JP2017530356A - 心血管系のリスクイベントの予測及びその使用 - Google Patents

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Abstract

１〜５年の期間にわたって心血管（ＣＶ）イベントをする発症するリスクの予測のために、個体を評価するために用いられる方法及びコンピュータによる方法が提供される。この方法は、ＭＭＰ１２、アンジオポイエチン−２、補体Ｃ７、心臓トロポニンＩ、アンジオポイエチン関連タンパク質４、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ、アルファ−１−抗キモトリプシン複合体、ＧＤＦ１１及びアルファ−２−抗プラスミン、またはＧＤＦ１１とＦＳＴＬ３との組み合わせから選択される少なくとも２種のバイオマーカーを使用する。この方法は、冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）を病む患者においてＣＶイベントを予測することで、特に有用である。【選択図】図２

Description

本出願は、一般的には、個体における将来的な心血管イベントのリスクを評価するためのバイオマーカーの検出及び方法に関し、より具体的には、１〜５年間にわたって心血管系（ＣＶ）イベントを発生させるリスクを予測するために個体を評価するために用いられる１つ以上のバイオマーカー、方法、装置、試薬、システム、及びキットに関する。このようなイベントとしては、心筋梗塞、卒中、うっ血性心不全または死亡が挙げられるが、これらに限定されない。
以下の説明において、本出願に関連する情報の要約を示すが、提供された情報または本明細書で参照された出版物は、いずれも本出願の従来技術であるということを認めたものではない。
米国での主な死亡原因は、心血管疾患である。一次イベントリスク（Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ，Ｒ ｅｔ ａｌ．，“Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｉｓｋ Ｐｒｏｆｉｌｅ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃａｒｅ：Ｔｈｅ Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ Ｈｅａｒｔ Ｓｔｕｄｙ”Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １１７：７４３−５３ （２００８）；及びＲｉｄｋｅｒ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｇｌｏｂａｌ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｉｓｋ ｉｎ Ｗｏｍｅｎ”ＪＡＭＡ ２９７（６）：６１１−６１９ （２００７））及び二次イベントリスク（Ｓｈｌｉｐａｋ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，“Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｔｏ Ｐｒｅｄｉｃｔ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｅａｓｅ： Ｔｈｅ Ｈｅａｒｔ ＆ Ｓｏｕｌ Ｓｔｕｄｙ”Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．１２１：５０−５７（２００８））についての多数の既存の重要な予測因子があり、これらは臨床実践及び治験で広く用いられている。残念ながら、受信者操作特性曲線、ハザード比、及びコンコーダンスは、既存のリスク要因及びバイオマーカーの性能があまり高くないことを示す（約０．７５のＡＵＣは、これらの因子が偶然性（Ｃｏｉｎ−ｆｌｉｐ）と完全性（ｐｅｒｆｅｃｔｉｏｎ）との間の中間程度でしかないことを意味する）。診断性能の改善の必要性に加えて、各個体において有益な（及び侵襲的な）介入と生活様式の変化に対する近い将来の反応性と個人的な反応性との両方を示すリスク商品が求められている。広く利用されているフラミンガム（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ）方程式は、３つの主要な問題を有する。第１に、フラミンガム方程式は時間がかかりすぎることであり、フラミンガム方程式によって、１０年のリスク計算が得られるが、ヒトは将来的なリスクを過小評価するために、それに基づいて行動及び生活様式を変化させることには抵抗がある。第２に、フラミンガム方程式は、介入に対する応答があまり良くないことであり、フラミンガム方程式が最も依存するものは、小さくすることが不可能な暦年齢と、変更することが不可能な性別とである。第３に、フラミンガム因子は、ここで想定された高リスク集団内において、高リスクと低リスクとの間をうまく区別することができず、高い四分位数と低い四分位数とのハザード比は、わずか２であり、被験者をより細かい層（例えば、十分位数）に階層化することによって、フラミンガムスコアを、リスクを個別化するために用いるよう試みる場合、観察されるイベント発生率は、十分位数の多くと同様である。
心血管疾患に関するリスク因子は、薬物療法の強度及び性質を向上させるために広く用いられており、これらの使用は、過去２０年にわたり観察された心血管疾患の罹患率及び死亡率の減少に貢献してきたことは間違いない。これらの因子を慣例的手順でアルゴリズムに組み合わせたが、残念ながら、それによっても全てのリスクを捕えられない（心疾患に関しても、最も一般的な最初の発現は、それでもなお死亡である）。実際には、このアルゴリズムでは、恐らくは、リスクの半分を捕えるにすぎない。このようなリスク因子の一次予防におけるＲＯＣ曲線下面積は、通常、約０．７６で、二次予防においてははるかに不良の性能（通常は０．６２）であり、０．５の偶然性と１．０の完全性との間の性能の約１／４から１／２の数値にすぎない。
臨床的リスクスコアに新規バイオマーカーを追加しても、期待通りにはいかなかった。例えば、３２０９人でのフラミンガム研究において（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｉｒｓｔ Ｍａｊｏｒ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｅｖｅｎｔｓ ａｎｄ Ｄｅａｔｈ”Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５５：２６３１−２６３７（２００６））、既存のリスク因子に１０種のバイオマーカー（ＣＲＰ、ＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、アルドステロン、レニン、フィブリノーゲン、Ｄダイマー、プラスミノーゲン活性化阻害剤１型、ホモシステイン、及び尿アルブミンとクレアチニンとの比）を追加しても、ＡＵＣはそれほど改善されなかった。０〜５年の間のイベントに関するＡＵＣは、加齢、性別、及び従来のリスク因子を用いた場合は０．７６であり、複合要素にバイオマーカーを追加した最良の組み合わせを用いた場合は０．７７であり、二次予防については、状況はより悪化する。
１〜５年の期間で心血管イベントのより高リスクを有する患者を早期同定することは重要であり、なぜなら、高リスクを有する個体により積極的な治療を行うことで結果を改善する可能性があるためである。したがって、より高リスクを有するとみなされる患者において心血管イベントのリスクを低減するためには、最適な管理のために積極的な介入を必要とする一方で、心血管イベントのリスクがより低い患者は、患者によって有益な作用がない可能性が高い、高価な、場合によっては侵襲的な処置を省くことができる。
所定期間内で特定の病状または状態を有するリスクを予測するためのバイオマーカーの選択は、先ず、特定の医療処置中のイベントの確率及び／またはタイミングとの測定可能かつ統計学的に有意な関係を有するマーカーを同定することを伴う。バイオマーカーは、対象の状態疾患に対して因果経路で分泌または放出された、または疾患もしくは状態の発症または進行に対して下流でまたは並行して分泌または放出されたいずれかの、あるいはこれら双方で分泌または放出されたものを含むことができる。これらは、心血管イベントの素因になる生物学的プロセスに応答して、心血管組織または他の臓器から、及び周囲組織や循環細胞から血流に放散されるか、またはこれらは、腎機能の低下などの下流の病態生理学的作用を反映するものであってもよい。バイオマーカーとしては、低分子物質、ペプチド、タンパク質、及び核酸を挙げることができる。バイオマーカーの同定に影響を及ぼす主要な問題のいくつかは、利用可能なデータの過剰適合（Ｏｖｅｒ−ｆｉｔｔｉｎｇ）及びデータのバイアスを含む。
バイオマーカーを同定し、疾患または状態を有するリスクを診断または予測する試みにおいて、様々な方法が利用されてきた。タンパク質ベースのマーカーの場合、このような方法としては、二次元電気泳動、質量分析法、及びイムノアッセイ法が挙げられる。核酸マーカーの場合、このような方法としては、ｍＲＮＡ発現プロファイル、マイクロＲＮＡプロファイル、ＦＩＳＨ、遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）、ラージスケールの遺伝子発現アレイ、遺伝子配列解析、及び遺伝子型解析（ＳＮＰまたは希少変異解析（ｓｍａｌｌ ｖａｒｉａｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ））が挙げられる。
二次元電気泳動の有用性は、低い検出感度；タンパク質の溶解性、電荷、ならびに疎水性の問題；ゲルの再現性；及び単一のスポットが複数のタンパク質を示す可能性により制限される。質量分析法については、この限界は、用いられる様式に応じて、サンプルの処理ならびに分解、低い発生量のタンパク質に対する感度、シグナル対ノイズ比の考察、及び検出されたタンパク質を即座に同定できないことに依存している。イムノアッセイアプローチにおけるバイオマーカー発見の限界は、主に、多数の分析物を測定するための抗体ベースの多量分析が不可能な点にある。単に、高品質の抗体のアレイをプリントして、サンドイッチすることなく、これらの抗体に結合した分析物を測定するに過ぎない（これは、形式的には、生物または細胞中の全てのＤＮＡまたはＲＮＡ配列をハイブリダイゼーションで判定するのに、核酸配列の全ゲノムを用いることに匹敵すると思われる）。ハイブリダイゼーションは、同一性に対してストリンジェントな試験であり得るために、ハイブリダイゼーション実験が行われる。非常に優れた抗体でさえも、それらの結合パートナーを選択する際に、血液に関して、または細胞抽出物に関しても、それらが働くためには、通常、十分なストリンジェンシーを有するものではなく、なぜなら、それらのマトリックス中のタンパク質集団が極めて多く、これが、不良なシグナル対ノイズ比につながる可能性があるためである。したがって、イムノアッセイベースのバイオマーカー発見アプローチによる異なるアプローチを使用せねばならならず、すなわち、多くの分析物を同時に測定して、どの分析物が本当のバイオマーカーであるかを決定するために十分なストレンジェンシーを獲得するためには、多重化ＥＬＩＳＡアッセイ（すなわち、サンドイッチ）を使用する必要がある。サンドイッチイムノアッセイは、高含量スケールにすることができず、そのため、標準的なアレイフォーマットでは、ストリンジェントなサンドイッチイムノアッセイを用いたバイオマーカーの発見は不可能である。最後に、抗体試薬は、実質的なロット間変動及び試薬の不安定性の影響を被る。本発明のタンパク質バイオマーカー発見のためのプラットフォームは、この問題を克服する。
これらの方法の多くは、解析前にいくつかのタイプのサンプルの分画化に依存するか、またはこれが必須である。したがって、一連の明確なサンプル群で統計学的に関連するバイオマーカーを同定及び発見するように設計された、十分に強力な研究を行うために必要とされるサンプル調製は極めて難しく、多大な費用を要し、時間もかかる。分画化中に、様々なサンプルに広範な変異性を導入してもよい。例えば、可能性のあるマーカーが処理に対して付安定な場合もあり、マーカーの濃度が変化する場合もあり、不適切な凝集または解離が起こる場合もあり、群発的なサンプル汚染が起こる場合があるため、疾患初期で予測される微妙な変化が曖昧になり得る。
これらの技術を用いるバイオマーカーの発見及び検出は、診断または予測バイオマーカーの同定に対して深刻な限界を有することが広く認められている。これらの限界としては、低発生量のバイオマーカーを検出できないこと、プロテオームの動的範囲全体を一貫して網羅できないこと、サンプル処理ならびに分画化において再現が不可能なこと、及び全体的に再現不可能であり、ロバスト性に欠けることが挙げられる。さらに、これらの研究のデータにはバイアスが導入されており、標的疾患集団中でバイオマーカーを同定かつ確認するのに必要な分布及びランダム化に関して適切な対照を含むサンプル群の複雑さに適切に対処することができない。
数十年にわたって、新規の有効なバイオマーカーを発見しようとする努力が続けられているが、この努力のほとんどがうまくいっていない。様々な疾患に対するバイオマーカーは、通常、大学の研究室で、いくつかの疾患の過程に関する基礎研究を行いつつ、通常は、偶発的な発見を介して同定されてきた。このような発見に基づき、僅かな臨床データによって、新たなバイオマーカーの同定を示唆する論文が公表された。しかしながら、これらの提唱されたバイオマーカーのほとんどが、現実の、または有用なバイオマーカーであるとは確認されておらず、その主な原因は、試験された臨床サンプルが少ないために、有効なバイオマーカーが実際に見出されたことを示す統計学的な証明が十分でないためである。すなわち、初期の同定は、統計の基礎的な要素に関して厳密ではなかった。１９９４年から２００３年の各年において科学文献を検索すると、バイオマーカーを目的とした何千もの参考文献が公開されていることが分かる。しかしながら、これと同じ時間枠において、ＦＤＡが診断用途を承認した新規タンパク質バイオマーカーは、最高でも１年で３種であり、そのうち数年間は、新規タンパク質バイオマーカーは承認されなかった。
このような不成功に終わったバイオマーカー発見の努力の歴史に基づいて、疾患及び状態を発症させるリスクの診断、予後予測または予測のためのバイオマーカーが発見されることは稀であり困難であるという一般的理解をさらに推進する理論が提唱されてきた。このような観念は、二次元ゲルまたは質量分析法に基づくバイオマーカーの研究によって裏付けられている。これらのアプローチでは有用なバイオマーカーはほとんど同定されていない。しかしながら、通常、二次元ゲル及び質量分析法は、およそ血中１ｎＭの濃度及びそれより高い濃度で存在するタンパク質を測定すること、さらにこのようなタンパク質集団はおそらくは、疾患または特定の状態の発症に伴い変化しにくいということは見過ごされている。本発明のバイオマーカー発見プラットフォームの他に、かなり低い濃度でタンパク質の発現レベルを正確に測定することができるプロテオミクスのバイオマーカー発見プラットフォームは存在しない。
複雑なヒト生物学の生化学的経路について多くのことがわかっている。多くの生化学的経路の結果、病理学の範疇で局所的に作用するタンパク質が分泌され、あるいはそのようなタンパク質によって生化学的経路が開始し、例えば増殖因子が分泌されると、他の細胞の複製を病理学的に刺激したり、免疫系を回避するためにその他の因子が分泌されたりする。これらの分泌タンパク質の多くがパラクリン様式で作用するが、そのうちいくつかは、体内において遠位で動作する。生化学的経路の基礎的な知識を有する当業者であれば、血中において、多くの病理学に特異的なタンパク質は、二次元ゲル及び質量分析法の検出限界未満の濃度で（さらにそれを下回る濃度で）存在することを理解するであろう。この比較的多数の疾患バイオマーカーの同定の前に優先すべきものは、二次元ゲルまたは質量分析法によって検出可能な濃度より低い濃度でタンパク質を解析することができるプロテオミクスのプラットフォームである。
上で論じたように、心血管イベントの性質を正確に決定することができる場合、心血管イベントは、積極的な治療によって予防することができ、このような介入を、最大でもそれらを必要とする人々を標的として及び／または最低でもそれらを必要とする人々から離れて行うことによって、医療資源提供効率を改善することができ、費用も同時に低減することができる。さらに、患者が彼らの心血管イベントの個人的な可能性に関する正確な知識及び短期的な情報を有するとき、長期の集団ベースの情報よりも否認することは少なく、改善された生活様式の選択及び有益性につながると思われる改善された服薬の遵守をもたらすであろう。既存の多種マーカー試験は、個体から複数のサンプルを回収するか、あるいはサンプルを複数のアッセイに分ける必要がある。１種の血液、尿またはその他のサンプルと１回のアッセイのみを必要とする改善された試験が最適である。したがって、５年の期間内の心血管イベントの予測を可能にするバイオマーカー、方法、装置、試薬、システム、及びキットに対する必要性が存在する。
本出願は、１年、２年、３年、または４年の期間内の心血管（ＣＶ）イベントを有するリスクの予測のためのバイオマーカー、方法、装置、試薬、システム、及びキットを含む。本出願のバイオマーカーは、本明細書に詳細に説明されるマルチプレックスの遅い解離速度のアプタマー（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｓｌｏｗ ｏｆｆ ｒａｔｅ ａｐｔａｍｅｒ）（ＳＯＭＡｍｅｒ）ベースのアッセイを用いて同定された。本明細書に記載されるＳＯＭＡｍｅｒベースのバイオマーカー同定方法を用いることによって、本出願は、１年、２年、３年、または４年以内におけるＣＶイベントの可能性を予測するために有用であるバイオマーカーのセットを記載する。
心血管イベントの性質を正確に決定できれば、心血管イベントは積極的治療によって回避することが可能である。従来技術の多重マーカー試験は、一個体から複数のサンプルを回収することか、あるいはサンプルを複数のアッセイに分配することのいずれかを必要とする。異なる分析物のタイプ（脂質、タンパク質、代謝産物）または分析物のパネルごとに複数のサンプルを必要とするのではなく、むしろ単一アッセイで測定される、必要な生体サンプルが１つだけの予後予測アッセイを提供することが好ましいと思われる。複数のサンプル回収及び／または複数の技術（例えば、血液検査結果を、人口統計、心エコー検査、画像診断、尿検査、血圧または血管コンプライアンスなどの相補的情報源と一体化させること）が必要な試験の実施はより複雑であり、その複雑さが使用の障壁となるため、単一サンプル試験の中核となる利点は、使用時の簡便さである。追加の利点は、複数のタンパク質に対して単一サンプルを単一アッセイで処理することに由来する。単一アッセイにより、複数のアッセイ結果または技術様式を一緒に較正することによる不要な変動が少なくなると予想される。本出願の基礎をなす試験は、このような「単一サンプル、単一アッセイ」での試験である。この単一サンプルと単一アッセイとの組み合わせは、本発明の心血管イベントリスク試験の新規の特徴であって、これは、複数のサンプル回収及び複数の測定法を用いることの論理学的な複雑さ、それに加えて、サンプルを複数の独立した分析手法のために複数のアリコートに分けることに関する問題及びバイオハザードを解決しようとするものである。
心血管疾患は、複数の生物学的過程及び組織が関与することが知られている。心血管疾患に関連する生物学的システム及び過程の周知の例は、炎症、血栓症、疾患関連血管新生、血小板活性化、マクロファージの活性化、肝臓の急性期反応、細胞外マトリックスのリモデリング、及び腎機能である。これらの過程は、性別、閉経状態、及び年齢に応じて、さらに凝固及び血管機能の状態に従って観察することができる。これらのシステムは、部分的にタンパク質ベースのシグナル伝達システムを介して伝達し、単一の血液サンプル中で複数のタンパク質が測定される可能性があるため、本発明は、心血管疾患に関与する特定の生物学的システム及び過程に由来するタンパク質に焦点を当てた、単一サンプル、単一アッセイによる複数のタンパク質をベースとする試験を提供する。
本明細書で論じられるように、心血管イベントリスク測定における中核的な機能の１つは、治療に応答する進行と食事や運動などの行動に関する変化の評価を可能にすることである。フラミンガム方程式のような現在のリスク予測法は、明らかに無反応な臨床的共変量情報を含み、そのうち重要な要素は、被験者の年齢及び性別である。年齢は集団の正確な情報であるが、そのために個体のリスク変化のモニターについてはフラミンガム方程式の有用性は低い。このＣＶイベントリスク試験の新規の特徴は、予後予測モデルの一部として年齢を必要としない点である。本発明は、老化の生物学の範疇で、より直接的にリスクに関連するが、個体間で可変であり、したがって実年齢よりもリスクを評価するために使用される基礎となる生物学的因子が存在するという前提に基づいている。本発明は、年齢それ自体は疾患の原因となる要素ではなく、年齢は、基礎となる生物学のサロゲートまたは代用として作用するという確信を前提とする。年齢は、実際にはＣＶイベントの予後予測になるが、年齢は個々の改善を評価するのには使用できず、おそらく年齢の作用は生物学的機能によってもたらされる。この作用は、それに関連する生物学的な測定によってよりよく決定することができる。本発明では、標的化されるタンパク質は、疾患の生物学に関与するものである。したがって、本発明は、年齢とＣＶイベントリスクとの相関に反映される生物学的な情報を捕獲する。
心血管疾患に関与する複合過程からタンパク質を同定する方策は、様々なイベントまたは症状を有する広範囲の／多様なＣＶ疾患患者を提示するパラメータを選択することを必要とする。心血管疾患に起因するイベントは、ヘテロジニアスであり、すなわち未知の原因の突然死、及び既知のイベントの２つの主要なクラス、すなわち血栓関連イベント（卒中、一過性虚血発作、心筋梗塞）とＣＨＦ関連イベントに関与する。いくつかの提示イベントは、具体的な診断情報がない場合がある（例えば、自宅での死亡）。これらのＣＶ疾患の特徴を考慮して、本発明の試験は、様々なイベントからの血液サンプルで、ＣＶ疾患に関連する生物学的過程由来の関連タンパク質を測定することによって開発された。この方策により、疾患に関与する複合過程からの情報（例えば血管新生、血小板活性化、マクロファージの活性化、肝臓の急性期反応、その他のリンパ球性炎症、細胞外マトリックスのリモデリング、及び腎機能）を一まとめにした。ＣＶ疾患に関する複数のタンパク質をベースとした予後予測のための単一サンプル試験を開発するために、選択された研究対象集団は、明らかに安定な冠状動脈性疾患を有する高リスク対象グループのコホート研究「ハート・アンド・ソウル（Ｈｅａｒｔ ＆ Ｓｏｕｌ）」スタディであった。この高いＣＶイベント発生率を有する対象群を選択することにより、一般的な集団（上記イベントがめったに発生しない集団）で決定される場合よりも正確にタンパク質測定に関連するリスクを決定することができる。この高いリスクのグループで本発明の試験を行うことにより、一般的な生物学により汎用化することができるタンパク質バイオマーカーの組み合わせを同定することが可能になった。その結果、本発明の試験及びバイオマーカーは、「ハート・アンド・ソウル」スタディの組み入れ基準に適合する個体よりも大きい集団におけるイベントの予測よりも有効である可能性が高い。
いくつかの実施形態において、心血管（ＣＶ）イベントのリスクに関して被験者をスクリーニングするための方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、
（ａ）ＭＭＰ１２、アンジオポイエチン−２、補体Ｃ７、心臓トロポニンＩ、アンジオポイエチン関連タンパク質４、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ、アルファ−１−抗キモトリプシン複合体、ＧＤＦ１１、及びアルファ−２−抗プラスミンから選択されるＮ種のバイオマーカーを含む（Ｎは、２〜９の整数である）バイオマーカーパネルを形成することと、
（ｂ）被験者由来のサンプル中のパネルのＮ種のバイオマーカーのそれぞれのレベルを検出することと、を含む。
いくつかの実施形態において、被験者がＣＶイベントを有することになる可能性を予測するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、方法は、
（ａ）ＭＭＰ１２、アンジオポイエチン−２、補体Ｃ７、心臓トロポニンＩ、アンジオポイエチン関連タンパク質４、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ、アルファ−１−抗キモトリプシン複合体、ＧＤＦ１１、及びアルファ−２−抗プラスミンから選択されるＮ種のバイオマーカーを含む（Ｎは、２〜９の整数である）バイオマーカーパネルを形成することと、
（ｂ）被験者由来のサンプル中のパネルのＮ種のバイオマーカーのそれぞれのレベルを検出することと、を含む。
いくつかの実施形態において、心血管（ＣＶ）イベントのリスクに関して被験者をスクリーニングするための方法が提供され、方法は、被験者由来のサンプル中で、ＭＭＰ１２、アンジオポイエチン−２、補体Ｃ７、心臓トロポニンＩ、アンジオポイエチン関連タンパク質４、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ、アルファ−１−抗キモトリプシン複合体、ＧＤＦ１１、及びアルファ−２−抗プラスミンから選択される少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、または全９種のバイオマーカーのレベルを検出することを含む。
いくつかの実施形態において、被験者がＣＶイベントを有することになる可能性を予測するための方法が提供され、方法は、被験者由来のサンプル中で、ＭＭＰ１２、アンジオポイエチン−２、補体Ｃ７、心臓トロポニンＩ、アンジオポイエチン関連タンパク質４、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ、アルファ−１−抗キモトリプシン複合体、ＧＤＦ１１、及びアルファ−２−抗プラスミンから選択される少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、または全９種のバイオマーカーのレベルを検出することを含む。
いくつかの実施形態において、４年以内に被験者がＣＶイベントを有する可能性は、ＭＭＰ１２、アンジオポイエチン−２、補体Ｃ７、心臓トロポニンＩ、アンジオポイエチン関連タンパク質４、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ、及びアルファ−１−抗キモトリプシン複合体のレベルから選択される少なくとも５種、少なくとも６種、または全７種のバイオマーカーのレベルが、対応のタンパク質の対照レベルよりも高い場合、かつＧＤＦ１１及びアルファ２−抗プラスミンから選択される少なくとも１種のバイオマーカーまたは両方のバイオマーカーのレベルが、対応のタンパク質の対照レベルよりも低い場合に高い。
いくつかの実施形態において、心血管（ＣＶ）イベントのリスクに関して被験者をスクリーニングするための方法が提供され、方法は、被験者由来のサンプル中のＧＤＦ１１及びＦＳＴＬ３のレベルを検出することを含む。
いくつかの実施形態において、被験者がＣＶイベントを有することになる可能性を予測するための方法が提供され、方法は、被験者由来のサンプル中のＧＤＦ１１及びＦＳＴＬ３のレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態において、被験者が血栓形成イベントを有することになる可能性を予測するための方法が提供され、方法は、被験者由来のサンプル中のＧＤＦ１１及びＦＳＴＬ３のレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態において、血栓形成イベントは、心筋梗塞、卒中、及び一過性虚血発作から選択される。
いくつかの実施形態において、４年以内に被験者がＣＶイベント（血栓形成イベントなど）を有する可能性は、ＧＤＦ１１のレベルが、ＧＤＦ１１の対照レベルよりも低い場合及び／またはＦＳＴＬ３のレベルが、ＦＳＴＬ３の対照レベルよりも高い場合に高い。
いくつかの実施形態において、本方法は、ＭＭＰ１２のレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、アンジオポイエチン−２のレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、補体Ｃ７のレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、心臓トロポニンＩのレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、アンジオポイエチン関連タンパク質４のレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣのレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、アルファ−１−抗キモトリプシン複合体のレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ＧＤＦ１１のレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、アルファ−２−抗プラスミンのレベルを検出することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ＭＭＰ１２、アンジオポイエチン−２、補体Ｃ７、心臓トロポニンＩ、アンジオポイエチン関連タンパク質４、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ、アルファ−１−抗キモトリプシン複合体、ＧＤＦ１１、及びアルファ−２−抗プラスミンのレベルを検出することを含む。
いくつかの実施形態において、被験者は、冠状動脈疾患を有する。いくつかの実施形態において、被験者はＣＶイベントの病歴を有さない。いくつかの実施形態において、被験者は、高い米国心臓病学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ）（ＡＣＣ）リスクスコアを有する。いくつかの実施形態において、被験者は、中間のＡＣＣリスクスコアを有する。いくつかの実施形態において、被験者は、低いＡＣＣリスクスコアを有する。いくつかの実施形態において、被験者は、少なくとも１種のＣＶイベントを有する。いくつかの実施形態において、このＣＶイベントは、心筋梗塞、卒中、うっ血性心不全、一過性虚血発作、及び死亡から選択される。
いくつかの実施形態において、サンプルは、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、及び尿サンプルから選択される。いくつかの実施形態において、サンプルは、血漿サンプルである。いくつかの実施形態において、本方法は、インビトロで行われる。
いくつかの実施形態において、各バイオマーカーは、タンパク質バイオマーカーである。いくつかの実施形態において、本方法は、被験者由来のサンプルのバイオマーカーをバイオマーカー捕獲試薬のセットと接触させることを含み、バイオマーカー捕獲試薬のセットの各バイオマーカー捕獲試薬は、検出される異なるバイオマーカーに特異的に結合する。いくつかの実施形態において、各バイオマーカー捕獲試薬は、抗体またはアプタマーである。いくつかの実施形態において、各バイオマーカー捕獲試薬は、アプタマーである。いくつかの実施形態において、少なくとも１種のアプタマーは、遅い解離速度のアプタマーである。いくつかの実施形態において、少なくとも１種の遅い解離速度のアプタマーは、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種の、修飾を有するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、各遅い解離速度のアプタマーは、その標的タンパク質に、≧３０分、≧６０分、≧９０分、≧１２０分、≧１５０分、≧１８０分、≧２１０分、または≧２４０分の解離速度（ｔ１／２）で結合する。
いくつかの実施形態において、ＣＶイベントの可能性は、バイオマーカーレベルと、下記から選択される追加の生物医学的情報の少なくとも１つの項目に基づく。
ａ）心筋梗塞、血管造影で１本またはそれよりも多くの冠血管で５０％を超える狭窄の証拠、トレッドミルまたは心臓核試験による運動誘発性虚血、または冠血行再建の既往からなる群から選択される心血管系リスク因子の存在に相当する情報、
ｂ）該個体の身体的な記述子に相当する情報、
ｃ）該個体の体重変化に相当する情報、
ｄ）該個体の民族性に相当する情報、
ｅ）該個体の性別に相当する情報、
ｆ）該個体の喫煙歴に相当する情報、
ｇ）該個体のアルコール摂取歴に相当する情報、
ｈ）該個体の職業歴に相当する情報、
ｉ）該個体の心血管疾患またはその他の循環系状態の家族歴に相当する情報、
ｊ）該個体または該個体の家族におけるより高い心血管疾患リスクと相関する少なくとも１種の遺伝子マーカーの前記個体における存在または非存在に相当する情報、
ｋ）該個体の臨床症状に相当する情報、
ｌ）その他の実験室試験に相当する情報、
ｍ）該個体の遺伝子発現値に相当する情報、
ｎ）飽和脂肪が多く、高塩、高コレステロール濃度の食事などの既知の心血管系リスク因子の該個体における消費に相当する情報、
ｏ）心電図、心エコー検査、頚動脈内膜中膜厚の超音波診断、血流依存性血管拡張反応検査、脈波伝播速度、足関節上腕血圧比、ストレス心エコー検査、心筋血流イメージング、ＣＴによる冠動脈カルシウム検査、高分解能ＣＴ血管撮影法、ＭＲＩイメージング、及びその他のイメージング様式からなる群から選択される技術によって得られる個体のイメージング結果に相当する情報、
ｐ）個体の薬物療法に関する情報、及び
ｑ）個体の腎機能に関する情報。
いくつかの実施形態において、本方法は、医療保険料または生命保険料を決定する目的に、ＣＶイベントの可能性を決定することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、医療保険または生命保険の補償範囲または保険料を決定することをさらに含む。いくつかの実施形態において、本方法は、医療資源の利用を予測及び／または管理するために、本方法から得られた情報を用いることをさらに含む。いくつかの実施形態において、本方法は、医療行為、病院、または企業を取得または購入するための決定を下すことを可能にするために、本方法から得られた情報を使用することをさらに含む。
