluem duas regiões fixas (isto é, cada um dos membros da mistura de candidatos contém a mesmas sequências na mesma localização) e uma região variável. Tipicamente as regiões de sequência fixas são selecionadas tal que ajudem à etapa de amplificação descrita posteriormente, ou aumentem o potencial de uma determinada disposição estrutural dos ácidos nucleicos na mistura de candidatos. A região variável proporciona tipicamente a região de ligação ao alvo de cada ácido nucleico da mistura de candidatos, e esta região variável pode ser completamente aleatória (isto é, a probabilidade de encontrar uma base em qualquer posição é de uma a quatro) ou somente parcialmente aleatória (por exemplo, a probabilidade de encontrar uma base em qualquer localização pode ser selecionado a qualquer nível entre 0 e 100 por cento) . A mistura de candidatos preparada é posta em contato com o alvo selecionado sob condições que favorecem que seja produzida a ligação entre o alvo e os membros da mistura de candidatos. Sob estas condições, a interação entre o alvo e os ácidos nucleicos da mistura de candidatos forma geralmente pares ácido nucleico-alvo que têm a afinidade relativa mais forte entre os membros do par. Os ácidos nucleicos com a afinidade mais alta pelo alvo são separados dos ácidos nucleicos com menor afinidade pelo alvo. O processo de separação é levada a cabo de uma maneira que retém o máximo número de candidatos de alta afinidade. Estes ácidos nucleicos selecionados durante a separação que têm uma afinidade relativamente alta pelo alvo são amplificados para criar uma nova mistura de candidatos que está enriquecida em ácidos nucleicos que têm uma afinidade relativamente alta pelo alvo. Repetindo as etapas de separação e amplificação anterior, a mistura de candidatos de nova formação contém pouco a pouco sequências únicas, e o grau médio de afinidade da mistura de ácidos nucleicos pelo alvo geralmente aumentará. Levado a este extremo, o processo SELEX produzirá uma mistura de candidatos que contenha um ou um número muito baixo de ácidos nucleicos únicos que representem os ácidos nucleicos da mistura de candidatos original que têm a afinidade mais alta pela molécula alvo. No entanto, o processo básico SELEX não seleciona aptámeros que tenham taxas de dissociação lenta de sus alvos.
As Patentes SELEX e as Patentes FotoSELEX descrevem e elaboram este processo com grande detalhe. Estas patentes incluem descrições dos distintos alvos que podem ser utilizados no processo; métodos para a preparação da mistura de candidatos inicial; métodos para separar os ácidos nucleicos de uma mistura de candidatos; e métodos para amplificar os ácidos nucleicos separados para gerar misturas de candidatos enriquecidas. As Patentes SELEX também descrevem soluções de aptámeros que são obtidos para vários dos diferentes tipos das moléculas alvo, que incluem alvos proteicos em que a proteína é ou não uma proteína que se liga ao ácido nucleico.
Com referência à FIG. 1B o processo SELEX modificado que é revelado no presente documento inclui a introdução de um processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta que segue ao equilíbrio da mistura de ácidos nucleicos candidatos com o alvo ou alvos e uma etapa de separação antes das etapas posteriores do processo SELEX. A introdução de um processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta no processo SELEX básico proporciona um meio para o enriquecimento de complexos de afinidade de aptámero com taxas de dissociação lentas de um grupo de complexos ácido nucleico-alvo que inclui uma variedade de taxas de dissociação. Portanto, o processo SELEX modificado proporciona um método para identificar aptámeros que se ligam a moléculas alvo, e uma vez que se ligaram, têm umas taxas de dissociação relativamente lentas (também designadas no presente documento como taxa de dissociação) da molécula alvo.
Como é utilizado no presente documento, "ligação" refere-se em geral à formação de uma associação não covalente entre o ligando e o alvo, embora tal ligação não seja necessariamente reversível. As expressões "complexo ácido nucleico-alvo" ou "complexo" ou "complexo de afinidade" são utilizados para se referir ao produto de tal associação de ligação não covalente.
Em várias formas de realização, os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta podem ser oligonucleótidos ARN ou ADN de cadeia dupla ou cadeia simples. Os aptámeros podem conter bases não padrão ou modificadas. Além disso, os aptámeros podem conter qualquer tipo de modificação. Como é utilizado no presente documento, uma "base modificada" pode incluir uma modificação relativamente simples respeito a um resíduo de ácido nucleico natural, cuja modificação confere um mudança nas propriedades físicas do resíduo de ácido nucleico. Tais modificações incluem, mas não se limitam a, modificação na posição 5 de pirimidinas, substituição com grupos hidrófobos, por exemplo, benzilo, isobutilo, indol, ou naftilo, ou a substituição com grupos hidrófilos, por exemplo, amina quaternaria ou guanidinio, ou grupos mais "neutros", por exemplo, imidazol e similares. Podem estar presentes modificações adicionais no anel de ribose, por exemplo, na posição 2' , tais como 2'-amino (2'-NH2) e 2'-fluoro (2'-F), ou a estrutura principal fosfodiéster, por exemplo, fosforotioatos ou metil fosfonatos.
Em várias formas de realização, uma mistura de candidatos que contém um grupo aleatorio de sequências de ácidos nucleicos que contêm bases de nucleótidos modificadas é misturada com uma quantidade da molécula alvo e permite que se estableça a ligação em equilíbrio com a molécula alvo. Em geral, somente alguns dos ácidos nucleicos que se ligam com alta afinidade à molécula alvo serão separados eficazmente com o alvo.
Em várias formas de realização, a mistura de candidatos inclui sequências de ácidos nucleicos que têm regiões variáveis que incluem grupos modificados . Os grupos modificados podem ser bases de nucleótidos modificadas. A região variável pode conter sequências completa ou parcialmente aleatórias; também podem conter subpartes de uma sequência fixa que se incorpora com a região variável. Os nucleótidos das regiões fixas também podem conter bases de nucleótido modificadas, ou podem conter o grupo de referência das bases de origem natural.
Em algumas formas de realização, a amplificação ocorre depois de que os membros da mistura de ensaio foram separados, e é o ácido nucleico o que se amplifica. Por exemplo, a amplificação das moléculas de ARN pode ser levada a cabo por uma sequência de três reações: fazer cópias ADNc dos ARN selecionados, utilizando a reação em cadeia da polimerase para aumentar o número de cópias de cada ADNc, e transcrever as cópias de ADNc para obter moléculas de ARN que têm as mesmas sequências que os ARN selecionados. Pode ser utilizado qualquer reação ou combinação de reações que conhecem-se na técnica que sejam apropriadas, incluindo replicação de ADN, a amplificação direta de ARN e similares, como reconhecerão os peritos na especialidade. 0 método de amplificação pode dar como resultado proporções da mistura amplificadas que sejam representativas das proporções de diferentes sequências da mistura antes da amplificação. Se sabe que muitas modificações em ácidos nucleicos são compatíveis com a amplificação enzimática. As modificações que não são compatíveis com a amplificação podem ser feitas após cada ciclo de amplificação, se fosse necessário. A mistura de ácidos nucleicos candidatos pode ser modificada de várias maneiras para aumentar a probabilidade de ácidos nucleicos que têm propriedades que facilitem ou outras propriedades desejáveis, particularmente as que aumentam a interação entre o ácido nucleico e o alvo. As modificações contempladas incluem modificações que introduzem outros grupos químicos que têm a carga correta, polaridade, ligações hidrogénio, ou interação eletrostática para aumentar as interações ligando-alvo desejadas. As modificações que podem aumentar as propriedades de ligação, que incluem as taxas de afinidade e/ou dissociação, do ácido nucleico, por exemplo, incluem resíduos hidrófilos, resíduos hidrófobos, estruturas rígidas, grupos funcionais que estão em proteínas tais como imidazois, álcoois primários, carboxilatos, grupos guanidinio, grupos amino, tiois e similares. As modificações podem ser utilizadas também para aumentar a sobrevivência dos complexos aptámero-alvo sob pressões de seleção rigorosas que ser aplicadas para produzir aptámeros com uma taxa de dissociação lenta para uma ampla variedade de alvos. Numa forma de realização é utilizado Bz-dU (benzil-dU) na geração das misturas de candidatos que são utilizados para produzir aptámeros com uma taxa de dissociação lenta, embora outros nucleótidos modificados também são adequados para a produção de tais aptámeros. Outros nucleótidos modificados são mostradas na FIG. 14.
Uma mistura de candidatos com nucleótidos modificados para as finalidades desta aplicação é qualquer das misturas de candidatos ARN e ADN que incluem tanto os de origem natural como nucleótidos distintos dos de origem natural. As modificações adequadas incluem modificações de cada resíduo do ácido nucleico, num único resíduo do ácido nucleico, em resíduos aleatórios, em todas as pirimidinas ou todas as purinas, em todas de uma base específica que esteja presente (isto é, G, C, A, T ou U) no ácido nucleico, ou qualquer outro esquema de modificação que possa ser adequado para uma aplicação em particular. Admite-se que a modificação não é um pré-requisito para facilitar a atividade ou a capacidade de ligação dos aptámeros. Os aptámeros podem incluir resíduos modificados dUTP e dCTP.
As misturas de candidatos para os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta podem compreender um grupo de pirimidinas que têm uma modificação diferente na posição C-5 da base. A modificação C-5 poder ser introduzida por meio de uma ligação amida, diretamente, ou indiretamente por meio de outro tipo de enlace. Estas misturas de candidatos são utilizadas num processo SELEX para identificar aptámeros com uma taxa de dissociação lenta. Este processo pode incluir também a utilização do processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta. As misturas de candidatos se podem produzir enzimática ou sinteticamente.
Como foi descrito anteriormente, os nucleótidos podem ser modificados num número qualquer de maneiras, incluindo modificações da ribose e/ou fosfatos e/ou posições de bases. Certas modificações são descritas na Patente U.S. N° 5.428.149 intitulada "Method for Palladium Catalyzed Carbon-Carbon Coupling and Products", Patente U.S. N° 5.580.972 intitulada "Purine Nucleoside Modifications by Palladium Catalyzed Methods". Numa forma de realização, as modificações são aquelas em que outro grupo químico se liga à posição 5 de uma pirimidina, a posição 8 de uma purina, ou a posição 2' de um açúcar. Não ha limitação no tipo do outro grupo químico que poder ser incorporado nos nucleótidos individuais. Em algumas formas de realização, o nucleótido modificado resultante pode ser amplificado ou modificado posteriormente às etapas de amplificação (veja-se, por exemplo, a Patente U.S. N° 6,300,074 intitulada "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Chemi-SELEX".
