CN101855367A - 外周血白细胞中FC受体介导的肿瘤坏死因子超家族mRNA表达 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于预测患者对涉及改变肿瘤坏死因子超家族(“TNFSF”)-2、TNFSF-8或TNFSF-15的表达的类风湿性关节炎疗法的应答性的方法。也公开了用于监测这种疗法的有效性的方法。此外，公开了筛选用于治疗类风湿性关节炎的化合物的方法。也公开了随时间监测类风湿性关节炎患者中疾病状态的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请是2007年11月14日提交的美国临时专利申请号61/002,967的非临时专利申请，并且是2008年10月7日提交的美国专利申请号12/296,423的部分继续申请，其中所述美国专利申请号12/296,423是2007年4月5日提交的国际申请号PCT/US2007/008559的国家阶段，所述国际申请又要求2006年4月7日提交的美国临时专利申请号60/790,511的优先权。
发明背景
技术领域
本公开涉及用于预测患者对涉及肿瘤坏死因子超家族成员或细胞因子的类风湿性关节炎疗法的应答性的方法，涉及监测这种疗法的有效性的方法，以及涉及用于筛选用于治疗类风湿性关节炎的化合物的方法。本公开也涉及用于监测类风湿性关节炎患者中疾病状态的方法。
相关技术的描述
自身免疫病以产生与宿主细胞反应的抗体或具有自身反应性的免疫效应T细胞为特征。经常在某些类型的自身免疫病中鉴定到自身抗体，如重症肌无力中的抗乙酰胆碱受体抗体和系统性红斑狼疮中的抗DNA抗体。然而，在许多类型的自身免疫病中见不到此类自身抗体。此外，在健康个体中经常检测到自身抗体，不过此类抗体不诱导自身免疫病。因而，除了自身抗体外，仍待鉴定的其它机制显然参与自身免疫病的发病机理。
一旦自身抗体与靶宿主细胞结合，则认为补体级联被激活以在靶细胞膜上形成导致宿主细胞死亡的C5-9攻膜复合物(见Esser，Toxicology 87，229(1994))。副产物趋化因子如C3a、C4a或C5a召集更多白细胞至损害处(见Hugli，Crit.Rev.Immunol.1，321(1981))，所召集的白细胞或在损害处的天然存在的白细胞通过Fc受体(“FcR”)识别结合抗体的细胞(免疫复合物)。一旦FcR被免疫复合物交联，则白细胞释放TNF-α(见Debets等，J.Immunol.141，1197(1988))，所述TNF-α与宿主细胞表面上存在的特异性受体结合并诱导细胞凋亡或细胞损伤(见Micheau等，Cell 114，181(2003))。激活的FcR也启动趋化性细胞因子释放以召集不同亚群的白细胞至损害处(见Chantry等人，Eur.J.Immunol 19，189(1989))。这是FcR相关性自身免疫病的分子机制的总体假设。
类风湿性关节炎(“RA”)是涉及胃肠道炎症的免疫疾病。虽然该疾病在临床上被充分表征，然而对其发病机理了解甚少。RA以持续的炎性滑膜炎为特征，通常涉及对称分布的外周关节。这可以导致软骨破坏、骨糜烂和关节完整性的改变。RA的病因仍未知，不过高度怀疑CD4+T细胞在本病中发挥作用，原因是这种细胞在滑膜中占优势、RA患者的血液和血清中(由激活的T细胞产生的)可溶性IL-2受体增加以及本病通过除去T-细胞而明显改善。RA与关节中TNF-α(也称作TNFSF-2)的堆积有关。TNF-α通常起到动员白细胞以对抗感染和其它入侵者，从而在患部(affected area)引起炎症的作用。健康身体自身可以去除过多的TNF-α，但是类风湿性关节炎患者的身体不能。因而，越来越多的白细胞迁移至患部。尤其在类风湿性关节中，TNF-α的堆积引起炎症、疼痛和组织损伤。
已知IgG Fc受体(FcγR)与免疫复合物(IC)(一个表位与针对该表位的抗体的组合)反应引发各种炎症反应。经常在RA患者的关节损害处鉴定到IC，尽管具体抗原没有得到充分表征。也已知IC激活补体级联以形成炎症以及通过结合至各种白细胞的FcγR以形成抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。先前已经从滑膜液中收集并研究了局部浸润性白细胞。然而，因为这些收集物含有新来细胞和衰竭细胞，故而结果难以解释。由于移行至疾病部位时，外周血白细胞在RA的发病机理中发挥重要作用，因而已经开展众多实验以体外模拟此类功能。一般地，将单核白细胞分离、悬浮于培养基中并在CO2培养箱中与各种刺激物或效应细胞孵育。然而，实施测定法的条件并不接近生理条件，原因是缺少不同细胞群体之间的通讯、缺少来自红细胞的氧供应以及缺少与血浆蛋白和其它组分的复杂相互作用。次级反应可能在冗长的孵育期间出现。此外，因繁琐的技术和巨大的实验对实验的变化，这些体外试验较少应用于诊断检验中。
