JP4800384B2 - 腫瘍細胞及び刺激された白血球におけるｍＲＮＡの発現プロファイルに基づく腫瘍性疾患に対する免疫応答を予測する方法 - Google Patents

腫瘍細胞及び刺激された白血球におけるｍＲＮＡの発現プロファイルに基づく腫瘍性疾患に対する免疫応答を予測する方法 Download PDF

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本発明は、腫瘍組織における腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）スーパーファミリーのｍＲＮＡの発現プロファイル、及び循環白血球における腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーのｍＲＮＡの発現プロファイルに基づく腫瘍性疾患に対する哺乳類の免疫応答を予測する方法に関する。この方法では、腫瘍組織のサンプルが得られ、これらの組織で発現したＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群のｍＲＮＡを評価する。さらに哺乳類の全血にこの血液のＴ細胞を活性化する刺激因子を与え、この刺激因子に応答して発現レベルの有意な変化を示すＴＮＦスーパーファミリー亜群のｍＲＮＡを同定する。これらの腫瘍組織で発現したＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群に対応するＴＮＦスーパーファミリー亜群における発現レベルの変化を示す個体は、これらの疾患において予後の重症度が低いと予測される。
本出願は、２００５年６月８日に提出された米国仮出願特許第６０／６８８，７４４号及び２００５年１１月１１日に提出された同第６０／７３５，５０８号に対する優先権を主張する。
癌治療の様々な様式は、社会における様々な種類の力の使用になぞらえることができる。化学療法は、都市において軍事力を広範囲に使用するようなことであり、関連兵器の圧倒的な力によって、文民への巻き添え損害が起こる危険性がある。これに対して、ヒト体内における癌細胞の主要な致死因子である循環末梢血における白血球は、路上犯罪に対処する市街路を巡回する警察官のようなものである。同様に、白血球が体内において癌細胞に接触する場合、これらの細胞は癌標的に対する最初の応答因子である。白血球は、フローサイトメトリ又は免疫組織化学的染色技法を使用する細胞表面マーカーの形態分析及び特徴付けに基づいて、多くの群と亜群とに分類される。これらの群及び亜群は、その制服及び識別バッチによって警察官を識別するようなことである。末梢血１ｍｍ3当たりの白血球の数は、都市における警察官の数に対応する。
警察官が路上犯罪に遭遇したら、警察官は手にした武器でこの路上犯罪に対処しなければいけない。しかし、警察官は常に適切な武器を所持している訳ではない。同様に、細胞傷害性Ｔ細胞は、常に特異的な癌細胞に効く適切な抗腫瘍因子が与えられている訳ではない。癌細胞がＩｇＧで覆われていると、細胞傷害性Ｔ細胞はＩｇＧ Ｆｃ受容体（ＦｃＲγ）を介して癌細胞を認識する。このプロセスは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と呼ばれる。事実、ＩｇＧは抗ヒトＩｇＧで染色することにより癌の周辺で度々認識される（例えば、Richman AV著「良性及び悪性のヒト乳房組織の免疫蛍光研究(Immunofluorescence studies of benign and malignant human mammary tissue)」(J. Natl. Cancer Inst. 1976; 57:263-7)、及びKoneval T他著「頭頸部の扁平上皮細胞癌の腫瘍及び悪性組織における免疫グロブリンのデモンストレーション(Demonstration of immunoglobulin in tumor and marginal tissues of squamous cell carcinomas of the head and neck)」(J. Natl. Cancer Inst. 1977; 59: 1089-97)を参照のこと）。単核白血球の癌病巣への浸潤も、多くの場合に見られる。細胞傷害性Ｔ細胞の表面上のＦｃＲγは、警察官が所持する様々な武器の入ったバッグのようなものである。ＣＤ１６、ＣＤ３２及びＣＤ６４等の様々な種類のＦｃＲγは、様々な種類のバッグに相応する。警棒は最初の武器であり、いつでも攻撃できるように保持している。細胞傷害性Ｔ細胞では、警棒はパーフォリンに相応し（Nakanishi他著「ヒト結腸直腸癌に浸潤した白血球におけるパーフォリン発現(Perforin
expression in lymphocytes infiltrated to human colorectal cancer)」(Br. J. Canc
er 1991; 64: 239-42)を参照のこと）、これは前合成され、細胞傷害性Ｔ細胞のサイトゾルに保存され、ＦｃＲγ活性化の際に即座に放出される。使用できる状態である他の前合成された「警棒」としては、グランザイム、消化酵素トリプシンに関連するプロテアーゼ、及びキモトリプシンが挙げられ、これらは標的細胞でアポトーシスを誘発するように作用することができる。
警察官はより強力な銃も所持しており、これは細胞傷害性Ｔ細胞では腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に相当し得る。通常、細胞の文脈における（ＴＮＦ亜群の）「弾丸」は銃に装填されておらず、合成され、Ｆｃ受容体活性化の際にのみ細胞傷害性Ｔ細胞から放出される。ＴＮＦは、標的細胞の表面上に存在する特異的なＴＮＦ受容体と相互作用することにより、アポトーシスを誘導することができる。広範な標的細胞に対する致死活性を維持するために、様々な種類のＴＮＦリガンドが存在する（ＴＮＦスーパーファミリー（ＴＮＦＳＦと省略される）の一部として）。ＧｅｎＢａｎｋ及びＵｎｉＧｅｎｅ情報(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)によれば、ヒトＴＮＦスーパーファミリーは、全体で１７個のヒト成員において、最大でＴＮＦスーパーファミリー１８を包含し、幾つかが欠番し（１６及び１７）、同じ番号において複数の配列（１３Ａ及び１３Ｂ）が存在する。対応するＴＮＦ受容体（ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦと省略される））に関して、ヒトＴＮＦ−Ｒスーパーファミリーは、最大でＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群２１を包含する。ＴＮＦ／ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群の相互作用は厳密には特異的ではないが、表１で示されるように一般的に、それぞれのリガンドが特異的な受容体と反応し、３００を超える様々なＴＮＦスーパーファミリー亜群とＴＮＦ−Ｒスーパーファミリーとの組み合わせが存在する。
Figure 0004800384
適切なＴＮＦスーパーファミリー亜群が浸潤する細胞傷害性Ｔ細胞から放出される場合、癌の完全な根絶が起こり得る。癌が奇跡的に生存する稀なケースは、ＴＮＦスーパーファミリー亜群とＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群との組み合わせが完全である場合に起こり得る。
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、抗体と共に白血球の細胞溶解機能に関与する別の仕組みである（Perrussia他著「ヒトのナチュラルキラー細胞における抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び逆ＡＤＣＣ（転嫁細胞傷害性）に関するアッセイ(Assays for antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) and reverse ADCC (redirected cytotoxicity) in human natural killer cells)」(Methods Mol Biol. 2000; 121: 179-92)を参照のこと）。ＩｇＧのＦａｂ部分が標的細胞と結合すると、ＩｇＧのＦｃ部分が白血球上のＦｃ受容体を活性化し、その後これらの白血球が活性化することにより、標的細胞を攻撃する。ＡＤＣＣは長年研究されてきたが、ＡＤＣＣを伴うｉｎ ｖｉｔｒｏ実験の条件は、人工の溶液で懸濁された純粋な細胞系におけるエフェクター細胞傷害性Ｔ細胞と標的細胞との間の比に応じて変わる。さらに、細胞溶解は標的細胞からのアイソトープ（クロム−５１）の放出によって一般的に定量化されたので、観察された細胞溶解がパーフォリン又はＴＮＦのいずれを介して行われたのか知られていなかった。いずれのＴＮＦスーパーファミリー亜群がＡＤＣＣに関与しているのかも知られていない。
最終的に、白血球が癌と闘うさらなる重要な仕組みは、より多くの白血球を疾患部位に補充するためのケモカインの放出である。多くのこのようなサイトカインが発見されてい
る。特定のケモカインと補充される白血球の特定集団との間に相関関係は確立されていないが、ケモカイン放出及び白血球補充の現象が癌と闘うのに重要である。これに類似するのは、犯罪組織に立ち向かう警察官がより多くの援軍のために折り返し本部に無線連絡することであり得る。