Em outras formas de realização mais, certos nucleótidos são modificados por um método para produzir aptámeros que se ligam e formam uma reticulação covalente com sua molécula alvo pela foto-ativação do complexo de afinidade. Este método abrange aptámeros que se ligam a, fotorreticulam com, e/ou fotoinativam moléculas alvo. Em várias formas de realização, os aptámeros contêm grupos fotorreativos que são capazes de se fotorreticular com a molécula alvo ao ser irradiados com luz. Em outras formas de realização, os aptámeros são capazes de formar ligações com o alvo em ausência de radiação.
Um grupo fotorreativo pode ter qualquer estrutura química que contenha um f otocromóf oro e que seja capaz de fotoentrecruzarse com uma molécula alvo. Embora sejam designados no presente documento grupos fotorreativos, em alguns casos, como é descrito posteriormente, não é necessária a radiação para que seja produzida a ligação covalente entre o aptámero e o alvo. Em algumas formas de realização, o grupo fotorreativo absorverá a luz de uma determinada comprimento de onda que não é absorvida pelo alvo nem pelas porções modificadas do oligonucleótido. Os grupos fotorreativos incluem 5-halo-uridinas, 5-halo-citosinas, 7-halo-adenosina, 2-nitro-5-aziodbenzoilos, diazirinas, aril azidas, aril azidas fluoradas, benzofenonas, amino-benzofenonas, psoralenos, antraquinonas, etc.
Os grupos fotorreativos em geral formam ligações com ο alvo por radiação do par associado de ácido nucleico-alvo. Em alguns casos, a radiação não se necessita para que seja produzida a formação de ligações. A reticulação que se produz tipicamente será a formação de uma ligação covalente entre o aptámero e o alvo associado. No entanto, pode ser produzido também uma forte interação iónica entre ao aptámero e alvo ao ser irradiado.
Numa forma de realização, a reticulação ocorre devido à exposição a radiação eletromagnética. A radiação eletromagnética inclui a luz ultravioleta, a luz visível, os raio X, e os raio gama.
Em outras várias formas de realização, uma seleção limitada de oligonucleótidos que utiliza o método SELEX é seguido por uma seleção utilizando um método fotoSELEX. Os ciclos iniciais da seleção SELEX são levadas a cabo com oligonucleótidos que contêm grupos fotorreativos. Após um número de ciclos SELEX é levada a cabo o fotoSELEX para selecionar oligonucleótidos capazes de se ligar com a molécula alvo.
Em outra forma de realização, é descrito a produção de um aptámero que inclui uma seção clivável ou libertável (também descrita como um elemento ou componente) na sequência de aptámero. Estes componentes ou elementos adicionais são elementos ou componentes estruturais que introduzem uma funcionalidade adicional no aptámero e portanto são elementos ou componentes funcionais. 0 aptámero é produzido além disso com um ou mais dos seguintes componentes adicionais (também descritos como elemento ou componente ou meio funcional ou estrutural em qualquer combinação destes termos): um marcador ou componente detetável, um componente espaçador, e um marcador específico da ligação ou componente ou elemento de imobilização.
Como foi destacado anteriormente, a presente divulgação proporciona métodos para identificar aptámeros que se ligam a moléculas alvo e uma vez ligados têm taxas de dissociação lentas. As taxas de dissociação lentas que são obtidos com este método podem exceder uma semivida de cerca de uma hora e como muito cerca de 240 minutos, isto é, uma vez que se gera o grupo de complexos ácido nucleico-alvo, a metade dos complexos do grupo permanecem ligados depois de uma hora. Devido ao efeito de um processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta que depende das diferentes taxas de dissociação dos complexos de afinidade de aptámeros, a duração do processo de taxa de dissociação lenta é escolhida de forma que retenha uma alta proporção de complexos de afinidade de aptámeros com taxas de dissociação lenta enquanto que é reduzida o número de complexos de afinidade de aptámeros com taxas de dissociação rápidas. Por exemplo, incubando a mistura durante períodos relativamente mais longos de tempo após realizar o processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta serão selecionados aptámeros com taxas de dissociação mais longass que os aptámeros selecionados utilizando processos de enriquecimento de taxa de dissociação lenta que têm períodos de incubação mais curtos.
Em várias disposições, a mistura de candidatos é misturada com uma quantidade da molécula alvo e se permite que se estabeleça uma ligação em equilíbrio com a molécula alvo. Antes de separar o alvo ligada a ácidos nucleicos dos que estão livres na solução, realiza-se um processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta para enriquecer a população ligada com taxas de dissociação lenta. Como foi destacado anteriormente, o processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta pode ser aplicado por adição de uma molécula competidora, por diluição da amostra, por uma combinação de diluição da amostra em presença de uma molécula competidora. Portanto, numa forma de realização, o processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta é aplicado introduzindo moléculas competidoras na mistura que contém os complexos ácido nucleico-alvo e incubando a mistura durante certo período de tempo antes de separar os ácidos nucleicos livres de ligação. A quantidade de moléculas competidoras geralmente é um ordem de magnitude maior que o das moléculas de ácidos nucleicos e pode ser maior em dois ou mais ordens de magnitude. Em outra forma de realização, o processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta se aplica diluindo a mistura de amostra de complexos de ácido nucleico-alvo várias vezes (por exemplo, pelo menos cerca de uma de 2x, 3x, 4x, 5x) de Volume e incubando a mistura um certo período de tempo antes da separação de ácidos nucleicos livres de ligação. 0 Volume de diluição é geralmente pelo menos uma ordem de magnitude maior, e pode ser cerca de dois ou mais ordens de magnitude maior, que o Volume original. Em outra forma de realização mais, uma combinação de moléculas competidoras e diluição é utilizado para aplicar o processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta. Em outra forma de realização, as misturas de candidatos que demostraram que dão como resultado um aumento da frequência de aptámeros com uma taxa de dissociação lenta são utilizados para selecionar vários aptámeros candidatos. Estes aptámeros são rastreados para identificar os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta.
Em outra disposição, produz-se um aptámero com uma taxa de dissociação lenta que inclui uma seção clivável ou libertável na região fixa do aptámero. 0 aptámero pode ser produzido também com um ou mais dos seguintes componentes adicionais: um componente marcador, um componente espaçador, e um marcador específico da ligação. Quaisquer destes elementos podem ser introduzidos num aptámero de cadeia simples. Numa disposição, o elemento é introduzido na extremidade 5' do aptámero. Em outra disposição, incluem-se um ou mais destes elementos criando um aptámero parcialmente de cadeia dupla, em que uma cadeia contém os distintos elementos desejados assim como uma sequência complementária a uma das seções de sequência fixa da segunda cadeia que contém a região variável de ligação ao alvo.
Um elemento ou resíduo ou componente "clivável" ou "libertável" refere-se a um grupo funcional em que certos ligações do grupo funcional se podem romper para produzir 2 componentes separados. Em várias formas de realização, o grupo funcional se pode clivar ao irradiar o grupo funcional (fotoclivável) com o comprimento de onda apropriada ou por tratamento com os reagentes químicos ou enzimáticos adequados. Em outra forma de realização, o elemento libertável pode ser uma ligação dissulfureto que pode ser tratada com um agente redutor para destruir a ligação. 0 elemento libertável permite ao complexo de afinidade aptámero/alvo que está ligado a um suporte sólido que se separe do suporte sólido, tal como por eluição do complexo. 0 elemento libertável pode ser estável nas condições do resíduo do ensaio e pode ser libertável sob condições que não destruam o complexo aptámero/alvo.
Como é revelado no presente documento, um aptámero pode compreender além disso um "marcador" ou um "componente ou elemento de imobilização" ou um "componente ou elemento de ligação especifica" que refere-se a um componente que proporciona um meio para ligar ou imobilizar um aptámero (e qualquer molécula alvo que se liga a ele) a um suporte sólido. Um "marcador" é um grupo de cópias de um tipo ou espécie de componente que é capaz de se associar com uma sonda. "Marcadores" refere-se a mais de um de tais grupos de componente. 0 marcador pode ser ligado a ou incluído no aptámero por qualquer método adequado. Em geral, o marcador permite ao aptámero se associar, seja direta ou indiretamente, com uma sonda ou recetor que está ligado ao suporte sólido. A sonda pode ser altamente específica em sua interação com o marcador e manter essa associação durante as etapas de processo ou procedimentos posteriores. Um marcador pode possibilitar a localização de um complexo de afinidade de aptámero (ou complexo de afinidade de aptámero covalente opcional) numa direção espacial definida sobre um suporte sólido. Os diferentes marcadores, portanto, podem possibilitar a localização de diferentes complexos de aptámero covalentes em diferentes direções definidas espacialmente sobre um suporte sólido. Um marcador pode ser um polinucleótido, um polipéptido, um ácido nucleico peptídico, um ácido nucleico bloqueado, um oligossacárido, um polissacárido, um anticorpo, um aficorpo, um anticorpo mimético, um recetor celular, um ligando, um lípido, biotina, qualquer fragmento ou derivado destas estruturas, qualquer combinação do anterior, ou qualquer outra estrutura com a qual pode ser projetada ou configurada uma sonda (ou molécula ligante, como é descrito posteriormente) para se ligar ou de alguma maneira se associar com especificidade. Em geral, um marcador configura-se tal que não interaja intramolecularmente consigo mesmo ou com o aptámero ao que está ligado ou do qual é uma parte. Se for utilizado SELEX para identificar um aptámero, o marcador pode ser adicionado ao aptámero ou pré- ou pós-SELEX. 0 marcador é incluído na extremidade 5' do aptámero pós-SELEX, ou o marcador é incluído na extremidade 3' do aptámero pós-SELEX, ou os marcadores podem ser incluídos em ambos extremidades 3' e 5' dos aptámeros no processo pós-SELEX.