いくつかの実施形態において、コンピュータにより実施される心血管（ＣＶ）イベントのリスクを評価する方法が提供される。いくつかの実施形態において、この方法は、コンピュータで被験者のバイオマーカー情報を検索すること（ここで、このバイオマーカー情報は、被験者由来のサンプル中の、ＭＭＰ１２、アンジオポイエチン−２、補体Ｃ７、心臓トロポニンＩ、アンジオポイエチン関連タンパク質４、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ、アルファ−１−抗キモトリプシン複合体、ＧＤＦ１１、及びアルファ−２−抗プラスミンから選択される少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、または全９種のレベルを含む）と、該バイオマーカー値のそれぞれの分類をコンピュータで実行することと、複数の分類に基づいて、該個体に関するＣＶイベントについてのリスクの評価の結果を表示することと、を含む。いくつかの実施形態において、被験者に関するＣＶイベントについてのリスクの評価の結果を表示することは、コンピュータディスプレイ上に結果を表示することを含む。
各サンプル希釈においてディスカバリー及びバリデーションのセットで測定されたタンパク質に関する正規化スケール因子分布の箱ひげ図（ｂｏｘ ｐｌｏｔ）を示す。箱ひげ図において、赤色線は中央値を表し、箱の範囲は、データの５０％を含有する四分位数範囲を表し、ひげは、箱から１．５倍の四分位数範囲に延びる。極端な正規化スケール因子を有するサンプルを赤色で「＋」符号で印をつけている。評価サンプルで測定されたタンパク質シグナルにおける系統的強度バイアスの証拠を補償するために、正規化によって、ディスカバリー（バリデーション）セットにおける中央値シグナルレベルを増加（減少）させる。 ＲＦＵの標準偏差当たりの（上部）または外側のＲＦＵ四分位数間（底部）の単変量Ｃｏｘモデルハザード比のボルカノ（ｖｏｌｃａｎｏ）プロットを示す。水平の点線は、ボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）補正されたｐ＝０．０５の有意レベルを示す。国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）の遺伝子名称を、極端なハザード比を有するタンパク質に対する簡潔なラベルとして用いる。赤色でラベルされたタンパク質は、ＣＶＤ９モデル中に含まれるものであり、すなわち、ＡＮＧＰＴ２は「アンジオポイエチン−２」であり、Ｃ７は「補体Ｃ７」であり、ＳＥＲＰＩＮＦ２は「セリンプロテアーゼ阻害剤Ｆ２」または「α２−抗プラスミン」であり、ＣＣＬ１８は「ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１８」（「肺及び活性調節ケモカイン（ＰＡＲＣ）」としても知られる）であり、ＡＮＧＬ４は「アンジオポイエチン関連タンパク質４」であり、ＫＬＫ３．ＳＥＲＰＩＮＡ３は、「α１−抗キモトリプシン複合体」であり、ＴＮＮＩ３は、「心臓トロポニン−Ｉ」である。 ディスカバリー及びバリデーションセットにおけるＣＶＤ９タンパク質の平均シグナルレベルならびに正規化手順から得られた残強度バイアスを推定するために用いられたロバストな線形回帰モデルを示す。 Ｃｏｘ較正モデルによる再較正前（左）及び再較正後（右）の発見セットにおけるフラミンガムモデルによって生じた予測されたリスクと実際のリスクとの比較を示す。 Ｃｏｘ較正モデルによる再較正前（左）及び再較正後（右）のＨＵＮＴ３評価セットにおけるフラミンガムモデルによって生じた予測されたリスクと実際のリスクとの比較を示す。 サンプル及びディスカバリー（左側、灰色）ならびに評価（右側、桃色）サンプルセットに適用された統計的処理のフローチャートを示す。 バリデーションセットにおいて多変数ＬＡＳＳＯ手法によって選択された１６種のタンパク質（黒色符号、各線対の上の線）及び評価セットからの同一のタンパク質（赤色符号、各線対の下線）の相補群に関する単変量の第４〜第１四分位数ハザード比（９５％の信頼区間での）の比を示す。星印の付いたタンパク質は、重要性が低いタンパク質の段階的変数減少法後の最終母数モデル（ＣＶＤ９）に含まれるものである。これらの１６種のタンパク質の関連する生物学的性質については、実施例を参照されたい。凡例：ＭＭＰ−７は、マトリックスメタロプロテアーゼ７であり；ＭＭＰ１２は、マトリックスメタロプロテアーゼ１２であり、ＴＩＭ３は、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有タンパク質３であり、ＣＣＬ１８は、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１８（以前は、ＰＡＲＣ（肺及び活性調節ケモカイン）として知られていた）であり、ＧＤＦ１１は、増殖分化因子１１であり、ＣＤＯは、細胞接着関連癌遺伝子調節因子であり、ＥＧＦは、上皮細胞増殖因子である。 ＣＶＤ９（左側）及びフラミンガム（右側）についてのＨＵＮＴ−３評価セットにおいて予測されたリスクの十分位数によって実行された校正を示す。 ＣＶＤ９リスクの百分位数に対するＣＶＤ９（桃色）及びフラミンガム（灰色）についての予測されたリスクを示す。大きな点は、ＣＶＤ９（桃色）及びフラミンガム（灰色）モデルによって生じた予測されたリスクの各十分位数において患者に対して観察されたイベント頻度を示す。水平線は、４年間のイベント発生率を示す。 １年及び４年（この集団では、フラミンガムスコアに対する最長の適用期間である）における、発見セット（黒色、矢印で表示）及び独立した評価セット（赤色、矢印で表示）に適用されたモデルに関するＲＯＣ曲線を示す。発見（緑色）及び評価（青色）コホートにおけるフラミンガムスコアに関するＲＯＣ曲線も含まれる。 ディスカバリー（左側）及びバリデーション（右側）コホートにおいて各ＣＶＤ９で予測されたリスク四分位数に関するカプランマイヤー（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）生存率曲線を示す。目盛りは、個々の被験者についての中断打ち切り（最終観察）の時間を示し、網かけ線の間隔は、９５％信頼区間を示す。 本明細書で記載される様々なコンピュータ実装方法で使用するための非限定的な例示的なコンピュータシステムを例示する。 生体サンプル中の１つ以上のバイオマーカーを検出するように使用することができる非限定的な例示的なアプタマーアッセイを例示する。 遅い解離速度のアプタマーなどのアプタマーに組み入れられ得る特定の例示的な修飾ピリミジンを示す。 ＧＤＦ１１とＦＳＴＬ３との間の相関を示す。 各モデルに関する各四分位数についての生存率曲線を示す。第１〜第４の四分位数は、黒色（上の線）、赤色（２番目の線）、緑色（３番目の線）、及び青色（下の線）で記述されている。網かけ線は、９５％信頼区間を示す。記号「＋」は、中断打ち切られたサンプルを意味する。 低リスク群と高リスク群に関するＧＤＦ１１とＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３との間の生存率曲線の比較を示す。左側パネルにおいて、上の線は、ＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３モデルを表し、下の線は、ＧＤＦ１１モデルを表す。右側パネルにおいて、上の線はＧＤＦ１１モデルを表し、下の線は、ＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３モデルを表す。 ＧＤＦ１１とＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３との間の（左側）及びＦＳＴＬ３とＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３との間（右側）の４年の確率の比較を示す。 ３つのモデルに関する４年におけるＲＯＣ曲線を示す。 ＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３モデルの各群（全て、ＣＨＦ−死亡、及び血栓形成イベント）の線形予測子の各四分位数に関する生存率曲線を示す。第１〜第４四分位数は、黒色（上の線）、赤色（２番目の線）、緑色（３番目の線）、及び青色（下の線）で記述されている。網かけ線は、９５％信頼区間を示す。 モデルＧＤＦ１１、ＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ１、ＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ２、及びＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ１．ＷＦＩＫＫＮ２に関する各四分位数についての生存率曲線を示す。 ＧＤＦ１１モデルとＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ１との間の、ＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ２とＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ１．ＷＦＩＫＫＮ２モデルとの間のリスク確率を示す。 各モデル：ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ１、ＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ２、及びＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ１．ＷＦＩＫＫＮ２に関するＲＯＣ曲線を示す。
本発明は、特定の代表的な実施形態と併せて説明されるが、本発明は、特許請求の範囲で定義されるものであり、これらの実施形態に限定されるものではないことが理解されよう。
当業者であれば、本発明の実施において使用可能な、本明細書で記載されたものと類似するかまたは等価な多くの方法及び材料を理解しているものと思われる。本発明は、説明された方法及び材料によって限定されることは決してない。
他に定義されない限り、本明細書において用いられる専門用語や科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。本発明の実施において本明細書で説明されるものと類似するかまたは等価なあらゆる方法、装置、及び材料が使用できるが、特定の方法、装置、及び材料を本明細書に記載する。
本明細書において引用された全ての公開、公開された特許文献、及び特許出願は、参照により本明細書に組み入れられ、それにより参照により本明細書に組み入れられたそれぞれ個々の公開、公開された特許文献、または特許出願が、個別かつ具体的に提示されたのと同程度とする。
添付の請求項を含む本出願で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、その内容から明らかに別の意味を示していない限り、複数形を含み、「少なくとも１つの」及び「１つ以上の」とほとんど同じ意味で用いられてもよい。したがって、「ａｎ ａｐｔａｍｅｒ」と記載される場合、それはアプタマーの混合物を含み、「ａ ｐｒｏｂｅ」と記載される場合、プローブの混合物を含み、他も同様である。
本明細書で使用される場合、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、「ｃｏｎｔａｉｎｓ」、「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」、及びそれらのあらゆる変化形は、非排他的な包含を網羅することを意図し、これにより、要素または一連の要素を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｃｏｎｔａｉｎｓ）プロセス、方法、プロダクト−バイ−プロセス、または物質の組成物が、明確に列挙されていない他の要素を含んでもよい。
本出願は、所定期間内の、例えば、１年以内、２年以内、３年以内、または４年以内の短期のＣＶイベントのリスクを予測するためのバイオマーカー、方法、装置、試薬、システム、及びキットを含む。
「心血管イベント」とは、循環系のあらゆる部分の障害または機能不全を意味する。一実施形態において、「心血管イベント」は、卒中、一過性虚血発作（ＴＩＡ）、心筋梗塞（ＭＩ）、循環器系の機能不全に起因する突然死、及び／もしくは心不全、またはほとんどの原因が心血管系に起因する集団において未知の原因の突然死を意味する。別の実施形態において、「心血管イベント」は、ステントまたは血管形成術などを要する、前述の機能不全及び／または不安定狭心症のいずれかを意味する。
心血管イベントは、「うっ血性心不全」または「ＣＨＦ」及び「血栓形成イベント」を含む。血栓形成イベントとしては、ＭＩ、一過性虚血発作（ＴＩＡ）、卒中、急性冠症候群、及び冠血行再建の必要性が挙げられる。
ある特定の実施形態において、４年以内の期間の突然死または将来的なＣＶイベントのリスクを評価するために、単独でまたは様々な組み合わせでのいずれかで使用されるバイオマーカーが提供され、ここでＣＶイベントは、心筋梗塞、卒中、死亡、及びうっ血性心不全と定義される。血栓形成イベントは、心筋梗塞と卒中との組み合わせからなる。以下で詳細に説明されるように、例示的な実施形態は、表３に示されるバイオマーカーを含み、これらは実施例で全般的に説明されるマルチプレックスＳＯＭＡｍｅｒベースのアッセイを用いて同定されたものである。
説明されるＣＶイベントバイオマーカーのうちのいくつかは、単独でもＣＶイベントのリスクを評価するのに有用であるが、本明細書では、ＣＶイベントのバイオマーカーの複合サブセットのグループ分けのための方法も記載され、この方法では、選択された各グループまたはサブセットは、本明細書ではほとんど同じ意味で「バイオマーカーパネル」及びパネルと称される３種またはそれ以上のバイオマーカーのパネルとして有用である。したがって、本出願の様々な実施形態は、表３のバイオマーカーのうちの少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、または全９種を含む組合せを提供する。
一実施形態において、バイオマーカーのサブセットまたはパネルに有用なバイオマーカーの数は、特定のバイオマーカー値の組み合わせにおける感度及び特異度の値に基づく。用語「感度」及び「特異度」は、本明細書では、個体の生体サンプルで検出された１種以上のバイオマーカー値に基づいて、４年以内にＣＶイベントを起こす高いリスクがあるか、または同じ期間内にＣＶイベントを起こす高いリスクがないと個体を正確に分類する能力に関して用いられる。「感度」は、高いＣＶイベントリスクがある個体を正確に分類することに関するバイオマーカー（複数可）の性能を示す。「特異度」は、高いＣＶイベントリスクがない個体を正確に分類することに関するバイオマーカー（複数可）の性能を示す。例えば、イベント陰性サンプルとイベント陽性サンプルのセットを試験するのに用いられたマーカーのパネルについて特異度が８５％及び感度が９０％であるということは、そのパネルにより対照サンプルの８５％がイベント陰性サンプルに正確に分類され、そのパネルによりイベント陽性サンプルの９０％がイベント陽性サンプルに正確に分類されたことを示す。
代替的な方法において、スコアは、ＣＶイベントの高、中、または低リスクの閾値と共に連続範囲で報告することも可能であり、閾値は、臨床所見に基づいて決定され、すなわち、同一データの代替的表現は、確率の閾値（５０％など）を設定するために、及び被験者のこの比率が彼らのイベントを有すると思われる時間を予測するため（例えば、同位体半分崩壊する時間である、放射活性崩壊おける半減期に類似する）のためのものである。
バイオマーカーのサブセットまたはパネルで使用するバイオマーカーの数に影響を及ぼし得る要素は、ＣＶイベントのリスクを評価する個体からの生体サンプルを得るために使用される手法である。慎重に管理されたサンプル調達環境においては、所望の感度及び特異度ならびに／または閾値への適合に必要なバイオマーカーの数は、サンプル回収、取り扱い、及び保管の際により多くの変動が起こりやすい状況よりも少なくなると予想される。あるいは、より高い感度及び特異度は、サンプル調達に対してロバスト性が低いより多くのマーカー（例えば、変動する回収環境で生き残れないもの）と、これと共に不完全に回収されるサンプルの拒絶またはリスク予測アルゴリズム由来の高感度マーカーの排除を可能にするサンプル取り扱いマーカーを用いることで得ることができる。
「生体サンプル」、「サンプル」、及び「試験サンプル」は、本明細書ではほとんど同じ意味で用いられ、個体から得られた、または別の方法で個体から生じたあらゆる材料、生体液、組織、または細胞を意味する。例としては、血液（例えば全血、白血球、末梢血単核細胞、軟層、血漿、及び血清）、痰、涙、粘液、鼻の洗浄標本、鼻吸引液、尿、唾液、腹腔洗浄液、腹水、嚢胞液、腺液、リンパ液、気管支吸引液、滑液、関節吸引液、臓器分泌物、細胞、細胞抽出物、及び脳脊髄が挙げられる。さらにこの例としては、前述した全てのものを実験的に分離した画分も挙げられる。例えば血液サンプルは、血清、血漿に分画してもよいし、あるいは特定のタイプの血液細胞、例えば赤血球または白血球（白血球）を含む画分に分画してもよい。いくつかの実施形態においては、血液サンプルは、乾燥血液スポットである。いくつかの実施形態においては、血漿サンプルは、乾燥血漿スポットである。いくつかの実施形態においては、サンプルは、組織及び流体サンプルの組み合わせなどの、個体由来のサンプルの組み合わせとすることもできる。用語「生体サンプル」はさらに、例えば便サンプル、組織サンプル、または組織生検等をホモジナイズした固体材料を含有する材料も含む。用語「生体サンプル」はさらに、組織培養または細胞培養から抽出された材料も含む。生体サンプルを得るためのあらゆる適切な方法を用いることができき、例示的な方法としては、例えば、静脈切開、綿棒（例えば口腔内用綿棒）、及び穿刺吸引細胞診生検法が挙げられる。穿刺吸引細胞診に適した例示的な組織としては、リンパ節、肺、甲状腺、乳房、膵臓、及び肝臓が挙げられる。サンプルはさらに、例えば、顕微解剖（例えばレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（ＬＣＭ）またはレーザーマイクロダイセクション（ＬＭＤ））、膀胱の洗浄標本、塗抹標本（例えばＰＡＰ塗抹標本）、または乳管洗浄によっても回収することができる。個体から得られたまたは個体から生じた「生体サンプル」は、個体から採取された後に何らかの適切な方式で処理したサンプルも含む。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、血漿サンプルである。
さらに、いくつかの実施形態において、多数の個体から生体サンプルを採取し、それらをプールするかまたはそれぞれ個々の生体サンプルのアリコートをプールすることにより生体サンプルを得てもよい。プールしたサンプルは、１つの個体からのサンプルとして処理してもよいし、さらに、例えば、プールしたサンプルにおいて予後不良が確定したら、それぞれ個々の生体サンプルを再試験して、どの個体（複数可）が高いまたは低いＣＶイベントのリスクを有するのかを決定してもよい。
本明細書の目的において、成句「個体からの生体サンプルに起因するデータ」とは、いくつかの形態のデータが、個体の生体サンプルから生じたものであるか、あるいは個体の生体サンプルを用いて作製されたものであることを意味することを意図する。このようなデータは、作製された後に、再フォーマットしてもよく、修正してもよく、またはある程度まで数学的に変更してもよく、これは、例えば、ある測定システムでの単位からの別の測定システムでの単位に変換することによってなされるが、このようなデータは、生体サンプルから抽出されたものであるか、あるいは生体サンプルを用いて作製されたものと理解される。
「標的」、「標的分子」、及び「分析物」は、本明細書ではほとんど同じ意味で用いられ、生体サンプル中に存在し得るあらゆる対象の分子を意味する。「対象の分子」には、特定の分子の何らかのわずかな変化、タンパク質の場合、例えばアミノ酸配列、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化におけるわずかな変化、あるいはその他のあらゆる操作または改変、例えば標識成分との共役も含まれるが、それにより実質的に分子の同一性は変更されない。「標的分子」、「標的」または「分析物」は、１つのタイプの分子または分子種のコピー群であるか、あるいは多分子構造を指す。「標的分子」、「標的」、及び「分析物」は、複数のタイプの分子または分子種のコピー群であるか、あるいは多分子構造を意味する。例示的な標的分子としては、タンパク質、ポリペプチド、核酸、炭水化物、脂質、多糖類、糖タンパク質、ホルモン、受容体、抗原、抗体、アフィボディ、抗体模倣体、ウイルス、病原体、有毒物質、基質、代謝産物、遷移状態類似体、補因子、阻害剤、薬物、色素、栄養素、増殖因子、細胞、組織、及び前述のものいずれかのあらゆるフラグメントまたは部分が挙げられる。いくつかの実施形態において、標的分子はタンパク質であり、この場合、標的分子は、「標的タンパク質」と称されてもよい。
本明細書で使用される場合、「捕獲剤」または「捕獲試薬」とは、バイオマーカーに特異的に結合することができる分子を指す。「標的タンパク質捕獲試薬」とは、標的タンパク質に特異的に結合することができる分子を指す。非限定的な例示的な捕獲試薬としては、アプタマー、抗体、アドネクチン、アンキリン、他の抗体模倣体ならびに他のタンパク質足場、自己抗体、キメラ、低分子物質、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、インプリントポリマー、アビマー、ペプチド模倣体、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、合成受容体、及び前述の捕獲試薬のいずれかの改変体ならびにフラグメントが挙げられる。いくつかの実施形態において、捕獲試薬は、アプタマー及び抗体から選択される。
用語「抗体」とは、あらゆる種の全長抗体及びこのような抗体のフラグメントならびに誘導体、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体、ＦＶフラグメント、及び単鎖Ｆｖフラグメントを指す。用語「抗体」はさらに、合成由来抗体、例えば、ファージディスプレイ由来抗体及びフラグメント、アフィボディ、ナノボディなどを指す。
本明細書で使用される場合、「マーカー」及び「バイオマーカー」は、ほとんど同じ意味で用いられ、個体における正常もしくは異常な過程の徴候、または個体における疾患またはその他の状態を示す標的分子を指す。より具体的には、「マーカー」または「バイオマーカー」は、特定の生理学的な状態または過程の存在に関連する解剖学的、生理学的、生化学的、または分子的なパラメータであり、このような状態または過程は、正常か異常かのいずれでもよく、異常な場合、慢性または急性のどちらでもよい。バイオマーカーは、実験室のアッセイ及び医療用イメージングなどの様々な方法によって検出及び測定が可能である。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、標的タンパク質である。
本明細書で使用される場合、「バイオマーカーレベル」及び「レベル」とは、生体サンプル中のバイオマーカーを検出するあらゆる分析法を用いて得られるものであって、生体サンプル中のバイオマーカーの、生体サンプル中のバイオマーカーに関する、または生体サンプル中のバイオマーカーに対応する、存在、非存在、絶対量または濃度、相対量または濃度、タイター、レベル、発現レベル、測定レベルの比率などを示す測定値を指す。「レベル」の正確な性質は、バイオマーカーを検出するのに用いられる具体的な設計及び特定の分析法の構成要素に依存する。
バイオマーカーが、個体における異常な過程または疾患もしくはその他の状態を示すか、あるいはそれらの徴候である場合、そのバイオマーカーは、一般的に、個体における正常な過程または疾患もしくはその他の状態の非存在を示すか、あるいはそれらの徴候であるバイオマーカーの発現レベルまたは値と比較して、過剰発現されたかまたは過小発現されたかのいずれかと説明される。「アップレギュレーション」、「アップレギュレートされた」、「過剰発現」、「過剰発現された」、及びそれらのあらゆる変化形は、ほとんど同じ意味で用いられ、生体サンプル中のバイオマーカーの値またはレベルが、一般的に健康または正常な個体からの類似の生体サンプルで検出されるバイオマーカーの値またはレベル（もしくは値またはレベルの範囲）よりも高いことを意味する。この用語はさらに、生体サンプル中のバイオマーカーの値またはレベルが、特定の疾患の異なるステージで検出される可能性があるバイオマーカーの値またはレベル（もしくは値またはレベルの範囲）よりも高いことを意味する場合もある。
「ダウンレギュレーション」、「ダウンレギュレートされた」、「過小発現」、「過小発現された」、及びそれらのあらゆる変化形は、ほとんど同じ意味で用いられ、生体サンプル中のバイオマーカーの値またはレベルが、一般的に健康または正常な個体からの類似の生体サンプルで検出されるバイオマーカーの値またはレベル（もしくは値またはレベルの範囲）よりも低いことを指す。この用語はさらに、生体サンプル中のバイオマーカーの値またはレベルが、特定の疾患の異なるステージで検出される可能性があるバイオマーカーの値またはレベル（もしくは値またはレベルの範囲）よりも低いことを指してもよい。
さらに、過剰発現または過小発現されたバイオマーカーは、個体における正常な過程または疾患もしくはその他の状態を示すかまたはそれらの徴候である「正常な」バイオマーカーの発現レベルと比較して、「差次的に発現される」ことを指す場合もあるし、あるいは「差次的なレベル」または「差次的な値」を有することを指す場合もある。したがって、バイオマーカーの「差次的な発現」は、バイオマーカーの「正常な」発現レベルからの変動を指す場合もある。
標的分子の「対照レベル」とは、疾患または状態を有さない個体からの、あるいは疾患または状態を有する疑いがないかまたはそのリスクがない個体からの、あるいは一次または第１の心血管イベントを有したが、二次心血管イベントを有さなかった個体からの、あるいは安定したし血管疾患を有する個体からの同一のサンプルタイプ中の標的分子のレベルを指す。対照レベルは、疾患または状態を有さない、あるいは疾患または状態を有する疑いがないかまたはそのリスクがない、あるいは一次または第１の心血管イベントを有したが、二次心血管イベントを有さなかった、あるいは安定したし心血管疾患を有する、またはこれらの組み合わせを有する個体の集団からのサンプル中の標的分子の平均レベルを指してもよい。
本明細書で使用される場合、「個体」、「被験者」、及び「患者」は、ほぼ同じ意味で用いられ、哺乳動物を指す。哺乳動物の個体は、ヒトであってもよく、またはヒト以外であってもよい。様々な実施形態において、個体はヒトである。健康または正常な個体は、従来の診断方法で対象の疾患または状態（例えば、心筋梗塞、卒中、及びうっ血性心不全などの心血管イベント）が検出することができない個体である。
「診断する」、「診断すること」、「診断」、及びそれらの変化形は、個体の健康状態または状態を、１つ以上の徴候、症状、データまたはその個体に関するその他の情報に基づき検出、決定、または確認することを指す。個体の健康状態は、健康／正常と診断される場合もあるし（すなわち、疾患または状態がないという診断）、あるいは不健康／異常と診断される場合もある（すなわち、疾患もしくは状態の特徴があるという診断、または疾患もしくは状態の特徴の評価）。用語「診断する」、「診断すること」、「診断」等は、特定の疾患または状態に関して、疾患の初期の検出；疾患の特徴付けまたは分類；疾患の進行、寛解または再発の検出；及び個体に処理または治療を施した後の疾患応答の検出を包含する。ＣＶイベントリスクの予測は、高いＣＶイベントリスクを有する個体とそうではない個体とを区別することを含む。
「予後予測する」、「予後予測すること」、「予後予測」、及びそれらの変化形は、疾患または状態を有する個体における疾患または状態の将来的な経過の予測（例えば、患者の生存を予測すること）を意味し、このような用語は、個体に処理または治療を施した後の疾患または状態の応答を評価することを包含する。
「評価する」、「評価すること」、「評価」、及びそれらの変化形は、「診断」と「予後予測」の両方を包含し、さらに疾患を有さない個体における疾患または状態の将来的な経過に関する決定または予測、ならびに一見疾患が治癒したまたは状態が消散した個体において疾患または状態が再発するリスクに関する決定または予測も包含する。また用語「評価する」は、治療に対する個体の応答を評価すること、例えば個体が、治療剤によく応答する可能性が高いのか、あるいは治療剤に応答する可能性が低いのか（または例えば毒作用またはその他の望ましくない副作用を受けるのか）を予測すること、個体に投与する治療剤を選択すること、または個体に施された治療に対する個体の応答を監視もしくは決定することも包含する。したがって、ＣＶイベントのリスクを「評価すること」は、例えば、以下のうちいずれか、すなわち個体における将来的なＣＶイベントリスクを予測すること；一見ＣＶの問題がない個体におけるＣＶイベントリスクを予測すること；またはＣＶ処置に対する個体の応答を決定もしくは予測すること、あるいは個体の生体サンプルから抽出されたバイオマーカー値の決定に基づいて個体に施されるＣＶ処置を選択することのいずれかであってもよい。ＣＶイベントのリスクの評価は、例えば連続的なスケールでＣＶイベントのリスクを評価する実施形態、または漸増式の分類でＣＶイベントのリスクを分類する実施形態を含んでいてもよい。リスクの分類は、例えば「ＣＶイベントの高いリスクなし」、「ＣＶイベントの高いリスク」、及び／または「ＣＶイベントの平均より低いリスク」などの２つ以上の分類に分類することを含む。いくつかの実施形態において、ＣＶイベントリスクの評価は、所定の期間でなされる。非限定的な例示的なこのような所定の期間は、１年、２年、３年、４年、５年、及び５年超が含まれる。
本明細書で使用される場合、「追加の生物医学的情報」は、ＣＶリスク、またはより具体的にはＣＶイベントリスクと関連がある本明細書で記載されるバイオマーカーのいずれかを用いてなされた評価以外の個体の１つ以上の評価を意味する。「追加の生物医学的情報」は、以下のうちいずれか、すなわち、個体の身体的な記述子、例えば個体の身長及び／または体重；個体の年齢；個体の性別；体重変化；個体の民族性；職業歴；心血管疾患（またはその他の循環系障害）の家族歴；個体におけるより高い心血管疾患（またはその他の循環系障害）のリスクと相関する遺伝子マーカー（複数可）の存在、あるいは家族間の頚動脈内膜厚の変化；胸痛、体重増加などの臨床症状、または遺伝子発現値の消失；個体の身体的な記述子、例えば放射線学的画像検査によって観察された身体的な記述子；喫煙状態；アルコール摂取歴；職業歴；食事の習慣−塩、飽和脂肪、及びコレステロール摂取；カフェイン消費；及び撮像情報、例えば心電図、心エコー検査、頚動脈内膜中膜厚の超音波診断、血流依存性血管拡張反応検査、脈波伝播速度、足関節上腕血圧比、ストレス心エコー検査、心筋血流イメージング、冠ＣＴによる冠動脈カルシウム検査、高分解能ＣＴ血管撮影法、ＭＲＩイメージング、及びその他のイメージング様式；及び個体の薬物療法のいずれかを含む。いずれかの追加の生物医学的情報、例えばその他の実験室試験（例えばＨＤＬ、ＬＤＬ検査、ＣＲＰレベル、Ｎｔ−ｐｒｏＢＮＰ検査、ＢＮＰ検査、高感度トポロニン検査、ガレクチン−３検査、血清アルブミン検査、クレアチン検査）の評価と組み合わせてバイオマーカーレベルを試験することは、バイオマーカー試験単独または追加の生物医学的情報のいずれかの特定の項目単独（例えば頚動脈内膜厚イメージング単独）の評価と比較して、例えばＣＶイベント予測に関する感度、特異度、及び／またはＡＵＣを改善する可能性がある。追加の生物医学的情報は、当該技術分野において既知の慣例的な技術を用いて個体から得ることができ、例えば、慣例的な患者への質問事項または健康歴の質問事項などの使用によって個体自身から得てもよいし、あるいは医師などから得てもよい。いずれかの追加の生物医学的情報の評価と組み合わせてバイオマーカーレベルを試験することは、バイオマーカーを単独で試験すること、または追加の生物医学的情報のいずれかの特定の項目を単独で（例えば、ＣＴイメージング単独で）評価することと比較して、例えばＣＶイベントの予測（またはその他の心血管関連の用途）に関する感度、特異度、及び／または閾値を改善する可能性がある。
本明細書で使用される場合、バイオマーカー値に関して「検出すること」または「決定すること」は、バイオマーカーレベルに対応するシグナルを観察し記録するのに使用される機器と、そのシグナルを生成するのに必要な材料／材料（複数）との両方の使用を含む。様々な実施形態において、バイオマーカーレベルは、蛍光、化学発光、表面プラズモン共鳴、表面弾性波、質量分析法、赤外分光分析、ラマン分光法、原子間力顕微鏡、走査トンネル顕微鏡、電気化学的な検出方法、各磁気共鳴、量子ドットなどが含まれるあらゆる適切な方法を用いて検出される。
本明細書で使用される場合、「米国心臓病学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ）（ＡＣＣ）リスクスコア」は、２０１３年１１月１２日にオンラインでサーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）に公開された（Ｐｒｉｎｔ ＩＳＳＮ：０００９−７３２２、Ｏｎｌｉｎｅ ＩＳＳＮ：１５２４−４５３９）、Ｇｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，“２０１３ ＡＣＣ／ＡＨＡ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｏｎ ｔｈｅ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｒｉｓｋ：Ａ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ／Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｈｅａｒｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｔａｓｋ Ｆｏｒｃｅ ｏｎ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ”に従って決定される。本明細書で使用される場合、「高い」リスクスコアは、ハードアテローム性動脈硬化症／心血管疾患（ＡＳＣＶＤ）イベント（非致死性心筋梗塞または冠状動脈性心疾患（ＣＨＤ）による死亡、あるいは致死性または非致死性卒中の最初の発症として定義される）に関する２０．０％またはそれ以上と予測された１０年のリスクであり、「中間の」リスクスコアは、ハードＡＳＣＶＤに関する１０．０〜１９．９％と予測された１０年のリスクであり、「低い」リスクは、ハードＡＳＣＶＤイベントに関する１０．０％未満と予測された１０年のリスクである。Ｇｏｆｆの１６ページ、表５を参照されたい。