手短に言うと、特定の癌マーカーを認識することができる適切な白血球のサブセットを育てるために、複雑な細胞メカニズムが必要であり、また適切な走化性因子を放出し、これらの成熟した白血球を病巣に引き込まなければいけないが、実際に癌の致死が２つの別々の方法で起こる。これらの白血球からのパーフォリンの放出、その後のＴＮＦの合成及び放出を介するアポトーシスの緩徐性で且つ持続性の誘導によって、即座に癌の致死が起こる（Vujanovic著「ナチュラルキラー細胞の抗腫瘍活性におけるＴＮＦファミリーリガンドの役割(Role of TNF family ligands in antitumor activity of natural killer cells」(Int. Rev. Immunol. 2001 Jun; 20(3-4): 415-37)を参照のこと）。ＴＮＦは、標的細胞表面上での特異的な受容体との結合を介してアポトーシスを誘導する。このことは、白血球が癌細胞に存在する受容体に対応する特異的なＴＮＦリガンド（複数可）を放出する必要があることを意味する。疾患の結果を予測するものとして、ＴＮＦ／ＴＮＦ受容体の比の実用性が考慮されてきたが（McDermott著「健康及び疾患におけるＴＮＦ及びＴＮＦＲの生物学(TNF and TNFR biology in health and disease)」(Cell. Mol. Biol. (Noisy-le-grand). 2001 Jun; 47(4): 619-35)を参照のこと）、癌細胞におけるＴＮＦ受容体のプロファイル、及び白血球におけるリガンドの誘導についてはほとんど知られておらず、またどのように適切な白血球集団が補充されるかも知られていない。
病理組織検体において癌部周辺のＩｇＧ沈着が見られる場合、このことは、患者が少なくとも癌を認識するＩｇＧを高めることができることを意味する。単核白血球の浸潤が癌集団(cancer mass)の周辺に存在する場合、このことは、患者の白血球が、癌と結合するＩｇＧの補体の活性化の間に、おそらくは走化性因子（Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、Ｃ５６７）の放出により（Becker著「補体誘導性因子（Ｃ３ａ、Ｃ５ａ及びＣ５６７）及び細菌の走化性因子の走化性挙動とそれらのウサギの多形核白血球のプロエステラーゼ１を活性化する能力との関係(The relationship of the chemotactic behavior of the complement-derived factors, C3a, C5a, and C567, and a bacterial chemotactic factor to their ability to activate the proesterase 1 of rabbit polymorphonuclear leukocytes)」(J. Exp. Med. 1972; 135: 376-87)を参照のこと）、何とか癌病巣に引き込まれることを意味する。癌細胞の表面上で発現したＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群の種類は、例えば、免疫染色（抗体が利用可能である場合）、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、又はｉｎ ｓｉｔｕ ＰＣＲ（配列はＧｅｎＢａｎｋから利用可能である）によって同定することができる。ＦｃＲγを未だに活性化することができないために、浸潤する単核細胞で発現したＴＮＦスーパーファミリー亜群の同定は難しいと考えられる。末梢血の白血球は増援された警察官のようなものなので、末梢血において適切で且つ完全に整った細胞傷害性Ｔ細胞を供給することは、癌に対する闘いにおいて必須の最初の工程である。このように、この方法は、末梢血の白血球における適切なＴＮＦスーパーファミリー亜群の誘導性を定量化することによって、それぞれの患者における抗癌免疫性を予測することを可能にする。
したがって、本発明の一実施の形態は、哺乳類の腫瘍性疾患の予後の重症度を予測する方法であって、哺乳類由来の全血の第１のサンプルにおいて、複数の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー亜群の発現レベルを求める工程、哺乳類の全血の第２のサンプルを全血においてＴ細胞を活性化する刺激因子に曝す工程、第２のサンプルにおいて、複数
の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー亜群の発現レベルを求める工程、第１のサンプルと第２のサンプルとの間で全血における発現レベルの有意な変化を示す亜群を同定する工程、及びＴＮＦスーパーファミリーの同定された亜群が、哺乳類の腫瘍細胞で発現する特定の腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）スーパーファミリー亜群に対応する場合、予後の重症度が低いと予測することを含む方法を提供する。
さらなる一態様において、腫瘍組織で発現するＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群が、ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群１Ａ、３、１２Ａ、及び１４から成る群より選択される。別の態様では、腫瘍組織で発現するＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群が同定される。さらなる一態様では、腫瘍組織で発現するＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群が、免疫染色、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕポリメラーゼ連鎖反応、及びｉｎ ｖｉｔｒｏポリメラーゼ連鎖反応から成る群より選択される方法により同定される。
さらなる一態様において、全血を曝すことがヘパリンの添加を包含する。別の態様では、刺激因子が、熱凝集ヒトＩｇＧ及び抗ヒトα／β Ｔ細胞受容体モノクローナルＩｇＧから成る群より選択される。さらなる一態様では、異常細胞により発現するＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群が、ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群１Ａ、１Ｂ、３、４、５、６、７、８、９、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１１Ａ、１１Ｂ、１２Ａ、１４、１７、１８及び２５から成る群より選択される。別の態様では、上記曝された全血で発現するＴＮＦスーパーファミリーのｍＲＮＡ亜群が、ＴＮＦスーパーファミリー亜群１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１３Ｂ、１４、１５及び１８から成る群より選択される。
別の態様において、本方法は、哺乳類由来の全血の第３のサンプルにおいて、複数のケモカインの発現レベルを求める工程、哺乳類の全血の第４のサンプルを全血においてＴ細胞を活性化する刺激因子に曝す工程、第４のサンプルにおいて、複数のケモカインの発現レベルを求める工程、及び上記第３のサンプルと上記第４のサンプルとの間の全血において、発現レベルの有意な変化を示すケモカインが同定された場合、予後の重症度が低いと予測することをさらに含む。さらなる態様では、ケモカインが、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１５、及びＩＬ１６から成る群より選択される。
本発明のさらなる一実施の形態は、哺乳類において腫瘍性疾患を処置するための食事成分の有用性を予測する方法であって、哺乳類の全血の第１のサンプルを得る工程、哺乳類の全血の第２のサンプルを食事成分に曝す工程、哺乳類の全血の第１のサンプル及び第２のサンプルを全血においてＴ細胞を活性化する刺激因子に曝す工程、哺乳類由来の全血の第１のサンプル及び第２のサンプルにおいて、複数のＴＮＦスーパーファミリー亜群の発現のレベルを求める工程、上記第１のサンプルと上記第２のサンプルとの間で上記全血における発現レベルの有意な変化を示す亜群を同定する工程、及びＴＮＦスーパーファミリーの同定された亜群が、哺乳類の腫瘍細胞で発現する特定のＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群に対応する場合、食事成分が腫瘍性疾患を治療する有用性がある可能性が高いと判定する工程を含む方法を提供する。
さらなる一態様において、第１のサンプルが、全血においてＴ細胞を活性化する刺激因子に曝される前に対照の刺激因子に曝される。別の態様では、腫瘍組織で発現するＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群が、ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群１Ａ、３、１２Ａ、及び１４から成る群より選択される。さらなる一態様では、腫瘍組織で発現するＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群が同定される。別の態様では、腫瘍組織で発現するＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群が、免疫染色、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕポリメラーゼ連鎖反応、及びｉｎ ｖｉｔｒｏポリメラーゼ連鎖反応から成る群より選択される方法により同定される。