Como é ilustrado na FIG. 8D, um corante fluorescente (tal como Cy3), os resíduos fotocliváveis e biotina são adicionados todos na extremidade do aptámero. Devido a as potenciais interações entre o resíduo fotoclivável e o corante, se inserta um espaçador entre os dois resíduos. Todas as construções podem ser sintetizadas utilizando técnicas de referência de fosforamidita. As construções de aptámero representativas são mostradas na FIG. 9A a FIG. 9F. A funcionalidade pode ser dividida entre a extremidade 5' e 3' ou ser combinada em cada extremidade. Além dos meios fotocliváveis, podem ser utilizados outros resíduos cliváveis, incluindo resíduos cliváveis química ou enzimaticamente. Pode ser utilizado uma variedade de resíduos espaçadores e podem ser incluídos um ou mais resíduos de biotina. Também podem ser incluídos marcadores (também designados como elementos ou componentes de imobilização ou ligação específica) distintos da biotina. Os reagentes de construção adequados incluem biotina fosforamidita, ligante PC ((Glen Research PN 10-4920-02); PC biotina fosforamidita (Glen Research PN 10-4950-02); dSpacer CE fosforamidita (Glen Research PN 10-1914-02); Cy3 fosforamidita (Glen Research PN 10-5913-02); e Arm26-Ach
Espaçador Amidita (Fidelity Systems PN SP26Ach-05).
Numa forma de realização, os modificadores de bases dos nucleótidos são utilizados na produção da região variável do aptámero. Estes nucleótidos modificados demostraram que produzem aptámeros que têm taxas de dissociação de sus alvos muito lentas.
Nos métodos da presente divulgação a mistura de candidatos pode compreender ácidos nucleicos modificados em que um, vários (por exemplo, um de, ou pelo menos um de, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30) ou todas as pirimidinas em pelo menos um, ou cada um, dos ácidos nucleicos de uma mistura de candidatos estão quimicamente modificadas na posição 5. Opcionalmente, todos os resíduos C dos ácidos nucleicos da mistura de candidatos estão modificados quimicamente na posição 5. Opcionalmente, todos os resíduos T dos ácidos nucleicos da mistura de candidatos estão modificados quimicamente na posição 5. Opcionalmente, todos os resíduos OU dos ácidos nucleicos da mistura de candidatos estão modificados quimicamente na posição 5.
Em outra forma de realização, os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta são misturados com ou expostos a uma amostra. Permite-se que o aptámero com uma taxa de dissociação lenta reaja ou se ligue a seu alvo específico na amostra para formar um complexo. Podem ser utilizadas uma variedade de métodos para detetar o alvo ou o aptámero. O alvo pode ser detetado no complexo ou ao ser libertado do complexo. O aptámero pode ser detetado no complexo ou ao ser libertado do complexo. O complexo aptámero/alvo pode ser utilizado para isolar o alvo específico de outros componentes na amostra de ensaio. Podem ser utilizados múltiplos aptámeros quando se deseja um ensaio múltiplo para a deteção de uma variedade de alvos. O método da presente divulgação é ilustrado em geral nos Exemplos 1-7. O método da presente divulgação é ilustrado em geral nos Exemplos 1-6. O exemplo 1 descreve o método SELEX de afinidade geral utilizando uma mistura de candidatos composta por nucleótidos modificados. 0 Exemplo 2 descreve um método fotoSELEX utilizando uma mistura de candidatos composta por nucleótidos modificados e um grupo fotorreativo na extremidade 5', e o método SELEX melhorado em que é utilizado a diluição para proporcionar o processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta para a mistura aptámero:alvo em equilíbrio. 0 Exemplo 3 estende o método descrito no Exemplo 2 adicionando um competidor à etapa de diluição. 0 Exemplo 4 ilustra a eficácia do processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta. 0 valor médio de semivida de dissociação (tl/2) para os aptámeros que utilizam nucleótidos modificados 5-benzil-dUTP (BzdUTP), 5-isobutil-dUTP (iBdUTP), ou 5-triptamino-dUTP que são selecionados em ausência de um processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta era de 20 minutos com alguns aptámeros que tinham um valor de th de até uma hora. Este é substancialmente mais longo que o que foi descrito anteriormente com bases naturais ou outros nucleótidos modificados. A média para aptámeros selecionados com um processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta era de mais de 85 minutos. Mais especificamente, com referência à Figura 3B, se pode apreciar que a introdução de um processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta produz aptámeros com valores de ti/2 de cerca de > 30 min., > 60 min., > 90 min., > 120 min., > 150 min., > 180 min., > 210 e cerca de > 240 min. Estas taxas de dissociação para os complexos aptámero:alvo não têm anteriores. O Exemplo 5 descreve a geração de aptámeros com uma taxa de dissociação lenta utilizando uma mistura de candidatos NpdUTP. O Exemplo 6 descreve a geração de um aptámero com uma taxa de dissociação lenta para um alvo peptídico.
EXEMPLOS
Os seguintes exemplos são fornecidos com fins ilustrativos somente e não se pretende que limitem o âmbito da invenção como é definido nas reivindicações anexas.
Exemplo 1. Incorporação de nucleótidos modificados em bibliotecas de ácidos nucleicos que origina bibliotecas enriquecidas de alta afinidade no SELEX de afinidade A. Preparação das misturas de candidatos
As misturas de candidatos foram preparadas com dATP, dGTP, 5-metil-dCTP (MedCTP) e ou bem dTTP ou um de três análogos dUTP : 5-Benzil-dUTP (BzdUTP), 5-isobutil-dUTP (iBdUTP), ou 5-triptamino-dUTP (TrpdUTP). As misturas de candidatos foram preparadas por extensão de polimerase de um iniciador hibridado com uma matriz biotinilada (FIG. 2). Para cada composição de mistura de candidatos, foram combinados 4,8 nmol de iniciador de PCR direto e 4 nmol de matriz em 100 μΐ de lx tampão de ADN polimerase KOD (Novagen), aquecendo a 95 °C durante 8 minutos, e arrefecido em gelo. Cada 100 μΐ da mistura iniciador:matriz foi adicionado a 400 μΐ à reação de extensão que continha lx tampão de ADN polimerase KOD, 0, 125 OU/μΙ de ADN polimerase KOD, e 0,5 mM de cada um de dATP, MedCTP, dGTP, e dTTP ou análogos de dUTP, e foram incubadas a 70 °C, 30 minutos. O produto de cadeia dupla foi capturado por meio das cadeias de biotinas da matriz adicionando 1 ml de contas magnéticas revestidas de estreptavidina (MagnaBind Streptavidin, Pierce, 5 mg/ml em NaCl a 1 M + 0, 05% de TWEEN-20) e foram incubadas a 25 °C durante 10 minutos misturando. As contas foram lavadas três vezes com 0,75 ml de Tampão SB1T (40 mM de HEPES, pH 7,5, 125 mM de NaCl, 5 mM de KC1, 1 mM de MgCl2, 0,05% de TWEEN-20). A cadeia de aptámero foi eluída das contas com 1,2 ml de NaOH 20 mM, foi neutralizada com 0,3 ml de HC1 80 mM, e foi tamponada com 15 μΐ de HEPES 1 M, pH 7,5. As misturas de candidatos foram concentradas com um Centricon-30 a cerca de 0,2 ml, e foi quantificada por espetrometria de absorvância UV. B. Imobilização dos alvos proteicos
Os alvos proteicos foram adquiridos com marcadores poli His, tais como, marcadores (His) 6 (R&D Systems) e foram imobilizados com contas paramagnéticas Co+2-NTA (TALON, Invitrogen). os alvos proteicos foram diluídos a 0,2 mg/ml em 0,5 ml de Tampão B/W (50 mM de fosfato-Na, pH 8,0, 300 mM de
NaCl, Ο, 01% de TWEEN-20) , e foram adicionados a 0,5 ml de contas TALON (pré-lavadas três vezes em Tampão B/W e re-suspendidas a 10 mg/ml em Tampão B/W). A mistura foi rotacionada durante 30 minutos a 25 °C e foi armazenada a 4 °C até sua utilização. As contas TALON revestidas com o péptido (His)6 também foram preparadas e armazenadas como anteriormente. Antes da utilização, as contas foram lavadas 3 vezes com Tampão B/W, uma vez com SB1T, e foram ressuspensas em SB1T. C. Esquema de seleção de aptámeros
As seleções de afinidade foram levadas a cabo por separado com cada mistura de candidatos, comparando a ligação entre as contas de alvo proteico (sinal, S) e as contas (His)6 (sinal de fundo, F). Para cada amostra, foram preparados 0,5 μΜ de mistura de ADN candidatos em 40 μΐ de SB1T. Foi adicionado 1 μΐ de complemento oligo-(His)6 (1 mM) (FIG. 2) ao ADN, juntamente com 10 μΐ de uma mistura de proteína competidora (0, 1% de HSA, 10 μΜ de caseína, e 10 μΜ de protrombina em SB1T) .
As reações de ligação foram levados a cabo adicionando 50 μΐ de contas revestidas de proteína ou contas revestidas de (His)6 (5 mg/ml em SB1T) à mistura de ADN e incubando a 37 °C durante 15 minutos, misturando. A solução de ADN foi retirada e foram lavadas 5 vezes as contas a 37 °C com SB1T que continha 0, 1 mg/ml de ADN de esperma de arenque (Sigma-Aldrich) . A menos de que se indique, todos as lavagens foram levados a cabo re-suspendendo as contas em 100 μΐ de solução de lavagem, misturando durante 30 segundos, separando as contas com um imã, e eliminando a solução de lavagem. Os aptámeros ligados foram eluídos das contas adicionando 100 μΐ de SB1T + 2 M de Guanidina-HCl e incubando a 37 °C, 5 minutos com misturado. O aptámero eluído foi transferido a um novo tubo após a separação magnética. Depois das dois primeiros ciclos de seleção, as duas lavagens finais dos cinco das contas de alvo, foram feitos durante 5 minutos em vez de 30 segundos.
As contas de iniciador foram preparadas imobilizando o iniciador de PCR inverso biotinilado em contas paramagnéticas revestidas com estreptavidina (MyOne-SA, Invitrogen). 5 ml de contas MyOne-SA foram lavadas uma vez (10 mg/ml) com NaCIT (5 M NaCl, 0,01% TWEEN-20), e foram ressuspensas em 5 ml de iniciador de PCR inverso biotinilado (5 μΜ em NaCIT) . A amostra foi incubada a 25 °C, 15 minutos, foi lavada duas vezes com 5 ml de NaCIT, foi ressupensa em 12,5 ml de NaCIT (4 mg/ml), e foi armazenada a 4 °C.