RA的治疗集中在缓解疼痛、减少炎症、保护关节结构、维持功能和控制系统受累上。选项包括：阿司匹林和其它非甾体类抗炎药物；抗风湿药如甲氨蝶呤、金化合物、D-青霉胺、抗疟药和柳氮磺吡啶；糖皮质激素；TNF-α中和剂如英夫利昔单抗(infliximab)和依那西普(etanercept)；和免疫抑制药如硫唑嘌呤、来氟米特、环孢霉素和环磷酰胺。因为治疗选项的选择取决于对RA患者中疾病状态的评估，故开发评价疾病状态和监测疾病加重的新方法将是受欢迎的。
附图简述
图1A-1C显示了外周全血中人白细胞内各种TNFSF mRNA的FcγR介导的基因表达的量化结果。
图2A-2C显示了与来自类风湿性关节炎患者和对照患者的未刺激的全血相比，所述患者全血中由热聚IgG(HAG)刺激诱导的各种TNFSF mRNA水平的倍数增量。
图3A-3C显示与来自类风湿性关节炎患者和对照患者的未刺激的全血相比，所述患者全血中由热聚IgG(HAG)刺激诱导的各种TNFSF mRNA水平的比较性倍数增量。
优选实施方案的详述
本公开涉及应答于特定细胞性刺激物的白细胞中的差异性mRNA转录模式在评估RA患者是否是特定疗法的良好候选者中的用途。本公开也涉及此类差异性转录模式在评估施用于RA患者的疗法是否有效的用途。本公开也涉及此类差异性转录模式在筛选用于治疗RA的候选药剂中的用途。本公开也涉及此类差异性转录模式在随时间评价患者内RA状态和监控疾病加重中的用途。
如上文所述，RA的病理学可能与RA患者免疫细胞中FcγR与IC之间的相互作用相关。为了进一步评估这种可能性，使用热聚IgG(IC的经典模型HAG)来刺激健康成年对照和RA患者内的人全血中的FcγR。可以使用的其它刺激物包括豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(PMA)、植物凝集素(PHA)、小麦胚凝集素(WGA)、伴刀豆球蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)、榴莲凝素(jacalin)、墨角藻聚糖(fucoidan)、热聚IgE、热聚IgA和热聚IgM。
将HAG直接添加至肝素化全血，并且评估肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)各种成员的mRNA水平的改变。虽然存在多种FcγR，如FcγRI、IIa、IIb和III(GeneBank UniGene数据库)，然而HAG充当可以与全部FcR亚型反应的通用刺激物。量化了因HAG刺激所致的TNFSF诸成员的mRNA(见例如GeneBankUniGene数据库)水平的改变。
如所述，FcγR介导的功能由IgG(IgG1-4)的Fc部分的4个亚类、多种类型的FcγR(FcγRIa-c、FcγRIIa-c和FcγRIIIa-b)、不同亚群的携带FcγR的白细胞和各种下游细胞内信号传导级联组成。此外，这些蛋白质具有多种转录物变体和各种遗传多态性。FcγR在疾病状态中的改变功能可以在任何水平发生。然而，可能做不到表征每个个体中的每种因素。本公开构思了全血(伴有其附属离体(exvivo)条件)作为鉴定个体的筛选工具的用途，其中所述个体为将从各种后续测定法(如单个细胞分析、各种基因的基因分型和细胞内信号传导级联变异)获益的个体。因为已知IC诱导TNFSF-2(＝TNF-α)和TNFSF-15(＝TL1A)mRNA，故以这种方式筛选全部肿瘤坏死因子超家族(TNFSF)成员。
所用方法如下。从GenBank中的UniGene数据库检索各种TNFSF基因的核苷酸序列。针对每种基因的PCR引物由Primer Express(Applied Biosystem公司，福斯特城，加利福尼亚州)和HYBsimulator(RNAture公司，欧文市，加利福尼亚州)(见Mitsuhashi等，Nature 367，759(1994)；Hyndman等，BioTechniques 20，1090(1996))设计。序列汇总于下面的表1中。寡核苷酸由IDT公司(科拉维尔市，爱荷华州)、筑波低聚服务公司(Tsukuba Oligo Service)(筑波市，日本)、NipponEGT公司(富山市，日本)和北海道系统科学公司(Hokkaido System Science)(札幌市，日本)合成。
表1引物序列
| 靶mRNA | 正向(3′-5′) | SEQIDNO | 反向(3′-5′) | SEQIDNO |
| TNFSF-1 | CAGCTATCCACCCACACAGATG | 1 | CGAAGGCTCCAAAGAAGACAGT | 2 |
| TNFSF-2 | CGAAGGCTCCAAAGAAGACAGT | 3 | CAGGGCAATGATCCCAAAGT | 4 |
| TNFSF-3 | AGGGTGTACGTCAACATCAGTCA | 5 | CACGGCCCCAAAGAAGGT | 6 |