ｍＲＮＡの定量
本発明者らは、全血の白血球における遺伝子発現の微小な変化を定量することができるＨｅｍ（Ａ）+系として知られる独自の技術を開発している。この技術は、米国特許出願第１０／７９６，２９８号及びＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０３６３０９号に詳細に記載されており、これらは共に参照により本明細書中に援用される（Mitsuhashi著「表現型遺伝子発現に基づく診断用モデルとしてのヒト血液の白血球におけるｍＲＮＡの絶対量測定(Absolute quatitation of mRNA in human blood leukocytes as a model for phenotypic gene expression-based diagnostics)」(Clin Chem, 52: 4 (2006))も参照のこと）。
この定量技法では、全血を９６ウェルのフィルタープレートに添加し、白血球を捕捉する。合成される外部対照ＲＮＡ及び特定のリバースプライマーの両方を含む溶解緩衝液をフィルタープレートに添加し、ハイブリダイゼーションのために、細胞溶解物をオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレートに移す。それから、オリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレートで、これらのプライマー部位からｃＤＮＡを合成する。特定のリバースプライマープライム化ｃＤＮＡを含む溶液をリアルタイムＰＣＲに使用する。オリゴ（ｄＴ）プライム化した固定化ｃＤＮＡを含むプレートをｃＤＮＡバンクとして保存することができる。
より詳細には、アッセイ手法は３つの主要工程から成る：（ａ）フィルタープレート上での白血球の単離及び溶解、（ｂ）オリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレートでのｍＲＮＡ単離、リバースプライマーハイブリダイゼーション、及びｃＤＮＡ合成、並びに（ｃ）リアルタイム定量ＰＣＲ。白血球減少膜（Ｌｅｕｋｏｓｏｒｂ、Pall）で集合化(assembly)することによって、特注の９６ウェルのフィルタープレートを例えばWhatman又はPallで製造することができる。これらのフィルタープレートを回収プレート上に置き、５ｍｍｏｌ／Ｌのトリス（ｐＨ７．４）１５０μＬを添加し、フィルター膜を湿らせる。この膜からトリス溶液を除去するために、４℃、１２０ｇで１分間遠心分離した後、十分に混合した全血サンプル５０μＬを各ウェルに添加し、直ぐに４℃、１２０ｇで２分間遠心分離する。それからウェルをリン酸緩衝生理食塩水３００μＬで１回洗浄する。生理食塩溶液を除去するために４℃、２０００ｇで５分間、遠心分離した後、ストック溶解緩衝液（５ｇ／ＬのＮ−ラウロイルサルコシン、４×標準クエン酸生理食塩水、１０ｍｍｏｌ／ＬのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ、１ｍＬ／ＬのＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０（ＮＰ−４０の代用）、１．７９ｍｏｌ／Ｌのチオシアン酸グアニジン（全てSigma製））６０μＬに１ｍＬ／Ｌの２−メルカプトエタノール(Bio-Rad)、０．５ｇ／ＬのプロテイナーゼＫ(Pierce)、０．１ｇ／Ｌのサケ精子ＤＮＡ(5 Prime Eppendorf/Brinkman)、０．１ｇ／Ｌの大腸菌ｔＲＮＡ(Sigma)、それぞれ５ｎｍｏｌ／Ｌの特定のリバースプライマー、及び１０9個の分子／Ｌの合成ＲＮＡ３４（外部対照として）をさらに加えて、フィルタープレートの各ウェルに添加する。それから、プレートを３７℃で１０分間インキュベートし、オリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレート(ＧｅｎｅＰｌａｔｅ、RNAture)上に置き、４℃、２０００ｇで５分間遠心分離する。４℃で一晩保存した後、マイクロプレートをプレーン(plain)溶解緩衝液１００μＬで３回、それから４℃で洗浄緩衝
液（０．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス（ｐＨ７．４）、１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ）１５０μｌで３回洗浄する。
ｃＤＮＡは、１×逆転写緩衝液（５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５．５ｍＭＭｇＣｌ2、１ｍＬ／Ｌトウィーン２０）、それぞれ１．２５ｍＭデオキシヌクレオシド三リン酸、４単位のｒＲＮａｓｉｎ、及び８０ＵのＭＭＬＶ逆転写酵素（プライマーを除いてPromega製）を含む緩衝液３０μＬを添加し、３７℃で２時間インキュベートすることによって、それぞれのウェルで直接合成することができる。それぞれ３０μＬの反応液からｃＤＮＡ４μＬを直接３８４ウェルのＰＣＲプレートに移し、ＴａｑＭａｎ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘｔｕｒｅ(Applied Biosystems)５μＬ及びオリゴヌクレオチドカクテル（それぞれ５μＭのフォワードプライマー及びリバースプライマー、及び１〜２μＭのＴａｑＭａｎプローブ）を添加する。ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ(Applied Biosystems)において、９５℃で１０分を１サイクル、その後９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、そして６０℃で１分を４５サイクルでＰＣＲを行うことができる。それぞれの遺伝子が別個のウェルで増幅される。サイクル閾値（Ｃｔ）、すなわち（蛍光に基づく）或る特定の量のＰＣＲ産物を発生するサイクルを分析用ソフトウェア（ＳＤＳ、Applied Biosystems）で判定する。
定量のための検量線を構築するために、フォワードプライマー及びリバースプラマーの配列並びにＴａｑＭａｎプローブを含む長い合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドがそれぞれの標的で合成される。例えば、対照ＲＮＡ３４のＴａｑＭａｎプローブは、ＣＣＡＡＧＧＣＣＣＡＧＣＣＣＴＣＡＣＡＣＡ（配列番号１）である。代替的には、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎのＰＣＲを用いることができる。それぞれのオリゴヌクレオチドをＨＰＬＣで９５％を超える純度まで精製することができる。各ＰＣＲには、１０〜１０6個の分子／これらの鋳型オリゴヌクレオチドのウェルが含まれる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドによって生成した対照ＲＮＡ３４の検量線を使用して、サンプルのＣｔ値を分子数／ＰＣＲのウェル（ｃＤＮＡ ４μＬ）に変換することができ、それから７．５（３０÷４）を掛けることにより、分子数／サンプル（ｃＤＮＡ ３０μＬ）を得る。ＲＮＡ３４の回収率は、これらの値を元の緩衝液６０μＬ（６×１０5＝１０7／ｍＬ×６０μＬ）におけるＲＮＡ３４の量で割ることにより得られる。天然ｍＲＮＡに関して、上記のようにそれぞれの検量線で分子数／ＰＣＲウェルを求め、それから７．５（３０÷４）を掛け、それぞれのサンプルにおけるＲＮＡ３４の回収率で割って、フィルタープレートのそれぞれのウェルに添加した血液量（通常５０μＬ）で割ることによって、これらの値を血液１μＬ当たりの分子数に変換する。平均（ＳＤ）を三重アリコートの全血から算出し、スチューデントｔ検定を統計分析に使用することができる。
複数の実施例において、上記のｍＲＮＡ定量系（Ｈｅｍ（Ａ）+）を使用することにより、ＴＮＦ受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のｍＲＮＡの発現プロファイルを様々な癌検体の間で特徴付けた。それから、ヘパリン化全血をマウス抗ヒトＴ細胞受容体モノクローナル抗体又は細胞傷害性Ｔ細胞介在性反応及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のｅｘ ｖｉｖｏモデルとしての熱凝集ＩｇＧでそれぞれ刺激することによって、ＴＮＦスーパーファミリー（ＴＮＦＳＦ）のｍＲＮＡの誘導性を定量化した。当該技術分野で既知の統計法を使用して、発現レベルの有意な誘導又は低減を算出した。ｐ値は０．０５以下を用いた。個体間のかなりの変動が見られることにより、本発明の実施例を個体に合わせた癌の免疫療法の基盤作りに利用することができることが示される。
上記のｍＲＮＡ定量方法を用いて、熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）を使用したｅｘ ｖｉｖｏ刺激の有り無しの両方で、全ての種類のＴＮＦスーパーファミリーのｍＲＮＡを定量し、これを免疫複合刺激のモデルとして用いた（Ostreiko他著「所定の分子量による熱凝集Ｉ