「固体支持体」は、本明細書では、分子が共有結合または非共有結合のいずれかを介して直接的または間接的に結合する可能性がある表面を有するあらゆる基質を意味する。「固体支持体」は、様々な物理的構造を有するものでもよく、このような固体支持体としては、例えば、メンブレン；チップ（例えば、タンパク質チップ）；スライド（例えば、スライドガラスまたはカバーガラス）；カラム；中空の、固体の、半固体の、孔または空孔を含有する粒子、例えばビーズ；ゲル；ファイバー、例えば、光ファイバー材料；マトリックス；及びサンプル容器が挙げられる。例示的なサンプル容器としては、サンプルウェル、チューブ、毛細血管、バイアル、及びその他のあらゆる容器、サンプルを保持することができる溝またはくぼみが挙げられる。サンプル容器は、例えば、マイクロタイタープレート、スライド、マイクロフルイディクス装置などのマルチサンプルプラットフォーム上に含まれていてもよい。支持体は、天然または合成材料、有機または無機材料で構成されていてもよい。捕獲試薬を結合させる固体支持体の組成は、一般的に、結合の方法（例えば共有結合）に依存する。その他の例示的な容器としては、アッセイ及び関連の操作をその中で起こすことができる、微小液滴や、マイクロ流体工学的に制御された、またはバルクの水中油型エマルジョンが挙げられる。適切な固体支持体としては、例えば、プラスチック、樹脂、多糖類、シリカまたはシリカベースの材料、官能化ガラス、変性ケイ素、炭素、金属、無機ガラス、メンブレン、ナイロン、天然繊維（例えば、絹、羊毛、及び綿）、ポリマーなどが挙げられる。固体支持体を構成する材料は、例えば、カルボキシ、アミノ、またはヒドロキシル基などの反応性基を含んでいてもよく、これらは捕獲試薬の結合に利用される。ポリマー固体支持体としては、例えば、ポリスチレン、ポリエチレングリコールテトラフタレート、ポリ酢酸ビニル、塩化ビニル、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロニトリル、ポリメタクリル酸メチル、ポリテトラフルオロエチレン、ブチルゴム、スチレンブタジエンゴム、天然ゴム、ポリエチレン、ポリプロピレン、（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）フッ化ビニリデン、ポリカーボネート、及びポリメチルペンテンが挙げられる。用いることができる適切な固体支持体粒子としては、例えば、コード化粒子、例えば、ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）（登録商標）タイプのコード化粒子、磁気粒子、及びガラス粒子が挙げられる。
バイオマーカーの例示的な使用
様々な例示的な実施形態において、個体におけるＣＶイベントのリスクを評価するための方法が提供され、本方法は、例えば本明細書に記載される分析方法のいずれかを含む、多数の分析方法によって、個体の循環系中、例えば血清または血漿中に存在する１種以上のバイオマーカーに対応する１種以上のバイオマーカー値を検出することによってなされる。これらのバイオマーカーは、例えば、高いＣＶイベントのリスクを有する個体において、高いＣＶイベントリスクを有さない個体と比較して差次的に発現される。個体におけるバイオマーカーの差次的な発現の検出を用いて、例えば、１年、２年、３年、４年、または５年の時間枠以内のＣＶイベントのリスクを予測することができる。
独立型の診断テストとしてバイオマーカーレベルを試験することに加えて、バイオマーカーレベルは、疾患または状態の罹患性に関する高リスクを有する一塩基多型（ＳＮＰ）もしくはその他の遺伝子の損傷または変動性の決定と共になされてもよい。（例えばＡｍｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ４０、６１６−６２２（２００９）を参照）。
独立型の診断テストとしてバイオマーカーレベルを試験することに加えて、バイオマーカーレベルは、放射線学的なスクリーニングと共に用いてもよい。バイオマーカーレベルは、関連する症状または遺伝学的試験と共に用いてもよい。個体の適切な臨床ケアの方向性を示すために、ＣＶイベントのリスクを評価した後に本明細書に記載されるバイオマーカーのいずれかを検出することが有用な可能性があり、例えば、ＣＶイベントリスクを決定した後に高リスク個体のケアのレベルをより積極的なものに高めるといったことができる。関連する症状またはリスク因子と共にバイオマーカーレベルを試験することに加えて、バイオマーカーに関する情報はさらに、その他のタイプのデータと共に評価することもでき、このようなその他のタイプのデータは、具体的には個体の心血管イベントに関するリスクを有するデータ（例えば患者の病歴、症状、心血管疾患の家族歴、喫煙またはアルコール摂取歴、リスク因子、例えば遺伝子マーカー（複数可）の存在、及び／またはその他のバイオマーカーの状態など）を示す。これらの様々なデータは、コンピュータプログラム／ソフトウェアなどの自動化された方法によって評価してもよく、このような方法は、コンピュータまたはその他の器具／装置で具体化することができる。
高リスク個体において放射線学的なスクリーニングと共にバイオマーカーレベルを試験すること（例えば、冠動脈造影図で検出された閉塞と共にバイオマーカーレベルを評価すること）に加えて、バイオマーカーに関する情報はさらに、その他のタイプのデータと共に評価することもでき、このようなその他のタイプのデータとしては、具体的には個体がＣＶイベントを有することを示すデータは（例えば、患者の病歴、症状、心血管疾患の家族歴、リスク因子、例えば個体が喫煙者、重度のアルコール飲用者であるかどうか、及び／またはその他のバイオマーカーの状態など）を示す。これらの様々なデータは、コンピュータプログラム／ソフトウェアなどの自動化された方法によって評価してもよく、このような方法は、コンピュータまたはその他の器具／装置で具体化することができる。
バイオマーカーの試験はさらに、現在のところ臨床業務において利用されているガイドライン及び心血管系リスクのアルゴリズムと連携させてもよい。例えば、フラミンガムのリスクのスコアは、以下のリスク因子、すなわちＬＤＬ−コレステロール及びＨＤＬ−コレステロール値、グルコースレベルの異常、喫煙、収縮期血圧、及び糖尿病を含むリスク因子などを使用して、リスクのスコアを作製する。高リスク患者の頻度は加齢に伴って増加し、高リスク患者のうち男性のほうが女性よりも高い比率を占める。
記載されるバイオマーカーはいずれも、イメージング試験で利用することができる。例えば、造影剤を記載されるバイオマーカーのいずれかにカップリングしてもよく、これを利用して、その他の用途のなかでも特に、心血管イベントリスクの予測を補助したり、治療的介入への応答を監視したり、臨床試験において標的集団を選択したりすることができる。
バイオマーカー及びバイオマーカーレベルの検出及び決定
本明細書に記載されるバイオマーカーのバイオマーカーレベルは、様々な既知の分析方法のいずれかを用いて検出することができる。一実施形態において、バイオマーカー値は捕獲試薬を用いて検出される。様々な実施形態において、捕獲試薬は、溶液中でバイオマーカーと接触させてもよいし、あるいは捕獲試薬を固体支持体に固定した状態でバイオマーカーと接触させてもよい。他の実施形態において、捕獲試薬は、固体支持体上で二次的な機構との反応性を有する機構を含む。これらの実施形態において、溶液中で捕獲試薬とバイオマーカーとを接触させて、捕獲試薬上の機構と固体支持体上の二次的な機構とを共に用いてバイオマーカーを固体支持体に固定することもできる。捕獲試薬は、行われる分析のタイプに基づいて選択される。捕獲試薬としては、アプタマー、抗体、アドネクチン、アンキリン、その他の抗体模倣体、及びその他のタンパク質の足場、自己抗体、キメラ、低分子物質、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体フラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖフラグメント、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、アフィボディ、ナノボディ、インプリントポリマー、アビマー、ペプチド模倣体、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、及び合成受容体、ならびにこれらの改変体及びフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、バイオマーカーレベルは、バイオマーカー／捕獲試薬複合体を用いて検出される。
いくつかの実施形態において、バイオマーカーレベルは、バイオマーカー／捕獲試薬複合体から抽出されるか、あるいは間接的に検出され、例えば、バイオマーカー／捕獲試薬の相互作用の後に起こる反応の結果として検出されるが、これは、バイオマーカー／捕獲試薬複合体の形成に依存する。
いくつかの実施形態において、バイオマーカーレベルは、生体サンプル中のバイオマーカーから直接検出される。
いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、生体サンプル中の２つ以上のバイオマーカーの同時検出可能にする多重化様式を用いて検出される。多重化様式のいくつかの実施形態において、捕獲試薬は、固体支持体上の別々の位置で、共有結合または非共有結合によって、直接的または間接的に固定される。いくつかの実施形態では、多重化様式は、別々の固体支持体を使用し、各固体支持体は、その固体支持体に関連する固有の捕獲試薬、例えば、量子ドットを有する。いくつかの実施形態において、生体サンプル中で複数のバイオマーカーのそれぞれ１つの検出ごとに、別個の装置が用いられる。別個の装置は、生体サンプル中の各バイオマーカーを同時に処理可能であるよう構成されてもよい。例えば、マルチタイタープレートを用いることができ、これにより、プレート中の各ウェルは、生体サンプル中で検出される１つ以上のバイオマーカーを独自に分析するのに用いられる。
前述の実施形態のうちの１つまたはそれより多くにおいて、バイオマーカーレベルの検出を可能にするために、蛍光タグを用いてバイオマーカー／捕獲試薬複合体の構成要素を標識するようことができる。様々な実施形態において、蛍光標識は、既知の技術を用いて、本明細書に記載されるバイオマーカーのいずれかに特異的な捕獲試薬に共役させることができ、その後、蛍光標識を用いて、対応するバイオマーカーレベルを検出することができる。適切な蛍光標識としては、希土類キレートフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、アロフィコシアニン、ＰＢＸＬ−３、Ｑｄｏｔ ６０５、リサミン（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）、フィコエリトリン、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ）、及びその他の類似の化合物が挙げられる。
いくつかの実施形態において、蛍光標識は、蛍光色素分子である。いくつかの実施形態において、蛍光色素分子は、少なくとも１つの置換インドリウム環系を含み、インドリウム環の３位の炭素における置換基は、化学反応性を有する基または共役物質を含む。いくつかの実施形態において、色素分子としては、アレクサフルオロ（ＡｌｅｘＦｌｕｏｒ）分子、例えばアレクサフルオロ（Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ）４８８、アレクサフルオロ５３２、アレクサフルオロ６４７、アレクサフルオロ６８０、またはアレクサフルオロ７００が挙げられる。他の実施形態において、色素分子は、第１のタイプの色素分子と第２のタイプの色素分子とを含み、例えば、２種の異なるアレクサフルオロ分子を含む。いくつかの実施形態において、色素分子は、第１のタイプの色素分子と第２のタイプの色素分子とを含み、このような２種の色素分子は、異なる放出スペクトルを有する。
蛍光は、蛍光は、広範なアッセイ様式に対応可能な様々な機器で測定することができる。例えば、分光蛍光計は、マイクロタイタープレート、顕微鏡スライド、プリントされたアレイ、キュベットなどを分析できるように設計されている。Ｊ．Ｒ．ＬａｋｏｗｉｃｚによるＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＋ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，Ｉｎｃ．，２００４を参照されたい。Ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｐｈｉｌｉｐ Ｅ．Ｓｔａｎｌｅｙ Ｌａｒｒｙ Ｊ．Ｋｒｉｃｋａ ｅｄｉｔｏｒｓ，、Ｗｏｒｌｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｊａｎｕａｒｙ ２００２を参照されたい。
１つ以上の実施形態において、任意選択で化学発光タグを用いてバイオマーカー／捕獲複合体の構成要素を標識することができ、それによりバイオマーカーレベルの検出が可能になる。適切な化学発光物質としては、塩化オキサリル、ローダミン６Ｇ、Ｒｕ（ｂｉｐｙ）３ ２＋、ＴＭＡＥ（テトラキス（ジメチルアミノ）エチレン）、ピロガロール（１，２，３−トリヒドロキシベンゼン）、ルシゲニン（Ｌｕｃｉｇｅｎｉｎ）、ペルオキシオキサレート、アリールオキサレート、アクリジニウムエステル、ジオキセタンなどのいずれかが挙げられる。
いくつかの実施形態において、検出方法は、バイオマーカーレベルに対応する検出可能なシグナルを生成する酵素／基質の組み合わせを含む。一般的に、酵素は、発色性基質の化学的変化を触媒し、この化学的変化は、分光光度法、蛍光、及び化学発光などの様々な技術を用いて測定することができる。適切な酵素としては、例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸塩デヒドロゲナーゼ、ウリカーゼ、キサンチンオキシダーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが挙げられる。
いくつかの実施形態において、検出方法は、測定可能なシグナルを生成する、蛍光、化学発光、放射性核種または酵素／基質の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施形態において、多モードのシグナル伝達は、バイオマーカーのアッセイ様式において固有かつ有利な特徴を有し得る。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるバイオマーカーについてのバイオマーカーレベルは、あらゆる分析方法を用いて検出することができ、このような分析方法としては、シングルプレックスアプタマーアッセイ、マルチプレックスアプタマーアッセイ、シングルプレックスまたはマルチプレックスイムノアッセイ、ｍＲＮＡ発現プロファイリング、ｍｉＲＮＡ発現プロファイリング、質量分析、組織学的／細胞学的方法などが挙げられ、以下で詳述される。
アプタマーベースのアッセイを用いるバイオマーカーレベルの決定
生体サンプル及びその他のサンプル中の生理学的に重要な分子の検出及び定量化を目的としたアッセイは、科学的な調査及び健康管理分野において重要なツールである。このようなアッセイの部類の１つは、固体支持体に固定された１種以上のアプタマーを有するマイクロアレイの使用に関するものである。アプタマーはそれぞれ、高度に特異的な様式で、かつ極めて高親和性で標的分子に結合することができる。例えば「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」という表題の米国特許第５，４７５，０９６号を参照されたい。さらに、例えばそれぞれ「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏｃｈｉｐ」という表題の米国特許第６，２４２，２４６号、米国特許第６，４５８，５４３号、及び米国特許第６，５０３，７１５号も参照されたい。マイクロアレイがサンプルと接触すると、アプタマーはサンプル中に存在するそれぞれの標的分子に結合し、それにより、バイオマーカーに対応するバイオマーカー値を決定することができる。
本明細書で使用される場合、「アプタマー」は、標的分子に対して特異的な結合親和性を有する核酸を指す。親和性の相互作用は程度の問題であることが認識されているが、しかしながら、この文脈において、アプタマーの標的に対する「特異的な結合親和性」は、アプタマーとその標的との結合親和性が、一般的には試験サンプル中のその他の構成要素に結合する場合の結合親和性よりもかなり高い程度であることを意味する。「アプタマー」は、特定のヌクレオチド配列を有する１つのタイプまたは種の核酸分子のコピーのセットである。アプタマーは、あらゆる適切な数のヌクレオチドを含んでいてもよく、化学修飾されたヌクレオチドの任意の数が含まれていてもよい。「アプタマー」は、１個より多くのこのような分子のセットを意味する。アプタマーは、同一または異なる多数のヌクレオチドを有する様々なアプタマーであってもよい。アプタマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡでもよく、あるいは化学修飾された核酸でもよく、さらに一本鎖、二本鎖でもよく、あるいは二本鎖の領域を含んでいてもよく、さらにより高次の構造を含んでいてもよい。またアプタマーは、光アプタマーであってもよく、その場合、アプタマーは光反応性または化学反応性を有する官能基を含み、その対応する標的に共有結合で結合することが可能になる。本明細書で開示されたアプタマーの方法はいずれも、同じ標的分子に特異的に結合する２種以上のアプタマーの使用を含んでいてもよい。以下でさらに説明されるように、アプタマーは、タグを含んでいてもよい。アプタマーがタグを含む場合、必ずしもアプタマーのコピー全てが同じタグを有していなくてもよい。その上、異なるアプタマーそれぞれがタグを含む場合、これらの異なるアプタマーは、同じタグまたは異なるタグのどちらを有していてもよい。
アプタマーは、ＳＥＬＥＸ法などの既知のあらゆる方法を用いて同定することができる。アプタマーが同定されたら、化学合成法及び酵素的な合成方法などの既知のあらゆる方法に従ってアプタマーを調製してもよいし、または合成してもよい。
用語「ＳＥＬＥＸ」及び「ＳＥＬＥＸ法」は、本明細書ではほとんど同じ意味で用いられ、一般的には（１）望ましい方式、例えばタンパク質との高親和性の結合で標的分子と相互作用するアプタマーの選択と、（２）その選択された核酸の増幅との組み合わせを指す。ＳＥＬＥＸ法を用いて、特異的な標的またはバイオマーカーに対して高親和性を有するアプタマーを同定することができる。
ＳＥＬＥＸは、一般的に、候補の核酸混合物を調製すること、候補混合物を望ましい標的分子に結合させて親和性複合体を形成すること、親和性複合体を未結合の候補核酸から分離すること、親和性複合体から核酸を分離して単離すること、核酸を精製すること、及び特異的なアプタマー配列を同定することを含む。選択されたアプタマーの親和性をさらに洗練するために、この方法を複数回行ってもよい。この方法は、過程の１またはそれより多くのポイントで増幅工程を含んでいてもよい。例えば「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」という表題の米国特許第５，４７５，０９６号を参照されたい。ＳＥＬＥＸ法は、標的と共有結合するアプタマーだけでなく、標的と非共有結合によって結合するアプタマーを生成するのにも使用することができる。例えば「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｃｈｅｍｉ−ＳＥＬＥＸ」という表題の米国特許第５，７０５，３３７号を参照されたい。
ＳＥＬＥＸ法を用いて、アプタマーに例えば改善されたインビボでの安定性または改善された送達特徴など、改善された特徴を付与する修飾ヌクレオチドを含む高親和性のアプタマーを同定することができる。このような修飾の例としては、リボース及び／またはリン酸及び／または塩基の位置での化学的置換が挙げられる。ＳＥＬＥＸ法によって同定された修飾ヌクレオチドを含むアプタマーは、「Ｈｉｇｈ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」という表題の米国特許第５，６６０，９８５号で説明されており、そこでは、ピリミジンの５’位及び２’位で化学修飾されたヌクレオチド誘導体を含むオリゴヌクレオチドが説明されている。米国特許第５，５８０，７３７号（上記参照）は、２’−アミノ（２’−ＮＨ２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、及び／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）で修飾されたヌクレオチドを１つ以上含む高度に特異的なアプタマーを記載している。またＳＥＬＥＸ及びフォトＳＥＬＥＸ（ｐｈｏｔｏＳＥＬＥＸ）における拡張された物理的及び化学特性を有する核酸ライブラリー及びその使用を記載している「ＳＥＬＥＸ ａｎｄ ＰＨＯＴＯＳＥＬＥＸ」という表題の米国特許出願公開公報第２００９００９８５４９号も参照されたい。
またＳＥＬＥＸを用いて、望ましい解離速度の特徴を有するアプタマーを同定することもできる。標的分子に結合することができるアプタマーを作製するための改良ＳＥＬＥＸ法を記載している「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ Ａｐｔａｍｅｒｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｏｆｆ−Ｒａｔｅｓ」という表題の米国特許出願公開公報第２００９０００４６６７号を参照されたい。それぞれの標的分子からの解離速度が遅いアプタマー及びフォトアプタマーを生成する方法を説明する。この方法は、候補混合物と標的分子とを接触させること、核酸−標的複合体の形成が起こるようにすること、及び遅い解離速度を強化した過程を行うことを含み、ここで速い解離速度を有する核酸−標的複合体は解離して再形成されないが、一方遅い解離速度を有する複合体は無傷のまま残ることになる。加えてこの方法は、解離速度性能が改善されたアプタマーを作製するための候補核酸混合物の生成に修飾ヌクレオチドを使用することを含む。非限定的な例示的な修飾ヌクレオチドとしては、例えば、図１４に示される修飾ピリミジンが挙げられる。いくつかの実施形態において、アプタマーは、塩基修飾などの修飾を有する、少なくとも１種のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、アプタマーは、標的タンパク質との疎水性接触を可能にする疎水性塩基修飾などの疎水性修飾を有する、少なくとも１種のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、このような疎水性接触は、より大きな親水性及び／またはより遅い解離速度のアプタマーによる結合に寄与する。非限定的な例示的な疎水性修飾を有するヌクレオチドは、図１４に示されている。いくつかの実施形態において、アプタマーは、少なくとも２種の、少なくとも３種の、少なくとも４種の、少なくとも５種の、少なくとも６種の、少なくとも７種の、少なくとも８種の、少なくとも９種の、または少なくとも１０種の、疎水性修飾を有するヌクレオチドを含み、ここでは、各疎水性修飾は、互いに同一であってもまたは異なってもよい。いくつかの実施形態において、アプタマー中の少なくとも１種の、少なくとも２種の、少なくとも３種の、少なくとも４種の、少なくとも５種の、少なくとも６種の、少なくとも７種の、少なくとも８種の、少なくとも９種の、または少なくとも１０種の疎水性修飾は、図１４に示される疎水性修飾から独立して選択されてもよい。
いくつかの実施形態において、遅い解離速度のアプタマー（例えば、疎水性修飾を有する少なくとも１種のヌクレオチドを含むアプタマー）は、≧３０分、≧６０分、≧９０分、≧１２０分、≧１５０分、≧１８０分、≧２１０分、または≧２４０分の解離速度（ｔ１／２）を有する。
いくつかの実施形態において、アッセイは、アプタマーが標的分子と共有結合したりまたは「光架橋」したりすることを可能にする光反応性を有する官能基を含むアプタマーを用いる。例えば「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｂｉｏｃｈｉｐ」という表題の米国特許第６，５４４，７７６号を参照されたい。これらの光反応性アプタマーは、フォトアプタマーとも称される。例えば、それぞれ「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ：Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ ａｎｄ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ＳＥＬＥＸ」という表題の米国特許第５，７６３，１７７号、米国特許第６，００１，５７７号、及び米国特許第６，２９１，１８４号を参照されたい。また、例えば「Ｐｈｏｔｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」という表題の米国特許第６，４５８，５３９号も参照されたい。マイクロアレイをサンプルと接触させて、フォトアプタマーが標的分子に結合する機会を与えた後、フォトアプタマーを光活性化し、固体支持体を洗浄して、全ての非特異的に結合した分子を除去する。フォトアプタマー上で光活性化した官能基（複数可）により形成された共有結合のためにフォトアプタマーに結合する標的分子は通常除去されないため、厳しい洗浄条件を使用することができる。このようにして、このアッセイは、試験サンプル中のバイオマーカーに対応するバイオマーカーレベルの検出を可能にする。
いくつかのアッセイ様式において、アプタマーは、サンプルと接触させる前に固体支持体に固定される。しかしながら所定の環境下では、サンプルと接触させる前にアプタマーを固定すると、最適なアッセイを提供できない可能性がある。例えば、アプタマーを前もって固定することは、固体支持体の表面上で非効率的なアプタマーと標的分子との混合が起こり、反応時間が長期化する可能性があり、したがって、インキュベート期間を延長すると、アプタマーとその標的分子との効率的な結合が可能になる。さらに、このようなアッセイにおいて、固体支持体として利用される材料に応じてフォトアプタマーが用いられる場合、固体支持体は、用いられる光を散乱させたりまたは吸収したりして、フォトアプタマーとその標的分子との間で共有結合を形成させる性質があるものでもよい。さらに用いられる方法に応じて、それらのアプタマーに結合した標的分子の検出は不正確になりやすいが、これは、固体支持体の表面も、用いられるあらゆる標識物質に晒されたりその影響を受けたりする可能性があるためである。最終的に、固体支持体上へのアプタマーの固定は、一般的に、アプタマーをサンプルに曝露する前のアプタマーの調製工程（すなわち、固定）を含み、この調製工程は、アプタマーの活性または官能性に影響を与える可能性がある。
溶液中でアプタマーにその標的を捕獲させて、その後、検出前にアプタマー−標的混合物の特定の構成要素を除去するように設計された分離工程を用いるアプタマーアッセイ法も説明されている（「Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ Ｔｅｓｔ Ｓａｍｐｌｅｓ」という表題の米国特許出願公開公報第２００９００４２２０６号を参照）。説明されているアプタマーアッセイ法は、核酸（すなわち、アプタマー）を検出して定量することによって、試験サンプル中の非核酸標的（例えば、タンパク質標的）の検出及び定量化を可能にする。説明されている方法では、非核酸標的を検出して定量するための核酸サロゲート（すなわち、アプタマー）が作製されることから、増幅などの多種多様の核酸技術をタンパク質標的などのより広範囲の望ましい標的に応用することが可能になる。
アプタマーバイオマーカー複合体（またはフォトアプタマーバイオマーカーの共有結合複合体）からのアッセイの構成要素の分離が容易であり、検出及び／または定量化のためにアプタマーの単離が可能なアプタマーを構築することもできる。一実施形態において、これらの構築物は、アプタマー配列内に切断可能なまたは取り外し可能な要素を含んでいてもよい。他の実施形態において、アプタマーに追加の官能性を導入してもよく、例えば、標識されたまたは検出可能な構成要素、スペーサー構成要素、または特異的な結合タグもしくは固定要素を導入してもよい。例えば、アプタマーは、切断可能な部分を介してアプタマーに連結されたタグ、標識、標識を分離するスペーサー構成要素及び切断可能な部分を含んでいてもよい。一実施形態において、切断可能な要素は、光切分解性リンカーである。光切分解性リンカーをビオチン部分とスペーサーのセクションとに結合させて、アミンの誘導体化のためのＮＨＳ基を入れることにより、ビオチン基をアプタマーに導入して、アッセイ方法の後半でアプタマーを放出させるのに用いることができる。
ホモジニアスアッセイは、溶液中で全てのアッセイの構成要素を用いてなされ、シグナルの検出前にサンプルと試薬との分離を必要としない。この方法は迅速であり、取り扱いが簡単である。この方法では、その特異的な標的と反応する分子の捕獲または結合試薬に基づいてシグナルが生成される。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態において、分子の捕獲試薬は、アプタマーもしくは抗体などを含み、特異的な標的は、表３に示されるバイオマーカーであってもよい。
いくつかの実施形態において、シグナル生成方法は、フルオロフォアで標識された捕獲試薬とその特異的なバイオマーカー標的との相互作用に起因する異方性シグナルの変化を利用するものである。標識された捕獲試薬がその標的と反応すると、分子量の増加により複合体に結合したフルオロフォアの回転運動が起こり、異方性値の変化がかなり遅くなる。異方性変化を監視することによって、溶液中のバイオマーカーを結合事象を用いて定量的に測定することができる。他の方法としては、蛍光偏光アッセイ、分子ビーコン法、時間分解蛍光消光、化学発光、蛍光共鳴エネルギー転移などが挙げられる。
生体サンプル中のバイオマーカー値を検出するのに用いることができる例示的な溶液ベースのアプタマーアッセイは、以下の：（ａ）生体サンプルと、第一のタグを含み、バイオマーカーに対して特異的な親和性を有するアプタマーとを接触させることにより混合物を調製すること（ここで、バイオマーカーがサンプル中に存在する場合、アプタマーの親和性複合体が形成される）；（ｂ）混合物を第１の捕獲要素を含む第１の固体支持体に晒して、第１一のタグを第一の捕獲要素に連結させること；（ｃ）第１の固体支持体と連結しない混合物のあらゆる構成要素を除去すること；（ｄ）第２のタグをアプタマー親和性複合体のバイオマーカー構成要素に結合させること；（ｅ）第１の固体支持体からアプタマー親和性複合体を放出させること；（ｆ）放出されたアプタマー親和性複合体を第２の捕獲要素を含む第２の固体支持体に晒して、第２のタグを第２の捕獲要素に連結させること；（ｇ）錯体化していないアプタマーをアプタマー親和性複合体から分けることにより、混合物からあらゆる錯体化していないアプタマーを除去すること；（ｈ）固体支持体からアプタマーを溶出させること、及び（ｉ）アプタマーを親和性複合体のアプタマー構成要素を検出することによりバイオマーカーを検出すること、を含む。
アプタマー親和性複合体のアプタマー構成要素を検出することによってバイオマーカー値を検出するために、当該技術分野において既知のあらゆる手段を用いることができる。多種多様の検出方法を用いて、例えばハイブリダイゼーションアッセイ、質量分析、またはＱＰＣＲなど、親和性複合体のアプタマー構成要素を検出することができるいくつかの実施形態において、核酸の配列決定法を用いてアプタマー親和性複合体のアプタマー構成要素を検出して、それによりバイオマーカー値を検出することができる。簡単に言えば、試験サンプルをあらゆる種類の核酸配列決定法で処理して、試験サンプル中に存在する１種以上のアプタマーの配列または配列（複数）を同定して定量することができる。いくつかの実施形態において、このような配列は、分子を特徴的に同定するのに利用できるアプタマー分子の全体または分子のいずれかの部分を含む。他の実施形態において、特定する配列は、アプタマーに付加された特異的な配列である；このような配列は、「タグ」、「バーコード」または「ジップコード」と称されることが多い。いくつかの実施形態において、配列決定法は、酵素を用いた工程を含み、このような工程は、アプタマー配列を増幅したり、あるいはいずれかの位置に化学修飾を含むＲＮＡ及びＤＮＡなどのあらゆる種類の核酸を配列決定に適したその他のあらゆる種類の核酸に変換したりするために行われる。
いくつかの実施形態において、配列決定法は、１つ以上のクローニング工程を含む。他の実施形態において、配列決定法は、クローニングを用いない直接配列決定法を含む。
いくつかの実施形態において、配列決定法は、試験サンプル中の１種以上のアプタマーを標的とする特異的プライマーを用いる定方向性アプローチを含む。他の実施形態において、配列決定法は、試験サンプル中の全てのアプタマーを標的とするショットガンアプローチを含む。
いくつかの実施形態において、配列決定法は、配列決定を目的とした分子を増幅する酵素を用いた工程を含む。他の実施形態において、配列決定法は、単一の分子を直接配列決定する。生体サンプル中のバイオマーカーに対応するバイオマーカー値を検出するのに用いることができる例示的な核酸配列決定ベースの方法は、以下の：（ａ）酵素を用いた工程で化学修飾されたヌクレオチドを含むアプタマーの混合物を、未修飾の核酸に変換すること；（ｂ）例えば、４５４シーケンシングシステム（４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｒｏｃｈｅ）、イルミナシーケンシングシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、ＡＢＩ ＳＯＬｉＤシーケンシングシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ヘリフコープ（ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ）シングルモレキュラーシーケンサー（Ｈｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはパシフィック・バイオサイエンシズ・リアルタイムシングルモレキュラーシーケンシングシステム（Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）もしくはポロネーターＧ（Ｐｏｌｏｎａｔｏｒ Ｇ）シーケンシングシステムズ（Ｄｏｖｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）などの大規模並列配列決定プラットフォームを用いて得られた未修飾の核酸をショットガン配列決定すること；及び（ｃ）特異的な配列と配列数とにより混合物中に存在するアプタマーを同定して定量すること、を含む。
アプタマーを用いて、生体サンプル中のバイオマーカーを検出する非限定的な例示の方法は、実施例１に記載される。さらにＫｒａｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１１、ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ６（１０）：ｅ２６３３２を参照されたい。
イムノアッセイを用いるバイオマーカーレベルの決定