| TNFSF-4 | GCCCCTCTTCCAACTGAAGAA | 7 | GGTATTGTCAGTGGTCACATTCAAG | 8 |
| TNFSF-5 | CCACAGTTCCGCCAAACCT | 9 | CACCTGGTTGCAATTCAAATACTC | 10 |
| 靶mRNA | 正向(3′-5′) | SEQIDNO | 反向(3′-5′) | SEQIDNO |
| TNFSF-6 | TGGCAGCATCTTCACTTCTAAATG | 11 | GAAATGAGTCCCCAAAACATCTCT | 12 |
| TNFSF-7 | CACACTCTGCACCAACCTCACT | 13 | TGCACTCCAAAGAAGGTCTCATC | 14 |
| TNFSF-8 | ACCACCATATCAGTCAATGTGGAT | 15 | GAAGATGGACAACACATTCTCAAGA | 16 |
| TNFSF-9 | AGCTACAAAGAGGACACGAAGGA | 17 | CGCAGCTCTAGTTGAAAGAAGACA | 18 |
| TNFSF-12 | TACTGTCAGGTGCACTTTGATGAG | 19 | CGCAGTGGCTGAGAATTCCT | 20 |
| TNFSF-13 | ATATGGTGTCCGAATCCAGGAT | 21 | CCTGACCCATGGTGAAAGTCA | 22 |
| TNFSF-13B | ATGCCTGAAACACTACCCAATAATT | 23 | GCAAGTTGGAGTTCATCTCCTTCT | 24 |
| TNFSF-14 | CGTCCGTGTGCTGGATGA | 25 | CATGAAAGCCCCGAAGTAAGAC | 26 |
| TNFSF-15 | TGCGAAGTAGGTAGCAACTGGTT | 27 | CCATTAGCTTGTCCCCTTCTTG | 28 |
通过将PBS中的20mg/mL人IgG(西格玛公司，圣路易斯市)在63℃加热15分钟(见Ostreiko等，Immunol.Lett.15，311(1987))制备热聚IgG(HAG)。在8孔微量管板条中，添加1.4μl HAG或对照(磷酸盐缓冲液)并贮存在-20℃直至使用。将70μl新鲜的肝素化全血(其保持在4℃直至用IC刺激)添加至各孔，一式三份，并关闭管盖在37℃孵育4小时。在抽取血液的同一日处理血样。处理后，将每份血样冷冻贮存于-80℃直至使用。
按照Mitsuhashi等，Clin.Chem.52，634(2006)中所述方法从全血制备mRNA和cDNA。也可以使用在通过引用并入本文的美国专利申请号10/796,298中所披露的方法。简而言之，将50μl全血转移至96孔过滤平板以捕获全血中的白细胞；将这些过滤平板置于收集平板上，并施加150μl的5mM Tris，pH 7.4。在4℃于120xg离心1分钟后，将50μl血样施加至各孔并立即在4℃于120xg离心2分钟，随后用300μlPBS洗涤各孔1次，在4℃于2000xg离心5分钟。然后，施加60μl裂解缓冲母液至过滤平板，随后在37℃孵育10分钟，其中所述的裂解缓冲母液补充有1％2-巯基乙醇(Bio Rad公司，埃库莱斯(Hercules)，加利福尼亚州，美国)、0.5mg/ml蛋白酶K(Pierce公司，罗克福德，伊利诺斯州，美国)、0.1mg/ml鲑鱼精DNA(5Prime Eppendorf/Brinkmann，韦斯特伯里，纽约州，美国)、0.1mg/ml大肠杆菌tRNA(西格玛公司)、10mM每种特异性反向引物的混合物和标准RNA34寡核苷酸。随后将过滤平板置于固定有寡(dT)的微孔板(GenePlate，RNAture公司制)(见Mitsuhashi等，Nature 357，519(1992)；Hamaguchi等，Clin.Chem.44，2256(1998)(两篇文献均通过引用并入本文))上并在4℃于2000xg离心5分钟。在4℃贮存过夜后，将微孔板在4℃用100μl空白的裂解缓冲液洗涤3次，随后在4℃用150μl洗涤缓冲液(0.5M NaCl，10mMTris，pH 7.4，1mM EDTA)洗涤3次。通过添加含有1×RT缓冲液、1.25mM每种dNTP、4单位rRNasin和80单位MMLV逆转录酶(Promega公司)(无引物)的缓冲液并在37℃孵育2小时，直接在各孔内的30μl溶液中合成cDNA。特异性引物引发的cDNA存在于溶液中，并且寡(dT)引发的cDNA仍固定在微孔板内(见Hugh，Crit.Rev.Immunol.1，321(1981))。