ｇＧ複合体の産出及び特徴付け：光散乱の研究(Production and characterization of heat-aggregated IgG complexes with predetermined molecular masses: light-scattering study)」(Immunol Lett. 1987; 15: 311-6)を参照のこと）。標的細胞と結合したＩｇＧ分子が白血球においてＦｃ受容体と高親和性で結合すると免疫複合体が形成され、Ｆｃ受容体の架橋及び白血球の活性化シグナルの発生を引き起こす。
それぞれ５０μＬのヘパリン化全血の三重アリコートを３７℃で２時間、２００μｇ／ｍＬのＨＡＧでインキュベートした。それから、血液サンプルを９６ウェルのフィルタープレートに添加し、白血球を捕捉して、上記のように、ポリ（Ａ）+ｍＲＮＡの単離のため、細胞溶解物を９６ウェルのオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレートに移した。ｃＤＮＡをマイクロプレート上で合成し、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎの蛍光をモニタリングすることにより、３８４ウェルのプレートでのリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用した（Morrison他著「増幅中の連続ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉモニタリングによる低コピー転写物の定量化(Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification)」(Biotechniques 1998; 24: 954-8, 960, 96)を参照のこと）。手短に言うと、ｃＤＮＡを水で３〜４倍に希釈すること及びｃＤＮＡ溶液４μＬを直接、３８４ウェルのＰＣＲプレートに移すことにより、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲを行い、これにｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ(BioRad, Hercules, CA)５μＬ及びオリゴヌクレオチドカクテル（それぞれ１５μＭのフォワードプライマー及びリバースプライマー）１μＬを添加し、ＰＲＩＳＭ７９００ＨＴ(ABI)において９５℃で１０分を１サイクル、その後９５℃で３０秒、６０℃で１分を４５サイクルでＰＣＲを行った。それぞれの遺伝子が別々のウェルで増幅された。分析用ソフトウェア（ＳＤＳ、ABI）でＣｔを求めた。プライマー二量体を全く用いずに、溶融曲線の分析において単一の適切なピークが検出するように、ＰＣＲ条件を慎重に最適化した。アッセイ条件を有効にするために、合成ＲＮＡ３４を溶解緩衝液に入れ、またこのＲＮＡ３４もリアルタイムＰＣＲにより定量した。プライマーの配列特異性をｂｌａｓｔ分析により確認した(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。或る特定の量のＰＣＲ産物を生成したＰＣＲサイクルと同様にＣｔを設定し、刺激サンプルのＣｔ値から非刺激サンプルのＣｔ値を引くことでデルタＣｔ（ΔＣｔ）も算出した。Ｃｔは対数尺度であるので、１ΔＣｔは２倍量又は２分の１量を意味し、負のΔＣｔは、発現の増大を示す。
結果を図１Ａ及び図１Ｂに示す。これらの図では、ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲによって、ＴＮＦＳＦのｍＲＮＡ（１〜１８）及び入れられた(spiked：スパイク)対照ＲＮＡ３４を定量した。３、２、１、０、−１、−２及び−３のΔＣｔ値は、それぞれ１／８、１／４、１／２、０、２、４、８倍の増大を示す。図１Ａでは、それぞれの記号は各個体の平均値である。記号○が有意な増大（ｐ＜０．０５）を示す一方で、記号△は有意な低減（ｐ＜０．０５）を示し、×は変化がないことを示す。図１Ｂは、同じ個体を使用して、２日間連続で分析を繰り返した結果を示す。記号は、それぞれの個体の平均±標準偏差である。それぞれ、●はＴＮＦＳＦ−２（ＴＮＦα）であり、▲はＴＮＦＳＦ−８であり、◆はＴＮＦＳＦ−１５である。実線は、２つのデータ組が同一である線である。点線は、±０．５ΔＣｔを示す。
この技法によって、血液の白血球において全ての成員のＴＮＦスーパーファミリーのｍＲＮＡの基礎レベルを検出することができた。図１Ａに示されるように、全血をＨＡＧに曝した場合、ＴＮＦスーパーファミリーのｍＲＮＡの有意な誘導が同定された。個体間の大きな変動が存在するが、有力なＴＮＦスーパーファミリーのｍＲＮＡは、ＴＮＦスーパーファミリー亜群２（ＴＮＦα）、８、及び１５であった。これらのｍＲＮＡは、それぞれ試験個体の８０％（１２／１５）、７３％（１１／１５）、及び６０％（９／１５）においてＨＡＧ誘導性応答を示した。ＴＮＦスーパーファミリー亜群１、３、４、６（すなわち、ＦａｓＬ）、７、９、１０（すなわち、ＴＲＡＩＬ）、１４、及び１８のｍＲＮＡ
は、少なくとも１つの試験個体においてＨＡＧ誘導性応答を示した。ＴＮＦスーパーファミリー亜群５、１１、１２、１３、及び１３ＢのｍＲＮＡは、いずれの試験個体においてもＨＡＧ誘導性応答を示さなかった。ＴＮＦスーパーファミリー亜群２、８及び１５のうちの少なくとも１つがそれぞれの試験個体のＨＡＧ曝露によって誘導された。例えば、ＨＡＧ誘導性のＴＮＦスーパーファミリー亜群２の応答を示さなかった３つの個体が全て、亜群１５の応答を示した一方で、ＨＡＧ誘導性の亜群１５の応答を示さなかった６つの個体は亜群２の応答を示した。ＴＮＦスーパーファミリー亜群８がＨＡＧ誘導性応答を示さなかった４つの個体は、亜群２又は亜群１５のいずれかにおいて応答を示した。図１Ａに示されるように、対照の入れられたＲＮＡ３４のΔＣｔは全て、±０．５以内であった。これらの実験をさらに有効にするために、２日間連続で２回、同じ個体から血液サンプルを得た。図１Ｂに示されるように、ＴＮＦスーパーファミリー亜群２、８、１５及びＲＮＡ３４の値は、標準偏差±０．５以内で再現性があった。それぞれのサンプルにおける三重全血アリコート内の変動も０．５ΔＣｔ未満であった（図１Ｂ、それぞれの記号のＸ−Ｙバー）。
この方法を以下のように一実施例に適用することができる。外科切除又は生検を受けた哺乳類患者から取り除いた癌検体をＩｇＧ沈着、単核白血球の浸潤、及び癌細胞で発現したＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群の種類について分析した。それから同じ個体から血液サンプルを得て、どの種類のＴＮＦスーパーファミリーのｍＲＮＡがＨＡＧ刺激によって誘導されるか、及びどの程度誘導されるかを求める分析を行った。個体を誘導されたＴＮＦスーパーファミリーと発現したＴＮＦ−Ｒとが適合する群、及びそれらが適合しない群に分類する。２つの群における臨床転帰の比較結果によって、適合群の予後の重症度が小さくなることが示される。早期の不可視の転移病変等を有する癌塊が小さい場合、適切なＴＮＦスーパーファミリー介在性の免疫系の攻撃は癌の再発を予防するのに十分であり得る。したがって、比較された臨床転帰は寛解期間、及び再発（転移）頻度を含む必要がある。
表１に示すように、ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー及びＴＮＦスーパーファミリーのｍＲＮＡのＤＮＡ配列をＧｅｎＢａｎｋからダウンロードして、以下の表２で示されるプライマー配列をＰｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ(Applied Biosystems)及びＨＹＢｓｉｍｕｌａｔｏｒ(RNAture)によって設計した。このような変異が存在する場合には、複数の転写物間で共通の領域でこれらの配列を設計した。ｃＤＮＡなし（プライマー二量体なし）では増幅は起こらず、融解曲線分析で単一ピークを検出した。
Figure 0004800384
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以下で修正されるような上記の方法で、それぞれのｍＲＮＡの量を求めた。手短に言うと、約１２５ｍｇの凍結癌検体を１％ ２−メルカプトエタノール(Bio Rad)、０．５ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ(Pierce)、０．１ｍｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡ(5 Prime Eppendorf/Brinkmann)、０．１ｍｇ／ｍＬの大腸菌ｔＲＮＡ(Sigma)、それぞれ１０ｍＭの特定のリバースＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群プライマー、及び外部対照として１０7個の分子／ｍＬの合成ＲＮＡ３４をさらに加えた溶解緩衝液１ｍＬに混合し、Ｐｏｌｙｔｒｏｎ(Brinkmann)で均質化させた。７０μＬのこれらの溶解物をｍＲＮＡ精製用のオリゴ（ｄＴ）固定化マイクロプレート（ＧｅｎｅＰｌａｔｅ、RNAture）に添加した。４℃で一晩のインキュベート後、マイクロプレートをプレーン溶解緩衝液１００μＬで３回、それから４℃で洗浄緩衝液（０．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス（ｐＨ７．４）、１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ）１５０μｌで３回洗浄した。１×ＲＴ緩衝液（５０ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌ、１０ｍｍｏｌ／ＬのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ2、ジチオスレイトールなし）、それぞれ１．２５ｍｍｏｌ／Ｌ