イムノアッセイ法は、抗体のその対応する標的または分析物に対する反応に基づいており、特異的アッセイ様式に応じて、サンプル中の分析物を検出することができる。免疫反応性に基づくアッセイ方法の特異度及び感度を改善するために、モノクローナル抗体及びそのフラグメントが、それらの特異的エピトープ認識により、頻繁に用いられる。ポリクローナル抗体も様々なイムノアッセイで成功裏に用いられており、これは、ポリクローナル抗体は、モノクローナル抗体と比較して標的に対する親和性が高いことによる。イムノアッセイは、広範な生体サンプルマトリックスと共に使用するように設計されている。イムノアッセイの様式は、定性的、半定量的、及び定量的な結果が得られるように設計されている。
定量的な結果は、検出される特異的分析物の既知の濃度で作製された標準曲線を使用して得られる。未知のサンプルからの応答またはシグナルを標準曲線にプロットすることにより、未知のサンプル中の標的に対応する量またはレベルが確立される。
多数のイムノアッセイの様式が設計されている。ＥＬＩＳＡまたはＥＩＡは、分析物の検出に関して定量的であり得る。この方法は、分析物または抗体のいずれかへの標識の結合に基づく方法であり、標識の構成要素は、直接的または間接的のいずれかで酵素を含む。ＥＬＩＳＡ試験は、分析物の直接的、間接的、競合的、またはサンドイッチ検出に適するようにフォーマットすることができる。他の方法は、例えば、放射性同位体（Ｉ１２５）または蛍光などの標識に基づく方法である。追加の技術としては、例えば、凝集、ネフェロメトリー、比濁法、ウェスタンブロット、免疫沈降、免疫細胞化学、免疫組織化学、フローサイトメトリー、ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）アッセイなどが挙げられる（ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ、Ｂｒｉａｎ Ｌａｗ編、Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｌｔｄ．出版、２００５年版を参照）。
例示的なアッセイ様式としては、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ、蛍光、化学発光、及び蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）または時間分解ＦＲＥＴ（ＴＲ−ＦＲＥＴ）イムノアッセイが挙げられる。バイオマーカーを検出する手法の例としては、バイオマーカー免疫沈降、それに続いてサイズ及びペプチドレベルの識別を可能にする定量方法、例えばゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動、平面エレクトロクロマトグラフィーなどが挙げられる。
検出可能な標識またはシグナルを生成する材料を検出及び／または定量する方法は、標識の性質に依存する。適切な酵素によって触媒された反応の生成物（この場合、検出可能な標識は酵素である；上記参照）は、これらに限定されないが、蛍光、発光、または放射性を示してもよく、あるいはこれらは、可視光または紫外光を吸収するものでもよい。このような検出可能な標識の検出に適した検出器の例としては、これらに限定されないが、Ｘ線フィルム、放射活性カウンター、シンチレーションカウンター、分光光度計、測色計、蛍光測定器、ルミノメーター、及び濃度計が挙げられる。
検出方法はいずれも、あらゆる適切な調製、加工処理、及び反応の分析を可能にするあらゆる様式で行うことができる。このような検出方法は、例えば、マルチウェルアッセイプレート（例えば、９６ウェルまたは３８６ウェル）で、またはあらゆる適切なアレイまたはマイクロアレイを用いて行うことができる。様々な薬剤のストック溶液を手動またはロボットで製造することができ、それに続くピペッティング、希釈、混合、分配、洗浄、インキュベーション、サンプル読み出し、データ回収、及び分析はいずれも、検出可能な標識を検出することができる市販の解析ソフトウェア、ロボット工学、及び検出機器を用いてロボット利用によりなされてもよい。
遺伝子発現プロファイリングを用いるバイオマーカーレベルの決定
生体サンプル中のｍＲＮＡ測定は、いくつかの実施形態においては、生体サンプル中の対応するタンパク質のレベルを検出するためのサロゲートとして利用することができる。したがって、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるバイオマーカーまたはバイオマーカーパネルは、適切なＲＮＡを検出することによって検出が可能である。
いくつかの実施形態において、ｍＲＮＡ発現レベルは、逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ、続いてｑＰＣＲ）によって測定される。ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製する。このｃＤＮＡは、ｑＰＣＲアッセイで用いることにより、ＤＮＡ増幅プロセスが進行するにつれて蛍光を発生させることができる。ｑＰＣＲでは、標準曲線と比較することによって、細胞あたりのｍＲＮＡのコピー数などの絶対測定値を得ることができる。ノーザンブロット、マイクロアレイ、インベーダーアッセイ、及びＲＴ−ＰＣＲと、キャピラリー電気泳動との併用はいずれも、サンプル中のｍＲＮＡ発現レベルを測定するのに使用されてきた。Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｒｉｃｈａｒｄ Ａ．Ｓｈｉｍｋｅｔｓ，ｅｄｉｔｏｒ、Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ、２００４を参照されたい。
インビボ分子イメージング技術を用いるバイオマーカーの検出
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるバイオマーカーは、分子イメージング試験で用いることができる。例えば、造影剤を、捕獲試薬にカップリングしてもよく、これを用いてインビボでバイオマーカーを検出することができる。
インビボでのイメージング技術は、個体の体内の特定の疾患の状態を決定するための非侵襲的方法を提供する。例えば、体の全体、または全身をも三次元画像として調査することができ、これによって、体内の形態及び構造に関する有用な情報を提供することができる。このような技術は、本明細書に記載されるバイオマーカーの検出と組み合わせて、インビボでのバイオマーカーに関する情報を提供することができる。
インビボでの分子イメージング技術は、様々な技術進歩のために発展しつつある。これらの進歩としては、体内で強いシグナルを発生させることができる放射標識及び／または蛍光標識などの新しいコントラスト剤または標識の開発；及び体の外部からこれらのシグナルを十分な感度ならびに精度で検出して分析し、有用な情報を提供することができる強力で新しいイメージング技術の開発がある。コントラスト剤は、適切なイメージングシステムで可視化することができ、それによって体のコントラスト剤が存在する部分または部分（複数）の画像を得ることができる。コントラスト剤は、例えばアプタマーまたは抗体などの捕獲試薬、及び／またはペプチドもしくはタンパク質、またはオリゴヌクレオチド（例えば、遺伝子発現を検出するため）、またはこれらのいずれかと１種以上の巨大分子及び／または他の粒子型とを含む複合体と結合または連結していてもよい。
またコントラスト剤は、イメージングにおいて有用な放射性原子を特徴とするものであってもよい。適切な放射性原子としては、シンチグラフ検査のためのテクネチウム−９９ｍまたはヨウ素−１２３が挙げられる。他の容易に検出可能な部分としては、例えば、磁気共鳴像（ＭＲＩ）用のスピン標識であり、例として、ここでもヨウ素−１２３が挙げられ、加えてヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガンまたは鉄が挙げられる。このような標識は、当該技術分野において周知であり、当業者であれば容易に選択することができる。
標準的なイメージング技術としては、磁気共鳴撮像、コンピュータ断層撮影スキャン、陽電子射出断層撮影法（ＰＥＴ）、単光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）などが挙げられるが、これらに限定されない。インビボでの診断イメージングのためには、所定のコントラスト剤、例えば所定の放射性核種とそれを用いて標的化する具体的なバイオマーカー（タンパク質、ｍＲＮＡなど）とを選択することにおいて、利用可能な検出機器のタイプが重要な要因である。通常選択される放射性核種は、所定のタイプの機器で検出可能なある種の減衰を示す。またインビボでの診断のために放射性核種を選択する場合、その半減期は、標的組織によって最大限に取り込まれた時間において検出可能に十分な程に長く、宿主への有害な放射線が最小化されるのに十分な程に短いものであるべきである。
例示的なイメージング技術としては、ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴが挙げられるが、これらに限定されず、ＰＥＴ及びＳＰＥＣＴは、個体に放射性核種が合成的または局所的に照射されるイメージング技術である。その後の放射性トレーサの取り込みが経時的に測定され、標的化された組織及びバイオマーカーに関する情報を得るのに用いられる。用いられる特定の同位体からの高エネルギー（ガンマ線）放射と、それを検出するために用いられる機器の感度及び精巧さのために、体の外部から放射活性の二次元分布を推定することができる。
ＰＥＴ下で一般的に使用される陽電子放出核種としては、例えば、炭素―１１、窒素−１３、酸素−１５、及びフッ素−１８が挙げられる。ＳＰＥＣＴでは、電子捕獲及び／またはガンマ放射によって減衰する同位体が用いられ、例えば、ヨウ素−１２３及びテクネチウム−９９ｍが挙げられる。アミノ酸をテクネチウム−９９ｍで標識するための例示的な方法は、キレート前駆体の存在下で過テクネチウム酸イオンを還元し、不安定なテクネチウム−９９ｍ前駆体複合体を形成し、続いて、これを二官能性修飾下走化性ペプチドの金属結合基と反応させて、テクネチウム−９９ｍ−走化性ペプチド結合体を形成する。
このようなインビボでのイメージング診断方法において、抗体が頻繁に用いられる。インビボでの診断用の抗体の調製及び使用は当該技術分野において周知である。同様に、アプタマーは、このようなインビボイメージング診断法に使用されてもよい。例えば、本明細書に記載される特定のバイオマーカーを同定するために使用されたアプタマーは、適切に標識され、個体に注射され、インビボでバイオマーカーを検出することができる。用いられる標識は、これまでに述べられたような使用されるイメージング様式に従って選択されることになる。アプタマー指向性造影剤は、他の造影剤と比べて、組織透過性、組織分布、速度論、除去、効力、及び選択性に関して、特有かつ有利な特性を有する可能性がある。
このような技術はまた、任意選択で、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いるイメージングにより遺伝子発現を検出するために、例えば、標識されたオリゴヌクレオチドを用いて行うこともできる。これらの方法は、例えば標識として蛍光分子または放射性核種を用いるインサイチュハイブリダイゼーションで用いられる。遺伝子発現の検出のための他の方法としては、例えば、レポーター遺伝子活性の検出が挙げられる。
別の一般的なタイプのイメージング技術は、光学イメージングであり、この場合、被験者体内の蛍光シグナルは、被験者の外部にある光学装置によって検出される。これらのシグナルは、実際の蛍光及び／または生物発光に起因し得る。光学検出装置の感度が改善されたことにより、インビボでの診断アッセイのための光学イメージングの有用性は高まってきた。
他の技術の総論については、Ｎ．Ｂｌｏｗ、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ、６、４６５−４６９、２００９を参照されたい。
質量分析法を用いるバイオマーカーレベルの決定
バイオマーカー値を検出するために、様々な構造のマススペクトロメーターを用いることができる。数々のタイプのマススペクトロメーターが利用可能であり、あるいは様々な構造を有するものを作製してもよい。一般的に、マススペクトロメーターは、以下の主な構成要素：サンプル注入口、イオン源、質量分析器、検出器、真空システム、及び機器制御システム、及びデータシステムを有する。一般的に、サンプル注入口、イオン源、及び質量分析器の違いにより、機器のタイプ及びその性能が規定される。例えば、注入口は、キャピラリー−カラム液体クロマトグラフィー源であってもよいし、あるいは、マトリックス支援レーザー脱離で用いられるような直接プローブまたはステージであってもよい。一般的なイオン源は、例えば、ナノスプレー及びマイクロスプレーなどのエレクトロスプレー、またはマトリックス支援レーザー脱離である。一般的な質量分析器としては、四重極質量フィルター、イオントラップ質量分析器、及び飛行時間型質量分析器が挙げられる。さらなる質量分析法は当該技術分野において周知である（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ ｅｔ ａｌ．、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７０：６４７Ｒ〜７１６Ｒ（１９９８）；Ｋｉｎｔｅｒ ａｎｄ Ｓｈｅｒｍａｎ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２０００）を参照）。
タンパク質バイオマーカー及びバイオマーカーレベルは、以下のうちいずれか：エレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）、ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／（ＭＳ）ｎ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、表面増強レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、シリコン上での脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）、二次イオン質量分析法（ＳＩＭＳ）、四重極飛行時間型（Ｑ−ＴＯＦ）、ウルトラフレックスＩＩＩ ＴＯＦ／ＴＯＦと呼ばれるタンデム飛行時間型（ＴＯＦ／ＴＯＦ）技術、大気圧化学イオン化質量分析法（ＡＰＣＩ−ＭＳ）、ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ−（ＭＳ）Ｎ、大気圧光イオン化質量分析法（ＡＰＰＩ−ＭＳ）、ＡＰＰＩ−ＭＳ／ＭＳ、及びＡＰＰＩ−（ＭＳ）Ｎ、四重極質量分析法、フーリエ変換質量分析法（ＦＴＭＳ）、定量的質量分析法、ならびにイオントラップ質量分析法によって検出及び測定することができる。
質量分析法によるタンパク質バイオマーカーの特徴付け及びバイオマーカーレベルの決定の前に、戦略的なサンプル調製を用いてサンプルを標識して濃縮する。標識付けの方法としては、相対的及び絶対的定量用アイソバリックタグ（ｉｓｏｂａｒｉｃ ｔａｇ）（ｉＴＲＡＱ）、ならびに細胞培養にアミノ酸を用いる安定同位体標識法（ＳＩＬＡＣ）が挙げられるが、これらに限定されない。質量分光分析の前に選択的にサンプル中の候補バイオマーカータンパク質を濃縮するのに用いられる捕獲試薬としては、アプタマー、抗体、核酸プローブ、キメラ、低分子物質、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖抗体フラグメント、Ｆｖフラグメント、単鎖Ｆｖフラグメント、核酸、レクチン、リガンド結合受容体、アフィボディ、ナノボディ、アンキリン、ドメイン抗体、代替抗体の足場（例えば、二重特異性抗体など）、インプリントポリマー、アビマー、ペプチド模倣体、ペプトイド、ペプチド核酸、トレオース核酸、ホルモン受容体、サイトカイン受容体、及び合成受容体、ならびにこれらの改変体及びフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
近位ライゲーションアッセイを用いるバイオマーカーレベルの決定
バイオマーカー値を決定するのに近接ライゲーションアッセイを用いることができる。簡単に言うと、試験サンプルを、対のそれぞれの成員をオリゴヌクレオチドで拡張した一対の親和性プローブ（一対の抗体または一対のアプタマーであり得る）と接触させる。その一対の親和性プローブの標的は、１種のタンパク質に対する２種の別個の決定因子であってもよいし、あるいは２種の異なるタンパク質それぞれに対する１種の決定因子であってもよく、これらは、ホモまたはヘテロ多量体の複合体として存在していてもよい。プローブが標的の決定因子に結合すると、拡張されたオリゴヌクレオチドの遊離の端部が十分に近接し、共にハイブリダイズすることができる。拡張されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、拡張されたオリゴヌクレオチドがそれぞれ十分に近接して存在する場合に、それらを共に架橋するのに役立つ一般的なコネクターオリゴヌクレオチドによって促進される。プローブの拡張されたオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしたら、拡張部分の端部が、酵素によるＤＮＡライゲーションによって共に連結される。
拡張されたオリゴヌクレオチドはそれぞれ、ＰＣＲ増幅用のプライマー部位を含む。拡張されたオリゴヌクレオチドが共にライゲーションしたら、オリゴヌクレオチドは連続するＤＮＡ配列を形成するが、この配列から、標的タンパク質の同一性及び量に関する情報、ならびに標的の決定因子が２種の異なるタンパク質に対するものである場合、タンパク質−タンパク質相互作用に関する情報がＰＣＲ増幅により明らかになる。近接ライゲーションは、リアルタイムＰＣＲの使用によりリアルタイムのタンパク質濃度及び相互作用情報に関する高感度かつ特異的な分析を得ることができる。対象の決定因子と結合しないプローブは、それに対応する拡張されたオリゴヌクレオチドを近接させることはなく、したがってライゲーションまたはＰＣＲ増幅が進行せず、結果としてシグナルは生じない。
前述のアッセイは、ＣＶイベントのリスクを予測する方法において有用なバイオマーカー値の検出を可能にし、このような方法は、個体からの生体サンプルにおいて、ＭＭＰ１２、アンジオポイエチン−２、補体Ｃ７、心臓トロポニンＩ、アンジオポイエチン関連タンパク質４、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ、アルファ−１−抗キモトリプシン複合体、ＧＤＦ１１、及びアルファ−２−抗プラスミンから選択される少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、または全９種のレベルを検出することを含み、ここで、以下で説明されるように、バイオマーカー値を用いた分類は、個体が、１年、２年、３年、または４年の期間中に発生するＣＶイベントの高リスクを有するかどうかを示す。本明細書に記載される方法のいずれかによれば、バイオマーカー値は、個々に検出及び分類してもよいし、あるいは、例えばマルチプレックスアッセイ様式で行われるようにまとめて検出して分類してもよい。
バイオマーカーの分類及び疾患スコアの計算
いくつかの実施形態において、所定の診断試験に関するバイオマーカーの「署名（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）」は、バイオマーカーのセットを含み、各バイオマーカーは、対象の集団中で特徴的なレベルを有する。特徴的なレベルとは、いくつかの実施形態において、特定の群内の個体に関するバイオマーカーの平均または平均値を指してもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される診断方法を用いて、個体からの未知のサンプルを、２つのグループのうちの一方、すなわち、高いＣＶイベントリスクを有するグループかまたはそうではないグループのうちの一方に割り当てることができる。
サンプルを２つ以上のグループのうちの１つに割り当てることは、分類として知られ、この割り当てを達成するための手法は分類器または分類方法として知られる。分類方法は、スコア付け法と称されてもよい。バイオマーカーレベルのセットから診断分類器を構築するのに用いることができる多くの分類方法がある。いくつかの例では、分類方法は、教師あり学習技術を用いて行われ、この場合、区別しようとする２つ（または複合分類状態の場合はそれより多く）の別個のグループの個体から得られたサンプルを用いてデータセットが回収される。各サンプルが属するクラス（グループまたは集団）が、それぞれ予めサンプルごとにわかっているために、分類方法を訓練して、望ましい分類応答を得ることができる。教師なし学習技術を使用して、診断分類器を作製することも可能である。
診断分類器を開発するための一般的なアプローチは、決定木；バギング＋ブースティング＋フォレスト；推論ルールに基づく学習；パルザン（Ｐａｒｚｅｎ）窓；線形モデル；記号論理学；ニューラルネットワーク法；教師なしクラスタリング；Ｋ平均法；階層上昇／下降（ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ａｓｃｅｎｄｉｎｇ／ｄｅｓｃｅｎｄｉｎｇ）；半教師あり学習；プロトタイプ法；最近傍法；カーネル密度推定；サポーティブベクターマシーン；隠れマルコフ（Ｍａｒｋｏｖ）モデル；ボルツマン（Ｂｏｌｔｚｍａｎｎ）学習を含み、さらに分類器は、単純に組み合わせてもよいし、あるいは特定の目的関数を最小化する方法で組み合わせてもよい。総論に関して、例えば、Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｒ．Ｏ．Ｄｕｄａ，ｅｔ ａｌ．、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、２００１を参照されたい。また、Ｔｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ−Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ， Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ，ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ、Ｔ．Ｈａｓｔｉｅ，ｅｔ ａｌ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ，ＬＬＣ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、２００９も参照されたい。
教師あり学習技術を用いて分類器を作製するために、訓練データと呼ばれるサンプルのセットを入手する。診断テストの文脈において、訓練データは、後に未知サンプルが割り当てられる別個のグループ（クラス）からのサンプルを含む。例えば、対照集団の個体から回収されたサンプルと、特定の疾患を有する集団の個体から回収されたサンプルとは、未知サンプル（また、より具体的にはサンプルを得た個体）を、疾患を有するか、または疾患がないかのいずれかに分類することができる分類器を開発するための訓練データを構成することができる。訓練データからの分類器の開発は、分類器の訓練として知られている。分類器の訓練に関する具体的な詳細は、教師あり学習技術の性質に依存する。単純ベイズ分類器は、このような教師あり学習技術の一例である（例えば、Ｐａｔｔｅｒｎ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｒ．Ｏ．Ｄｕｄａ，ｅｔ ａｌ．、ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、２００１を参照；またＴｈｅ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ−Ｄａｔａ Ｍｉｎｉｎｇ，Ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ，ａｎｄ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ、Ｔ．Ｈａｓｔｉｅ，ｅｔ ａｌ．、ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ＋Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｍｅｄｉａ， ＬＬＣ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、２００９も参照）。単純ベイズ分類器の訓練は、例えば、米国特許公開第２０１２／０１０１００２号及び同第２０１２／００７７６９５号に記載されている。
典型的には、訓練セットのサンプルよりも見込みのある多くのバイオマーカーレベルがあるため、過剰適合を回避するように配慮する必要がある。過剰適合は、統計モデルが、基本の関係の代わりにランダムエラーまたはノイズを表す場合に起こる。過剰適合は、様々な方法で回避することができ、このような方法としては、例えば、分類器開発に用いられるバイオマーカーの数を制限すること、バイオマーカーの応答が互いに独立していると仮定すること、用いられる基本の統計モデルの複雑さを制限すること、及び基本の統計モデルが確実にデータに一致するようにすることが挙げられる。
バイオマーカーのセットを用いる診断試験の開発の具体的な例としては、単純ベイズ分類器の適用、すなわち、バイオマーカーの厳密な独立した処理を用いるベイズの定理に基づく単純な確率的分類器の適用が挙げられる。各バイオマーカーは、各クラスにおける測定されたＲＦＵ値または対数ＲＦＵ（相対蛍光単位）値に関するクラス依存性確率密度関数（ｐｄｆ）によって説明される。１つのクラスにおけるバイオマーカーのセットに関する結合ｐｄｆは、各バイオマーカーに関する個々のクラス依存性ｐｄｆの積であると推定される。この文脈における単純ベイズ分類器を訓練することは、クラス依存性ｐｄｆを特性化するために、パラメータを割り当てること（パラメータ化）に等しい。クラス依存性ｐｄｆのためにあらゆる基本のモデルが使用されてもよいが、このモデルは、一般的に、訓練セットで観測されたデータと一致するはずである。
単純ベイズ分類器の性能は、分類器を構築し訓練するために用いられたバイオマーカーの数及び品質に依存する。単一のバイオマーカーは、ＫＳ−距離（コルモボロフ−スミルノフ（Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ）に従って働くであろう。良好なＫＳ距離（例えば、＞０．３）を有する後続のバイオマーカーの付加は、引き続いて付加されたバイオマーカーが第１のバイオマーカーから独立している場合、一般に、分類性能を向上させると思われる。分類器スコアとして感度に加えて特異度を用いることは、多くの高いスコア付け分類器を、グリーディアルゴリズムの変動によって作製することができる。（グリーディアルゴリズムは、大域的最適解という目的で各段階において局所的に最適な選択を行う問題解決達成につながるメタヒューリスティック手法に従うあらゆるアルゴリズムである）。
分類器性能を描写するための別の方法は、受信者動作特性（ＲＯＣ）、または単純にＲＯＣ曲線もしくはＲＯＣプロットによるものである。ＲＯＣは、２値分類器系の識別閾値が変化すると、その２値分類器系に関する、感度、または真陽性率の偽陽性率に対する（１−特異度または１−真陽性率）のグラフィカルプロットである。このＲＯＣはまた、陽性のうちの真陽性のフラクション（ＴＰＲ＝真陽性率）を、陰性のうちの偽陽性のフラクション（ＦＰＲ＝偽陽性率）に対してプロットすることによって同等に表すことができる。これは、基準の変化としての２つの動作特性（ＴＰＲ ＆ ＦＰＲ）の比較であるために、相対的動作特性曲線としても知られている。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、診断精度の集約尺度として一般的に使用されている。これは、０．０〜１．０の値を取り得る。ＡＵＣは、重要な統計的性質：すなわち、分類器のＡＵＣが、分類器が無作為に選択された正事例を無作為に選択された負事例よりも上にランク付けする確率に等しいと性質を有する（Ｆａｗｃｅｔｔ Ｔ、２００６．Ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ ＲＯＣ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐａｔｔｅｒｎ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ．２７：８６１−８７４）。ウィルコクソン順位検定（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ ｔｅｓｔ ｏｆ ｒａｎｋｓ）に相当する（Ｈａｎｌｅｙ，Ｊ．Ａ．、ＭｃＮｅｉｌ，Ｂ．Ｊ、１９８２．Ｔｈｅ ｍｅａｎｉｎｇ ａｎｄ ｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｒｅａ ｕｎｄｅｒ ａ ｒｅｃｅｉｖｅｒ ｏｐｅｒａｔｉｎｇ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ） ｃｕｒｖｅ．Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ １４３、２９−３６）。診断検査の性能を既知の参照基準と関連付けて説明するための別の方法は、純再分類（ｎｅｔ ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）であり、これは、新しい検査の能力を、参照基準検査と比較する場合に、リスクを正確にアップグレードまたはダウングレードするためのものである。例えば、Ｐｅｎｃｉｎａ ｅｔ ａｌ．、２０１１、Ｓｔａｔ．Ｍｅｄ．３０：１１−２１を参照されたい。ＲＯＣ曲線下のＡＵＣが、２クラスの分類器の性能を評価するために最適であっても、別化また個別化医療は、集団が２よりも多くのクラスを含むという推論に依存する。このような比較については、上位四分位数対下位四分位数のハザード比（または、十分位数などの他の階層化）をより適切に使用することができる。
本発明によって可能になるリスク予測は、初期治療にある、または専門心血管センターにおける個体に適用されてもよく、あるいは消費者にも向けられてもよい。いくつかの実施形態において、イベントを予測するために用いられる分類器は、これらが適用される集団に対するある程度の校正を伴う場合があり、例えば、民族性または地域性に起因する変動の可能性が考えられるからである。このような校正は、いくつかの実施形態においては、大集団での試験に先立って確立されてもよく、したがって、個々の患者に適用される場合、これらは、リスク予測を行う前に組み込まれる。静脈血が採取され、適切に処理され、本明細書に記載される通りに分析される。分析が完了すると、リスク予測は、遺伝学的または人工統計学的記録などの本明細書に記載される医療記録からの他のメタデータを組み込み、または組み込まずに、数学的に行われてもよい。消費者の専門知識のレベルに応じて、情報の出力の様々な形式が可能である。最も簡単なタイプの出力を求める消費者に対しては、いくつかの実施形態において、情報は、「この人は、以後ｘ年（このｘは、１〜４である）にイベントを有する可能性があるか、はい／いいえ」であってもよく、または「信号機」に似た赤／オレンジ／緑であってもよく、あるいは高／中／低リスクなど、それと同意義のことを言葉で表すか書き込まれてもよい。より詳細を求める消費者に対しては、いくつかの実施形態において、リスクは、単位時間当たりのイベントの確率を示す数または図形を、連続スコアとして、またはより大きな数の階層（十分位数など）として、及び／もしくはイベント及び／または最も可能性の高いイベントに至るまでの平均時間として、出力してもよい。いくつかの実施形態において、出力は、治療勧告を含んでもよい。同じ患者の経時的な縦軸モニタリングは、介入に対する応答または生活様式の変化をグラフに示すことを可能にするであろう。いくつかの実施形態において、患者のニーズ及び異なるレベルの専門知識を有する医療管理チームの個々のメンバーのニーズを満たすために、複数のタイプの出力が、同時に提供されてもよい。
いくつかの実施形態において、表３に示される９種のバイオマーカー（「ＣＶＤ９バイオマーカー」が、例えば、遅い解離速度のアプタマーなどのアプタマーを用いて、被験者からの血液サンプル中（血漿サンプルまたは血清サンプル）で検出される。対数ＲＦＵ値を用いて、予後予測指数（ＰＩ）を計算する。非限定的な例示のＰＩ式を以下に示す。
式中、タンパク質レベルは、常用対数ＲＦＵで取られている。当業者であれば、ＰＩ式が、被験者が採取された集団に従って再校正されてもよいことを理解されるであろう。このような再校正は、本明細書に記載される方法及び／または当該技術分野において既知の方法に従って行うことができる。
ＰＩであるならば、被験者が以後「ｔ」年に心血管イベント（ＣＶイベント）を患うことになる確率は、下記の式で与えられる。
式中、ＰＩは、予後予測指数（または、線形予測子）であり、ｓは、極値分布についての関連するスケールパラメータである。様々な実施形態において、「ｔ」は、５年以下、４年以下、３年以下、または２年以下である。
キット
例えば、本明細書に開示された方法に実行で使用するために、適切なキットを用いて、本明細書に記載されるバイオマーカーのあらゆる組み合わせを検出することができる。さらに、いずれのキットも、本明細書に記載されているような１種以上の検出可能な標識、例えば、蛍光部分などを含むことができる。
いくつかの実施形態において、キットは、（ａ）生体サンプル中の１種以上のバイオマーカーを検出するための１種以上の捕獲試薬（例えば、ＭＭＰ１２、アンジオポイエチン−２、補体Ｃ７、心臓トロポニンＩ、アンジオポイエチン関連タンパク質４、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ、アルファ−１−抗キモトリプシン複合体、ＧＤＦ１１、及びアルファ−２−抗プラスミンから選択される、少なくとも１種のアプタマーまたは抗体）（ここで、バイオマーカーは、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、または全９種のバイオマーカーを含む）と、任意選択で（ｂ）本明細書でさらに説明されるように、生体サンプルを得た個体を、高いＣＶイベントリスクを有するかまたは有さないいずれかに分類するための、あるいは個体が高いＣＶイベントリスクを有する傾向性を決定するための、１つ以上のソフトウェアまたはコンピュータプログラム製品とを含む。あるいは、１つ以上のコンピュータプログラム製品よりはむしろ、上記の工程をヒトが手動で行うための１つ以上の説明書が提供されてもよい。
いくつかの実施形態において、キットは、固体支持体、捕獲試薬、及びシグナルを生成する材料を含む。キットはまた、装置と試薬の使用、サンプルの取り扱い、及びデータ解析についての説明書を含むことができる。さらに、キットは、生体サンプルの分析結果を解析して報告するためのコンピュータシステムまたはソフトウェアと共に用いてもよい。