对于SYBR Green PCR(见(通过引用并入的)Morrison等，Biotechniques 24，954(1998))，将cDNA在水中稀释4倍，并将4μl cDNA溶液直接转移至384孔PCR平板，向其中施加5μl iTaq SYBR主混合物(Bio Rad公司，埃库莱斯，加利福尼亚州)和1μl寡核苷酸混合物(15μM每种正向引物和反向引物)，然后在PRISM 7900HT(ABI公司)中实施PCR：95℃、10分钟的1个循环；随后的95℃、30秒和60℃、1分钟的45个循环。也可以使用TaqMan PCR；在这种情况下，将cDNA溶液直接转移至384孔PCR平板，向其中施加5μl TaqMan通用主混合物(ABI公司)和1μl寡核苷酸混合物(15μM每种正向引物和反向引物、和3-6μM TaqMan探针)至所述384孔PCR平板，然后在PRISM 7900HT(ABI公司)中实施PCR：95℃、10分钟的1个循环；随后的95℃、30秒，55℃、30秒和60-65℃、1分钟的45个循环。分别扩增每种基因。
使用1×RT缓冲液作为阴性对照以证实在SYBR Green PCR条件下无引物二聚体生成。此外，在每种情况中分析解链曲线以证实PCR信号从单一PCR产物衍生。通过分析软件(SDS、ABI)确定循环阈值(Ct)，该阈值是生成某个量的PCR产物(荧光)所需要的PCR循环次数。HAG处理的三等份样品的Ct值分别减去PBS对照的平均Ct值以计算ΔCt，并且通过假设每个PCR循环的效率是100％，将与未刺激样品相比的刺激样品的倍数增量(下文中简称为“倍数增量”)计算为2^(-ΔCt)。
图1A-C显示外周血白细胞中FcγR-介导的mRNA表达。每个数据点代表来自全血三等份试样的均值+标准偏差(图1A)或均值(图1B、1C)。
图1A显示了表达的动力学的分析结果。70μl每份肝素化全血的三等份试样与PBS或200μg/ml热聚IgG(HAG)混合并在37℃孵育0-8小时。随后量化TNFSF-2(＝TNF-α，●)、TNFSF-8(▲)、TNFSF-15(＝TL1A，◆)和β-肌动蛋白(△)mRNA并如上文所述计算倍数增量(y-轴)。如图1A中所示，TNFSF-2的诱导是极迅速的，约30分钟具有峰，随后在4小时具有巨大持续峰，与TNFSF-2相反，TNFSF-8(图1A，▲)和TNFSF-15(＝TL1A)(图1A，◆)缓慢增加，在约4小时具有峰。持家基因(β-肌动蛋白)在与HAG孵育8小时期间未被诱导(图1A，△)。HAG孵育因此固定于4小时以分析TNFSF-2、-8和-15mRNA。这种短时孵育(4小时)是基于mRNA的测定法的优势之一，因为蛋白质检测要求至少过夜孵育以鉴定药物诱导的改变。
图1B显示剂量反应。将肝素化全血与0-800μg/ml HAG在37℃孵育4小时，随后量化各种mRNA(每种符号如图1A中定义)。HAG诱导的TNFSF-2、TNFSF-8和TNFSF-15从10μg/ml HAG以剂量依赖性方式被证实并在100-200μg/ml处饱和，同时β-肌动蛋白未改变。
图1C显示1周内从相同个体两次抽取血液并且量化HAG诱导的TNFSF-2(●)、TNFSF-8(▲)、TNFSF-15(◆)mRNA和外部对照mRNA(合成性RNA34)(○)时所获得的结果。如图1C中所示，诱导作用是可重复的并且8位健康个体当中在第1日与第2日之间的r2值是0.927(n＝32，p＜0.001)(图1C)。掺混到裂解缓冲液中的外部合成性RNA(RNA34，图1C，○)的倍数增量总是低于1.5，表明在每个实验中正确实施了该测定法。
虽然用于mRNA分析的实际血液体积是50μl，然而该测定法使用每个反应70μl全血(20μl是从8孔板条转移至过滤平板期间的裕量)。因此，每个试验消耗少至420μl(＝70μl/孔×2(HAG和PBS)×3(三等份))全血。从50μl全血/孔中，通过RT-PCR(30μl cDNA加90μl水(1∶4稀释)，4μl cDNA/PCR)量化30种不同的mRNA。甚至从1∶4的cDNA稀释物中，实现了对各种TNFSF mRNA的测量。不同于基于血清的试验(其中血清体积因个体之间血细胞比容的变异而是不可预测的)，全血容易操作。
表2显示了外周全血中人白细胞内FcR-介导的TNFSF mRNA的基因表达的分析结果。所示结果表述为“应答”受试者的百分数，其中所述的“应答”受试者定义为在应答HAG刺激时展示大于2的倍数增量的那些试者。使用χ2检验来比较健康受试者与RA患者之间就每种TNFSF mRNA的阳性应答发生率。由于存在两种群体(阳性和阴性应答)，故t-检验仅施用于倍数增量大于2的受试者。
表2.免疫复合物诱导的TNFSF mRNA表达
*：倍数增量＞2.0