のｄＮＴＰ、４単位のｒＲＮａｓｉｎ、及び８０単位のＭＭＬＶ逆転写酵素（プライマーを除いてPromega製）を含む緩衝液３０μＬを添加し、３７℃で２時間インキュベートすることによって、それぞれのウェルでｃＤＮＡを直接合成した。１００μＬの水をこれらの３０μＬのｃＤＮＡに添加し、ｃＤＮＡ４μＬを３８４ウェルのＰＣＲプレートに移し、これにｉＴａｑ ＳＹＢＲ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ(BioRad)５μＬ及びプライマーカクテル（それぞれ１０μｍｏｌ／Ｌのフォワードプライマー及びリバースプライマー）１μＬを添加して、ＰＲＩＳＭ ７９００ＨＴ(Applied Biosystems)において、９５℃で１０分を１サイクル、その後９５℃で３０秒、６０℃で１分を４５サイクルでＰＣＲを行った。それぞれの遺伝子が別個のウェルで増幅された。或る特定の量のＰＣＲ産物（蛍光）を発生するＰＣＲのサイクルであったサイクル閾値（Ｃｔ）を分析用ソフトウェア（ＳＤＳ、Applied Biosystems）を使用して求めた。ｃＤＮＡなし（プライマー二量体なし）では増幅は確認されず、単一ピークを融解曲線分析で検出した。２０個の異なるｍＲＮＡ間で複数のサンプルを比較するために、それぞれのＣｔを同じサンプル由来のＴＮＦＲＳＦ１ＡのＣｔで引いた（ΔＣｔ、Ｙ軸）。正のＣｔは、ＴＮＦＲＳＦ１Ａより低い発現を意味し、１ΔＣｔは発現が半分であることを意味する。それぞれの記号は１つの検体の平均値を示す。図２の各列の左側（○◆）は、結腸、肝臓、胃、子宮等の腺癌、及び３つの症例の乳癌（◆）、並びにメラノーマのサンプルの結果を示す。右側（△）は、肺癌、咽頭癌、舌癌及び子宮頸癌等の扁平上皮細胞癌のサンプルの結果を示す。
抗ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）モノクローナル抗体によるヘパリン化全血におけるＴＮＦスーパーファミリーのｍＲＮＡの誘導の分析（その結果は図３に示される）に関しては、５μｇ／ｍＬの抗ＴＣＲα／β又は対照ＩｇＧによって三重で、３７℃で２時間だけ全血６０μＬを刺激した。上記のように、５０μＬの血液サンプルをフィルタープレートに添加し、白血球を補足した後、溶解緩衝液を添加することによって膜に溶解させた。上記のように、ポリ（Ａ）+ｍＲＮＡの精製、ｃＤＮＡ合成、及びリアルタイムＰＣＲを行った。抗ＴＣＲα／βのＣｔから対照ＩｇＧのＣｔ値を引くことでΔＣｔを算出した。それぞれの記号は単一個体の三重血液アリコートの平均ΔＣｔを示す。溶解緩衝液に入れられた合成ＲＮＡ３４も定量して、外部対照としてそれぞれのアッセイを有効にした。
或る特定の量のＰＣＲ産物（蛍光）を発生するＰＣＲのサイクルであったサイクル閾値（Ｃｔ）を分析用ソフトウェア（ＳＤＳ、Applied Biosystems）を使用して求めた。ＤＮＡチップ技術（Schena他著「相補的ＤＮＡマイクロアレイによる遺伝子発現パターンの定量的モニタリング(Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray)」(Science 1995; 270: 467-70)を参照のこと）によって、多くの遺伝子を同時に分析することができるが、正確に定量することができず、一般的に有意な結果として３倍を超える増大が必要になる。これに対して、上記のＤＮＡ定量技術は、それぞれのサンプルにおけるｍＲＮＡの回収及びｃＤＮＡ合成効率を考慮することにより、より正確な定量化を提供し、１５０％（１．５倍）ほどの小さい変化を統計的有意性をもって検出することができる。したがって上記のように、この方法で調製されたそれぞれ個別のｃＤＮＡ由来の各ｍＲＮＡをＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎリアルタイムＰＣＲで分析した(Morrison他著「増幅中の連続ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉモニタリングによる低コピー転写物の定量化(Quantification of low-copy transcripts by continuous SYBR Green I
monitoring during amplification)」(Biotechniques 1998 Jun; 24(6): 954-8, 960, 962）を参照のこと）。
図２は、様々な癌におけるＴＮＦ−ＲスーパーファミリーのｍＲＮＡ発現の結果を示す（結腸、乳房、肝臓、胃、子宮、メラノーマ、肺、咽頭、舌及び頸部）。２０個の異なるｍＲＮＡ間で複数のサンプルを比較するために、観察されたそれぞれのＣｔから同じサンプル由来のＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群１ＡのＣｔを引いた（ΔＣｔ、Ｙ軸）。正のＣｔ値は発現レベルがＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群１Ａよりも低いことを意味し
、１ΔＣｔは発現レベルが半分であることを意味する。図２で示されるように、ほとんど全ての癌組織は、ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群１Ａ、３、１２Ａ及び１４を高いレベルで発現した。このことは、癌浸潤白血球が、浸潤部位でＴＮＦスーパーファミリー亜群１（すなわち、リンホトキシン）（ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群３に対応）、ＴＮＦスーパーファミリー亜群２（すなわち、ＴＮＦα）（ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群１Ａ及び１Ｂに対応）、ＴＮＦスーパーファミリー亜群１２（ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群１２Ａに対応）、ＴＮＦスーパーファミリー亜群１４（ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群１４に対応）、又はこれらのリガンドの組み合わせを産出することができる場合、これらの種類の癌を全て根絶することができることを示している。ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群４、５、８、９、１１Ａ及び１１Ｂ、並びに１７の発現レベルは評価されたサンプルにおいて非常に低かったが（図２）、他のサンプルがこれらの受容体亜群を発現する可能性を無視することはできない。したがって、白血球におけるＴＮＦスーパーファミリー亜群４（ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群４に対応）、ＴＮＦスーパーファミリー亜群５（すなわち、ＣＤ４０リガンド）（ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群５に対応）、ＴＮＦスーパーファミリー亜群８（すなわち、ＣＤ３０リガンド）（ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群８に対応）、並びにＴＮＦスーパーファミリー亜群１３及び１３Ｂ（ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群１７に対応）の誘導性も、癌免疫療法には重要であり得る。個体間で非常に大きな変動が存在するが、白血球におけるＴＮＦスーパーファミリー亜群６（すなわち、Ｆａｓリガンド）（ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群６に対応）、ＴＮＦスーパーファミリー亜群７（すなわち、ＣＤ２７リガンド）（ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群７に対応）、ＴＮＦスーパーファミリー亜群１１（ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群１１Ａ及び１１Ｂに対応）、ＴＮＦスーパーファミリー亜群１８（ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群１８に対応）、及びＴＮＦスーパーファミリー亜群１５（すなわち、ＤＲ３のリガンド）（ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群２５に対応）の誘導性は、対応する受容体の発現レベルが高い癌にとって重要であり得る。ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群１０ＡのｍＲＮＡが癌において高い発現を示したが、囮受容体ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群１０Ｂ（Sheridan他著「ファミリーのシグナル及び囮受容体によるＴＲＡＩＬ誘導性アポトーシスの制御(Control of TRAIL-induced apoptosis by a family of signaling and decoy receptors)」(Science 1997 Aug 8; 277(5327): 818-21)及びPan他著「ＴＲＡＩＬに関するアンタゴニスト囮受容体及び致死ドメイン含有受容体(An antagonist decoy receptor and a death domain-containing receptor for TRAIL)」(Science 1997 Aug 8; 277(5327): 815-8)を参照のこと）のｍＲＮＡ発現はＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群１０Ａより高かった。それにもかかわらず、依然としてＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群１０（すなわち、ＴＲＡＩＬ）は、幾つかの癌の治療に有用な標的であり得る。腺癌／メラノーマ（図２のそれぞれの列の左側に示される）と扁平上皮細胞癌（図のそれぞれの列の右側に示される）との間に大きな差はない。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、特定の外部の非自己分子を認識する細胞傷害性Ｔ細胞の細胞表面分子である。抗原提示及び癌致死の最初の工程におけるＴＣＲの役割が既知である（例えば、Mami-Chouaib著「ヒト肺癌における抗腫瘍細胞傷害性Ｔリンパ球応答：腫瘍関連抗原の同定(Antitumor cytotoxic T-lymphocyte response in human lung carcinoma: identification of a tumor-associated antigen)」(Immunol Rev. 2002 Oct; 188: 114-21)を参照のこと）。細胞免疫学における一般的な実験は人工溶液に懸濁された単離細胞を使用する純粋な細胞系を用いるが、本実施例で用いたｍＲＮＡアッセイによって、全血のｅｘ ｖｉｖｏ刺激後の様々なｍＲＮＡレベルの変化の同定が可能になる。後者が前者の純粋な細胞系より生理的であるため、本実施例は細胞間及び細胞−プラズマ間の相互作用が存在する全血におけるＴＣＲ標的分子相互作用の刺激を利用する。
全血には、細胞傷害性Ｔ細胞だけでなく、他の種類の白血球も含まれるので、ＴＣＲは、抗ヒトα／β ＴＣＲマウスモノクローナルＩｇＧ１ ｋにより特異的に刺激された（
「抗ＴＣＲ」(BioLegend製)）。対照として、同じ濃度の精製マウスＩｇＧ１ ｋ(これもBioLegend製)も使用した。６０μＬの全血を５μｇ／ｍＬの抗ＴＣＲ又は対照ＩｇＧにより三重で３７℃で２時間だけ刺激した。末梢血の白血球におけるＴＮＦＳＦのｍＲＮＡ発現に関する抗ＴＣＲ抗体の効果の予後分析によって、用量及びインキュベート時間を決定し、その結果を図４Ａ及び図４Ｂに示す。用量応答及び動態に関して、図４Ａに示されるように、それぞれ６０μＬのヘパリン化全血の三重アリコートをＰＢＳ（○）、１０（■）若しくは１（◆）μｇ／ｍＬのマウス抗ヒトα／β ＴＣＲ ＩｇＧ１ ｋ、又は１０（□）若しくは１（◇）μｇ／ｍＬの精製マウスＩｇＧ１ ｋと混合し、３７℃で０〜７時間インキュベートした。それから上記のように、ＴＮＦＳＦ−２のｍＲＮＡを定量した。動態に関して、図４Ｂに示されるように、ＴＮＦＳＦ−２（●）、ＴＮＦＳＦ−５（◇）、ＴＮＦＳＦ−６（△）、ＴＮＦＳＦ−９（□）、及びＴＮＦＳＦ−１４（▲）のＣｔ値から対照ＩｇＧのＣｔ値を引くことにより、それぞれのΔＣｔを算出した。それぞれのデータは、全血の三重アリコートの平均±標準偏差であった。抗ＴＣＲを使用して得たＣｔ値から対照のＩｇＧを使用して得たＣｔ値を引くことによって、ΔＣｔを算出した。
図３に示されるように、抗ＴＣＲ刺激はＴＮＦスーパーファミリー亜群２、５、６、９、１０及び１４を特異的に誘導した。これらの受容体のｍＲＮＡの発現レベルが全ての種類の癌で高かったので（図２を参照のこと）、ＴＮＦスーパーファミリー亜群２及び１４の結果は特に興味深い。複数のＴＮＦ／ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群関連のカスケードの同時活性化によって、併用化学療法と同程度まで癌細胞の耐性機構を抑制することができる。溶解緩衝液に入れた対照の合成ＲＮＡ３４により得られた結果は、±０．３ΔＣｔ未満の非常に小さい変化を示し（図３のＲＮＡ３４）、これによりこのアッセイ系は信頼性があることが示唆される。さらに重要なことに、ＴＣＲ応答が個体間のかなりの変動を示し、９つの内の６つ（６６％）、及び９つの内の５つ（５６％）の個体がＴＮＦスーパーファミリー亜群２及び１４それぞれで、抗ＴＣＲ介在性誘導を示さなかった。さらに、ＴＮＦスーパーファミリー亜群２の応答が負を示した個体は、ＴＮＦスーパーファミリー亜群１４の応答も負を示した。しかし、これらの個体は、他のＴＮＦスーパーファミリーリガンドにおいては正を示した。
本実施例において、実施例１のように、ＡＤＣＣで見られる免疫複合体のモデルとして広く使用される熱凝集ヒトＩｇＧ（ＨＡＧ）を使用して、全血において白血球のＦｃ受容体を刺激した。手短に言うと、ヒトＩｇＧ(Sigma)を２０ｍｇ／ｍＬのＰＢＳに懸濁し、６３℃で２０分間加熱した。２００μｇ／ｍＬのＨＡＧ又は対照のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）により三重で、３７℃で２〜４時間だけ６０μＬの全血を刺激した。図５及び図６に示されるように、ＨＡＧの用量及びインキュベート時間を予備分析によって決定した。
図５Ａは、用量応答の分析結果を示す。それぞれ６０μＬのヘパリン化全血の三重アリコートを様々な濃度のヒトＩｇＧ（○）又はＨＡＧ（●）と混合し、３７℃で２時間インキュベートした。図５Ｂは動態の分析結果を示す。それぞれ６０μＬのヘパリン化全血の三重アリコートをＰＢＳ（○）又は２００ｍｇ／ｍＬのＨＡＧ（●）と混合し、３７℃で０〜１２時間インキュベートした。それから、ＴＮＦＳＦ−１５のｍＲＮＡを定量した。それぞれのデータは、全血の三重アリコートの平均±標準偏差であった。
図６は、再現性の分析結果を示す。１〜３日以内で同じ個体から血液を採取し、ＨＡＧ誘導性ＴＮＦＳＦのｍＲＮＡ及び対照ＲＮＡ３４を定量した。記号はそれぞれ、○：ＲＮＡ３４、●：ＴＮＦＳＦ−２、◆：ＴＮＦＳＦ−８、及び▲：ＴＮＦＳＦ−１５を示す。それぞれのデータは、全血の三重アリコートの平均±標準偏差であった。実線は２つのデータが同一である線である。点線は±０．５ΔＣｔを示す。
図７に示されるように、ＨＡＧは主に、ＴＮＦスーパーファミリー亜群２、８、１４、１５及び１８の発現を誘導した。ＴＮＦスーパーファミリー亜群１５の誘導は、抗ＴＣＲ刺激で得られたＴＮＦスーパーファミリー亜群の誘導より高かった（図３）。さらに、ＨＡＧ応答は個体間でかなりの変動を示した。幾つかの個体はＴＮＦスーパーファミリー亜群１５のみを発現し、それ以外の個体はＴＮＦスーパーファミリー亜群１５の応答なしで、ＴＮＦスーパーファミリー亜群２及び８を発現した。興味深いことに、全ての個体が少なくとも１つのＴＮＦスーパーファミリー応答を示した。溶解緩衝液に入れた対照ＲＮＡ３４の結果は、±０．６ΔＣｔ未満の非常に小さい変化を示し（図３のＲＮＡ３４）、それによりこのアッセイ系は信頼性があることが示唆された。アッセイの再現性を試験するために、１〜３日以内で２回同じ個体から血液を採取した。しかし結果は、ΔＣｔ差が０．５未満で非常に類似していた（図６）。ＨＡＧ及び抗ＴＣＲ刺激を独立して使用して血液を試験した９つの個体の中で、ＨＡＧ刺激で誘導したＴＮＦスーパーファミリー亜群１５の発現応答は、抗ＴＣＲ刺激で誘導したＴＮＦスーパーファミリー亜群２及び１４の発現応答と相関関係がなかった。
本実施例において、幾つかの個体由来の全血をＨＡＧ刺激して、ケモカイン群のｍＲＮＡレベルの変化を実施例１に記載のと同じように評価した。ＲＮＡ３４及びＣＤ４のｍＲＮＡを対照として用いた。分析されたケモカインのｍＲＮＡのフォワードプライマー配列及びリバースプライマー配列は図８に示される。
分析結果を図９に示す。この図では、丸は、特定のケモカインのｍＲＮＡレベルがＨＡＧ刺激によって有意に誘導された個体を示す。三角は、刺激後のｍＲＮＡレベルの有意な低減を示し、記号Ｘは有意な変化がないことを示す。図９から分かるように、応答は個体間で異なるが、例えば、全ての試験個体がＣＣＬ−３及びＣＣＬ−２０、ＣＸＣＬ−１、ＣＸＣＬ−２、及びＣＸＣＬ−３、並びにＩＬ−８及びＩＬ−１Ｂの有意な誘導を示したという共通点が存在した。
これらの結果によって、癌患者が疾患領域により多くの白血球を補充することができる可能性を確認することができることが示され、特定のケモカインと特定の白血球集合との間に相関関係が確立される場合、図９に示されるようなデータを使用して、補充された白血球集合と腫瘍細胞との間のＴＮＦ／ＴＮＦ−Ｒ適合分析に基づいて、腫瘍を効果的に攻撃できる白血球集合を補充する可能性を判断することができる。