Foram adicionados 25 μΐ de contas de iniciador (4 mg/ml em NaCIT) aos 100 μΐ da solução de aptámero em Tampão de Guanidina e foi incubada a 50 °C, 15 minutos com mistura. A solução foi retirada de aptámero, e as contas foram lavadas 5 vezes com SB1T. O aptámero foi eluído das contas adicionando 85 μΐ de NaOH 20 mM, e foi incubado a 37 °C, 1 minuto com mistura. Foram transferidos 80 μΐ do eluído a um tubo novo após a separação magnética, foi neutralizado com 20 μΐ de HC1 80 mM, e foi tamponado com 1 μΐ de Tris-HCl 0,5 M, pH 7,5. D. Amplificação e purificação de aptámeros O aptámero ADN selecionado foi amplificado e quantificado por QPCR. Foram adicionados 48 μΐ de ADN a 12 μΐ de Mistura QPCR (5x Tampão de ADN polimerase KOD, 25 mM de MgCl2, 10 μΜ de iniciador de PCR direto, 10 μΜ de iniciador de PCR inverso biotinilado, 5x SYBR verde I, 0,125 OU/μΙ ADN Polimerase KOD, e 1 mM de cada dATP, dCTP, dGTP, e dTTP) e foi realizada a ciclagem térmica num instrumento ABI5700 QPCR com o seguinte protocolo: 1 ciclo de 99,9 °C, 15 segundos, 55 °C, 10 segundos, 70 °C, 30 minutos; 30 ciclos de 99,9 °C, 15 segundos, 72 °C, 1 minuto. A quantificação foi feita com o software do instrumento e comparou-se o número de cópias de ADN selecionado com contas de alvo e contas de (His) 6 para determinar as relações sinal/sinal de fundo.
Depois da amplificação, foi capturado o produto de PCR em contas MyOne-SA por meio da cadeia antisense biotinilada. Foram lavadas 1,25 ml de contas MyOne-SA (10 mg/ml) duas vezes com 0,5 ml de NaOH 20 mM, uma vez com 0,5 ml de SB1T, foram ressuspensas em 2,5 ml de NaCl 3 M, e foram armazenadas a 4 °C. As contas MyOne-SA (4 mg/ml em NaCl 3 M) foram adicionadas a 50 μΐ do produto de QPCR de cadeia dupla e foram incubadas a 25 °C, 5 minutos com mistura. As contas foram lavadas uma vez com SB1T, e a cadeia sense foi eluida das contas adicionando 200 μΐ de NaOH 20 mM, e foi incubada a 37 °C, 1 minuto com mistura. A cadeia eluida foi descartada e as contas foram lavadas 3 vezes com SB1T e uma vez com NaCl 16 mM. A cadeia de aptámero sense foi preparada com a composição de nucleótidos apropriada por extensão do iniciador a partir da cadeia antisense imobilizada. As contas foram ressuspensas em 20 μΐ da mistura de reação de extensão do iniciador (lx de Tampão de ADN Polimerase KOD, MgCÍ2 1,5 mM, 5 μΜ iniciador de PCR direto, 0,125 OU/μΙ de ADN Polimerase KOD, 0,5 mM de cada dATP, MedCTP, dGTP, e dTTP ou análogos de dUTP) e foram incubadas a 68 °C, 30 minutos com mistura. As contas foram lavadas 3 vezes com SB1T, e foi eluida a cadeia de aptámero das contas adicionando 85 μΐ de NaOH 20 mM, e foi incubada a 37 °C, 1 minuto com mistura. Foram transferidos 80 μΐ do aptámero eluido a um novo tubo após a separação magnética, foi neutralizada com 20 μΐ de HC1 80 mM, e foi tamponada com 5 μΐ de HEPES 0,1 M, pH 7,5. E. Restringência e Retroalimentação da Seleção A concentração relativa de alvo proteico da etapa de seleção diminuiu em cada ciclo em resposta à relação S/F da seguinte maneira, onde o sinal S e o sinal de fundo F foram definidos na Seção C anterior: se S/F < 10, [P] (i+ 1) = [P]i se 10 < S/F < 100, [P] (i + l) = [P]i / 3,2 se S/F > 100, [P] (i + l) = [P]i / 10 onde [P] = concentração de proteína e i = número de ciclo atual. A concentração de alvo proteico foi diminuída ajustando a massa das contas de alvo proteico (e contas de (His) 6 para a determinação da sinal de fundo) gue são adicionados à etapa de seleção.
Depois de cada ciclo de seleção, foi determinado o estado de convergência da mistura de ADN enriguecida. Foram diluídos 5 μΐ do produto de QPCR de cadeia dupla até 200 μΐ com 4 mM de MgCÍ2 gue continha lx SYBR verde I. Foram superpostas as amostras com 75 μΐ de óleo de silício e foram analisados em quanto à convergência utilizando um análise C0t que mede o tempo de hibridação para as misturas de complexos de oligonucleótidos de cadeia dupla. A mistura foi submetida a uma ciclagem térmica com o seguinte protocolo: 3 ciclos a 98 °C, 1 minuto, 85 °C, 1 minuto; 1 ciclo de 93 °C, 1 minuto, 85 °C, 15 minutos. Durante os 15 minutos a 85 °C, foram medidas as imagens de fluorescência a intervalos de 5 segundos. A intensidade de fluorescência foi representada em função do log (tempo) para avaliar a diversidade das sequências. F. Medição da constante de ligação em equilíbrio (Kd)
As constantes de ligação em equilíbrio das bibliotecas enriquecidas foram medidas utilizando a separação de contas TALON. 0 ADN foi renaturalizado por aquecimento a 95 °C e arrefecimento lentamente até 37 °C. Os complexos foram formados misturando uma concentração baixa de ADN radiomarcado (~ lxlCT11 M) com um intervalo de concentrações de alvo proteico (lxlCT7 M a lxlCT12 M final) em tampão SB1 (descrito anteriormente), e foram incubadas a 37 °C. Uma porção de cada reação foi transferida a uma membrana de náilon e foi seca para determinar as contagens totais de cada reação. Foi adicionado uma pequena quantidade de 5 mg/ml de contas MyOne TALON (Invitrogen) ao resíduo de cada reação e foi misturado a 37 °C durante um minuto. Uma porção se pasó através de uma placa HV Multiscreen (Millipore) a vácuo para separar os complexos com proteína ligada do ADN sem ligar e foi lavada com 100 μΐ de Tampão SB1. As membranas de náilon e as Placas HV Multiscreen foram submetidas a fosforoimagem e a radioatividade foi quantificada de cada amostra utilizando um FUJI FLA-3000. A fração de ADN capturado foi representada em função da concentração de proteína e foi utilizado um algoritmo de ajuste da curva não linear para extrair as constantes de ligação em equilíbrio (valores Kd) dos dados. O quadro 1 amostra os valores de Kd que foram determinados para cada mistura de candidatos enriquecida para um grupo de alvos. NT indica que a biblioteca enriquecida para uma composição de bases particular não parece que tenha mudado com relação à mistura de candidatos original, como se determina pelo análise C0t (descrito previamente), e portanto não se ensayó (NT). 0 Quadro 1 mostra as constantes de ligação em equilíbrio (Kd) para os grupos enriquecidos de quinze alvos proteicos diferentes e quatro bibliotecas de ADN diferentes: bases de origem natural (dT), benzilo (BzdU) , isobutilo (iBdU) ou triptofano (TrpdU). É desejável um aptámero com uma Kd menor de 1 x 1CT8. A utilização de bases modificadas no processo SELEX produz uma percentagem significativamente mais alto de aptámeros desejáveis de alta afinidade. Observou-se que somente 2 dos 14 aptámeros produzidos com os nucleótidos normais têm as taxas de dissociação lentas desejadas. Os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta que são produzidas com os nucleótidos modificados foram identificados como 9 de 14, 7 de 14, e 14 de 14 para BzdUTP, iBdUTP, e TRPdUTP, respetivamente.
Quadro 1. Constantes de ligação em equilíbrio (Kd) das bibliotecas enriquecidas que são selecionados com diferentes nucleótidos modificados, aapresentadas em unidades de molaridade. NT = Não testado.
Exemplo 2. Geração de Fotoaptámeros que utiliza FotoSELEX 5' Fixo e processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta por diluição. A. Preparação das misturas de candidatos
As misturas de candidatos que continham dATP, dCTP, dGTP, e BzdTTP foram preparadas por extensão com polimerase de um iniciador hibridado com uma matriz biotinilada (FIG. 4A-B). Para cada matriz, são utilizados quatro iniciadores diretos diferentes, cada um tinha um único cromóforo na extremidade 5' (FIG. 5) . Para cada mistura de candidatos, foram combinados 11 nmol de iniciador direto (com o cromóforo em 5') e 10 nmol de matriz em 250 μΐ de Tampão de Extensão de Iniciador (120 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM de KC1, 6 mM de (NH4)2S04, 7 mM de MgS04, 0,1 mg/ml de BSA, 0,1% de Triton X-100), foram aquecidos a 95 °C durante 5 minutos, e foram arrefecidos em gelo. Foram adicionados 125 μΐ de cada mistura iniciador:matriz a 1 ml da reação de extensão que continha o Tampão de extensão do Iniciador, 0,125 OU/ μΐ de ADN Polimerase KOD, e 0,5 de cada dATP, dCTP, dGTP, e BzdUTP, e foram incubadas a 70 °C, 30 minutos. Cada 1 ml de reação foi dividida em quatro alíquotas de 250 μΐ e foram arrefecidos em gelo. Foi capturado o produto de cadeia dupla por meio das cadeias com biotinas da matriz adicionando 1 ml de contas magnéticas revestidas de estreptavidina (MagnaBind-Streptavidin, Pierce, 5 mg/ml em 1 M de NaCl + 0,05% de TWEEN-20) a cada alíquota de 250 μΐ e foram incubadas a 25 °C durante 60 minutos com mistura. As contas foram lavadas três vezes com 0,5 ml de Tampão SB17T (40 mM de HEPES, pH 7,5, 125 mM de NaCl, 5 mM de KC1, 5 mM de MgCl2, 1 mM de EDTA, 0,05% de TWEEN-20). A cadeia de aptámero foi eluída das contas com 1 ml de NaOH 20 mM, foi neutralizada com 0,25 ml de HC1 80 mM, e foi tamponada com 10 μΐ de HEPES 1 M, pH 7,5. As misturas de candidatos foram concentradas com Centricon-30 a cerca de 0,2 ml por espetrometria de absorvância UV. B. Preparação de alvos proteicos
Os alvos proteicos sem marcar foram biotinilados por acoplamento covalente de NHS-PE04-biotina (Pierce) a resíduos de lisina. As proteínas (300 pmol em 50 μΐ) foram permutados em SB17T com uma coluna Sephadex G-25 microspin. Foi adicionado NHS-PE04-biotina a 1,5 mM e a reação foi incubada a 4 °C durante 16 horas. A NHS-PE04-biotina que não reagiu foi retirada com uma coluna Sephadex G-25 microspin. C. Seleção de aptámeros com o processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta e fotorreticulação
As seleções foram levados a cabo por separado com cada mistura de candidatos, comparando a ligação entre as amostras com alvo proteico (sinal S) e as amostras sem alvo proteico (sinal de fundo F). Os primeiros três ciclos foram levados a cabo com a seleção por afinidade (sem fotorreticulação) ; a segunda e terceira inclui o processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta. Os ciclos quatro a oito incluem tanto o processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta como o fotorreticulação.