如表2中所示，HAG在全部健康捐助者中诱导出TNFSF-15(＝TL1A)mRNA(倍数增量＞2)并在61位RA患者中的59位患者内诱导出TNFSF-15。在离体条件，这些结果重现了最近发表的报告(见Prehn等，The T cell costimulator TL1A is induced by FcgammaR signaling in human monocytes and dendritic cells(T细胞共 刺激物TL1A由人单核细胞和树突细胞中的FcγR信号传导作用诱导)，J.Immunol.178，4033(2007)；Cassatella等，Soluble TNF-like cytokine(TL1A1) production by immune complexes stimulated monocytes in rheumatoid arthritis(在 类风湿性关节炎患者中由免疫复合物刺激的单核细胞所进行的可溶性TNF样 细胞因子(TL1A1)的产生)，J.Immunol.178，7325(2007)(这两篇文献均通过引用并入本文))。已知HAG也诱导TNFSF-2(＝TNF-α)mRNA(见Satoh等，Endogenous production of TNF in mice with immune complex as a primer(以免疫 复合物作为引子在小鼠中内源性产生TNF)，J.Biol Response Mod.5，140(1986)；Chouchakova等，Fc gamma RIII-mediated production of TNF-alpha induces immune complex alveolitis independently of CXC chemokine generation (FcγRIII介导的TNF-α的产生诱导了与CXC趋化因子生成无关的免疫复合物肺 泡炎)，J.Immunol166，5193(2001)(这两篇文献均通过引用的方式并入))。然而，如表2中所示，并未在全部个体中发现TNFSF-2诱导，并且超过一半的受试者无应答。此外，HAG刺激作用在超过1/3的对照和RA患者中诱导出TNFSF-8(＝CD153，CD30配体)和TNFSF-14(＝LIGHT)mRNA，并在一些患者中诱导出TNFSF-1(＝淋巴毒素α，LTA)、TNFSF-3(＝淋巴毒素β，LTB)、TNFSF-4(＝CD252，CD134配体)、TNFSF-6(＝Fas配体)、TNFSF-7(＝CD70，CD27配体)和TNFSF-9，而在TNFSF-5(＝CD154，CD40配体)、TNFSF-12(＝TWEAK)、TNFSF-13(＝CD256)和TNFSF-13B(＝CD257)方面显示微小诱导作用或不显示诱导作用。这种个体-对-个体变异或距离刺激开始4小时处存在应答者和非应答者，是有意义的，因为如图1A和1B中所示，与200μg/ml HAG孵育4小时，实现饱和。这个离体测定法预期可用作各种后续测定法的筛选平台。
针对类风湿因子(RF)(2型(单克隆IgM至多克隆IgG)或3型(多克隆IgM至多克隆IgG)冷球蛋白)的试验是在疑似RA情况下的标准诊断方法。因HAG刺激造成的TNFSF-2、TNFSF-8和TNFSF-15诱导的结果，通过在RF水平上分解以查找相关性。结果在图2A-2C中显示。分别采用＜30、30-100和＞100IU/ml RF，从40位健康成年志愿者(对照)和61位RA患者中量化HAG诱导的TNFSF-2(A)、TNFSF-8(B)和TNFSF-15(C)mRNA。因为观察到两个群体(倍数增量＞2的应答者和非应答者)，t-检验仅应用至应答者群体。借助χ2检验的分析没有在这四个组之间揭示显著差异。
如图2中所示，借助RF量对RA患者的分类揭示TNFSF诱导作用的显著差异。如图2C中所示，RF＞100IU/ml的RA患者中的TNFSF-15的倍数增量分别显著低于对照(p＝0.01)和RF＜30IU/ml的RA患者(p＝0.04)的TNFSF-15的倍数增量。这可能因以下事实产生：RF是天然形式的IC并在离体添加HAG时存在于全血中。大部分RA患者维持对HAG刺激的应答。这表明即便长时间暴露于RF，RA患者外周血中的循环性白细胞仍能够激活IC。具有高RF的RA患者中所示的降低的TNFSF-15应答可能表示外周血白细胞中的TNFSF-15受体功能或多或少地下调了。
就通过RF激活FcγR而言，作出TNFSF-15mRNA的基线水平是否因连续暴露于RF而升高的评估。就Ct方面，通过计算TNFSF-15超过TNFSF-5、-13和-13B的相对表达而测量了结果，原因是，如表2中显示，这三种TNFSF mRNA不受HAG诱导。然而，在全部三种计算中发现RA患者中的基线水平并没有显著不同于对照受试者。