キットはさらに、生体サンプルを処理するための１つ以上の試薬（例えば、可溶化緩衝液、洗浄剤、洗浄液、または緩衝液）を含むことができる。本明細書に記載されるキットのいずれも、例えば、緩衝液、ブロッキング剤、質量分析用マトリックス材料、抗体捕獲剤、陽性対照サンプル、陰性対照サンプル、プロトコル、指針、及び参照データなどのソフトウェアならびに情報を含んでもよい。
いくつかの実施形態において、キットは、ＣＶイベントリスクの状態を分析するために提供され、ここでは、キットは、本明細書に記載されるバイオマーカーに特異的な１種以上のアプタマー用のＰＣＲプライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットはさらに、使用に関する説明書と、ＣＶイベントのリスクの予測との相関に関する説明書とを含んでもよい。いくつかの実施形態では、キットはまた、本明細書に記載されるバイオマーカーに特異的なアプタマーのうちの１種以上の補体を含むＤＮＡアレイ、試薬、及び／またはサンプルＤＮＡを増幅または単離するための酵素を含んでもよい。いくつかの実施形態において、キットは、リアルタイムＰＣＲのための試薬、例えば、ＴａｑＭａｎプローブ及び／またはプライマー、及び酵素を含んでもよい。
例えば、キットは、（ａ）試験サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルを決定するための少なくとも１つの捕獲試薬を含む試薬と、任意選択で（ｂ）試験サンプル中で定量された各バイオマーカーの量を１つ以上の所定のカットオフと比較する工程を実行するための１以上のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムとを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、アルゴリズムまたはコンピュータプログラムは、該比較に基づいて定量された各バイオマーカーについてのスコアを割り当て、いくつかの実施形態においては、バイオマーカーごとの割り当てられたスコアを足し合わせて総スコアを得る。さらに、いくつかの実施形態において、アルゴリズムまたはコンピュータプログラムは、総スコアと所定のスコアとを比較し、この比較を用いて、個体が高いＣＶイベントリスクを有する可動化を決定する。あるいは、１つ以上のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムよりはむしろ、上記の工程をヒトが手動で行うための１つ以上の説明書が提供されてもよい。
コンピュータの方法及びソフトウェア
バイオマーカーまたはバイオマーカーパネルが選択されたら、個体を診断する方法は、以下：１）生体サンプルを得ること；２）分析方法を実行して、生体サンプルでパネル中のバイオマーカーまたはバイオマーカー（複数）を検出して測定すること；３）任意選択で、あらゆるデータの正規化または標準化を実行すること；４）各バイオマーカーレベルを決定すること；及び５）これらの結果を報告することを含むことができる。いくつかの実施形態において、これらの結果は、集団／被験者の民族性に対して校正される。いくつかの実施形態において、バイオマーカーレベルは、何らかの方法で組み合わされ、組み合わされたバイオマーカーレベルについての単一の値が報告される。このアプローチにおいて、いくつかの実施形態においては、スコアは、全てのバイオマーカーの計算の合計から決定される単一の数であってもよく、これを疾患の存在または非存在の指標である予め設定された閾値と比較する。あるいは診断または予測スコアは、それぞれバイオマーカー値を示す一連のバーであってもよく、応答パターンは、疾患、状態またはイベントの高い（または低い）リスクの存在または非存在の決定についてあらかじめ設定されたパターンと比較してもよい。
本明細書に記載される方法の少なくともいくつかの実施態様は、コンピュータの使用で実施することができる。図１２にコンピュータシステム１００の例を示す。図１２を参照すると、システム１００は、プロセッサ１０１、入力装置１０２、出力装置１０３、記憶装置１０４、コンピュータで読取り可能な記憶媒体リーダー１０５ａ、通信システム１０６、加速処理装置（例えばＤＳＰまたは特殊用途のプロセッサ）１０７、及びメモリ１０９を含む、バス１０８を介して電気的にカップリングされたハードウェア要素で構成されることが示される。コンピュータで読取り可能な記憶媒体リーダー１０５ａは、さらにコンピュータで読取り可能な記憶媒体１０５ｂにカップリングされ、この組み合わせは、包括的に、コンピュータで読取り可能な情報を一時的及び／またはそれよりも長期にわたり内包させるための、遠隔、局所、固定、及び／または取り外し可能な記憶装置と記憶媒体、メモリなどに相当し、この組み合わせは、記憶装置１０４、メモリ１０９、及び／またはこのようなその他のあらゆるアクセス可能なシステム１００リソースを含む。またシステム１００は、オペレーティングシステム１９２、及びその他のコード１９３、例えばプログラム、データなどを含むソフトウェア要素（現行では作業メモリ１９１内に配置されているものとして示される）も含む。
図１２を参照すると、システム１００は、広いフレキシビリティーとコンフィギュアビリティーを有する。したがって、例えば、単一のアーキテクチャーを利用して１つ以上のサーバーを実施してもよく、このようなサーバーはさらに、現在のところ望ましいプロトコール、プロトコール変更、拡張などに従ってさらに構成することもできる。しかしながら、当業者には明らかであると予想されるが、より特定のアプリケーション要求に従って実施形態を利用できるであろう。例えば、１つ以上のシステム要素が、システム１００の構成要素内の（例えば、通信システム１０６内の）下位要素として実施されてもよい。またカスタマイズされたハードウェアを利用することもでき、及び／またはハードウェア、ソフトウェアまたはその両方において特定の要素を実施してもよい。さらに、ネットワーク入力／出力装置（図示せず）などのその他の計算装置への接続が用いられる可能性があるが、その他の計算装置への有線、無線、モデム、及び／またはその他の接続もしくは接続（複数）が利用されていてもよいことが理解されよう。
一態様において、システムは、ＣＶイベントのリスクの予測に特徴的なバイオマーカーの特徴を含むデータベースを含むことができる。バイオマーカーデータ（またはバイオマーカー情報）は、コンピュータにより実施される方法の一部として使用するためのコンピュータへの入力として利用することができる。バイオマーカーデータは、本明細書に記載されるデータを含んでいてもよい。
一態様において、システムは、入力データを１つ以上のプロセッサに提供するための１つ以上の装置をさらに含む。
システムは、順位付けされたデータ要素のデータセットを保存するためのメモリを更に含む。
別の態様において、入力データを提供するための装置は、例えば、質量分析装置または遺伝子チップリーダーなどのデータ要素の特徴を検出するための検出器を含む。
システムは、加えて、データベース管理システムを含んでもよい。ユーザーの要求または質問は、質問を処理して訓練セットのデータベースからの関連情報を抽出するデータベース管理システムによって理解される適切な言語でフォーマットされてもよい。
システムは、ネットワークサーバーと１つ以上のクライエントとが接続されるネットワークに接続可能であってもよい。ネットワークは、当該技術分野において既知であるように、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）またはワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）であってもよい。好ましくは、サーバーは、コンピュータプログラム製品（例えば、ソフトウェア）を作動させてユーザーの要求を処理するためのデータベースのデータにアクセスするのに必要なハードウェアを含む。
システムは、データベース管理システムからの命令を実行するためのオペレーティングシステム（例えば、ＵＮＩＸ（登録商標）またはＬｉｎｕｘ（登録商標））を含んでいてもよい。一態様において、オペレーティングシステムは、インターネットなどのグローバルコミュニケーションネットワークで作動し、このようなネットワークに接続するのにグローバルコミュニケーションネットワークサーバーを利用することができる。
システムは、当該技術分野において既知であるグラフィカルユーザーインターフェースで慣例的に見出されるようなボタン、プルダウンメニュー、スクロールバー、テキスト入力用フィールドなどインターフェース要素を含むグラフィカルディスプレイインターフェースを含む１つ以上の装置を含んでいてもよい。ユーザーインターフェースで入力される要求は、１つ以上のシステムデータベースで関連情報が検索されるようにフォーマットするためのシステム中のアプリケーションプログラム伝送することができる。ユーザーによって入力された要求または質問は、あらゆる適切なデータベース言語で構築することができる。
グラフィカルユーザーインターフェースは、オペレーティングシステムの一部としてグラフィカルユーザーインターフェースコードによって作製してもよく、データを入力したり、及び／または入力されたデータを表示したりするのに用いることができる。処理されたデータの結果は、インターフェースで表示したり、システムと連通した印刷機で印刷したり、メモリデバイスに保存したり、及び／またはネットワークに伝送したりしてもよく、あるいはコンピュータで読取り可能な媒体の形態で提供してもよい。
システムは、システムにデータ要素に関するデータ（例えば、発現値）を提供するための入力装置と連通することができる。一態様において、この入力装置は、例えば、質量分析装置、遺伝子チップまたはアレイリーダーなどの遺伝子発現プロファイリングシステムを含むことができる。
様々な実施態様に従ってＣＶイベントリスク予測のバイオマーカー情報を解析するための方法及び装置は、あらゆる適切な方式で、例えば、コンピュータシステムで作動するコンピュータプログラムを用いて実施することができる。リモートアクセス可能なアプリケーションサーバー、ネットワークサーバー、パーソナルコンピュータまたはワークステーションなどのプロセッサ及びランダムアクセスメモリを含む従来のコンピュータシステムが用いられ得る。追加のコンピュータシステム要素は、例えば、大規模記憶システム及びユーザーインターフェース、例えば、従来型のモニター、キーボード、及びトラッキング装置のような、メモリデバイスまたは情報保存システムを含んでいてもよい。コンピュータシステムは、独立型のシステムであってもよいし、あるいはサーバーと１つ以上のデータベースとを含むコンピュータのネットワークの一部であってもよい。
ＣＶイベントリスク予測のバイオマーカー解析システムは、データ収集、処理、解析、報告、及び／または診断などのデータ解析を完了するための機能及び操作を提供することができる。例えば、一実施態様において、コンピュータシステムは、ＣＶイベントリスク予測のバイオマーカーに関する情報を受け取る、保存する、検索する、解析する、及び報告することができるコンピュータプログラムを実行することができる。コンピュータプログラムは、様々な機能または操作を実行する複数のモジュールを含んでもよく、例えば生データを処理して補充データを作製するための処理モジュール、及び生データと補充データを解析して、ＣＶイベントリスクの予測、状態、及び／もしくは診断またはリスク計算を作製するための解析モジュールなどがある。ＣＶイベントのリスク状態の計算は、任意選択で、疾患、状態またはイベントに関連した個体の状態に関する追加の生物医学的情報を含むその他のあらゆる情報を作製または回収すること、さらなる試験が望ましい場合があるかどうかを特定すること、または別の方法で個体の健康状態を評価することを含んでもよい。
本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、コンピュータプログラム製品が含まれるように実施することができる。コンピュータプログラム製品は、コンピュータで読取り可能なプログラムコードを有するコンピュータで読取り可能な媒体を含んでもよく、アプリケーションプログラムをデータベースを有するコンピュータで実行させるためにその媒体で具体化されるものである。
本明細書で使用される場合、「コンピュータプログラム製品」とは、あらゆる性質（例えば、文書、電子、磁気、光学または別の様式）の物理的な媒体に含まれ、またコンピュータまたはその他の自動データ処理システムで用いることができる自然またはプログラミング言語のステートメントの形態で組織化された命令のセットを指す。このようなプログラミング言語のステートメントは、コンピュータまたはデータ処理システムで実行される場合、コンピュータまたはデータ処理システムを、ステートメントの特定の内容に従って作動させる。コンピュータプログラム製品としては、ソース及びオブジェクトコードでのプログラム、及び／またはコンピュータで読取り可能な媒体に埋め込まれたテストまたはデータライブラリーが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、コンピュータシステムまたはデータ処理装置を予め選択された方式で作動させることが可能なコンピュータプログラム製品が、オリジナルソースコード、アセンブリコード、オブジェクトコード、機械言語、前述の暗号化または圧縮されたバージョン、ならびにありとあらゆる等価物が含まれるが、これらに限定されない、多数の形態で提供することができる。
一態様において、ＣＶイベントのリスクを評価するためのコンピュータプログラム製品が提供される。このコンピュータプログラム製品は、計算装置またはシステムのプロセッサによって実行可能なプログラムコードを具体化するコンピュータで読取り可能な媒体を含み、このプログラムコードは：個体からの生体サンプルに起因するデータを検索するコード（このデータは、それぞれが表３のバイオマーカーのうちの１種に相当するバイオマーカーのレベルを含む）；及びバイオマーカー値の関数として個体のＣＶイベントリスクの状態を示す分類方法を実行するコードを含む。
さらに別の態様において、ＣＶイベントのリスクの可能性を示すためのコンピュータプログラム製品が提供される。このコンピュータプログラム製品は、計算装置またはシステムのプロセッサによって実行可能なプログラムコードを具体化するコンピュータで読取り可能な媒体を含み、このプログラムコードは：固体からの生体サンプルに起因するデータを検索するコード（このデータは、表３に示されたバイオマーカーから選択される生体サンプル中のバイオマーカーに相当するバイオマーカー値を含む）；及びバイオマーカー値の関数として個体のＣＶイベントリスクの状態を示す分類方法を実行するコードを含む。
様々な実施態様を、方法または器具として説明したが、これらの実施形態は、コンピュータと連結されたコード、例えばコンピュータに内在するまたはコンピュータによってアクセス可能なコードを介して実施することができるものであることを理解するべきである。例えば、ソフトウェア及びデータベースを利用して、上で論じられた本方法の多くを実施することができる。したがって、ハードウェアによって達成される実施態様に加えて、これらの実施態様は、この説明で開示された機能の実行可能性をもたらす、コンピュータで読取り可能なプログラムコードを具体化させるコンピュータが使える媒体で構成される製造品の使用により達成することができることにも留意する。それゆえに、それらのプログラムコード手段においてもこれらの実施態様が本特許によって同様に保護されたものとみなされることが望ましい。さらに、このような実施形態は、ＲＡＭ、ＲＯＭ、磁気媒体、光学媒体、または磁気光学媒体が含まれるが、これらに限定されない、実質的にあらゆる種類のコンピュータで読取り可能なメモリ内に保存されたコードとして具体化することができる。さらにより一般的に言えば、このような実施形態は、ソフトウェアにおいて、またはハードウェアにおいて、あるいはそれらのあらゆる組み合わせで、例えば、汎用プロセッサで作動するソフトウェア、マイクロコード、プログラマブルロジックアレイ（ＰＬＡ）、または特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）が含まれるが、これらに限定されないものにおいて実施することができる。
さらに、実施形態が、搬送波で具体化されるコンピュータシグナル、ならびに伝送媒体を介して伝播するシグナル（例えば、電気及び光学）として達成することができることも想定される。したがって、上で論じられた様々な種類の情報をデータ構造などの構造でフォーマットし、伝送媒体を介して電気信号として伝送するか、またはコンピュータで読取り可能な媒体に保存することができる。
また、本明細書に列挙された構造、材料、及び行為の多くが、ある機能を実行するための手段またはある機能を実行するための工程として列挙される可能性があることにも留意する。それゆえ、このような言語は、参照により本明細書に組み込まれる事項を含み、本明細書で開示されたこのような全ての構造、材料、または行為、及びそれらの等価物を包含することを理解するべきである。
本明細書で開示されたバイオマーカーの同定法、バイオマーカーの利用、及びバイオマーカー値を決定するための様々な方法は、ＣＶイベントのリスクの評価に関して詳細が上述されている。しかしながら、本方法の適用、同定されたバイオマーカーの使用、及びバイオマーカー値を決定するための方法は、その他の特定のタイプの心血管状態、その他のあらゆる疾患または病状、あるいは補助的な薬物療法による利益がある可能性があるまたはその可能性がない個体の同定にも十分に適用可能である。
その他の方法
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるバイオマーカー及び方法は、医療保険料または補償範囲及び／もしくは生命保険料または補償範囲を決定することに用いられる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法の結果は、医療保険料及び／または生命保険料を決定することに用いられる。このような場合においては、医療保険または生命保険を提供する機構は、対象者のＣＶイベントのリスクに関する情報を要求または別の方法で入手し、この情報を用いて、対象者に関する適切な医療保険または生命保険料を決定する。いくつかの実施形態において、医療保険または生命保険を提供する機構により検査が要求され、支払いを受ける。いくつかの実施形態において、この検査は、実際の買収企業または医療制度もしくは企業によって、将来的な債務またはコストを予測し、契約を進めるべきかを決定するために用いられる。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるバイオマーカー及び方法は、医療資源の利用を予測及び／または管理するために用いられる。いくつかのこのような実施形態において、本方法はこのような予測の目的で行われることはないが、本方法から得られた情報が、このような医療資源の利用の予測及び／または管理において用いられる。例えば、検査施設または病院は、特定の施設でのまたは特定の地理的地域における医療資源の利用を予測及び／または管理するために、本方法から多くの被験者に関する情報を収集してもよい。
以下の実施例は、単に冷笑的な目的で提供されたものであり、添付の特許請求の範囲で定義されるような本出願の範囲を限定することを意図するものではない。以下の実施例に記載される慣例的な分子生物学技術は、Ｓａｍｂｒｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ．ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（２００１）などの標準的な実験マニュアルで説明されているようにして行ってもよい。
実施例１：アプタマーを用いる例示的なバイオマーカーの検出
サンプル中の１つ以上のバイオマーカーを検出する例示的な方法は、例えば、Ｋｒａｅｍｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（１０）：ｅ２６３３２に記載され、また以下に記載されている。定量化の３つの異なる方法：マイクロアレイベースのハイブリダイゼーション、ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）ビーズベースの方法、及びｑＰＣＲが説明される。
試薬
ＨＥＰＥＳ、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ＭｇＣｌ２、及びトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０は、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入することができる。デキストラン硫酸ナトリウム塩（ＤｘＳＯ４）、通常８０００の分子量を有するものは、例えば、ＡＩＣから購入することができ、脱イオン水に対して、一回交換して、少なくとも２０時間透析する。ＫＯＤ ＥＸ ＤＮＡポリメラーゼは、例えばＶＷＲから購入することができる。塩化テトラメチルアンモニウム及びＣＡＰＳＯは、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入でき、ストレプトアビジン−フィコエリスリン（ＳＡＰＥ）は、例えば、Ｍｏｓｓ Ｉｎｃ．から購入できる。４−（２−アミノエチル）−ベンゼンスルホニルフルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）は、例えば、Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入することができる。ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレートは、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｅｉｎｔｉｆｉｃから購入できる（Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ Ｃｏａｔｅｄ Ｐｌａｔｅｓ ＨＢＣ、透明、９６ウェル、製品番号１５５００または１５５０１）。ＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンは、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｅｉｎｔｉｆｉｃから購入でき（ＥＺ−Ｌｉｎｋ ＮＨＳ−ＰＥＯ４−Ｂｉｏｔｉｎ、製品番号２１３２９）、無水ＤＭＳＯ中に溶解させ、単回使用アリコートで凍結保存してもよい。ＩＬ−８、ＭＩＰ−４、リポカリン（Ｌｉｐｏｃａｌｉｎ）−２、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＭＰ−７、及びＭＭＰ−９は、例えば、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入できる。レジスチン（Ｒｅｓｉｓｔｉｎ）及びＭＣＰ−１は、例えば、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈから購入でき、ｔＰＡは例えば、ＶＷＲから購入できる。
核酸
従来の（アミン置換及びビオチン置換を含む）オリゴヌクレオチドは、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から購入できる。Ｚ−ブロック（Ｂｌｏｃｋ）は、５’−（ＡＣ−ＢｎＢｎ）７−ＡＣ−３’の配列の一本鎖オリゴヌクレオチドである（式中、Ｂｎは、ベンジル置換デオキシウリジン残基を示す）。Ｚ−ブロックは、従来のホスホルアミダイト化学によって合成することができる。アプタマー捕獲試薬もまた、従来のホスホルアミダイト化学によって合成されてもよく、例えば、Ｗａｔｅｒｓ Ａｕｔｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ２７６７システム（または、Ｗａｔｅｒｓ ６００シリーズ半自動システム）で８０℃にて動作する２１．５×７５ｍｍのＰＲＰ−３カラムで、例えば、生成物を溶出するために、ｔｉｍｂｅｒｌｉｎｅ ＴＬ−６００またはＴＬ−１５０ヒーター及び重炭酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）／ＡＣＮの勾グラディエントを用いて精製することができる。検出は、２６０ｎｍで行い、フラクションを、最適なフラクションをプールする前に、主ピーク全体にわたって回収する。
緩衝液
緩衝液ＳＢ１８は、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０１ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．０５体積％のトゥイーン２０から構成され、ＮａＯＨでｐＨ７．５に調節したものである。緩衝液ＳＢ１７は、１ｍＭの三ナトリウムＥＤＴＡで補充したＳＢ１８である。緩衝液ＰＢ１は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０１ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭの三ナトリウムＥＤＴＡ、及び０．０５体積％のトゥイーン２０から構成され、ＮａＯＨでｐＨ７．５に調節されたものである。ＣＡＰＳＯ溶出緩衝液は、１００ｍＭのＣＡＰＳＯ（ｐＨ１０．０）及び１ＭのＮａＣｌからなる。中和緩衝液は、５００ｍＭのＨＥＰＥＳ、５００ｍＭのＨＣｌ、及び０．０５体積％のトゥイーン２０を含む。アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）ハイブリダイゼーション緩衝液は、キット（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ−オン−チップハイブリダイゼーションキット）の一部として供給される独自の配合物である。アジレント洗浄用緩衝液Ｉは、独自の配合物である（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ−オン−チップ洗浄用緩衝液１、アジレント）。アジレント洗浄用緩衝液２は、独自の配合物である（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ−オン−チップ洗浄用緩衝液２、アジレント）。ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液は、４．５Ｍの塩化テトラメチルアンモニウム、６ｍＭの三ナトリウムＥＤＴＡ、７５ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、及び０．１５体積％のサルコシル（Ｓａｒｋｏｓｙｌ）からなる。ＫＯＤ緩衝液（１０倍濃度）は、１２００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５ｍＭのＭｇＳＯ４、１００ｍＭのＫＣｌ、６０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１体積％のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）−Ｘ１００、及び１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡからなる。
サンプルの調製
血清（１００μＬのアリコートで−８０℃にて保存）を２５℃の水浴で１０分間融解させ、次いでサンプル希釈の前に氷上で保存した。サンプルを穏やかなボルテックスにより８秒間混合した。６％の血清サンプル溶液を、０．６ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭの三ナトリウムＥＧＴＡ、０．８ｍＭのＡＥＢＳＦ、及び２μＭのＺ−ブロックで補充した０．９４×ＳＢ１７中に希釈することによって調製した。６％の血清保存溶液の一部を、ＳＢ１７中で１０倍希釈し、０．６％の血清ストックを作製した。いくつかの実施形態において、６％及び０．６％のストックを用いて、それぞれ高豊富度の分析物及び低豊富度の分析物を検出する。
捕獲試薬（アプタマー）及びストレプトアビジンプレートの調製
アプタマーを、それらの同族の分析物（またはバイオマーカー）の相対豊富度に従って２つのミックスにグループ分けした。各アプタマーについてのストック濃度は４ｎＭであり、各アプタマーの最終濃度は０．５ｎＭである。アプタマーストックミックスを、ＳＢ１７緩衝液中で４倍に希釈し、９５℃で５分間加熱し、使用前に１５分かけて３７℃に冷却した。この変性−再生サイクルは、アプタマーの配座異性体分布を正規化することを目的とし、このようにして、履歴の変動に関わらず再現可能なアプタマー活性を確実にした。ストレプトアビジンプレートを、使用前に、緩衝液ＰＢ１の１５０μＬで２回洗浄した。
平衡化及びプレートの捕獲
加熱―冷却した２×アプタマーミックス（５５μＬ）を、等容量の６％または０．６％の血清希釈液と合わせ、３％及び０．３％の血清を含有する平衡化混合物を生成した。プレートをシリコーンのシールマット（Ａｘｙｍａｔシリコーンシールマット、ＶＷＲ）で密封し、３７℃で１．５時間インキュベートした。次いで、平衡化混合物を、洗浄した９６ウェルストレプトアビジンプレートのウェルに移し、エッペンドルフサーモミキサーセット（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ ｓｅｔ）で、８００ｒｐｍで振盪しながら、３７℃で２時間さらにインキュベートした。
手動アッセイ
特に他の規定がない限り、液体は、ダンピングし、その後、層状のペーパータオルの上で２回軽くたたくことによって除去した。洗浄容量は１５０μＬであり、全ての振盪インキュベーションは、２５℃、８００ｒｐｍに設定したエッペンドルフサーモミキサー場で行った。平衡化ミックスをピペッティングによって取り出し、プレートを、１ｍＭの硫酸デキストラン及び５００μＭのビオチンで補充した緩衝液ＰＢ１で１分間、２回洗浄し、その後緩衝液ＰＢ１で１５秒間、４回洗浄した。緩衝液ＰＢ１中の１ｍＭのＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンの新たに作製された溶液（１５０μＬ／ウェル）を添加し、プレートを振盪しながら５分間インキュベートした。ＮＨＳ−ビオチン溶液を除去し、プレートを、２０ｍＭのグリシンで補充した緩衝液ＰＢ１で３回、緩衝液ＰＢ１で３回洗浄した。次いで、１ｍＭのＤｘＳＯ４で補充した緩衝液ＰＢ１の８５μＬを各ウェルに添加し、プレートを、ブラックレイ（ＢｌａｃｋＲａｙ）ＵＶランプ（公称波長３６５ｎｍ）下で、振盪しながら、５ｃｍの距離で２０分間放射線照射した。サンプルを、新たに洗浄したストレプトアビジン被覆プレートに、または既存の洗浄済みストレプトアビジンプレートの未使用のウェルに移し、高及び低サンプル希釈混合物を単一ウェルに合わせた。サンプルを、振盪しながら室温で１０分間インキュベートした。未吸着物質を除去し、３０％のグリセロールで補充した緩衝液ＰＢ１で毎回１５秒間、８回洗浄した。次いでプレートを、緩衝液ＰＢ１で１回洗浄した。１００μＬのＣＡＰＳＯ溶出緩衝液を用いて、アプタマーを室温で５分間溶出させた。９０μＬの溶出物を９６ウェルのハイバイド（ＨｙｂＡｉｄ）プレートに移し、１０μＬの中和緩衝液を添加した。
半自動化アッセイ
吸着された平衡化ミックスを担持するストレプトアビジンプレートを、バイオテック（ＢｉｏＴｅｋ）ＥＬ４０６プレートウォッシャーのデッキ上に置いた。このバイオテックＥＬ４０６は、以下：未吸着物質を吸引により除去し、ウェルを１ｍＭの硫酸デキストラン及び５００μＭのビオチンで補充した緩衝液ＰＢ１の３００μＬで４回洗浄する工程を行うようプログラムされている。続いて、ウェルを、３００μＬの緩衝液ＰＢ１で３回洗浄した。緩衝液ＰＢ１中の１ｍＭのＮＨＳ−ＰＥＯ４−ビオチンの新たに調製した（ＤＭＳＯ中、１００ｍＭのストックから）溶液１５０μＬを添加した。プレートを、振盪しながら５分間インキュベートした。液体を吸引し、１０ｍＭグリシンを補充した３００μＬ緩衝液ＰＢ１でウェルを８回洗浄する。１ｍＭデキストラン硫酸を補充した１００μＬの緩衝液ＰＢＩを加える。これらの自動化工程の後に、プレートをプレートウォッシャーから取り出し、ＵＶ光源（ブラックレイ、公称波長３６５ｎｍ）下に取り付けたサーモシェーカー上に５ｃｍの距離で２０分間配置した。サーモシェーカーを８００ｒｐｍ及び２５℃に設定した。２０分間の放射線照射後に、サンプルを、新たに洗浄したストレプトアビジンプレート（または既存の洗浄済みプレートの未使用のウェル）に手動で移した。高豊富度（３％の血清＋３％のアプタマーミックス）及び低豊富度反応ミックス（０．３％の血清＋０．３％のアプタマー）を、この時点で合わせ、単一ウェルに入れた。この「キャッチ−２」プレートを、バイオテックＥＬ４０６プレートウォッシャーのデッキ上に置いた。このバイオテックＥＬ４０６は、以下：プレートを振盪しながら１０分間インキュベーションし、液体を吸引し、及びウェルを３０％のグリセロールで補充した緩衝液ＰＢ１の３００μＬで２１回洗浄する工程を行うようプログラムされている。ウェルを３００μＬの緩衝液ＰＢ１で５回洗浄し、最終洗浄液を吸引した。１００μＬのＣＡＰＳＯ溶出緩衝液を添加し、アプタマーを振盪しながら５分間にわたって溶出させた。これらのアプタマー工程の後に、プレートをプレートウォッシャーのデッキから取り外し、サンプルの９０μＬのアリコートを、１０μＬの中和緩衝液を含有するハイバイド９６ウェルプレートのウェルに手動で移した。
特注のアジレント８×１５ｋマイクロアレイへのハイブリダイゼーション
２４μＬの中和された溶出物を、新しい９６ウェルプレートに移し、１０個のＣｙ３アプタマーから構成されるハイブリダイゼーション対照のセットを含有する、１０×アジレントブロック（Ｏｌｉｇｏ ａＣＧＨ／ＣｈＩＰ−オン−チップハイブリダイゼーションキット、大容量、アジレント５１８８−５３８０）の６μＬを、各ウェルに添加した。３０μＬの２×アジレントハイブリダイゼーション緩衝液を各サンプルに添加し、混合した。４０μＬの得られたハイブリダイゼーション溶液を、ハイブリダイゼーションガスケットスライド（ハイブリダイゼーションガスケットスライド、スライドフォーマット当たり８マイクロアレイ、アジレント）の各「ウェル」に手動でピペッティングした。各アプタマーの４０個のヌクレオチドランダム領域に相補的な、アレイ当たり１０個のプローブと、それと共に２０×ｄＴリンカーを担持する特注のアジレントマイクロアレイスライドを、製造業者のプロトコールに従って、ガスケットスライド上に配置した。組立体（ハイブリダイゼーションチャンバーキット−ＳｕｒｅＨｙｂ−ｅｎａｂｌｅｄ、アジレント）をクランプし、２０ｒｐｍで回転させながら、６０℃で１９時間にわたってインキュベートした。
ハイブリダイゼーション後の洗浄
およそ４００ｍＬのアジレント洗浄用緩衝液１を、２つの別々のガラス染色皿のそれぞれに置いた。スライド（一度に２つ以内）を分解し、洗浄用緩衝液１で浸しながら分離させ、次いで、洗浄用緩衝液１をまた含有する第２の染色皿のスライドラックに移した。スライドを、洗浄用緩衝液１中で、撹拌しながらさらに５分間インキュベートした。スライドを、３７℃に予め平衡化された洗浄用緩衝液２に移し、撹拌しながら５分間インキュベートした。スライドを、アセトニトリルを含有する第４の染色皿に移し、撹拌しながら５分間インキュベートした。