Para cada amostra, foi preparado uma mistura de ADN de 90 μΐ em SB17T com 10-20 pmol de mistura de candidatos (100 pmol na primeira ciclo) e 100 pmol de iniciador inverso. As amostras foram aquecidas a 95 °C durante 3 minutos e foram arrefecidos a 37 °C a uma taxa de 0,1 C/segundo. As amostras foram combinadas com 10 μΐ de mistura de proteínas competidoras (0,1% de HSA, 10 μΜ de caseína e 10 μΜ de protrombina em SB17T) , foram adicionados a 0,5 mg de contas MyOne Dynal Estreptavidina (pré-lavadas duas vezes com 20 mM de NaOH e uma vez com SB17T) , e foram incubadas a 37 °C durante 5 minutos com mistura. As contas foram retiradas por separação magnética.
As reações de ligação foram levadas a cabo adicionando 10 μΐ de alvo proteico (0,5 μΜ em SB 17T) ou SB 17T a 40 μΐ de mistura ADN e incubando a 37 °C durante 30 minutos.
Quando foi utilizado o processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta, as amostras foram diluídas 20x adicionando 950 μΐ de SB17T (pré-aquecendo a 37 °C), e foram incubadas a 37 °C durante 30 minutos antes da captura dos complexos .
Foram capturados os complexos em contas SA por meio de proteínas biotina adicionando 0,25 mg de contas MyOne-SA (Invitrogen) e foram incubadas a 37 °C durante 15 minutos com mistura. O ADN livre foi retirado lavando as contas cinco vezes com SB17T. A menos de que se indique, todas as lavagens foram levados a cabo ressuspendendo as contas em 100 μΐ de solução de lavagem, misturando durante 30 segundos a 25 °C, separando as contas com um imã, e retirando a solução de lavagem. A cadeia de aptámero foi eluída das contas adicionando 85 μΐ de NaOH 20 mM, e incubando a 37 °C, 1 minuto com mistura. Foram transferidos 80 μΐ do aptámero eluído a um tubo novo após a separação magnética, foi neutralizada com 20 μΐ de HC1 80 mM, e foi tamponada com 1 μΐ de Tris-HCl 0,5 M, pH 7,5.
Quando foi utilizada a foto-seleção, as reações de ligação de 50 μΐ, (ou 1 ml de reações de ligação após o processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta opcional por diluição) foram irradiadas desde cima com uma lâmpada de mercúrio de alta pressão (Optical Associates, Inc. modelo 0131-0003-01, 500W, com espelho de 310 nm). As amostras de candidatos que tinham um cromóforo BrdU foram irradiados durante 37 segundos, as que tinham um cromóforo ANA foram irradiados durante 60 segundos, e as que tinham um cromóforo AQ ou psoraleno foram irradiados durante 10 minutos. Foi utilizado um filtro adicional (placa de cristal de 5 mm) para os cromóforos ANA, AQ e psoraleno para eliminar os comprimentos de onda desnecessárias, e potencialmente danosas menores de 320 nm. Foram capturados os complexos como anteriormente, e o ADN foi retirado não reticulado lavando as contas uma vez com 4 M de guanidina-HCl + 0,05% de TWEEN-20 a 50 °C durante 10 minutos, uma vez com NaOH a 20 mM a 25 °C durante 2 minutos, duas vezes com SB17T, e uma vez com 16 mM de NaCl. O ADN reticulado não foi eliminado da superfície das contas para as etapas de amplificação. D. Amplificação e purificação de aptámeros 0 aptámero ADN foi amplificado e quantificado por QPCR. Foram adicionados 48 μΐ de ADN a 12 μΐ de mistura QPCR (5x Tampão ADN Polimerase KOD, 25 mM MgCl2, 10 μΜ iniciador de PCR direto, 10 μΜ iniciador de PCR inverso biotinilado, 5x SYBR Verde I, 0,125 OU/ μΐ de ADN Polimerase KOD, e 1 mM de cada dATP, dCTP, dGTP, e dTTP) e foi submetida a ciclagem térmica num instrumento QPCR MylQ Bio-Rad com o seguinte protocolo: 1 ciclo de 99, 9 °C, 15 seg, 55 °C, 10 seg, 68 °C, 30 min, 30 ciclos de 99, 9 °C, 15 segundos, 72 °C, 1 minuto. Para os ciclos fotoSELEX, é levada a cabo a incubação inicial de 30 minutos. A quantificação foi feita com o software do instrumento e o número de cópias de ADN selecionado com e sem alvo proteico foi comparado para determinar as relações sinal/sinal de fundo.
Quando foi utulizada foto-seleção, uma cópia ADNc do ADN selecionado foi preparada por extensão do iniciador na superfície das contas. As contas lavadas foram ressuspensas em 20 μΐ de mistura de extensão de ADNc (Tampão de Extensão de Iniciador que continha 5 μΜ de iniciador de PCR inverso, 0,5 mM de cada dATP, dCTP, dGTP, e dTTP, 0,125 OU/μΙ ADN Polimerase KOD) e foram incubadas a 68 °C durante 30 minutos com mistura. As contas foram lavadas 3 vezes com SB17T, e a cadeia de aptámero foi eluída das contas adicionando 85 μΐ de NaOH 20 mM, e foi incubada a 37 °C, 1 minuto com mistura. Foram transferidos 80 μΐ do aptámero eluído a um novo tubo após a separação magnética, foi neutralizado com 20 μΐ de HC1 80 mM, e foi tamponado com 1 μΐ de Tris-HCl 0,5 M, pH 7,5. O ADNc foi amplificado e quantificado por QPCR como anteriormente pelos 30 ciclos de 99,9 °C, 15 segundos, 72 °C, 1 minuto.
Depois da amplificação, o produto de PCR foi capturado em contas MyOne-SA por meio da cadeia antisense biotinilada. Foram lavadas duas vezes 1,25 ml de contas MyOne-SA (10 mg/ml) com 0,5 ml de NaOH 20 mM, uma vez com 0,5 ml de SB17T, foram ressuspensas em 1,25 ml de NaCl 3 M + 0,05% Tween, e foram armazenadas a 4 °C. Foram adicionados 25 μΐ de contas MyOne-SA (10 mg/ml em 3 M de NaCIT) a 50 μΐ de produto de QPCR de cadeia dupla e foram incubados a 25 °C, 5 minutos com mistura. As contas foram lavadas uma vez com SB17T, e foi eluída a cadeia sense das contas adicionando 200 μ de NaOH 20 mM, e foi incubada a 37 °C, 1 minuto com mistura. A cadeia eluída foi descartada e as contas foram lavadas 3 vezes com SB17T e uma vez com NaCl 16 mM. O aptámero da cadeia sense foi preparado com o cromóforo apropriado por extensão do iniciador a partir da cadeia antisense imobilizada. As contas foram ressuspensas em 20 μΐ de mistura de reação de extensão do iniciador (lx Tampão de Extensão de Iniciador, 1,5 mM de MgCÍ2, 5 μΜ de iniciador direto com o cromóforo 5' adequado, 0,5 mM de cada um de dATP, dCTP, dGTP, e BzdUTP, e 0,125 OU/μΙ de ADN Polimerase KOD) e foram incubadas a 68 °C, 30 minutos com mistura. As contas foram lavadas 3 vezes com SB 17T, e a cadeia de aptámero foi eluída das contas adicionando 85 μΐ de NaOH 20 mM, e foram incubadas a 37 °C, 1 minuto com mistura. Foram transferidos 80 μΐ do aptámero eluído a um novo tubo após a separação magnética, foi neutralizada com 20 μΐ de HC1 80 mM, e foi tamponada com 5 μΐ de HEPES 0,1 M, pH 7,5. E. Restringência e retroalimentação da seleção O alvo proteico foi ajustado em cada ciclo como é descrito no Exemplo 1, Após cada ciclo de seleção, o estado de convergência do grupo enriquecido foi determinada como é descrito no Exemplo 1. F. Constantes de ligação em equilíbrio de bibliotecas enriquecidas A afinidade de ligação foi determinada como é descrita no Exemplo 1 anterior, exceto que se captura com contas MyOne-SA. A seguinte quadro, o Quadro 2, resume as constantes de ligação em equilíbrio (Kd) que são obtidos utilizando o protocolo fotoSELEX com processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta.
Quadro 2. Constantes de ligação em equilíbrio (Kd) das bibliotecas enriquecidas selecionadas com diferentes cromóforos, apresentadas em unidades de molaridade. As medições não foram feitos nas bibliotecas que não cumpriam a convergência (indicadas com uma x).
G. Ensaio de atividade de reticulação A quantidade de reticulação das bibliotecas enriquecidas foi determinada medindo a percentagem de ADN reticulado com a proteína sob condições de saturação de proteína e luz. 0 ADN radiomarcador (50 pM) foi misturado com o iniciador inverso (16 nM) em SB17T, foi aquecida a 95 °C durante 3 minutos, e foi arrefecida a 37 °C a 0,1 °C/segundo. o alvo proteico foi adicionado à mistura de ADN até uma concentração final de 10 nM e foi incubada a 37 °C durante 30 minutos. Foram preparados simultaneamente as amostras de controlo sem proteína. As amostras foram reticuladas com as condições de cromóforo específico descritas anteriormente, mas com uma dose de saturação (6 minutos para BrdU, 10 minutos para ANA, e 30 minutos para AQ e Psor) . As amostras foram analisadas por desnaturalização PAGE, FIG. 6, e foram quantificadas e foram tabuladas os resultados na Quadro 3.
Quadro 3. Quantidades de reticulações das bibliotecas enriquecidas selecionadas com diferentes cromóforos, apresentadas em unidades de percentagem do ADN total reticulado com a proteína. As medições não foram feitas em bibliotecas que não cumpriam a convergência (indicadas com uma x).