图3显示如下时所获得的结果：针对对照(○)和RA(●)，通过分别将TNFSF-2和-8(A)、TNFSF-2和-15(B)及TNFSF-8和-15(C)进行比较，将图2中所示结果转换成x-y图。如图3C中所示，TNFSF-15的倍数增量与RA(●)和健康受试者(o)中TNFSF-8的倍数增量良好地相关，r2值分别是0.48(n＝61，p＜0.001)和0.27(n＝38，p＜0.001)。然而，因为TNFSF-8的倍数增量低于TNFSF-15的倍数增量并且阳性应答者人数小于TNFSF-15阳性应答者人数，故没有观察到TNFSF-8在对照与RA之间的显著差异，甚至当RA患者通过RF的量进行分类时亦如此(图2B)。然而，如图2A中所示，与TNFSF-15相反，RF＜30和＜100的RA患者中TNFSF-2的倍数增量显著(p＜0.03，0.05)高于健康受试者的TNFSF-2的倍数增量。TNFSF-2的倍数增量不与TNFSF-8的(图3A)(对照和RA的r2分别等于0.03和0.02)和TNFSF-15(图3B)(对照和RA的r2分别等于0.11和0.003)的倍数增量相关，这表明TNFSF-2和TNFSF-8/-15从不同途径衍生。这一点进一步由图1A中所示的证据证实，其中TNFSF-2与TNFSF-8/-15之间的动力学是不同的。
TNFSF-2(＝TNF-α)是参与RA发病机理的炎性细胞因子之一，并存在于RA中的滑膜液内(见Saxne等人，Detection of tumor necrosis factor alpha but not tumor necrosis factor beta in rheumatoid arthritis synovial fluid and serum(在类风 湿性关节炎患者滑膜液和血清中检测肿瘤坏死因子α而非肿瘤坏死因子β).Arthritis Rheum.31，1041(1988)(该文献通过引用并入本文))。已经通过原位杂交显示TNF-α转录物存在于滑膜组织巨噬细胞中(见MacNaul等，Analysis of TL-1 and TNF-αlpha gene expression in human rheumatoid synoviocytes and normal monocytes by in situ hybridization(通过原位杂交分析人类风湿滑膜细胞 和正常单核细胞中的TL-1和TNF-α基因的表达)，J.Immunol.145，4154(1990)(该文献通过引用并入本文))。此外，阻断TNF-α作用的抗TNF-α单克隆抗体(英夫利昔单抗，瑞米凯德(Remicade))和可溶性TNF受体(依那西普，恩博(Enbrel))已经在RA患者中显示临床效力(见Weaver，The impact of new biologicals in the treatment of rheumatoid arthritis(新生物制剂在治疗类风湿性关节炎中的影响). Rheumatology(牛津)43增刊3：iii17-iii23(2004)(该文献通过引用并入本文))。因此，在我们的离体测定法中RA患者内所示升高的HAG-诱导的TNF-α诱导作用是相当合理的。当然，mRNA诱导并不总是对应于蛋白质合成和后续的生物学及临床结果，原因在于改变的剪接作用、翻译后修饰和抑制性级联的共激活。然而，这种离体刺激作用将有效作为各种后续分子测定法(如受体和相关蛋白质的遗传多态性)的起点筛选工具。
我们也在HAG-诱导的TNFSF-2mRNA的应答者(倍数增量＞＝2)和非应答者(倍数增量＜2)之间比较了患者的临床特征。结果在表3中显示。
表3，在HAG-诱导的TNFSF-2方面的应答者和非应答者的特征
*：FI：倍数增量，**：χ2检验
如表3中所示，在RF＜30IU/ml组中的应答者群体显著地(p＝0.04)比非应答者群体年轻。在全部RF组中应答者与非应答者之间的其它临床参数，如年龄、性别、疾病持续期、CRP、肿胀关节个数和痛的关节个数没有显著不同(表3)。有趣的是，当合并全部患者时，在应答者群体中的用生物药剂(如抗TNF-α单克隆抗体或可溶性TNF受体)治疗的患者数显著地(p＝0.02)高于在非应答者群体中的对应的患者数(表3)。这些抗TNF-α剂的使用可能通过未鉴定的负反馈机制而增强FcγR介导的TNF-α功能，或此类患者可能是生物制剂疗法的良好候选人。对于在HAG诱导的TNF-αmRNA方面显示应答的RA患者而言，TNF-α更有可能明显地参与于RA病理学中，并且因而这些患者更有可能是这些生物药剂的良好候选人。由于生物药物极其昂贵，并非在全部患者中有效，并偶然显示不良的副作用，因而鉴定有可能应答于这些药物的患者将具有作为个体化用药的临床用途。
通常已经使用细胞毒性检测法来研究因免疫系统活性(如认为存在于RA中的免疫系统活性)造成的实际细胞死亡。细胞毒性检测法一般通过以各种比率将载有51Cr的靶细胞与效应细胞一起孵育，然后量化从死亡或受损细胞释放的51Cr放射性的量而实施(见Dunkley等，J.Immunol.Methods 6，39(1974))。在某些情况下，已将放射性物质替换为非放射性物质，如荧光测量物质(见Kruger-Krasagakes等，J.Immunol.Methods 156，1(1992))，但基本原理不变。细胞毒性检测法的结果因而反映实际的细胞死亡。