マイクロアレイの画像化
マイクロアレイスライドを、Ｃｙ３−チャンネルを、５μｍの解像度で、１００％のＰＭＴ設定、及び０．０５で可能になるＸＲＤオプションで用いて、アジレントＧ２５６５ＣＡマイクロアレイスキャナーシステムで画像化した。得られたＴＩＦＦ画像を、ＧＥ１＿１０５＿Ｄｅｃ０８プロトコールにより、アジレントの特徴抽出ソフトウェア・バージョン１０．５．１．１を用いて加工した。
ルミネックスプローブの設計
ビーズに固定化したプローブは、標的アプタマーの４０個のヌクレオチドランダム領域の３’末端に相補的な４０個のデオキシヌクレオチドを有する。このアプタマー相補性領域を、５’アミノ末端を担持するヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）リンカーを介して、ルミネックスマイクロスフェアにカップリングさせた。ビオチン化検出デオキシオリゴヌクレオチドは、標的アプタマーの５’プライマー領域に対して相補的な１７〜２１個のデオキシヌクレオチドを含む。ビオチン部分を、検出オリゴの３’末端に付加した。
プローブのルミネックスマイクロスフェアへのカップリング
プローブは、実質的に製造業者の説明に従って、ルミネックスマイクロスフェアにカップリングされるが、以下の変更：アミノ末端オリゴヌクレオチドの量は、２．５×１０６個のマイクロスフェア当たり０．０８ｎモルであること、及び第２のＥＤＣ添加が、１０ｍｇ／ｍＬで５μＬであること、を用いた。カップリング反応を、２５℃及び６００ｒｐｍに設定したエッペンドルフサーモシェーカーで行った。
マイクロスフェアのハイブリダイゼーション
マイクロスフェア保存溶液（約４０００個のマイクロスフェア／μＬ）をボルテックスし、ヘルスソニックス（Ｈｅａｌｔｈ Ｓｏｎｉｃｓ）超音波クリーナー（モデル：Ｔ１．９Ｃ）で６０秒間超音波処理し、マイクロスフェアを懸濁させた。懸濁マイクロスフェアを、１．５×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液中で、反応当たり２０００個のマイクロスフェアに希釈し、ボルテックス及び超音波処理によって混合した。反応当たり３３μＬのビーズ混合物を、９６ウェルのハイバイドプレートに移した。１×ＴＥ緩衝液中、１５ｎＭのビオチン化検出オリゴヌクレオチドストック７μＬを、各反応に添加し、混合した。１０μＬの中和されたアッセイサンプルを添加し、プレートをシリコンキャップのマットシールで密封した。このプレートを、初めに９６℃で５分間インキュベートし、通常のハイブリダーゼーションオーブン内で撹拌することなく、５０℃で一晩インキュベートした。フィルタープレート（デュラポア（Ｄｕｒａ ｐｏｒｅ）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ部品番号ＭＳＢＶＮ１２５０、１．２μｍの孔径）を、０．５体積％のＢＳＡを補充した１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液の７５μＬで前もって湿らせた。ハイブリダイゼーション反応からの全サンプル容量を、フィルタープレートに移した。ハイブリダイゼーションプレートを、０．５％のＢＳＡを含有する１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液の７５μＬで濯ぎ、あらゆる残存する物質もフィルタープレートに移した。サンプルを、１５０μＬの緩衝液で、ゆっくりとした真空下で濾過し、約８秒間真空排気した。フィルタープレートを、０．５％のＢＳＡを含有する１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液７５μＬで１回洗浄し、フィルタープレート内のマイクロスフェアを、０．５％のＢＳＡを含有する１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液７５μＬ中で再懸濁させた。フィルタープレートを遮光し、エッペンドルフサーモミキサーＲで１０００ｒｐｍにて５分間インキュベートした。次いで、フィルタープレートを０．５％のＢＳＡを含有する１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液の７５μＬで１回洗浄した。１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液中、１０μｇ／ｍＬのストレプトアビジンフィコエリスリン（ＳＡＰＥ−１００、ＭＯＳＳ，Ｉｎｃ．）の７５μＬを、各反応に添加し、エッペンドルフサーモミキサーＲで、２５℃にて１０００ｒｐｍ、６０分間にわたりインキュベートした。フィルタープレートを、０．５％のＢＳＡを含有する１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液の７５μＬで２回洗浄し、フィルタープレート内のマイクロスフェアを、０．５％のＢＳＡを含有する１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液の７５μＬ中に再懸濁させた。続いて、フィルタープレートを遮光し、エッペンドルフサーモミキサーＲで１０００ｒｐｍにて５分間インキュベートした。次いで、フィルタープレートを、０．５％のＢＳＡを含有する１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液の７５μＬで１回洗浄した。マイクロスフェアを、０．５％のＢＳＡを補充した１×ＴＭＡＣハイブリダイゼーション溶液の７５μＬ中に再懸濁させ、ＸＰｏｎｅｎｔ３．０ソフトウェアを実行するルミネックス１００機器で解析した。高いＰＭＴ校正及び７５００〜１８０００のダブレット弁別器設定下で、ビーズのタイプ当たり少なくとも１００個のマイクロスフェアを計測した。
ＱＰＣＲの読み出し
ｑＰＣＲについての標準曲線を、１０倍の希釈、１０８〜１０２個のコピーの範囲、及びテンプレートなしの対照で作製した。中和されたアッセイサンプルを、ｄｉＨ２Ｏ中に４０倍に希釈した。ｑＰＣＲマスターミックスを、２×最終濃度（２×ＫＯＤ緩衝液、４００μＭのｄＮＴＰミックス、４００ｎＭのフォワード及びリバースプライマーミックス、２×ＳＹＢＲグリーンＩならびに０．５Ｕ ＫＯＤ ＥＸ）で調製した。１０μＬの２×ｑＰＣＲマスターミックスを、１０μＬの希釈したアッセイサンプルに添加した。ｑＰＣＲを、バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）ＭｙＩＱ ｉＣｙｃｌｅｒで、９６℃で２分、続いて９６℃で５秒及び７２℃で３０秒の４０サイクルを用いて行った。
実施例２．方法
試験デザイン及びサンプルの採取
安定したＣＨＤを有する被験者からの保管された血漿サンプルを、２つの周知の独立したコホート研究から得た。対象母集団の特性を表１に示す。我々は、ハート・アンド・ソウル研究からの９３８個の血漿サンプルにおいてタンパク質バイオマーカーの発見及びモデル訓練を行い、これに続く、１０年間の追跡調査を行った。例えば、Ｓｈｌｉｐａｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｍｅｄ．２００８；１２１：５０−５７；Ｗｈｏｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ．２００８；３００：２３７９−２３８８を参照されたい。我々は、ＨＵＮＴ３、ノルウェーの前向きコホート研究からの９７１個のサンプルで、モデルを５年間の追跡調査により評価した。例えば、Ｋｒｏｋｓｔａｄ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．２０１３；４２：９６８−９７７を参照されたい。我々は、この解析のためのより大きなＨＵＮＴ３コホートからの安定なＣＨＤを有する全参加者を選択するために、ハート・アンド・ソウルの組み入れ基準及び除外基準を使用した。ディスカバリー血漿サンプルは、管理良好な学術的前向き研究を表し：すなわち、被験者は絶食し、サンプルを一日のうちの同じ時間に採取し、遠心分離し、採取の１時間以内に−８０℃に凍結した。これとは対照的に、ＨＵＮＴ３バリデーションセットで採取されたサンプルは、「現実世界」の状態に似たものを表し、すなわち、被験者は絶食せず、一日のうちの異なる時間で採取し、サンプルを４℃で維持しながら、最長で２４時間まで血漿を細胞から分離させなかった。このような方法でモデル性能を評価することは、バイオマーカーバリデーションにとって重視すべき事項である、臨床サンプルの実際の採取に関連する因子に対するモデルのロバスト性を、我々が確認することを可能にする。ＭｃＳｈａｎｅ ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１３；５０２：３１７−３２０を参照されたい。両研究は、関連する治験審査委員会によって承認されている。
ＳＯＭＡスキャンプロテオミクスアッセイ
タンパク質アッセイで用いられる個々の親和性試薬は、それらのタンパク質標的に対して非常に高い親和性を有する、遅い解離速度の改変ＤＮＡアプタマー（ＳＯＭＡｍｅｒ）である。Ｖａｕｇｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１０；１３２：４１４１−４１５１を参照されたい。アプタマー中のＤＮＡ塩基に対する化学修飾は、それらの結合特性を向上させる。Ｄａｖｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１２；１０９：１９９７１−１９９７６を参照されたい。我々は、ＳＯＭＡスキャン（商標）マルチフレックスアッセイ８−１０においてこれらの試薬の１１３０種を使用した。簡単に言うと、９６ウェルプレートの各ウェル中の血漿のサンプルを、それらの標的タンパク質に結合するＳＯＭＡｍｅｒの混合物と一緒にインキュベートした。２段階のビーズをベースとした固定化工程が、未結合のまたは特異的に結合しないタンパク質の排除及び未結合のＳＯＭＡｍｅｒの排除を可能にする。標的−タンパク質に結合した試薬のみがアッセイで残存し、これらのそれぞれの数は、元のサンプル中のタンパク質の濃度に定量的に比例する。各試薬中のＤＮＡは、アジレントハイブリダイゼーションアッセイで定量化され、サンプルは、アレイ上のスポットに関する蛍光の程度が特定のタンパク質濃度に関連するように正規化かつ校正される。品質管理に合格した１０５４個のタンパク質は、＜５％のアッセイ内（ｉｎｔｒａ−ａｓｓａｙ）及びアッセイ間（ｉｎｔｅｒ−ａｓｓａｙ）変動係数の中央値を有した。Ｇｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１０；５：ｅ１５００４を参照されたい。
ＳＯＭＡｓｃａｎアッセイ及びデータ
血漿サンプルを、３２の別々のアッセイの実行で３週間の実験時間にわたってアッセイを行った。試験サンプルを、無作為に割り付け、校正のセット及び対照サンプルと共にアッセイを行った。アッセイを行う検査技師は、判別情報を入手できなかった。
イントララン正規化及びインターラン正規化を、ソーマロジック（ＳｏｍａＬｏｇｉｃ）優良実験室基準（ＧＬＰ）品質システムに定義されたようなＳＯＭＡスキャンバージョン３アッセイデータ品質管理（ＱＳ）手順に従って行った。インターラン正規化は、連続的なアッセイ間の「バッチ効果」を除去するよう設計され、一方イントララン正規化は、各実験内のサンプル間のタンパク質濃度（したがって、シグナル強度）におけるバルク変動を除去する。
簡単に言うと、インターラン校正は、実験校正基準において観測されたレベルが外部校正基準によって表された予想レベルとマッチするように、各タンパク質に関するシグナルレベルを調整する。ＱＣ公差は、繰り返し校正基準に関する中央値シグナルレベルを外部基準によって作製されたシグナルレベルにマッチさせるために必要な増加するスケーリングの大きさに関して定義される。
イントララン正規化は、サンプル中の総タンパク質濃度を変化させる、差次的なハイブリダイゼーション効率もしくは差次的なサンプル希釈（またはその他の収集プロトコールのアーティファクト）のいずれかから生じ得る「バルク」シグナル強度バイアスに対して制御する。前者の効果は、各サンプルに対するハイブリダイゼーション反応をモニターするために用いられる対照のセットによって捕獲され、後者は、各サンプル中の中央値シグナルレベルの実験内の全サンプルにわたる中央値シグナルレベルに対する比の中央値を用いる。多数のタンパク質に関するシグナルレベルで系統的強度バイアスを作成することは、サンプル採集プロトコールにとって珍しいことではない。図１は、１１３０個のタンパク質がサンプル希釈によってグループ分けされる場合の、２つのコホートにおいて増加するスケール因子の箱ひげ図を示す。４０％及び１％のサンプル希釈で測定されたタンパク質は、バリデーション（ディスカバリー）セットで系統的により高い（より低い）シグナルレベルを有し、その結果、１よりも小さい（１よりも大きい）対応する正規化スケール因子をもたらした。正規化手法後に、３つの希釈のそれぞれにおけるタンパク質に関する中央値シグナルレベルは、ディスカバリー及びバリデーションセットで同一である。
タンパク質レベルを相対蛍光単位（ＲＦＵ）で報告し、その後の分析の前に対数変換した。
分析から除外されるサンプル及びタンパク質
タンパク質は、関連するインターラン校正品質管理（ＱＣ）公差が、独立して行われた３２のアッセイのうちの少なくとも１つにおいて超過する場合に分析から除外された。これは、７６種のタンパク質について発生し、多くの場合、実験の大部分は、要求された公差内であったが、簡単にするために、ここに提示されるバイオマーカーディスカバリー分析において７６種全てのタンパク質を除外することを選択した。
サンプルは、バイオマーカーディスカバリー分析から以下の理由：１）イントララン正規化ＱＣ公差を満たしていないため、２）著しく高い数値の異常値であるため、または３）ヘモグロビンの極端なレベルもしくは検査技師が異常な（赤色の）血漿の色を指摘することによって示された出血の証拠があるために除外された。単一タンパク質の異常値は、中央値±６＊中央値絶対偏差（ＭＡＤＮ）１によって与えられる範囲の外側のシグナルレベルを有するタンパク質として定義し、測定されたタンパク質の５％超で異常値を有する患者サンプルを、分析から除外した。表２は、各基準に基づいて除外されたサンプルの数をまとめている。
１Φ−１（ｚ）は、正規累積分布関数の逆数を表すものとする。次いで、正規分布データについて、ロバスト推定ＭＡＤＮ（ｘ）＝σ＊Φ−１（３／４）であり、したがって、３＊ＭＡＤＮ≒２σ及びガウス測定に関する表示範囲は±４σである。
統計的方法
本試験におけるアウトカムは、死亡、心筋梗塞（ＭＩ）、卒中、一過性虚血発作（ＴＩＡ）、または心不全による入院の中の最初のイベントとして定義される。我々は、以下のように、コックス比例ハザードモデルを用いて、タンパク質レベルと心血管イベントのリスクとの間の単変量相関を推定した。
心血管リスクを予測するタンパク質の選択
単変量コックス比例ハザードモデルを用いて、二次心血管イベントの高リスクに個々に関連するタンパク質のセットを同定した。５％のボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）補正された有意水準において、厳密に２００種のタンパク質を、高リスクの心血管アウトカムと関連付けた。図２の「ボルカノ（ｖｏｌｃａｎｏ）」プロットは、ワルド（Ｗａｌｄ）の統計的ｐ値の負の対数を、相対蛍光単位（ＲＦＵ）の標準偏差当たりの（上部）、またはＲＦＵの四分位数構成員についてのカテゴリー指標の極端なレベル間の（下部）いずれかのハザード比の関数として示している。後者の場合、報告されたハザード比は、最低のリスク（第１の）四分位数における被験者と比べて、最も高いリスク（第４の）四分位数における被験者によって経験されるハザードの増加を与える。
これらの２００種のタンパク質のいくつかは、比較的小さな効果量と関連するが、表１４に列挙された１１７種は、範囲［０．７５〜１．２５］を外れるハザード比を有する。これらの２００種のタンパク質の中での対応する相関構造（データを示さず）を検討することは、同様なペアワイズ相関を有するタンパク質の数個のクラスタを明らかにする。これらのタンパク質クラスタの生物学的機能の包括的論議は、本文献の範囲を超えるものであり、他で議論されよう。
高いＣＶリスクに共同して関連するタンパク質のサブセットを同定するために、ＬＡＳＳＯ（Ｔｉｂｃｈｉｒａｎｉ、Ｓｔａｔ Ｍｅｄ １９９７；１６：３８５−９５）を変量スクリーニング手法として用いた。Ｒパッケージのｇｌｍｎｅｔ（Ｆｒｉｅｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ２０１０；３３：１−２２）においてｃｏｘｎｅｔ（Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ２０１１；３９：１−１３）を用いる一般化クロス確認（ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ ｃｒｏｓｓ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）を用いて、ＬＡＳＳＯ正則化パラメータを設定した。我々は、正則化レベルを設定するために、「１標準誤差」ヒューリスティック（Ｈａｓｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｌｅａｒｎｉｎｇ、Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄ．．２ｅｄ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；２００９）を用いた。クロス確認を摂動させることを、選択されたタンパク質の得られたセットの「安定性」についての簡単なチェックとして用いた。この解析は、ＣＶＤ９中に含まれるタンパク質が、これらが「ＬＡＳＳＯそれに続く変数減少法」手法が適用されるほとんどの場合に選択される限りにおいて安定であるとの確信をもたらした。解析を確実にするための再現可能な結果を生じるために、ＬＡＳＳＯクロス確認に先立って、乱数シードを１に固定した。この値を初期化し、ＬＡＳＳＯ正則化パラメータを、クロス確認された部分尤度（ｐａｒｔｉａｌ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ）を最小化する上記の１標準誤差の値に設定することで、本明細書で論議される１６種のタンパク質を含有するＬＡＳＳＯモデルを結果として得た。
我々は、ＬＡＳＳＯを変量選択のみに用い、むしろ完全パラメトリック（ワイブル）生存率モデルを最終的な予後予測モデルとして用いた。後者は、外部検証試験で使用するための校正に適した簡潔な表現及び数学的形式を有する（Ｒｏｙｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ ｍｅｄｉｃａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ２０１３；１３：３３；ｖａｎ Ｈｏｕｗｅｌｉｎｇｅｎ、Ｓｔａｔ Ｍｅｄ ２０００；１９：３４０１−１５）。完全ＬＡＳＳＯモデルから出発したステップワイズ減少法を用いて、ＬＡＳＳＯのペナルティーから課せられた制約の不在下において有意な予測因子ではないタンパク質を除去した。モデルの性能及び複雑性のバランスを取るための基準にベイズの情報量基準（ＢＩＣ）停止基準を用いる場合、変数減少法は、７種のタンパク質：すなわち、カテプシンＨ、ＥＧＦ受容体、成長ホルモン受容体、Ｔ細胞膜タンパク質ＴＩＭ−３、ＭＭＰ−７、癌遺伝子関連細胞接着分子ＣＤＯ、及びトロンボスポンジン−２を廃棄し、その結果、表３に示す９種のタンパク質ＣＶＤ９モデルを得た。
ＣＶＤ９モデル
最終モデル（ＣＶＤ９）は、９種のタンパク質を含有する。このモデルを臨床的変量用に調整することは、適合度をわずかに改善した（以下を参照）が、このような調整は、ディスカバリーセットにおける「タンパク質のみの」モデルで達成される判別または校正性能のいずれかにおける有意義な改善に失敗した。このことから、ＣＶＤ９を、バリデーション性能を評価するための「一次」モデルと称し、年齢、性別、糖尿病状態及び推算糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）を含むモデルを二次モデルと称することになった。
加速モデル（ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｆａｉｌｕｒｅ ｔｉｍｅ ｍｏｄｅｌ）については、時間間隔［０，ｔ］でイベントが発症する確率は、以下の式によって得られ、
式中、ＰＩは、予後予測指数（または、線形予測器）であり、ｓは、極値分布について関連するスケールパラメータである。モデルを適合させる場合、我々は、標準化変量を用いて行い、ここでは、母平均及び標準偏差を切片項に取り入れ、このようにして、予後予測指標及びスケール因子を下記のように報告することができる。
式中、タンパク質レベルは、常用対数ＲＦＵであるよう取られる。
臨床的変量
ＨＵＮＴ３研究は、心血管疾患研究として具体的に設計されておらず、そのため、ディスカバリーセットにおいて利用可能であるいくつかの既往歴パラメータ及び臨床検査測定値は、バリデーションセットにおいて利用不能であった（例えば、心エコー左心室駆出率、左心室肥大、拡張機能）。この点を念頭に置いて、両コレクションで利用可能であり、イベントを有する患者とそうでない患者との間で異なる臨床的変量に対してだけ調整するよう考慮した。
ＣＶＤ９に加える場合、臨床的変量の性別（男性）、年齢、糖尿病（有り）、ＡＣＥ阻害物質（有り）、及び推算糸球体濾過率（ｅＧＦＲ）は、個別に（及び共同して）得られた組み合わせモデルの適合度を増加させた（ｐ＜０．００１）。薬物治療はＨＵＮＴ３コホートにおいて利用不能であったため、ＡＣＥ阻害物質またはＡＲＢの使用は、最終モデルには含まれなかった。
ＣＶＤ９で用いられる９種のタンパク質に加えて、我々は、先ず、年齢及び性別を加え、その後、糖尿病の状態及びｅＧＦＲを加え、タンパク質とアウトカムを予測する通常利用可能な臨床的変量とを組み合わせる追加のモデルを得た。加速（ＡＦＴ）モデル線形予測器の係数についての点推定値及び推定されたスケールパラメータを表４に列挙している。表４において、略語は、ＡＮＧＰＴ２＝「アンジオポイエチン−２」；Ｃ７＝「補体７」；ＳＥＲＰＩＮＥ２＝「α２−抗プラスミン」；ＣＣＬ１８＝「ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１８」、「肺及び活性化調節ケモカイン（ＰＡＲＣ）」としても知られる；ＡＮＧＬ４＝「アンジオポイエチン関連タンパク質４；ＫＬＫ３．ＳＥＲＰＩＮＡ３＝「α１−アンチキモトリプシン複合体」；ＴＮＮＩ３＝「心臓トロポニン−Ｉ」；及びｅＧＦＲ＝「推算糸球体濾過率」である。
判別性能のいくつかの異なる尺度が一般的に報告されており、我々は「ｃ統計量」、統合判別改善指数（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ Ｉｎｄｅｘ）（ＩＤＩ）、及び無カテゴリーの純再分類改善指数（ｃａｔｅｇｏｒｙ−ｆｒｅｅ ｎｅｔ ｒｅｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）（ＮＲＩ）を報告する。
表５は、これらの判別尺度を、Ｑ４／Ｑ１ハザード比及びホスマー・レメショウ（Ｈｏｓｍｅｒ−Ｌｅｍｅｓｈｏｗ）統計量と共に列挙し、３つのモデルについての校正性能をまとめている。報告された信頼区間は、１００個のブートストラップサンプルを用いて作成された経験９５％のＣＩである。第１列は、拡大モデルをベースライン（タンパク質のみ）モデルと比較する尤度比検定についてのｐ値を列挙する。第１の列は、拡大モデルをタンパク質のみのモデルと比較する尤度比（ＬＲ）検定についてのｐ値を示す。後続の判別の尺度は、重み付けインシデント／ダイナミックＲＯＣ曲線下面積（Ｃτ）、統合判別改善指数（ＩＤＩ）、再分類改善指数（ＮＲＩ）及び第４の四分位数の第１の四分位数に対するハザード比（Ｑ４／Ｑ１）である。校正性能は、ホスマー・レメショウ統計量で評価した。
そのベースライン値がイベント有りグループとイベント無しグループを区別する臨床的変量を付加することは、統合ＡＵＣ「Ｃ統計量」は本質的に変化しないままであったが、ＩＤＩ、ＮＲＩ（＞０）及びＱ４／Ｑ１ハザード比の点推定におけるわずかな改善を供与した。
バリデーションのためのＣＶＤ９の再校正
ＣＶＤ９の性能をフラミンガムスコアと比較する前に、両方のモデルを、バリデーションセットにおけるその使用について再校正を行った。ｖａｎ Ｈｏｕｗｅｌｉｎｇｅｎ（Ｓｔａｔ Ｍｅｄ ２０００；１９：３４０１−１５）に記載されるように、我々は、ワイブル（Ｗｅｉｂｕｌｌ）の加速モデルを用いて、バリデーション母集団において使用するためのモデル係数を再校正した。ＰＩを予後予測指とし、Ｈ（ｔ｜ＰＩ）を、累積ハザード関数を示すものとすると、校正モデルは、
であり、式中、誤差項ｅは、極値分布を有する。ベースライン累積ハザード関数をＨ０（ｔ）で表し、Ｈ（ｔ｜ＰＩ）＝Ｈ０（ｔ）ｅＰＩを使用することで、
を得る。
形式的な校正評価（Ｖａｎ Ｈｏｕｗｅｌｉｎｇｅｎによる「校正によるバリデーション」と称される）は、完全校正仮説、Ｈ０：γ０＝０、γ１＝０、γ２＝１を検定することを伴う。Ｒパッケージｓｕｒｖｉｖａｌ（Ｔｈｅｒｎｅａｕ、Ｓ．Ｒパッケージバージョン２３７−７ ２０１４の生存率解析のためのパッケージ）からのｓｕｒｖｒｅｇを用いてモデルフィッティングを行うことによって、表６に列挙された校正係数を得た。
切片
及びスケール項
は、バリデーションコホートに適用される前に、ＣＶＤ９が校正を必要とすることを示すが、以下に論じるように、バリデーションセットにおける組織的強度バイアスが、切片項に対する寄与の大部分に起因している。
ＨＵＮＴ３バリデーションセットにおける血液サンプルを、ディスカバリーセットセットにおけるものよりも寛大な収集プロトコールを用いて収集した結果、バリデーションサンプルにおいて測定された１０５４種のタンパク質の大部分にわたって組織的強度バイアスを観測した。本明細書で論じられるように、このバイアスは、正規化工程でほとんどが除去されたが、以下に示すように、少しの残留バイアスが、モデルＣＶＤ９で用いられた９種のタンパク質に関するシグナルレベルに残存した。このバイアスは、正規化プロセスのアーティファクトであり（正規化の前には、バリデーションサンプルは、ディスカバリーサンプルより高いシグナルレベルを有するが、その後より低いシグナルレベルを有する）、以下に示すように、これは係数の推定値、γ０に起因する。
図３中のロバスト回帰直線の切片は、ＣＶＤ９における全ての９種のタンパク質に共通な強度バイアスの推定値を提示した。Δに推定されたバイアスを示すものとし、βｊ及びσｊを第ｊ番目のタンパク質についてのモデル係数及び母集団標準偏差とし、次いでＣＶＤ９をバリデーションデータに適用して、モデル切片の説明に別の方法で説明する定数因子
の付加をもたらした。このようにして、タンパク質シグナルにおける強度バイアスは、ディスカバリー及びバリデーションセットで、ベースライン生存者関数の時間スケールにおける不一致として、厳密には、校正モデル（１）におけるパラメータγ０に関連する項として現れる。ロバスト線形回帰から生じた推定値Δ＝−０．０５６をＣＶＤ９モデル係数及び母集団標準偏差と共に（２）用いることが、線形予測器から０．２３１４５を減じ、ほぼ正確に、値（γ０）は、校正モデルにおける切片を推定した。したがって、正規化手法後に残ったままの「残留」強度バイアスは、ディスカバリー及びバリデーションコホートにおけるベースライン生存者関数間の実際の不一致よりはむしろ（γ０）の大きさに大きく起因する。
ＨＵＮＴ３サンプル収集におけるシグナル強度バイアスは、この特定のバリデーションセットの様相であり、このことから、我々はより厳密な収集プロトコールの下で採取されたサンプルを一般化することを想定していない。この点を考慮して、以下に説明する再校正したＣＶＤ９モデルを用いて、バリデーションセットの性能を評価した。
イベントの時間分布が、スケールａ及び形状ｂを有するワイブル分布である場合、対応するベースライン生存者関数は、
であり、
ここでは、累積ベースラインハザード（Ｈ０）に関しては、ｌｏｇ（Ｈ０）＝ｂ ｌｏｇ（ｔ／ａ）と書かれている。これを等式（１）の左辺に代入し、「Ｅｒｒｏｒ！ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｏｕｒｃｅ ｎｏｔ ｆｏｕｎｄ」における校正係数を用いて、リスクスコアを生成するために得られる表現は、加速モデルの形態をとることができ、
これと共に「校正された」モデル係数は、
となる。
これらのモデル係数を用いて、関連する構成リスクスコアを
を用いて生成し、
式中、
である。
得られた予後予測指数（ＰＩ）及びバリデーションセットで用いられる再校正されたＣＶＤ９モデルに関する極値スケール因子は、
である。
同様な校正モデルを、臨床的変量を含むＣＶＤ９のバリアントについて構築した。得られた校正モデルを表７に列挙する。ＣＶＤ９の場合と同様に、臨床的変量を含むモデルは、９種のタンパク質における同様な組織的強度バイアスを有し、これと共に、このバイアスは、それぞれの校正モデルにおいて（γ０）推定値に対する−０．２５４及び−０．２４５の寄与を生成した。
心血管イベントに有意に関連するタンパク質の同定後に（５％有意水準におけるボンフェローニ補正後に）、変量（タンパク質）選択の目的のために、Ｌ１ペナルティー（ＬＡＳＳＯ；Ｔｉｂｓｈｉｒａｎｉ，Ｓｔａｔ Ｍｅｄ．１９９７；１６：３８５−３９５を参照）コックス回帰を利用した。変量の選択及び付随する係数の収縮を同時に行うことによって、広く実証されているように、ＬＡＳＳＯは良好な予測モデルをもたらす。Ｈａｓｔｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｌｅａｒｎｉｎｇ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；２００９を参照されたい。このようなＬ１ペナルティーアプローチは、我々の１０５４種のタンパク質によって例示される高次の予測変量設定において特に有効である。完全パラメトリックモデルを得るために、我々は、ＬＡＳＳＯ選択されたタンパク質のフルセットを用いて、ステップワイズ変数減少法をワイブル加速モデルに適用した。これが、７種の少なくとも重要な寄与原因を除去し、倹約な９種タンパク質のモデル（ＣＶＤ９）、すなわちフラミンガムの趣旨を尊重して、完全パラメトリック予後予測モデルをもたらした。
高く評価される比較基準として、以下の通りに、ディスカバリー及びバリデーションデータセットで使用するために再校正されたフラミンガム二次イベントリスクモデル（Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ｊ．２０００；１３９：２７２−２８１）からリスク予測を生成した。
Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏは、二次心血管イベント予測のために、以下の加速モデルを提供している。
ここで、男性についての予後予測指数及びスケールパラメータは、
である。
フラミンガムモデルをＣＶＤ９と比較する前に、ディスカバリー及びバリデーションセットにおいて使用するために、このモデルを再校正した。
ディスカバリー及びバリデーションセットのためのフラミンガムの再校正
ディスカバリーセット及びバリデーションセットで使用するようにフラミンガム二次リスクスコアを再校正するために、単変量コックス比例ハザード校正（ｖａｎ Ｈｏｕｗｅｌｉｎｇｅｎ、Ｓｔａｔ Ｍｅｄ ２０００；１９：３４０１−１５；Ｓｔｅｙｅｒｂｅｒｇ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ Ｍｏｄｅｌｓ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ；２０１０）モデルを用いた。ベースライン生存者関数をＳ０（ｔ）で表すと、校正された４年目のフラミンガムリスクスコアは、
であり、式中、β＊は、特定のサンプルセットにおけるフラミンガム予後予測指数の値にフィッティングさせた校正モデルからの推定値であり、Ｓ０（ｔ）は、母集団中の生存者関数のカプラン・マイヤー推定値である。表８は、得られた校正モデル係数である。
観測イベントと予測イベントの度数間の一致を評価することによって、校正性能を判定した。図４は、ディスカバリーセットにおけるフラミンガムモデルについてのリスクの各十分位数に関する観測イベント及び予測イベントの度数を示し、図５は、バリデーションセットでもものを示す。それぞれの場合、左の枠は、オリジナルのフラミンガムスコアを示し、右の枠は、表８に列挙した係数を有するモデルを使用して再校正したスコアを示す。
校正性能は、ディスカバリーコホートにおいては許容可能であったが、図５に示すように、予測及び観測イベント度数間の同様なレベルの一致は、バリデーションコホートでは達成しなかった。我々は、χ２（ホスマー・レメショウ）統計量を報告し、図４及び図５でグラフ表示された校正性能をまとめた−この統計量及び関連付けられたｐ値を、Ｒパッケージ ＰｒｅｄｉｃｔＡＢＬＥのｐｌｏｔＣａｌｉｂｒａｔｉｏｎ機能で計算した。Ｋｕｎｄｕ ｅｔ ａｌ．，ＰｒｅｄｉｃｔＡＢＥＬ：Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｒｉｓｋ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌｓ．Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １２−１ ２０１２を参照されたい。ホスマー・レメショウ検定についての０．７０及び０．０２のｐ値は、ディスカバリーにおけるフラミンガムモデルの良好な校正と、バリデーションコホートにおける不良な校正と合致する。
表９の項目は、ディスカバリー及びバリデーションセットの両方における再校正されたフラミンガムスコアの判別及び校正性能をまとめている。本明細書でより詳細に論じるように、我々は、２つの判別性能の尺度、第４と第１の四分位数との間のハザード比及び「Ｃ統計量」を報告している。後者の一致指数については、我々は、重み付けインシデント／ダイナミックＲＯＣ曲線下面積、Ｃτ（τ＝４年）を報告する。ｃ統計量は、ディスカバリー及びバリデーションコホートにおけるフラミンガムモデルの比較的不良は判別と一致している。