本実施例において、ＴＮＦスーパーファミリー亜群３のｍＲＮＡレベルのＨＡＧ誘導性変化に対するサプリメント等の様々な食事成分の効果を評価した。「食事成分」は、哺乳類が消化することのできる任意の化合物又は物質を指し、「食事サプリメント(dietary supplements)」は、哺乳類の食事を補助するのに使用されるこれらの有益な食事成分（例えば、ビタミン及び天然抽出物）並びに調合薬等の他の化学化合物を示す。このように、「食事成分」は意味が広く、その中に「食事サプリメント」が含まれる。用いられる食事成分は、ビタミンＡ（最終濃度１０ｎＭ）、ゲニステイン（ダイズ）（１００ｎＭ）、クルクミン（香辛料のウコン）（１００ｎＭ）、及びケルセチン（植物色素のフラボノイド）（１００ｎＭ）であった。これらの食事成分は全て、免疫系若しくは癌又はその両方に対する効果が報告されている。ビタミンＡは免疫系を刺激することが知られている。ゲニステインは抗癌性の活動を有することが幾つかの研究で見出されており、考え得る活動機構としては、アポトーシスの上方調節、血管形成の阻害、ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩの阻害及びタンパク質チロシンキナーゼの阻害が挙げられる。クルクミンは腫瘍細胞においてアポトーシス促進効果があり、転写因子ＮＦ−κＢの活性を阻害し、このような細胞に
おいて強く過剰発現することが多い。ケルセチンは、ラットにおけるナチュラルキラー細胞の活性をブースト化すること並びにマスト細胞、好塩基球及び好中球の脱顆粒を阻害することが示されている。この実施例において、リン酸緩衝生理食塩水を対照として用いた。
ヘパリン化全血を（上記のような血液濃度で）３７℃で１時間、様々な食事サプリメントで前インキュベート(pre-incubated：前培養)した後、４時間、１．２μＬの熱凝集ＩｇＧで刺激した。それから、血液を３７℃で２時間インキュベートした。それから、実施例１に記載の方法を使用して、ＴＮＦスーパーファミリー亜群３のｍＲＮＡのレベルを評価した。プライマー配列を上記の表２で与える。ＴＮＦスーパーファミリー亜群３は、リンホトキシン−α（ＬＴα）、腫瘍壊死因子−β（ＴＮＦ−β）、及びリンホトキシン−β（ＬＴβ）としても知られている。分泌されたＬＴαが可溶性ホモ三量体ＬＴα３として集合化する。分泌されたＬＴαが膜関連ＬＴβと複合体化して、２種類のヘテロ三量体、ＬＴα１／β及びＬＴα２／β１を形成する。亜群３が、活性化した未感作ＣＤ４細胞、非偏極(unpolarized)ＩＬ−２分泌エフェクター及びＴｈ１エフェクターによって発現され、亜群３に特異的な受容体を幾つかの腫瘍細胞により発現する。
結果を図１０に示す。図１０では、白丸がＰＢＳ対照を使用して得られたＴＮＦスーパーファミリー亜群３の値を示す一方で、黒丸はＨＡＧ刺激を使用したときに得られた亜群３の値を示す。亜群３のｍＲＮＡの基礎レベルは、食事サプリメントによる前処理では変わらなかった（白丸）。しかしこの結果は、ＨＡＧによって、ケルセチンに曝した血液中のＴＮＦスーパーファミリー亜群３の発現の有意な（ｐ＝０．０３）誘導が引き起こされたことを示している。この個体も適切なＴＮＦ−Ｒ亜群（亜群３）を発現する腫瘍細胞を有する場合、この遺伝子の発現の増大によって腫瘍のアポトーシスが増大され得るので、ケルセチンは、この個体における抗癌特性を有する食事に含まれる良好な候補物質である。図１０のＹ軸の値はサイクル閾値（Ｃｔ）を示す。それぞれの記号は、ヘパリン化全血５０ｍＬの三重アリコートの平均±標準偏差である。
当業者には、特定のＴＮＦスーパーファミリー亜群又はケモカインの発現における同様の効果に関して、調合薬及び他の化学化合物をスクリーニングすることも可能であるので、本実施例の系を広く利用し、特定の個体の癌に対する免疫応答を増大させるのに有用である物質に関してスクリーニングすることができることが理解されよう。
癌浸潤白血球は、病理学試験によって外科切除した組織検体で度々観察される。しかし、これらの発見が常に患者におけるはっきりした良好な徴候である訳ではなく、白血球の浸潤が存在する場合でさえ、癌の進行が起こる場合がある。これが起こると、病理学者は当惑することが多い。本実施例は、この技法のさらなる改良を提供し、特にケモカインの誘導も実証される場合に、癌細胞のＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群と浸潤白血球のＴＮＦスーパーファミリー亜群とを適合することが良好な予後の徴候であり得る。本発明者らはそれぞれの白血球が癌細胞を包含しているか否か、及びＴＮＦスーパーファミリーのカスケードが活性化しているか否かを知らないので、浸潤白血球の病理分析を解釈することは困難である。定量化した基線のＴＮＦスーパーファミリーのｍＲＮＡのレベルも解釈することが困難である。代わりに、本発明の実施例は、抗ＴＣＲ又はＨＡＧ刺激後のＴＮＦスーパーファミリーのｍＲＮＡ亜群の発現の機能的変化の分析を利用する。浸潤白血球が血流によってもたらされるので、本実施例のｅｘ ｖｉｖｏ機能アッセイは、診断、治療的モニタリング、予後マーカー並びに効果的自己免疫調節剤、モノクローナル抗体系薬、遺伝子治療及びワクチンの同定に関して、癌患者だけでなく、自己免疫疾患、炎症、移植等の他の疾患を患う患者においても免疫機能の分析に有用なツールである。このアッセイは単純で、生理学的であり（白血球を単離せず２〜４時間の全血のインキュベート）、有意な統計分析により正確であり（開始材料として全血の三重アリコート）、且つ感度が
高い（全血６０μＬが全ての１７個のＴＮＦスーパーファミリー亜群のｍＲＮＡの定量化に十分である）。全血の三重アリコート間のｍＲＮＡデータにおける非常に小さい変動のために、アッセイが、多くの場合、０．５〜１．０ΔＣｔ程の小さい遺伝子発現における有意な変化を確認することが可能であり、このことはＤＮＡチップに基づく方法論又は従来のリアルタイムＰＣＲよりもはるかに良好である。それぞれの細胞集合が特定の細胞表面マーカーで同定される場合、ＮＫ細胞又は細胞傷害性Ｔ細胞の数は、フローサイトメトリー分析又は免疫組織化学染色で定量することができる。しかし、これらのマーカー陽性細胞がこの分析の時に実際に予測される機能を有しているか否かは明らかではない。本実施例の方法によって、それぞれのＴＮＦスーパーファミリー亜群のｍＲＮＡの刺激応答で特定の細胞集合が同定されないが、個々人の病状把握に有用な機能全体を示す。得られた広範囲の個体の変動によって、個体の特定の遺伝子構造の発見が見られる。ＴＮＦスーパーファミリー応答は１〜３日以内で良好な再現性を示す（図６）が、長期間にわたって、食事サプリメントの投与及び運動によって変化することもでき、これにより非遺伝因子の関与が示唆される。このように、本実施例の方法は、個体に合わせた癌の将来の免疫療法に対する利点を示す。
このような個体に合わせた癌の免疫療法は、血液白血球における適切なＴＮＦスーパーファミリー亜群の発現を増大させること、及び適切なケモカインシグナル化を介して、亜群特異的な白血球を補充することに基づいている。上記の実施例の系及び方法は、薬剤のスクリーニング、検証、及び臨床試験に有用である。さらに、適切なＴＮＦスーパーファミリーの阻害が薬剤標的になる場合、同じ系は自己免疫疾患に適用可能であり得る。
都市において適切な装備を有する警察官の十分な供給は、彼らを犯罪現場に送り出す場合にのみ、意味のあるものになる。警察官が犯罪グループに接触するとき、警察官の最初の仕事は、単独で犯罪グループを逮捕することを試みることよりも救援を呼び、より多くの仲間を現場に派遣することである。細胞障害性Ｔ細胞において、この活動は、ＣＣＬ及びＣＸＣＬケモカイン等の化学走化性因子並びにインターロイキン（ＩＬ）の放出に対応し得る（配列はＧｅｎＢａｎｋ及びＵｎｉＧｅｎｅから利用可能である）。したがって、末梢血の白血球においてＣＣＬ、ＣＸＣＬのＨＡＧ誘導性をモニタリングすることも重要である。警察官派遣係のように、腫瘍学者は、末梢血においてこれらの供給をモニタリングすることによって、患者自身それぞれの免疫細胞を組織化することができる。
熱凝集ＩｇＧ（ＨＡＧ）への全血の曝露後に末梢血の白血球で誘導されたＴＮＦスーパーファミリーのｍＲＮＡの分析結果を示す図である。 図１Ａの分析を繰り返した結果を示す図である。 様々な腺癌及び扁平上皮細胞癌から採取した組織サンプルで発現したＴＮＦ−ＲスーパーファミリーのｍＲＮＡの分析結果を示す図である。 抗ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）モノクローナル抗体への全血の曝露後に末梢血の白血球で誘導されたＴＮＦスーパーファミリーのｍＲＮＡの分析結果を示す図である。 末梢血の白血球を抗ＴＣＲ抗体に曝したときの用量反応及び動態の分析結果を示す図であり、ＴＮＦスーパーファミリー亜群２のｍＲＮＡ発現を定量する。 末梢血の白血球を抗ＴＣＲ抗体に曝したときの動態の分析結果を示す図であり、ＴＮＦスーパーファミリー亜群２のｍＲＮＡ発現を定量する。 末梢血の白血球をＨＡＧに曝したときの用量反応及び動態の分析結果を示す図であり、ＴＮＦスーパーファミリー亜群１５のｍＲＮＡ発現を定量する。 末梢血の白血球をＨＡＧに曝したときの動態の分析結果を示す図であり、ＴＮＦスーパーファミリー亜群１５のｍＲＮＡ発現を定量する。 幾つかのＴＮＦスーパーファミリー亜群のｍＲＮＡ及び対照ｍＲＮＡに関する図５の分析を繰り返した結果を示す図である。 ＨＡＧへの全血の曝露の後に末梢血の白血球で誘導されたＴＮＦスーパーファミリーのｍＲＮＡの分析結果を示す図である。 実施例４で用いられるケモカインプライマー配列を示す図である。 実施例４で用いられるケモカインプライマー配列を示す図である。 ＨＡＧへの全血の曝露の後に末梢血の白血球で誘導されたケモカインｍＲＮＡの分析結果を示す図である。 ＨＡＧへの前もって栄養補助又は対照刺激で刺激された全血アリコートの曝露の後に末梢血の白血球で誘導されたＴＮＦスーパーファミリー亜群３のｍＲＮＡの分析結果を示す図である。