然而，细胞毒性检测法在非生理性实验条件下进行，并且在此类研究的过程中难以评估复杂的细胞-对-细胞和细胞-对-血浆的相互作用。此外，细胞毒性检测法不指示哪种TNFSF成员导致细胞死亡。一旦效应细胞识别靶细胞，则效应细胞的功能不仅是杀死靶细胞，而且也是召集其它效应细胞，因而单种效应细胞不足以杀死多种靶细胞。这种召集功能认为由趋化因子的释放代表。经典的细胞毒性检测法不会揭示，由效应细胞释放的此类趋化因子的身份。然而，本公开中所述的测定法系统能够同时鉴定效应细胞中许多类型的基因表达。
相对于使用在培养基中的已分离的白细胞而言，优选使用全血，因为全血比分离的白细胞具有更多生理性，并且可以筛选全种群的白细胞。较长时间的全血孵育可能产生额外的人为结果(artifact)。因而，理想方式是在在短时间孵育期间通过体外(in vitro)至离体(ex vivo)的转换来鉴定全血中的早期的杀手细胞(killer)信号和召集信号。mRNA的转录是比蛋白质合成或最终生物学结果要早的事件。因而，mRNA是合乎逻辑的标靶。
由于本方法使用全血，故该方法可以作为RA的早期诊断试验用来评价对TNFSF失活疗法的可能应答性并用来监测治疗性应答。具体而言，在用于确定患有RA的人是否有可能应答于疗法(所述疗法以应答于T细胞刺激时所转录的mRNA为标靶)的优选实施方案中，如上文所述，从RA患者获得全血并使血液样品经历HAG刺激并任选地经历对照刺激物(PBS)。可以如上所述测量样品中TNFSF-2、TNFSF-8或TNFSF-15mRNA的量。在HAG刺激后这些mRNA中的一种或多种mRNA的水平显著升高(如所示，例如大于2的倍数增量)的RA患者，是以这些mRNA为标靶的疗法的良好候选者。
此外，在评价RA治疗(该治疗以患者中TNFSF-2、TNFSF-8或TNFSF-15mRNA中的一种或多种为标靶)的有效性的方法的优选实施方案中，在启动所述治疗之前获得了HAG刺激后全血中所述mRNA的量与对照刺激后所述mRNA的量的第一比率。在启动所述治疗之后，获得了HAG刺激后全血中所述mRNA的量与对照刺激后mRNA的量的第二比率。所述比率的显著差异，如在第一比率大于第二比率的情况下，可以指示该治疗的有效性。此类疗法可能包括例如施用英夫利昔单抗或依那西普。
重要地，这种离体方法可以用于筛选如下化合物，所述化合物抑制由抗FcR介导的TNFSF-2、TNFSF-8或TNFSF-15mRNA中一种或多种mRNA的表达，并且尤其抑制由抗FcR介导的已知参与疾病病理学的TNFSF-2的表达。此类化合物将是重要的靶药物，因为这些新的候选药物将在转录水平阻断白细胞中的mRNA产生。这将为针对RA的药物开发提供新策略。
在使用所公开的系统筛选药物化合物并因而鉴定治疗RA的推定性药剂(putative agent)的方法的实施方案中，从作为应答者的RA患者获得全血，其中应答者是如下个体，所述个体的白细胞在暴露于T细胞刺激如HAG时显示出与RA相关的mRNA的水平增加至少2倍。计算了HAG刺激后受试者全血中mRNA的量与对照刺激后mRNA的量的第一比率。来自所述受试者的其它全血样品在体外暴露于药物化合物，并且随后如上所述被差异性刺激。随后计算这些被暴露的样品的、HAG刺激后全血中mRNA的量与对照刺激后mRNA的量的第二比率。这两个比率的显著差异，如在第一比率大于第二比率的情况下，可以指示该药物化合物是作为RA潜在治疗剂而进一步研究的候选物。
此外，在通过测量从RA患者获得的包含白细胞的样品中的TNFSF-2、TNFSF-8或TNFSF-15mRNA中的一种或多种mRNA的水平而监测RA患者的疾病状态的方法的优选实施方案中，在首次获得了在使用热聚IgG抗体或另一种刺激物体外刺激T细胞后全血中mRNA的量与体外对照刺激后mRNA的量的第一比率。在首次之后的第二次，获得了在体外刺激T细胞后全血中mRNA的量与体外对照刺激后mRNA的量的第二比率。所述比率的显著差异可以指示疾病状态的改变。例如，当第二比率大于第一比率，这可以表示疾病加重，而较大的第一比率可以指示该疾病已经减轻。
Claims (32)
1.确定类风湿性关节炎患者是否有可能应答于抗TNF疗法的方法，包括：
在体外刺激来自所述患者的第一样品中的白细胞的Fc受体；
测量在刺激后的第一样品中的编码肿瘤坏死因子超家族(“TNFSF”)蛋白的mRNA的量；
在体外使第二样品中的白细胞暴露于对照刺激物；
测量第二样品中所述mRNA的量；
确定第一样品中mRNA的量与第二样品中mRNA的量的比率；和
如果所述比率是约2∶1或更大，则确定患者有可能应答于所述疗法。
2.权利要求1的方法，其中所述mRNA编码TNFSF-2。
3.权利要求2的方法，其中刺激第一样品中的白细胞包括将热聚人IgG与第一样品相互混合。
4.权利要求2的方法，其中第一样品和第二样品中的至少一个包含全血。
5.权利要求2的方法，其中所述对照刺激物是磷酸盐缓冲液。
6.权利要求2的方法，其中所述疗法包括施用选自由英夫利昔单抗和依那西普组成的组中的药剂。