Exemplo 3. Geração de aptámeros com uma taxa de dissociação lenta que utiliza um processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta com um competidor A. Preparação das misturas de candidatos
Foram preparados as misturas que continham dATP, dCTP, dGTP, e BzdUTP por extensão com polimerase de um iniciador hibridado com uma matriz biotinilada para 94 alvos proteicos. Foram combinados 55 nmol de iniciador direto (com cromóforo ANA 5') e 55 nmol de matriz em 0,5 ml de Tampão de Extensão de Iniciador (120 mM de Tris-HCl, pH 7,9, 10 mM de KC1, 6 mM de (NH4)2S04, 0,1 mg/ml BSA, 0,1% Triton X-100), foram aquecidos a 95 °C durante 5 minutos, 48 °C durante 5 minutos, e foi arrefecida em gelo. A mistura iniciador:matriz foi adicionado a 5,5 ml da reação de extensão que continha o Tampão de Extensão de Iniciador, 0,125 OU/μΙ de ADN Polimerase KOD, e 0,5 mM de cada um de dATP, dCTP, dGTP, e BzdUTP, e foram incubadas a 70 °C, 60 minutos. Após completar a reação de extensão, a solução foi arrefecida em gelo. O produto de cadeia dupla foi capturado por meio das cadeias de biotina da matriz adicionando 25 ml de contas magnéticas revestidas de estreptavidina (MagnaBind-Streptavidin, Pierce, 5 mg/ml em 1 M de NaCl + 0, 05% de TWEEN-20) ao produto de extensão do iniciador e foi incubada a 25 °C durante 15 minutos com rotação. As contas foram lavadas três vezes com 40 ml de tampão SB 17T (40 mM de HEPES, pH 7,5, 125 mM de NaCl, 5 mM KC1, 5 mM MgCl2, 1 mM de EDTA, 0,05% TWEEN-20) . A cadeia de aptámero foi eluida das contas com 35,2 ml de NaOH a 20 mM durante 5 minutos com agitado. A cadeia eluida foi neutralizada com 8,8 ml de HC1 a 80 mM, e foi tamponada com 400 μΐ de HEPES 1 M, pH 7,3. As misturas de candidatos foram concentradas com um Centricon-30 a cerca de 0,7 ml, e foram quantificadas por espetrometria de absorvância UV. B. Preparação dos alvos proteicos
Os alvos proteicos sem marcar foram biotinilados como é descrito no Exemplo 2. C. Seleção de aptámeros com o processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta e fotorreticulação
Foram levados a cabo as seleções por separado como é descrito no Exemplo 2, com a adição de 10 mM de sulfato de dextrano como competidor para a re-ligação do aptámero durante o processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta nos ciclos seis a nove. O processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta foi utilizado de três maneiras distintas. Nos ciclos dois e três, foram diluídos as amostras 20x adicionando 950 μΐ de SB17T (pré-aquecendo a 37 °C) , e foram incubadas a 37 °C durante 30 minutos antes da captura dos complexos. Nos ciclos quatro e cinco, foram diluídos as amostras 20x adicionando 950 μΐ de SB17T (pré-aquecendo a 37 °C) , e foram incubadas a 37 °C durante 30 minutos antes da reticulação. Nos ciclos seis e sete, as amostras foram diluídas 20x adicionando 950 μΐ de SB17T (pré-aquecendo a 37 °C) . Foram diluídos de novo 50 μΐ de cada amostra diluída transferindo a 950 μΐ de SB17T + 1' mM 5000 K de sulfato de dextrano (pré-aquecendo a 37 °C) para dar uma diluição total de 400x, e foram incubadas a 37 °C durante 60 minutos antes do reticulação. Nos ciclos oito e nove, foram diluídos as amostras 20x adicionando 950 μΐ de SB17T (pré-aquecendo a 37 °C), e foram diluídos de novo e 50 μΐ de cada amostra transferindo-os a 950 μΐ de SB17T (pré-aquecendo a 37 °C) para dar uma diluição de 400x. Finalmente foram diluídos de novo 50 μΐ das amostras diluídas transferindo a 950 μΐ de SB17T + 10 mM 5000 K de sulfato de dextrano (pré-aquecendo a 37 °C) para dar uma diluição total de 8000x, e foram incubadas a 37 °C durante 60 minutos antes do reticulação. Foram capturados os complexos e foram lavados como é descrito no Exemplo 2. Quando foi utilizado a foto-reticulação, as reações de ligação de 1 ml após o processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta foram irradiadas desde cima com uma matriz de LED de 47 0 nm durante 60 segundos antes da captura do complexo como no Exemplo 2. D. Amplificação e purificação de aptámeros A amplificação e purificação foi levada a cabo como no Exemplo 2. E. Restringência e retroalimentação da seleção O alvo proteico foi ajustado em cada ciclo como é descrito no Exemplo 1, exceto nos ciclos seis e oito. Com a finalidade de maximizar o sinal depois destas grandes diluições, o alvo proteico foi aumentado a 100 nM nos ciclos seis e oito. Após cada ciclo de seleção, o estado de convergência do grupo enriquecido foi determinada como é descrito no Exemplo 1. F. Protocolo de determinação da constante da taxa de dissociação A constante da taxa de dissociação do complexo aptámero:proteína (koff) foi determinada para cada aptámero medindo a fração de complexos aptámero:proteína pré-formados que permaneciam ligados após a diluição em função do tempo. Se equilibro o aptámero radiomarcado (50 pM) em SB17T-0, 002 (SB17T com TWEEN-20 reduzido ao 0,002%) a 37 °C com proteína a uma concentração lOx maior que o valor de Kd medido. Foram diluídos as amostras lOOx com SB17T-0,002 a 37 °C e foram retirados alíquotas em vários pontos de tempo e foram separados para separar os aptámeros livres dos complexos proteína : aptámero. A separação foi conseguida adicionando resina ZORBAX (Agilent) à amostra, capturando os complexos na resina, passando a amostra através de uma membrana DuraPore a vácuo, e lavando a resina com SB17T-0,002. Para as proteínas que não capturam eficazmente pela resina ZORBAX, foi levada a cabo o ensaio com proteína biotinilada em SB17T e a separação era conseguida capturando os complexos com contas MyOne-SA Dyanal. Foi determinada a quantidade de complexo remanente em cada ponto de tempo quantificando o aptámero radiomarcado na resina com um fosforoimaqer FUJI FLA-3000. A fração de complexo foi representada em função do tempo e a constante da taxa de dissociação (koff) e o valor de semivida da dissociação (ti/2) foi determinada ajustando os dados a uma expressão analítica para as cinéticas de dissociação bimolecular utilizando regressão não linear. G. Propriedades cinéticas de alguns aptámeros A seguinte quadro, a Quadro 4, resume os valores de semivida da dissociação (11/2) que foi obtido dos aptámeros selecionados contra 10 alvos utilizando este protocolo.
Quadro 4. Valores de semivida de dissociação (ti/2) de aptámeros utilizando a etapa do protocolo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta com competidor
Exemplo 4: O processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta aumenta a semivida de dissociação de aptámeros selecionados
Os valores da semivida de dissociação (11/2) foram medidos e representados para 65 aptámeros que foram selecionados ou pelo método de afinidade SELEX descrito no Exemplo 1 ou os métodos fotoSELEX descritos na Patente U.S. N° 6.458.539, intitulada "Photoseletion of Nucleic Acid Ligands" sem processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta (Fig. 3A) . Os valores ti/2 também foram medidas e representadas para 72 aptámeros que tinham sido selecionados pelo processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta descrito no Exemplo 2 com um processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta por diluição ou por diluição com competidor (Fig. 3B) . 0 valor 11/2 meio para os aptámeros que utilizavam os nucleótidos modificados 5-benzil-dUTP (BzdUTP), 5-isobutil-dUTP (iBdUTP), ou 5-triptamino-dUTP selecionados em ausência de um processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta era de 20 minutos com alguns aptámeros que tinham um valor de ti/2 de até uma hora. Isto é substancialmente mais longo que o que tinha sido descrito anteriormente com bases naturais ou outros nucleótidos modificados. A média de aptámeros selecionados com um processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta era por encima de 85 minutos com alguns aptámeros que tinham um valor de ti/2 com excesso de quatro horas.
Exemplo 5: Geração de aptámeros de uma biblioteca aleatória NdpUTP A. Preparação das misturas de candidatos
Foram preparados as misturas de candidatos que continham dATP, dCTP, dGTP, e NdpUTP como foi descrito no Exemplo 3 porém sem o grupo fotorreativo 5'-ANA. B. Imobilização de alvos proteicos
Os alvos proteicos que continham um marcador (His)6 e que foram capturada com contas Co + 2-NTA como foi descrito no Exemplo 1. C. Seleção de aptámeros com o processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta A seleção de aptámeros foi levada a cabo como foi descrito no Exemplo 3, mas sem fotorreticulação. D. Amplificação e purificação de aptámeros A amplificação e purificação e levaram a cabo como foi descrito no Exemplo 3. E. Restringência e retroalimentação da seleção A restringência e retroalimentação da seleção foram levados a cabo como foi descrito no Exemplo 3. F. Propriedades dos aptámeros A constante de ligação em equilíbrio (Kd) de quatro aptámeros desta seleção são enumerados na Quadro 5.
Exemplo 6. Geração de aptámeros com uma taxa de dissociação lenta para um alvo peptídico utilizando um processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta A. Preparação das misturas de candidatos
As misturas de candidatos que continham dATP, dCTP, dGTP, e BzdUTP foram preparados or extensão com polimerase de um iniciador com um cromóforo 5' ANA e foram purificados como foi descrito no Exemplo 3. B. Seleção de aptámeros com processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta e fotorreticulação A seleção foi levada a cabo como foi descrito no Exemplo 3, com o alvo peptídico biotinilada SMAP29 (Péptido Antibacteriano mieloide de ovelha MAP-29, Anaspec). C. Amplificação e purificação de aptámeros A amplificação e purificação foram levados a cabo como foi descrito no Exemplo 3. D. Restringência e retroalimentação da seleção A restringência e retroalimentação da seleção foram levados a cabo como foi descrito no Exemplo 3. E. Propriedades dos aptámeros A constante de ligação em equilíbrio (Kd) de um aptámero desta seleção era l,2e-8M (medido de acordo com o protocolo que se ha descrito no Exemplo 1) . A semivida de dissociação (ti/2) deste aptámero era de 69 minutos (medido de acordo com o protocolo que se ha descrito no Exemplo 3). Os resultados são mostrados nas FIG. 12A e FIG. 12B.