このスコアは、４年間を含むそれ以下の予測に関して検証されたために、我々は、ＣＶＤ９タンパク質モデルとの性能比較のために４年間の期間を用いた。我々はさらに、以下に論じられるように、ＣＶＤ９タンパク質モデル対フラミンガムに関する無カテゴリー純細分類改善度指数（ＮＲＩ；Ｐｅｎｃｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔａｔ Ｍｅｄ．２０１１；３０：１１−２１）を算出した。このフラミンガムリスクスコアは、ＭＩ及び死亡の予測だけについて以前に検証されているが、我々は、卒中及び心不全イベントも予測している。我々は、フラミンガムの二次イベントスコアを比較器として保持しており、なぜなら、この研究において、その性能が、全てのイベントタイプにわたって同様であるためであり、またこれが、この母集団に関して科学者集団にとって関心の最も可能性が高いスコアと見なされているためである。多タンパク質の心血管リスク予測モデルを生成したプロセス及びこれをフラミンガムの二次イベントリスクスコアと比較する評価基準（Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ｊ．２０００；１３９：２７２−２８１）を、図６にまとめて、以下で説明する。通常利用可能な臨床パラメータ（両方のコホートにおいて利用可能であり、イベントを有する患者とそうでない患者との間で異なる変量から選択）をＣＶＤ９に付加することの影響も、二次モデルで評価した（上記を参照）。全ての統計計算を、統計計算のためのＲ言語（Ｒ Ｌａｎｇｕａｇｅ ｆｏｒ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ）を用いて行った。Ｒ Ｃｏｒｅ Ｔｅａｍ ＲＦｆＳＣ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ Ｒ：Ａ ｌａｎｇｕａｇｅ ａｎｄ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｆｏｒ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｍａｎｕａｌ．２０１３を参照されたい。
バリデーション性能
図７に示したフォレストプロットは、ディスカバリー及びバリデーションセットの両方における１６種のＬＡＳＳＯタンパク質に関するハザード比の比較を示す。アンジオポイエチン関連タンパク質４及び補体Ｃ７を除いては、ＣＶＤ９モデルにおける個々のタンパク質に関するハザード比はディスカバリー及びバリデーションセットで同様である。これは、個々のタンパク質のバリデーション性能の尺度であり−このセクションの残りの部分では、モデルＣＶＤ９をもたらすこれらのタンパク質の特定の組み合わせのバリデーション性能を論じる。
校正性能は、モデル予測が、臨床方針決定を伝えるために用いられる場合に特に重要である。我々は、初めに、Ｓｔｅｙｅｒｂｅｒｇ（Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ２０１０；２１：１２８−３８）に記載されたように、バリデーション母集団における絶対リスクのＣＶＤ９推定値を評価し、その後、Ｃ統計量における変化に関する判別性能及びフラミンガムノデルに対するリスク再分類を判定した。
校正
ベースライン血液サンプルに従って、４年の期間における観測されたイベントと予測されたイベントの度数間の一致を判定することによって、校正性能を評価した。図８は、バリデーションセットで使用するために再校正されたＣＶＤ９（左）及びフラミンガムモデル（右）についてのバリデーションセットにおけるリスクの各十分位数に対して予測されたイベントと観測されたイベントの度数を示す。
全体的な範囲にわたって、ＣＶＤ９により生成された所定のリスク十分位数における予測されたイベント度数は、観測されたイベント度数の８％以内（通常は３％以内）である。各対のバーのそれぞれの右側のバーは、おおよそ１００人の患者を表し、誤差バーが示唆するように、各十分位数における患者についてのリスクスコアは、隣接するリスク十分位数における患者のものよりも互いに類似している。これが、ＣＶＤ９中のタンパク質によって提供される情報を考慮する場合に、我々が「個別化された」リスク判定について言及する意味である。
一般に、予測イベントと観測イベントの度数間の一致は、フラミンガムモデルにおいては弱い（特に、第１０〜２０のリスク百分位数における患者に関して）。図９は、バリデーションセットで使用するために再校正されたＣＶＤ９及びフラミンガムスコアに関する予測曲線を示す（Ｐｅｐｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔａｔ Ｍｅｄ ２０１３；３２：１４６７−８２）。
図９の同じスケールでの２つのモデルからのリスクスコアを用いて、第１０の百分位数未満の被験者の（低い）リスク及び第９０のリスク百分位数以上の被験者についての最悪の（６５％の）高リスクを正確に予測することによって、我々は、ＣＶＤ９モデルが、リスクスペクトルの両端において、フラミンガムよりも絶対リスクに関するより正確な表現を生成することが分かった。加えて、ＣＶＤ９についての予測曲線の勾配は、リスク百分位数の上半分でより急勾配であり、このことは、ＣＶＤ９が、従来のフラミンガムモデルよりも、各リスク十分位数の患者についての絶対リスクのより細かな分解能を提供することを示唆している。
判別
表１０の項目は、バリデーションコホートのために再校正されたＣＶＤ９及びフラミンガムモデルの判別性能をまとめている。一致指数として、我々は、固定された追跡期間［０，τ］に関連付けられた、重み付けインシデント／ダイナミックＲＯＣ曲線下面積、Ｃτを報告し（Ｈｅａｇｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ ２００５；６１：９２−１０５）、これは、Ｈａｒｒｅｌｌ、Ｐｅｎｃｉｎａ及びＤ’Ａｇｏｓｔｉｎｏの「Ｃ統計量」と等しい。例えば、Ｈａｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔａｔ Ｍｅｄ １９９６；１５：３６１−８７；及びＰｅｎｃｉｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔａｔ Ｍｅｄ ２０１２；３１：１５４３−５３を参照されたい。我々は、ＲパッケージｒｉｓｋＳｅｔＲｏｃにおけるｒｉｓｋｓｅｔＡＵＣ機能を用いて、τ＝１及び４年についてのＣτを算出した。Ｈｅａｇｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，ｒｉｓｋｓｅｔＲＯＣ：Ｒｉｓｋｓｅｔ ＲＯＣ ｃｕｒｖｅ ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｃｅｎｓｏｒｅｄ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｄａｔａ．Ｒ Ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １０４ ２０１２を参照されたい。
ＲＯＣ曲線
図１０は、ディスカバリー及びバリデーションセットの両方について、ｒｉｓｋＳｅｔＲＯＣパッケージで生成した、ＣＶＤ９及びフラミンガムモデルに関するＲＯＣ曲線を示す。我々は、ＲＯＣ曲線を、各モデルについて、１年目と４年目において生成した。
リスク再分類
４年目のイベント確率を、ＣＶＤ９及びフラミンガム二次モデルで生成し、後者はディスカバリーセットで使用するために再校正されたものである。無カテゴリー純再分類改善指標１９ ＮＲＩ（＞０）を、Ｒパッケージｎｒｉｃｅｎｓを用いて算出した。Ｅｉｓｕｋｅ．ＮＲＩ ｆｏｒ ｒｉｓｋ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌｓ ｗｉｔｈ ｔｉｍｅ ｔｏ ｅｖｅｎｔ ａｎｄ ｂｉｎａｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｄａｔａ．Ｒ ｐａｃｋａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １２ ２０１３を参照されたい。
表１１は、ディスカバリー及びバリデーションセットの両方における、ＮＲＩ（＞０）における項目及びＣＶＤ９をフラミンガムと比較する再分類確率を列挙する。報告された信頼区間は、１００個のブートストラップサンプルを用いて計算された経験的な９５％の区間である。セクション「Ｅｒｒｏｒ！ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｏｕｒｃｅ ｎｏｔ ｆｏｕｎｄ」で論じたように、両方のＣＶＤ９及びフラミンガムモデルを、この計算に先立って、バリデーションセットにおいて使用するために再校正した。
実施例３．結果
ベースライン特性
ベースラインにおける２つの研究対象母集団の臨床的特性を表１２にまとめる。予想通りに、既知のリスク因子は、イベントを有するグループにおいてはるかにより優勢であった。ハート・アンド・ソウルにおけるものよりもＨＵＮＴ３における全体的なイベントはより少なく、これは、追跡期間が短いためであるが、それにもかかわらず、この母集団は、単位時間当たりのイベント率及びイベントタイプの分布において類似点があった。表１２において、Ｐ値は、カテゴリー共変量についてのフィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）の正確確率検定及び連続共変量についてのマン・ホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）のＵ検定に関連付けられる。連続値は、中央値及び四分位数範囲（ＩＱＲ）で要約される。ＨＵＮＴ３のバリデーションセットは、ＣＨＤ研究用に設計されておらず、その結果、いくつかの臨床情報は、利用することができず、Ｎ／Ａ（該当せず）と記されている。記号説明：ＢＭＩ＝肥満度指数；ＡＣＥ＝アンジオテンシン変換酵素；ＡＲＢ＝アンジオテンシン受容体遮断薬；ＬＤＬ−Ｃ＝低密度リポタンパク質コレステロール；ＨＤＬ−Ｃ＝高密度リポタンパク質コレステロール；ＴＧ＝トリグリセリド；ｅＧＦＲ＝推算糸球体濾過量。
３バリデーションセットにおいてはＣＫＤ−ＥＰＩ ２００９であり、ディスカバリーセットにおいてはＣＫＤ−ＥＰＩ ２０１２である（欠測値が２０１２様式の計算を妨害する場合、ＣＫＤ−ＲＰＩ ２００９を用いることが可能である）。
心血管（ＣＶ）リスクに関連するタンパク質
５％のボンフェローニ補正された有意水準において、単変量コックス回帰解析は、品質管理に合格した１０５４種のタンパク質のうちの１１７種が、心血管イベントの高リスクに関連付けられ、さらに＞１．２５または＜０．７５の単変量の第４から第１四分位数ハザード率を有することを明らかにした（これらの１１７種のタンパク質は、以下の表１４に列挙している）。これらのタンパク質のいくつかは相関性があり、このことは、１１７よりもはるかに少ない生物学的プロセスの存在を示唆している（これらの生物学的過程は、更なる分析の標的となると思われる）。ＬＡＳＳＯ法によってこのリストから選択された１６種のタンパク質及び最終的ＣＶＤ９モデルについて選択された９種のタンパク質のサブセット関するハザード比を、図７に示す。ＬＡＳＳＯで選択された１６種のタンパク質の関連する生物学的特性を以下にまとめた。
本分析において同定されたバイオマーカーは、強力な心血管リスク予測モデルを導出するよう働くのみならず、心血管疾患（ＣＶＤ）の生物学の理解を伝え、かつ創薬標的及び治療の選択肢も特定する。以下に、ＬＡＳＳＯによって選択され、ＣＶリスク予測モデルに入れられた１６種のタンパク質の既知の機能（複数可）の簡単な説明を提供する。
増殖及びリモデリング
増殖分化因子１１（ＧＤＦ１１）は、潜在的な臨床的有意性の調査結果を有する、網羅的プロテオミクスアッセイツールを用いた生物学的発見の一例である。ＳＯＭＡスキャンを用いて、Ｌｅｅらは、ＧＤＦ１１の加齢に関連する減少を、マウスの加齢に関連する心臓肥大の原因として特定した。Ｌｏｆｆｒｅｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２０１３；１５３：８２８−３９を参照されたい。ＧＤＦ１１は、ヒトの心臓肥大及び拡張期心不全を抑制するその役割についての積極的な研究中にある。例えば、Ｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ ２０１４；６３：Ａ７８０を参照されたい。興味深いことには、我々の研究では、ＧＦＤ−１１濃度は心血管イベントリスクの増加と共に減少するが、ＧＤＦ１１活性の阻害剤であるホリスタチン様３は、心血管リスクの増加と正の関連を示すことである（表１４を参照）。
上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）受容体（ＥＧＦＲ）は、アテローム硬化性病変の単球及びマクロファージ中で発現される。リガンドの結合による活性化は、細胞増殖及び走化性を刺激する。Ｄｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ ２００６；１８６：３８−５３参照。動物試験からの証拠は、ＥＧＦ受容体が、心臓肥大に対して保護し、適切な血管壁構造及び血管反応性を支援することを示している。Ｓｃｈｒｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２０１３；６１：３３３−４０参照。
成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）及び上皮細胞増殖因子の適切な形態は、有糸分裂誘発、細胞機能に関与する循環因子の貯蔵体ならびに阻害物質の両方として働き、癌における周知の役割を有する。興味深いことに、成長ホルモン受容体のその同化作用メディエータのインスリン様増殖因子Ｉを介してのシグナル伝達は、冠動脈疾患を発症するリスクと負の関連を示すことがすでに示されている。Ｊｕｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００２；１０６：９３９−４４。
チロシン−タンパク質キナーゼ受容体Ｔｉｅ−２受容体上でアンジオポイエチン−１活性を拮抗するアンジオポイエチン−２（ＡＮＧＰＴ２）は、血管新生の際に、アンジオポイエチン−１と共同して作用し、細胞マトリックス接触の緩和を促進し、血管新生の際の内皮細胞のアポトーシス及び血管破裂を誘発させ得る２６。Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７；２７７：５５−６０。同じ遺伝子族の一員であるアンジオポイエチン関連タンパク質４（ＡＮＧＰＴＬ４）は、低酸素症によって誘発され、血管機能及びマトリックス−内皮細胞相互作用に影響を及ぼすだけでなく、リポタンパク質リパーゼの強力な阻害物質として、脂質代謝にも影響を及ぼす。（２７）。Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｌｉｐｉｄｏｌｏｇｙ ２００６；１７：１５２−６。
細胞外マトリックスと細胞との制御された相互作用は、血管及び心筋損傷に応答する正常な発生の際の、ならびに癌転移の際の正常な器官生理のために不可欠である。マトリックスメタロプロティナーゼ及びそれらの阻害物質は、血管の細胞外マトリックス中にいくつかの標的を有し、アテローム斑の安定性、動脈瘤形成、及びその他の心血管疾患と関連付けられている。Ｄｏｌｌｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００６；６９：６２５−３５。マトリックスメタロプロティナーゼ（ＭＭＰ）−７及びＭＭＰ１２は、は我々の予測モデル中で表されており、一方ＴＩＭＰ１もまた、心血管リスクと有意な関連性を有する（表１４を参照）。トロンボスポンジン−２（ＴＨＢＳ２）は、血管及び心臓細胞−細胞間ならびに細胞−マトリックス間の相互作用を仲介し、血管新生、血栓症、及び炎症の調節に関与している。血清トロンボスポンジン−２濃度の増加は、高齢者の男性における心臓死のリスクと関連する。Ｇｏｌｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ ２０１３；１１１：１８００−４。癌細胞関連細胞接着分子ＣＤＯ（ＣＤＯＮ）は、筋形成及び筋細胞接着に関与する、Ｉｇ／フィブロネクチン上科の細胞表面タンパク質の一員である。Ｔｅｎｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｃｅｌｌ ２００６；１０：６４７−５６。その細胞−細胞間の相互作用における役割は、腫瘍侵襲性においては留意されているが、その心血管系との関係性はほとんど知られていない。
炎症
心血管疾患における炎症及び免疫の複雑な役割を表すために、我々のモデルは、Ｔ細胞の動員に関与するとみなされる単球／マクロファージ同化ケモカインである、炎症性ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド１８（以前は、肺及び活性化調節ケモカインＣＣＬ１８／ＰＡＲＣとして知られていた）を組み入れる。Ｃｈｅｎｉｖｅｓｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１２；１８９：１２８−３７。ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣの血漿レベルは、不安定狭心症の発作中に上昇し、安定狭心症を有する患者におけるＣＶイベントを予測することも見出されている。Ｄｅ Ｓｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ ２０１０；４９：８９４−６。Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン含有タンパク質３（ＴＩＭ−３）は、マクロファージ活性化及び他の免疫系の活性化に関与する。Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｅｘｐｅｒｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｓ ２００７；１１：１００５−９。
補体Ｃ７（Ｃ７）は、生理活性終末補体複合体（ＴＣＣ）を形成する５つの構成要素のうちの１つである。内皮細胞上に沈着したＴＣＣは、細胞増殖、増殖因子ならびに炎症性サイトカインの放出、及び組織因子の発現の増加をもたらす。ＴＣＣはまた、アテローム斑における平滑筋細胞の増殖を刺激する。Ｓｐｅｉｄｌ ｅｔ ａｌ．，ＪＴＨ ２０１１；９：４２８−４０。症候性心不全を有する患者において、血清可溶性ＴＣＣの上昇は、有害アウトカム（死亡、緊急心臓移植、または心不全の悪化による入院）を予測する。Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ｊ ２００１；１４１：６８４−９０。ＴＣＣの別の一員である補体Ｃ９もまた、我々の研究では上昇した（表１４）。
プロテアーゼ
α１−アンチキモトリプシン複合体（ＳＥＲＰＩＮＡ３）は、いくつかの生体基質を有するプロテアーゼ阻害物質のα１−アンチキモトリプシンの結合型を表す。これは、血圧を含む複数の急性及び慢性疾患過程を調節することができる。Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ ２００８；３０：６４８−６１。α２−抗プラスミン（ＳＥＲＰＩＮＥ２）は、プラスミンを不活性化し、したがって線維素溶解を低減する、セリンプロテアーゼ阻害物質（ＳＥＲＰＩＮ）である。Ｍａｔｓｕｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ａｎｄ ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ：ＪＴＨ ２００３；１：１７３４−９；Ｍｕｔｃｈ ｅｔ ａｌ．，ＪＴＨ ２００７；５：８１２−７。カテプシンＨ（ＣＴＳＨ）は、リソソームタンパク質の分解において重要な、リソソームシステインプロティナーゼである（３９）。Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２０１２；１２５：１５５１−６２。しかしながら、そのＣＶ疾患との関係は、我々の本研究までは不確かであった。Ｌｕｔｇｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，ＦＡＳＥＢ Ｊ．２００７；２１：３０２９−４１。
心筋壊死マーカー
心血管疾患の因果経路に潜在的に関与する前述のタンパク質の多くとは異なり、トロポニンＩは、心筋細胞壊死及び心血管リスクの十分に確立されたマーカーである。
ＣＶＤ９リスクモデルの適用
ＣＶＤ９リスクを、各被験者について算出し、四分位数に分割し、得られた５年の無イベント生存率極性を図１１に示す。ＣＶＤ９に関するＱ４／Ｑ１ハザード比は、ディスカバリーセットでは８．２であり、バリデーションセットでは６．０であり、フラミンガム二次リスクスコア（これらの母集団で使用するために再校正された）については、Ｑ４／Ｑ１ハザード比は、ディスカバリーコホートでは２．８であり、バリデーションコホートでは２．３であった。
我々はまた、１年（国立心臓・肺臓・血液研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｅａｒｔ， Ｌｕｎｇ ａｎｄ Ｂｌｏｏｄ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｗｏｒｋｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ）によって推奨された時間点、Ｅａｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１０；１２１：１４４７−１４５４を参照されたい）における純再分類改善指数及びＣ統計量を用いて、ＣＶＤ９対フラミンガムモデルの比較性能、及びフラミンガムモデルについて、４年の最大検証対象期間において評価した。Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ｊ．２０００；１３９：２７２−２８１を参照されたい。表１３に示すように、ＣＶＤ９リスク予測モデルは、ディスカバリー／バリデーションコホートにおける、それぞれ０．１４／０．０９のＣ統計量及び０．５７／０．５４の無カテゴリーＮＲＩの増加によって明らかなように、判別における実質的な改善を実現させる。ＣＶＤ９モデルについては、バリデーションコホートにおいて、観測されたイベント率と予測されたイベント率との間の良好な一致（校正）がある。通常利用可能な臨床的及び人工統計学的パラメータ（年齢、性別、糖尿病、及び推算糸球体濾過量）の付加は、ＣＶＤ９モデルに対して意味のある改善をもたらさなかった（表１３）。全モデルについての比較性能データを表１３に示す。表２において、ＮＲＩ（＞０）＝無カテゴリー純再分類改善指標であり、ｅＧＦＲ＝推算糸球体濾過量である。
実施例４：考察
本研究において、我々は、これまでに行われた最大級のプロテオミクス解析におけるバイオマーカーディスカバリーを用いることによって、特に今後短期間に、心血管アウトカムの予測を改善しようとした。我々は、修正アプタマー技術を用いて、安定ＣＨＤを有する９３８人の患者のディスカバリーコホートにおいて１１３０種の血漿タンパク質を分析し、９７１人の患者の独立コホートにおける調査結果を検証した。ディスカバリーコホートにおいては、１１７種のタンパク質が、全体構成から２５％超のハザード比で、複合心血管エンドポイントの予後予測因子であることを見出した（表１４）。これらから、９種のタンパク質からなる多変量モデル（ＣＶＤ９）で、その性能が、文献に記載された（例えば、Ｅａｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１０；１２１：１４４７−１４５４；Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ｊ．２０００；１３９：２７２−２８１；及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００３；１０７：４９９−５１１を参照）従来のリスク因子または血液バイオマーカーのものよりも優れており、候補ベースのアプローチと比べて広範囲にわたるプロテオミクスの潜在的有効性を示すものを構築した。個々のバイオマーカータンパク質及びＣＶＤ９モデルは、典型的な実際の臨床現場で一貫する血液サンプルの低品質にもかかわらず、バリデーションコホートにおいて十分な再現性を有した。
予防及び治療戦略の適切な適用は、医療従事者が最も高いリスクの個体を標的に最も集中的な治療を行うことを可能にするリスク分離システムに依存する。Ｅａｇｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２０１０；１２１：１４４７−１４５４を参照されたい。一般的に用いられているアプローチは、従来型のリスク因子に基づくリスク判定に依存しており、限界がある。これらのリスク因子の多くは、慣習的またはさらに固定的な変更不可能な条件、例えば、性別、人種、加齢、または家族健康歴である。当然のことながら、これらは、短期的なリスクよりも長期（１０年間）または生涯のリスクを予測することにはるかに適している。従来型のリスク因子は、頻発するＣＨＤを有する被験者において特に不良な二次イベントを予測する。心血管イベントの高リスクを短期間において同定することは、これが、心血管疾患の予防、所定の治療の介入及び遵守を正確に示すために、重要な、満たされていないニーズを表す。
心血管リスク判定における従来のリスク因子を補足するために、いくつかの「オーミクス」技術が提案されている。例えば、ＭｃＳｈａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１３；５０２：３１７−３２０を参照されたい。これらの中で、ゲノムリスクスコアが、最も広範囲にわたって検討されている。共通の一塩基多型に基づくゲノムアプローチは、従来のリスク因子を超えてリスク判別または再分類を改善することに失敗しており、これは本研究でのＣＶＤ９プロテオミクススコアによって好影響を及ぼされた同じメトリック（ｃ統計量及び純再分類）によって判断されたものである。例えば、Ｐａｙｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ．２０１０；３０３：６３１−６３７；Ｒｉｐａｔｔｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ． ２０１０；３７６：１３９３−１４００を参照されたい。ゲノムアプローチが最終的に成功する場合であっても、遺伝的リスク因子が経時的に変化せず、それらの作用を一生涯にわたって受けるために、ゲノムアプローチは、短期間のリスクよりはむしろ長期間のリスクを予測する上での成功であると思われる。ゲノムアプローチと比較して、プロテオミクスは、いくつかの潜在的な利点を提供する。プロテオミクスは、環境的及び遺伝的影響を組み入れ、タンパク質レベルは経時的に変更することができ、治療の有益性または有害性あるいは生活様式の変化を反映し、これらのタンパク質は、多くの場合、疾患の因果経路内にあり、したがって療法の標的候補となる。例えば、Ｎｉｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００５；３５２：２９−３８；Ｒｉｄｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．２００９；３７３：１１７５−１１８２；及びＳｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１２；３６６：１１０８−１１１８を参照されたい。
少量の（＜１００μｌ）の血漿中の１１３０種のタンパク質を測定するために、改変されたアプタマーからなる新規なプロテオミクスのプラットフォームを用いた。我々は、心血管リスクの１１７種の候補タンパク質バイオマーカーを発見した（表１４）。注目すべきことに、これらのタンパク質の多くは、心血管リスクのバイオマーカーとして以前に報告されたことがないことである。これらのタンパク質から、我々は、生物学的アプローチよりはむしろ統計的アプローチ（変数減数法と併せたＬＡＳＳＯ）を用いて完全にパラメトリックなモデルを構築した。このプロセスにおいて、妥当なハザード比を有するいくつかのタンパク質は、これらがこのモデルにおいて既に存在するタンパク質によって捕獲されている情報を伝えるので除外し（例えばＣＲＰ）、一方、固有の情報を提供するため、より低い単変量ハザード比を有する他のタンパク質がそのまま保持される。ＬＡＳＳＯ選択タンパク質の生物学的機能が、本明細書に論じられている。
ＣＶＤ９タンパク質リスクスコアは、従来のリスク因子に依存するフラミンガム二次リスクスコアよりも優れた性能を発揮した。（Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｈｅａｒｔ Ｊ．２０００；１３９：２７２−２８１）。イベント母集団において著しく異なる、例えば、年齢、性別、糖尿病または推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）などの臨床的変量を二次モデルに含むことは、ディスカバリーコホートで四分位数範囲ハザード比及び純再分類改善指数において、ＣＶＤ９に軽度の改善のみをもたらした（表１３）。我々は提案してはいないが、ＣＶＤ９が、従来のリスク因子と関連するリスクの根底をなす生物学をすでに封入していることが可能あり、ＣＶＤ９または同様なモデルによるタンパク質判定がそれらに取って代わることが可能であり、なぜなら、後者が長期リスク及び治療の特定の標的のなおより良い指標であり得るからである。さらに、ＣＶＣ９タンパク質レベルは、特に過度のリスクにある患者に対して、フラミンガムよりも優れた、短期間の心血管リスクの個別化判定を提供し（図６及び７）、これはおそらく、これらが心血管合併症に関連する経路が活性されたかどうか、及び末端器官障害が発生したかどうかを示すためである（例えば、トロポニン；Ｂｅａｔｔｙ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＭＡ Ｉｎｔｅｒｎ Ｍｅｄ．２０１３；１７３：７６３−７６９を参照されたい）。
我々の研究は、大量処理の大規模なプロテオミクスのプラットフォームを用いる心血管リスクの大規模なプロテオミクス分析としては、初めてのものである。このアプローチは、多数の新規な個々のタンパク質バイオマーカーの発見をもたらし、二次心血管イベントの短期間のリスクを予測するために優れた性能を有する、ロバストな多変量リスク予測モデルの構築につながった。本研究は、大規模な、２つの大陸にまたがる、アウトカムイベントの判定により十分に特性評価されたコホートで行われた。米国国立癌研究所は、専門の科学者と共同して、臨床試験における患者管理をガイドするためのオーミクスベースの技術の準備状態を決定するために用いることができる基準のチェックリストを開発した。１つの実験室から報告されたオーミクスの所見がなぜ他の実験室で再現されないかという重要な理由として、標本の品質が留意される。したがって、我々は、代表的な学術研究機関（ハート・アンド・ソウル）及び臨床実施基準（ＨＵＮＴ３）を代表する標本の品質の範囲にわたってプロテオミクス分析を実施し、我々の所見は、この範囲の標本品質にわたってロバストである。
我々は、初期調査を確立された冠動脈性心疾患（ＣＨＤ）を有する高リスクの被験者集団に意図的に焦点を当てた。低リスクの一般集団において、またはＣＨＤを有する高リスクの個体においても、正確な心血管リスク予測のさらなる必要性がある。これらの研究は、他のコホートにおいて現在進行中である。別の制限は、我々が定量化した１１３０種よりも多くのタンパク質が血液中に存在することである。これらが同じ経路にあり、したがって我々がすでに判定したタンパク質と冗長化するとき、これらの判定が、心血管判定を改善するかどうかについては、まだ定かではない。本研究で報告されたよりもさらに多数のタンパク質を評価する研究も、同様に進行中である。
要約すれば、我々は、現在まで、２００万個を超える個々のタンパク質の測定を用いて、心血管リスクの最大級のプロテオミクス研究を成功裏に実施し、多数の新しい、リスクのバイオマーカーを同定し、優秀かつロバストな性能を有するリスク予測モデルを立証した。
実施例５：ＧＤＦ１１及びＦＳＴＬ３モデル
３つのコックスの比例ハザードモデルを生成し、比較した。
● ＧＤＦ１１：ＧＤＦ１１タンパク質を有する単変量タンパク質モデル
● ＦＳＴＬ３：ホリスタチン関連タンパク質３を有する単変量タンパク質モデル(ＦＳＴＬ３)
● ＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３：ＧＤＦ１１とＦＳＴＬ３との組み合わせのタンパク質モデル
モデル間の比較について、ＡＮＯＶＡ、線形予測器のＱ４／Ｑ１ハザード比、４年目のリスク確率のＮＲＩ、及び４年以内の統合ＡＵＣを算出した。ＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３モデルは、全評価法で最適のモデルであった。
外れ値のサンプルを、分析から除去した。全てのモデルを、底１０の対数に変換し算出し、標準化した。
２つのタンパク質をモデルに組み合わせる前に、スピアマン（Ｓｐｅａｒｍａｎ）相関を適用し、ＧＤＦ１１とＦＳＴＬ３との間の関係をチェックした。２つのタンパク質間の相間は、有意であったが（ｐ＝３．１２３〜１２）、スピアマンの相関は強くはなかった（ｒｈｏ＝−０．２２５１）。表１５は、Ｒの相関試験の結果を示す。
ＧＤＦ１１とＦＳＴＬ３との間の相関を図１５に示す。ＲＦＵを底１０の対数領域に変換した。左の図は、全てのサンプルの相関を示し、右の図は高いＧＤＦ１１を有した１つのサンプルが省かれていない相関を示す。黒色及び赤色の丸は、それぞれイベント無しサンプルと、イベント有りサンプルを意味する。
３つのコックス比例ハザードモデル、ＧＤＦ１１、ＦＳＴＬ３、及びＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３を生成した。ＧＤＦ１１、ＦＳＴＬ３モデルは、単一のタンパク質を有するコックスモデルであり、ＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３は２つのタンパク質を有する組み合わせモデルである。モデルをフィッティングさせる前に、外れ値を除去し、ＲＦＵ値を対数変換し、標準化した。表１６及び１７は、ＡＮＯＶＡ逸脱度表による単一モデルと組み合わせモデルとの間の比較を示す。組合せモデルは、単一タンパク質モデルよりも有意に改善されている。ＧＤＦ１１対ＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３及びＦＳＴＬ３体ＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３についてのｐ−値は、それぞれ２ｅ−１６及び３．５ｅ−０６である。
表１８は、各モデルについての線形予測器のＱ４／Ｑ１ハザード比を示す。組合せモデルは、単一モデルよりも高いハザード比を示す。四分位数は、各コックスモデルの線形予測器によって定義される。
図１６は、全てのモデルの各四分位数の生存率曲線を示す。第１〜第４の四分位数は、黒色、赤色、緑色及び青色で表示される（上から下に向かって、線は黒色、赤色、緑色、次いで青色である）。網掛けは、９５％の信頼区間を表す。ＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３モデルの第１の四分位数と第４の四分位数との間の距離は、単一タンパク質モデルよりも広い。さらに、ＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３モデルの第２の四分位数と第３の四分位数との間の距離は、単一タンパク質モデルよりも広い。