7.确定类风湿性关节炎患者是否有可能应答于疗法的方法，所述疗法为抑制抗FcR-介导的编码肿瘤坏死因子超家族(“TNFSF”)蛋白的mRNA的表达的疗法，所述方法包括：
在体外刺激来自所述患者的第一样品中的白细胞的Fc受体；
测量在刺激后的第一样品中的编码肿瘤坏死因子超家族(“TNFSF”)蛋白的mRNA的量；
在体外使第二样品中的白细胞暴露于对照刺激物；
测量第二样品中所述mRNA的量；
确定第一样品中mRNA的量与第二样品中mRNA的量的比率；以及
如果所述比率是约2∶1或更大，则确定患者有可能应答于疗法。
8.权利要求7的方法，其中所述mRNA编码TNFSF-2。
9.权利要求8的方法，其中刺激第一样品中的白细胞包括将热聚人IgG与第一样品相互混合。
10.权利要求8的方法，其中第一样品和第二样品中的至少一个包含全血。
11.权利要求8的方法，其中所述对照刺激物是磷酸盐缓冲液。
12.鉴定用于治疗类风湿性关节炎的推定性药剂的方法，包括：
获得来自人的包含白细胞的第一、第二、第三和第四样品，其中所述样品的白细胞在暴露于热聚人IgG时在编码肿瘤坏死因子超家族(“TNFSF”)蛋白的mRNA的转录方面显示出至少1.5倍增加；
在体外刺激第一样品中的白细胞的Fc受体；
在体外使第二样品中的白细胞暴露于对照刺激物；
测量在刺激后的第一和第二样品中mRNA的量；
使第三和第四样品暴露于该药剂；
在体外刺激在暴露后的第三样品中的白细胞的Fc受体；
在体外使第四样品中的白细胞暴露于对照刺激物；
测量在刺激后的第三和第四样品中mRNA的水平；以及
比较从第一样品获得的数据与从第三样品获得的数据，并且比较从第二样品获得的数据与从第四样品获得的数据，其中比较的数据之间的显著差异预示推定性药剂。
13.权利要求12的方法，其中：
在测量第一和第二样品中mRNA的量后，计算第一样品中mRNA的量与第二样品中mRNA的量的第一比率；
在测量第三和第四样品中mRNA的水平后，计算第三样品中mRNA的量与第四样品中mRNA的量的第二比率；
比较第一比率与第二比率，其中比率的显著差异预示推定性药剂。
14.权利要求13的方法，其中所述TNFSF蛋白是TNFSF-2、TNFSF-8或TNFSF-15。
15.权利要求14的方法，其中刺激第一和第三样品中的白细胞包括将热聚人IgG与所述样品相互混合。
16.权利要求14的方法，其中所述对照刺激物是磷酸盐缓冲液。
17.权利要求14的方法，其中第一、第二、第三和第四样品中的至少一个包含全血。
18.权利要求14的方法，其中比率的显著差异是第一比率大于第二比率。
19.权利要求14的方法，其中所述mRNA编码TNFSF-2。
20.权利要求12的方法，其中所述TNFSF蛋白是TNFSF-2、TNFSF-8或TNFSF-15。
21.权利要求20的方法，其中刺激第一和第三样品中的白细胞包括将热聚人IgG与所述样品相互混合。
22.权利要求20的方法，其中所述对照刺激物是磷酸盐缓冲液。
23.权利要求20的方法，其中第一、第二、第三和第四样品中的至少一个包含全血。
24.权利要求20的方法，其中所述mRNA编码TNFSF-2。
25.评价患者的类风湿性关节炎的状态的方法，包括：
在体外刺激首次从患者获得的且包含白细胞的第一样品中的白细胞的Fc受体；
测量在刺激后的第一样品中的编码肿瘤坏死因子超家族(“TNFSF”)蛋白的mRNA的量；
在体外使首次从患者获得的包含白细胞的第二样品中的白细胞暴露于对照刺激物；
测量在刺激后的第二样品中mRNA的量；
确定第一样品中mRNA的量与第二样品中mRNA的量的第一比率；
在体外刺激在首次后第二次从患者获得的包含白细胞的第三样品中的白细胞的Fc受体；
测量在刺激后的第三样品中mRNA的量；
在体外使第二次从患者获得的包含白细胞的第四样品中的白细胞暴露于对照刺激物；
测量在刺激后的第四样品中mRNA的量；
确定第三样品中mRNA的量与第四样品中mRNA的量的第二比率；以及
比较第一比率与第二比率，其中第一比率与第二比率的显著差异预示疾病状态的改变。
26.权利要求25的方法，其中所述TNFSF蛋白是TNFSF-2、TNFSF-8或TNFSF-15。
27.权利要求26的方法，其中刺激第一和第三样品中的白细胞包括将热聚人IgG与所述样品相互混合。
28.权利要求26的方法，其中所述对照刺激物是磷酸盐缓冲液。
29.权利要求26的方法，其中第一、第二、第三和第四样品中的至少一个包含全血。
30.权利要求26的方法，其中比率的显著差异是第二比率大于第一比率，那么疾病状态的改变是该疾病加重。
31.权利要求26的方法，其中比率的显著差异是第一比率大于第二比率，那么疾病状态的改变是该疾病减轻。
32.权利要求26的方法，其中所述mRNA编码TNFSF-2。
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