Exemplo 7: Captura de afinidade com contas híbridas
Etapa 1: EXEMPLO 7: Medições de proteínas em amostras de ensaio que são capacitadas por aptámeros com taxas de dissociação lentas.
Etapa 1: A preparação das misturas de aptámero/iniciador e amostras de ensaio de aptámeros f com um marcador de deteção biotina Cy3 (4 nM de cada um) oram misturadascom um 3x de excesso de sonda de captura (oligonucleótido complementar à região 3' fixa do aptámero que continha um marcador de biotina e um elemento fotoclivável) em lx SB17T, e foram aquecidos a 95 °C durante 4 minutos depois a 37 °C durante 13 minutos, e foram diluídos 1:4 em lx SB17T. Foram adicionados 55 ul da mistura aptámero/iniciador a uma placa microtiter (Hybaid n° AB-0407) e foram vedados com uma lâmina. As amostras de ensaio foram preparadas numa placa microtiter misturando concentrações conhecidas de analitos proteicos em SB17T e foram diluídos em serie com SB17T.
Etapa 2: Equilíbrio da amostra
Foram adicionados 55 ul da mistura aptámero/iniciador a 55 ul de amostra de ensaio e foram incubadas a 37 °C durante 15 minutos numa placa microtiter vedada com lâmina. A concentração de cada aptámero na mistura de equilíbrio era de 0,5 nM. Após o equilíbrio, todas as etapas posteriores deste método foram levadas a cabo a temperatura ambiente a menos que seja indicado de outro modo.
Etapa 3: Captura de aptámeros e retirada da proteína livre Uma placa de filtração DuraPore (Millipore HV n° de cat. MAHVN4550) foi lavada com 100 ul de lx SB17T por filtração a vácuo, foram adicionados 133,3 ui de resina de estreptavidina-agarose ao 7,5% (Pierce) a cada poço e foram lavadas duas vezes com 200 ui de lx SB17T. Foram transferidos 100 ui de amostras em equilíbrio à placa Durapore que continha a resina estreptavidina-agarose e foi incubada num thermomixer (Eppendorf) a 800 rpm durante 5 minutos. A resina foi lavada uma vez com 200 ui de lx SB17T + 100 uM de biotina com 200 ui de lx SB17T.
Etapa 4: Marcação da proteína com biotina
Foram adicionados 100 ui de NHS-PE04-biotina 1,2 mM, que foi preparado imediatamente antes de sua utilização, à resina com o aptámero capturado e os complexos aptámero: proteína e foram incubadas num thermomixer a 800 rpm durante 20 minutos. A resina foi lavada cinco vezes com 200 ui de lx SB17T por filtração a vácuo.
Etapa 5: Processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta e fotoclivagem O diretor de gotejamento foi retirado da parte de abajo da placa DuraPore e foi colocado a placa sobre uma placa microtiter de recolha de 1 ml. A resina foi lavada uma vez com 200 ui de lxSB17T por centrifugação a 1000 x g durante 30 segundos. Foram adicionados 80 ui de lx SB17T + 10 mM de DxS04 à resina e foram irradiados com a lâmpada BlackRay Mercury num thermomixer a 800 rpm durante 10 minutos. A placa DuraPore foi transferida a uma nova placa de poços profundos de 1 ml e foi centrifugada a 1000 x g durante 30 segundos para recolher o aptámero fotoclivado e os complexos proteína:aptámero.
Etapa 6: Captura de proteínas e retirada de aptámeros livres
Foram adicionados 50 ui de contas paramagnéticas MyOne-estreptavidina Cl (Invitrogen) (10 mg/ml em lx SB17T) a uma placa microtiter. As contas foram separadas com um imã durante 60 segundos e o sobrenadante foi retirado. Foram adicionados 225 ui de mistura de fotoclivagem às contas e foram misturados durante 5 minutos. As contas foram lavadas quatro vezes com 200 ui lx SB17T separando as contas magnéticas e substituindo o tampão de lavagem. O tampão de lavagem final foi retirado .
Etapa 7: Eluição do aptámero
Foram adicionados 100 ui de Tampão de Eluição de Fosfato De sódio (10 mM de Na2P04, pH 11) às contas e foram misturadas durante 5 minutos. Foram transferidos 90 ui do eluido a uma placa microtiter e foram neutralizados com 10 ui de Tampão de Neutralização de Fosfato De sódio (10 mM NaH2P04, pH 5) . Etapa 8: Hibridação de aptámeros a as micromatrizes
Foram preparadas as matrizes de ADN com sondas de captura de oligonucleótidos compostas pela sequência complementária da região variável de cada aptámero imobilizado num suporte porta-objetos de microscópio a medida. Existem múltiplas matrizes (submatrizes) em cada porta-objetos, e as submatrizes são separadas fisicamente fixando uma junta (Grace) para a aplicação de amostras. As matrizes foram pré-tratadas com 100 ui de Tampão de Bloqueio e foram incubadas durante 15 minutos a 65 °C num thermomixer. Foram adicionados 30 ui de Tampão de Hibridação alto em sais a 90 ui do aptámero neutralizado eluido numa placa microtiter, foram incubadas a 95 °C durante 5 minutos num termociclagem, e foram arrefecidos até 65 °C a 0,1 °C/segundo. O Tampão de Bloqueio se retira das matrizes e são adicionados 110 ui de amostra de aptámero a as matrizes e se incuba numa câmara de humidade a 65 °C durante 20 horas. Etapa 9. Lavagem das matrizes A amostra de aptámero é retirada das matrizes e as matrizes u são lavadas ma vez com 200 ui de tampão de lavagem de Tween-20, fosfato de sódio a 65 °C, com a junta em seu lugar, e três vezes com 25 ml de tampão de lavagem de fosfato de sódio, Tween-20 num tarro pap com a junta retirada. As matrizes são secas com uma pistola de azoto.
Etapa 10: Quantidade de Sinal nas matrizes
Os porta-objetos de matriz foram rastreados num TECAN LS300 recargado num canal apropriado para a deteção de Cy3 e foi quantificada o sinal Cy3 da desempenho de cada matriz. Resultados:
Os aptámeros específicos para três diferentes alvos (bFGF, VEGF, e Mieloperoxidase) foram produzidos utilizando os métodos e materiais para o SELEX tradicional. Um segundo grupo de aptámeros específicos foi feito utilizando nucleótidos modificados na posição 5 e foram selecionados pela taxa de dissociação lenta para seus respetivos alvos. Os aptámeros que foram feitos no processo tradicional tinham taxas de dissociação medidas da ordem de menos de 5 minutos. Os aptámeros feitos com os nucleótidos modificados e utilizando o processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta durante o processo de seleção tinham taxas de dissociação maiores de 20 minutos. Foram feitos dois grupos de aptámeros para cada alvo pelos dois diferentes métodos para um total de 4 populações de aptámeros diferentes. A capacidade destas populações de aptámeros para medir as concentrações de analito no ensaio das amostras de ensaio foi avaliado como foi descrito anteriormente num intervalo de concentrações de alvo. O sinal relativa do chip de deteção de ADN foi representado contra a concentração de alvo introduzida. Veja-se a FIG. 11A a 11C. A curva de resposta dos aptámeros tradicionais é muito plana e a sensibilidade da deteção é bastante baixa. A sensibilidade da deteção das respetivas alvos com os aptámeros com uma taxa de dissociação lenta é excelente. Os dados apoiam a necessidade do utilização de aptámeros com uma taxa de dissociação lenta para uma desempenho analítica máxima.
Exemplo 8. Geração de aptámeros BzdU de alta afinidade para trombina humana A. Preparação da mistura de candidatos
Foi preparado uma mistura de candidatos que continha dATP, dCTP, dGTP, e BzdUTP por extensão com polimerase de um iniciador com cromóforo 5' ANA e foi purificado como é descrito no Exemplo 3. B. Preparação do alvo proteico A trombina humana foi marcada com biotina como é descrito no Exemplo 2. C. Seleção de aptámeros por enriquecimento de taxa de dissociação lenta e fotorreticulação A seleção de aptámeros foi levada a cabo como foi descrito no Exemplo 3 com a trombina humana biotinilada como alvo. D. Amplificação e purificação de aptámeros A amplificação e purificação de aptámeros foi levada a cabo como foi descrito no Exemplo 3. E. Restringência e retroalimentação da seleção A restringência e retroalimentação da seleção foram levados a cabo como foi descrito no Exemplo 3. F. Propriedades dos aptámeros A constante de ligação em equilíbrio (Kd) do aptámero 2336-17 desde sua seleção era 4,4e-ll M (medida de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 1) como foi demonstrada na FIG. 15 .
Foram selecionados os aptámeros de cadeia simples para a trombina humana a partir de uma biblioteca que compreendia os nucleótidos naturais dA, dC, dG e dT (Block, et ai., 1992) . As afinidades de ligação dos aptámeros tinham valores de Kd que oscilavam entre 2,5e-8 M a 2,0e-7 M. Utilizando um protocolo similar com uma biblioteca composta por dA, dC, dG naturais, e 5-(1-pentinil)-dUTP, os aptámeros foram selecionados com valores valores de Kd que oscilaban entre 4e-7 M a le-6 M. Várias patentes, publicações de pedidos de patente, e publicações científicas foram citadas ao longo e/ou são enumeradas ao final da descrição.
Os exemplos das publicações citadas e as limitações relacionadas nas mesmas pretendem ser ilustrativas e não exclusivas. Outras limitações das publicações citadas serão aparentes para os peritos na especialidade pela leitura da especificação e um estudo dos desenhos.