Claims (18)

  1. 哺乳類の腫瘍性疾患の予後の重症度を予測する方法であって、
    前記哺乳類から単離された全血の第１のサンプルにおいて、複数の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー亜群の発現レベルを求める工程、
    前記哺乳類から単離された全血の第２のサンプルを該全血において白血球を活性化する刺激因子に曝す工程、
    前記第２のサンプルにおいて、前記複数の腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー亜群の発現レベルを求める工程、
    前記第２のサンプルにおいて前記第１のサンプルよりも発現が増加した亜群を同定する工程、及び
    前記同定されたＴＮＦスーパーファミリー亜群が、前記哺乳類の腫瘍細胞で発現する特定の腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ−Ｒ）スーパーファミリー亜群に対応する場合、予後の重症度が低いと予測する工程
    を含む方法。
  2. 前記哺乳類から単離された腫瘍細胞を用い、該腫瘍細胞で発現するＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群を同定する工程を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 前記腫瘍細胞で発現するＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群が、免疫染色、ｉｎ ｓｉｔ
    ｕハイブリダイゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕポリメラーゼ連鎖反応、及びｉｎ ｖｉｔｒｏポリメラーゼ連鎖反応から成る群より選択される方法により同定される、請求項２に記載の方法。
  4. 全血の第２のサンプルを曝すことがヘパリンの添加を包含する、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. 前記刺激因子が、熱凝集ヒトＩｇＧ及び抗ヒトα／β Ｔ細胞受容体モノクローナルＩｇ
    Ｇから成る群より選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
  6. 前記腫瘍細胞で発現するＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群が、ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群１Ａ、１Ｂ、３、４、５、６、７、８、９、１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃ、１０Ｄ、１１Ａ、１１Ｂ、１２Ａ、１４、１７、１８及び２５から成る群より選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
  7. 前記全血で発現するＴＮＦスーパーファミリー亜群が、ＴＮＦスーパーファミリー亜群１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１３Ｂ、１４、１５及び１８から成る群より選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
  8. 前記全血で発現するＴＮＦスーパーファミリー亜群の発現レベルが、該ＴＮＦスーパーファミリー亜群のｍＲＮＡの発現レベルである、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 哺乳類の腫瘍性疾患の予後の重症度を予測する方法であって、
    前記哺乳類から単離された全血の第１のサンプルにおいて、複数のケモカインの発現レベルを求める工程、
    前記哺乳類から単離された全血の第２のサンプルを該全血において白血球を活性化する刺激因子に曝す工程、
    前記第２のサンプルにおいて、前記複数のケモカインの発現レベルを求める工程、及び
    前記第１のサンプルと前記第２のサンプルとの間で前記全血における発現レベルの有意な変化を示すケモカインが同定された場合、予後の重症度が低いと予測する工程
    を含む方法。
  10. 前記ケモカインが、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１５、及びＩＬ１６から成る群より選択される、請求項９に記載の方法。
  11. 哺乳類において腫瘍性疾患を処置するための食物成分の有用性を予測する方法であって、前記哺乳類から単離された全血の第１のサンプルを用意する工程、
    前記哺乳類から単離された全血の第２のサンプルを前記食物成分に曝す工程、
    前記第１のサンプル及び前記第２のサンプルを該全血において白血球を活性化する刺激因子に曝す工程、
    前記第１のサンプル及び前記第２のサンプルにおいて、複数のＴＮＦスーパーファミリー亜群の発現レベルを求める工程、
    前記第２のサンプルにおいて前記第１のサンプルよりも発現が増加した亜群を同定する工程、及び
    ＴＮＦスーパーファミリーの前記同定された亜群が、前記哺乳類の腫瘍細胞で発現する特定のＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群に対応する場合、前記食物成分が前記腫瘍性疾患を治療するのに有用性がある可能性が高いと判定する工程
    を含む方法。
  12. 前記第１のサンプルが、前記全血において白血球を活性化する前記刺激因子に曝される前に対照の刺激因子に曝される、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記腫瘍細胞で発現するＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群が、ＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群１Ａ、３、１２Ａ、及び１４から成る群より選択される、請求項１１または１２に記載の方法。
  14. 前記哺乳類から単離された腫瘍細胞を用い、該腫瘍細胞で発現するＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群を同定する工程を含む、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
  15. 前記腫瘍細胞で発現するＴＮＦ−Ｒスーパーファミリー亜群が、免疫染色、ｉｎ ｓｉｔ
    ｕハイブリダイゼーション、ｉｎ ｓｉｔｕポリメラーゼ連鎖反応、及びｉｎ ｖｉｔｒｏポリメラーゼ連鎖反応から成る群より選択される方法により同定される、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記哺乳類から単離された全血の第３のサンプルにおいて、複数のケモカインの発現レベルを求める工程、
    前記哺乳類から単離された全血の第４のサンプルを該全血において白血球を活性化する刺激因子に曝す工程、
    前記第４のサンプルにおいて、前記複数のケモカインの発現レベルを求める工程、及び
    前記第３のサンプルと前記第４のサンプルとの間で前記全血における発現レベルの有意な変化を示すケモカインが同定された場合、予後の重症度が低いと予測する工程
    をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記ケモカインが、ＣＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ６、ＣＣＬ７、ＣＣＬ８、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＣＣＬ１１、ＣＣＬ１２、ＣＣＬ１３、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１５、ＣＣＬ１６、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１８、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ２３、ＣＣＬ２４、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２６、ＣＣＬ２７、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ３、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１５、及びＩＬ１６から成る群より選択される、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記刺激因子が、熱凝集ヒトＩｇＧ及び抗ヒトα／β Ｔ細胞受容体モノクローナルＩｇ
    Ｇから成る群より選択される、請求項９に記載の方法。
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