ＧＤＦ１１についての生存率曲線とＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３についてのものの間の比較を図３に示す。左の図は、低リスクグループの比較を示し、右の図は高リスクグループの比較を示す。黒色及び赤色は、それぞれ、ＧＤＦ１１及びＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３を表す。このモデルにおいて、ＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３モデルによって同定された低リスクグループは、ＧＤＦ１１モデルによって同定された低リスクグループよりも少ないイベントサンプルを有し、ＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３モデルによって同定された高リスクグループは、ＧＤＦ１１モデルによって同定された高リスクグループよりも多くのイベントサンプルを有した。したがって、ＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３モデルは、サンプルの両方のグループについてより正確であった。ＦＳＴＬ３の封入は、高及び低リスクグループの両方についてモデルを改善した。
ＮＲＩを、単一タンパク質モデルＧＤＦ１１及びＦＳＴＬ３と、ＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３との間で算出した。確率を４年以内で算出し、ベースラインハザードを、カプラン・マイヤー推定量で推定した。表中の下限値及び上限値は、ＮＲＩの９５％信頼区間の下限値及び上限値であり、ブートストラッピングによって推定される。ＧＤＦ１１は、イベントサンプルのＮＲＩを改善し、ＦＳＴＬ３は、非イベントサンプルのＮＲＩを改善する。
図１８は、ＧＤＦ１１とＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３との間（左）、及びＦＳＴＬ３とＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３との間（右）の４年目の確率の比較を示す。黒点、赤点、及び緑点は、４年における対照、ケース、及び打ち切りサンプルを表す。
４年以内の統合ＡＵＣ（Ｃ統計量）を表２０に示す。９５％信頼区間を、ＮＲＩと同様に、ブートストラッピングで算出した。
４年でのＲＯＣ曲線を図１９に示す。記号の番号は、４年でのＡＵＣを指す（非統合ＡＵＣ）。
３つのコックス比例ハザードモデルを、単一マーカーモデル及び組み合わせマーカーモデルに関して、いくつかの評価統計量と比較した。ＧＤＦ１１及びＦＳＴＬ３を含む組合せモデルは、全ての評価値に従って最高の力を発揮した。
以下のボックスは、本実施例で用いられた３つのモデルを示す。
実施例６：特定のイベントグループのためのＧＤＦ１１及びＦＳＴＬ３モデル
ＧＤＦ１１、ＦＳＴＬ３、及びＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３のコックスモデルを、ＣＨＦ及び死亡サンプル、ならびに血栓形成イベントサンプルに別々にフィッティングさせ、モデルが各ＣＶイベントタイプに対してどのように性能を発揮するかを決定した。モデルの線形予測器のＱ４／Ｑ１ハザード比、４年以内の統合ＡＵＣ（Ｃ統計量）、及び４年のリスク確率のＮＲＩを算出した。リスク確率の算出については、カプラン・マイヤー推定量をベースラインハザードとして用いた。
コックス比例ハザードモデルを、特定のイベントグループ：ＣＨＦ及び死亡グループ、ならびに血栓形成イベントグループを用いて、ＧＤＦ１１、ＦＳＴＬ３、及びＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３にフィッティングさせた。ＣＨＦ及び死亡グループは、ＣＨＦ（１２５人）、ＣＶＤＤｅａｔｈ（５５人）、Ｄｅａｔｈ（１３５人）、及びＮＯＮＥ（４７２人）を含む。血栓形成イベントグループは、ＭＩ（１０４人）、ＳＴＲＯＫＥ（３０人）、ＴＩＡ（１６）及びＮＯＮＥ（４７２人）を含む。ＮＯＮＥは非イベントサンプルであり、両グループで使用した。モデルの評価については、線形予測器のＱ４／Ｑ１ハザード比、４年以内の統合ＡＵＣ、及び４年のリスク確率のＮＲＩを算出した。リスク確率は、カプラン・マイヤー推定量をベースラインハザードで算出した。
表２１は、Ｑ４／Ｑ１ハザード比、ハザード比の逆数、及びその９５％信頼区間を示す。ＧＤＦ１１及びＦＳＴＬ３のＱ４／Ｑ１ハザード比は、ＤＨＦ．ＤＥＡＴＨ及び血栓形成イベントサンプルの間で有意な差はないが、ＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３のハザード比は、ＣＨＦ．ＤＥＡＴＨグループよりも血栓形成グループで良好である。
図１は、ＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３モデルの各グループの線形予測器の四分位数の生存率曲線を示す。第１〜第４の四分位数が、黒色（上の線）、赤色（２番目の線）、緑色（その下の３番目の線）及び青色（下の線）で表示されている。網掛けは、９５％の信頼区間を示す。血栓形成イベントの第１の四分位数（低リスクグループ）は、より少ない数のイベントを示す。これは、モデルが血栓形成イベントに対して非常に敏感であり得たことを示唆する。
４年以内の統合ＡＵＣ（Ｃ統計量）及び９５％信頼区間を表２２に示す。Ｑ４／Ｑ１ハザード比が、グループ間で異なることが見出されたが、Ｃ統計量では、ＣＨＦ．ＤＥＡＴＨグループと血栓形成イベントのグループとの間に有意差はない。
結論として、ＧＤＦ１１、ＦＳＴＬ３、及びＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３のコックスモデルは、特定のサンプルグループで生成された。ＧＤＦ１１．ＦＳＴＬ３モデルは、血栓形成イベントグループによるＱ４／Ｑ１ハザード比で、最良の結果を示した。Ｃ統計量については、全てのモデルが同様な結果を示した。
実施例７：ＧＤＦ１１及びＧＡＳＰ１／ＧＡＳＰ２モデル
ＧＤＦ１１と２種の他のタンパク質、ＧＡＳＰ１（ＷＤＩＫＫＮ２、ＳｗｓｓＰｒｏｔ Ｑ８ＴＥＵ８）及びＧＡＳＰ２（ＷＦＩＫＫＮ１、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ Ｑ９６Ｄ０９）との組み合わせも試験した。
以下の４つのコックスモデルを生成した：（１）ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１１タンパク質を有するコックスモデル；（２）ＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ１、ＧＤＦ１１及びＧＡＳＰ２を有するコックスモデル；（３）ＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ２、ＧＤＦ１１及びＧＡＳＰ１を有するコックスモデル；ならびに（４）ＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ１．ＷＦＩＫＫＮ２、ＧＤＦ１１、ＧＡＳＰ１、及びＧＡＳＰ２を有するコックスモデル。モデルを作成する前に、タンパク質測定値を、ガウス分布（０，１）に標準化させた。
線形予測器のＱ４／Ｑ１ハザード比を、これらのモデルについて算出した。Ｑ１グループを、低リスクグループと想定し、Ｑ４を高リスクグループと想定した。ＧＡＳＰ２（ＷＦＩＫＫＮ１）を付加することは、ＧＤＦ１１モデルを改善しないが、ＷＦＩＫＫＮ２を付加することは、いくらかの改善を示すこと（２．４３２から２．７１９までの）を見出した。Ｑ４／Ｑ１ハザード比の値及び四分位数の生存率曲線を表２３及び図２１に示す。
加えて、モデルをＡＮＯＶＡ逸脱度表で比較した。ＧＤＦ１１と組み合わせモデルとの間の比較のＲの結果を以下に示す。ＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ２及びＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ１．ＷＦＩＫＫＮ２は、ＧＤＦ１１モデルと比較する場合、有意であった（それぞれ、ｐ＝３．１ｅ―０５、０．０００１５）。ＷＦＩＫＫＮ１を付加することは、有意性を示さなかった（ｐ＝０．３８）。ｐ値は、以下に強調表示されている。
・ ＧＤＦ１１とＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ１との間の比較
＃＃ 逸脱度表の分析
＃＃ コックスモデル： 目的変数はｓである
＃＃ モデル １： 〜 ＧＤＦ１１．２７６５．４．３
＃＃ モデル２： 〜 ＧＤＦ１１．２７６５．４．３ ＋ ＷＦＩＫＫＮ１．３１９１．５０．２
＃＃ ｌｏｇｌｉｋ Ｃｈｉｓｑ Ｄｆ Ｐ（＞｜Ｃｈｉ｜）
＃＃ １ −２９３８
＃＃ ２ −２９３７ ０．７７ １ ０．３８
・ ＧＤＦ１１とＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ２との間の比較
＃＃逸脱度表の分析
＃＃ コックスモデル： 目的変数はｓである
＃＃ モデル １： 〜 ＧＤＦ１１．２７６５．４．３
＃＃ モデル ２： 〜 ＧＤＦ１１．２７６５．４．３ ＋ ＷＦＩＫＫＮ２．３２３５．５０．２
＃＃ ｌｏｇｌｉｋ Ｃｈｉｓｑ Ｄｆ Ｐ（＞｜Ｃｈｉ｜）
＃＃ １ −２９３８
＃＃ ２ −２９２９ １７．４ １ ３．１ｅ−０５ ＊＊＊
＃＃ −−−
＃＃ Ｓｉｇｎｉｆ． ｃｏｄｅｓ： ０ ‘＊＊＊’ ０．００１ ‘＊＊’ ０．０１ ‘＊’ ０．０５ ‘．’ ０．１ ‘ ’ １
・ ＧＤＦ１１とＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ１．ＷＦＩＫＫＮ２との間の比較
＃＃逸脱度表の分析
＃＃ コックスモデル： 目的変数はｓである＃＃ Ｍｏｄｅｌ １： 〜 ＧＤＦ１１．２７６５．４．３
＃＃ モデル ２： 〜 ＧＤＦ１１．２７６５．４．３ ＋ ＷＦＩＫＫＮ１．３１９１．５０．２ ＋ ＷＦＩＫＫＮ２．３２３５．５０．２
＃＃ ｌｏｇｌｉｋ Ｃｈｉｓｑ Ｄｆ Ｐ（＞｜Ｃｈｉ｜）
＃＃ １ −２９３８
＃＃ ２ −２９２９ １７．６ ２ ０．０００１５ ＊＊＊
＃＃ −−−
＃＃ Ｓｉｇｎｉｆ． ｃｏｄｅｓ： ０ ‘＊＊＊’ ０．００１ ‘＊＊’ ０．０１ ‘＊’ ０．０５ ‘．’ ０．１ ‘ ’ １
これらのモデルを評価するために、ＮＲＩ算出も行った。確率を４年以内で算出した。ＧＡＳＰ１（ＷＦＩＫＫＮ２）を付加することは、特に非イベントサンプルで（０．１２）、ＮＲＩを改善した（０．１６）。この結果から、ＧＡＳＰ１は、真陰性率を改善することが可能である。これと対照的に、ＧＡＳＰ２は、ＮＲＩを１を超えて改善することはできなかった。ＮＲＩのＲの結果を以下に示す。
・ ＧＤＦ１１とＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ１との間ＮＲＩ
＃＃ −−−−− ＧＤＦ１１ ｖｓ ＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ１ −−−−−
＃＃ 推定値 下限値 上限値
＃＃ ＮＲＩ ０．０５８５５ −０．０８１０９ ０．２０１２６
＃＃ ＮＲＩ＋ ０．０９２４５ −０．０２８８１ ０．２０４０５
＃＃ ＮＲＩ− −０．０３３９１ −０．１１１４２ ０．０４６７１
＃＃ Ｐｒ（アップ｜ケース） ０．５４６２７ ０．４８５８６ ０．６０１７５
＃＃ Ｐｒ（ダウン｜ケース） ０．４５３８２ ０．３９７６９ ０．５１４６７
＃＃ Ｐｒ（ダウン｜Ｃｔｒｌ） ０．４８３０３ ０．４４４３１ ０．５２３３６
＃＃ Ｐｒ（アップ｜Ｃｔｒｌ） ０．５１６９４ ０．４７６６５ ０．５５５７３
・ ＧＤＦ１１とＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ２との間のＮＲＩ
＃＃ −−−−− ＧＤＦ１１ ｖｓ ＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ２ −−−−−
＃＃ 推定値 下限値 上限値
＃＃ ＮＲＩ ０．１６３１５ ０．０２６３９ ０．３０６３
＃＃ ＮＲＩ＋ ０．０４４２２ −０．０７２３６ ０．１７２７
＃＃ ＮＲＩ− ０．１１８９２ ０．０４３５１ ０．１９１９
＃＃ Ｐｒ（アップ｜ケース） ０．５２２０６ ０．４６３９４ ０．５８６１
＃＃ Ｐｒ（ダウン｜ケース） ０．４７７８４ ０．４１３３８ ０．５３６３
＃＃ Ｐｒ（ダウン｜Ｃｔｒｌ） ０．５５９４８ ０．５２１７６ ０．５９６０
＃＃ Ｐｒ（アップ｜Ｃｔｒｌ） ０．４４０５６ ０．４０４０５ ０．４７８３
・ ＧＤＦ１１とＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ１．ＷＦＩＫＫＮ２との間のＮＲＩ
＃＃ −−−−− ＧＤＦ１１ ｖｓ ＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ１．ＷＦＩＫＫＮ２ −−−−−
＃＃ 推定値 下限値 上限値
＃＃ ＮＲＩ ０．１３４６０ −０．０１２７６ ０．２７５９
＃＃ ＮＲＩ＋ ０．０２７３２ −０．０９３１０ ０．１６４３
＃＃ ＮＲＩ− ０．１０７２８ ０．０２８６３ ０．１７５８
＃＃ Ｐｒ（アップ｜ケース） ０．５１３６４ ０．４５３５４ ０．５８２０
＃＃ Ｐｒ（ダウン｜ケース） ０．４８６３２ ０．４１７７９ ０．５４６７
＃＃ Ｐｒ（ダウン｜Ｃｔｒｌ） ０．５５３６５ ０．５１４２８ ０．５８７９
＃＃ Ｐｒ（アップ｜Ｃｔｒｌ） ０．４４６３７ ０．４１２１１ ０．４８５７
モデル間の４年目の確率を図２２に示す。
最終的に、モデル間の評価のために、ＡＵＣ算出を行った。以下の結果によれば、いずれのタンパク質もＧＤＦ１１モデルを改善しなかった。各モデルについてのＲＯＣ曲線を図２３に示す。各モデルについてのＲＯＣ曲線は、同様であった。
・ ＧＤＦ１１
＃＃ −−−−− −−−−−
＃＃ Ｃ統計量 下限値．９５ 上限値．９５
＃＃ １ ０．５８６ ０．５５７９ ０．６１４３
・ ＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ１
＃＃ −−−−− −−−−−
＃＃ Ｃ統計量 下限値．９５ 上限値．９５
＃＃ １ ０．５８４９ ０．５５７２ ０．６１３３
・ ＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ２
＃＃ −−−−− −−−−−
＃＃ Ｃ統計量 下限値．９５ 上限値．９５
＃＃ １ ０．５９９４ ０．５７１７ ０．６３０５
・ ＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ１．ＷＦＩＫＫＮ２
＃＃ −−−−− −−−−−
＃＃ Ｃ統計量 下限値．９５ 上限値．９５
＃＃ １ ０．５９８８ ０．５７１２ ０．６３
要約すると、ＧＡＳＰ１（ＷＤＫＫＮ２）は、ＧＤＦ１１モデルを改善することができるが、この改善は小さい。ＧＡＳＰ２（ＷＦＫＫＮ１）は、ＧＤＦ１１モデルを改善しなかった。
本実施例で用いられたコックスモデルを以下に示す。
・ ＧＤＦ１１
＃＃ コール：
＃＃ ｃｏｘｐｈ（式＝ ｆ， データ ＝ ｘ， ｘ ＝ Ｔ）
＃＃
＃＃ ｎ＝ ９３８， イベントの数＝ ４６５
＃＃
＃＃ ｃｏｅｆ ｅｘｐ（ｃｏｅｆ） ｓｅ（ｃｏｅｆ） ｚ Ｐｒ（＞｜ｚ｜）
＃＃ ＧＤＦ１１．２７６５．４．３ −０．３３２５ ０．７１７１ ０．０５７８ −５．７５ ８．７ｅ−０９ ＊＊＊
＃＃ −−−
＃＃ Ｓｉｇｎｉｆ． ｃｏｄｅｓ： ０ ‘＊＊＊’ ０．００１ ‘＊＊’ ０．０１ ‘＊’ ０．０５ ‘．’ ０．１ ‘ ’ １
＃＃
＃＃ ｅｘｐ（ｃｏｅｆ） ｅｘｐ（−ｃｏｅｆ） 下限値 ．９５ 上限値．９５
＃＃ ＧＤＦ１１．２７６５．４．３ ０．７１７ １．３９ ０．６４ ０．８０３
＃＃
＃＃ 一致度＝ ０．６０２ （ｓｅ ＝ ０．０１４ ）
＃＃ Ｒスクエア＝ ０．０３７ （可能な最大値＝ ０．９９８ ）
＃＃ 尤度比検定＝ ３５．６ ｏｎ １ ｄｆ， ｐ＝２．４２ｅ−０９
＃＃ ワルド検定 ＝ ３３．１ ｏｎ １ ｄｆ， ｐ＝８．７５ｅ−０９
＃＃ スコア（ログランク） 検定 ＝ ２６．６ ｏｎ １ ｄｆ， ｐ＝２．５３ｅ−０７
・ ＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ１
＃＃ コール：
＃＃ ｃｏｘｐｈ（式 ＝ ｆ， データ ＝ ｘ， ｘ ＝ Ｔ）
＃＃
＃＃ ｎ＝ ９３８， イベントの数＝ ４６５
＃＃
＃＃ ｃｏｅｆ ｅｘｐ（ｃｏｅｆ） ｓｅ（ｃｏｅｆ） ｚ Ｐｒ（＞｜ｚ｜）
＃＃ ＧＤＦ１１．２７６５．４．３ −０．３２０６ ０．７２５７ ０．０５９０ −５．４３ ５．６ｅ−０８ ＊＊＊
＃＃ ＷＦＩＫＫＮ１．３１９１．５０．２ −０．０４０９ ０．９５９９ ０．０４６６ −０．８８ ０．３８
＃＃ −−−
＃＃ Ｓｉｇｎｉｆ． ｃｏｄｅｓ： ０ ‘＊＊＊’ ０．００１ ‘＊＊’ ０．０１ ‘＊’ ０．０５ ‘．’ ０．１ ‘ ’ １
＃＃
＃＃ ｅｘｐ（ｃｏｅｆ） ｅｘｐ（−ｃｏｅｆ） 下限値．９５ 上限値 ．９５
＃＃ ＧＤＦ１１．２７６５．４．３ ０．７２６ １．３８ ０．６４６ ０．８１５
＃＃ ＷＦＩＫＫＮ１．３１９１．５０．２ ０．９６０ １．０４ ０．８７６ １．０５２
＃＃
＃＃ 一致度＝ ０．６０１ （ｓｅ ＝ ０．０１４ ）
＃＃ Ｒスクエア＝ ０．０３８ （可能な最大値＝ ０．９９８ ）
＃＃ 尤度比検定＝ ３６．４ ｏｎ ２ ｄｆ， ｐ＝１．２６ｅ−０８
＃＃ ワルド検定 ＝ ３４．３ ｏｎ ２ ｄｆ， ｐ＝３．５５ｅ−０８
＃＃ スコア（ログランク） 検定＝ ２８．８ ｏｎ ２ ｄｆ， ｐ＝５．６５ｅ−０７
・ ＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ２
＃＃ コール：
＃＃ ｃｏｘｐｈ（式 ＝ ｆ， データ＝ ｘ， ｘ ＝ Ｔ）
＃＃
＃＃ ｎ＝ ９３８， イベントの数＝ ４６５
＃＃
＃＃ ｃｏｅｆ ｅｘｐ（ｃｏｅｆ） ｓｅ（ｃｏｅｆ） ｚ Ｐｒ（＞｜ｚ｜）
＃＃ ＧＤＦ１１．２７６５．４．３ −０．３３６９ ０．７１４０ ０．０５７５ −５．８６ ４．６ｅ−０９ ＊＊＊
＃＃ ＷＦＩＫＫＮ２．３２３５．５０．２ ０．２０１４ １．２２３２ ０．０４８４ ４．１６ ３．２ｅ−０５ ＊＊＊
＃＃ −−−
＃＃ Ｓｉｇｎｉｆ． ｃｏｄｅｓ： ０ ‘＊＊＊’ ０．００１ ‘＊＊’ ０．０１ ‘＊’ ０．０５ ‘．’ ０．１ ‘ ’ １
＃＃
＃＃ ｅｘｐ（ｃｏｅｆ） ｅｘｐ（−ｃｏｅｆ） 下限値 ．９５ 上限値 ．９５
＃＃ ＧＤＦ１１．２７６５．４．３ ０．７１４ １．４０１ ０．６３８ ０．７９９
＃＃ ＷＦＩＫＫＮ２．３２３５．５０．２ １．２２３ ０．８１８ １．１１２ １．３４５
＃＃
＃＃ 一致度＝ ０．６０９ （ｓｅ ＝ ０．０１４ ）
＃＃ Ｒスクエア＝ ０．０５５ （可能な最大値＝ ０．９９８ ）
＃＃ 尤度比検定＝ ５３ ｏｎ ２ ｄｆ， ｐ＝３．１８ｅ−１２
＃＃ ワルド検定 ＝ ５０．７ ｏｎ ２ ｄｆ， ｐ＝９．６３ｅ−１２
＃＃ スコア （ログランク） 検定 ＝ ４２．１ ｏｎ ２ ｄｆ， ｐ＝７．２６ｅ−１０
・ ＧＤＦ１１．ＷＦＩＫＫＮ１．ＷＦＩＫＫＮ２
＃＃ コール：
＃＃ ｃｏｘｐｈ（式 ＝ ｆ， データ ＝ ｘ， ｘ ＝ Ｔ）
＃＃
＃＃ ｎ＝ ９３８， イベントの数＝ ４６５
＃＃
＃＃ ｃｏｅｆ ｅｘｐ（ｃｏｅｆ） ｓｅ（ｃｏｅｆ） ｚ Ｐｒ（＞｜ｚ｜）
＃＃ ＧＤＦ１１．２７６５．４．３ −０．３２９４ ０．７１９３ ０．０５８９ −５．６０ ２．２ｅ−０８ ＊＊＊
＃＃ ＷＦＩＫＫＮ１．３１９１．５０．２ −０．０２５６ ０．９７４７ ０．０４６６ −０．５５ ０．５８
＃＃ ＷＦＩＫＫＮ２．３２３５．５０．２ ０．１９８９ １．２２０１ ０．０４８６ ４．１０ ４．２ｅ−０５ ＊＊＊
＃＃ −−−
＃＃ Ｓｉｇｎｉｆ． ｃｏｄｅｓ： ０ ‘＊＊＊’ ０．００１ ‘＊＊’ ０．０１ ‘＊’ ０．０５ ‘．’ ０．１ ‘ ’ １
＃＃
＃＃ ｅｘｐ（ｃｏｅｆ） ｅｘｐ（−ｃｏｅｆ） 下限値 ．９５ 上限値 ．９５
＃＃ ＧＤＦ１１．２７６５．４．３ ０．７１９ １．３９ ０．６４１ ０．８０７
＃＃ ＷＦＩＫＫＮ１．３１９１．５０．２ ０．９７５ １．０３ ０．８９０ １．０６８
＃＃ ＷＦＩＫＫＮ２．３２３５．５０．２ １．２２０ ０．８２ １．１０９ １．３４２
＃＃
＃＃ 一致度＝ ０．６０９ （ｓｅ ＝ ０．０１４ ）
＃＃ Ｒスクエア＝ ０．０５５ （可能な最大値＝ ０．９９８ ）
＃＃ 尤度比検定＝ ５３．２ ｏｎ ３ ｄｆ， ｐ＝１．６２ｅ−１１
＃＃ ワルド検定 ＝ ５１．４ ｏｎ ３ ｄｆ， ｐ＝４．１ｅ−１１
＃＃ スコア （ログランク） 検定 ＝ ４３．７ ｏｎ ３ ｄｆ， ｐ＝１．７３ｅ−０９

Claims (44)

  1. 心血管（ＣＶ）イベントのリスクに関して被験者をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）ＭＭＰ１２、アンジオポイエチン−２、補体Ｃ７、心臓トロポニンＩ、アンジオポイエチン関連タンパク質４、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ、アルファ−１−抗キモトリプシン複合体、ＧＤＦ１１、及びアルファ−２−抗プラスミンから選択されるＮ種のバイオマーカーを含むバイオマーカーパネルを形成することであって、Ｎが、２〜９の整数である、前記形成することと、
    （ｂ）前記被験者からのサンプル中の前記パネルの前記Ｎ種のバイオマーカーのレベルを検出することと、を含む、前記方法。
  2. 被験者がＣＶイベントを有する可能性を予測する方法であって、
    （ａ）ＭＭＰ１２、アンジオポイエチン−２、補体Ｃ７、心臓トロポニンＩ、アンジオポイエチン関連タンパク質４、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ、アルファ−１−抗キモトリプシン複合体、ＧＤＦ１１、及びアルファ−２−抗プラスミンから選択されるＮ種のバイオマーカーを含むバイオマーカーパネルを形成することであって、Ｎが、２〜９の整数である、前記形成することと、
    （ｂ）前記被験者からのサンプル中の前記パネルの前記Ｎ種のバイオマーカーの前記レベルを検出することと、を含む、前記方法。
  3. 心血管（ＣＶ）イベントのリスクに関して被験者をスクリーニングする方法であって、前記被験者のサンプル中の、ＭＭＰ１２、アンジオポイエチン−２、補体Ｃ７、心臓トロポニンＩ、アンジオポイエチン関連タンパク質４、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ、アルファ−１−抗キモトリプシン複合体、ＧＤＦ１１、及びアルファ−２−抗プラスミンから選択される少なくとも５種の、少なくとも６種の、少なくとも７種の、少なくとも８種の、または全９種のバイオマーカーのレベルを検出することを含む、前記方法。
  4. 被験者がＣＶイベントを有する可能性を予測する方法であって、前記被験者のサンプル中の、ＭＭＰ１２、アンジオポイエチン−２、補体Ｃ７、心臓トロポニンＩ、アンジオポイエチン関連タンパク質４、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ、アルファ−１−抗キモトリプシン複合体、ＧＤＦ１１、及びアルファ−２−抗プラスミンから選択される少なくとも５種の、少なくとも６種の、少なくとも７種の、少なくとも８種の、または全９種のバイオマーカーのレベルを検出することを含む、前記方法。
  5. 心血管（ＣＶ）イベントのリスクに関して被験者をスクリーニングする方法であって、前記被験者のサンプル中の、ＧＤＦ１１及びＦＳＴＬ３のレベルを検出することを含む、前記方法。
  6. 被験者がＣＶイベントを有する可能性を予測する方法であって、前記被験者のサンプル中の、ＧＤＦ１１及びＦＳＴＬ３のレベルを検出することを含む、前記方法。
  7. 前記被験者が４年以内にＣＶイベントを有する前記可能性が、ＭＭＰ１２、アンジオポイエチン−２、補体Ｃ７、心臓トロポニンＩ、アンジオポイエチン関連タンパク質４、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ、及びアルファ−１−抗キモトリプシン複合体の前記レベルから選択される少なくとも５種、少なくとも６種、または全７種のバイオマーカーのレベルが、対応のタンパク質の対照レベルよりも高い場合、かつＧＤＦ１１及びアルファ２−抗プラスミンから選択される少なくとも１種のバイオマーカーまたは両方のバイオマーカーの前記レベルが、前記対応のタンパク質の対照レベルよりも低い場合に高い、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記被験者が４年以内にＣＶイベントを有する前記可能性が、ＧＤＦ１１の前記レベルが、ＧＤＦ１１の対照レベルよりも低い場合及び／またはＦＳＴＬ３の前記レベルが、ＦＳＴＬ３の対照レベルよりも高い場合に高い、請求項５または６に記載の方法。
  9. 前記ＣＶイベントが、血栓形成イベントである、請求項５、６、及び８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記血栓形成イベントが、心筋梗塞、卒中、及び一過性虚血発作から選択される、請求項９に記載の方法。
  11. 前記方法が、ＭＭＰ１２の前記レベルを検出することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  12. 前記方法が、アンジオポイエチン−２の前記レベルを検出することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記方法が、補体Ｃ７の前記レベルを検出することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記方法が、心臓トロポニンＩの前記レベルを検出することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記方法が、アンジオポイエチン関連タンパク質４の前記レベルを検出することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記方法が、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣの前記レベルを検出することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  17. 前記方法が、アルファ−１−抗キモトリプシン複合体の前記レベルを検出することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記方法が、ＧＤＦ１１の前記レベルを検出することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記方法が、アルファ−２−抗プラスミンの前記レベルを検出することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  20. 前記方法が、ＭＭＰ１２、アンジオポイエチン−２、補体Ｃ７、心臓トロポニンＩ、アンジオポイエチン関連タンパク質４、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ、アルファ−１−抗キモトリプシン複合体、ＧＤＦ１１及びアルファ−２−抗プラスミンの前記レベルを検出することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記被験者が、冠動脈疾患を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  22. 前記被験者が、ＣＶイベントの病歴を有さない、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  23. 前記被験者が、高い米国心臓病学会（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ）（ＡＣＣ）リスクスコアを有する、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記被験者が、中間のＡＣＣリスクスコアを有する、請求項２２に記載の方法。
  25. 前記被験者が、低いＡＣＣリスクスコアを有する、請求項２２に記載の方法。
  26. 前記被験者が、少なくとも１つのＣＶイベントを有したことがある、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
  27. 前記ＣＶイベントが、心筋梗塞、卒中、うっ血性心不全、一過性虚血発作、及び死亡から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  28. 前記サンプルが、血液サンプル、血清サンプル、血漿サンプル、及び尿サンプルから選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  29. 前記サンプルが、血漿サンプルである、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記方法が、インビトロで行われる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  31. 各バイオマーカーが、タンパク質バイオマーカーである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  32. 前記方法が、前記被験者からの前記サンプルのバイオマーカーをバイオマーカー捕獲試薬のセットと接触させることを含み、前記バイオマーカー捕獲試薬のセットの各バイオマーカー捕獲試薬が、検出される異なるバイオマーカーに特異的に結合する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  33. 各バイオマーカー捕獲試薬が、抗体またはアプタマーである、請求項３２に記載の方法。
  34. 各バイオマーカー捕獲試薬が、アプタマーである、請求項３３に記載の方法。
  35. 少なくとも１種のアプタマーが、遅い解離速度のアプタマーである、請求項３４に記載の方法。
  36. 少なくとも１種の遅い解離速度のアプタマーが、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、少なくとも９種、少なくとも１０種の、修飾を有するヌクレオチドを含む、請求項３５に記載の方法。
  37. 各遅い解離速度のアプタマーが、その標的タンパク質に、≧３０分、≧６０分、≧９０分、≧１２０分、≧１５０分、≧１８０分、≧２１０分、または≧２４０分の解離速度（ｔ１／２）で結合する、請求項３５または３６に記載の方法。
  38. ＣＶイベントの前記可能性が、前記バイオマーカーのレベルと、
    ｒ）心筋梗塞の既往、血管造影で１本またはそれよりも多くの冠血管で５０％を超える狭窄の証拠、トレッドミルまたは心臓核試験による運動誘発性虚血、または冠血行再建の既往からなる群から選択される心血管系リスク因子の存在に相当する情報、
    ｓ）前記個体の身体的な記述子に相当する情報、
    ｔ）前記個体の体重変化に相当する情報、
    ｕ）前記個体の民族性に相当する情報、
    ｖ）前記個体の性別に相当する情報、
    ｗ）前記個体の喫煙歴に相当する情報、
    ｘ）前記個体のアルコール摂取歴に相当する情報、
    ｙ）前記個体の職業歴に相当する情報、
    ｚ）前記個体の心血管疾患またはその他の循環系状態の家族歴に相当する情報、
    ａａ）前記個体または前記個体の家族におけるより高い心血管疾患リスクと相関する少なくとも１種の遺伝子マーカーの前記個体における存在または非存在に相当する情報、
    ｂｂ）前記個体の臨床症状に相当する情報、
    ｃｃ）その他の実験室試験に相当する情報、
    ｄｄ）前記個体の遺伝子発現値に相当する情報、
    ｅｅ）飽和脂肪が多く、高塩、高コレステロール濃度の食事などの既知の心血管系リスク因子の前記個体における消費に相当する情報、
    ｆｆ）心電図、心エコー検査、頚動脈内膜中膜厚の超音波診断、血流依存性血管拡張反応検査、脈波伝播速度、足関節上腕血圧比、ストレス心エコー検査、心筋血流イメージング、ＣＴによる冠動脈カルシウム検査、高分解能ＣＴ血管撮影法、ＭＲＩイメージング、及びその他のイメージング様式からなる群から選択される技術によって得られる前記個体のイメージング結果に相当する情報、
    ｇｇ）前記個体の薬物療法に関する情報、及び
    ｈｈ）前記個体の腎機能に関する情報から選択される追加の生物医学的情報の少なくとも１つの項目と、に基づく、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  39. 前記方法が、医療保険料または生命保険料を決定する目的に、ＣＶイベントの前記可能性を決定することを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
  40. 前記方法が、医療保険または生命保険の補償範囲または保険料を決定することをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
  41. 前記方法が、医療資源の利用を予測及び／または管理するために、前記方法から得られた情報を用いることをさらに含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
  42. 前記方法が、医療行為、病院、または企業を取得または購入するための決定を下すことを可能にするために、前記方法から得られた情報を使用することをさらに含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
  43. コンピュータにより実施される心血管（ＣＶ）イベントのリスクを評価する方法であって、
    コンピュータで被験者に関するバイオマーカー情報を検索することであって、前記バイオマーカー情報が、前記被験者からのサンプル中の、ＭＭＰ１２、アンジオポイエチン−２、補体Ｃ７、心臓トロポニンＩ、アンジオポイエチン関連タンパク質４、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ、アルファ−１−抗キモトリプシン複合体、ＧＤＦ１１、及びアルファ−２−抗プラスミンから選択される少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、または全９種のレベルを含む、前記検索することと、
    前記バイオマーカー値のそれぞれの分類を前記コンピュータで実行することと、
    複数の分類に基づいて、前記個体に関するＣＶイベントについてのリスクの前記評価の結果を表示することと、を含む、前記方法。
  44. ＣＶイベントのリスクの前記評価の前記結果を表示することが、コンピュータディスプレイ上に前記結果を表示することを含む、請求項４３に記載の方法。
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