As palavras "compreender", "compreende" e "que compreende" são para ser interpretadas inclusivamente mais que exclusivamente. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Somaloqic, Inc. <120> Método para gerar aptámeros com taxas de dissociação melhoradas <130> RIC/FP6616189 <140> EP 08782010,6 <141> 17-07-2008 <150> PCT/US2008/070383 <151> 17-07-2008 <150> US 60/950,283 <151> 17-07-2007 <150> US 60/950,281 <151> 17-07-2007 <150> US 61/031,420 <151> 26-02-2008 <150> US 61/051,594 <151> 08-05-2008 <150> US 60/950,293 <151> 17-07-2007 <16Ο> 23 < 17Ο> Patentln versão 3.4 <210> 1 <211> 79 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial: Sintética" <22 0> <221> misc_feature <222> 2, 4 <223> t é dT-biotina <22 0> <221> misc_feature <222> (23)..(62) <223> n é a, c, g ou t <4 0 0> 1 atatgtcttc ttgtcgtttc gcnnnnnnnn nnnnnntmnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 60 nnggtggagt gtggtgagg 79 <210> 2 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial: Sintética" <400> 2 atatatatcc tcaccacact ccacc 25 <210> 3 <211> 30 <212> ADN <213> Artificial <22 0> 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da sequência artificial: Sintética" <400> 7 gtcttcttgt cgtttcgc 18 <210> 8 <211> 76 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial: Sintética" <22 0> <221> misc_feature <222> 2, 4 <223> t é dT-biotina <22 0> <221> misc_feature <222> (20)..(59) <223> n é a, c, g ou t <400> 8 atatcccgct cgtcgtctgn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnc 60 aggcagacgg tcactc 76 <210> 9 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial: Sintética" <400> 9 atatatatga gtgaccgtct gcctg 25 <210> 10 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial: Sintética" <4 0 0> 10 atatatatga gtgaccgtct gcctg 25 <210> 11 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota = "Descrição da sequência artificial: Sintética" <4 Ο 0> 11 atatatatga gtgaccgtct gcctg 25 <210> 12 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <221> fonte <223> /nota = "Descrição 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DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO
Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.
Documentos de patente referidos na descrição • US 5475096 A [0003] • US 5270163 A [0003] • WO 9119813 A [0003] • US 5707796 A [0004] • US 5580737 A [0004] [0005] • US 5567588 A [0004] • US 5496938 A [0004] • US 5705337 A [0004] • US 5660985 A [0005] [0106] • US 5763177 A [0006] • US 6001577 A [0006] • US 6291184 B [0006] • US 6458539 B [0006] [0164] • WO 9927133 A [0007] • US 20050003362 A [0007] • US 17538808 A [0014] • US 6168778 B [0018] • US 6051698 A [0018] • US 6426335 B [0018] • US 6962784 B [0018] • US 5843653 A [0018] • US 5789163 A [0018] • US 5853984 A [0018] • US 5874218 A [0018] • US 6261783 B [0018] • US 5989823 A [0018] • US 6177555 B [0018] • US 6531286 B [0018] • US 632914 A [0018] • US 6670132 B [0018] • US 7258980 B [0018] • US 6183967 B [0018] • US 6020130 A [0018] • US 5763173 A [0018] • US 5874557 A [0018] • US 5693502 A [0018] • US 5719273 A [0042] • US 5945527 A [0042] • US 6376190 B [0048] • US 50469604 A [0066] • US 175388 A [0084] • US 5428149 A [0106] • US 5580972 A [0106] • US 6300074 B [0106] • EP 08782010 A [0198] • US 2008070383 W [0198] • US 60950283 B [0198] • US 60950281 B [0198] • US 61031420 B [0198] • US 61051594 B [0198] • US 60950293 B [0198]
Literatura não relacionada com patentes, citada na descrição • DIDONATO, D. A. Part II. Synthesis and Evaluation of Modified Nucleotides for DNA Aptamer Selection. Dissertation, 09 August 2006, I-XI, 26-115 [0009] • DAVIS et al. Isolation of high-affinity GTP aptamers from partially structured RNA libraries. PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA, 03 September 2002, vol. 99 (18), 11616-11621 [0010]
Lisboa, 20 de Maio de 2015

Claims (14)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Um método para identificar um aptámero que tem uma taxa de dissociação (11/2) lenta de sua molécula alvo, em que o aptámero compreende pelo menos uma base pirimidínica modificada, compreendendo o método: (a) por em contato uma mistura de candidatos com uma molécula alvo, em que os ácidos nucleicos que têm uma maior afinidade pela molécula alvo com respeito a outros ácidos nucleicos da mistura de candidatos se ligam à molécula alvo, formando complexos ácido nucleico-molécula alvo e em que a mistura de candidatos compreende ácidos nucleicos modificados em que uma, várias ou todas as pirimidinas em pelo menos um, ou cada um, dos ácidos nucleicos da mistura de candidatos estão modificadas quimicamente na posição 5 para formar uma base pirimidínica modificada; (b) separar os complexos ácido nucleico-molécula alvo da mistura de candidatos; (c) dissociar os complexos ácido nucleico-molécula alvo para gerar ácidos nucleicos livres; (d) amplificar os ácidos nucleicos livres para produzir uma mistura de ácidos nucleicos enriquecidos em sequências que são capazes de se ligar à molécula alvo com afinidade aumentada, pelo qual pode ser identificado um aptámero para a molécula alvo; (e) opcionalmente, repetir (a) a (d) se for necessário; (f) identificar pelo menos um aptámero para a molécula alvo, em que o aptámero compreende pelo menos uma base pirimidínica modificada, e (g) selecionar o(s) aptámero(s) identifiçado(s) em (f) para identificar o (s) aptámero(s) que tem uma taxa de dissociação lenta (11/2) da molécula alvo.
  2. 2. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que dita base pirimidínica modificada é selecionada independentemente a partir do grupo que consiste em: 5- (N-benzilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-[2-(lH-indol-3 il) etil] carboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-[1-(3-trimetilamonio) propil] carboxiamida)-2'-desoxiuridina cloreto, 5-(N-naftilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina, e 5-(N-[1-(2,3-dihidroxipropil)] carboxiamida)-2'-desoxiuridina.
  3. 3. 0 método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita base pirimidinica modificada é selecionada independentemente a partir do grupo que consiste nas bases pirimidinicas modificadas que são mostradas na FIG. 14.
  4. 4. 0 método de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que o dito aptámero compreende ainda pelo menos uma modificação química adicional.
  5. 5. 0 método de acordo com a reivindicação 4, em que a dita pelo menos uma modificação química adicional é uma substituição química numa ou mais posições que são selecionadas independentemente a partir do grupo que consiste numa posição de ribose, uma posição de desoxirribose, uma posição fosfato, e uma posição de uma base.
  6. 6. 0 método de acordo com a reivindicação 4 ou a reivindicação 5, em que a dita pelo menos uma modificação química adicional é selecionada independentemente a partir do grupo que consiste numa modificação na posição 2' do açúcar, 2'-amino (2'-NH2), 2'-fluoro (2'-F), 2'-0-metil (2'-0Me), uma modificação na posição 5 da pirimidina, uma modificação numa amina exocíclica de citosina, uma substituição de 5-bromouracilo, uma substituição de 5-bromodesoxiuridina, uma substituição de 5-bromodesoxicitidina, uma modificação de estrutura principal, um revestimento 3', e um revestimento 5'.
  7. 7 . 0 método de qualquer uma das reivindicações anteriores em que dita molécula alvo é selecionada a partir do grupo que consiste numa proteína, um hidrato de carbono, um polissacárido, uma glicoproteína, uma hormona, um recetor, um péptido, um antigénio, um anticorpo, um vírus, um substrato, um metabolito, um análogo em estado de transição, um cofator, um inibidor, um fármaco, um corante, um nutriente, um fator de crescimento, e um tecido.
  8. 8. Um método para identificar um aptámero que tem uma taxa de dissociação (11/2) lenta de sua molécula alvo, em que o aptámero compreende pelo menos uma base pirimidínica modificada, compreendendo o método: (a) por em contato uma mistura de candidatos com uma molécula alvo, em que os ácidos nucleicos que têm uma maior afinidade pela molécula alvo com respeito a outros ácidos nucleicos da mistura de candidatos se ligam à molécula alvo, formando complexos ácido nucleico-molécula alvo e em que a mistura de candidatos compreende ácidos nucleicos modificados em que uma, várias ou todas as pirimidinas em pelo menos um, ou cada um, dos ácidos nucleicos da mistura de candidatos estão modificados quimicamente na posição 5 para formar uma base pirimidínica modificada; (b) separar os ácidos nucleicos com afinidade aumentada do resíduo da mistura de candidatos; (c) separar os ácidos nucleicos que têm uma taxa de dissociação (ti/2) lenta da molécula alvo da mistura de candidatos; e (d) amplificar os ácidos nucleicos separados para produzir uma mistura de ácidos nucleicos enriquecida em sequências de ácidos nucleicos que são capazes de se ligar à molécula alvo com uma afinidade aumentada e que têm uma taxa de dissociação (ti/2) lenta da molécula alvo, pelo que pode ser identificado um aptámero para uma molécula alvo que compreende pelo menos uma base pirimidínica modificada.
  9. 9. 0 método de acordo com a reivindicação 8, em que dita base pirimidínica modificada é selecionada independentemente a partir do grupo que consiste em: 5- (N-benzilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-isobutilcarboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-[2-(lH-indol-3il) etil] carboxiamida)-2'-desoxiuridina, 5-(N-[1-(3-trimetilamonio) propil] carboxiamida)-2'-desoxiuridina cloreto, 5-(N-naftilcarboxiamida)-2’-desoxiuridina, e 5- (N-[1-(2,3-dihidroxipropil) ] carboxiamida)-2'-desoxiuridina.
  10. 10. O método de acordo com a reivindicação 8, em que dita base pirimidínica modificada é selecionada independentemente a partir do grupo que consiste nas bases pirimidinicas modificadas que são mostradas na FIG. 14.
  11. 11. O método de qualquer uma das reivindicações 8 a 10 em que todos os resíduos C e/ou todos os T e/ou todos os OU dos ácidos nucleicos da mistura de candidatos estão modificados quimicamente na posição 5.
  12. 12. O método de qualquer uma das reivindicações 8 a 11 que compreende adicionalmente a etapa de sequenciamento dos ácidos nucleicos da mistura de (d) , pelo qual é identificado um aptámero para o dito alvo.
  13. 13. O método de qualquer uma das reivindicações anteriores em que a dita taxa de dissociação (11/2) é ou: a) maior ou igual a 30 minutos; b) entre 30 minutos e 240 minutos; ou c) é selecionado entre o grupo que consiste num tempo de > 60 min., > 90 min., > 120 min., > 150 min., > 180 min., > 210 e > 240 min.
  14. 14. 0 método de qualquer uma das reivindicações 8 a 12 em que a taxa de dissociação (11/2) do(s) aptámero(s) identificado (s) é escolhida dentre: (i) 30 minutos a 60 minutos (ii) 60 minutos a 90 minutos (iii) 90 minutos a 120 minutos (iv) 120 minutos a 150 minutos (v) 150 minutos a 180 minutos (vi) 180 minutos a 210 minutos (vii) 210 minutos a 240 minutos. Lisboa, 20 de Maio de 2015
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